ES2596753T3 - Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo - Google Patents

Abstract

Un VHC aislado caracterizado en que la distancia filogenética del fragmento NS5B de 340 pb de dicho VHC aislado es menor que o igual a 0,328 de uno de las siguientes secuencias de ácido nucleico; (i) un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o 2; en donde dicha distancia filogenética se mide en el entorno de dos parámetros de Kimura.

Description

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(i)

una secuencia de ácido nucleico definida por SEQ ID NO: 1, 2, 9, 10 o 16 en donde SEQ ID NO: 1 y 9 y SEQ ID NO: 2, 10 y 16 representan cada una un subtipo diferente de dicho genotipo de VHC;

(ii)

una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína definida por SEQ ID NO: 3, 4 o 17;

(iii) una secuencia de ácido nucleico que es el complemento de una secuencia de ácido nucleico de (i) o (ii);

(iv) una secuencia de ácido nucleico que hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) en condiciones rigurosas;

en donde dicho ácido nucleico es ADN, ADNc o un ácido nucleico sintético, o en donde dicho ácido nucleico es ARN en donde “T” se sustituye por “U”.

En el presente documento SEQ ID NO: 1, 2 y 16 son secuencias de ácido nucleico de NS5B de dos aislados individuales de VHC que se ajustan en el nuevo clado identificado en la presente invención. SEQ ID NO: 9 y 10 son secuencias de ácido nucleico de la región no codificante en 5’ de dichos aislados de VHC. SEQ ID NO: 3, 4 y 17 son las secuencias de aminoácidos de NS5B derivadas de SEQ ID NO: 1, 2 y 16, respectivamente.

Se describen además en el presente documento oligonucleótidos que comprenden al menos 8 nucleótidos contiguos tomados de una secuencia de ácido nucleico de VHC como se describe en el presente documento y en donde dicho oligonucleótido comprende al menos un nucleótido que es diferente de cualquier secuencia de ácido nucleico de VHC de un VHC de clados 1 a 6 o diferente de cualquier secuencia de ácido nucleico de VHC de un genotipo o subtipo de VHC de los clados 1 a 6.

Dicho oligonucleótido puede ser un cebador capaz de dirigir la amplificación específica de una secuencia de ácido nucleico de VHC. Alternativamente, dicho oligonucleótido puede ser una sonda capaz de hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico de VHC según la invención. En una alternativa adicional, dicho oligonucleótido es capaz de detectar específicamente una secuencia de ácido nucleico de VHC según la invención.

Cualquiera de las secuencias de ácido nucleico u oligonucleótidos descritos en el presente documento pueden comprender además de los monómeros de ácido ribonucleico o monómeros de ácido desoxirribonucleico: una o más bases nucleotídicas modificadas, uno o más nucleótidos marcados, uno o más monómeros de ácido péptido nucleico, uno o más monómeros de ácido nucleico bloqueado, y/o el esqueleto de dicho ácido nucleico u oligonucleótidos puede estar modificado.

Con “al menos 1 nucleótido diferente de cualquier ácido nucleico de VHC de un VHC de los clados 1 a 6” se quiere decir un ácido nucleico de VHC según la invención que tiene en cualquier lugar en su secuencia de ácido nucleico al menos 1 nucleótido que es diferente del nucleótido correspondiente en una secuencia de un VHC de cualquier genotipo, subtipo o aislado de un VHC que se clasifica en cualquiera de los clados conocidos 1 a 6. “Nucleótido correspondiente” en este contexto se refiere a un nucleótido en la misma posición relativa en el genoma de VHC (se indique como ARN o ADN) en donde la posición relativa considera las inserciones y/o deleciones específicas de genotipo, subtipo o aislado que posiblemente se produzcan (véase, por ejemplo, la sección sobre Genotype-specific insertion y deletions en la página 198 de Maertens y Stuyver, 1997); un nucleótido correspondiente también puede estar presente en un ácido nucleico que es el complemento del ácido nucleico con el que se hace la comparación. Las diferencias entre secuencias de nucleótidos las puede determinar fácilmente el experto en la materia, por ejemplo, después de alinear dichas secuencias. Equivalentes de o alternativas para “al menos 1 nucleótido diferente de cualquier ácido nucleico de VHC de un VHC de los clados 1 a 6” incluyen “al menos 1 nucleótido que es específico a una secuencia de ácido nucleico de VHC de la presente invención” o “al menos 1 nucleótido que es único a una secuencia de VHC de la presente invención”. Un equivalente o alternativa adicional incluye “al menos 1 nucleótido específico de genotipo” en donde específico de genotipo se refiere a la especificidad o unicidad de un nucleótido respecto a una secuencia de nucleótidos de un genotipo de VHC del recién identificado clado de VHC de la presente invención que es diferente de cualquiera de los clados de VHC 1 a 6. El término “específico de genotipo” generalmente se acepta como que puede, por ejemplo, estar derivado del documento EP 0 637 342 B1 o cualquiera de los documentos US 6.548.244, US 5.882.852 o US 5.514.539. Los términos “diferente de” o “único a”, “específico a”, “correspondiente” descritos anteriormente en relación de nucleótidos son igualmente válidos en relación a aminoácidos. El experto en la materia entenderá que esto implica intercambiar en la explicación anterior “nucleótido” por “aminoácido”, “secuencia de ácido nucleico” por “secuencia de aminoácidos”, “ácido nucleico” por “proteína”, etc. Los nucleótidos/aminoácidos únicos o específicos como se ha esbozado anteriormente se pueden producir como un único nucleótido/aminoácido o en un conjunto de nucleótidos/aminoácidos específicos para una secuencia de ácido nucleico/aminoácidos de cualquiera de los nuevos tipos de VHC identificados en la presente invención. Los nucleótidos/aminoácidos específicos o únicos de dicho conjunto pueden formar una secuencia contigua o pueden estar dispersos en una región mayor de una secuencia de ácido nucleico/aminoácidos de cualquiera de los nuevos tipos de VHC identificados en la presente invención.

Se pretende que un “nucleótido” incluya cualquier nucleótido natural, así como cualquier nucleótido modificado en donde dicha modificación se puede producir en la base nucleotídica o el azúcar nucleotídico. Cualquiera de las modificaciones se puede introducir en un ácido nucleico u oligonucleótido para aumentar/disminuir la estabilidad y/o reactividad de ácido nucleico u oligonucleótido y/o para otros fines tal como marcaje del ácido nucleico u

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oligonucleótido. Los nucleótidos modificados incluyen fosforotioatos, alquilfosforotioatos, metilfosfonato, fosforamidato, monómeros de ácido péptido nucleico y monómeros de ácido nucleico bloqueado.

Un ácido polinucleico, ácido nucleico y oligonucleótido pueden ser de origen genómico, puede ser ADN, ARN, ADNc, puede ser el producto de síntesis química, puede comprender nucleótidos modificados, o puede ser híbridos de ADN y/o ARN y/o nucleótidos modificados. Un ácido polinucleico, ácido nucleico puede ser mono-o bicatenario o puede ser un ácido nucleico que forma un triplex.

Se pretende que “amplificación de ácido nucleico” incluya todos los métodos que producen la multiplicación del número de un ácido nucleico diana. Los métodos de amplificación de la secuencia de nucleótidos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, amplificación de ADN), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA; amplificación de ADN), sistema de amplificación basado en transcripción (TAS; amplificación de ARN), replicación de secuencia autosostenida (3SR; amplificación de ARN), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA; amplificación de ARN), amplificación mediada por transcripción (TMA; amplificación de ARN), amplificación mediada por Qbeta replicasa y transcripción run-off. Durante la amplificación, los productos amplificados se pueden marcar convenientemente usando cebadores marcados o incorporando nucleótidos marcados. Los marcadores pueden ser isotópicos (32P, 35S, etc.) o no isotópicos (biotina, digoxigenina, etc.).

La técnica de amplificación de secuencia de nucleótidos más ampliamente extendida es la PCR. Básicamente, dos cebadores, uno sentido y otro antisentido, hibridan a un sustrato de ADN desnaturalizado y se extienden por una ADN polimerasa termoestable. La última permite la ciclación térmica rápida y repetida (desnaturalización/hibridación/extensión en PCR de tres pasos; desnaturalización/hibridación + extensión en PCR de dos pasos). El ADN diana se amplifica exponencialmente. La reacción de amplificación se repite entre 20 y 70 veces, ventajosamente entre 25 y 45 veces. Muchos métodos se basan en PCR incluyendo AFLP (polimorfismo de longitud de fragmento amplificado), IRS-PCR (PCR de secuencia repetitiva intercalada), iPCR (PCR inversa), RAPD (amplificación rápida de ADN polimórfico), RT-PCR (transcripción inversa PCR), y PCR en tiempo real. La RT-PCR se puede realizar con una única enzima termoestable que tiene actividad tanto de transcriptasa inversa como de ADN polimerasa (Myers et al. 1991). Alternativamente, es posible una reacción en un único tubo con dos enzimas (transcriptasa inversa y ADN polimerasa termoestable) (Cusi et al., 1994).

El término “oligonucleótido” se pretende que incluya todas las moléculas de ácido nucleico que comprenden o consisten en una parte de los ácidos nucleicos del VHC según la invención. El límite de tamaño inferior de un oligonucleótido es un ácido nucleico que comprende o consiste en al menos 5 nucleótidos contiguos de los ácidos nucleicos del VHC según la invención. Por tanto, un oligonucleótido puede comprender o consistir en al menos y/o comprender o consistir en hasta 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 o más nucleótidos contiguos de un ácido nucleico del VHC según la invención.

Un “cebador capaz de dirigir la amplificación específica de un ácido nucleico” es el al menos un oligonucleótido en una mezcla de reacción de amplificación de ácido nucleico que se requiere para obtener amplificación específica de un ácido nucleico diana. La amplificación del ácido nucleico puede ser lineal o exponencial y puede producir un ácido nucleico único amplificado de un ácido nucleico mono-o bicatenario o puede producir ambas hebras de un ácido nucleico bicatenario. La especificidad de un cebador en dirigir la amplificación de un ácido nucleico se puede mejorar introduciendo nucleótidos modificados en dicho cebador. El hecho de que un cebador no tenga que coincidir exactamente con el molde correspondiente o secuencia diana para garantizar la amplificación específica de dicho molde o secuencia diana está ampliamente documentado en la bibliografía (por ejemplo: Kwok et al. 1990). Se han aplicado cebadores tan cortos como de 8 nucleótidos de longitud con éxito en dirigir la amplificación específica de una molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, Majzoub et al., 1983).

Una “sonda capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico” es un oligonucleótido que hibrida principalmente con una secuencia de ácido nucleico específica en una mezcla de muchas secuencias diferentes de ácidos nucleicos. La hibridación específica pretende producir, tras la detección de los híbridos específicamente formados, en una proporción de señal respecto a ruido (en donde la señal representa la hibridación específica y el ruido representa la hibridación inespecífica) suficientemente alta para permitir la detección inequívoca de dichos híbridos específicos. En un caso específico la hibridación específica permite la distinción de hasta un mal apareamiento de un único nucleótido entre la sonda y los ácidos nucleicos diana. Las condiciones que permiten la hibridación específica generalmente son condiciones rigurosas, pero obviamente se pueden variar dependiendo de la complejidad (tamaño, contenido en GC, identidad global, etc.) de la(s) sonda(s) y/o las moléculas de ácido nucleico. La especificidad de una sonda en hibridar con un ácido nucleico se puede mejorar introduciendo nucleótidos modificados en dicha sonda.

Un oligonucleótido como se describe en el presente documento puede comprender además una modificación para unir dicho oligonucleótido a un soporte sólido. Dicha modificación puede ser, por ejemplo, modificación con amina, tiol, 3’-propanolamina o acridita del oligonucleótido o puede comprender la adición de una cola homopolimérica (por ejemplo, una cola de oligo(dT) añadida enzimáticamente a través de una enzima transferasa terminal o añadida

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bucle de la horquilla con el ADN diana amplificado. Este tipo de sonda/cebador en horquilla se conoce como cebadores escorpión (Whitcombe et al. 1999). Otro tipo especial de sonda es una sonda candado (o sonda circularizable o sonda de circulo abierto o sonda C) que se usan en RCA (amplificación en círculo rodante). La técnica de huellas CFLP ya se ha aplicado para realizar genotipado de VHC (Sreevatsan et al. 1998). Una alternativa química para CFLP o NIRCA es el ensayo CCM (corte químico de mal apareamiento).

Los métodos de secuenciación de ADN incluyen el protocolo de Maxam y Gilbert, la reacción de Sanger (reacción de terminación de la cadena con didesoxinucleótido) y modificaciones de la misma, pirosecuenciación, secuenciación en ciclo, SBH (secuenciación por hibridación). Una variación del procedimiento de minisecuenciación es GBA (Genetic Bit Analysis).

Otros métodos de secuenciación de ADN incluyen secuenciación por resonancia molecular que usa ionización de electrospray (ESI) combinada con espectrometría de masas por resonancia de ciclotrón iónico por transformada de Fourier (FTICR) (Smith et al., 1994) y, para fragmentos de ADN más pequeños, MALDI-TOF MS). También se ha descrito la secuenciación diagnóstica combinando corte específico de ADN seguido por análisis por espectrometría de masas de los fragmentos (véase, por ejemplo, Stanssens y Zabeau 2000 – documento WO00/66771).

En el futuro próximo, la secuenciación por nanoporos también podría estar disponible (Meller et al., 2000).

Para analizar el polimorfismo de secuencia de nucleótidos en moléculas diana de ARN, se pueden usar tanto ribozimas (ribozimas de tipo cabeza de martillo, horquilla, intrón de grupo I, ribonucleasa P o viral de hepatitis delta)

o desoxirribozimas (‘ADNzimas’). Esta característica es además la base para el posible uso de estas enzimas como agentes terapéuticos o en terapia génica (Cairns et al., 2000; James et al., 1995).

La metodología de secuenciación de ADN conocida como SBH o secuenciación por hibridación usa una matriz de todos los posibles oligómeros de n nucleótidos (n-meros) para identificar dichos n-meros comprendidos en una muestra de ADN desconocida (Drmanac et al., 1993). Tales matrices de oligonucleótidos de alta densidad son útiles para detectar polimorfismos de secuencia de ADN también, la matriz volviéndose eventualmente una VDA (matriz detectora de variantes) (Sapolsky et al., 1999; Hacia et al., 1996). Se pueden sustituir portaobjetos de microscopio por fibras ópticas como soporte sólido para los oligonucleótidos (Haley et al. 1997). Una variación del SBH anteriormente descrito se basa en hibridación en solución de sondas con una región de información conocida o etiquetas de información con los fragmentos de ADN diana que se van a secuenciar. La etiqueta de información puede ser un código de barras de ADN (que comprende eventualmente bases modificadas), un código de barras molecular o un código de barras de nanopartículas y forma la base para la identificación y caracterización del ADN diana hibridado (Drmanac 2000 – documento WO/0056937). Dichas matrices de oligonucleótidos de alta densidad o chips de ADN suprimen la necesidad de diseñar un conjunto de oligonucleótidos que hibridan específicamente en las mismas condiciones a un conjunto de secuencias nucleotídicas polimórficas. El último enfoque se aplica en ensayos de transferencia inversa convencional ajustando cuidadosamente la longitud, polaridad y posición del/de los nucleótido(s) mal apareado(s) en la sonda de oligonucleótidos (Sakai et al., 1989). Los ensayos de hibridación de transferencia inversa convencionales para el genotipado y detección de polimorfismos de secuencia de nucleótidos se han comercializado con éxito, por ejemplo, en el formato LiPA (ensayo de sonda en línea) (Innogenetics, Gante, Bélgica) (Stuyver et al., 1997; Stuyver et al., 1996).

Alternativamente, las sondas de oligonucleótidos modificadas con Acrydite™ se copolimerizan en un gel de poliacrilamida. Los objetivos de ADN diana monocatenarios se someten a electroforesis a través de dicho gel y, dependiendo de las condiciones de electroforesis (temperatura y/o desnaturalizante), son capturadas por los oligonucleótidos inmovilizados en una capa de gel de captura. Este método también es aplicable para detectar polimorfismos de secuencia de nucleótidos (Kenney et al., 1998).

Otros métodos basados en hibridación para detectar polimorfismos de secuencia de nucleótidos incluyen el ensayo de hibridación sándwich en fase solución en el que ADN diana es capturado por una sonda de captura inmovilizada específica de diana y detectado a través de una sonda amplificadora o enlazadora. Se han descrito dos métodos de generación de señal. El primero utiliza un oligonucleótido ramificado que hibrida con la solapa de la sonda enlazadora que no se une al ADN diana. Posteriormente, una sonda marcada hibrida con las ramas de la sonda amplificadora y la cantidad de marcador unido se cuantifica. En un segundo método, una sonda amplificadora (parcialmente) bicatenaria hibrida con la solapa de la sonda enlazadora que no se une al ADN diana. La (parte) bicatenaria de dicha sonda amplificadora comprende un promotor reconocido por una ARN polimerasa dependiente de ADN. La señal generada se forma por el ARN recién transcrito de la sonda amplificadora, cuya cantidad se cuantifica (véase, por ejemplo, Urdea 1991 – Documento WO91/10746).

Estará claro para el experto en la materia que se pueden hacer muchas variaciones y combinaciones a los métodos de detección de secuencia de nucleótidos y de polimorfismo de secuencia de nucleótidos descritos anteriormente. Estos se incorporan por este medio en la presente invención.

Los oligonucleótidos como se han descrito anteriormente se pueden adaptar de modo que se puedan usar en cualquiera de los métodos como se ha descrito anteriormente para la detección de las secuencias de nucleótidos del

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(v)

inferir, a partir de la señal de distinción detectada en el paso (iv), y/o de la secuencia de nucleótidos obtenida en (i), la presencia de dicho virus VHC en dicha muestra biológica y/o el genotipo de dicho virus VHC presente en dicha muestra biológica.

También se describen en el presente documento métodos que comprenden:

(i)

obtener un ácido nucleico de VHC diana de una muestra biológica sospechosa de contener un ácido nucleico de VHC o fragmento del mismo como se ha descrito en el presente documento;

(ii)

poner en contacto el ácido nucleico de VHC diana de (i) con un oligonucleótido como se ha descrito en el presente documento, y dicho contacto genera una señal de distinción;

(iii) inferir, a partir de la señal de distinción obtenida en (ii), la presencia de un ácido nucleico de VHC o fragmento del mismo como se ha descrito en el presente documento y, a partir de ello, la presencia de un virus VHC en dicha muestra biológica y/o el genotipo de dicho virus VHC presente en dicha muestra biológica.

En los últimos métodos, dicha distinción en (ii) se puede basar en hibridación y dicha señal de distinción en (iii) es entonces una señal de hibridación. Además, el oligonucleótido como se ha descrito en el presente documento puede ser capaz de distinguir al menos un nucleótido específico de genotipo o específico presente en dicho ácido nucleico de VHC diana o capaz de distinguir al menos un oligonucleótido específico a dicho ácido nucleico de VHC diana.

Con un “oligonucleótido capaz de distinguir, en un ácido (poli)nucleico al menos un nucleótido específico de genotipo

o específico” se quiere decir un oligonucleótido que da una señal cuando se pone en contacto con un ácido (poli)nucleico que comprende dicho al menos un nucleótido específico de genotipo o específico pero que no da una señal cuando se pone en contacto con un ácido nucleico que no comprende dicho al menos un nucleótido específico de genotipo o específico. Dicha señal, también denominada “señal de distinción”, puede ser cualquier señal obtenible usando dicho oligonucleótido en cualquiera de los ensayos capaces de detectar secuencias de nucleótidos y polimorfismos de secuencias de nucleótidos como se ha descrito anteriormente. Dichas señales incluyen, por ejemplo, señales fluorescentes, señales (quimio)luminiscentes, señales radioactivas, señales de luz, señales de hibridación, señales de espectrometría de masas, señales espectrométricas, señales cromatográficas, señales eléctricas, señales electrónicas, señales electroforéticas, señales de PCR en tiempo real, señales de PCR, señales de LCR, señales de ensayo CFLP y señales de ensayo Invader™. Dicha señal implica una proporción de señal respecto a ruido suficientemente alta como se ha esbozado anteriormente.

Con “poner en contacto un oligonucleótido con un ácido (poli)nucleico” generalmente se quiere decir apareamiento de dicho oligonucleótido con dicho ácido (poli)nucleico o hibridar dicho oligonucleótido con dicho ácido (poli)nucleico. “Poner en contacto un oligonucleótido con un ácido (poli)nucleico” no excluye y, por tanto, puede comprender además la modificación enzimática de dicho oligonucleótido en donde dicha modificación se puede producir en los extremos de dicho oligonucleótido y/o internamente en la secuencia de nucleótidos de dicho oligonucleótido. Los ejemplos de modificaciones enzimáticas de oligonucleótidos, por ejemplo, se aplican en varios de los ensayos capaces de detectar secuencias de nucleótidos y polimorfismos de secuencia de nucleótidos descritos en el presente documento.

Dichos métodos pueden además comprender, donde sea aplicable, alinear y/o comparar la secuencia de ácido nucleico obtenida con un conjunto de secuencias de ácido nucleico de VHC contenidas en una base de datos.

Con “base de datos” se quiere decir en el presente contexto una colección de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, más específicamente de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de VHC. Se debe entender que una base de datos comprende al menos un ácido nucleico o al menos una secuencia de aminoácidos. Una base de datos se puede registrar en una variedad de soportes. Tales soportes incluyes soportes legibles por ordenador.

La comparación de secuencias, por ejemplo, la determinación del porcentaje de identidad entre secuencias, y el alineamiento de secuencias se puede realizar usando un algoritmo matemático. La determinación del porcentaje de identidad entre secuencias se basa en un alineamiento previo de secuencias. El porcentaje de identidad (y similitud) entre secuencias se puede determinar usando, por ejemplo, el programa GAP (parte del software GCG, Genetics Computer Group; ahora disponible a través de Accelrys en http://www.accelrys.com). Los alineamientos entre secuencias se pueden hacer, por ejemplo, usando el algoritmo ClustalW (por ejemplo, parte del software GCG o parte del software VNTI distribuido por InforMax Inc.). Un alineamiento habitualmente es un alineamiento con huecos, es decir, se permite la introducción de huecos en una secuencia para optimizar el alineamiento. No se ha desarrollado una teoría estadística detallada para alineamientos con huecos, y los mejores costes de hueco para usar con una matriz de sustitución determinada se tienen que determinar empíricamente. Estos algoritmos hacen uso de matrices de sustitución de aminoácidos para detectar similitudes entre secuencias que han divergido (Altschul, 1991). Las matrices de sustitución también se han aplicado a comparación de secuencias de ADN (States et al., 1991). Estará claro para el experto en la materia que la eficacia de alinear residuos de aminoácidos similares también determina el porcentaje de identidad entre secuencias. Una matriz de sustitución comúnmente usada es la matriz BLOSUM62. Para alineamientos particularmente largos y débiles, se puede usar la matriz BLOSUM45. Para alineamientos de secuencias cortas, se pueden usar las matrices PAM (porcentaje de mutación aceptada) más viejas (por ejemplo, PAM30, PAM70). Un buen alineamiento de secuencias con una distancia evolucionaria mayor

se puede obtener usando una matriz de sustitución PAM con un número mayor (por ejemplo, usando PAM100 en lugar de PAM40). El número después de la matriz BLOSUM (por ejemplo, BLOSUM62) se refiere a porcentaje de identidad mínimo de los bloques usados para construir la matriz; números mayores son distancias menores. Se puede buscar contra una base de datos usando una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de interés como 5 ‘secuencia problema’. Los algoritmos para hacer búsquedas en bases de datos habitualmente se basan en el software BLAST (Altschul et al., 1990) y comprenden: 1) BLASTN, para hacer una búsqueda de una secuencia problema de ácido nucleico contra una base de datos de ácidos nucleicos; 2) BLASTP, para hacer una búsqueda de una secuencia problema de aminoácidos contra una base de datos de aminoácidos; 3) BLASTX, para hacer una búsqueda de una secuencia problema de ácido nucleico traducido (traducciones en los seis posibles marcos) contra

10 una base de datos de secuencias de aminoácidos; y 4) TBLASX, para hacer una búsqueda de una secuencia problema de ácido nucleico traducido (traducciones en los seis posibles marcos) contra una base de datos de secuencias de ácido nucleico traducido (traducciones en los seis posibles marcos). Para secuencias problema cortas, el umbral de valor esperado preferiblemente se ajusta alto, por ejemplo, a 1000 para secuencias de nucleótidos y a 20000 para secuencias de aminoácidos.

15 También se describe en el presente documento un método para la detección de ácidos nucleicos de VHC presentes en una muestra biológica, que comprende:

(i) opcionalmente extraer el ácido nucleico de la muestra, 20 (ii) amplificar el ácido nucleico con al menos un cebador como se ha definido en el presente documento,

(iii) detectar los ácidos nucleicos amplificados.

También se describe en el presente documento un método para la detección de ácidos nucleicos de VHC presentes en una muestra biológica, que comprende:

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(i)

opcionalmente extraer el ácido nucleico de la muestra,

(ii)

opcionalmente amplificar el ácido nucleico con al menos un cebador como se ha definido en el presente documento, y/o con un cebador universal de VHC,

(iii) hibridar los ácidos nucleicos de la muestra biológica, opcionalmente en condiciones desnaturalizantes, en las

30 condiciones apropiadas con una o más sondas como se ha definido en el presente documento, estando dichas sondas preferiblemente unidas a un sustrato sólido,

(iv)

opcionalmente lavar en las condiciones apropiadas,

(v)

detectar los híbridos formados.

35 También se describe en el presente documento un método para la detección de ácidos nucleicos de VHC presentes en una muestra biológica, que comprende:

(i) opcionalmente extraer el ácido nucleico de la muestra,

(ii) determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico de tipo VHC según la invención por medio de 40 secuenciación del ácido nucleico de VHC presente en dicha muestra biológica.

También se describe en el presente documento un método para detectar la presencia de uno o más genotipos de VHC presentes en una muestra biológica que comprende:

45 (i) opcionalmente extraer el ácido nucleico de la muestra,

(ii) específicamente amplificar el ácido nucleico con al menos un cebador como se ha definido en el presente documento,

(iii) detectar dichos ácidos nucleicos amplificados,

(iv) inferir la presencia de uno o más genotipos de VHC presentes del patrón de productos amplificados 50 observado.

También se describe en el presente documento un método para detectar la presencia de uno o más genotipos de VHC presentes en una muestra biológica que comprende:

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(i)

opcionalmente extraer el ácido nucleico de la muestra,

(ii)

opcionalmente amplificar el ácido nucleico con al menos un cebador como se ha definido en el presente documento, y/o con un cebador universal de VHC,

(iii) hibridar los ácidos nucleicos de la muestra biológica, opcionalmente en condiciones desnaturalizantes, en las

60 condiciones apropiadas con una o más sondas como se ha definido en el presente documento, estando dichas sondas preferiblemente unidas a un sustrato sólido,

(iv)

opcionalmente lavar en las condiciones apropiadas,

(v)

detectar los híbridos formados,

(vi) inferir la presencia de uno o más genotipos de VHC presentes del patrón de hibridación observado. 65

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También se describe en el presente documento un método como se ha definido en el presente documento, en donde dichas sondas se caracterizan además como se ha definido en el presente documento.

En cualquiera de los métodos anteriores, la muestra biológica es sospechosa o propensa a contener VHC o sus ácidos nucleicos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit diagnóstico para detectar la presencia de un virus VHC en una muestra biológica y/o para determinar el genotipo de un virus VHC presente en una muestra biológica, dicho kit comprende al menos un medio para detectar la presencia de un ácido nucleico de VHC según la invención.

Tales kits diagnósticos comprenden, por ejemplo, al menos un ácido nucleico y/u oligonucleótido (sonda o cebador) como se ha descrito en el presente documento. Tales ácidos nucleicos y/u oligonucleótidos pueden estar unidos a un soporte sólido. Alternativamente, una gama de tales ácidos nucleicos y/u oligonucleótidos se unen o acoplan a localizaciones específicas en el soporte sólido, por ejemplo, en la forma de líneas paralelas. Un soporte sólido ejemplar es una membrana.

También descrito en el presente documento, dicho kit diagnóstico comprende además al menos uno de:

-un medio para obtener la secuencia de ácido nucleico de un ácido nucleico de VHC diana de una muestra biológica sospechosa de contener un ácido nucleico u oligonucleótido de VHC como se ha descrito en el presente documento; o

-un medio para inferir, de la secuencia de ácido nucleico obtenida del ácido nucleico de VHC diana, la presencia de un ácido nucleico único respecto a un ácido nucleico de VHC según la invención, o la presencia de al menos un nucleótido específico de genotipo o específico en el mismo, y, de ello, la presencia en dicha muestra biológica de un VHC y/o el genotipo de dicho VHC.

También descrito en el presente documento, dicho kit diagnóstico comprende un oligonucleótido capaz de distinguir, en dicho ácido nucleico de VHC, al menos un nucleótido específico de genotipo o específico.

También descrito en el presente documento, dicho kit diagnóstico comprende además un medio para detectar la señal de distinción obtenida al poner en contacto el ácido nucleico de VHC obtenido de una muestra biológica y el/los ácido(s) nucleico(s) y/u oligonucleótido(s) como se describe en el presente documento.

También descrito en el presente documento, dicho kit diagnóstico comprende o comprende además al menos uno de:

-un medio para obtener un ácido nucleico de VHC diana presente en dicha muestra biológica y/u obtener la secuencia de nucleótidos del mismo; -al menos un cebador oligonucleotídico capaz de dirigir la amplificación específica de un ácido nucleico de VHC o fragmento del mismo como se describe en el presente documento;

-un par de oligonucleótidos adecuados para la amplificación de un ácido nucleico de VHC diana según la invención en donde dicho par comprende al menos un cebador oligonucleotídico capaz de dirigir la amplificación específica de un ácido nucleico de VHC o fragmento del mismo como se describe en el presente documento;

-un medio para desnaturalizar ácidos nucleicos; -al menos un oligonucleótido como se describe en el presente documento; -una enzima capaz de modificar una molécula de ácido nucleico bicatenario o monocatenario; -un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón; -una solución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha solución; -un medio para detectar ácidos nucleicos parcial o completamente desnaturalizados y/o un medio para

detectar híbridos formados en la hibridación anterior y/o un medio para detectar modificaciones enzimáticas

de ácidos nucleicos, en donde dicho medio produce una señal de distinción; -un medio para unir un oligonucleótido a una localización conocida en un soporte sólido; -un medio para inferir de una señal de distinción detectada, y/o de la secuencia de nucleótidos obtenida, la

presencia de un ácido nucleico de VHC según la invención, o la presencia de al menos un nucleótido específico de genotipo o específico en el mismo, y, a partir de ello, la presencia de dicho virus VHC en dicha muestra biológica y/o el genotipo de dicho virus VHC presente en dicha muestra biológica.

Con “un medio para inferir, a partir de una secuencia de ácido nucleico, la presencia de un nucleótido específico de genotipo o específico” se quiere decir cualquier técnica o método para localizar e identificar en dicha secuencia de ácido nucleico dicho nucleótido específico de genotipo o específico. Dicho medio puede incluir un método realizado manualmente, o realizado computacionalmente, o realizado manual y/o computacionalmente. Dicho método puede incluir alinear y/o comparar una secuencia de ácido nucleico obtenida con un conjunto de secuencias de ácido nucleico contenidas en una base de datos. Dicho medio puede incluir además el resultado del método que se presenta en la forma de un informe en donde dicho informe puede estar en forma de papel, en forma electrónica o en un soporte o medio legible por ordenador. Dicho medio puede incluir además hacer búsquedas de bases de

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datos de secuencias (de ácidos nucleicos y/o aminoácidos) y/o la creación de alineamientos de secuencias (de ácidos nucleicos y/o aminoácidos), cuyos resultados pueden o no estar incluidos en dicho informe. Dicho medio puede incluir además un dispositivo para detectar una señal de distinción, o un prospecto de kit o un gráfico del kit que indica cómo interpretar una señal de distinción detectada o que indica dónde debe aparecer una señal de distinción, por ejemplo, en un soporte sólido que porta múltiples oligonucleótidos que se pueden organizar como manchas, líneas, puntos, etc., y posiblemente interpretar dicha señal de distinción que se produce en una localización específica.

La invención también considera el uso de un ácido nucleico u oligonucleótido como se divulga en el presente documento en un método diagnóstico para detectar la presencia de un VHC en una muestra biológica y/o para determinar el genotipo de dicho VHC.

La invención también considera el uso de un ácido nucleico u oligonucleótido como se divulga en el presente documento para la fabricación de un kit diagnóstico para detectar la presencia de un VHC en una muestra biológica y/o para determinar el genotipo de dicho VHC.

El término “ácido nucleico” también se puede denominar hebra de analito y corresponde a una molécula de ácido nucleico monocatenario o bicatenario. Esta hebra de analito es preferentemente ARN de hebra positiva o negativa, ADNc o ADNc amplificado.

El término “cebador universal de VHC” se refiere a secuencias de oligonucleótidos complementarias a cualquiera de las regiones conservadas en los genomas de VHC de la mayoría o todos los genotipos de VHC.

La expresión “condiciones de hibridación y lavado apropiadas” se debe entender como rigurosas y generalmente se conocen en la técnica (por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Sin embargo, según la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas se deben hibridar a su temperatura apropiada para obtener suficiente especificidad. Para permitir que la hibridación se produzca, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan térmica, química (por ejemplo, por NaOH) o electroquímicamente para fundir una doble hélice en dos hebras individuales y/o para eliminar horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influida por condiciones tales como temperatura, concentración de sal y composición del tampón de hibridación. Las condiciones de alta rigurosidad para hibridación incluyen alta temperatura y/o baja concentración de sal (las sales incluyen NaCl y citrato Na3) y/o la inclusión de formamida en el tampón de hibridación y/o disminuir la concentración de compuestos tal como SDS (detergente) en el tampón de hibridación y/o la exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilenglicol (que fomentan la aglomeración molecular) del tampón de hibridación. Las condiciones de hibridación convencionales se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989) pero el experto en la materia apreciará que se pueden diseñar numerosas condiciones de hibridación diferentes en función de la homología conocida o esperada y/o la longitud de la secuencia de ácido nucleico. Generalmente, se recomienda para hibridaciones con sondas de ADN sin formamida, una temperatura de 68ºC, y para hibridaciones con formamida, 50% (v/v) una temperatura de 42ºC. Para hibridaciones con oligonucleótidos, las condiciones óptimas (concentración de formamida y/o temperatura) dependen de la longitud y composición de bases de la sonda y se deben determinar individualmente. En general, la hibridación óptima para oligonucleótidos de aproximadamente 10 a 50 bases de longitud se produce aproximadamente 5ºC por debajo de la temperatura de fusión para un dúplex determinado. La incubación a temperaturas por debajo de la óptima puede permitir que secuencias mal apareadas hibriden y por tanto puede producir especificidad reducida. Cuando se usan oligonucleótidos de ARN con formamida (50%, v/v) se recomienda usar una temperatura de hibridación de 68ºC para la detección de ARN diana y de 50ºC para la detección de ADN diana. Alternativamente, se puede utilizar una solución de hibridación con alto SDS (Church et al., 1984). La especificidad de hibridación se puede además asegurar mediante la presencia de una fracción entrecruzadora en la sonda de ácido nucleico (por ejemplo, Huan et al. 2000 – documento WO00/14281). Dicha fracción entrecruzadora permite la unión covalente de la sonda de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos diana y por tanto permite condiciones de lavado rigurosas. Tal sonda de ácido nucleico de entrecruzamiento puede además comprender otro marcador adecuado para la detección/cuantificación de la sonda hibridada con la diana.

El término “marcado” se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados. Esto puede incluir el uso de nucleótidos marcados incorporados durante el paso de polimerasa de la amplificación como ilustran Saiki et al. (1988) o Bej et al. (1990) o cebadores marcados, o por cualquier otro método conocido para el experto en la materia.

El proceso como se describe en el presente documento comprende los pasos de poner en contacto cualquiera de las sondas como se definen en el presente documento, con uno de los siguientes elementos:

-o bien una muestra biológica en la que los ácidos nucleicos se hacen disponibles para hibridación.

-o los ácidos nucleicos purificados contenidos en la muestra biológica,

-o una única copia derivada de los ácidos nucleicos purificados,

-o una copia amplificada derivada de los ácidos nucleicos purificados, estando dichos elementos o dichas

sondas unidos a un sustrato sólido.

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La expresión “inferir la presencia de uno o más genotipos de VHC presentes a partir del patrón de hibridación observado” se refiere a la identificación de la presencia de genomas de VHC en la muestra analizando el patrón de unión de un panel de sondas oligonucleotídicas. Las sondas únicas pueden proporcionar información útil respecto a la presencia o ausencia de genomas de VHC en una muestra. Por otra parte, la variación de los genomas de VHC está dispersa en la naturaleza, de modo que raramente cualquier sonda es capaz de identificar únicamente un genoma de VHC específico. Más bien, la identidad de un genotipo de VHC se puede inferir del patrón de unión a un panel de sondas oligonucleotídicas, que son específicas para (diferentes) segmentos de los diferentes genomas de VHC. Dependiendo de la elección de estas sondas oligonucleotídicas, cada genotipo de VHC conocido corresponderá a un patrón de hibridación específico tras el uso de una combinación específica de sondas. Cada genotipo de VHC también se podrá distinguir de cualquier otro genotipo de VHC amplificado con los mismos cebadores dependiendo de la elección de las sondas oligonucleotídicas. La comparación del patrón generado de sondas que hibridan positivamente para una muestra que contiene una o más secuencias de VHC desconocidas a un esquema de patrones de hibridación esperado, permite inferir claramente los genotipos de VHC presentes en dicha muestra.

También se describe en el presente documento un método como se define en el presente documento, en donde una o más sondas de hibridación son fragmentos oligonucleotídicos tomados de cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 9, 10 o 16 o variantes de secuencia de las mismas como se ha definido en el presente documento. En particular, dichas sondas oligonucleotídicas hibridan con cualquiera de, o al menos uno de SEQ ID NO: 11 a 15.

Para distinguir los genomas de VHC diana amplificados entre sí, los ácidos polinucleicos de VHC diana amplificados se hibridan con un conjunto de sondas de ADN específicas de secuencia que se dirigen a regiones de genotipo de VHC (regiones únicas) localizadas en los ácidos polinucleicos de VHC. La mayoría de estas sondas se dirigen a la mayoría de regiones específicas de tipo o subtipo de genotipos de VHC, pero algunas pueden hibridar con más de un genotipo de VHC. Dependiendo de solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.) estas sondas se deben hibridar rigurosamente a su temperatura apropiada para obtener suficiente especificidad. Sin embargo, modificando ligeramente las sondas de ADN, sea añadiendo o delecionando uno o unos pocos nucleótidos en sus extremos (sea 3’ o 5’), o sustituyendo algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no esenciales para distinguir entre tipos) por otros (incluyendo nucleótidos modificados o inosina) se puede producir que estas sondas o variantes de las mismas hibriden específicamente en las mismas condiciones de hibridación (es decir, la misma temperatura y la misma solución de hibridación). También cambiar la cantidad (concentración) de sonda usada puede ser beneficioso para obtener resultados de hibridación más específicos. Se debe indicar en este contexto, que sondas de la misma longitud, independientemente de su contenido en GC, hibridarán específicamente a aproximadamente la misma temperatura en soluciones TMACI, es decir, soluciones de sal de tetraalquilamonio (Jacobs et al., 1988). Los métodos de ensayo adecuados para los fines de la presente invención de detectar híbridos formados entre las sondas oligonucleotídicas y las secuencias de ácido nucleico en una muestra pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo conocidos en la técnica, tal como formato de transferencia en mancha convencional, hibridación en sándwich o hibridación inversa. Por ejemplo, la detección se puede lograr usando un formato de transferencia en mancha, la muestra amplificada sin marcar se une a una membrana, en la membrana se incorpora al menos una sonda marcada en condiciones de hibridación y lavado adecuadas, y la presencia de la sonda marcada se controla. Un método alternativo y preferido es un formato de transferencia en mancha “inverso”, en el que la secuencia amplificada contiene un marcador. En este formato, las sondas oligonucleotídicas no marcadas se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra marcada en condiciones de hibridación y posteriores de lavado rigurosas apropiadas. Se debe entender que también se puede usar cualquier otro método de ensayo que se base en la formación de un híbrido entre los ácidos nucleicos de la muestra y las sondas oligonucleotídicas como se describe en el presente documento.

Las sondas como se describen en el presente documento se pueden inmovilizar en un formato de ensayo de sondas en línea (LiPA). Este es un formato de hibridación inversa que usa tiras de membranas sobre las que varias sondas oligonucleotídicas (incluyendo oligonucleótidos control negativos o positivos) se pueden aplicar convenientemente como líneas paralelas. LiPA es una prueba de hibridación muy rápida y fácil de usar. Los resultados se pueden leer después de 4 horas después del inicio de la amplificación. Después de la amplificación durante la cual habitualmente se incorpora un marcador no isotópico en el producto amplificado, y desnaturalización alcalina, el producto amplificado se pone en contacto con las sondas en la membrana y la hibridación se lleva a cabo durante aproximadamente 1 a 1,5 h, el ácido polinucleico hibridado se detecta. A partir del patrón de hibridación generado, el tipo de VHC se puede deducir ya sea visualmente, pero preferiblemente usando software dedicado. El formato LiPA es completamente compatible con dispositivos de barrido comercialmente disponibles, haciendo de esta manera la interpretación automática de los resultados muy fiable. Todas esas ventajas hacen el formato LiPA responsable para el uso de detección de VHC en un marco de rutina. El formato LiPA debe ser particularmente ventajoso para detectar la presencia de diferentes genotipos de VHC.

También se describe en el presente documento un soporte sólido, preferiblemente una tira de membrana, que lleva en su superficie, una o más sondas como se ha definido en el presente documento, acopladas al soporte en forma de líneas paralelas.

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Otras modificaciones de proteína incluyen polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, APN, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica tanto naturales como no naturales. Dichas modificaciones también incluyen modificaciones de aminoácidos conocidas tal como formación de enlace disulfuro, cisteinilación, oxidación, glutationilación, metilación, acetilación, farnesilación, biotinilación, estearoilación, formilación, adición de ácido lipoico, fosforilación, sulfatación, ubiquitinación, miristoilación, palmitoilación, geranilgeranilación, ciclación (por ejemplo, formación de ácido piroglutámico), oxidación, desamidación, deshidratación, glucosilación (por ejemplo, pentosas, hexosaminaas, N-acetilhexosaminas, desoxihexosas, hexosas, ácido siálico, etc.) y acilación, así como residuos de aminoácidos no naturales, residuos de L-aminoácidos, y residuos de D-aminoácidos. Un número de dichas modificaciones de aminoácidos se puede producir como resultado de modificación postraduccional como reconocerá el experto en la materia. Otras modificaciones incluyen la adición de un grupo químico a uno o más aminoácidos de una proteína, péptido u oligopéptido. Dichos grupos químicos incluyen, por ejemplo, biotina. Dichos grupos químicos incluyen además grupos introducidos en tioles de cisteína resultante en un tiol de cisteína bloqueado de forma reversible o irreversible; los ejemplos de compuestos modificadores de cisteína incluyen Netilmaleimida, biotina-N-etilmaleimida, vinilpiridina, ácido yodoacético, yodoacetamida, etilenimina, y yoduro de metilo. Además, las cisteínas se pueden convertir a S-sulfo-cisteínas en una reacción de sulfitolisis. Las proteínas, péptidos u oligopéptidos pueden además generalmente estar marcados radioactivamente, quimioluminiscentemente, fluorescentemente, fosforescentemente, con colorantes infrarrojos o con un marcador Raman de superficie potenciada o partícula resonante de plasmón. Mediante “biológicamente equivalente” si se usa en el presente documento, se quiere decir que una proteína es un equivalente antigénico o inmunogénico a una proteína o péptido como se describe en el presente documento.

Cualquiera de las proteínas, partes de las mismas o derivados de cualquiera de ellas como se describe en el presente documento puede ser de origen sintético, es decir, sintetizada aplicando química orgánica, o de origen recombinante. Los péptidos de VHC se pueden producir por expresión en, por ejemplo, células de mamífero o insecto infectadas con virus recombinantes, células de levadura o células bacterianas.

Más particularmente, dichas células de mamíferos incluyen células HeLa, células Vero, células RK13, células MRC5, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de hámster recién nacido (BHK) y células PK15. Más particularmente, dichas células de insecto incluyen células de Spodoptera frugiperda, tal como células Sf9. Más particularmente dichos virus recombinantes incluyen virus vaccinia recombinantes, adenovirus recombinantes, baculovirus recombinantes, virus de la viruela del canario recombinantes, virus del bosque de Semliki recombinantes, alfavirus recombinantes, virus de Ankara modificados recombinantes y virus de viruela aviar recombinantes. Más particularmente, dichas células de lavadura incluyen células de Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, o Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces, tal como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, tal como Kluyveromyces lactis, Yarrowia, tal como Yarrowia lipolytica, Hansenula, tal como Hanserzula polymorpha, Pichia, tal como Pichia pastoris, especies de Aspergillus, Neurospora, tal como Neurospora crassa, o Schwanniomyces, tal como Schwatiniomyces occidentalis, o células mutantes derivadas de cualquiera de las mismas. Más específicamente, el péptido de VHC o parte del mismo como se describe en el presente documento es el producto de expresión en una célula de Hansenula. Más particularmente dichas células bacterianas incluyen células de Escherichia coli o especies de Streptomyces.

En la proteína, parte de la misma o derivado de cualquiera de las mismas como se describe en el presente documento y que comprende al menos un residuo de cisteína, el/los grupo(s) tiol de la cisteína se pueden proteger irreversiblemente por medios químicos. “Protección irreversible” o “bloqueo irreversible” por medios químicos se refiere a alquilación por medio de agentes alquilantes, tal como, por ejemplo, halógenos activos, etilenimina o N(yodoetil)trifluoro-acetamida. A este respecto, se debe entender que la alquilación de grupos tiol de cisteína se refiere a la sustitución del hidrógeno del tiol por (CH2)nR, en el que n es 0, 1, 2, 3 o 4 y R= H, COOH, NH2, CONH2, fenilo, o cualquier derivado de los mismos. La alquilación se puede realizar por cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, halógenos activos X(CH2)nR en el que X es un halógeno tal como I, Br, Cl o F. Los ejemplos de halógenos activos son yoduro de metilo, ácido yodoacético, yodoacetamida, y 2-bromoetilamina. Otros métodos de alquilación incluyen el uso de NEM (N-etilmaleimida) o biotina-NEM, una mezcla de las mismas, o etilenimina o N-(yodoetil)trifluoroacetamida ambos produciendo la sustitución de -H por -CH2-CH2-NH2 (Hermanson 1996). El término “agentes alquilantes” como se usa en el presente documento se refiere a compuestos que son capaces de realizar la alquilación como se describe en el presente documento.

Se entiende además que los grupos tiol de cisteína de las proteínas de VHC o partes de las mismas o derivados de cualquiera de las mismas como se describe en el presente documento se pueden proteger reversiblemente. El fin de la protección reversible es estabilizar la proteína de VHC o parte de la misma o derivado de cualquiera de las mismas. Especialmente, después de la protección reversible el grupo funcional que contiene azufre (por ejemplo, tioles y disulfuros) se mantiene en un estado no reactivo. Por tanto, el grupo funcional que contiene azufre es incapaz de reaccionar con otros compuestos, por ejemplo, ha perdido su tendencia de formar o intercambiar enlaces disulfuro, tal como, por ejemplo

R1-SH + R2-SH--X--> R1-S-S-R2; R1-S-S-R2 + R3-SH --X--> R1-S-S-R3 + R2-SH;

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en una reacción química), y/o de un reactivo de muestra modificable por dicha molécula (por ejemplo, en una reacción química). En un kit diagnóstico para la detección de un antígeno o anticuerpo en una muestra, uno o más anticuerpos o antígenos, respectivamente, son parte de dicho kit. En un kit diagnóstico para detectar antígenos o anticuerpos, los anticuerpos o antígenos, respectivamente, con frecuencia están presentes en una fase, matriz o soporte sólido.

Las proteínas o partes de las mismas o derivados de cualquiera de las mismas como se describe en el presente documento se pueden embalar y ser parte de un kit diagnóstico. El kit normalmente contendrá en envases o viales separados los péptidos o polipéptidos como se describen en el presente documento (marcados o sin marcar), formulaciones de anticuerpos control (positivos y/o negativos), anticuerpo marcado cuando el formato de ensayo requiere el mismo y reactivos generadores de señal (por ejemplo, sustratos de enzimas) si el marcador no genera una señal directamente. Los péptidos o polipéptidos como se describe en el presente documento pueden estar ya unidos a una matriz sólida o pueden estar presentes en el kit en un vial separado junto con reactivos para unirlos a la matriz. Habitualmente se incluyen en el kit instrucciones (por ejemplo, escritas, cinta, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo en ensayo.

El compuesto generador de señal puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radioactivo y un compuesto quimioluminiscente. Los ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y beta-galactosidasa. Los ejemplos de compuestos potenciadores incluyen biotina, anti-biotina y avidina. Los ejemplos de miembros de unión de compuestos potenciadores incluyen biotina, anti-biotina y avidina. Para bloquear los efectos de sustancias tipo factor reumatoide, la muestra de prueba se somete a condiciones suficientes para bloquear el efecto de sustancias similares al factor reumatoide. Estas condiciones comprenden poner en contacto la muestra de prueba con una cantidad de anti-IgG humana para formar una mezcla, e incubar la mezcla durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar un producto de mezcla de reacción suficientemente libre de sustancia similar a factor reumatoide.

También se describen en el presente documento kits diagnósticos para detectar anticuerpos contra un virus VHC o para el tipado de un virus VHC en donde dichos kits comprenden al menos una proteína o péptido como se describe en el presente documento. En dicho kit diagnóstico dicha proteína o péptido puede estar unido a un soporte sólido.

También se describen métodos para para detectar anticuerpos contra un virus VHC presentes en una muestra biológica que comprende poner en contacto un antígeno con dichos anticuerpos en presencia de un anticuerpo aislado como se describe en el presente documento como competidor de la unión de dicho antígeno a dicho anticuerpo.

También se describe un método para detectar la presencia de antígenos de VHC en una muestra biológica que comprende poner en contacto dicho antígeno con un anticuerpo contra dicho antígeno en presencia de una proteína

o péptido aislado según la invención como se describe en el presente documento como competidor de la unión de dicho antígeno a dicho anticuerpo.

En otro aspecto, la presente invención prevé vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico según la invención. Más específicamente, dicho vector recombinante puede ser un vector de expresión capaz de dirigir la expresión de una proteína de VHC codificada por la secuencia de ácido nucleico de VHC comprendida en dicho vector.

Las células hospedadoras aisladas transformadas con un ácido nucleico según la invención o transformadas con un vector recombinante según la invención también son parte de la presente invención.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para la producción recombinante de una proteína según la invención que comprende los pasos de:

(i)

transformación de un hospedador celular apropiado con un vector recombinante según la invención;

(ii)

cultivar el hospedador celular transformado de (i) en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína;

(iii) recoger la proteína expresada en (ii).

En particular, la expresión de la proteína de VHC por medio del vector de expresión estará dirigida por elementos reguladores de transcripción que están operativamente unidos a la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína de VHC.

Como se usa en el presente documento, el término “elementos reguladores de transcripción” se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene elementos reguladores esenciales, de modo que tras la introducción en una célula de vertebrado viva es capaz de dirigir la maquinaria celular para producir productos de transcripción codificados por el polinucleótido. Los elementos reguladores de transcripción incluyen promotores, terminadores, potenciadores, etc.

El término “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes están configurados de modo que realicen su función habitual. Por tanto, los elementos reguladores de la transcripción operativamente unidos a una secuencia de nucleótidos son capaces de efectuar la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos. Los expertos en la materia pueden apreciar que diferentes promotores transcripcionales, terminadores, vectores

5 portadores o secuencias de genes específicas se pueden usar con éxito.

Las células hospedadoras aisladas para la expresión de la proteína de VHC como se describe en el presente documento pueden ser células procariotas o eucariotas como se ha descrito anteriormente.

10 También se describe en el presente documento el uso de un vector recombinante como se ha descrito en el presente documento para la fabricación de una composición inmunógena o una composición vacuna. En particular, la composición inmunógena es una composición inmunógena de VHC y la composición vacuna es una composición vacuna de VHC, una composición vacuna de VHC terapéutica o una composición vacuna de VHC profiláctica. Cualquiera de estas composiciones se puede usar para inmunizar un mamífero contra infección por VHC o para

15 tratar un mamífero infectado con VHC.

Una “composición inmunógena” es una composición que comprende un antígeno capaz de provocar al menos un elemento de la respuesta inmunitaria contra el antígeno comprendido en dicha composición cuando dicha composición se introduce en el cuerpo de un animal capaz de generar una respuesta inmunitaria. Una composición 20 inmunógena puede comprender más de un antígeno, es decir, una pluralidad de antígenos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, por ejemplo, hasta 15, 20, 25, 30, 40 o 50 o más antígenos distintos. En particular, la composición inmunógena como se describe en el presente documento es una composición inmunógena de VHC en donde el antígeno o pluralidad de antígenos son péptido(s) o polipéptido(s) o proteína(s) o parte o derivado de cualquiera de los mismos como se describe en el presente documento. Dicha pluralidad de antígenos puede comprender una

25 combinación de proteínas de VHC o partes de las mismas o derivados de cualquiera de las mismas derivadas de diferentes genotipos y/o subtipos y/o aislados de VHC incluyendo los aislados del nuevo clado/genotipo de VHC identificado en la presente invención.

Una “composición vacuna” es una composición inmunógena capaz de provocar una respuesta inmunitaria 30 suficientemente amplia y vigorosa para provocar uno o ambos de:

-un efecto estabilizador en la multiplicación de un patógeno ya presente en un hospedador y contra el que se dirige la composición vacuna; y -un efecto que aumenta la velocidad a que un patógeno recién introducido en un hospedador, después de la 35 inmunización con una composición vacuna dirigida contra dicho patógeno, se resuelve de dicho hospedador.

Una composición vacuna también puede provocar una respuesta inmunitaria amplia y fuerte suficiente para ejercer

40 un efecto negativo sobre la supervivencia del patógeno ya presente en un hospedador o amplia y fuerte suficiente para prevenir que un hospedador inmunizado desarrolle síntomas de enfermedad causados por un patógeno recién introducido. En particular, la composición vacuna como se describe en el presente documento es una composición vacuna de VHC en donde el patógeno es VHC.

45 Una “cantidad eficaz” de un antígeno en una composición vacuna se refiere a una cantidad de antígeno necesaria y suficiente para provocar una respuesta inmunitaria. Estará claro para el experto en la materia que la respuesta inmunitaria suficientemente amplia y vigorosa para provocar los efectos previstos por la composición vacuna pueden requerir inmunizaciones sucesivas (en el tiempo) con la composición vacuna como parte de un esquema de vacunación o programa de vacunación. La “cantidad eficaz” puede variar dependiendo de la salud y estado físico del

50 individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, humano, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para montar una respuesta inmunitaria eficaz, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico, la cepa del patógeno que infecta y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos rutinarios. Habitualmente, la cantidad variará desde 0,01 a 1000 µg/dosis, más

55 particularmente de 0,1 a 100 µg/dosis. La pauta posológica puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. La vacuna se puede administrar junto con otros agentes inmunorreguladores.

Una “composición vacuna profiláctica” es una composición vacuna que proporciona inmunidad protectora, es decir, una inmunidad que previene el desarrollo de la enfermedad tras la exposición del hospedador inmunizado con la 60 composición vacuna profiláctica. En particular para VHC, una composición vacuna de VHC profiláctica se debe entender como una composición vacuna capaz de proporcionar inmunidad protectora que ayuda a resolver una infección de HVC de exposición rápidamente y/o a prevenir que una infección de VHC de exposición proceda a una infección crónica. La depuración vírica de VHC acelerada o control acelerado de infección por exposición a VHC, por tanto, se prevé mediante la vacunación con la composición de VHC profiláctica como se describe en el presente

65 documento.

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Una “cantidad profilácticamente eficaz” de un antígeno en una composición vacuna profiláctica se refiere a una cantidad de antígeno necesaria y suficiente para provocar una respuesta inmunitaria que permita el desarrollo de inmunidad protectora. Estará claro para los expertos en la materia que la respuesta inmunitaria suficientemente amplia y vigorosa para provocar los efectos previstos por la composición vacuna profiláctica pueden requerir inmunizaciones sucesivas (en el tiempo) con la composición vacuna profiláctica (véase también “cantidad eficaz”).

Una “composición vacuna terapéutica” es una composición vacuna que proporciona una respuesta inmunitaria curativa, es decir, una respuesta inmunitaria capaz de efectuar una reversión, o al menos capaz de efectuar una parada, de los síntomas de la enfermedad asociados con una infección de patógeno ya establecida. En particular para VHC, una composición vacuna de VHC terapéutica se debe entender como una composición vacuna capaz de reducir la enzima hepática en suero, por ejemplo, alanina aminotransferasa (ALT) o γ-glutamilpeptidasa (γ-GT), niveles de actividad en la sangre y/o de reducir los niveles de ARN de VHC y/o de reducir la enfermedad hepática y/o de reducir la fibrosis hepática y/o de reducir la evolución de fibrosis hepática y/o de reducir los niveles de antígeno de VHC en o presentados en células hepáticas.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un antígeno en una composición vacuna terapéutica se refiere a una cantidad de antígeno necesaria y suficiente para provocar una respuesta inmunitaria que permita el desarrollo de una respuesta inmunitaria curativa. Estará claro para los expertos en la materia que la respuesta antigénica o inmunogénica suficientemente amplia y vigorosa para provocar los efectos previstos por la composición vacuna terapéutica pueden requerir inmunizaciones sucesivas (en el tiempo) con la composición vacuna terapéutica (véase también “cantidad eficaz”).

También se describen en el presente documento composiciones, composiciones inmunógenas y/o composiciones vacuna que comprenden al menos uno de un ácido nucleico u oligonucleótido como se describe en el presente documento, una proteína o péptido aislado como se describe en el presente documento, un vector recombinante como se describe en el presente documento o un anticuerpo como se describe en el presente documento; y al menos uno de un soporte, adyuvante o vehículo adecuado. En particular dichas composiciones inmunógenas son composiciones inmunógenas de VHC y dichas composiciones vacunas son composiciones vacuna de VHC, composiciones vacuna de VHC terapéuticas o composiciones vacuna de VHC profilácticas. Cualquiera de estas composiciones se puede usar para inmunizar un mamífero contra una infección por VHC o para tratar un mamífero infectado con VHC.

También se describe en el presente documento composiciones inmunógenas de VHC, composiciones vacuna de VHC, composiciones vacuna de VHC profilácticas y/o composiciones vacuna de VHC terapéuticas que comprenden una proteína o parte o un derivado de cualquiera de las mismas como se ha descrito en el presente documento.

También se describe en el presente documento el uso de una proteína (de VHC) aislada o parte de la misma o derivado de cualquiera de las mismas como se ha descrito en el presente documento para la fabricación de una composición inmunógena de VHC, una composición vacuna de VHC profiláctica o una composición vacuna de VHC terapéutica.

También se describen en el presente documento métodos de vacunar un mamífero sin exposición a VHC o infectado con VHC que comprende administrar una composición inmunógena de VHC, una composición vacuna de VHC, una composición vacuna de VHC profiláctica y/o una composición vacuna de VHC terapéutica como se ha descrito en el presente documento en combinación con (es decir, antes, después o al mismo tiempo que) administrar una vacuna de ADN.

La composición inmunógena, composición vacuna, composición vacuna terapéutica o composición vacuna profiláctica como se ha descrito anteriormente puede además comprender vectores de vacuna de ADN capaces de expresar o efectuar la expresión de un antígeno. La composición inmunógena de VHC, composición vacuna de VHC, composición vacuna de VHC terapéutica o composición vacuna de VHC profiláctica puede además comprender vectores de vacuna de ADN capaces de expresar o efectuar la expresión de uno o más antígenos tal como proteínas de VHC o partes de las mismas, por ejemplo, una proteína de VHC o parte de la misma como se describe en el presente documento. Alternativamente, la composición inmunógena, composición vacuna, composición vacuna terapéutica o composición vacuna profiláctica basada en proteína o péptido como se ha descrito en el presente documento se puede usar en combinación con una composición inmunógena, composición vacuna, composición vacuna terapéutica o composición vacuna profiláctica basada en vector de ADN (también denominada “vacuna de ADN” o “vacuna de ADN de VHC” si el vector de ADN comprendido en la misma codifica una proteína de VHC o parte de la misma). Tal combinación, por ejemplo, incluye un esquema de vacunación de sensibilización con ADN refuerzo de proteína en donde la vacunación se inicia administrando una composición inmunógena, composición vacuna, composición vacuna terapéutica o composición vacuna profiláctica basada en vector de ADN y va seguida por la administración de una composición inmunógena, composición vacuna, composición vacuna terapéutica o composición vacuna profiláctica basada en proteína o péptido como se ha descrito en el presente documento. En particular, el factor de vacuna de ADN es capaz de expresar uno o más antígenos o proteínas de VHC o partes de las mismas.

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Los aislados IG93305 e IG93306 no se agruparon con ninguno de los 11 genotipos conocidos de los 6 clados actualmente conocidos para VHC (véase la figura 3 en el ejemplo 3). Se formó una rama separada clara independiente de cualquier clado/genotipo de virus VHC conocido, que abarca los aislados tanto IG93305 como IG93306. Se preparó una matriz de distancia filogenética con secuencias prototipo de todos los clados/genotipos de 5 VHC conocidos (tabla 2) por DNADIST usando el entorno de dos parámetros de Kimura (paquete de software PHYLIP versión 3.5; Felsenstein 1993). Usando un fragmento de NS5B de 340 pb, se establecieron los límites de distancias filogenéticas para diferentes tipos (distancia filogenética > 0,328), el mismo tipo pero diferente subtipo (distancia filogenética entre 0,127 y 0,328), y el mismo subtipo (< 0,127) (Maertens y Stuyver 1997). Según estos criterios, los aislados ytanto IG93305 como IG93306 pertenecen a un nuevo genotipo de VHC en un nuevo clado (la 10 distancia mínima es de 0,439 con el aislado prototipo del genotipo 2a (número de registro D00944). Además, ambos aislados representan diferentes subtipos (subtipos a y b) en un nuevo genotipo (distancia filogenética entre sí 0,185).

Tabla 2. Matriz de distancia filogenética de las regiones de ácido nucleico de NS5B de los aislados IG93305 e IG93306 frente a secuencias de referencia indicadas de todos los clados/genotipos conocidos y sus subtipos 15 principales

Genotipo (Clado)

Subtipo Mu estras de refereNo. registro Genbank ncia Aislado de virus Disponibilidad secuencia genomacompleto Región NS5B IG93306 IG93305

IG93306

0,000 0,185

IG93305

0,185 0,000

1(1)

a M62321 HCV-1 x 0,542 0,472

a

D10749 HC-J1 x 0,563 0,479

b

D90208 HCV-J x 0,677 0,659

c

D14197 HC-G9 x (D14853) 0,618 0,538

2(2)

a D00944 HC-J6 x 0,507 0,439

c

D50409 BEBE1 x 0,503 0,531

d

L29634 NE92 - 0,530 0,537

e

D49780 JK151 - 0,582 0,529

f

L44601 nl33 - 0,580 0,556

l

L48499 HN4 - 0,542 0,513

j

D86532 RU169 - 0,548 0,485

3(3)

a D17763 NZL1 x 0,563 0,523

4(4)

a Y11604 ED43 x 0,532 0,477

c

L29614 GB48 - 0,490 0,492

5(5)

a Y13184 EUH1480 x 0,616 0,561

a

AF064490 SA13 x 0,603 0,561

6(6)

a L38379 VN11 - 0,543 0,487

b

D84262 Th580 x 0,605 0,572

Tabla 2 (continuación)

Genotipo (Clado)

MuSubtipo estras de refereNo. registro Genbank ncia Aislado de virus Disponibilidad secuencia genomacompleto Región NS5B IG93306 IG93305

7(6)

a L38381 VN13 - 0,492 0,504

b

D84263 VN235 x 0,578 0,574

8(6)

a D87357 VN507 - 0,467 0,499

b

D84264 VN405 x 0,553 0,548

9(6)

a D87352 VN004 - 0,578 0,517

b

AB027609 Th555 x 0,543 0,550

10(3)

a D26387 Td3/93 - 0,626 0,630

11(6)

a D63822 JK046 x 0,530 0,503

20 x: disponible; -: no disponible.

Ejemplo 5. Secuenciación de la región 5’NCR de las muestras IG93305 e IG93306

Para la determinación de la secuencia de las regiones 5’NCR de IG93305 e IG93306, un fragmento de 5’NCR de 25 300 pb se amplificó como se describe en Stuyer et al (1996). Este fragmento de PCR se clonó posteriormente en un vector pGEM-T (Promega Corp., EE UU) y los clones se secuenciaron usando cebadores SP6/T7 del vector. Las

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Claims (1)

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