DE69324678T2 - Verfahren zur typisierung von hcv-isolaten - Google Patents

Verfahren zur typisierung von hcv-isolaten

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Sonden, die sich gegen Sequenzen aus der 5'-nichttranslatierten Region von HCV richten, zur Genotypbestimmung von HCV-Isolaten.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Genotypbestimmung von HCV-Isolaten.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Kit zur Genotypbestimmung von HCV- Isolaten.
  • Hepatitis C-Viren (HCV) sind eine Familie von umhüllten Plus-Strang- RNA-Viren, welche den größten Teil von Non-A-Non-B (NANB)-Hepatitis verursachen. Ihre genomische Organisation zeigt eine enge Verwandtschaft zu den Pestiviridae und Flaviviridae an. Die Sequenzen von cDNA-Klonen, welche das vollständige Genom mehrerer Prototyp- Isolate abdecken, wurden bereits vollständig bestimmt (Kato et al., 1990; Choo et al., 1991; Okamoto et al., 1991; Takamizawa et al., 1991; Okamoto et al., 1992b). Diese Genome sind etwa 9500 Basenpaare lang. Die von Kato, Takamizawa und Choo beschriebenen Isolate enthalten einen offenen Leserahmen (ORF) von 3010 oder 3011 Aminosäuren und die von Okamoto beschriebenen kodieren 3033 Aminosäuren. Ein Vergleich dieser Isolate zeigt eine beträchtliche Variabilität in den Regionen der Hülle (E) und den nicht- strukturellen (NS)-Regionen, während die 5'-nicht-translatierte Region (UR) und, in geringerem Maße, die Core-Region hochkonserviert sind.
  • Kubo et al. (1989) verglichen unter Verwendung klonierter Sequenzen der NS3-Region ein japanisches und ein amerikanisches Isolat und fanden nahezu 80% Nucleotid- und 92% Aminosäurehomologie. Das Vorhandensein von Sequenzvariabilität wurde darüber hinaus dokumentiert als Sequenzen der 5'-UR-, Core- und E1-Regionen verfügbar wurden (HC-J1 und HC-J4; Okamoto et al., 1990). Nach der Isolierung mehrerer NS5-Fragmente in japanischen Laboratorien wurden zwei Gruppen, K1 und K2, beschrieben (Enomoto et al., 1990). Ein Vergleich des "amerikanischen" Isolats PT-I mit K1, welches in Japan häufiger vorkam, zeigte, daß sie eng verwandte, aber unterschiedliche Subtypen mit einer Intergruppen-Nucleotididentität von etwa 80% darstellen. Die K2-Sequenz war sowohl mit K1 als auch mit PT-1 entfernter verwandt, da Homologien von nur 67% auf der Nukleinsäureebene und 72% auf der Aminosäureebene beobachtet wurden. Darüber hinaus konnte K2 in zwei Gruppen, K2a und K2b, unterteilt werden, welche ebenfalls Intergruppen-Nucleotidhomologien von etwa 80 % zeigten. Eine Nucleotidsequenzanalyse in der 5'-UR zeigte 99% Identität zwischen K1 und PT-1 und höchstens 94% Identität zwischen K1 und K2 an, was den Einsatz der 5'-UR für Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) und die Klassifizierung von HCV in die Gruppen K1 und K2 ermöglichte (Nakao et al., 1991). Einen weiteren Hinweis auf eine zweite Gruppe gab die vollständige Sequenz von HC-J6 und HC-J8, zwei Sequenzen, die mit der K2-Gruppe verwandt sind (Okamoto et al., 1991; Okamoto et al., 1992b). Ein phylogenetischer Baum von HCV mit vier Zweigen (d. h., Typ I: HCV-1 und HCV-H; Typ 11: HCV-J, -BK, HC-J4; Typ III: HC-J6; Typ IV: HC-J8) wurde von Okamoto et al. (1992b) vorgeschlagen. Es können jedoch Nukleinsäuresequenzhomologien von 79% zwischen Typ I und Typ 11 und auch zwischen Typ III und IV beobachtet werden. Ein geringerer Verwandtschaftsgrad von nur 67-68% ist zwischen der ersten Gruppe (Typ I und 11) und der zweiten Gruppe (Typ III und IV) vorhanden. Darüber hinaus wurde ein neuer Typ von HCV, HCV-T, nach der Untersuchung von NS5-Bereichen in Thailand nachgewiesen (Mori et al., 1992). HCV-T besaß eine Sequenzhomologie von etwa 65% zu allen anderen bekannten NS5-Sequenzen und es konnten zwei Gruppen nachgewiesen werden, HCV-Ta und HCV-Tb, welche wiederum Nukleinsäuresequenzhomologien von etwa 80% zeigten. Die Aufklärung der phylogenetischen Verwandtschaft einer ähnlichen neuen Gruppe, die in britischen Isolaten gefunden worden war, mit Typ I bis IV war durch Analyse der konservierten Teile der 5'-UR, Core-, NS3- und NS5- Regionen möglich (Chan et al., 1992a). Es wurde ein neuer phylogenetischer Baum vorgeschlagen, bei dem "Typ 1", Typ I und II entspricht, "Typ 2" Typ III und IV entspricht, und "Typ 3" ihren eigenen Isolaten E-b1 bis E-b8 und HCV-T. Einige Sequenzen der 5'-UR von Isolaten des "Typs 3" wurden auch von anderen beschrieben (Bukh et al., 1992; Cha et al., 1992; Lee et al., 1992).
  • Mehrere Patentanmeldungen befaßten sich mit dem Problem des Nachweises der Anwesenheit von HCV mittels Sonden, die von dem Genom von Typ 1-HCV-Isolaten erhalten worden waren (WO 92/02642, EP 419 182, EP 398 748, EP 469 438 und EP 461 863). Ferner erwies sich die 5'-UR von HCV-Isolaten als guter Kandidat für die Konstruktion von Sonden und Primern für den allgemeinen HCV-Nachweis (Cha et al., 1991; Inchaupse et al., 1991). Jedoch bietet keine dieser Patentanmeldungen ein Verfahren zur Identifizierung des Typs und/oder Subtyps von HCV, der in der zu analysierenden Probe vorhanden ist.
  • Die Demonstration, daß Infektionen mit unterschiedlichen HCV- Genotypen zu unterschiedlichen serologischen Reaktivitäten (Chan et al., 1991) und Reaktionen auf Interferon IFN-y-Behandlung (Pozatto et al., 1991; Kanal et al., 1992; Yoshioka et al., 1992) führten, unterstreicht die Bedeutung der HCV-Genotypbestimmung. Bisher konnte diese nur erreicht werden durch große Sequenzierungsanstrengungen in der kodierenden Region oder in der 5'-UR, oder durch Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit HCV-cDNA mit typenspezifischen Sätzen von Core-Primern (Okamoto et al., 1992a) oder durch (RFLP)-Analyse in der 5'-UR oder in der NS5-Region (Nakao et al., 1991; Chan et al., 1992b). Jedoch bietet keine dieser obengenannten Patentanmeldungen oder Veröffentlichungen ein verläßliches Verfahren zur Identifizierung des Typs oder Subtyps von HCV, der in der zu analysierenden Probe vorliegt, insbesondere da die Typbestimmung aufwendig ist und eine Subtypbestimmung mit diesen Verfahren sogar noch aufwendiger oder unmöglich erscheint. Diesbezüglich kann angemerkt werden, daß Lee et al. (1992) versuchten, zwischen den HCV-Isolaten HCV 324 und HCV 324 · mit Hilfe von PCR-Fragmenten aus der 5'-UR der Genome dieser Isolate zu unterscheiden. Die Ergebnisse demonstrieren, daß diese 5'-UR-Sonden keine spezifische Reaktivität mit dem Genom des jeweiligen Isolats zeigen, aus dem sie erhalten wurden.
  • WO 92/19743 beschreibt ein Hybridisierungsexperiment, bei dem eine ³²P-markierte Sequenz mit der Sequenz AACCCACTCTATGYCCGGYCAT und GAATCGCTGGGGTGACCG, worin Y C oder T/U bedeutet, mit einem immobilisierten PCR-Produkt hybridisiert wird, welches unter Verwendung der folgenden Sequenzen: CCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTA und TTGCGGGGGCACGCCCAA als Primer hergestellt wurde.
  • Folglich ist das Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur schnellen und unzweideutigen Bestimmung der Anwesenheit eines Genotyps oder mehrerer Genotypen von HCV, der bzw. die in einer biologischen Probe vorliegt/vorliegen, und zur unzweideutigen Klassifizierung des/der bestimmten Isolats(e).
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung noch unbekannter HCV-Typen oder - Subtypen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches die Klassifizierung infizierter biologischer Fluide in verschiedene serologische Gruppen, die unzweideutig mit Typen und Subtypen auf der Genomebene verknüpft sind, ermöglicht.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Kits für den schnellen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Typen oder Subtypen von HCV.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Sonde, wobei die Sonde (i) fähig ist, mit einer genotypspezifischen Target-Region zu hybridisieren, die in einem zu analysierenden Strang in der sich von den Nucleotiden in den Positionen -291 bis -66 der 5'- nichttranslatierten Region (UR) eines der HCV-Isolate erstreckenden Domäne vorliegt, oder wobei diese Sonde (ii) zu einer beliebigen der oben definierten Sonden komplementär ist, zur Genotypbestimmung von HCV-Isolaten, die in einer biologischen Probe vorliegen.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer Sonde, die vorzugsweise etwa 5 bis etwa 50 Nucleotide enthält, bevorzugter etwa 10 bis etwa 40 Nucleotide, und am meisten bevorzugt etwa 15 bis etwa 30 Nucleotide enthält, wobei die Sonde (i) fähig ist, mit einer genotypspezifischen Target-Region zu hybridisieren, die in einem zu analysierenden Strang in der Domäne vorliegt, die sich von den Nucleotiden in den Positionen -291 bis -66 der 5'-UR eines der HCV- Isolate erstreckt, welche durch ihre cDNA-Sequenzen repräsentiert werden, beispielsweise durch ihre cDNA-Sequenzen in Fig. 2 repräsentiert werden, wobei die negative Numerierung der Nucleotidpositionen an dem Nucleotid beginnt, welches dem ersten ATG- Codon des für das HCV-Polyprotein kodierenden offenen Leserahmens vorangeht, oder wobei diese Sonde (ii) zu den oben definierten Sonden komplementär ist, für die (in vitro) Genotypbestimmung von HCV- Isolaten, die in einer biologischen Probe vorliegen, wobei diese Probe gegebenenfalls vorher als HCV-positiv identifiziert wurde, wobei sich diese Verwendung von der Verwendung einer ³²P-markierten Sequenz mit der Sequenz AACCCACTCTATGYCCGGYCAT und GAATCGCTGGGGTGACCG, worin Y C oder T/U bedeutet, in einem Hybridisierungsversuch mit einem unter Verwendung der folgenden Sequenzen: CCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTA und TTGCGGGGGCACGCCCAA als Primer hergestellten immobilisierten PCR-Produkt unterscheidet.
  • Das obengenannte Verfahren kann eingesetzt werden zur Klassifizierung dieses Isolats entsprechend dem Prozentsatz an Homologie zu anderen HCV-Isolaten, gemäß der Tatsache, daß Isolate, die zum selben Typ gehören:
  • eine Homologie von mehr als 74% auf der Nukleinsäureebene in dem gesamten Genom aufweisen;
  • oder eine Homologie von mehr als 74% auf der Nukleinsäureebene in der NS5-Region zwischen den Nucleotidpositionen 7935 und 8274 aufweisen;
  • oder daß bei ihnen das gesamte Polyprotein mehr als 78% Homologie auf der Aminosäureebene zeigt;
  • oder daß bei ihnen die NS5-Region zwischen den Aminosäuren an den Positionen 2646 und 2758 mehr als 80% Homologie auf der Aminosäureebene zeigt;
  • und gemäß der Tatsache, daß HCV-Isolate, die zum selben Subtyp gehören, eine Homologie von mehr als 90% auf der Nukleinsäureebene in dem gesamten Genom und von mehr als 90 % auf der Aminosäureebene in dem gesamten Polyprotein aufweisen.
  • Bevorzugter betrifft das obengenannte Verfahren die Klassifizierung von HCV-Isolaten gemäß der Tatsache, daß
  • (1) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS5b-Region zwischen den Nucleotiden 7935 und 8274 (Choo et al., 1991) oder 8261 und 8600 (Kato et al., 1990) oder 8342 und 8681 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,34, gewöhnlich von weniger als 0,33 und üblicherweise von weniger als 0,32 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,135, gewöhnlich von weniger als 0,13 und üblicherweise von weniger als 0,125 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,135 bis 0,34, gewöhnlich im Bereich von 0,14 bis 0,33 und üblicherweise im Bereich von 0,15 bis 0,32 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,34, gewöhnlich von mehr als 0,35 und üblicherweise von mehr als 0,36 zeigen,
  • (2) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der Core/EI-Region zwischen den Nucleotiden 378 und 957, Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,38, gewöhnlich von weniger als 0,37 und üblicherweise von weniger als 0, 36 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,17, gewöhnlich von weniger als 0,16 und üblicherweise von weniger als 0,15 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotid-distanzen im Bereich von 0,15 bis 0,38, gewöhnlich im Bereich von 0,16 bis 0,37 und üblicherweise im Bereich von 0,17 bis 0,36 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,36, gewöhnlich von mehr als 0,365 und üblicherweise von mehr als 0,37 zeigen,
  • (3) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS3/NS4-Region zwischen den Nucleotiden 4664 und 5292 (Choo et al., 1991) oder zwischen den Nucleotiden 4993 und 5621 (Kato et al., 1990) oder zwischen den Nucleotiden 5017 und 5645 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,35, gewöhnlich von weniger als 0,34 und üblicherweise von weniger als 0,33 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,19, gewöhnlich von weniger als 0,18 und üblicherweise von weniger als 0,17 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,17 bis 0,35, gewöhnlich im Bereich von 0,18 bis 0,34 und üblicherweise im Bereich von 0,19 bis 0,33 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,33, gewöhnlich von mehr als 0,34 und üblicherweise von mehr als 0,35 zeigen.
  • Der Begriff "Genotypbestimmung" bezieht sich auf die Bestimmung des Typs und/oder Subtyps. Ein Verfahren zur "Genotypbestimmung" von HCV- Isolaten wird zumindestens teilweise als Klassifizierung von HCV- Isolaten in Genotypen betrachtet. Ein HCV-"Genotyp" ist eine Gruppe von HCV-Isolaten mit verwandten Sequenzen. Diese verwandten Sequenzen sind dadurch definiert, daß sie Nucleotiddistanzen wie oben angegeben und in Beispiel 9 illustriert zeigen. Sowohl größere Gruppen (HCV- Typen) als auch kleinere Gruppen (HCV-Subtypen) haben sich als verwandt erwiesen. Ein HCV-Typ schließt immer einen oder mehrere HCV- Subtyp(en) ein. Folglich kann ein Verfahren zur Genotypbestimmung auf die Typbestimmung (Klassifizierung in HCV-Typen) von HCV-Isolaten ohne das Erfordernis einer Subtypbestimmung (Klassifizierung in HCV- Subtypen) abzielen, oder es kann, in einer bevorzugten Ausführungsform, auf eine Subtypbestimmung abgezielt werden. Es versteht sich, daß die Klassifizierung in Subtypen inhärent Daten für eine Klassifizierung in Typen liefert.
  • Der Begriff "genotypspezifische Target-Region" bezieht sich auf mindestens eine Nucleotid-variation, die zwischen verschiedenen HCV- Genotypen in der 5'-nichttranslatierten Region (UR) beobachtet wird, wie sie ohne weiteres aus den Fig. 2 und 4 abgeleitet werden kann.
  • Der Begriff "HCV-Polyprotein" bezieht sich auf das HCV-Polyprotein des HCV-J-Isolats (Kato et al., 1990), welches zum Subtyp 1b gehört.
  • Dem Ausdruck "Sonde" entspricht jedes beliebige Polynucleotid, welches auf der Basis von Komplementarität ein Hybrid mit einer Target-Sequenz bildet, die in einem bestimmten HCV-Isolat vorliegt. Eine solche Sonde kann aus DNA, RNA oder synthetischen Nucleotid- Analoga aufgebaut sein. Die Sonden der Erfindung können mit einem zu analysierenden Strang inkubiert sein, der auf einem festen Substrat immobilisiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Sonden selbst auf einem festen Substrat immobilisiert sein. Diese Sonden können ferner "Einfang"-Sonden einschließen, dadurch gekennzeichnet, daß sie an ein bindendes Molekül gekoppelt sind, welches wiederum direkt oder indirekt an ein festes Substrat gebunden ist, oder können auch Markierungs-Sonden einschließen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine nachweisbare Markierung tragen.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Genotypbestimmung von HCV- Isolaten, die in einer biologischen Probe vorliegen, umfassend die folgenden Schritte:
  • - In-Kontakt-Bringen dieser Probe, bei der die Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide falls nötig durch geeignete Denaturierung zugänglich gemacht wurden, mit mindestens einer Sonde, wobei diese Sonde (i) fähig ist, mit einer Region in der Domäne zu hybridisieren, die sich von den Nucleotiden in den Positionen -291 bis -66 der 5'-nichttranslatierten Region eines der HCV-Isolate erstreckt, oder wobei diese Sonde (ii) zu einer beliebigen oben definierten Sonde komplementär ist, sowie
  • - Nachweisen der gegebenenfalls zwischen dieser Sonde und der Nucleotidsequenz des zu identifizierenden HCV-Isolats gebildeten Komplexe.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Genotypbestimmung eines in einer biologischen Probe vorliegenden HCV-Isolats, umfassend die folgenden Schritte:
  • - In-Kontakt-Bringen dieser Probe, bei der die Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide falls nötig durch geeignete Denaturierung zugänglich gemacht wurden, mit mindestens einer Sonde mit vorzugsweise etwa 5 bis 50, in bevorzugter Weise etwa 10 bis 40 Nucleotiden und am in am meisten bevorzugter Weise etwa 15 bis etwa 30 Nucleotiden, wobei diese Sonde (i) fähig ist, mit einer Region in der Domäne zu hybridisieren, die sich von den Nucleotiden in den Positionen -291 bis -66 der 5'-UR eines der HCV-Isolate erstreckt, welche durch ihre cDNA-Sequenzen repräsentiert werden, beispielsweise durch ihre cDNA-Sequenzen in Fig. 2 repräsentiert werden, wobei die negative Numerierung der Position an dem Nucleotid beginnt, welches dem ersten ATG-Codon des für das Hcv-Polyprotein kodierenden offenen Leserahmens vorangeht, oder wobei diese Sonde komplementär zu den oben definierten Sonden ist,
  • - Nachweisen der gegebenenfalls zwischen dieser Sonde und der Nucleotidsequenz des zu identifizierenden HCV-Isolats gebildeten Komplexe, sowie Ziehen von Schlußfolgerungen auf den oder die vorliegenden Typ(en) von HCV-Isolaten aus dem Hybridisierungsmuster.
  • Das obengenannte Verfahren kann betrachtet werden als Verfahren zur Klassifizierung des Isolats entsprechend dem Prozentsatz an Homologie zu anderen HCV-Isolaten, gemäß der Tatsache, daß Isolate, die zum selben Typ gehören:
  • - eine Homologie von mehr als 74% auf der Nukleinsäureebene in dem gesamten Genom aufweisen,
  • oder eine Homologie von mehr als 74% auf der Nukleinsäureebene in der NS5-Region zwischen den Nucleotidpositionen 7935 und 8274 aufweisen,
  • oder daß bei diesen das gesamte Polyprotein mehr als 78% Homologie auf der Aminosäureebene zeigt,
  • oder daß bei diesen die NS5-Region zwischen den Aminosäuren an den Positionen 2646 und 2758 mehr als 80% Homologie auf der Aminosäureebene zeigt,
  • und gemäß der Tatsache, das HCV-Isolate, die zum selben Subtyp gehören, eine Homologie von mehr als 90% auf der Nukleinsäureebene in dem gesamten Genom und von mehr als 90% auf der Aminosäureebene in dem gesamten Polyprotein zeigen.
  • Bevorzugter betrifft das Verfahren die Klassifizierung von HCV- Isolaten gemäß der Tatsache, daß
  • (1) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS5b-Region zwischen den Nucleotiden 7935 und 8274 (Choo et al., 1991) oder 8261 und 8600 (Kato et al., 1990) oder 8342 und 8681 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,34, gewöhnlich von weniger als 0,33 und üblicherweise von weniger als 0,32 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,135, gewöhnlich von weniger als 0,13 und üblicherweise von weniger als 0,125 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,135 bis 0,34, gewöhnlich im Bereich von 0,14 bis 0,33 und üblicherweise im Bereich von 0,15 bis 0,32 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,34, gewöhnlich von mehr als 0,35 und üblicherweise von mehr als 0,36 zeigen,
  • (2) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der Core/EI-Region zwischen den Nucleotiden 378 und 957, Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,38, gewöhnlich von weniger als 0,37 und üblicherweise von weniger als 0,36 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,17, gewöhnlich von weniger als 0,16 und üblicherweise von weniger als 0,15 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,15 bis 0,38, gewöhnlich im Bereich von 0,16 bis 0,37 und üblicherweise im Bereich von 0,17 bis 0,36 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,36, gewöhnlich von mehr als 0,365 und üblicherweise von mehr als 0,37 zeigen,
  • (3) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS3/NS4-Region zwischen den Nucleotiden 4664 und 5292 (Choo et al., 1991) oder zwischen den Nucleotiden 4993 und 5621 (Kato et al., 1990) oder zwischen den Nucleotiden 5017 und 5645 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,35, gewöhnlich von weniger als 0,34 und üblicherweise von weniger als 0,33 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,19, gewöhnlich von weniger als 0,18 und üblicherweise von weniger als 0,17 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotid-distanzen im Bereich von 0,17 bis 0,35, gewöhnlich im Bereich von 0,18 bis 0,34 und üblicherweise im Bereich von 0,19 bis 0,33 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,33, gewöhnlich von mehr als 0,34 und üblicherweise von mehr als 0,35 zeigen.
  • Dem Begrif "zu analysierender Strang" entspricht ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, von dem angenommen wird, daß es Sequenzen enthält, die in einer biologischen Probe vorliegen könnten, wobei dieser zu analysierende Strang direkt nachgewiesen oder nach Amplifizierung nachgewiesen wird. Dieser zu analysierende Strang ist vorzugsweise Plus- oder Minus-Strang-RNA, cDNA oder amplifizierte cDNA.
  • Der Ausdruck "biologische Probe" kann sich auf jede biologische Probe (Gewebe oder Fluid) beziehen, die HCV-Sequenzen enthält, und bezieht sich konkreter auf Blutserum- oder Plasma-Proben.
  • Der Nachweis von Hybriden, die zwischen der typ- oder subtypspezifischen Target-Region, falls vorhanden, und den obengenannten Sonden gebildet werden, hängt von der Art des eingesetzten Reportermoleküls ab (das entweder auf der Sonde oder dem zu analysierenden Target-Strang vorliegt) und kann mit Hilfe eines kolorimetrischen, Fluoreszenz-, radiometrischen Nachweises oder eines beliebigen anderen Verfahrens im Stand der Technik erfolgen.
  • Der Begriff "(HCV)-Isolate" bezieht sich auf jedes biologische Fluid, enthaltend genetisches Material von Hepatitis C-Virus, das von natürlicherweise infizierten Menschen oder experimentell infizierten Tieren erhalten wurde, und bezieht sich auch auf Fluide, die genetisches Material von Hepatitis C-Virus enthalten, welches aus in vitro-Experimenten erhalten wurde. Beispielsweise können aus in vitro-Kultivierungsexperimenten sowohl Zellen als auch Wachstumsmedium als Quelle von HCV-Genommaterial eingesetzt werden.
  • Der Ausdruck "hybridisieren" oder "Target" bezieht sich auf ein Hybridisierungsexperiment, welches nach einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt wird und den Nachweis homologer Targets (einschließlich einer oder weniger Fehlpaarung(en)) oder vorzugsweise vollständig homologer Targets (keine Fehlpaarungen zugelassen) erlaubt.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde für die hochkonservierten 5'-UR ein empfindliches PCR-Protokoll mit Sätzen von verschachtelten Universalprimern eingesetzt. Die Positionen und Sequenzen dieser Primer wurden aus den Sequenzen von früher beschriebenen Sequenzen vom Typ 1 und 2 und der Typ 3-Sequenz BR56 (Fig. 2) abgeleitet. Das erhaltene Amplifizierungsprodukt wurde mit Oligonucleotiden hybridisiert, welche gegen die variablen Regionen der 5'-UR gerichtet waren, immobilisiert als parallele Linien auf Membranstreifen (Prinzip der reversen Hybridisierung). Dieser Hybridisierungsassay, als Linien-Sonden-Assay (LiPA) bezeichnet, ist ein schneller Assay, mit dem bisher schlecht beschriebene Isolate mit Ähnlichkeit mit 24, 26 und 27 (Bukh et al., 1992) nachgewiesen wurden. Eine neue Typ 4- Klassifizierung wird für diese HCV-Stämme vorgeschlagen. Andere Isolate mit Ähnlichkeit mit BE95 und BE96 und mit SA1 (Cha et al., 1992) können unterschieden werden und es wird vorgeschlagen, solche Isolate als Typ 5a zu klassifizieren. Isolate mit Ähnlichkeit mit HK2 (Bukh et al., 1992) können unterschieden werden und es wird ein neuer Klassifizierungstyp 6a vorge-schlagen. Ein neuer Genotyp wurde in dem Isolat BE98 nachgewiesen und es wird vorge-schlagen, dieses Isolat in den HCV-Typ 3, Subtyp 3c einzuordnen. Eine weitere neue Sequenz wurde in GB438 nachgewiesen, welche als 4f klassifiziert werden konnte.
  • Diese LiPA-Technologie erlaubt eine leichte und schnelle Bestimmung von HCV-Typen und deren Subtypen, welche in Patientenserum vorliegen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Satz von Sonden eingesetzt, der mindestens zwei Sonden umfaßt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich in dem erfindungsgemäßen Verfahren die eingesetzte Sonde gegen eine Region von mindestens 5 Nucleotiden in einer der folgenden Domänen:
  • a) die sich von dem Nucleotid in Position -293 bis zu dem Nucleotid in Position -278 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • b) die sich von dem Nucleotid in Position -275 bis zu dem Nucleotid in Position -260 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • c) die sich von dem Nucleotid in Position -253 bis zu dem Nucleotid in Position -238 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • d) die sich von dem Nucleotid in Position -244 bis zu dem Nucleotid in Position -229 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • e) die sich von dem Nucleotid in Position -238 bis zu dem Nucleotid in Position -223 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • f) die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • g) die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • h) die sich von dem Nucleotid in Position -83 bis zu dem Nucleotid in Position -68 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • i) die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position -88 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • j) die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position -130.
  • Die Regionen -170 bis -155 und -141 bis -117 repräsentieren variable Regionen in der linearen Sequenz, welche Teil desselben Stammes in der viralen RNA sein können. Folglich könnten Mutationen in einer Region durch eine andere Mutation in einer anderen Region ergänzt werden, um eine RNA-Doppelstrang-Bildung zu erlauben oder nicht zu erlauben. Es steht zu erwarten, daß in den gleichen Positionen bei anderen neuen HCV- Typen ebenfalls eine Variation auftritt, und deshalb könnten diese variablen Regionen zu der Unterscheidung zwischen allen gegenwärtigen und noch aufzufindenden HCV-Typen beitragen.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Sonde, die bis zu 50 Nucleotide enthält, umfassend mindestens eine der folgenden Sequenzen:
  • worin Y T oder C darstellt, K G oder T darstellt und R G oder A darstellt,
  • - oder die entsprechende Sequenz, worin T durch U ersetzt wurde,
  • - oder die Sequenzen, die zu den oben definierten Sequenzen komplementär sind, oder Varianten dieser Sonden, die folgendermaßen gekennzeichnet sind:
  • - Sonden, bei denen die Position der typspezifischen Nucleotide dieser Sondensequenz geändert wurde, um unter einer gewissen Hybridisierungsbedingung eine spezifischere Hybridisierung zu erreichen, oder
  • - Sonden, bei denen diese Sondensequenz verlängert oder verkürzt wurde, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, oder
  • - Sonden, bei denen die Leserichtung dieser Sondensequenz umgekehrt wurde, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, oder
  • - Sonden, bei denen Inosine eingebaut wurden, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, oder
  • - Sonden, bei denen fehlgepaarte Nucleotide eingebaut wurden, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, und wobei sich diese Sonde von AACCCACTCTATGYCCGGYCAT und GAATCGCTGGGGTGACCG, worin Y C oder T/U bedeutet, unterscheidet.
  • Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden mindestens zwei der obengenannten Sonden oder eine Mischung von zwei dieser Sonden eingesetzt, um zwischen verschiedenen HCV- Typen oder -Subtypen, wie im folgenden definiert, zu unterscheiden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für jeden zu bestimmenden Typ oder Subtyp von HCV ein Satz von zwei verschiedenen Sonden oder eine Mischung zweier verschiedener Sonden eingesetzt, wobei jede Sonde des Satzes bzw. der Mischung wie oben definiert ist.
  • Die Erfindung betrifft auch eine Sonde, welche eine derartige Sequenz aufweist, daß sie gerichtet ist gegen:
  • - die folgende Sequenz: TTC TTG GAA CTA ACC C,
  • - oder die entsprechende Sequenz, worin T durch U ersetzt wurde,
  • - oder die Sequenzen, welche komplementär zu den oben definierten Sequenzen sind.
  • Die Erfindung betrifft auch einen Satz von zwei Sonden oder Mischungen von zwei Sonden, worin jede der beiden Sonden aus 10 bis 40 aufeinanderfolgenden Nucleotiden besteht, und worin die beiden jeweiligen Sonden sich gegen zwei Regionen richten, die jeweils aus den folgenden Paaren von Domänen ausgewählt sind:
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position - 117 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position - 88 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position - 88 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -83 bis zu dem Nucleotid in Position -68 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -83 bis zu dem Nucleotid in Position -68 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position - 130 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -132 bis zu dem Nucleotid in Position -117 iii Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position - 130 in Fig. 2 erstreckende Domäne,
  • * die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position -130 in Fig. 2 erstreckende Domäne und die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position - 88 in Fig. 2 erstreckende Domäne.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Typisierung von HCV-Isolaten aus einer biologischen Probe, die vermutlich HCV enthält,
  • als zu mindestens einem der folgenden HCV-Typen gehörig: HCV-Typ 1, HCV-Typ 2, HCV-Typ 3, HCV-Typ 4, HCV-Typ 5, HCV-Typ 6, umfassend die folgenden Schritte:
  • - In-Kontakt-Bringen dieser Probe, bei der die Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide falls nötig durch geeignete Denaturierung zugänglich gemacht wurden, mit mindestens einer Sonde, die fähig ist, mit einer Region in derjenigen Domäne zu hybridisieren, die sich von dem Nucleotid in Position -291 bis zu dem Nucleotid in Position -66 der 5'-UR von HCV-Isolaten, die durch ihre cDNA- Sequenzen in Fig. 2 und 4 repräsentiert werden, erstreckt, wobei die negative Numerierung der Nucleotidposition an dem Nucleotid beginnt, welches dem ersten ATG-Codon in dem für das HCV- Polyprotein kodierenden offenen Leserahmen vorangeht, oder wobei die Sonde zu den oben definierten Sonden komplementär ist;
  • - Nachweisen der gegebenenfalls zwischen dieser Sonde und der Target- Region gebildeten Komplexe, sowie
  • - Ziehen von Schlußfolgerungen auf die vorliegenden HCV-Typen aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Typisierung von HCV-Isolaten als zu mindestens einem der folgenden HCV-Typen gehörig: HCV-Typ 1, HCV-Typ 2, HCV-Typ 3, HCV-Typ 4, HCV-Typ 5 und HCV-Typ 6, derart, daß die verwendeten Sonden fähig sind, sich gegen mindestens eine der folgenden Target- Regionen oder diese Regionen, in denen T durch U ersetzt worden ist, oder die zu den obengenannten Regionen komplementären Regionen zu richten:
  • für HCV-Typ 1 und 6:
  • für HCV-Typ 1:
  • für HCV-Typ 2:
  • für HCV-Typ 3:
  • für HCV-Typ 4 und 5:
  • für HCV-Typ 4:
  • für HCV-Typ 4, 3c und 3b:
  • für HCV Typ 4 und 3b:
  • für HCV Typ 4:
  • für HCV-Typ 5:
  • für HCV-Typ 6:
  • worin Y C oder T darstellt und K G oder T darstellt, oder wobei die verwendeten Sonden einen Satz von zwei Sonden, die aus den oben definierten Sonden ausgewählt sind, darstellen.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des oben definierten Verfahrens zur Bestimmung des Typs oder der Typen von HCV-Isolaten, die in einer biologischen Probe vorliegen.
  • Dem Begriff "Typ" entspricht eine Gruppe von HCV-Isolaten, bei denen das gesamte Genom mehr als 74% Homologie auf der Nukleinsäureebene oder bei denen die NS5-Region zwischen den Nucleotidpositionen 7935 und 8274 mehr als 74% Homologie auf der Nukleinsäureebene oder bei denen das gesamte HCV-Polyprotein mehr als 78% Homologie auf der Aminosäureebene oder bei denen die NS5-Region zwischen den Aminosäuren in den Positionen 2646 und 2758 mehr als 80% Homologie auf der Aminosäureebene zu Genomen der anderen Isolate der Gruppe zeigt, wobei die Numerierung mit dem ersten ATG-Codon oder Methionin des HCV-Polyproteins des HCV-J-Isolats beginnt (Kato et al., 1990). Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, weisen Homologien von weniger als 74% auf der Nukleinsäureebene und weniger als 78% auf der Aminosäureebene auf. Isolate, die zum selben Typ gehören, zeigen gewöhnlich Homologien von etwa 92 bis 95% auf der Nukleinsäureebene und 95 bis 96% auf der Aminosäureebene, wenn sie zum selben Subtyp gehören, und diejenigen, welche zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, zeigen vorzugsweise Homologien von etwa 79% auf der Nukleinsäureebene und 85 bis 86% auf der Aminosäureebene. In bevorzugter Weise sollte die Klassifizierung von HCV-Isolaten gemäß der Tatsache vorgenommen werden, daß
  • (1) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS5b-Region zwischen den Nucleotiden 7935 und 8274 (Choo et al., 1991) oder 8261 und 8600 (Kato et al., 1990) oder 8342 und 8681 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,34, gewöhnlich von weniger als 0,33 und üblicherweise von weniger als 0,32 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,135, gewöhnlich von weniger als 0,13 und üblicherweise von weniger als 0,125 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,135 bis 0,34, gewöhnlich im Bereich von 0,14 bis 0,33 und üblicherweise im Bereich von 0,15 bis 0,32 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,34, gewöhnlich von mehr als 0,35 und üblicherweise von mehr als 0,36 zeigen,
  • (2) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der Core/EI-Region zwischen den Nucleotiden 378 und 957, Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,38, gewöhnlich von weniger als 0,37 und üblicherweise von weniger als 0,36 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,17, gewöhnlich von weniger als 0,16 und üblicherweise von weniger als 0,15 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,15 bis 0,38, gewöhnlich im Bereich von 0,16 bis 0,37 und üblicherweise im Bereich von 0,17 bis 0,36 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,36, gewöhnlich von mehr als 0,365 und üblicherweise von mehr als 0,37 zeigen,
  • (3) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS3/NS4-Region zwischen den Nucleotiden 4664 und 5292 (Choo et al., 1991) oder zwischen den Nucleotiden 4993 und 5621 (Kato et al., 1990) oder zwischen den Nucleotiden 5017 und 5645 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,35, gewöhnlich von weniger als 0,34 und üblicherweise von weniger als 0,33 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,19, gewöhnlich von weniger als 0,18 und üblicherweise von weniger als 0,17 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,17 bis 0,35, gewöhnlich im Bereich von 0,18 bis 0,34 und üblicherweise im Bereich von 0,19 bis 0,33 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,33, gewöhnlich von mehr als 0,34 und üblicherweise von mehr als 0,35 zeigen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung können beliebige der Sonden mit den Bezeichnungen SEQ ID NO 5, 28 und 6 eingesetzt werden, um den Typ 1 zu identifizieren; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 8 bis 12 oder 22 bis 26 und 32 bis 34 können eingesetzt werden, um den Typ 2 zu identifizieren; und beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 13, 14, 36, 21 oder 54, um den Typ 3 zu identifizieren; und beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 17, 18 oder 19 und 37 bis 43 und der Sonden der SEQ ID NO 49, 50 und 53, um den Typ 4 zu identifizieren.
  • Die Sonden 44 bis 47 können zur Identifizierung des Typs 5 eingesetzt werden, die Sonde 48 kann zur Identifizierung des Typs 6 eingesetzt werden.
  • Die folgenden Regionen könnten ebenfalls zur Unterscheidung bestimmter Typen eingesetzt werden: die Region zwischen den Positionen -238 bis -223 für den Typ 2, die Region zwischen den Positionen -244 bis -229 für den Typ 4, die Regionen zwischen den Positionen -253 bis -238 oder zwischen den Positionen -275 bis -260 oder zwischen den Positionen -293 bis -278 für den Typ 3.
  • Das Nucleotid an Position -2 kann ebenfalls zur weiteren Unterscheidung zwischen bestimmten Typen oder Subtypen eingesetzt werden.
  • Das Verfahren der Erfindung umfaßt auch die Unterscheidung und Einteilung von HCV-Sub-typen, wobei neben den obengenannten Sonden auch Sonden eingesetzt werden, die mit den folgenden Target-Regionen hybridisieren oder diesen Regionen, in denen T durch U ersetzt worden ist, oder den Regionen, die zu den oben definierten Regionen komplementär sind,
  • für HCV-Typ 1, Subtyp 1a:
  • für HCV-Typ 1, Subtyp 1b:
  • worin Y C oder T darstellt,
  • für HCV-Typ 2, Subtyp 2a:
  • worin R A oder G darstellt,
  • für HCV-Typ 2, Subtyp 2b:
  • für HCV-Typ 2, Subtyp 2c:
  • für HCV-Typ 3, Subtype 3a:
  • worin K G oder T darstellt,
  • für HCV-Typ 3, Subtyp 3b:
  • für HCV Typ 3, Subtyp 3c:
  • für HCV-Typ 4, Subtyp 4a oder 4d:
  • für Typ 4, Subtyp 4b:
  • für Typ 4, Subtyp 4c:
  • für Typ 4, Subtyp 4e:
  • für Typ 4, Subtyp 4f:
  • für Typ 4, Subtyp 4g (vorläufig):
  • für Typ 4, Subtyp 4h (vorläufig):
  • oder wobei es sich bei den verwendeten Sonden um einen Satz von zwei aus den definierten Sonden ausgewählten Sonden handelt.
  • Die Erfindung betrifft auch die Anwendung des oben definierten Verfahrens zur Bestimmung des HCV-Subtyps oder der HCV-Subtypen, der bzw. die in einer zu analysierenden biologischen Probe vorliegt/vorliegen.
  • Dem Begriff "Subtyp" entspricht eine Gruppe von HCV-Isolaten, bei denen das gesamte Genom oder das gesamte Polyprotein eine Homologie von mehr als 90% sowohl auf der Nukleinsäure- als auch auf der Aminosäureebene zeigt oder bei denen die Region in NS5 zwischen den Nucleotidpositionen 7935 und 8274 eine Homologie von mehr als 88% auf der Nukleinsäureebene zu den entsprechenden Teilen der Genome der anderen Isolate derselben Gruppe zeigt, wobei diese Numerierung mit dem Adeninrest des Initiationscodons des langen ORF beginnt. Isolate, die zu verschiedenen HCV-Subtypen gehören und zum selben HCV-Typ gehören, zeigen Homologien von mehr als 74% auf der Nukleinsäureebene und von mehr als 78% auf der Aminosäureebene.
  • Bevorzugter sollte das obengenannte Verfahren, welches die Klassifizierung von HCV-Isolaten in Typen und Subtypen betrifft, gemäß der Tatsache durchgeführt werden, daß
  • (1) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS5b-Region zwischen den Nucleotiden 7935 und 8274 (Choo et al., 1991) oder 8261 und 8600 (Kato et al., 1990) oder 8342 und 8681 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,34, gewöhnlich von weniger als 0,33 und üblicherweise von weniger als 0,32 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,135, gewöhnlich von weniger als 0,13 und üblicherweise von weniger als 0,125 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,135 bis 0,34, gewöhnlich im Bereich von 0,14 bis 0,33 und üblicherweise im Bereich von 0,15 bis 0,32 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,34, gewöhnlich von mehr als 0,35 und üblicherweise von mehr als 0,36 zeigen,
  • (2) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der Core/EI-Region zwischen den Nucleotiden 378 und 957, Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,38, gewöhnlich von weniger als 0,37 und üblicherweise von weniger als 0,36 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,17, gewöhnlich von weniger als 0,16 und üblicherweise von weniger als 0,15 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,15 bis 0,38, gewöhnlich im Bereich von 0,16 bis 0,37 und üblicherweise im Bereich von 0,17 bis 0,36 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,36, gewöhnlich von mehr als 0,365 und üblicher von mehr als 0,37 zeigen,
  • (3) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS3/NS4-Region zwischen den Nucleotiden 4664 und 5292 (Choo et al., 1991) oder zwischen den Nucleotiden 4993 und 5621 (Kato et al., 1990) oder zwischen den Nucleotiden 5017 und 5645 (Okamoto et al., 1991), Isolate, die zum selben HCV-Typ gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,35, gewöhnlich von weniger als 0,34 und üblicherweise von weniger als 0,33 zeigen, und Isolate, die zum selben Subtyp gehören, Nucleotiddistanzen von weniger als 0,19, gewöhnlich von weniger als 0,18 und üblicherweise von weniger als 0,17 zeigen, und folglich Isolate, die zum selben Typ, jedoch verschiedenen Subtypen gehören, Nucleotiddistanzen im Bereich von 0,17 bis 0,35, gewöhnlich im Bereich von 0,18 bis 0,34 und üblicherweise im Bereich von 0,19 bis 0,33 zeigen, und Isolate, die zu verschiedenen HCV-Typen gehören, Nucleotiddistanzen von mehr als 0,33, gewöhnlich von mehr als 0,34 und üblicherweise von mehr als 0,35 zeigen.
  • Bei Anwendung dieser Kriterien können HCV-Isolate in mindestens 6 Typen klassifiziert werden.
  • Bei den Typen 1, 2, 3 und 4 können eindeutig mehrere Subtypen (1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e und 4f) unterschieden werden, basierend auf Homologien der 5'-UR und der kodierenden Regionen, einschließlich des NS5-Abschnitts zwischen den Positionen 7935 und 8274 und der C/El-Region zwischen den Nucleotiden 317 und 957, und basierend auf Vergleichen mit den Isolaten 21 und DK13 wie in Bukh et al. (1993) beschrieben.
  • Eine weitere Unterteilung des Typs 4 in die Subtypen 4g und 4h ist vorläufig und basiert nur auf Unterschieden in der 5'-UR. Ein Überblick über die meisten beschriebenen Isolate und deren vorgeschlagene Klassifizierung entsprechend dem Typisierungssystem der vorliegenden Erfindung wird in Tabelle 1 gegeben.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Sonde mit SEQ ID NO 31 zur Identifizierung des Subtyps 1a eingesetzt werden; die Sonden mit SEQ ID NO 7 und 30 können zur Identifizierung des Subtyps 1b eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 9, 10, 22 oder 24 können zur Identifizierung des Subtyps 2a eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 11, 12, 23 oder 25 können zur Identifizierung des Subtyps 2b eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 33 oder 34 können zur Identifizierung des Subtyps 2c eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 13, 14 oder 35 können zur Identifizierung des Subtyps 3a eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 38, 19 und 21 können zur Identifizierung des Subtyps 3b, 4a oder 4d eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 38 oder 41 können zur Identifizierung des Subtyps 4b eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 42 oder 43 können zur Identifizierung des Subtyps 4c eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 39, 40 oder 41 können zur Identifizierung von 4e eingesetzt werden; 51, 38, 19 oder 7 für 4f; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 49 oder 50 können zur Identifizierung des mutmaßlichen Subtyps 4h eingesetzt werden; beliebige der Sonden mit SEQ ID NO 50 oder 53 können zur Identifizierung des mutmaßlichen Subtyps 4g eingesetzt werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden die HCV-Typen oder -Subtypen, zwischen denen zu unterscheiden ist, auch mittels Universalsonden für HCV identifiziert, wie z. B. denjenigen, die sich gegen eine der folgenden Regionen richten:
  • Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung geht dem Hybridisierungsschritt ein Schritt der Amplifizierung des die Target-Region enthaltenden Desoxyribonucleotids oder Ribonucleotids voraus, welcher vorteilhaft die folgenden Schritte umfaßt:
  • - In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, die das zu typisierende oder subtypisierende Isolat enthalten kann, mit einem Satz Primer, welche die Target-Region flankieren, wobei diese Primer zu konservierten Regionen des HCV-Genoms komplementär sind und vorzugsweise zu den 5'-nichttranslatierten konservierten Regionen des HCV-Genoms komplementär sind, wobei die Primer vorzugsweise über mindestens 8 aufeinanderfolgende Nucleotide, bevorzugterweise etwa 15 und noch in bevorzugter Weise mehr als 15 aufeinanderfolgende Nucleotide, verfügen, wobei diese aufeinanderfolgenden Nucleotide jeweils komplementär zu Sequenzen sind, die aus der sich von dem Nucleotid -341 bis zu dem Nucleotid -171 erstreckenden Region und der sich von dem Nucleotid -67 bis zu dem Nucleotid -1 erstreckenden Region der Fig. 2 und 4 ausgewählt sind.
  • Alternativ könnten sich die Antisense-Primer auch in die Core-Region erstrecken, oder der Satz von Primern ist darauf gerichtet oder könnte darauf gerichtet sein, daß sowohl die 5'-UR als auch die Core- Region amplifiziert wird, entweder in 1 PCR-Fragment oder mit einem Satz von Primern für jede der beiden Regionen. Folglich können Sonden von der Core-Region, fähig, mit (sub)typspezifischen Regionen in Core-PCR-Produkten zur hybridisieren, in den Linien-Sonden-Assay zur weiteren Unterscheidung zwischen Typen und/oder Subtypen eingeschlossen sein,
  • - Amplifizieren der Target-Region, z. B. über eine Polymerasekettenreaktion mittels des obengenannten Satzes von Primern und gegebenenfalls Einbauen eines Markers, wie Digoxigenin oder Biotin, in die amplifizierte Target-Sequenz, wobei zwischen 20- und 80mal, vorteilhafterweise zwischen 30- und 50mal, amplifiziert wird.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der zu analysierende Strang entweder in vivo oder in vitro vor der Hybridisierung enzymatisch oder chemisch modifiziert werden. Viele Systeme zur Kopplung von Reportergruppen an Nukleinsäureverbindungen wurden beschrieben, basierend auf der Verwendung solcher Markierungen wie Biotin oder Digoxigenin. In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Sandwich-Hybridisierung eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die in dem zu analysierenden Strang vorliegende Target-Sequenz in cDNA überführt, wobei diese cDNA durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren, wie z. B. die Polymerasekettenreaktion (PCR; Saiki et al., 1988), Ligasekettenreaktion (LCR; Landegren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989, Barany, 1991), Amplifizierung auf Nukleinsäuresequenzbasis (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), das Amplifizierungssystem auf Transkriptionsbasis (TAS; Kwoh et al., 1989), die Strangverdrängungsamplifizierung (SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992) oder Amplifizierung mittels Qb-Replikase (Lizardi et al., 1988, Lomeli et al., 1989), amplifiziert wird.
  • Der cDNA-Amplifizierungsschritt wird vorzugsweise mittels PCR- Technologie erreicht und kann bestehen aus den Schritten:
  • (a) Bereitstellung eines Satzes von Primern für ein Polymerasekettenreaktionsverfahren, welche die nachzuweisende TargetSequenz flankieren;
  • (b) Amplifizierung der Target-Region durch ein Polymerasekettenreaktionsverfahren mittels der Primer von (a); wobei in demselben Schritt ein geeignetes Markierungs-molekül in das amplifizierte Target inkorporiert werden kann, wobei das Markierungs-molekül vorzugsweise Digoxigenin oder Biotin ist.
  • Dem Begriff "Primer" entsprechen Oligonucleotidsequenzen, die zu konservierten Regionen von Sense- oder Antisense-Strängen von cDNA oder RNA, abgeleitet von dem HCV-Genom, komplementär sind; vorzugsweise aus den 5'-nichttranslatierten konservierten Regionen des HCV-Genoms und bevorzugter aus konservierten Regionen der 5'- nichttranslatierten Region des HCV-Genoms, welche die Positionen -341 bis -171 und -67 bis -1 umfaßt, oder der Core-Region ausgewählt.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren derart, daß die Amplifizierung aus einem doppelten PCR- Schritt besteht, wobei bei jedem Schritt ein spezifischer Satz von Primern verwendet wird, wobei bei dem ersten Schritt äußere Primer, ausgewählt aus der Region, die sich von Nucleotid -341 bis Nucleotid -186 erstreckt, und der Region, die sich von Nucleotid -52 bis Nucleotid -1 erstreckt, und insbesondere der folgende Satz:
  • oder deren komplementäre Sätze,
  • worin W A oder T darstellt, verwendet werden, und wobei bei dem zweiten Schritt innere Primer, ausgewählt aus der Region, die sich von Nucleotid -326 bis Nucleotid -171 erstreckt, und der Region, die sich von Nucleotid -68 bis Nucleotid -1 erstreckt, und insbesondere der folgende Satz:
  • worin R A oder G darstellt und Y T oder C darstellt, oder dazu komplementäre Sätze verwendet werden.
  • Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird eine doppelte PCR durchgeführt mit äußeren Primern in der ersten Runde, unter Einschluß von Sequenzen wie in SEQ ID NO 1 und 2 dargestellt oder ihrer komplementären Sequenzen, und mit inneren Primern für die zweite Runde, unter Einschluß von Sequenzen wie in SEQ ID NO 3 und 4 dargestellt oder ihrer komplementären Sequenzen.
  • Der Begriff "geeignetes Markierungsmolekül" kann die Verwendung markierter Nucleotide einschließen, die während des Polymeraseschritts der Amplifizierung inkorporiert werden, wie in Saiki et al. (1988) und Bej et al. (1990) erläutert, und/oder oder jedes andere Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist.
  • Die in dieser Erfindung beschriebenen Assays können auf verschiedene Arten verbessert werden, die für den Fachmann naheliegen werden. Beispielsweise kann den cPCR-Reaktionen ein RNA-Einfangschritt vorangehen.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die mindestens einen Oligonucleotid- Primer umfaßt, welcher Primer vorzugsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, wobei diese aufeinanderfolgenden Nucleotide jeweils komplementär zu Sequenzen sind, welche aus der Region, die sich von Nucleotid -341 bis Nucleotid -171 erstreckt, und aus der Region, die sich von Nucleotid -67 bis Nucleotid -1 erstreckt, (von Fig. 2) oder deren komplementären Sequenzen ausgewählt sind.
  • Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die mindestens einen Oligonucleotid- Primer umfaßt, der vorzugsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, wobei die aufeinanderfolgenden Nucleotide aus irgendeiner der folgenden Sequenzen:
  • worin W A oder T darstellt, R A oder G darstellt und Y T oder C darstellt, oder deren komplementären Sequenzen ausgewählt sind.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt das Verfahren der Erfindung zur gleichzeitigen Typisierung aller in einer biologischen Probe enthaltenen HCV-Isolate den Schritt, daß eines der folgenden Elemente:
  • - entweder die genannte biologische Probe, in der das genetische Material hybridisierungsbereit gemacht wurde,
  • - oder das in der biologischen Probe enthaltene gereinigte genetische Material,
  • - oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltene Einzelkopien,
  • - oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltene amplifizierte Kopien,
  • mit einem festen Träger, auf dem zuvor Sonden wie oben definiert immobilisiert wurden, in Kontakt gebracht wird.
  • Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die oben definierten Sonden auf einem festen Substrat immobilisiert.
  • Der Begriff "festes Substrat" kann sich auf jedes Substrat beziehen, an das eine Oligonucleotid-Sonde gekoppelt werden kann, vorausgesetzt, daß diese ihre Hybridisierungs-eigenschaften behält, und vorausgesetzt, daß das Hintergrundniveau der Hybridisierung niedrig bleibt. Gewöhnlich wird das feste Substrat eine Mikrotiterplatte oder eine Membran (z. B. Nylon oder Nitrocellulose) sein.
  • Vor der Aufbringung auf die Membran oder der Fixierung kann es günstig sein, die Nukleinsäure-Sonde zu modifizieren, um die Fixierung zu erleichtern oder die Hybridisierungs-effizienz zu verbessern. Solche Modifikationen können beinhalten Homopolymer- Tailing, Kopplung mit verschiedenen reaktiven Gruppen wie z. B. aliphatischen Gruppen, NH&sub2;-Gruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen, oder Kopplung mit Biotin oder Haptenen.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren den Schritt des In-Kontakt-Bringens einer beliebigen Sonde wie oben definiert mit einem der folgenden Elemente:
  • - entweder einer biologischen Probe, in der das genetische Material hybridisierungsbereit gemacht wurde,
  • - oder dem in der genannten biologischen Probe enthaltenen gereinigten genetischen Material,
  • oder einer von dem gereinigten genetischen Material erhaltenen Einzelkopie,
  • - oder einer von dem gereinigten genetischen Material erhaltenen amplifizierten Kopie, wobei die genannten Elemente zuvor auf einem Träger immobilisiert wurden.
  • Die Erfindung betrifft auch die Typisierung neuer Isolate.
  • Konkreter betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung neuer HCV-Typen oder -Subtypen, die sich von den bekannten Typen oder Subtypen unterscheiden, umfassend die folgenden Schritte:
  • - Bestimmen, nach dem oben definierten Verfahren, zu welchen bekannten Typen oder Subtypen das in der biologischen Probe vorliegende HCV-Isolat gehört, wobei gegebenenfalls diese biologische Probe zuvor, gegebenenfalls mittels HCV-Antigen- oder - Antikörper-Assays oder mit einer HCV-Universalsonde, wie z. B. den oben definierten, als HCV-haltig bestimmt worden ist,
  • - falls eine Probe beobachtet wird, die nicht mit mindestens einer der Sonden, die fähig sind, sich gegen die aus einer beliebigen der beiden Domänen wie oben definiert ausgewählten Regionen zu richten, positiv hybridisiert, Sequenzieren des vollständigen Genoms des in der Probe vorliegenden HCV-Typs oder als Alternative Sequenzieren des Teils bzw. der Teile der 5'-nichttranslatierten Region der Probe, der bzw. die einem neuen, zu bestimmenden Typ und/oder Subtyp entspricht/entsprechen.
  • Vofteilhafterweise umfaßt das Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von neuartigen HCV-Typen und/oder -Subtypen, die in einer biologischen Probe vorliegen und die sich bei Identifizierung eines neuartigen Typs von Typ 1, Typ 2, Typ 3, Typ 4, Typ 5 und Typ 6 unterscheiden und die sich bei Identifizierung eines neuartigen Subtyps für ein HCV-Isolat vom Typ 1 von den Subtypen 1a und 1b, für ein Isolat vom Typ 2 von den Subtypen 2a, 2b und 2c, für ein Isolat vom Typ 3 von den Subtypen 3a, 3b und 3c, für ein Isolat vom Typ 4 von den Subtypen 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g und 4h, für ein Isolat vom Typ 5 von dem Subtyp 5a, für ein Isolat vom Typ 6 von dem Subtyp 6a unterscheiden, die folgenden Schritte:
  • - Bestimmen, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, zu welchem bzw. welchen bekannten Typ(en) oder Subtyp(en) das in der zu analysierenden biologischen Probe vorliegende HCV-Isolat, bzw. die in der biologischen Probe vorliegenden HCV-Isolate, gehört bzw. gehören, wobei gegebenenfalls diese biologische Probe zuvor, gegebenenfalls mittels HCV-Antigen- oder -Antikörper-Assays oder mit einer HCV-Universalsonde, wie z. B. der oben definierten, als HCV-haltig bestimmt worden ist,
  • - falls eine Probe beobachtet wird, die nicht mit mindestens einer der Sonden, die fähig sind, sich gegen die aus einer der typspezifischen oder subtypspezifischen, oben definierten Domänen gewählten Regionen zu richten, hybridisiert, insbesondere die für Typ 1 nicht mit SEQ ID NO 5, 28 und 6, für Typ 2 nicht mit SEQ ID NO 8 bis 12 oder 22 bis 26 und 32 bis 34, für Typ 3 nicht mit SEQ ID NO 13, 14, 36, 21 oder 54, für Typ 4 nicht mit SEQ ID NO 17, 18, 19, 37 bis 43, 49, 50 und 53, und für Subtyp 1b nicht mit SEQ ID NO 7 und 30, für Subtyp 1a nicht mit SEQ ID NO 31, für Subtyp 2a nicht mit SEQ ID NO 9, 10, 22 oder 24, für Subtyp 2b nicht mit SEQ ID NO 11, 12, 23 oder 25, für Subtyp 2c nicht mit SEQ ID NO 33 oder 34, für Subtyp 3a nicht mit SEQ ID NO 13, 14 oder 35, für Subtyp 3b, 4a oder 4d nicht mit SEQ ID NO 38, 21 und 19, für Subtyp 4b nicht mit SEQ ID NO 38 oder 41, für Subtyp 4c nicht mit SEQ ID NO 42 oder 43, für Subtyp 4e nicht mit SEQ ID NO 39, 40 oder 41, für Subtyp 4f nicht mit SEQ ID NO 51, 38, 19 oder 7, für den vermutlichen Subtyp 4h nicht mit SEQ ID NO 49 oder 50 und für den vermutlichen Subtyp 4g nicht mit SEQ ID NO 50 oder 53 hybridisiert, Sequenzieren des vollständigen Genoms des in der Probe vor-liegenden HCV-Typs oder, als Alternative, Sequenzieren des Teils bzw. der Teile der 5'- nichtranslatierten Region der Probe, der bzw. die einem neuen, zu bestimmenden Typ und/oder Subtyp entspricht/entsprechen.
  • Dem Begriff "neue Isolate" entsprechen Isolate, welche nicht imstande sind, mit irgendeiner der 9 obengenannten Regionen zu hybridisieren, oder Reaktivitäten zeigen, welche nicht zutreffenderweise so interpretiert werden können, daß sie einem der gegenwärtig bekannten HCV-Typen oder -Subtypen entsprechen. Diese spezielle Ausführungsform der Erfindung kann auch durchgeführt werden durch die Schritte:
  • (a) Screenen von HCV-Antikörperpositiven Seren oder klinischen NANB-Hepatitis-Proben oder einer Population statistischer Proben durch cPCR (cDNA-PCR),
  • (b) Durchführung eines HCV-LiPA mit denjenigen Proben, von denen ein cPCR-Produkt erhalten wurde, und
  • (c) Klonierung und Sequenzierung dieser PCR-Fragmente, welche abweichende Reaktivitäten zeigen.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung des Typs bzw. der Typen sowie des Subtyps bzw. der Subtypen von HCV und/oder HIV und/oder HBV und/oder HTLV, der bzw. die in einer biologischen Probe vorliegt bzw. vorliegen, umfassend die folgenden Schritte:
  • - Bereitstellung von
  • * mindestens einer der Sonden wie oben definiert, vorzugweise der Sonden wie oben definiert, wodurch man den Genotyp (Typ und/oder Subtyp) von HCV bestimmen kann, und mindestens einer der folgenden Sonden:
  • * Sonden, die fähig sind, Oligonucleotide von HIV Typ 1 und/oder 2 nachzuweisen, die in dieser biologischen Probe vorhanden sein können, und/oder
  • * Sonden, die fähig sind, Oligonucleotide von HBV-Subtypen und/oder sAg-Mutanten und/oder cAg-Mutanten nachzuweisen, die in dieser biologischen Probe vorliegen können, und/oder
  • * Sonden, die fähig sind, Oligonucleotide von HTLV-I und/oder HTLV- II nachzuweisen, von denen angenommen wird, daß sie sich in der biologischen Probe befinden,
  • - gegebenenfalls Bereitstellung eines Satzes von Primern wie oben definiert sowie mindestens eines der folgenden Primer: Primer-Sätze für die Amplifizierung von jeweils Human-Immunschwäche-Virus (HIV)- und/oder HBV- und/oder Human-T-Zell-Leukämie-Virus (HTLV)- Oligonucleotiden mittels PCR-Reaktion und Amplifizierung der Oligonucleotide von HCV und entweder HBV und/oder HIV und/oder HTLV, die möglicherweise in der Probe vorliegen,
  • - In-Kontakt-Bringen
  • * der biologischen Probe, in der das genetische Material hybridisierungsbereit gemacht wurde,
  • * oder des in dieser biologischen Probe enthaltenen gereinigten genetischen Materials,
  • * oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltener Einzelkopien,
  • * oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltener amplifizierter Kopien,
  • mit den genannten oben definierten Sonden unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen den Sonden und den Target-Sequenzen von HCV-Isolaten und mindestens einem der folgenden Viren: HBV und/oder HIV und/oder HTLV, gestatten, sowie
  • - Nachweisen der zwischen den verwendeten Sonden und den gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegenden Target- Regionen gegebenenfalls gebildeten Komplexe.
  • Gemäß dieser Ausführungsform betrifft die Erfindung neben dem in einer biologischen Probe vorliegenden Typ oder Subtyp von HCV auch ein Verfahren zur Bestimmung des Typs oder Subtyps irgendeines anderen parenteral übertragenen viralen Isolats wie HTLV, HIV, HBV, dadurch gekennzeichnet, daß auf ein und demselben Streifen Sonden inkorporiert sind, welche spezifisch hybridisieren mit:
  • - den verschiedenen Typen und/oder Subtypen von HCV wie oben definiert,
  • - Human-Immunschwäche-Viren HIV-1 und HIV-2,
  • - Human-T-Zell-Leukämie-Viren HTLV-1 und HTLV-2,
  • - den verschiedenen HB-Oberflächenantigen (HBsAg)-Mutanten oder HB- Core-Antigen-HBcAg)- oder HB-Precore-Ag-Mutanten.
  • In einigen Testproben sind verschiedene Target-Sequenzen, deren spezifischer Nachweis von klinischer Bedeutung ist, gleichzeitig vorhanden. Für jede dieser Target-Sequenzen sollte ein separater Hybridisierungstest mit der entsprechenden Sonde durchgeführt werden. Die Kombination von unterschiedlichen typ/subtypspezifischen Sonden des Standes der Technik in Kombination mit den neuen und erfinderischen HCV-Typ/Subtyp-spezifischen Sonden wie in der vorliegenden Erfindung erläutert auf einem Membranstreifen könnte ein einfaches und verläßliches allgemeines Typisierungssystem für parenteral übertragene humane Viruserkrankungen zur Verfügung stellen. Falls eine Amplifizierung des zu analysierenden Stranges erforderlich ist, kann ein Satz von Primern für jeden zu unterscheidenden und zu klassifizierenden viralen Organismus bereitgestellt werden.
  • Die Erfindung betrifft auch einen festen Träger, insbesondere eine Mikrotiterplatte oder einen Membranstreifen, der auf bekannten Stellen seiner Oberfläche eine Auswahl der folgenden Sonden bzw. Komplementärsonden oder der obengenannten Sonden, bei denen T durch U ersetzt wurde, enthält:
  • - NO 5, NO 6, NO 7, NO 8, NO 9, NO 10, NO 11, NO 12, NO 13, NO 14, NO 15, NO 16, NO 17, NO 18, NO 19, NO 20, NÖ 21, NO 22, NO 23, NO 24, NO 25, NO 26, NO 27, NO 28 bis 54 und NO 93 bis 96 wie oben definiert sowie eine Kontrolle, um zu bestimmen, ob zwischen diesen Sonden und den Ribo- oder Desoxyribonucleotidsträngen von HCV, die in einer biologischen Probe, in der HCV-Isolate zu unterscheiden sind, enthalten sein können, eine Hybridisierung stattfindet.
  • Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Sonden in Form einer Linie auf einem Membranstreifen immobilisiert.
  • In dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Satz von Sonden, die jeweils an einer bekannten Stelle auf dem Membranstreifen aufgebracht sind, Sonden, welche aus den Sequenzen mit SEQ ID NO 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, SEQ ID NO 28 bis 54 und NO 93 bis 96 ausgewählt sind, sowie eine Kontrollinie für die Konjugat-Bindung.
  • Das Verfahren dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ermöglicht es, den Typ der HCV-Infektion schnell zu bestimmen. Dieser Assay bietet die Möglichkeit, zwischen mindestens 6 verschiedenen HCV-Typen zu unterscheiden, und könnte zwischen mindestens 18 Subtypen unterscheiden und stellt ein gutes Instrument für die Suche nach neuen Typen oder Subtypen von HCV dar. Beispielsweise können die neuen Subtypen 1c, 1d und Typ 7 und anderen neuen (Sub)typen spezifische Mutationen in den obengenannten Regionen enthalten, welche für einen spezifischen Nachweis mittels typenspezifischer Sonden, die von solchen neuen Sequenzen erhalten wurden, eingesetzt werden können.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Kit zur Bestimmung mindestens eines HCV-Isolats aus einer biologischen Probe, die ein solches enthalten kann, und zur Klassifizierung dieses HCV-Isolats nach HCV-Typ und - Subtyp, wobei dieses Kit enthält
  • - mindestens eine Sonde, die beliebig aus den oben definierten Sonden ausgewählt ist,
  • - einen Puffer oder für die Herstellung des Puffers, welcher die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den cDNAs und/oder RNAs von HCV-Isolaten gestattet, erforderliche Bestandteile;
  • - gegebenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Kit zur Typisierung mindestens eines HCV-Isolats aus einer biologischen Probe, die ein solches enthalten kann, und zur Klassifizierung dieses HCV-Isolats nach HCV-Typ und - Subtyp, wobei dieses Kit enthält
  • - gegebenfalls eine Universalsonde wie oben definiert,
  • - mindestens eine Sonde, die aus beliebigen Sonden der Erfindung ausgewählt ist,
  • - einen Puffer oder für die Herstellung des Puffers, welcher die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs von HCV-Isolaten gestattet, erforderliche Bestandteile;
  • - gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
  • Gemäß dieser Ausführungsform betrifft die Erfindung auch ein Kit zur Genotypbestimmung (Bestimmung des Typs und/oder Subtyps) von HCV- Isolaten, umfassend:
  • - einen Satz von Sonden wie oben definiert, vorzugsweise auf einem festen Substrat immobilisiert und noch bevorzugter auf ein und derselben Membran, und
  • - gegebenenfalls einen Satz von Primern wie oben definiert,
  • - einen Satz von Puffern, welche erforderlich sind, um die Hybridisierung sowie den Nachweis der gebildeten Hybride durchzuführen.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Kit zur Genotypbestimmung von HcV- Isolaten, die zu mindestens einem der folgenden HCV-Typen gehören: HCV-Typ 1, HCV-Typ 2, HCV-Typ 3, HCV-Typ 4, HCV-Typ 5, HCV-Typ 6, wobei das Kit enthält mindestens eine der oben definierten Sonden,
  • - den Puffer oder die für die Herstellung des Puffers, der die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den cDNAs und/oder RNAs der oben genannten HCV-Isolate gestattet, erforderlichen Bestandteile;
  • - gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
  • Die Erfindung betrifft vorteilhafterweise ein Kit zur Unterscheidung und Klassifizierung von HCV-Typen und -Subtypen, wobei das Kit enthält:
  • - mindestens eine der Sonden wie oben definiert,
  • - den Puffer oder die für die Herstellung des Puffers, der die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs der obengenannten HCV-Isolate gestattet, erforderlichen Bestandteile;
  • - gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
  • Es ist anzumerken, daß alle Sonden von SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 54 und SEQ ID NO 93 bis 96 neu sind.
  • Ferner sind die Sonden der SEQ ID NO 18, 29, 33, 34, 35, 40, 42, 43, 47, 49 und 54 von neuen Sequenzen abgeleitet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Sonde, die bis zu 50 Nucleotide mit einer solchen Sequenz enthält, daß sie gegen mindestens eine der folgenden universellen HCV-Sequenzen von der 5'- UR-Region von HCV gerichtet ist:
  • worin Y T oder C repräsentiert, oder die korrespondierende Sequenz, worin T durch U ersetzt wurde, oder die Sequenzen, welche komplementär zu den oben definierten Sequenzen sind, wobei diese Sonde von TTGCGGGGGCACGCCCAA verschieden ist und wobei die Sonde zur Identifizierung eines vorher amplifizierten Fragments aus einer HCV- 5'-nichttranslatierten Region eingesetzt wird.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN Fig. 1
  • Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel, welches die Länge der Fragmente der verschachtelten PCR zeigt. Spur A eines jeden Paares zeigt das PCR-Fragment bei Inkorporation von Bio-11-dUTP. Spur B ist das PCR- Fragment ohne Bio-11-dUTP. 1: Serum BR28, 2: Serum BR24, 3: Serum BR29, 4: Serum BR33, 5: Serum BR36, 6 und 7: Negativkontrollseren, 8: Serum JP62, 9: Serum BR23, 10: cPCR-Kontrolle ohne Matrize, M: Molekulargewichtsmarker
    • Fig. 2
  • Zuordnung der 5'-UR-Nucleotidsequenzen von Isolaten aus vier verschiedenen HCV-Typen. Die eingerahmten Nucleotide zeigen die Positionen von Sonden, welche zur Typbestimmung der vier verschiedenen Gruppen eingesetzt wurden. Die unterstrichenen Nucleotide werden zur Subtypbestimmung innerhalb einer jeden Gruppe eingesetzt. Der Punkt zwischen Nucleotid -140 und -139 in den meisten Sequenzen entspricht der Insertion in einigen der Typ-4-Isolate. Die Numerierung der Sonden entspricht den in Tabelle 4 verwendeten Nummern.
    • Fig. 3
  • Ergebnisse der HCV-LiPA-Typbestimmung einiger repräsentativer Seren. Der Streifen enthält 19 parallele Sondenlinien:
  • A: Sonde 5 (SEQ ID NO 5); B: Sonde 6 (SEQ ID NO 6); C: Sonde 7 (SEQ ID NO 7); D: Sonde 8 (SEQ ID NO 8); E: Sonde 26 (SEQ ID NO 26); F: Sonde 22 (SEQ ID NO 22) und Sonde 24 (SEQ ID NO 24); G: Sonde 10 (SEQ ID NO 10); H: Sonde 13 (SEQ ID NO 13); I: Sonde 14 (SEQ ID NO 14); J: Sonde 21 (SEQ ID NO 21); K: Sonde 15 (SEQ ID NO 15); L: Sonde 16 (SEQ ID NO 16); M: Sonde 17 (SEQ ID NO 17); N: Sonde 19 (SEQ ID NO 19); 0: Sonde 18 (SEQ ID NO 18); P: Sonde 155 (Antisense-Sonde. 5'-GGGGGCCTGGAGGCTG-3') (SEQ ID NO 97); Q: Sonde 27 (SEQ ID NO 27); R: Sonde 20 (SEQ ID NO 20); S. Kontrollinie für Konjugat-Bindung.
  • Die Streifen wurden mit cPCR-Produkten der folgenden Seren hybridisiert: Streifen 1: Serum BR5, Streifen 2: Serum BR12, Streifen 3: Serum BR18, Streifen 4: Serum BR22, Streifen 5: Serum BR19, Streifen 6: Serum BE95, Streifen 7: Serum BU79, Streifen 8: Serum BR23, Streifen 9: Serum JP63.
    • Fig. 4
  • Nucleotidsequenz-Zuordnung der 5'-nichttranslatierten HCV-Regionen der neuen Isolate BE90, BE91, BE92, BE93, BE94, BE95, BE96, BE97, BE98, BE99, GB48, GB116, GB358, GB569, GB549, GB809, CAM600, CAM736, GB478, GB724 und GB438 zu Sequenzen des HCV-Typs 1a (HCV-1), 1b (HCV- J), 2a (HC-J6), 2b (HC-J8), 3a (BR56), 3b (HCV-TR), 5 (SA1), 6 (HK1). Die zur Erstellung dieser Zuordnung verwendeten Sequenzen sind der EMBL-Datenbank entnommen und haben die folgenden Hinterlegungsnummer: ¹M62321, ²D10749, ³D00944, &sup4;D01221, &sup5;D13448, &sup6;D11443, &sup7;M84838 und &sup8;L08156. Die Sequenzen zwischen den Nucleotiden -220 und -180 sind nicht gezeigt, sie sind in allen Isolaten mit HCV-1 identisch. '-' bedeutet, daß das Nucleotid mit dem entsprechenden Nucleotid in HCV-1 identisch ist; '..', eine zwischen -145 und -144 gebildete Lücke, um die Zuordnung zu Typ 6-Sequenzen zu ermöglichen, die eine CA-Insertion aufweisen; '.', eine zwischen -138 und -137 in den meisten der Sequenzen gebildete Lücke, um die Zuordnung zu Sequenzen zu erhalten, welche ein zusätzliches Nucleotid in dieser Position aufweisen. * bezieht sich auf die konservierte HCV-Sequenz zwischen den Resten -220 und -180 wie in Fig. 2 dargestellt.
    • Fig. 5
  • Aminosäuresequenz-Zuordnung der NS5-Sequenzen der Isolate BE90, BE91, BE92, BE93, BE95, GB358, GB549 und GB809 zu bekannten Sequenzen wie in Tabelle 6 beschrieben.
    • Fig. 6
  • Linien-Sonden-Assays unter Einschluß der Sonde mit SEQ ID NO 32, getestet mit Seren des Typs 1 und 2. 1, Typ 1b-Serum BE82, 2, Typ 2a- Serum JP62, 3, Typ 2b-Serum BE91, A, Konjugat-Kontrolle, B, Sonden 20 und 27, C, Sonde 8, D, Sonde 26, E Sonde 32 (SEQ ID NO 32).
    • Fig. 7
  • Linien-Sonden-Assays unter Einschluß der Sonden mit SEQ ID NO 33 und 34, getestet mit Seren der Typen 2a, 2b und 2c. 1, Typ 2a-Serum JP62, 2, Typ 2b-Serum BE91, 3, Typ 2c-Serum BE92, A, Konjugat-Kontrolle, B, Sonden 20 und 27, C, Sonde 8, D, Sonde 26, E, Sonde 32, F, Sonde 22, G, Sonde 24, H, Sonde 23, I, Sonde 25, J, Sonde 33 (SEQ ID NO 33), K, Sonde 34 (SEQ ID NO 34).
    • Fig. 8
  • Linien-Sonden-Assays unter Einschluß der Sonden mit SEQ ID NO 31, 37 und 38, getestet mit Typ 4-Seren. 1, Typ 4a-Serum GB116, 2, Serum GB113, 3, Typ 4f-Serum GB438, A, Konjugat-Kontrolle, B, Sonden 20 und 27, C, Sonde 37 (SEQ ID NO 37), D, Sonde 38 (SEQ ID NO 38), E, Sonde 19, F, Sonde 31 (SEQ ID NO 31), G, Sonde 7.
    • Fig. 9
  • Linien-Sonden-Assays unter Einschluß der Sonden mit SEQ ID NO 44, 45 und 46, getestet mit Seren der Typen 4a und 5a. 1, Typ 5a-Serum BE95, 2, Typ 4a-Serum GB116, A, Konjugat-Kontrolle, B, Sonden 20 und 27, C, Sonde 44 (SEQ ID NO 44), D, Sonde 45 (SEQ ID NO 45), E, Sonde 46 (SEQ ID NO 46), F, Sonde 31 (SEQ ID NO 31), G, Sonde 7.
    • Fig. 10
  • Linien-Sonden-Assays unter Einschluß der Sonden mit SEQ ID NO 93, 94, 95 und 96, getestet mit Seren der Typen 4a und 5a. 1, Typ 4a-Serum GB116, 2, Typ 5a-Serum BE95, A, Konjugat-Kontrolle, B, Sonden 20 und 27, C, Sonde 93 (SEQ ID NO 93), eingesetzt in einer Konzentration von 0,4 pMol/ul, D, Sonde 94 (SEQ ID NO 94), eingesetzt in einer Konzentration von 2,5 pMol/ul, E, Sonde 94 (SEQ ID NO 94), eingesetzt in einer Konzentration von 1,0 pMol/ul, F, Sonde 94 (SEQ ID NO 94), eingesetzt in einer Konzentration von 0,4 pMol/ul, G, Sonde 95 (SEQ ID NO 95), eingesetzt in einer Konzentration von 2,5 pMol/ul, H, Sonde 95 (SEQ ID NO 95), eingesetzt in einer Konzentration von 1,0 pMol/ul, 1, Sonde 95 (SEQ ID NO 95), eingesetzt in einer Konzentration von 0,4 pMol/ul, J, Sonde 96 (SEQ ID NO 96), eingesetzt in einer Konzentration von 0,4 pMol/ul.
    • Tabelle 1 Überblick über die verschiedenen Klassifizierungssysteme Tabelle 2 Interpretation der in Fig. 3 dargestellten Ergebnisse Tabelle 3
  • Endergebnisse der HCV-LiPA-Typisierungs- und HCV-Antikörper-Assays. Es wird eine Zusammenfassung der Typisierung in bezug auf die Serologie gegeben. Der INNO-LIA-HCV-Ab-Assay enthält eine Linie mit NS4-Epitopen, eine Linie mit NS5-Epitopen und vier Linien mit Core- Epitopen. Nur die höchste Bewertung für die Core-Linien ist angegeben. Die Intensität des Signals wird durch eine Zahl angegeben: 0 = negativ; 9 = unbestimmt; 1 bis 3 = positiv. Die abschließende Interpretation des Antikörpertests ist in der LIA-Spalte angegeben: 1 = positiv; 0 = negativ; 9 = unbestimmt.
  • Das Signal-Rauschverhältnis der in dem Innotest HCV Ab getesteten Sonden ist für einige der Seren ebenfalls angegeben.
    • Tabelle 4 Nucleotidsequenz, Position und Orientierung der Primer und Sonden Tabelle 5
  • Überblick über neue Sonden, die von neuen Typen und Subtypen von HCV konstruiert wurden. Der Typ oder Subtyp, für den eine Klassifizierung möglich oder verbessert ist,
  • die Sequenz und die SEQ ID NO sind angegeben.
  • * repräsentiert eine Sonde, welche nicht den Typ oder Subtyp aller Isolate bestimmt, von denen befunden wurde, daß sie diesen Typ oder Subtyp repräsentieren. Die unterstrichenen Buchstaben zeigen vorläufige Einteilungen in Subtypen an.
    • Tabelle 6
  • Sequenzhomologie zwischen BE90, BE91, BE92, BE93, BE95, GB358, GB549 und GB809 und veröffentlichten Sequenzen in der HCV-NS5-Region von Nucleotid 7935 bis 8274 gemäß der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Numerierung. Homologiewerte innerhalb desselben Subtyps sind fett gedruckt. Die veröffentlichten Sequenzen, welche zur Durchführung von Homologieberechnungen verwendet wurden, wurden der EMBL- Datenbank entnommen und haben die folgenden Hinterlegungsnummern: ¹ M62321, ² D10749, ³ M67463, &sup4; D90208, &sup5; X61596, &sup6; L02836, &sup7; MB84754, &sup8; D10750, &sup9; D11168, D01171, ¹&sup0; 538204, ¹¹ M58335, ¹² D10078, ¹³ D10079, ¹&sup4; D10080, ¹&sup5; D10081, ¹&sup6; D00944 und ¹&sup7; D012221. Von diesen repräsentieren alle vollständige Genome mit Ausnahme von ¹², ¹³, ¹&sup4;, ¹&sup5; und ¹&sup8;, für die NS5-Sequenzen veröffentlicht wurden. 18 wurde in dem Chiron-Patent WO 92/19743, SEQ ID NO 18, veröffentlicht.
    • BEISPIELE
  • Zur Untersuchung der natürlichen Variation von HCV-Isolaten, welche aus verschiedenen geographischen Gebieten auf der ganzen Welt erhalten worden waren, wurde ein schnelles Mittel zur Bestimmung des Typs und Subtyps von HCV-Isolaten in Form eines Linien-Sonden-Assays (LiPA) entwickelt.
  • Im wesentlichen wird ein cPCR-Fragment, das biotinyliertes dUTP inkorporiert enthält, mit Oligonucleotiden hybridisiert, welche auf einer Nitrocellulosemembran immobilisiert sind. Der stabile Hybridisierungs-Doppelstrang wird dann durch Streptavidin-markierte alkalische Phosphatase und anschließende Farbentwicklung mit NBT (Nitro-42-Tetrazoliumblau) und BCIP (Bromchlorindolylphosphat) sichtbar gemacht. Das cPCR-Fragment wird von der 5'-UR einer beliebigen HCV-RNA unter Verwendung hochkonservierter Primersätze synthetisiert. Die für die Typbestimmung eingesetzten Oligonucleotide sind gegen die inneren typspezifischen variablen Teile des cPCR- Fragments gerichtet. In der Tat können die beiden variablen Regionen zwischen den Positionen -170 und -155 und zwischen -132 und -T17 in der linearen Sequenz Teil eines Stammes in der gefalteten viralen RNA sein und Mutationen in der ersten Region könnten durch eine andere Mutation in der zweiten Region ergänzt werden, um eine RNA- Doppelstrang-Bildung zu erlauben oder nicht zu erlauben. Es steht zu erwarten, daß Variation und Konservierung auch bei anderen neuen HCV- Typen an denselben Positionen auftreten, und deshalb könnte diese variable Region zu der Unterscheidung zwischen allen gegenwärtigen und noch aufzufindenden HCV-Typen beitragen, Nachdem in den Core-, NS3- und NS5-Regionen im Vergleich zu der 5'-UR höhere Variabilitäten beobachtet werden, könnte darüber hinaus die Typbestimmung in diesen Regionen unter Einsatz universeller Sätze von Primern nicht länger vertretbar sein sein.
  • Die vorgeschlagene Nomenklatur dieser Erfindung ist vorläufig und könnte noch Gegenstand von Verbesserungen entsprechend neuen Richtlinien sein, welche von internationalen Komitees herausgegeben werden könnten. Beispielsweise könnte der Subtyp 4a in einen anderen Subtyp des Typs 4 wie 4c oder 4e abgeändert werden und Typ 4 körnte in Typ 5 oder 6 abgeändert werden, in welchem Fall Typ 4a beispielsweise 6c werden könnte. Neue Klassifizierungssysteme werden jedoch die Klassifizierung einer bestimmten Gruppe von Isolaten nicht behindern, welche mit Hilfe der vorgeschlagenen Sonden der Erfindung in einen Typ oder Subtyp eingeordnet wurden.
    • 1. Serumproben, die für die Bestimmung des Typs und Subtyps eingesetzt wurden
  • 61 brasilianische Proben (BR1 bis BR61) wurden sowohl in dem HCV- Antikörper-ELISA-Assay (Innotest HCV Ab, Innogenetics) als auch in dem Inno-LIA HCV Ab-Test (Innogenetics) getestet. Die ersten 23 Serumproben (BR1 bis BR23, Tabelle 3) wurden Hämodialyse-Patienten mit entweder hohen ALT-Spiegeln oder positiven Inno-LIA-Resultaten oder Blutspendern, von denen sich der Empfänger eine NANB-Hepatitis- Lebererkrankung zuzog, entnommen. 14 (BR24 bis BR37) der anderen Serumproben wurden willkürlich ausgewählt; die 24 verbleibenden Seren (BR38 bis BR61) wurden auf der Basis ihrer LIA-Muster ausgewählt. Die meisten der letzteren zeigten bei dem LIA schwach positive, unbestimmte oder negative Reaktivität mit den synthetischen NS4- und NS5-Peptiden. Die folgenden Seren waren ebenfalls in diesem Typisierungsversuch eingeschlossen: zwei Pools von japanischen Seren (JP62 und J63), sechs belgische Seren (BE64 bis BE69), vier Seren aus den Niederlanden (NE70 bis NE73), sechs Seren aus Burundi (BU74 bis BU79) und zwei Seren aus Gabün (GB80 und GB81). Sie wurden alle mit dem Inno-LIA HCV Ab-Assay-System getestet. Die Seren BU74 bis BU78 waren nur bezüglich Anti-Core-Antikörper positiv, wohingegen das Serum BU79 nur mit der NS5-Linie reagierte. Beide gabunesischen Seren waren LIA HCV-negativ (Inno-LIA HCV), HIV-negativ (Innotest HIV), aber HTLV-positiv (Innotest HTLV). Ein Serum aus Belgien (BE69) und eines aus den Niederlanden (NE73) war vollständig negativ. Drei der NE-Seren (NE71 bis NE73) wurden ausgewählt, da sie in dem RIBA-Test der zweiten Generation negativ waren (Ortho Diagnostics Inc.).
    • 2. cPCR, Analyse des PCR-Produkts und Klonierung
  • Die für die PCR-Reaktionen eingesetzten Primer waren komplementär zu den konservierten Gebieten der 5'-UR der verschiedenen HCV-Typen. Degeneration war eingeschlossen, um eine Verschmelzung mit Typ 1- und Typ 2-Sequenzen (Kato et al., 1990; Nakao et al., 1991; Okamoto et al., 1991) und mit der Sequenz unseres Typ 3-Klons (BR56; Hinterlegungsnummer D13448, DDJJB/EMBL/GenBank-DNA-Datenbank, hinterlegt am 21.10.1992) zu erlauben. Die Sequenzen der äußeren PCR- Primer (HcPr98, SEQ ID NO 1 und HcPr29, SEQ ID NO 2) und der inneren PCR-Primer (HcPr95, SEQ ID NO 3 und HcPr96, SEQ ID NO 4) sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Sonden, welche zum Nachweis der verschiedenen Serumtypen eingesetzt wurden, sind ebenfalls in Tabelle 4 aufgeführt. Alle Oligonucleotide wurden mit einem 392 DNA/RNA- Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert.
  • Virale RNA wurde aus Serum im wesentlichen wie von Chomczynski und Sacchi (1987) beschrieben, unter kleineren Modifikationen, extrahiert. Die RNA wurde mit 20 ug Dextran T500 (Pharmacia) kopräzipitiert. Das RNA-Pellet wurde kurz getrocknet und in 10 ul DEPC-behandeltem H&sub2;O resuspendiert. Nach Zugabe von 2 ul mit 150 ng/ul Zufalls-Primern (Pharmacia) und 10-minütigem Denaturieren bei 65ºC wurde die Synthese des ersten cDNA-Stranges in 20 ul bei 42ºC in Gegenwart von 25 U HPRI (Amersham), 500 uM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 1 · AMV-Puffer (Stratagene) und 2,5 U AMV-RT (Stratagene) durchgeführt. 7 ul der resultierenden cDNA wurden in einer äußeren PCR über 40 Zyklen, jeweils bestehend aus 1 Minute 95ºC, 1 Minute 55ºC und 1 Minute 72ºC, in einem Gesamtvolumen von 50 ul amplifiziert. Die Lösung wurde auf eine Endkonzentration von 200 uM dATP, dCTP, dTTP und dGTP, 1 · Taq-Puffer (Stratagene), 0,2 uM eines jeden Primers und 1 U Taq-Polymerase (Stratagene) eingestellt. 1 ul des Amplifizierungsprodukts der ersten Runde wurde mit den inneren Primern erneut 40 Zyklen lang in einem Puffer mit der gleichen Zusammensetzung amplifiziert. Für die HCV-Typbestimmung enthielt die innere PCR 40 uM Bio-11-dUTP (Sigma) und 160 uM an dTTP. Sowohl das Produkt der äußeren PCR als auch das Produkt der inneren PCR wurde dann einer Elektrophorese in einem 2%igen Gel von niedrigschmelzender Agarose (NuSieve GTG, FMC)/1%igen Gel von Ultra Pure (Gibco BRL)- Agarose unterworfen. Nach Ethidiumbromid-Anfärbung wurden PCR- Fragmente aus dem Agarosegel ausgeschnitten, die DNA wurde mittels Zentrifugation durch eine 0,45-um-HV-Membran (Millipore) gewonnen, durch zwei Phenol/Chloroform- und zwei Etherextraktionen gereinigt, gefällt und anschließend mit T4-DNA-Polymerase (Boehringer) behandelt, mit T4-Kinase (Boehringer) kinasiert und schließlich in die dephosphorylierte EcoRV-Stelle von psluescript KS(-) (Stratagene) ligiert. Die Plasmid-DNA-Herstellung erfolgte wie bei dem Verfahren der alkalischen Lysis (Maniatis et al., 1982) beschrieben. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit doppelsträngiger Plasmid-DNA mit T7- und T3-Primern unter Verwendung der Deaza G/A T7- Sequenzierungsmischungen (Pharmacia) durchgeführt.
  • Die Ergebnisse dieser Sequenzierungsreaktionen sind in Fig. 2 dargestellt. Die folgenden Sequenzen wurden bei DNA-Datenbanken hinterlegt (BR56: DDBJ/EMBL/Genbank, Hinterlegungsnummer D13448; BU74: DDBJ/EMBL/GenBank, Hinterlegungsnummer D13449; BU 79: Hinterlegungsnummer D13450; GB80: Hinterlegungsnummer D13451; GB81: Hinterlegungsnummer D13452; GP62: Hinterlegungsnummer D13453).
  • Serum-RNA aus HCV-infizierten Patienten wurde als Matrize für die Synthese von cDNA eingesetzt, welche wiederum eine Matrize für verschachtelte PCR darstellte. Es wurden zwei Sätze von PCR-Primern konstruiert: HcPr98 (SEQ ID NO 1) und HcPr29 (SEQ ID NO 2) für die äußere Reaktion, HcPr95 (SEQ ID NO 3) und HcPr96 (SEQ ID NO 4) für die innere Reaktion (Tabelle 4). Diese vier Primer wurden so ausgewählt, daß sie den veröffentlichten Sequenzen (Kato et al., 1990; Nakao et al., 1991; Okamoto et al., 1991) und der Sequenz eines Klons, der von der nichttranslatierten Region des Isolats BR56 erhalten worden war, entsprachen (siehe Fig. 2). Das resultierende Amplifizierungsprodukt der verschachtelten PCR ist 235 Basenpaare (bp) lang. Aufgrund der Inkorporation von Bio-11-dUTP liegt eine Verminderung der Mobilität vor, welche nach Agarose-Gelelektrophorese (Fig. 1) deutlich sichtbar ist. Die Größe der DNA-Fragmente ist für alle verschiedenen HCV-Typen gleich, was nahelegt, daß ein zweites Experiment wie Restriktionsenzymverdauung oder Hybridisierung für die Klassifizierung erforderlich ist. Es wurde daher ein Membranstreifen entwickelt, welcher immobilisierte HCV-spezifische Oligonucleotid- Sonden, als parallele Linien aufgebracht, enthält. Diese Streifen werden mit PCR-amplifizierten DNA-Fragmenten der 5'-UR hybridisiert, in die während der Synthese biotinylierte Nucleotide inkorporiert wurden. Nach der Hybridisierung wird Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase, zugegeben und wird an die während der Hybridisierung gebildeten biotinylierten Hybride gebunden. Nach Inkubation mit NBT/BCIP erscheint ein purpurfarbenes Präzipitat.
    • 3. Herstellung der Linien-Sonden-Assay (LiPA)-Streifen
  • Die 16-mer-Oligonucleotide, spezifisch für die verschiedenen Typen oder Subtypen von HCV (Tabelle 4, Nummer 5 bis 27) wurden an ihrem 3'-Ende folgendermaßen mit einem Poly(dT)-Ende versehen: 20 pMol Primer wurden in 25 ul Puffer, enthaltend 3,2 mM dTTP, 25 mM Tris- HCl (pH 7,5), 0,1 M Natriumcacodylat, 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM Dithiothreitol und 60 E terminale Desoxynucleotidyltransferase (Pharmacia), 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,5 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0) gestoppt und mit 20 · SSC (Maniatis et al., 1982) verdünnt, bis eine Endkonzentration von 6 · SSC und 2,5 pMol Oligonucleotid/ul erreicht war.
  • Ein pMol dieser Lösung wurde über eine Strecke von 4 mm auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht. Als Kontrolle für das Konjugat wurde daneben biotinylierte DNA aufgebracht. Die Oligonucleotide wurden durch zweistündiges Backen bei 80ºC an die Membran fixiert. Die Membran wurde dann in 4-mm-Streifen geschnitten.
    • 4. LiPA-Test-Hybridisierung und Farbentwicklung
  • 10 ul des Amplifizierungsprodukts der verschachtelten PCR, enthaltend inkorporiertes Bio-11-dUTP, wird mit 10 ul 400 mM NaOH/10 mM EDTA gemischt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Dann wird 1 ml vorgewärmter (37ºC) Hybridisierungspuffer, enthaltend 3 M Tetramethylammoniumchlorid (TMACI, Merck), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 1 mM EDTA, 5 · Denhardts (Maniatis et al., 1982), 0,6% (Gew./Vol.) SDS und 100 ug/ml gescherte Lachssperma-DNA, zugegeben und die Hybridisierung in einem schüttelnden Wasserbad 2 h lang bei 42ºC durchgeführt (Jacobs et al., 1988). Die Streifen werden zweimal bei RT für 5 Minuten mit 1 ml vorgewärmtem (37ºC) Waschpuffer (3 M TMACI, 0,2% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) gewaschen, gefolgt von einem stringenten Waschschritt bei 51ºC für 30 Minuten und zwei kurzen Waschschritten bei RT. Zu diesem Zeitpunkt wird der Waschpuffer durch Spüllösung (Phosphatpuffer, enthaltend NaCl, Triton, 0,5 % NaN&sub3;; Inno-Lipa, Innogenetics, Antwerpen, Belgien) ersetzt und die Streifen werden zweimal mit 1 ml bei RT gespült. Schließlich werden die Streifen mit Konjugat-Verdünnungsmittel (Phosphatpuffer, enthaltend NaCl, Triton, Proteinstabilisatoren, 0,1% NaN&sub3;; Inno-Lia, Innogenetics, Antwerpen, Belgien) gespült und mit Konjugat- Verdünnungsmittel, enthaltend 4000 · verdünntes Streptavidin, markiert mit alkalischer Phosphatase (Gibco BRL), weitere 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Die Streifen werden erneut dreimal mit Spüllösung und einmal mit Substrat-Verdünnungsmittel (Tris-Puffer, enthaltend NaCl und MgCl&sub2;; Inno-Lia, Innogenetics, Antwerpen, Belgien) gewaschen. Farbentwicklung wird erreicht durch Zugabe von BCIP und NBT zu dem Substrat-Verdünnungsmittel und Inkubation der Streifen für 30 Minuten bei RT. Die Farbentwicklung wird gestoppt, indem der Puffer durch destilliertes Wasser ersetzt wird.
    • 5. Ein LiPA für die Unterscheidung zwischen den HCV-Typen 1, 2 und 3
  • Die Sequenzen für die Sonden gegen Typ 3 wurden von einem cPCR-Klon von Serum BR56 (Hinterlegungsnummer D13448) abgeleitet. Beim Vergleich der veröffentlichten Typ 1-Sequenzen mit BR56 konnten jedesmal zwei Regionen von 16 Nucleotiden, enthaltend 4 bis 6 Mutationen, beobachtet werden. Überraschenderweise blieb, als Typ 2- Sequenzen verfügbar wurden, die Variation in diesen beiden Regionen wiederum erhalten. Deshalb wurde die Position der Typisierungssonden in den Regionen mit einem relativ niedrigen Homologiegrad zwischen Typen, jedoch guter Konservierung innerhalb eines Typs, gewählt. In einer ersten Version der Streifen wurden insgesamt 8 separat immobilisierte Oligonucleotide aufgebracht. Zwei von ihnen waren gegen Typ 1 (HcPr124, SEQ ID NO 5 und HcPr125, SEQ ID NO 6), vier gegen Typ 2 (HcPr136, SEQ ID NO 9 und HcPr137 (SEQ ID NO 10) für Typ 2a, HcPr126 (SEQ ID NO 11) und HcPr127 (SEQ ID NO 12) für Typ 2b) und zwei gegen Typ 3 (HcPr128, SEQ ID NO 13 und HcPr129, SEQ ID NO 14) von HCV gerichtet (Tabelle 4).
  • cPCR-Produkte wurden aus 23 brasilianischen Seren (BR1 bis BR23) synthetisiert und nach Hybridisierung erkannten 17 von ihnen die 16- mere des Typs 1. Vier Typ 3-Seren wurden gefunden sowie ein Typ 2a- Serum. Serum BR23 war mit Typ 1 und Typ 3 koinfiziert. Zwei Pools von japanischen Seren wurden anschließend getestet: JP63 reagierte mit den Typ 1- und Typ 2a-Sonden und der Großteil des JP62-Pools enthielt Typ 2a-Sequenzen. Nach cPCR-Klonierung und Sequenzierung der Region zwischen den Primern HcPr95 (SEQ ID NO 3) und HcPr96 (SEQ ID NO 4) wurde die Sequenz von JP62 (Fig. 2) als Typ 2a bestätigt. Die Typ 2b-Sonden HcPr126 (SEQ ID NO 11) und HcPr 127 (SEQ ID NO 12), mit denen JP62 nicht reagierte, unterschieden sich nur durch ein bzw. zwei Nucleotide von der Sequenz von JP62 (Hinterlegungsnummer D13453). Somit waren die gewählten Hybridisierungs- und Waschbedingungen sehr stringent und so, daß selbst einzelne Fehlpaarungen eine Hybridisierung in diesem Assay verhindern.
    • 6. Unterscheidung zwischen Subtypen
  • Nach sorgfältigem Vergleich aller verfügbaren kodierenden Sequenzen des Typs 1 können zwei Subtypen (1a und 1b) mit einer durchschnittlichen Genomhomologie von 79% klar unterschieden werden. Bei der 5'-UR wurden nur zwei Mutationen zwischen HCV-J und HCV-1 in der Region des Produkts der verschachtelten PCR beobachtet, was 98,8 % Homologie ergab. Obwohl nur zwei Mutationen zwischen HCV-1 (1a) und HCV-J (1b) lagen, tritt die A-zu-G-Transition, die an Position -99 beobachtet wurde, in allen bisher untersuchten Isolaten vom Typ 1b auf. Deshalb zeigt eine Hybridisierung mit der Sonde HcPr138 (SEQ ID NO 7), welche die Region der G-Substitution überspannt, ein Isolat vom Typ 1b an.
  • Bei einem Vergleich aller verfügbaren 5'-UR-Sequenzen des Typs 3 (vorliegende Erfindung; Bukh et al., 1992; Chan et al., 1992; Lee et al., 1992) konnten die Isolate entsprechend der Anwesenheit eines üblichen G (Typ 3a; HcPr140, SEQ ID NO 15) oder eines selteneren A (Typ 3b; HcPr139, SEQ ID NO 16) an Position -139 in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die Unterscheidung zwischen den Typen 2a und 2b (oder K2a und K2b) konnte in den variablen Regionen wie oben angegeben erfolgen.
  • Die Kombination aller dieser typ- und subtypspezifischen Sonden für Typ 1 und 3 (Tabelle 4) ermöglichte uns die Auftrennung der 17 brasilianischen Seren, welche bisher als Typ 1 charakterisiert worden waren, in 8 Seren vom Typ 1a und 9 Seren vom Typ 1b. Drei der vier Typ 3-Seren bildeten Hybride mit der Typ 3a-Linie. Unterschiedliche Moleküle in dem cPCR-Fragment des koinfizierten Serums BR23 hybridisierten mit den Linien für Typ 1b und Typ 3a (Fig. 3, Streifen 8).
  • Weitere 38 brasilianische Seren (BR24 bis BR61) wurden in diesem neuen LiPA getestet. Das gewichtigste Kriterium für die Auswahl dieser Seren war die Abwesenheit von Antikörpern für NS4- und NS5- Epitope, da frühere Berichte zeigten, daß es einen geringen Grad an Kreuz-reaktivität von Antikörpern gegen Typ 2- und Typ 3-NS4 mit Typ 1-NS4-Antigenen gab (Chan et al., 1991). Bei den 38 brasilianischen Seren konnten 12 als Typ 1a, 14 als Typ 1b, 9 als Typ 3a, 2 als Typ 3b bestimmt sowie eine Koinfektion von Typ 1b und 3a festgestellt werden. Es wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß alle getesteten brasilianischen Seren in Typen eingeteilt werden konnten. Es bleibt festzustellen, ob die Unterscheidung zwischen den Typ 3-Subtypen relevant ist. Nachdem keine Sequenzdaten von der 5'-UR der Ta- und Tb-Isolate (Mori et al., 1992) veröffentlicht wurden, ist unsere Einteilung in Typ 3a und 3b noch vorläufig. Mehr Daten über die Serologie und die Sequenzen des offenen Leserahmens sind erforderlich, um die Subtypbestimmung der Typen 3 und 4 zu bestätigen.
    • 7. Identifizierung von Typ 4-Isolaten und Inkorporation von Typ 4- spezifischen Sonden in den LiPA
  • PCR-Fragmente, die aus 6 Seren aus Burundi (BU74 bis BU79) amplifiziert wurden, waren nicht in der Lage, mit irgendeinem der 16- mere auf den Streifen zu reagieren. Drei PCR-Fragmente von diesen burundischen Proben (BU74: Hinterlegungsnummer D13449, welches mit BU76 identisch war, und BU79: Hinterlegungsnummer D13450, Fig. 2) wurden kloniert und sequenziert. Es wurden Sequenzen erhalten, welche sich deutlich von den meisten der vorher beschriebenen Typen unterschieden. Die burundischen Proben sind miteinander und mit 26 (Bukh et al., 1992) verwandt und zeigen höhere Homologien zu Typ 1 als zu Typ 3 oder Typ 2. Jedoch waren die meisten Unterschiede zum Typ 1 wiederum in den variablen Regionen lokalisiert. Der überraschendste Befund war die Anwesenheit eines zusätzlichen Nucleotids in BU74 und BU76 zwischen den Positionen -139 und -140. Diese Resultate sind Argumente für die Existenz eines neuen HCV-Typs oder -Subtyps bzw. neuer HCV-Typen oder -Subtypen, welche(r) vorläufig als Typ 4 bezeichnet werden wird. Die Sequenzen der 5'-UR des Virus, welche aus diesen afrikanischen Seren amplifiziert werden konnten, wichen stark von den bisher beschriebenen Typen ab. Deshalb wurden diese Isolate vorläufig als Typ 4 bezeichnet. Ähnliche Sequenzen, die in der Studie von Bukh et al. (1992) mitgeteilt wurden, stammten ebenfalls aus Afrika, obwohl eine aus Dänemark war. Fig. 2 zeigt, daß in der Region zwischen den Nucleotiden -291 und - 55 bis zu 8 Nucleotidvariationen innerhalb dieser Gruppe möglich sind. Es ist wahrscheinlich, daß Typ 4 weiter aus mehreren Subtypen zusammengesetzt ist oder daß diese Subtypen divergierende Subtypen des Typs 1 sind.
  • Nach Erhalt dieser Daten wurde der LiPA auf dreifache Weise verbessert. Zunächst wurde das Oligonucleotid HcPr142 (SEQ ID NO 20), welches eine Degeneration trägt, aus einer hochkonservierten Region als universelle HCV-Sonde zur Bestätigung der Anwesenheit des PCR- Produkts gewählt (Tabelle 4). Zweitens wurden drei Oligonucleotide zur Identifizierung der Typ 4-Sequenzen synthetisiert (HcPr144, SEQ ID NO 17 mit einer Degeneration, HcPR145, SEQ ID NO 18, und HcPr146, SEQ ID NO 19; Tabelle 4). Drittens wurde eine universelle Typ 2-Sonde außerhalb der variablen Regionen gewählt (HcPr147, SEQ ID NO 8, Tabelle 4), da eine Universalsonde für den Nachweis des Typs 2 nicht aus den Regionen zwischen den Positionen -170 und -155 und zwischen den Positionen -132 bis -117 gewählt werden konnte.
  • Mit dieser Version des LiPA wurden die 6 PCR-Fragmente aus den burundischen Seren (Tabelle 3) erwartungsgemäß als Typ 4 klassifiziert (Fig. 3, Streifen 6 und 7). Zwei Seren aus Gabun, 4 Seren aus den Niederlanden und 6 belgische Seren waren ebenfalls in das Screening eingeschlossen. Aus GB80 konnte eine HCV-Typ 4-5'-UR amplifiziert werden, welche kloniert und sequenziert wurde (Fig. 2). Das andere gabunesische Serum GB81 zeigte eine Koinfektion einer Variante des Typs 2 (kloniert und sequenziert, Fig. 2) und des Typs 4. Das letztere ergab dasselbe Typisierungsmuster wie BU79 (Fig. 3, Streifen 7). Zur Klärung, ob die Reaktion mit GB81 mit den Typ 2- und Typ 4-Sonden durch eine unerwartete Kreuz-reaktivität zwischen den Typisierungssonden verursacht wurde oder lediglich das Ergebnis einer Koinfektion war, wurde das cPCR-Produkt kloniert und 17 individuelle Kolonien PCR und HCV-LiPA unterworfen. 10 (59%) Kolonien enthielten Typ 4-Inserts und 7 waren Typ 2 (41%), was klar die gemeinsame Zirkulation von zwei HCV-Typen im selben Serum anzeigt. Für die drei NE-Seren, welche in dem Ortho-RIBA-Test negativ und positiv (NE71), unbestimmt (NE72) oder negativ (NE73) in dem Inno-LIA HCV Ab-Test waren, konnte gezeigt werden, daß Typ 3a-Isolate vorlagen. Das vierte NE-Serum, welches gute Reaktivitäten sowohl im Ortho-RIBA als auch im INNO-LIA zeigte, enthielt ein Typ 1a-Isolat. Schließlich waren von den 6 analysierten belgischen Seren BE64 bis BE67 mit Typ 1b-Stämmen infiziert. Ein Patient italienischer Herkunft (BE68) wies eine Typ 2a-Infektion auf und BE69 enthielt Typ 3a-Sequenzen. Das letztere wurde von einem Fall chronischer virusähnlicher NANB-Hepatitis erhalten, war jedoch negativ in allen Assays der zweiten Generation und in Anti-NS3-, Anti-E1- und Anti-E2-Forschungsassays. Dieses Serum besaß einen sehr niedrigen Virustiter und wurde nur nach der zweiten PCR-Runde schwach positiv in vier verschiedenen Proben, welche im Verlauf von zwei Jahren genommen wurden, was den Bedarf für eine verschachtelte cPCR bei der HCV-Diagnose zeigt. Die Sequenz des Fragments der verschachtelten PCR war mit BR56 identisch. Dies war nicht überraschend, da Typ 3-Stämme sehr geringe Sequenzvariation zeigen.
  • Insgesamt wurden 19 verschiedene Oligonucleotide für diese Version der LiPA-Streifen eingesetzt, wie in Fig. 3 gezeigt. Da einige der Oligonucleotide gegen denselben HCV-Subtyp gerichtet sind, wurde die Sonde HcPr156 (SEQ ID NO 22) mit HcPr158 (SEQ ID NO 24) für den Typ 2a gepoolt. Die Oligonucleotide gegen Typ 4 wurden separat eingesetzt, da zuwenig Sequenzinformation aus der kodierenden Region zu diesem Zeitpunkt bekannt ist und somit bisher noch keine Einteilung in Subtypen (falls vorhanden) vorgenommen werden kann. Die Anwesenheit einer zusätzlichen Base in einigen der Typ 4-Sequenzen kann die Basis für weitere Versuche zur Subtypisierung dieser Gruppe bilden. Die mit einigen repräsentativen Seren erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Die Interpretation dieser Streifen wird in Tabelle 2 gegeben.
  • In dieser Studie wurden 61 PCR-positive brasilianische HCV-Seren typisiert. 20 (33%) Seren wiesen eine Infektion vom HCV-Typ 1a auf, 23 (38%) waren Typ 1b, eines (1,5%) Typ 2a, 15 (24,5%) Typ 3, und zwei (3%) Seren mit Koinfektionen wurden gefunden. Die Erkennung koinfizierter Seren wird durch BR23 illustriert (Fig. 1, Spur 9; Fig. 3, Streifen 8). Die verbleibenden 20 Seren wurden aus fünf verschiedenen Ländern gesammelt; 8 der Seren stammten aus zwei afrikanischen Ländern.
  • In einer Minorität der Fälle, wie dies für BE67 zutraf, erkannte ein Typ 1b-PCR-Fragment die Subtyp 3b-Sonde HcPr139 (SEQ ID NO 16). Dies kann durch die Annahme erklärt werden, daß die 1b-Sequenz von Serum BE67 ein A anstelle eines T an Position -139 aufweist. Die mit der JP62-Sequenz (Hinterlegungsnummer D13453) erhaltenen Ergebnisse, wonach eine Fehlpaarung in dem Oligonucleotid das Hybridisierungssignal eliminiert, stützt diese Annahme zusätzlich. Nachdem isolatspezifische Mutationen über die 5'-UR verstreut sind, ist es möglich, daß ein Isolat eines gegebenen Typs auch mit einer Subtypisierungs-Sonde eines anderen Typs hybridisiert (siehe Fig. 3, Streifen 6 und 7). Solche Reaktivitäten zeigen lediglich die Anwesenheit der Sequenz der Subtypisierungs-Sonde in dem untersuchten Isolat an. Jedoch wurden niemals Reaktivitäten mit mehrfach typisierenden Sonden beobachtet, wenn nicht ein Serum koinfiziert war, wie für GB81 untersucht.
  • Im allgemeinen muß bei Hybridisierung eines Typ 1a-cPCR-Produkts bei dem LiPA die Sequenz der Sonden HcPr124 (SEQ ID NO 5), HcPr125 (SEQ ID NO 6) und HcPr142 (SEQ ID NO 20) in dem Fragment der verschachtelten cPCR vorhanden sein. Folglich sind 48 (26%) bp von 184 bp (Fig. 2) unmittelbar bekannt. Mit derselben Begründung läßt sich berechnen, daß für Isolate mit Ähnlichkeit mit dem HCV-J-Typ 33 %, mit dem HCV-J6-Typ 35%, mit dem BR56-Typ 34%, mit dem 26- und BU77-Typ 26%, mit dem BU74-Typ 41% und mit dem BU79-Typ 32% der Sequenz bekannt sind. Es muß jedoch berücksichtigt werden, daß aufgrund der Degeneration einiger der 16-mere etwas Information verlorengeht und somit sind diese Prozentsätze Maximalwerte. Nichtsdestoweniger unterstützt dieser Ansatz die Idee der Sequenzierung nach dem Hybridisierungsprinzip (Strezoska et al., 1991).
  • Beim Vergleich von LiPA mit Antikörper-Reaktivität dieser Seren in unserem Inno-LIA HCV Ab-Assay (Tabelle 3) treten einige Korrelationen zwischen Genotypen und ihren Phänotypen (Serotypen) auf. Die Typ 3- und Typ-4-Seren aus Belgien, den Niederlanden, Gabun und Burundi reagieren alle sehr schwach positiv, unbestimmt oder negativ in den Antikörper-Assays der zweiten Generation. Die schwach positive Reaktion wird größtenteils durch Anti-Core-Antikörper verursacht, wohingegen Antikörper gegen die LIA-NS4- und -NS5-Epitope gewöhnlich fehlen. Dies stimmt überein mit der hohen Konservierung von Core- Sequenzen, die für nur leicht unterschiedliche Epitope kodieren, welche eine immunologische Kreuzreaktion erlauben. Epitope für die NS4- und NS5-Region sind in hochvariablen Regionen lokalisiert, was den größten Teil der immunologischen Kreuzreaktion verhindert. Nachdem die gegenwärtigen Antikörper-Assays Typ 1-Epitope enthalten, ist es möglich, daß einige wenige Prozent der mit Typ 2, Typ 3 und Typ 4 infizierten Seren ein negatives Ergebnis zeigen werden. Jedoch kann die Schlußfolgerung fehlender Kreuzreaktion der brasilianischen Typ 3-Seren mit Typ 1-NS4- und -NS5-Antigenen aus unseren Ergebnissen nicht gezogen werden (Tabelle 3). Bei den 14 willkürlich gewählten Seren (BR24 bis BR37; Tabelle 3) lag eine 100%ige Korrelation zwischen der LIA-Reaktivität und den 9 Typ 1-Viren vor. Von vier Typ 3-Seren reagierten zwei (BR34 und BR36) mit NS4 und drei (BR33, BR34 und BR35) mit NS5. BR37 wurde aufgrund der Koinfektion nicht berücksichtigt. Bei einer Analyse aller serologischen Daten der 77 Seren, welche von einem einzigen Typ infiziert waren, erkannten 58% und 44% der Typ 1-Seren die NS4- bzw. NS5-Epitope. Diese Prozentsätze sind relativ niedrig und auf die Selektionskriterien zurückzuführen. Für die Typ 3-Seren waren 37 und 53% mit den NS4- bzw. NS5-Epitopen reaktiv. Es ist möglich, daß bei Hochrisiko- Gruppen, wie z. B. bei den aus Brasilien erhaltenen Proben, im Vergleich zu Ergebnissen mit europäischen Blutspendern (vorliegende Erfindung und Chan et al., 1992) höhere Kreuzreaktivitäten beobachtet werden. Solche kreuzreagierenden Seren könnten durch mehrfache Infektionen induziert werden, von denen einige gleichzeitig auftreten, andere jedoch nacheinander auftreten könnten. Eine frühere Anti-HCV-Erinnerung könnte durch neue HCV-Infektionen aufgefrischt werden und zu einer gemeinsamen Zirkulation von Viren eines Typs mit Antikörpern, die hauptsächlich gegen einen anderen Typ gerichtet sind, führen. Eine solche Erklärung ist plausibel für das Serum BR56, welches als HCV-Typ 3 eingeordnet wurde, jedoch Antikörper gegen Typ 1-Core, -E1, -E2, -NS3, -NS4 und -NS5 enthielt (Daten nicht gezeigt). Es bleibt festzustellen, ob Anti-Typ 3-Antikörper in diesem Serum vorliegen.
  • Aufgrund der Unterschiede in der Immunreaktion könnten verschiedene HCV-Typen auch eine unterschiedliche Entwicklung zu einer andauernden Lebererkrankung zeigen, wie bereits berichtet wurde (Okamoto et al., 1992a).
  • Zusammenfassend erlaubt der LiPA eine schnelle Bestimmung des Typs einer HCV-Infektion. Dieser Assay ist in der Lage, zwischen 4 verschiedenen HCV-Typen und 8 Subtypen zu unterscheiden, und stellt ein gutes Mittel zur Bestimmung neuer Typen dar.
  • Darüber hinaus kann dieser Assay weiter verbessert werden, beispielsweise indem die cPCR-Reaktionen durch die RNA-Einfang-PCR ersetzt werden. Schließlich könnte dieser Assay zur weiteren Klärung der Beziehung zwischen Genotypen, zukünftigen Serotypen und dem klinischen Status oder Ergebnis der Krankheit beitragen.
    • 8. Identifizierung neuer Typen und Subtypen und Sonden, die sich für deren Klassifizierung eignen
  • Die Isolate BE82, BE90, BE91, BE92, BE93, BE94, BE95, BE96, BE97, BE98, erhalten aus Belgien, GB48, GB116, GB358, GB569, GB549, GB809, GB487, GB724 und GB438, erhalten aus Gabun, CAM600 und CAM736, erhalten aus Kamerun, wurden für die weitere Untersuchung zurückbehalten, da nach der Genotypbestimmung mittels eines LiPA gemäß den Beispielen 3 und 4, welcher die Sonden 5 bis 27 einschloß, abweichende Reaktivitäten beobachtet wurden. Die Sequenzen der 5'- nichttranslatierten Region wurden erhalten nach einer verschachtelten PCR mit Hilfe von Primern mit SEQ ID NO 1, 2, 3 und 4, Klonierung und Sequenzierung wie in Beispiel 2 beschrieben. Für die meisten dieser Isolate wurde Sequenz-information in der kodierenden NS5-Region erhalten und eine Zuordnung zu bekannten Sequenzen ist in Fig. 5 dargestellt. Die Homologien der NS5-Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen repräsentativer Isolate für jeden Subtyp zu den Sequenzen veröffentlichter Isolate sind in Tabelle 6 dargestellt. Diese Berechnung erlaubt die Klassifizierung in Typen und Sub-typen wie in Fig. 4 dargestellt. Eine Nucleotidsequenz-Zuordnung der 5'- nichttranslatierten Regionen dieser neuen Isolate zu einigen Prototyp-Sequenzen ist ebenfalls in Fig. 4 dargestellt. Es können mehrere Mutationen im Vergleich zur HCV-I-Sequenz beobachtet werden. Nachdem identische Mutationen in der 5'-nichttranslatierten Region mit ähnlichen Sequenzen in der kodierenden Region korrelieren, werden solche Mutationen in der vor-liegenden Erfindung zur Konstruktion neuer typ- und subtypspezifischer Sonden eingesetzt.
  • BE82, ein Subtyp 1b-Isolat, zeigte eine C-Mutation in Position -94 und konnte deshalb nicht mit Sonde 7 reagieren. Nach Sequenzierung der NS5-Region konnte die Schlußfolgerung gezogen werden, daß dieses Isolat zum Subtyp 1b gehörte. Deshalb sollte die Sonde 30, welche eine Degeneration von T und C an Position -94 einschließt, eine bessere Genotypbestimmung des Subtyps 1b ermöglichen.
  • BE90, ein weiteres Subtyp 1b-Isolat, zeigte eine T-Mutation in Position -159 und eine G-Mutation in Position -126 und reagierte deshalb nur mit den Universalsonden 20 und 27 und der Subtypisierungssonde 7. Die Sequenzierung der NS5-Region lehrte, daß das Isolat zum Subtyp 1b gehörte. Sonde 28, welche eine Degeneration von T und C an Position -126 einschließt, sollte eine bessere Genotypbestimmung der Typen 1 und 6 ermöglichen.
  • Das Isolat BE92 reagierte neben den Universalsonden 20 und 27 nur mit den Sonden 8 und 26. So konnte dieses Isolat als Typ 2 klassifiziert werden, es konnte jedoch nicht subtypisiert werden, da keine Reaktivität mit den Sonden 23, 24, 25 oder 26 beobachtet werden konnte. Nach der Sequenzierung konnten in der Tat zwei neue Motive festgestellt werden: GGACCCAGTCTTCCTG, von Sonde 33 umfaßt, und TGCCTGGTCATTTGGG, von Sonde 34 umfaßt. Die Sequenzierung der NS5- Region offenbarte in der Tat Homologien zu Typ 2a- und 2b-Isolaten, vereinbar mit einer Klassifizierung in denselben Typ, jedoch in einen anderen Subtyp, welches der vorgeschlagene Subtyp 2c ist.
  • Die Isolate BE93 und BE94 zeigten keinerlei Reaktivität mit der Subtypisierungssonde 14. Nach Sequenzierung der 5'- nichttranslatierten Region und der NS5-Region wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß diese Isolate zum Subtyp 3a gehörten. Deshalb sollte eine Sonde, die eine C- und A-Degeneration in Position -118 enthält, wie Sonde 35, eine bessere Genotypbestimmung des Subtyps 3a ermöglichen.
  • Die Isolate GB48, GB116, GB358 und GB569 zeigten positive Hybridisierungssignale mit den Sonden 17 und 19 im LiPA, was eine Ähnlichkeit mit den früher beschriebenen Typ 4-Isolaten anzeigt, die Isolate GB549 und GB809 reagierten jedoch nur mit den Universalsonden. Die Sequenzen von Teilen der 5'-nichttranslatierten Region und der NS5 wurden erhalten. Aus Fig. 5 und 6 und Tabelle 6 kann geschlossen werden, daß die durch GB358 repräsentierten Isolate zum selben Subtyp des Typs 4 gehören, welches der vorgeschlagene Subtyp 4a ist. Jedoch zeigen sowohl GB549 als auch GB809 geringere Homologien zu den Isolaten der Subtypen 4a, 4b und 4d und auch zueinander, allerdings scheint GB809 zum selben Subtyp wie 24 zu gehören. Diese Homologien sind vereinbar mit einer Klassifizierung in denselben Typ 4, jedoch in einen unterschiedlichen Subtyp von Typ 4: Subtyp 4e für GB549 und Subtyp 4c für GB809 werden vorgeschlagen. Die aus den Isolaten GB116, GB358 und GB569 erhaltenen Sequenzen zeigten alle die Motive AATCGCCGGGATGACC, nachweisbar mit Sonde 38, und TTTCCGGGCATTGAGC, nachweisbar mit Sonde 19. Somit eignen sich die Sonden 38 und 19 zum Nachweis und zur Klassifizierung des Subtyps 4a. Die Sonde 38 ist spezifisch für die Subtypen 4a, 4b, 4d, 4f und 3b, wohingegen die Sonde 19 die Subtypen 3b, 4a und 4d erkennt, jedoch auch mit den neuen Typen 3c und 4f hybridisiert. Interessanterweise sollte die neue Subtyp 3b-Sequenz HCV-TR mit diesen Sonden kreuzreagieren. Jedoch kann 3b aufgrund der Reaktivität mit der für Typ 3 spezifischen Sonde 21 immer noch als Typ 3 klassifiziert werden.
  • GB549 zeigt ebenfalls charakteristische Motive. Das Motiv AATCGCCGGGACGACC kann mit der Sonde 40 nachgewiesen werden und die Sequenz AATGCCCGGCAATTTG ist mit Sonde 41 nachweisbar. Somit eignen sich die Sonden 40 und 41 zur Subtypbestimmung des Subtyps 4b.
  • Reaktivitäten, die mit GB809 identisch waren, wurden bei einem LiPA mit zwei aus Kamerun erhaltenen Proben: CAM600 und CAM736, erhalten. Nach Sequenzierung der NS5-Region konnte die Schlußfolgerung gezogen werden, daß diese Proben zum selben Subtyp wie GB809 gehören, und nach Sequenzierung der 5'-nichttranslatierten Region wurden wiederum zwei identische Motive als diejenigen nachgewiesen, welche bereits in GB809 vorhanden waren. Somit scheint es so, daß die Motive AATCGCCGAGATGACC, nachweisbar mit Sonde 42, und AATGCTCGGAAATTTG, nachweisbar mit Sonde 43, charakteristisch für den Subtyp 4c sind, und daß die Sonden 42 und 43 zum Nachweis und zur Klassifizierung des Subtyps 4c geeignet sind. Jedoch zeigt Z4, welches Homologie in der EI-Region zeigt, vereinbar mit einer Klassifizierung in denselben Subtyp 4c, 5'-UR-Sequenzen, welche wiederum einmalig sind und durch die Sonden 7, 50 und 53 nachgewiesen werden könnten.
  • Neue Sequenzen wurden in der 5'-nichttranslatierten Region der Isolate GB487, GB724 und BE97 nachgewiesen. Eine neue Subtyp- Klassifizierung, die nicht auf Sequenz-information aus der kodierenden Region basiert, wird vorläufig für diese Isolate vorgeschlagen. Alle drei Isolate zeigen die Sequenz TGCCTGGAAATTTGGG, nachweisbar mit Sonde 50. GB487 zeigt die einmalige Sequenz AATCGCCAGGATGACC, nachweisbar mit Sonde 49, und wird vorläufig als Subtyp 4h klassifiziert. GB724 und BE97 enthalten beide die Sequenz GGAATCGCCAGGACGA, nachweisbar mit Sonde 53, und werden vorläufig als Subtyp 4g klassifiziert.
  • Typ 4-Isolate zeigen gewöhnlich ein T in Position -238 und ein A bei -235. Deshalb sollten die Sonden 37, 38 und 51 eine bessere Genotypbestimmung des Typs 4 ermöglichen.
  • In einem weiteren Beispiel zeigt BE95, welches in dem LiPA nur mit den Sonden 7 und 17 hybridisierte, niedrige Homologien in der kodierenden Region von etwa 68% zu allen anderen Isolaten, mit Ausnahme von BE96, welches eine Homologie zu BE95 zeigt, die vereinbar ist mit einer Klassifizierung in denselben Subtyp, welches der vorgeschlagene Subtyp 5a ist. BE95, BE96 und SA1 zeigen alle dieselben Motive GAGTGTCGAACAGCCT, nachgewiesen mit Sonde 44; AATTGCCGGGAYGACC, nachweisbar mit den Sonden 45 und 47, und TCTCCGGGCATTGAGC, nachweisbar mit Sonde 46. Somit eignen sich die Sonden 44, 45, 46 und 47 für die Genotypbestimmung des Typs 5a.
  • Es wurden Sequenzen von Bukh et al. (1992) veröffentlicht, welche eine einmalige CA-Insertion zwischen den Positionen -144 und -145 enthalten. Diese Isolate werden vorläufig als Typ 6 klassifiziert und können mit Hilfe der Sonde 48 nachgewiesen werden.
  • Ein neuer Typ von Hepatitis C-Virus wurde in dem Isolat BE98 entdeckt, welches in einem LIPA nur mit Sonde 19 reagierte. Die Sequenz der 5'-nichttranslatierten Region enthält das neue Motiv GAATCGCCGGGTTGAC, welches mit Hilfe der Sonde 54 nachgewiesen werden kann. Die Sequenzierung der Core-Region offenbarte Sequenzen, welche etwa gleich entfernte Homologien zu den Genotypen 3a und 3b zeigen, und für diese Prototyp-Sequenz wird ein neuer Typ 3c vorgeschlagen.
  • Das Isolat GB438 enthält Sequenzmotive, welche typisch für Subtyp 4a sind, nachweisbar mit den Sonden 38 und 19, zeigt jedoch noch eine unterschiedliche Sequenz in der EI-Region, welche einen neuen Subtyp innerhalb des Typs 4 repräsentiert, der als Subtyp 4f bezeichnet wurde. Die Unterscheidung von Subtyp 4a kann mit Hilfe der Sonden mit SEQ ID NO 51 und 7 erfolgen.
  • Die Sonden 29, abgeleitet von der Sequenz von BE90, und die Sonden 51 und 52, abgeleitet von der Sequenz von GB724, könnten zur Verbesserung der Genotypbestimmung bestimmter HCV-Typen oder - Subtypen nützlich sein.
    • Beispiel 9: Berechnung von Nucleotiddistanzen Phylogenetische Analyse
  • Früher veröffentlichte Sequenzen wurden der EMBL-Datenbank, Freigabe 35, entnommen. Andere Sequenzen wurden von den Erfindern analysiert und wurden bei der DDBJ-Datenbank hinterlegt. Die Sequenzen wurden in einem sequentiellen Format dem Phylogeny Interference Package Version 3.5c (Felsenstein, März 1993) präsentiert. Nur Sequenzen mit identischen Längen waren in die Ähnlichkeitsberechnungen eingeschlossen. Die eingesetzten Programme waren DNADIST, PROTDIST, DNAPARS, PROTPARS, NEIGHBOR, SEQBOOT, CONSENSE und DRAWTREE. DNA- Distanz-Matrices maximaler Wahrscheinlichkeit wurden von DNADIST unter Verwendung der Kimura-2-Parameter-Einstellung erzeugt. Eine Bootstrap-Analyse wurde unter Einsatz von SEQBOOT mit 2000 Wiederholungen durchgeführt. Alle diese Matrices wurden mit NEIGHBOR, unter Verwendung der Neighbor-Joining-Einstellungen, und mit CONSENSE, um den Konsensus-Baum zu berechnen, weiter analysiert. Der SEQBOOT-Datensatz wurde auch mit dem DNAPARS-Programm mit 1130 Wiederholungen analysiert. Abgeleitete Proteinsequenzen wurden mit PROTDIST, gefolgt von NEIGHBOR, analysiert. Schließlich wurde das Programm DRAWTREE zur Erzeugung einer graphischen Darstellung des phylogenetischen Baums eingesetzt. Alle Analysen wurden mit einer SUN SPARC IPX-Computerstation durchgeführt.
    • Die NS5-Region
  • Unter Verwendung des von Enomoto et al. (1990) beschriebenen Primersatzes amplifizierten, klonierten und sequenzierten wir 340 bp lange NS5b-PCR-Fragmente aus 13 verschiedenen Isolaten. Die Nucleotidsequenzen wurden verwendet, um unter Einsatz des DNADIST- Programms des PHYLIP 3.5c-Pakets (Felsenstein, 1993) einen phylogenetischen Baum zu erzeugen. Eine Aufspaltung von 6 Hauptgruppen oder "Typen" ist für diesen nicht verwurzelten Baum ersichtlich. Jede Gruppe konnte weiter in zwei oder mehr Subgruppen oder "Subtypen" unterteilt werden. Die folgenden Cluster (Gruppen, die aus engverwandten Isolaten bestehen) wurden gebildet: 1a, 1b, 2b, 3a, 3b, 4a und 5a. Diese Clusterbildung erschien in 100% der neu aufgenommenen Bootstrap-Datensätze unter Einsatz der Programme SEQBOOT/DNADIST/NEIGHBOR/CONSENSE mit 2000 Wiederholungen. Die Bootstrap-DNAPARS-Analyse ergab eine ähnliche Clusterbildung.
  • Aus der DNADIST-Matrix konnten die molekularen Evolutionsdistanzen zwischen Isolaten, Subtypen und Typen berechnet werden. Nur die oben angegebenen, getrennten Cluster waren in diesen Berechnungen eingeschlossen. Zwischen Isolaten innerhalb eines Subtyps lag diese Distanz in einem Bereich von 0,0148 bis 0,1064 (Mittel 0,0623; SA 0,0181). Die Distanz zwischen Subtypen lag in einem Bereich von 0,1654 bis 0,2675 (Mittel 0,2312; SA 0,0182) und die Distanz zwischen Typen in einem Bereich von 0,3581 bis 0,6549 (Mittel 0,4942; SA 0,0485). Es traten jedoch einige Ausnahmefälle auf.
  • Die Distanz zwischen HC-J6 und dem Isolat BE92 betrug 0,1539, ein niedriger Wert für Distanzen zwischen Distanzen, jedoch weit oberhalb eines jeden Werts, welcher zwischen Isolaten erhalten wurde, die zum selben Subtyp gehören. Die NS5-Nucleotidsequenzhomologie zwischen HC-J6 und zwischen BE92 betrug 86,2%. Die Bootstrap-DNA-Datensätze ergaben einen Cluster für beide Sequenzen in 98,8% der Fälle, welches ein Argument für eine Subtyp 2a- Klassifizierung ist, jedoch erlaubten uns die molekulare Evolutionsdistanz und die Sequenz der 5'-UR von BE92 die vorläufige Klassifizierung dieses Isolats als Subtyp 2c. GB809 konnte in einer mittleren Distanz von 0,1509 (min. /max. = 0,1384/0,1597) von dem Typ 4a-Cluster positioniert werden. Eine maximale Homologie von 87,4% liegt zwischen GB809 und GB358 (Typ 4a) vor. Jedoch erlaubten uns diese Daten zusammen mit den beobachteten Variationen in der 5'-UR die Bildung eines neuen Subtyps von Typ 4, 4c. GB549 repräsentiert den neuen Subtyp 4e und weist Distanzen von 0.2426 von Cluster 4a; 0,2403 von Subtyp 4c und 0,1738 von GB438 auf der Nucleotidebene auf. Das Isolat GB438 repräsentiert möglicherweise einen weiteren neuen Subtyp von Typ 4, vorläufig als 4f bezeichnet.
    • Die Core/EI-Region
  • Die Berechnung des phylogenetischen Baums für die Core/EI-Region zwischen den Nucleotiden 378 und 957 unter Einsatz des DNADIST- Programms resultierte in der Feststellung von 6 Hauptzweigen, welche die 6 verschiedenen Genotypen repräsentieren. Die folgenden Cluster konnten mit 100%iger Sicherheit aus der Bootstrap-Neuaufnahme- Analyse mit 2000 Wiederholungen abgeleitet werden: Subtyp 1a, 1b, 2a, 2b, 3a und 4a. Die Clusterbildung ist irrelevant für die Subtypen 4c, 4e und 5a, da sie nur von einem Isolat repräsentiert werden. Basierend auf der DNADIST-Matrix lag die molekulare Evolutionsdistanz für Isolate, die zum selben Subtyp gehören, im Bereich von 0,0402 bis 0,111 (Mittel 0,0772, SA 0,0197) zwischen Subtypen im Bereich von 0,1864 bis 0,3535 (Mittel 0,2833, SA 0,0350) und zwischen Typen im Bereich von 0,3824 bis 0.6230 (Mittel 0,4894, SA 0,0554).
  • Die Distanzen aus der DNADIST-Matrix lieferten einen weiteren Hinweis auf die Existenz von mindestens vier verschiedenen Subtypen in Typ 4. Typ 4a besitzt eine mittlere wechselseitige Distanz von 0,0083, während der Mittelwert mit Typ 4c, 4e und 4f 0,2602 betrüg. Die Subtypen 4c und 4f waren von 4e durch 0,2047 bzw. 0,1864 getrennt, während die Distanz zwischen 4c und 4f 0,2316 betrug.
    • Die NS3/4-Region
  • DNA-Sequenzen, welche die früher beschriebene Region des Typ 3a- Epitops enthielten (Stuyver et al., 1993a), und andere Sequenzen der EMBL-Datenbank wurden verwendet, um die Nucleotiddistanzen unter Einsatz von DNADIST und NEIGHBOR zu berechnen. Gemäß der DNADIST- Matrix lagen die molekularen Evolutionsdistanzen zwischen Isolaten im Bereich von 0,0407 bis 0,1181 (Mittel 0,0855, SA 0,0190), zwischen Subtypen im Bereich von 0,2281 bis 0,2603 (Mittel 0,2416, SA 0,0098) und zwischen Typen im Bereich von 0,4052 bis 0,6247 (Mittel 0,4889, SA 0,0531).
    • Beispiel 10
  • Wie in der Einführung zu den Beispielen und in vorhergehenden Beispielen beschrieben, steht zu erwarten, daß variable Regionen in der 5'-UR auch in neu entdeckten Genotypen genotypspezifische Sequenzen enthalten, wie in Beispiel 8 illustriert, und folglich sollten solche neuen genotypspezifischen Motive wiederum mittels der genotypspezifischen Sonden nachweisbar sein, wie in Beispiel 8 beschrieben. Deshalb wurden die Sonden 32 und, wie in Beispiel 8 beschrieben, die Sonden 31, 33, 34, 37, 38, 44, 45 und 46 synthetisiert und auf Nitrocellulosemembranen aufgebracht und Linien- Sonden-Assays mit Biotin-markierten PCR-Fragmenten durchgeführt wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben, mit Ausnahme der Markierung des PCR-Produkts mit Biotin, welches nicht mit Bio-11-dUTP inkorporiert wurde, sondern mit 5'-biotinylierten Primern mit SEQ ID NO 3 und 4 oder 5'-biotinylierten Primern mit SEQ ID NO 1 und 2 während der Synthese des PCR-Fragments.
  • Fig. 6 zeigt die typspezifische Hybridisierung von 5'-UR-Fragmenten des HCV-Typs 2, jedoch nicht des Typs 1, mit der Sonde mit SEQ ID NO 32. Sowohl Subtyp 2a- als auch Subtyp 2b-Isolate hybridisierten spezifisch mit der Sonde 32.
  • In Fig. 7 konnte gezeigt werden, daß die Sonden mit SEQ ID NO 33 und 34 spezifisch mit dem Genotyp 2c-PCR-Produkt hybridisierten, welches von dem Serum BE92 erhalten worden war, während Genotyp 2a- und 2b-Seren mit diesen Sonden nicht reagierten, obwohl eine spezifische Hybridisierung mit den jeweiligen für den Genotyp 2a bzw. -2b spezifischen Sonden beobachtet werden konnte. Es ist zu betonen, daß sich der neue Genotyp 2c von anderen Genotyp 2c- Subtypen, die kürzlich entdeckt wurden, unterscheiden könnte, und deshalb könnten alternative Namen zur Bezeichnung dieses Subtyps vorgeschlagen werden.
  • Fig. 8 zeigt Linien-Sonden-Assays, durchgeführt mit Typ 4-Seren, um die spezifische Hybridisierung der häufigsten Typ 4-Seren mit den Sonden 37 und 38 zu zeigen.
  • Fig. 9 stellt die spezifische Hybridisierung von Typ 5a-Seren mit den Sonden 44, 45, 46 und Sonde 7 dar, während die Reaktivität der Typ 4-Seren gewöhnlich auf Sonde 31 beschränkt ist und bei den Sonden 44 bis 46 fehlt. Deshalb kann die "Promiskuität" der Sonde mit SEQ ID NO 18 für sowohl Typ 4- als auch Typ 5-Isolate nun bequem überwunden werden, indem neben der Sonde mit SEQ ID NO 19 Sonden mit SEQ ID NO 37, 38, 44, 45, 46, 7, 30 und 31 zur Unterscheidung der Genotypen 4 und 5 eingesetzt werden.
    • Beispiel 11
  • Es könnte vorzuziehen sein, andere Hybridisierungsbedingungen (Temperatur, Puffer) einzusetzen, als in den Beispielen 3 und 4 ausgeführt. Deshalb wurden Sonden mit SEQ ID NO 93, 94, 95 und 96 auf Nitrocellulosemembranen aufgebracht. Fig. 10 zeigt Linien- Sonden-Assays mit dem Typ 4a-Serum GB116 und dem Typ 5a-Serum BE95, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit Ausnahme des folgenden: Nach Denaturierung des PCR-Fragments in NaOH/SDS wurde 1,0 ml Hybridisierungslösung (auf 50ºC vorgewärmt), bestehend aus 3x SSC (Maniatis et al., (1982) und 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), dem denaturierten PCR-Produkt zugegeben und die Hybridisierung in einem geschüttelten Wasserbad für 2 Stunden bei 50ºC durchgeführt. Die Streifen wurden mit derselben Hybridisierungslösung 30 Minuten lang bei 50ºC gewaschen, wonach die Streifen gewaschen wurden und die Farbentwicklung erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. In Fig. 10 ist eine klare typspezifische Reaktion zu beobachten. Somit wurde nach Einführung von kleineren Modifikationen bei den Hybridisierungssonden eine typspezifische Hybridisierung unter anderen Hybridisierungsbedingungen erhalten als in den Beispielen 4 und 10 beschrieben. Beispielsweise kann die Position der Sonden geändert werden, um eine spezifischere Hybridisierung unter einer bestimmten Hybridisierungsbedingung zu erzielen, beispielsweise kann die Sonde so positioniert werden, daß die typspezifischen Nucleotide im mittleren Teil der Sonde lokalisiert sind. Für bestimmte Sonden kann es zur Erhaltung der Spezifität unter anderen Hybridisierungsbedingungen auch bevorzugt sein, die zusammenhängende HCV-Sequenz zu verlängern oder zu verkürzen und/oder die Leserichtung der Sonden umzukehren, um eine genotypspezifische Hybridisierung bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration zu erlauben. Es kann jedoch in einigen Fällen bevorzugt sein, Inosine oder fehlgepaarte Nucleotide einzuschließen, um eine genotypspezifische Hybridisierung bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration zu erlauben. Beispielsweise wurde die Sonde mit SEQ ID NO 37, welche fähig war, zwischen Typ 4- und Typ 5-Isolaten in Tetramethylammoniumchlorid- Puffer zu unterscheiden, wie in Beispiel 10 beschrieben, nun durch Verlängerung der zusammenhängenden HCV-Sequenz am 3'-Ende mit 2 Nucleotiden in die Sonde mit SEQ ID NO 93 (5'-GAGTGTTGTACAGCCTCC-3') verwandelt und Sonde 93 zeigte eine spezifische Reaktivität in SSC/SDS-Hybridisierungspuffer (Fig. 10). Die Sonde mit SEQ ID NO 44, welche fähig war, zwischen Typ 4- und Typ S-Isolaten in Tetramethylammoniumchlorid-Puffer zu unterscheiden, wie in Beispiel 10 beschrieben, wurde nun durch Verlängerung der zusammenhängenden HCV-Sequenz am 3'-Ende mit einem Nucleotid in die Sonde mit SEQ ID NO 96 (5 '-GAGTGTCGAACAGCCTC -3') verwandelt, und Sonde 96 zeigte eine spezifische Reaktivität in SSC/SDS-Hybridisierungspuffer (Fig. 10). Die Antisense-Sonde mit SEQ ID NO 46, welche gegen die Positionen -132 bis -117 gerichtet ist, war fähig, zwischen Typ 4- und Typ 5-Isolaten in Tetramethylammoniumchlorid-Puffer zu unterscheiden, wie in Beispiel 10 beschrieben, und wurde nun in die Sonde mit SEQ ID NO 95 (5'-TGCCCGGAGATTTGGG-3') verwandelt, eine In- Leserichtung-Sonde, welche gegen die Positionen -126 bis -111 gerichtet ist, und Sonde 95 zeigte eine spezifische Reaktivität in SSC/SDS-Hybridisierungspuffer (Fig. 10).
  • Dieses Beispiel erläutert Fachleuten die zahlreichen Möglichkeiten der Entwicklung von Sonden, um diese gegen genotypspezifische Mutationen wie in Fig. 4 dargestellt oder gegen genotypspezifische Mutationen, welche in anderen neuen oder noch aufzufindenden Genotypen vorliegen, zu richten. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 2: Interpretation der in Fig. 3 dargestellten Ergebnisse Tabelle 3: Endergebnisse d. HCV-LIPA-Typisierungs- u. HCV-Antikörper-Assays Tabelle 3: (Fortsetzung) Endergebnisse d. HCV-LIPA-Typisierungs- u HCV-Antikdrper-Assays Tabelle 3: (Fortsetzung) Endergebnisse d. HCV-LIPA-Typisierungs- u. HCV-Antikörper-Asssys Tabelle 4. Nucleotidsequenz, Position und Orientierung der Primer und Sonden Tabelle 5 Tabelle 6 Homologie zu der NS5-Nucleotid (Aminosäure)-Sequenz des Typs Tabelle 6 (Fortsetzung) Homologie zu der NS5-Nucleotid (Aminosäure)-Sequenz des Typs
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Claims (26)

1. Verwendung von mindestens einer Sonde zur Genotypbestimmung eines beliebigen, in einer biologischen Probe vorliegenden HCV-Isolats, wobei diese Sonde bis zu 50 Nucleotide aufweist und (i) fähig ist, mit einer genotypspezifischen Target-Region zu hybridisieren, die in einem zu analysierenden Strang in der sich von den Nucleotiden in den Positionen -291 bis -66 der 5'-nichttranslatierten Region eines der HCV- Isolate erstreckenden Domäne vorliegt, oder wobei diese Sonde (ii) zu der beliebigen oben definierten Sonde komplementär ist, wobei sich diese Verwendung von der Verwendung einer ³²P-markierten Sequenz mit der Sequenz AACCCACTCTATGYCCGGYCAT und GAATCGCTGGGGTGACCG, in der Y C oder T/U bedeutet, in einem Hybridisierungsversuch mit einem unter Verwendung der Sequenzen CCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTA und TTGCGGGGGCACGCCCAA als Primer hergestellten immobilisierten PCR-Produkt unterscheidet.
2. Verfahren zur Genotypbestimmung eines beliebigen, in einer biologischen Probe vorliegenden HCV-Isolats, umfassend die folgenden Schritte:
- In-Kontakt-Bringen dieser Probe, bei der die Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide falls nötig durch geeignete Denaturierung zugänglich gemacht wurden, mit mindestens einer Sonde, wobei diese Sonde über bis zu 50 Nucleotide verfügt und (i) fähig ist, mit einer genotypspezifischen Target-Region zu hybridisieren, die in einem zu analysierenden Strang in der sich von den Nucleotiden in den Positionen -291 bis -66 der 5'-nichttranslatierten Region eines der HCV- Isolate erstreckenden Domäne vorliegt, oder wobei diese Sonde (ii) zu einer beliebigen oben definierten Sonde komplementär ist, sowie
- Nachweisen der gegebenenfalls zwischen der Sonde und der Nucleotidsequenz des zu identifizierenden HCV-Isolats gebildeten Komplexe, wobei sich dieses Verfahren von einem Verfahren zur Bestimmung eines HCV-Genotyps, bei dem ³²P-markierte Sequenzen, die über die Sequenz AACCCACTCTATGYCCGGYCAT und GAATCGCTGGGGTGACCG verfügen, in der Y C oder T/U bedeutet, in einem Hybridisierungsversuch mit einem unter Verwendung der Sequenzen CCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTA und TTGCGGGGGCACGCCCAA als Primer hergestellten immobilisierten PCR-Produkt verwendet werden, unterscheidet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem ein aus mindestens zwei Sonden bestehender Sondensatz verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, bei dem sich die verwendete Sonde gegen eine mindestens 5 Nucleotide umfassende Region in einer der folgenden Domänen richtet:
a) die sich von dem Nucleotid in Position -293 bis zu dem Nucleotid in Position -278 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
b) die sich von dem Nucleotid in Position -275 bis zu dem Nucleotid in Position -260 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
c) die sich von dem Nucleotid in Position -253 bis zu dem Nucleotid in Position -238 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
d) die sich von dem Nucleotid in Position -244 bis zu dem Nucleotid in Position -229 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
e) die sich von dem Nucleotid in Position -238 bis zu dem Nucleotid in Position -223 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
f) die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
g) die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 tin Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
h) die sich von dem Nucleotid in Position -83 bis zu dem Nucleotid in Position -68 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
i) die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position -88 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
j) die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position -130 erstreckende Domäne.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem für jeden zu bestimmenden HCV-Typ oder -Subtyp ein Satz aus zwei verschiedenen Sonden oder eine Mischung aus zwei verschiedenen Sonden verwendet wird, wobei sich jede Sonde des Satzes bzw. der Mischung gegen jeweils unterschiedliche genotypspezifische, in einem zu analysierenden Strang vorliegende Target-Regionen unter den in Anspruch 4 definierten Regionen richtet, wobei insbesondere zwei Sonden in diesem Satz bzw. dieser Mischung sich gegen jeweils unterschiedliche, jeweils aus der folgenden Liste an Domänenpaaren ausgewählte Regionen richten:
* die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position -88 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position -88 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -83 bis zu dem Nucleotid in Position -68 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -141 bis zu dem Nucleotid in Position -117 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -83 bis zu dem Nucleotid in Position -68 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -170 bis zu dem Nucleotid in Position -155 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position -130 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -132 bis zu dem Nucleotid in Position -117 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position -130 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne,
* die sich von dem Nucleotid in Position -146 bis zu dem Nucleotid in Position -130 (in Fig. 2 und 4) sowie die sich von dem Nucleotid in Position -103 bis zu dem Nucleotid in Position -88 (in Fig. 2 und 4) erstreckende Domäne.
6. Sonde mit bis zu 50 Nucleotiden, die sich gegen mindestens eine der folgenden genotypspezifischen Target-Regionsequenzen richtet:
worin Y T oder C darstellt,
K G oder T darstellt
und R G oder A darstellt, insbesondere eine Sonde mit einer beliebigen der oben definierten Sequenzen,
- oder der entsprechenden Sequenz, worin T durch U ersetzt wurde
- oder den Sequenzen, die zu den oben definierten Sequenzen komplementär sind,
oder Varianten dieser Sonden, die folgendermaßen gekennzeichnet sind:
- Sonden, bei denen die Position der typspezifischen Nucleotide dieser Sondensequenz geändert wurde, um unter einer gewissen Hybridisierungsbedingung eine spezifischere Hybridisierung zu erreichen, oder
- Sonden, bei denen diese Sondensequenz verlängert oder verkürzt wurde, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, oder
- Sonden, bei denen der Sinn dieser Sondensequenz umgekehrt wurde, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, oder
- Sonden, bei denen Inosine eingebaut wurden, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten, oder
- Sonden, bei denen fehlgepaarte Nucleotide eingebaut wurden, um bei einer bestimmten bevorzugten Temperatur oder Salzkonzentration eine genotypspezifische Hybridisierung zu gestatten,
wobei sich diese Sonde von AACCCACTCTATGYCCGYCAT oder GAATCGCTGGGGTGACCG (wobei Y C oder T/U bedeutet) unterscheidet.
7. Satz zweier Sonden bzw. Mischungen zweier Sonden, wobei es sich bei jeder der beiden Sonden um eine Sonde nach Anspruch 6 handelt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 zur Genotypbestimmung von HCV-Isolaten, die zu mindestens einem der folgenden HCV-Typen gehören: HCV-Typ 1, HCV-Typ 2, HCV-Typ 3, HCV-Typ 4, HCV-Typ 5, HCV-Typ 6, in einer biologischen Probe, die vermutlich HCV enthält, umfassend die folgenden Schritte:
- In-Kontakt-Bringen dieser Probe, bei der die Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide falls nötig durch geeignete Denaturierung zugänglich gemacht wurden, mit mindestens einer bis zu 50 Nucleotide umfassenden Sonde, wobei diese Sonde (i) fähig ist, mit einer genotypspezifischen Target-Region zu hybridisieren, die in einem zu analysierenden Strang in der sich von dem Nucleotid in Position -291 bis zu dem Nucleotid in Position -66 der 5'-nichttranslatierten Region von HCV-Isolaten erstreckenden Domäne vorliegt, oder wobei diese Sonde (ii) zu den oben definierten Sonden komplementär ist, sowie
- Nachweisen der gegebenenfalls zwischen dieser Sonde und der Target-Region gebildeten Komplexe, sowie
- Ziehen von Schlußfolgerungen auf die vorliegenden HCV-Typen aus den beobachteten Hybridisierungsmustern, wobei sich dieses Verfahren von einem Verfahren zur Bestimmung eines HCV-Genotyps, bei dem ³²P-markierte Sequenzen, die über die Sequenz AACCCACTCTATGYCCGGYCAT und GAATCGCTGGGGTGACCG verfügen, in der Y C oder T/U bedeutet, in einem Hybridisierungsversuch mit einem unter Verwendung der Sequenzen CCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTA und TTGCGGGGGCACGCCCAA als Primer hergestellten immobilisierten PCR-Produkt verwendet werden, unterscheidet.
9. Verfahren nach Anspruch 8 zur Genotypbestimmung von HCV-Isolaten, die zu mindestens einem der folgenden HCV-Typen gehören: HCV-Typ 1, HCV-Typ 2, HCV-Typ 3, HCV-Typ 4, HCV-Typ 5, HCV-Typ 6, wobei die verwendeten Sonden fähig sind, sich mindestens gegen eine der folgenden Target-Regionen, oder diese Regionen, in denen T durch U ersetzt worden ist, oder die zu den obengenannten Regionen komplementären Regionen zu richten:
für HCV-Typ 1 und 6:
für HCV-Typ 1:
für HCV-Typ 2:
für HCV-Typ 3:
für HCV-Typ 4 und 5:
für HCV-Typ 4:
für HCV-Typ 4, 3c und 3b:
für HCV-Typ 4 und 3b:
für HCV-Typ 4:
für HCV-Typ 5:
für HCV Typ 6:
worin Y C oder T und K G oder T darstellt, oder
wobei die verwendeten Sonden einen Satz von zwei aus den oben definierten Sonden ausgewählten Sonden darstellen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, das außerdem die Unterscheidung und Einteilung von HCV-Subtypen umfaßt, wobei neben der mindestens einen Sonde, die fähig ist, mit einem bestimmten wie in Anspruch 9 definierten HCV-Typ zu hybridisieren, mindestens eine der Sonden, die sich gegen die folgenden Target-Regionen richtet, verwendet wird, oder diese Regionen, bei denen T durch U ersetzt ist, oder diese Regionen, die zu den oben definierten Regionen komplementär sind,
für HCV-Typ 1, Subtyp 1a:
für HCV-Typ 1, Subtyp 1b:
worin Y C oder T darstellt,
für HCV-Typ 2, Subtyp 2a:
worin R A oder G darstellt,
für HCV-Typ 2, Subtyp 2b:
für HCV-Typ 2, Subtyp 2c:
für HCV-Typ 3, Subtyp 3a:
worin K G oder T darstellt,
für HCV-Typ 3, subtyp 3b:
für HCV-Typ 3, Subtyp 3c:
für HCV-Typ 4, Subtyp 4a oder 4d:
für Typ 4, Subtyp 4b:
für Typ 4, Subtyp 4c:
für Typ 4, Subtyp 4e:
für Typ 4, Subtyp 4f:
für Typ 4, Subtyp 4g (vorläufig):
für Typ 4, Subtyp 4h (vorläufig):
oder wobei es sich bei den verwendeten Sonden um einen Satz von zwei aus den definierten Sonden ausgewählten Sonden handelt,
und wobei, falls nur zwei Subtypen eines Typs existieren, man mit diesen obengenannten Sonden den aus der Tatsache, daß sie sich nicht gegen eine der obengenannten Regionen richten, gefolgerten Subtyp auf dem Ausschlußweg bestimmen kann.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 8 bis 10, wobei die HCV-Typen oder -Subtypen, zwischen denen zu unterscheiden ist, mittels HCV-Universalsonden identifiziert werden, wobei diese Sonden über bis zu 50 Nucleotide verfügen, z. B. diejenigen, die sich gegen eine der folgenden Regionen richten:
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 8 bis 11, bei dem vor dem Hybridisierungsschritt ein Amplifizierungsschritt des Desoxyribonucleotids oder Ribonucleotids, das die Target-Region enthält, durchgeführt wird, der vorteilhaft folgende Schritte enthält:
- In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe, die das zu typisierende oder subtypisierende Isolat enthalten kann, mit einem Satz Primer, die die Target- Region flankieren, wobei diese Primer zu konservierten Regionen des HCV-Genoms komplementär sind und vorzugsweise zu den 5'-nichttranslatierten konservierten Regionen des HCV-Genoms komplementär sind, wobei die Primer vorzugsweise über mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide verfügen, wobei diese aufeinanderfolgenden Nucleotide jeweils zu aus der sich von dem Nucleotid -341 bis zu dem Nucleotid -171 erstreckenden Region und der sich von dem Nucleotid -67 bis zu dem Nucleotid -1 (der Fig. 2 und 4) erstreckenden Region gewählten Sequenzen komplementär sind,
- Amplifizieren der Target-Region, z. B. über eine polymerase Kettenreaktion mittels des obengenannten Satzes Primer und gegebenenfalls Einbauen eines Markers, wie Digoxigenin oder Biotin, in die amplifizierte Target-Sequenz, wobei zwischen 20 und 80 mal, vorteilhafterweise zwischen 30 und 50 mal amplifiziert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Amplifizierung aus einem doppelten PCR-Schritt besteht, wobei bei jedem Schritt ein spezifischer Satz Primer verwendet wird, wobei bei dem ersten Schritt äußere, aus der sich von dem Nucleotid -341 bis zu dem Nucleotid -186 erstreckenden Region und aus der sich von dem Nucleotid -52 bis zu dem Nucleotid -1 erstreckenden Region ausgewählte Primer, insbesondere der folgende Satz:
bzw. komplementäre Sätze,
worin W A oder T darstellt, verwendet werden und wobei in dem zweiten Schritt aus der sich von dem Nucleotid -326 bis zu dem Nucleotid -171 erstreckenden Region und aus der sich von dem Nucleotid -68 bis zu dem Nucleotid -1 erstreckenden Region gewählte innere Primer,
insbesondere der folgende Satz:
worin R A oder G darstellt und Y T oder C darstellt,
oder dazu komplementäre Sätze verwendet werden.
14. Verfahren zur gleichzeitigen Genotypbestimmung aller in einer biologischen Probe enthaltenen HCV-Isolate nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 8 bis 13, umfassend den Schritt, daß eines der folgenden Elemente:
- entweder diese biologische Probe, in der das genetische Material hybridisierungsbereit gemacht wurde,
- oder das in dieser biologischen Probe enthaltene gereinigte genetische Material,
- oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltene Einzelkopien
- oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltene amplifizierte Kopien
mit einem festen Träger, auf dem zuvor Sonden nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 8 bis 13 immobilisiert wurden, in Kontakt gebracht wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 8 bis 14, umfassend die Schritte des In-Kontakt- Bringens einer beliebigen Sonde nach einem der Ansprüche 2 bis 5 und 8 bis 14 mit einem der folgenden Elemente:
- entweder einer biologischen Probe, in der das genetische Material hybridisierungsbereit gemacht wurde,
- oder dem in dieser biologischen Probe enthaltenen gereinigten genetischen Material,
- oder einer von dem gereinigten genetischen Material erhaltenen Einzelkopie
- oder einer von dem gereinigten genetischen Material erhaltenen amplifizierten Kopie, wobei diese Elemente zuvor auf einem Träger immobilisiert wurden.
16. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung neuer HCV-Typen oder -Subtypen, die sich von den bekannten Typen oder Subtypen unterscheiden, umfassend die folgenden Schritte:
- nach dem in einem der Ansprüche 2 bis 5 oder 8 bis 15 definierten Verfahren Bestimmen, zu welchen bekannten Typen oder Subtypen die in der biologischen Probe vorliegenden HCV-Isolate gehören, wobei gegebenenfalls diese biologische Probe zuvor gegebenenfalls mittels HCV-Antigen- oder -Antikörper- Assays oder mit einer HCV-Universalsonde, z. B. den in Anspruch 11 definierten, als HCV-haltig bestimmt worden ist, und
- falls eine Probe beobachtet wird, die nicht mit mindestens einer der Sonden, die fähig sind, sich gegen die aus einer beliebigen wie in Anspruch 4 oder 5 definierten Domäne ausgewählten Regionen zu richten, positiv hybridisiert, Sequenzieren des vollständigen Genoms des in der Probe vorliegenden HCV-Typs oder als Alternative Sequenzieren des Teils bzw. der Teile der 5'nichttranslatierten Region der Probe, der bzw. die einem neuen zu bestimmenden Typ und/oder Subtyp entspricht/entsprechen.
17. Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von neuartigen HCV-Typen und/oder -Subtypen, die in einer biologischen Probe vorliegen, und die sich bei Identifizierung eines neuartigen Typs von Typ 1, Typ 2, Typ 3, Typ 4, Typ 5 und Typ 6 unterscheiden und die sich bei Identifizierung eines neuartigen Subtyps für ein HCV-Isolat vom Typ 1 von den Subtypen 1a und 1b, für ein Isolat vom Typ 2 von den Subtypen 2a und 2b, für ein Isolat vom Typ 3 von den Subtypen 3a, 3b und 3c und für ein Isolat vom Typ 4 von den Subtypen 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g (vorläufig) und 4h (vorläufig) unterscheiden, umfassend die folgenden Schritte:
- nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder 8 bis 15 Bestimmen, zu welchem bzw. welchen bekannten Typ(en) oder Subtyp(en) das in der biologischen Probe vorliegende HCV-Isolat, bzw. die in der biologischen Probe vorliegenden HCV-Isolate, gehört bzw. gehören, wobei gegebenenfalls diese biologische Probe zuvor gegebenenfalls mittels HCV-Antigen- oder -Antikörper-Assays oder mit einer HCV-Universalsonde, z. B. den in Anspruch 11 definierten, als HCV-haltig bestimmt worden ist,
- falls eine Probe beobachtet wird, die nicht mit mindestens einer der Sonden, die fähig sind, sich gegen die aus einer der typspezifischen oder subtypspezifischen wie in Anspruch 9 und 10 definierten Domänen gewählten Regionen zu richten, hybridisiert, insbesondere die für Typ 1 nicht mit SEQ ID NO 5, 28 und 6, für Typ 2 nicht mit SEQ ID NO 8 bis 12 oder 22 bis 26 und 32 bis 34, für Typ 3 nicht mit SEQ ID NO 13, 14, 36, 21 oder 54, für Typ 4 nicht mit SEQ ID NO 17, 18, 19, 37 bis 43, 49, 50 und 53, und für Subtyp 1b nicht mit SEQ ID NO 7 und 30, für Subtyp 1a nicht mit SEQ ID NO 31, für Subtyp 2a nicht mit SEQ ID NO 9, 10, 22 oder 24, für Subtyp 2b nicht mit SEQ ID NO 11, 12, 23 oder 25, für Subtyp 2c nicht mit SEQ ID NO 33 oder 34, für Subtyp 3a nicht mit SEQ IN NO 13, 14 oder 35, für Subtyp 3b, 4a oder 4d nicht mit SEQ ID NO 38, 21 und 19, für Subtyp 4b nicht mit SEQ IN NO 38 oder 41, für Subtyp 4c nicht mit SEQ ID NO 42 oder 43, für Subtyp 4e nicht mit SEQ ID NO 39, 40 oder 41, für Subtyp 4f nicht mit SEQ ID NO 51, 38, 19 oder 7, für den vermutlichen Subtyp 4h nicht mit SEQ ID NO 49 oder 50 und für den vermutlichen Subtyp 4g nicht mit SEQ ID NO 50 oder 53 hybridisiert, Sequenzieren des vollständigen Genoms des in der Probe vorliegenden HCV-Typs oder als Alternative Sequenzieren des Teils bzw. der Teile der 5'-nichttranslatierten Region der Probe, der bzw. die einem neuen zu bestimmenden Typ und/oder Subtyp entspricht/entsprechen.
18. Verfahren zur Bestimmung des Typs bzw. der Typen sowie des Subtyps bzw. der Subtypen von HCV und/oder HIV und/oder HBV und/oder HTLV, das bzw. die in einer biologischen Probe vorliegt bzw. vorliegen, umfassend die folgenden Schritte:
- Bereitstellung von
* mindestens einer der Sonden wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert, vorzugsweise der Sonden wie in Anspruch 9 und 10 definiert, wodurch man den Genotyp (Typ und/oder Subtyp) von HCV bestimmen kann, und mindestens einer der folgenden Sonden:
* Sonden, die fähig sind, Oligonucleotide von HIV Typ 1 und/oder 2 nachzuweisen, die in dieser biologischen Probe vorhanden sein können, und/oder
* Sonden, die fähig sind, Oligonucleotide von HBV-Subtypen und/oder -Oberflächenantigen (sAg)- Mutanten und/oder -Core-Antigen (cAg)-Mutanten nachzuweisen, die in dieser biologischen Probe vorliegen können, und/oder
* Sonden, die fähig sind, Oligonucleotide von HTLV-I und HTLV-II nachzuweisen, von denen angenommen wird, daß sie sich in der biologischen Probe befinden,
- gegebenenfalls Bereitstellung eines Satzes Primer wie in Anspruch 12 oder 13 definiert sowie mindestens eines der folgenden Primer: Primer-Sätze für die Amplifizierung von jeweils HIV- und/oder HBV- und/oder HTLV-Oligonucleotiden mittels PCR-Reaktion und Amplifizierung der Oligonucleotide von HCV und entweder HBV und/oder HIV und/oder HTLV, die möglicherweise in der biologischen Probe vorliegen,
- In-Kontakt-Bringen
* der biologischen Probe, in der das genetische Material hybridisierungsbereit gemacht wurde,
* oder des in dieser biologischen Probe enthaltenen gereinigten genetischen Materials,
* oder von dem gereinigten genetischen Material erhaltener Einzelkopien
* oder von dem gereinigten Material erhaltener amplifizierter Kopien mit den oben definierten Sonden unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen den Sonden und den Target- Sequenzen von HCV-Isolaten und mindestens einem der folgenden Viren: HBV und/oder HIV und/oder HTLV gestatten, sowie
- Nachweisen der zwischen den verwendeten Sonden und den gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegenden Target-Regionen gegebenenfalls gebildeten Komplexen.
19. Fester Träger, insbesondere eine Mikrotiterplatte oder ein Membranstreifen, der auf bekannten Stellen seine Oberfläche die folgenden Sonden bzw. Komplementärsonden oder die obengenannten Sonden, bei denen T durch U ersetzt wurde, enthält:
- SEQ ID NO 5, NO 6, NO 7, NO 8, NO 9, NO 10, NO 11, NO 12, NO 13, NO 14, NO 15, NO 16, NO 17, NO 18, NO 19, NO 20, NO 21, NO 22, NO 23, NO 24, NO 25, NO 26, NO 27, NO 28 bis NO 54 und SEQ ID NO 93 bis 96 nach den Ansprüchen 9 bis 10 sowie eine Kontrolle, um zu bestimmen, ob zwischen dieser Sonde und den Ribo- oder Desoxyribonucleotidsträngen von HCV, die in einer biologischen Probe, in der HCV-Isolate zu unterscheiden sind, enthalten sein können, eine Hybridisierung stattfindet.
20. Kit zur Bestimmung eines beliebigen HCV-Isolats, wobei dieses Kit folgendes enthält:
- ein Mittel zur Identifizierung des Vorhandenseins eines HCV-Isolats,
- mindestens eine wie in Anspruch 6 definierte Sonde,
- ein Puffer bzw. für die Herstellung des die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs von HCV-Isolaten gestattenden Puffers erforderliche Bestandteile,
- gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
21. Kit zur Bestimmung des Genotyps von mindestens einem HCV-Isolat aus einer biologischen Probe, die ein solches enthalten kann, nach dem Verfahren von Anspruch 11, und zur Klassifizierung dieses HCV-Isolats nach HCV-Typ und -Subtyp, wobei dieses Kit folgendes enthält:
- gegebenenfalls eine wie in Anspruch 24 definierte Sonde,
- mindestens eine beliebig aus den Sonden nach Anspruch 6 ausgewählte Sonde,
- ein Puffer bzw. für die Herstellung des die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs von HCV-Isolaten gestattenden Puffers erforderliche Bestandteile,
- gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
22. Kit zur Bestimmung des Genotyps von HCV-Isolaten, die zu mindestens einem der folgenden HCV-Isolate gehören: HCV-Typ 1, HCV-Typ 2, HCV-Typ 3, HCV-Typ 4, HCV-Typ 5, HCV-Typ 6, nach dem Verfahren von Anspruch 9, wobei dieses Kit folgendes enthält: mindestens eine der entsprechenden Sonden nach Anspruch 6,
- den Puffer bzw. die für die Herstellung des die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den cDNAs und/oder RNAs der obengenannten HCV-Isolate gestattenden Puffers erforderlichen Bestandteile,
- gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
23. Kit zur Unterscheidung und Klassifizierung von HCV-Typen und -Subtypen nach dem Verfahren von Anspruch 10, wobei dieses Kit folgendes enthält:
- mindestens eine der entsprechenden Sonden nach Anspruch 6,
- den Puffer bzw. die für die Herstellung des die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs der obengenannten HCV-Isolate gestattenden Puffers erforderliche Bestandteile,
- gegebenenfalls Mittel zum Nachweis der aus der obigen Hybridisierung hervorgehenden Hybride.
24. Sonde mit bis zu 50 Nukleotiden und mit mindestens einer der folgenden HCV-Universalsequenzen von der 5'UR-Region von HCV:
in der Y T oder C darstellt, oder der entsprechenden Sequenz, in der T durch U ersetzt wurde, oder der Sequenzen, die zu den oben definierten Sequenzen komplementär sind, wobei sich diese Sonde von TTGCGGGGGCACGCCCAA unterscheidet und wobei diese Sonde zur Identifizierung eines zuvor amplifizierten Fragments der 5'-nichttranslatierten Region von HCV verwendet wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 8 bis 18, bei dem weiterhin mindestens eine Sonde von der Core-Region verwendet wird, die mit genotypspezifischen Target-Sequenzen der Core-Region hybridisiert.
26. Verfahren für die allgemeine Amplifizierung der 5'UR-Region von HCV-Isolaten, bei dem mindestens einer der folgenden degenerierten Primer verwendet wird:
- ein degenerierter Primer mit der SEQ ID NO 1, vorzugsweise in Kombination mit einem Primer ausgewählt aus der sich von Nukleotid -52 bis Nukleotid -1 erstreckenden Region, z B. SEQ ID NO 2, wobei W A oder T darstellt, oder der Komplementärsequenz von SEQ ID NO 1 oder 2,
- ein degenerierter Primer mit der SEQ ID NO 3, vorzugsweise in Kombination mit einem Primer ausgewählt aus der sich von Nukleotid -68 bis Nukleotid -1 erstreckenden Region, z. B. SEQ ID NO 4, worin R A oder G darstellt und Y T oder C darstellt, oder der Komplementärsequenz von SEQ ID NO 3 oder 4.
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