KR19990008122A - 항원 펩타이드 화합물 및 면역학적 측정방법 - Google Patents

항원 펩타이드 화합물 및 면역학적 측정방법 Download PDF

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Abstract

하기 아미노산 서열 1 또는 2를 갖는 항원 펩타이드 화합물과 C형 간염 바이러스(HCV) 항체와의 특이적 결합성을 이용하여 면역 검정법에 따라 검체 속의 HCV 항체를 측정한다
서열 1
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro
서열 2
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro
상기한 방법에 따르면, 교차 반응 내지 비특이 반응을 억제하면서 검체의 serotype을 간편하고도 정확하게 판정할 수 있게 되고 인터페론 치료 효과를 미리 정확하게 예측하거나 C형 간염의 치유 내지 치료 경과를 간편하게 관찰할 수 있게 된다.

Description

항원 펩타이드 화합물 및 면역학적 측정방법
지구상에는 각종 바이러스가 존재하고 있으며 이중의 몇가지는 병원체이다. 예를 들면, 바이러스성 간염의 원인인 간염 바이러스는 수혈, 주사 또는 출산시에 감염되는 것으로 공지되어 있다.
수혈은 사람의 생명 유지를 위한 중요한 한가지 수단이며 이러한 수혈로 인해 바이러스성 간염이 발병되는 예가 현재까지 무수하게 보고되고 있다. 이러한 바이러스성 간염은 일반적으로 A형, B형 및 비A비B형으로 분류되고 있다.
종래에 B형 간염 바이러스(HBV)도 수혈할 때의 바이러스성 간염의 원인으로 알려져 있다. 최근에 이러한 HBV의 존재를 검출하는 검사 시약이 개발되고 수혈전에 간편하게 HBV의 존재를 확인할 수 있게 되었으므로 수혈로 인한 HBV감염자는 전무한 상태이다. 한편 명백하게 바이러스성이면서 지금까지 간염을 일으키는 원인으로 생각되고 있는 A형 간염 바이러스(HAV)에 따른 A형 또는 HBV로 인한 B형이 아닌 간염(비A비B형: nonAnonB형)의 존재도 공지되어 있으며 이의 발생원(바이러스)를 확인하는 것은 종래부터 곤란하다고 되어 있다.
1989년에 Choo, Q-L.등(참조: Science, 244, 359-362, 1989) 및 Kuo, G등(참조: Science, 244, 362-364, 1989)에 의해 비A비B형 간염 바이러스의 존재가 명백해졌다. 이러한 간염 바이러스는 HCV(C형 간염 바이러스)라고 명명되었으며 이러한 HCV는 사람과 침팬지에만 감염되는 것으로 이전부터 보고되어 있다.
상기한 문헌에 하기와 같은 실험이 기재되어 있다. 즉, 환자에게 투여되어 비A비B형 간염을 발병시키는 혈액 응고 제Ⅷ인자 제제와 동일한 제제를 침팬지 No.1에 투여하고 비A비B형 간염을 발병시킨다. 다시 침팬지의 간장에서의 추출물을 침팬지 No.2에 투여하고 동일하게 비A비B형 간염을 발병시킨 다음, 침팬지 No.2의 혈장을 추출한다. 또한 이러한 침팬지 No.2의 혈장을 침팬지 No.3에 다시 투여하고 비A비B형 간염의 발병을 확인한다. 이러한 발병이 확인된 혈장에 대해 목적하는 바이러스를 프라비노바이러스라고 상징하여 바이러스 입자의 농축조작(참조: Bradley, D.W.등: Gastroenterology, 88: 773-779, 1989)을 실시하고 바이러스의 RNA를 추출한다. 이와 같이 수득한 RNA에 기초하여 cDNA를 합성하고 λgtll라이브러리를 제조한다. λgtll 라이브러리에 대해 회복기의 침팬지 혈청이나 비A비B형 만성간염 환자 혈청을 사용하는 면역 스크리닝을 실시하고 반응하는 클론의 선택을 실시한다. 그결과,5-1-1이라고 호칭되는 클론만이 HCV에 유래하는 cDNA 단편인 것으로 확인된다.
상기한 조작은 일본국 특허공보 제(평)2-500880호에 기재되어 있으며 유전자 서열도 명백하게 되어 있다. 또한 일본에서 HCV의 유전자 서열에 관한 보고가 되어 있다[참조: Journal of virology, 65(3), 1105 내지 1113, 1991].
1990년 6월의 일본국 간장학회에서 HCV 구조 영역의 유전자 서열이 지지 의과대학의 오카모토 등에 의해 명백해졌다(참조: 제26회 니혼간조각가이요코슈, 1990년), 1990년 7월 일본국 암학회에서 오카모토 등과 동일하게 HCV의 구조 영역의 유전자 서열이 명백해졌다(참조: 제49회 니혼간각이요코슈, 1990년). 이들의 발표를 비교하면 HCV코어 영역에 관해 유전자의 변이가 거의 없으며 HCV엔빌로프 영역의 유전자 서열에 관해 양자간에 약간의 상이가 확인된다.
다음에 HCV 구조 영역의 코어 항원과 HCV 비구조 영역의 항원부위를 조합한 항체 검사가 제안되어 있으며[참조: 린쇼보리, 40(12), 1245-1251, 1992] 이러한 항체 검사에 따라 거의 완전하게 HCV 항체 양성 보유자의 스크리닝을 실시할 수 있게 되었다.
한편, HCV 검사와 평행하게 C형 간염의 인터페론을 사용하는 치료를 하도록 되었으며 HCV의 유전자형(genotype)의 종류에 따라 인터페론 치료 효과가 상이한 것으로 판명되었다. 이러한 genotype의 분류는 Okamoto H.: 간단스이, 24, 7-14(1992)에 의해 명백해졌으며 I형(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,2451-2455, 1991), II형(참조: Journal of virology, 65(3), 1105 내지 1113, 1991), III형(참조: Journal of General Virology, 72, 2697-2704, 1991) 및 IV형(참조: Virology, 188, 331-341, 1992)으로 분류되어 있다. 1993년 6월에 실시된 일본국 간장학회에서 genotype I형 및 II형(인터페론 치료: 20%유효)은 genotype III형 및 IV형(인터페론 치료: 80%유효)과 비교하여 인터페론의 치료 효과가 낮은 것으로 보고되어 있다(참조: 제29회 니혼간조각각이요코슈, 제55페이지, 1993년).
인터페놀의 투여는 탈모나 발열 등의 강한 부작용이 수반되는 경우가 많으며 환자에 대한 부담이 크므로 치료전의 HCV genotype의 판정은 인터페론 투여 효과의 예측에 매우 중요하다. 그러나 종래의 genotype 판정법에서 「환자 검체 속의 HCV의 RNA 추출, 이에 대응하는 cDNA의 합성, 당해 cDNA의 PCR(폴리머라제 연쇄반응)법을 사용하는 증폭 및 전기영동법을 사용하는 증폭 cDNA의 밴드 확인」이라는 통상적으로 48시간 이상으로 미치는 복잡한 공정을 경유하여 genotype이 결정되므로 장시간 및 고비용이 필요하다.
한편, 유전자 재조합의 방법을 사용하여 제조하는 항원(약 300개의 아미노산으로 이루어진다)을 사용하여 환자 혈청 속의 HCV 항체를 두가지 형태로 분류할 수 있다고 보고되어 있으며(참조: 간단스이 22, 883 내지 889, 1991년) 이러한 분류는 상기한(인터페론 치료의 판정에 중요한) genotype과 대응하는 점에서 반드시 충분하지 않다.
상기한 바와 같이 인터페론 투여에는 많은 비용이 들고 당해 인터페론 투여의 전제로 되는 genotype의 판정에도 많은 비용이 드는 결점이 있다. 치료전에 HCV의 genotype판정을 간편하게 실시할 수 있으면 인터페론 투여 효과를 간편하게 예측할 수 있게 되고 인테페론의 투여 방법이나 치료 지침을 계획적으로 책정할 수 있으며 또한 환자에 대한 정신적, 육체적 및 경제적 부담을 경감시킬 수 있으므로 간편한 HCV의 genotype판정이 요망되고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 HCV 의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있는 HCV 항체를 간편하게 측정할 수 있게 하는 HCV 항체 측정용 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있으며 또한 교차 반응 내지 비특이 반응이 억제되는 HCV항체를 측정할 수 있게 하는 HCV항체 측정용 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있는 HCV 항체의 간편한 측정법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있으며 또한 교차 반응 내지 비특이 반응이 억제되는 HCV항체의 측정법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있는 저비용의 HCV항체의 측정법을 제공하는 것이다.
발명의 개시
본 발명자는 예의 연구한 결과, HCV 항원 부위에 기초하여 특정한 아미노산 서열(6개 이상의 아미노산을 함유하는 서열)을 사용하여 HCV 항체형(serotype)의 판정을 실시하는 것이 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 간편하게 구별할 수 있게 할 뿐만 아니라 항원-항체 반응에 수반되는 교차 반응 내지 비특이 반응을 효과적으로 억제하여 상기한 목적 달성에 매우 효과적인 것을 밝혀냈다.
본 발명의 항원펩타이드 화합물은 상기한 발견에 기초한 것이며 보다 상세하게는 하기 서열 1에 함유된 아미노산 서열이며 연속된 6개 이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 함유함을 특징으로 한다.
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro
또한 본 발명에 따르면 하기 서열 2에 함유된 아미노산 서열이며 연속된 6개이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 함유함을 특징으로 하는 항원 펩타이드 화합물이 제공된다.
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro
또한 본 발명에 따르면 서열 1 및/또는 2이 기재된 항원 펩타이드를 담체에 결합시키고 항원-항체 반응을 이용하여 당해 펩타이드에 검체 속의 HCV 항체를 결합시키고 다시 항원-항체반응을 이용하여 HCV항체에 표지 리간드를 결합시킴으로써 검체 속의 HCV 항체를 측정함을 특징으로 하는 HCV 항체의 면역학적 측정법이 제공된다.
본 명세서에서 「리간드」란 항원 및/또는 항체에 대해 특이적인 결합성이 있는 물질(예: 항체 및/또는 항원)을 말한다.
상기한 종래의 genotype 판정에서 HCV 유전자의 서열 자체를 이용하여 HCV의 형 판정을 실시하며 본 발명에서 HCV에 고유한 항원 부위에 대한 항체 형(serotype)을 이용하여 HCV의 형 판정을 실시한다. 이러한 항체 형의 판정은 종래의 genotype 판정 (HCV의 RNA 추출→cDNA의 합성→cDNA의 PCR법을 사용하는 증폭→전기영동법을 사용하는 증폭 밴드의 확인)과 비교하여 현저하게 단시간에 실시할 수 있으며 또한 작업공정도 단순하므로 본 발명에 따르면 간편하면서 저비용의 HCV형(genotype)의 판정 방법을 제공할 수 있다.
상기한 종래의 혈청형 판정법(약 300개의 아미노산으로 이루어진 항원을 사용한다)과 비교하여 본 발명에서 항원-항체 반응에 수반되는 교차 반응 내지 비특이 반응이 효과적으로 억제된다.
「20개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열」을 항원 펩타이드로서 사용하는 방법[참조: 일본국 특허원 제(평)5-272864호, 제(평)6-207695호 및 국제특허출원 PCT/JP94/01823호]을 사용하여 HCV genotype(I형 및 II형/III형 및 IV형)을 구별할 수 있으며 30개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열에 함유된 아미노산 서열에서 연속된 6개 이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 사용하는 본 발명에 따르면 상기한 20 아미노산 서열을 사용하는 경우와 비교하여 아미노산의 상동성이 증대함에도 불구하고 특이성은 저하되지 않으며 오히려 반응성 및 형 판정율이 더욱 향상될 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 core 영역에 대한 감도가 향상되므로 예를 들면, 면역적인 점에서 HCV의 과거 감염(예: 바이러스 본체인 core 영역의 측정에 기초한다)과 현재의 감염(예: 바이러스 증식시에 출현하는 NS4 및/또는 NS5 영역의 측정에 기초한다)을 세로타입(serotype)으로 식별할 수 있게 된다.
즉, NS4 및 NS5 영역 등의 바이러스 증식시에 출현하는 펩타이드가 간염 치유후에 신속하게 소실되는데 대해 core 영역은 간염 치유후에 어느 정도의 기간내(예:치유후 1 내지 2년 정도)에도 검출할 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면 core 영역의 검출에 기초하여 과거의 HCV 감염을 식별할 수 있게 된다.
본 발명은 HCV(C형 간염 바이러스)관련 항체의 측정에 유용한 펩타이드 화합물 및 면역학적 측정방법에 관한 것이다.
도 1A 내지 1C는 실시예 1에서 HCV의 core 영역에 관해 Hydrophilicity Value, Hydropathy Value 및 Antigenicity Value를 계산함으로써 구한 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 실시예 2에서 수득한 항원 펩타이드 화합물(1) (ckk-c12)의 HPLC분석 결과를 도시한 크로마토그래피이다.
도 3은 실시예 2에서 수득한 항원 펩타이드 화합물(2) (ckk-c12)의 HPLC분석 결과를 도시한 크로마토그래피이다.
도 4는 HCV의 항원 영역과 각 항원 펩타이드의 관계를 도시한 모식도이다.
도 5(표1)는 실시예에서 수득한 HCV 세로타입의 판정 결과를 정리한 표이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 양태
하기에 필요에 따라 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 아미노산 서열의 표기에 N말단(좌측)으로부터 C말단(우측)에 기재한다[예: 하기 아미노산 서열(1)에서 Arg가 N말단 및 Pro가 C말단이다]. 또한 본 명세서에서 하기에 기재된 아미노산 표기를 사용한다.
(아미노산의 1문자 표기 및 3문자 표기)
약효 명칭 약효 명칭
Asp D 아스파라긴산 Val V 발린
Asn N 아스파라긴 Met M 메티오닌
Thr T 트레오닌 Ile I 이소로이신
Ser S 세린 Leu L 로이신
Glu E 글루탐산 Tyr Y 티로신
Gln Q 글루타민 Phe F 페닐알라닌
Pro P 프롤린 Trp W 트립토판
Gly G 글리신 Lys K 라이신
Ala A 알라닌 His H 히스티딘
Cys C 시스틴 Arg R 아르기닌
(항원 펩타이드 화합물)
본 발명의 항원 펩타이드 화합물은 하기 1 또는 2의 서열(아미노산 30개)에 함유된 서열이며 6개 이상의 연속된 아미노산으로 이루어진 서열을 갖는 펩타이드 화합물이다.
서열 1
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro (ckk-c12; core-1, core영역에 대응)
(1문자 표기: RKTSE RSQPR GRRQP IPKAR RPEGR TWAQP)
서열 2
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro (ckk-c22; core-2, core영역에 대응)
(1문자 표기: RKTSE RSQPR GRRQP IPKDR RSTGK SWGKP)
본 발명자의 발견에 따르면 서열(1) 또는 (2)의 아미노산 30개로 이루어진 서열을 구성하는 각종 길이의 아미노산 서열에서 6개 이상이 연속된 아미노산을 함유하는 서열은 본 발명에서 펩타이드(1) 및/또는 (2)와 동일하게 항원으로서 적절하게 사용할 수 있다. 이러한 「각종 길이의 아미노산 서열」을 구성하는 아미노산의 갯수는 HCV의 식별성과 교차 반응 및 특이 반응의 억제와의 균형면에서 21개 이상(또한 25개 이상)이 바람직하다.
상기한 「각종 길이의 아미노산 서열」의 구체적인 예(아미노산 6개 내지 30개)로서 예를 들면 하기의 서열을 들 수 있다.
펩타이드 화합물(1)에 함유된 아미노산 서열
Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro
(1문자 표기: RSQPR GRRQP IPKAR RPEGR TWAQP)
펩타이드 화합물(2)에 함유된 아미노산 서열
Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro
(1문자 표기: RSQPR GRRQP IPKDR RSTGK SWGKP)
본 발명자의 발견에 따르면 (1) 또는 (2)의 서열을「함유하는」펩타이드(아미노산 31개 이상으로 이루어진다)도 (1) 또는 (2)와 동일하게 항원으로서 적절하게 사용할 수 있다. 이러한 펩타이드를 구성하는 아미노산의 수는 화학적으로 합성하는 경우에 40개 이하가 바람직하며 리콤비난트법을 사용하여 수득하는 경우에 100개 이하가 바람직하다.
상기한 항원 펩타이드 화합물(6개 이상의-아미노산을 함유하는 펩타이드 화합물)을 수득하는 방법은 특별히 제한하지 않는다. 당해 펩타이드 화합물은 화학적으로 합성할 수 있으며 또한 유전공학적 수법(예: 유전자 조합 기술, 즉 리콤비난트법)을 사용하여 제조할 수 있다. 화학적 수법을 사용하는 경우, 중간 생성물의 정제 등이 용이한 점으로부터 고상법을 사용하여 아미노산을 연결하는 것이 바람직하며 자동 펩타이드 합성기(예: 어플라이드ㆍ바이오시스템사제의 430A 펩타이드 합성기)를 사용하여 합성하는 것이 보다 바람직하다.
(항원 펩타이드 화합물의 항원성 확인)
상기한 펩타이드 화합물(1) 및 (2)의 서열은 HCV의 core영역의 아미노산 서열로부터 항원 부위의 추출에 근거하여 발견한 것이다(참조: 실시예 1). 본 발명자는 또한 이들 펩타이드 화합물(1) 및 (2)를 사용하는 효소 면역측정법( ELISA 내지 EIA)을 사용하여 HCV genotype의 검사를 실시하고 별도로 HCV genotype의 판정을 실시하는 환자의 검체를 사용하여 이의 특이성을 확인한다(참조: 실시예 4 및 실시예 5).
(기타 항원 펩타이드 화합물)
상기한 펩타이드 화합물(1) 및/또는 (2)(모두 HCV의 core영역에 대응하는 서열)를 사용함으로써 하기하는 바와 같이 serotype을 충분하게 판정할 수 있으며 serotype판정의 정밀도 향상 내지 적용범위 확대를 한층 높게 하는 점에서 상기한 펩타이드 화합물(1) 및/또는 (2)와 다른 항원 펩타이드 화합물을 조합하는 것이 바람직하다. 이러한「기타 항원 펩타이드 화합물」로서 하기 펩타이드(3) 내지 (6)을 들 수 있다.
Ile-Ile-Leu-Ser-Gly-Arg-Pro-Ala-Ile-Val-Pro-Asp-Arg-Glu-Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Gln-Leu-Ala (ckk-n1(40), NS4 영역에 대응)
(1문자 표기: IILSG RPAIV PDREL LYQEF DEMEE CASHL PYIEQ GMQLA)
Leu-His-Val-Asn-Gln-Arg-Ala-Val-Val-Ala-Pro-Asp-Lys-Glu-Val-Leu-Tyr-Glu-Ala-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-Arg-Ala-Ala-Leu-Ile-Glu-Glu-Gly-Gln-Arg-Ile-Ala (ckk-n2(40), NS4 영역에 대응)
(1문자 표기: LHVNQ RAVVA PDKEV LYEAF DEMEE CASRA ALIEE GQRIA)
Cys-Thr-Thr-His-His-Val-Ser-Pro-Asp-Ala-Asp-Leu-Ile-Glu-Ala-Asn-Leu-Leu-Trp-Arg (ckk-n3, NS5 영역에 대응)
(1문자 표기: CTTHH VSPDA DLIEA NLLWR)
Cys-Thr-Thr-His-Gly-Lys-Ala-Tyr-Asp-Val-Asp-Met-Val-Asp-Ala-Asn-Leu-Phe-Met-Gly (ckk-n4, NS5 영역에 대응)
(1문자 표기: CTTHG KAYDV DMVDA NLFMG)
상기한 펩타이드 (3) 내지 (6)에 대해서도 core영역에 대응하는 펩타이드(1) 및 (2)의 경우와 동일하게 하여 항원성의 확인 및 제조 등을 실시할 수 있다.
또한 본 발명자의 발견에 따르면 서열(3) 내지 (6)의 아미노산 40개 또는 20개로 이루어진 서열을 구성하는 각종 길이의 아미노산 서열에서 6개 이상이 연속된 아미노산을 함유하는 서열은 본 발명에서 펩타이드(3), (4), (5) 및/또는 (6)중의 하나와 동일하게 항원 펩타이드로서 적절하게 사용할 수 있다.
이러한 각종 길이의 아미노산 서열(아미노산 6개 내지 30개)로서 예를 들면, 하기 서열을 들 수 있다.
펩타이드 화합물(3)에 함유된 아미노산 서열
Ile-Ile-Leu-Ser-Gly-Arg-Pro-Ala-Ile-Val-Pro-Asp-Arg-Glu-Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu
(1문자 표기 :IILSG RPAIV PDREL LYQEF DEMEE CASHL)
펩타이드 화합물(4)에 함유된 아미노산 서열
Leu-His-Val-Asn-Gln-Arg-Ala-Val-Val-Ala-Pro-Asp-Lys-Glu-Val-Leu-Tyr-Glu-Ala-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-Arg-Ala
(1문자 표기: LHVNQ RAVVA PDKEV LYEAF DEMEE CASRA)
펩타이드 화합물(5)에 함유된 아미노산 서열
Val-Ser-Pro-Asp-Ala-Asp-Leu-Ile-Glu-Ala-Asn-Leu-Leu-Trp-Arg
(1문자 표기: VSPDA DLIEA NLLWR)
펩타이드 화합물(6)에 함유된 아미노산 서열
Lys-Ala-Tyr-Asp-Val-Asp-Met-Val-Asp-Ala-Asn-Leu-Phe-Met-Gly
(1문자 표기: KAYDV DMVDA NLFMG)
본 발명자의 발견에 따르면 (3) 내지 (6)중의 하나의 서열을 함유하는 펩타이드(아미노산 16 내지 31개 이상으로 이루어진다)는 (3) 내지 (6)과 동일하게 항원으로서 적절하게 사용할 수 있다. 이러한 펩타이들를 구성하는 아미노산의 수는 화학적으로 합성하는 경우에 40개 이하가 바람직하며 리콤비난트법을 사용하여 수득하는 경우에 100개 이하가 바람직하다.
본 발명자의 발견에 따르면 펩타이드 화합물(1) 내지 (6)을 각각 단독으로 항원으로서 사용하는 경우, serotype 판정의 정밀도의 관점에서 항원으로서 바람직한 순위는 하기와 같다. 당해 구분의 기재에서 「(1) 및/또는 (2)」를 정리하여 「core」로 나타내고 「(3) 및/또는 (4)」를 정리하여 「NS4」로 나타내고 「(5) 및/또는 (6)」을 정리하여 「NS5」로 나타낸다.
바람직한 순위: core NS4 NS5
한편 상기한 펩타이드 화합물 core, NS4 및 NS5중의 어느 그 종류를 조합하여 항원으로서 사용하는 경우, serotype 판정의 정밀도의 관점에서 항원으로서 바람직한 순위는 하기와 같다.
바람직한 순위: (core) + (NS4) + (NS5) (core) + (NS5)
또한 상기한 펩타이드 화합물 core, NS4 및 NS5중의 어느 3종류를 조합하여 항원으로서 바람직한 순위는 하기와 같다.
바람직한 순위: (core) + (NS4) + (NS5) (core) + (NS4) + (NS5)
(HCV 항체의 측정방법)
상기한 항원 펩타이드 화합물의 HCV 항체와의 특이적 결합성을 이용하여 시료 내지 검체 속의 HCV 항체를 면역학적으로 측정할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 면역학적 측정법은 특별히 제한하지 낳으며 예를 들면, 공지된 면역 검정법을 특별히 제한하지 않고 사용할 수 잇다. 이러한 면역 검정법으로서 예를 들면, 효소 면역 측정법, 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA) 등을 사용할 수 있다. 이러한 면역 검정에서 공지된 측정 기술(예: 경합법, 2항체법, 샌드위취법 등)을 특별히 제한하지 않고 사용할 수 있다. 이러한 공지된 측정기술에 관해 문헌[참조: EIA에 관해 예를 들면, 이시카와 에이지「고소멘에키소쿠데이호」(제3판), 180페이지, 이가쿠쇼인]을 참조할 수 있다.
본 발명에 따르면 상기한 항원 펩타이드 화합물을 사용하여 HCV 항체를 면역학적으로 측정함으로써 검체의 HCV항체의 종류(serotype)를 판정할 수 있다(예: 하기와 같이 HCV의 serotype이 group I이거나 group II인 것으로 판정할 수 있다). 하기와 같이 HCV serotype의 group I은 HCV genotype I 및 II에 대응하고 HCV seroytpe의 group Ⅱ는 HCV genotype Ⅲ 및 Ⅳ에 대응하므로 간편한 HCV genotype을 판정할수 있게 된다.
상기한 면역 검정에서 필요에 따라 항원 펩타이드 화합물을 담체(내지 지지체)에 결합 내지 고상화하여 이의 HCV 항체와의 특이적 결합성을 이용하여 HCV항원에 대한 항체의 종류(즉, HCV의 serotype)을 판정할 수 있다. 이때의 담체 내지 지지체로서 소 혈청 알부민(BSA), 바람직하게는 분자량 5만 내지 10만 정도의 폴리펩타이드, 마이크로플레이트의 웰, 바람직하게는 직경 0.1μm 내지 6㎜ 정도의 폴리스티렌 볼(내지 폴리스티렌비드)등이 바람직하게 사용된다.
펩타이드(1) 내지 (2)는 상기와 같이 HCV 항체 측정에 적절하게 사용할 수 있으며 또한 예를 들면, HCV에 대한 백신 제조용의 항원 내지 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 경우의 백신은 예를 들면, 유전 공학적 수법을 사용하여 제조할 수 있다(리콤비난트법).
하기에 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
실시예
실시예 1
(Hydrophilicity Value에 따른 항원 부위의 특징)
Geoffrey RS, Nature, 302, 490-495(1983)로 합성된 항원성을 갖는 펩타이드의 서열과 HCV의 유전자 서열[참조: 제26회 나혼간조각가이요코슈, 1990년;제49회 니혼간각가이요코슈, 1990년; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 2451-2455, 1991; Journal of virology, 65(3), 1105 내지 1113, 1991; Journal of General Virology, 72, 2697-2704, 1991; Virology, 188, 331-341, 1992]에 기초하여 HCV의 비구조 영역 및 구조 영역의 아미노산 서열을 결정한다.
이와 같이 구한 아미노산 서열에 기초하여 이의 항원 부위를 Hopp TP, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828(1981)의 방법으로 산출한다. 보다 구체적으로 각 아미노산의 Hydrophilicity Value를 사용하고 하기와 같이 실시한다.
상기에서 구한 HCV를 구성하는 아미노산 서열에 기초하여 연속하는 6개의 아미노산의 Hydrophilicity Value를 합계한다. 이러한 계산을 HCV 아미노산 서열의 전체 영역에 대해 실시하고 친수성 및 소수성의 강도를 산출한다. 친수성이 높은 부분을 항원성을 나타내는 부위로 한다.
이때에 Jack K., Mol. Biol. 157,105(1982)에 기재된 Hydropathy Value 또한 Alan MS., Science, 227,429(1985)에 기재된 Antigenicity Value 등을 상기한 Hydrophilicity Value와 동일하게 산출할 수 있다.
Hydrophilicity Value를 사용하는 계산으로 구한 결과를 도 1(core 영역)의 그래프로 도시한다(Hydropathy Value를 및 Antigenicity Value를 사용하는 결과를 아울러 도시한다).
도 1에서 수득한 결과에 기초하여 C형 간염의 항원으로 될 수 있는 영역을 추출한 다음, 이와 같이 구한 영역 중에서 genotype I 및 genotype II로 공통된 아미노산 서열을 갖는 영역과 gentype Ⅲ 및 genotype Ⅳ로 공통된 아미노산 서열을갖는 영역을 구한다. 그 결과, 이러한 조건을 만족시키는 항원의 아미노산 서열로서 core 영역에 관해 하기의 ckk-c12 및 ckk-c22를 구할 수 있다.
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro (ckk-c12)
Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-PRo-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro (ckk-c22)
실시예 2
(C형 간염 항원의 제조)
상기한 HCV의 항원 펩타이드 화합물(ckk-c12) 및 (ckk-c22)를 하기에 기재된 방법으로 합성한다.
펩타이드의 합성은 자동 펩타이드 합성기 Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer를 사용하고 t-Boc 아미노산의 대칭성 무수물을 시약으로서 사용하여 실시한다. 수득된 합성 펩타이드를 아니솔ㆍ디메틸설파이드ㆍ파라티오크레졸속에 용해한 다음, 불화수소산의 존재하에 0 내지 5℃에서 1시간 동안 반응시켜 탈보호를 실시한다[참조: S. Sakakibara, Bull. Chem. Soc. Jpn. 40, 2164(1967)].
탈보호로 수득된 조결정을 2N 아세트산으로 용해하여 에테르로 추출하고 추출물을 동결 건조한다. 이러한 동결 건조물을 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 사용하여 정제한다.
이러한 HPLC 정제는 칼럼(SISEIDO 캡슐팩 C18SG 120, 직경 46㎜, 길이 250㎜)을 사용하고 순수중에 0.1% 트리폴루오로아세트산(Trifluoroacetic acid; TFA)과 5% 아세트니트릴(CH3CN)이 함유된 용액과 순수중에 0.1% TFA와 50% 아세트니트릴이 함유된 용액을 사용하고 유량 12㎖/분에서 이동상으로 변화도를 줌으로써 실시한다.
이때에 수득된 크로마토그래피를 도 2(ckk-c12)에 도시한다.
상기와 동일하게 합성 항원 펩타이드 ckk-c22를 HPLC를 사용하여 정제한다. 이때에 수득된 크로마토그래피를 도 3(ckk-c22)에 도시한다.
상기와 동일하게 하기에 기재된 합성 항원 펩타이드 ckk-n1(40)와 ckk-n2(40)(NS4 영역 펩타이드); ckk-n3와 ckk-n4(NS5 영역 펩타이드) 및 ckk-c1과 ckk-c2(20 아미노산으로 이루어진 core 영역 펩타이드)를 각각 합성한다.
서열 3
Ile-Ile-Leu-Ser-Gly-Arg-Pro-Ala-Ile-Val-Pro-Asp-Arg-Glu-Leu-Leu-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly-Met-Gln-Leu-Ala (ckk-n1(40), NS4 영역에 대응)
(1문자 표기: IILSG RPAIV PDREL LYQEF DEMEE CASHL PYIEQ GMQLA)
서열 4
Leu-His-Val-Asn-Gln-Arg-Ala-Val-Val-Ala-Pro-Asp-Lys-Glu-Val-Leu-Tyr-Glu-Ala-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-Arg-Ala-Ala-Leu-Ile-Glu-Glu-Gly-Gln-Arg-Ile-Ala (ckk-n2(40), NS4 영역에 대응)
(1문자 표기: LHVNQ RAVVA PDKEV LYEAF DEMEE CASRA ALIEE GQRIA)
서열 5
Cys-Thr-Thr-His-His-Val-Ser-Pro-Asp-Ala-Asp-Leu-Ile-Glu-Ala-Asn-Leu-Leu-Trp-Arg (ckk-n3, NS5 영역에 대응)
(1문자 표기: CTTHH VSPDA DLIEA NLLWR)
서열 6
Cys-Thr-Thr-His-Gly-Lys-Ala-Tyr-Asp-Val-Asp-Met-Val-Asp-Ala-Asn-Leu-Phe-Met-Gly (ckk-n4, NS5 영역에 대응)
(1문자 표기: CTTHG KAYDV DMVDA NLFMG)
서열 7
Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro (ckk-c1, core 영역에 대응)
(1문자 표기 : GRRQP IPKAR RPEGR TWAQP)
서열 8
Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro (ckk-c2, core 영역에 대응)
(1문자 표기: GRRQP IPKDR RSTGK SWGKP)
상기한 각종 항원 펩타이드와 HCV의 항원 영역의 관계를 도 4에 모식적으로 도시한다.
실시예 3
(ELISA용 플레이트의 제조)
실시예 2에서 수득한 core 영역의 항원 펩타이드 ckk-C12를 0.15M NaCl-0.10M Na2HPO4-NaH2PO4ㆍ2H2O 완충액(PBS) pH7.0에 0.04g/㎖의 농도로 되도록 용해한다. 이러한 펩타이드 용액을 96-웰 마이크로폴레이트(상품명: ELISA PLATE 68667, NUNC사제)에 1웰당 100μℓ씩 분주하고 37℃에서 60분 동안 정치하여 상기한 항원 펩타이드를 마이크로플레이트에 고상화한다.
잉여의 펩타이드 용액을 제거한 다음, 마이크로플레이트를 0.01MPBS(pH 7.0)로 3회 세정한다. 세정액을 제거한 다음, 농도 0.1% 젤라틴의 0.01MPBS(pH7.0)용액을 1웰당 300μℓ씩 분주하고 37℃에서 60분 동안 정치하여 젤라틴을 플레이트위에 코팅한다. 잉여의 젤라틴 용액을 제거한 다음, 농도 0.05%의 Tween 20을 함유하는 0.01MPBS 용액(pH7.0)으로 3회 세정한다.
이와 같이 하여 젤라틴을 코팅한 플레이트를 25℃에서 6시간 동안 건조한 다음, 4℃에서 검체를 분석할 때가지 보존한다.
실시예 4
(검체의 분석)
검체(20종류)는 미리 가부시키가이샤에스알엘하치오지 실험실에서 상기한 문헌에 기재된[참조: Okamoto H., 간단스이, 24, 7-14(1992)] PCR을 사용하는 방법을 사용하여 HCV genotype의 검사를 실시하고 HCV genotype의 판정을 얻는다. 아울러 시판하는 HCV-RNA 양 측정시약(Chiron사, 상품명 T퀀터플렉스 HCV-RNA」)를 사용하여 측정한 각 검체의 HCV-RNA 양(단위:mEQ/㎖)을 측정한다(HCV-RNA 양의 적은 것은 HCV 바이러스의 갯수가 적은 것을 나타낸다).
이와 같이 PCR법을 사용하여 HCV genotype의 판정을 실시한 검체를 사용하여 하기와 같이하여 실시예 2에서 수득한 항원 펩타이드의 특이성을 확인한다. 이의 검토에서 실시예 3에서 제조한 항원 펩타이드 고상화 마이크로플레이트를 사용하고 하기와 같은 수순으로 분석을 실시한다.
상기한 각 검체를 각각 0.01% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 0.01MPBS(pH7.0)로 50배 희석하여 각 웰에 100μℓ씩 분주하여 항원 펩타이드와 37℃에서 60분 동안 반응시킨다(항원 펩타이드-HCV 항체의 반응).
반응후에 마이크로플레이트를 0.05% Tween 20 함유 0.01MPBS(pH7.0)으로 5회 세정하고 세정액을 제거한 다음, 농도 0.1μg/20㎖의 퍼옥시다제 표지 항사람 IgG 항체(KPL 사제)를 100μℓ씩 각 웰에 주입하고 37℃에서 60분 동안 반응시킨다(HCV 항체-POD 표지 항사람 IgG 항체의 반응).
반응후에 마이크로플레이트를 0.05% Tween 20 함유 0.01MPBS(pH7.0)로 5회 세정하고 세정액을 제거한 다음, 각 웰에 0.023% 과산화수소 및 0.005% O-페닐렌디아민(OPD)을 함유하는 0.1M 시트르산-Na2HPO4완충액을 100μℓ씩 분주하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨다(퍼옥시다제의 활성 측정 반응). 반응후에 5N 황산을 50μℓ씩 첨가하여 반응을 정지시키고 파장 491㎚의 흡광도(ABS 내지 OD)를 분광광도계(상품명: 플레이트리더, 니혼인터매드사제 NJ-2001)로 측정한다.
실시예 5
(항원 펩타이드 ckk-c22를 사용하는 검체의 측정)
실시예 3에서 사용하는 항원 펩타이드 ckk-c12를 대신하여 실시예 2에서 수득한 항원 펩타이드 ckk-c22를 사용하는 이외에도 실시예 3과 동일하게 하여 항원 펩타이드 ckk-c22를 고상화하는 마이크로플레이트를 제조한다. 이와 같이하여 수득하는 마이크로플레이트를 사용하는 이외에는 실시예 4와 동일하게 하여 미리 HCV genotype의 판정을 실시한 검체(20종류)를 분석한다.
이어서 실시예 4 및 본 실시예에서 수득한 흡광도의 측정 데이터에 기초하여 serotype 판정을 실시한다. 이때의 serotype 판정에서 항원 펩타이드 ckk-c12(serotype 1에 대응하는 펩타이드)를 사용하는 경우의 흡광도와 항원 펩타이드 ckk-c22(serotype 2에 대응하는 펩타이드)를 사용하는 경우의 흡광도를 비교하여 어느 한쪽의 흡광도의 값의 1.5배 이상인 경우에 흡광도가 높은 쪽의 타입(ckk-c12의 편이면 serotype 1이고 ckk-c22의 편이면 serotype 2이다)으로 한다.
상기에서 수득한 serotype 판정결과를 하기의 도 5(표 1)의 제7열 30 core에 도시한다.
상기한 도 5(표1)에서 각 열의 데이터의 의미는 하기와 같다.
제1열 : 검체의 식별 기호
제2열 : 검체 번호
제7열 : 30개의 아미노산으로 이루어진 core 영역 항원 펩타이드 ckk-c12 및 ckk-c22를 사용하는 경우의 검체의 serotype 판정 결과.
상기 도 5(N=20)의 serotype 판정 결과 중에서 1은 1형, 2는 2형, 0은 음성(판정 불능), 1=2는 혼재형(1÷2;즉 어느 한쪽의 흡광도의 값이 다른쪽의 흡광도의 값의 1.5배 미만인 경우)을 나타낸다.
12는 쌍방의 측정 데이터 모두 컷오프치(OD치=0.5)미만이며 OD치의 비교에서(12)를 나타낸다. 한편 12는 쌍방의 측정 데이터 모두 컷오프치(OD치=0.5)미만이며 OD치의 비교에서 (12)를 나타낸다.
상기에서 수득한 serotype판정의 결과를 정리하여 genotype판정 결과[도 5(표1)내에서 제9열 genotype에 나타낸다]와 비교한 바, 하기의 대응 관계가 얻어진다[참조: Hepatology, 16(4), 886, 1992]
serotype과 genotype의 대응
genotype 판정 serotype 판정
(PCR) (core 항원)
I group I
II group I
III group II
IV group II
V -
(표내에서 「genotype V」는 PCR법에 따른 genotype 판정에서 형 판정 불능 내지 불명(혼재하는 것을 포함한다)을 나타낸다.)
실시예 6
(항원 펩타이드 ckk-n1 및 ckk-n2를 사용하는 검체의 측정)
실시예 3에서 사용하는 항원 펩타이드 ckk-c12를 대신하여 실시예 2에서 수득한 NS4 영역의 항원 펩타이드 ckk-n1 및 ckk-n2를 각각 사용하는 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 각각의 항원 펩타이드를 고상화하는 마이크로플레이트를 제조한다.
이와 같이 하여 수득하는 수득하는 마이크로플레이트를 사용하는 이외에는 실시예 4 및 5와 동일하게 하여 HCV genotype의 판정을 실시한 검체(20종류)를 분석한다.
본 실시예의 방법에 따른 serotype 판정에서 실시예 5의 경우와 동일하게 흡광도 (ckk-n1)와 흡광도(ckk-n2)를 비교하여 이중의 하나의 값이 다른 편의 값의 1.5배 이상인 경우에 흡광도가 높은 편의 타입(ckk-n1의 편이면 serotype 1이고 ckk-n2의 편이면 serotype 2)으로 한다.
상기에서 수득한 serotype 판정 결과를 하기 도 5(표1)의 제3열 NS4(50)에 도시한다.
본 실시예에서 수득한 serotype 판정의 결과를 정리하여 genotype판정 결과와 비교한 바, 실시예 4 및 5의 결과와 동일하게 하기의 대응관계가 얻어진다.
serotype과 genotype의 대응
genotype 판정 serotype 판정
(PCR) (NS4)
I group I
II group I
III group II
IV group II
V -
실시예 7
(검체의 희석 배율을 변화시키는 측정)
실시예 6(검체의 희석 배율: 50배)에서 흡광도 데이터가 포화상태에 가깝다고 생각되는 검체에 대해서도 이의 정확한 흡광도 데이터에 기초하여 serotype판정을 실시하므로 측정하여야 할 검체의 희석 배율을 500배로 하여 측정을 실시한다.
즉, 검체의 희석 배율을 500배로 하는 이외에는 실시예 6과 동일하게 하여 흡광도의 측정 및 serotype 판정을 실시한다.
상기에서 수득한 serotype 판정 결과를 하기 도 5(표1)의 제4열 NS4(500)에 도시한다.
실시예 8
(항원 펩타이드 ckk-n3 및 ckk-n4를 사용하는 검체의 측정)
실시예 3에서 사용하는 항원 펩타이드 ckk-c12를 대신하여 실시예 2에서 수득한 NS5 영역의 항원 펩타이드 ckk-n3 및 ckk-n4을 각각 사용하는 이외에는 실시예 3과 동일하게 하여 각각의 항원 펩타이드를 고상화하는 마이크로플레이트를 제조한다.
이와 같이하여 수득하는 마이크로플레이트를 사용하는 이외에는 실시예 4 및 5와 동일하게 하여 미리 HCV genotype의 판정을 실시한 검체(20종류)를 분석한다.
본 실시예의 방법에 따른 serotype 판정에서 실시예 5의 경우와 동일하게 흡광도(ckk-n3)와 흡광도(ckk-n4)를 비교하여 이중의 하나의 값이 다른 편의 값의 1.5배 이상인 경우에 흡광도가 높은 편의 타입(ckk-n3의 편이면 serotype 1이고 ckk-n4의 편이면 serotype 2)으로 한다.
상기에서 수득한 serotype 판정 결과를 하기 도 5(표1)의 제5열 NS5에 도시한다.
본 실시예에서 수득한 serotype 판정의 결과를 정리하여 genotype 판정 결과와 비교한 바, 실시예 4 및 5의 결과와 동일하게 하기의 대응 관계가 얻어진다.
serotype과 genotype의 대응
genotype 판정 serotype 판정
(PCR) (NS5)
I group I
II group I
III group II
IV group II
V -
실시예 9
(항원 펩타이드 (ckk-c1 및 ckk-c2를 사용하는 검체의 측정)
실시예 3에서 사용하는 항원 펩타이드 ckk-c12를 대신하여 실시예 2에서 수득한 core 영역의 항원 펩타이드 ckk-c1 및 ckk-c2(모두 아미노산 20개로 이루어진 펩타이드)를 각각 사용하는 이외에는 실시예 3과 동일하게하여 각각의 항원 펩타이드를 고상화하는 마이크로플레이트를 제조한다.
이와 같이 하여 수득하는 마이크로플레이트를 사용하는 이외에는 실시예 4 및 5와 동일하게 하여 미리 HCV genotype의 판정을 실시한 검체(20종류)를 분선한다.
상기에서 수득한 serotype 판정 결과를 하기 도 5(표1)의 제6열 20 core에 도시한다.
본 실시예의 방법에 따른 serotype 판정에서 실시예 5의 경우와 동일하게 흡광도(ckk-c1)와 흡랑도(ckk-c2)를 비교하여 이중 하나의 값이 다른 편의 값의 1.5배 이상인 경우에 흡광도가 높은 편의 타입(ckk-c1의 편이면 serotype 1이고 ckk-c2의 편이면 serotype 2)으로 한다.
본 실시예에서 수득한 serotype 판정의 결과를 정리하여 genotype 판정 결과와 비교한 바, 실시예 4 및 5의 결과와 동일하게 하기의 대응 관계가 얻어진다.
serotype과 genotype의 대응
genotype 판정 serotype 판정
(PCR) (core)
I group I
II group I
III group II
IV group II
V -
본 실시예에서 수득한 serotype 판정의 결과를 정리하여 genotype 판정 결과와 비교한 바, 실시예 4 및 5의 결과와 동일하게 하기의 대응 관계가 얻어진다.
serotype과 genotype의 대응
genotype 판정 serotype 판정
(PCR) (core)
I group I
II group I
III group II
IV group II
V -
실시예 4 내지 9에서 수득한 serotype 판정 결과를 도 5(표1)에 정리하여 도시한다. 도 5(표1)에서 각 열의 데이터의 의미는 하기와 같다.
제1열: 검체의 식별 기호
제2열: 검체 번호
제3열: NS4 영역 항원 펩타이드 ckk-n1 및 ckk-n2를 사용하는 경우의 검체의 serotype 판정 결과(검체의 희석 배율은 50배)
제4열: NS4 영역 항원 펩타이드 ckk-n1 및 ckk-n2를 사용하는 경우의 검체의 serotype 판정 결과(검체의 희석 배율은 500배).
제5열: NS5 영역 항원 펩타이드 ckk-n3 및 ckk-n4를 사용하는 경우의 검체의 serotype 판정 결과.
제6열: 20개의 아미노산으로 이루어진 core 영역 항원 펩타이드 ckk-c1 및 ckk-c2를 사용하는 경우의 검체의 serotype 판정 결과.
제7열: 30개의 아미노산으로 이루어진 core 영역 항원 펩타이드 ckk-c12 및 ckk-c22를 사용하는 경우의 검체의 serotype 판정 결과.
제8열: 시판하는 HCV-RNA양 측정시약(Chiron사, 상품명 「퀀티플렉스 HCV-RNA」)을 사용하여 측정한 각 검체의 HCV-RNA양(단위: mEQ/㎖), HCV-RNA양이 적은 것은 HCV 바이러스의 갯수가 적은 것을 나타낸다.
상기 도 5(표1)에 도시한 바와 같이 core 항원으로서 아미노산 20개의 배열(ckk-c1 및 ckk-c2)을 사용하는 경우(실시예 9,「20 core」의 열의 데이터)에서는 5/20=25%를 판정할 수 있으며 core 항원으로서 아미노산 30개의 서열(ckk-c12 및 ckk-c22)을 사용하는 경우(실시예 9, 「30 core」의 열의 데이터)에서 14/20=70%를 판정할 수 있게 된다. 특히 본 발명의 30아미노산으로 이루어진 항원 펩타이드(ckk-c12 및 ckk-c22)를 사용하는 경우에 HCV-RNA양(표1의 제8열, 「QP」)이 적은 경우라도 양호한 serotype 판정을 할 수 있다.
추가하여 상기한 바와 같이 genotype I 및 genotype II는 serotype I과 양호하게 상관하는 한편, genotype III 및 genotype IV는 serotype II와 양호하게 상관한다.
상기와 같이 본 발명에 따르면 HCV에 고유한 특정 아미노산 서열을 갖는 항원 펩타이드 화합물 및 이를 사용하는 HCV 항체 측정방법이 제공된다.
본 발명에 따르면 교차반응 내지 비특이 반응을 억제하면서 core 영역의 감도를 항상시킴으로써 검체의 serotype을 간편하면서 정확하게 판정할 수 있게 된다. 따라서 본 발명에 따르면 core 영역의 감도를 향상시킨 정확하면서 간편한 serotype 판정에 기초하여 예를 들면, 인터페론 치료 효과를 미리 예측할 수 있게 된다.
또한 본 발명에 따른 HCV 항체가 측정에 기초하여 C형 간염의 치유 내지 치료 경과를 간편하게 관찰할 수 있게 된다. 즉 본 발명에 따르면 역학적인 관점에서 세로타입을 이용할 수 있게 되고 과거의 감염(core 영역의 항체가)과 현재의 간염(NS4 및/또는 NS5 영역의 항체가)과의 관계에 대한 발견을 얻을 수 있게 된다.
또한 본 발명에 따르면 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있는 HCV항체를 간편하게 간편하게 측정할 수 있게 하는 HCV항체 측정용 항원이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면 HCV의 genotype I형과 II형 및 genotype III형과 IV형을 구별할 수 있으며 또한 교차 반응 내지 비특이 반응이 억제되는 HCV 항체를 측정할 수 잇게하는 HCV 항체 측정용 항원이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면 HCV의 genotype Ⅰ형과 Ⅱ형 및 genotype Ⅲ형과 Ⅳ형을 구별할 수 있는 HCV 항체의 간편한 측정법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면 HCV의 genotype Ⅰ형과 Ⅱ형 및 genotype Ⅲ형과 Ⅳ형을 구별할 수 있으며 또한 교차 반응 내지 비특이 반응이 억제되는 HCV 항체의 측정법이 제공된다.
또한 본 발명에 따르면 HCV의 genotype I형과 II형 및 gentype III형과 IVgud을 구별할 수 있는 저비용의 HCV항체의 측정법이 제공된다.

Claims (10)

  1. 하기 서열 1에 함유된 아미노산 서열로서, 연속된 6개 이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 함유함을 특징으로 하는 항원 펩타이드 화합물.
    서열 1
    Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro
  2. 하기 서열 2에 함유된 아미노산 서열로서, 연속된 6개 이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 함유함을 특징으로 하는 항원 펩타이드 화합물.
    서열 2
    Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Asp-Arg-Arg-Ser-Thr-Gly-Lys-Ser-Trp-Gly-Lys-Pro
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학적 수법을 사용하여 제조하는 항원 펩타이드 화합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전공학적 수법을 사용하여 제조하는 항원 펩타이드 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 따르는 항원 펩타이드를 담체에 결합시키고 항원-항체 반응을 이용하여 펩타이드에 검체 속의 HCV 항체를 결합시킨 다음, 항원-항체 반응을 이용하여 HCV 항체에 표지 리간드를 결합시킴으로써 검체 속의 HCV 항체를 측정함을 특징으로 하는 HCV 항체의 면역학적 측정법.
  6. 제5항에 있어서, 표지 리간드로서 효소로 표지한 리간드를 사용하는 HCV항체의 면역학적 측정법.
  7. 제5항에 있어서, 표지 리간드로서 방사선 물질로 표지한 리간드를 사용하는 HCV 항체의 면역학적 측정법.
  8. 제5항에 있어서, 표지 리간드로서 형광 물질로 표지한 리간드를 사용하는 HCV 항체의 면역학적 측정법.
  9. 제5항에 있어서, 제1항 또는 제2항에 따르는 항원 펩타이드로부터 선택된 두 가지 이상의 항원 펩타이드를 사용하여 HCV의 세로타입(serotype)을 판정하는 HCV 항체의 면역학적 측정법.
  10. 제5항에 있어서, 제1항 또는 제2항에 따르는 HCV의 core영역 및 NS4 영역과 NS5 영역에 대응하는 항원 펩타이드로부터 선택된 상이한 영역에 대응하는 둘 이상의 항원 텝타이드를 사용하여 HCV의 세로타입(serotype)을 판정하는 HCV 항체의 면역학적 측정법.
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