KR20040083940A - Ｃ형 간염 바이러스 (ｈｃｖ) 유전자형 분석을 위한서스펜션 어레이의 마이크로스피어 조성물 및 그 검사 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈장 및 혈청으로부터 RNA를 추출하고 C형 간염 바이러스 (HCV) RT-PCR과 비대칭 PCR을 시행한 후에 HCV 프로브가 결합된 서스펜션 어레이의 마이크로스피어와 반응시킴으로써 HCV 유전자형을 분석하는 방법을 제공한다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 (ＨＣＶ) 유전자형 분석을 위한 서스펜션 어레이의 마이크로스피어 조성물 및 그 검사 방법 {Microsphere composition of suspension array for analyzing Hepatitis C virus (HCV) genotype and detecting method thereof}

본 발명은 서스펜션 어레이 조성물 및 그 제조방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 C형 간염 바이러스 (HCV) 유전자형 분석을 위한 서스펜션 어레이의 조성물 및 그 제조방법에 관한 발명이다.

일반적으로, C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus; HCV)는 간염의 원인 바이러스로 급성간염에서 만성간염, 간경변 및 간암으로 진행되는 매우 위험한 질병을 일으키는 요인으로서, 주로 수혈과 체액에 의해 감염된다 (Choo et al.,Science244, 359-362, 1989). 이 바이러스는 전세계적으로 약 4억 명 가량이 감염되어 있는 것으로 추정되는데 유럽, 북미, 일본 등의 선진국에서는 전 인구의 0.2-2%, 남미, 아시아 등에서는 2-5%, 대부분의 아프리카 국가에서는 5% 이상이 감염되어 있으며, 우리나라에서도 전 인구의 1.6%인 80만명 가량이 HCV에 감염되어 있는 것으로 추정되고 있다 (Park et al.,J. Viral Hepat. 2, 195-202, 1995). 이와 같이 HCV는 인류건강을 위협하는 매우 무서운 바이러스로 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus; HBV)와는 달리 감염자의 50-85%가 만성간염으로 진행될 정도로 예후가 좋지 않은 바이러스임에도 불구하고, RNA 바이러스라는 특성 때문에 아직까지 적절한 치료제 및 백신개발은 물론 기초적인 연구도 확립되지 못한 실정이다. 그러나 분자생물학의 발전에 따라서 진단 방법들이 개발되어 수혈에 따른 감염 위험에서 벗어 날 수가 있게 되었으나, 아직도 감염자의 많은 수의 감염경로가 불분명하여 감염의 위험은 계속 남아있는 상태이다.

HCV는 1989년 Choo 등에 의해 침팬지의 혈장에서 얻은 non-A, non-B (NANB)형 간염의 바이러스로부터 밝혀진 50 nm 정도 크기로 약 9,500개의 염기와 3,000여개의 아미노산으로 이루어진 positive-single strand linear RNA 바이러스이다. 이 HCV 유전자의 기본 구조는 core, nucleocapsid 및 envelope glycoprotein과 같은 3개의 구조 단백질과 helicase, viral protease, RNA-dependent RNA polymerase, transcriptase 및 regulatory peptide 같은 6개의 비구조 단백질을 생성하는 하나의 open reading frame (ORF)으로 이루어져 있다 (Chou et al.,Jpn. J. Med. Sci. Biol.4, 147-157, 1991). ORF의 양쪽 끝에는 5'-untranslated region (5'UTR)과 3'UTR이 존재하는데, 5'UTR은 약 340 bp로 HCV 유전자에서 가장 보존이 잘되어 있는 부위로서 stem-loop 구조로 되어 있다 (Han et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88, 1711-1715, 1991).

HCV는 돌연변이율이 높아 1년에 (1.44-1.92) x 10^-3bp 정도의 염기 치환이 발생하는데, HCV 유전자 중에서 5'UTR과 capsid가 가장 보존이 잘되어 있고 E1과 E2에서 변이가 가장 많이 나타나고 있다 (Ogata et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88, 3392-3396, 1991). 이로 인하여 HCV는 매우 높은 유전자 다형성을 나타내고 있는데 현재까지 크게 6개의 형으로 분류를 하고 그 속에 속하는 아형도 수종에서 수십종까지 분포하고 있다 (Simmonds et al.,J. Gen. Virol.74, 2391-2399, 1993; Cha et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89, 7144-7148, 1992). 아직까지 이들 형을 분류하는데 있어 표준화된 방법이 없어 연구자마다 서로 다른 명명법을 사용하고 있으나, 현재는 Simmomd 등이 제안한 분류법이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 이 분류법은 유전자형에 숫자 (1, 2, 3 등)를 붙이고 아형에 알파벳 문자 (a, b, c 등)를 붙이는 방법이다. 이들 분류법에 따르면 HCV는 유전자형간에는 31-35%의 차이가 있고 아형간에는 20-23%의 차이를 나타내고 있으며, 같은 아형 내에서도 1-10%의 차이를 보이고 있다 (Simmonds et al.,J. Gen. Virol.74, 661-668, 1993).

HCV 유전자형의 분석은 HCV 감염의 확인, 감염 경로, 및 IFN-α의 치료 효과를 예측하는 등에 이용되고 있다(Hino et al.,J. Med. Virol.42, 299-305, 1994). 또한 지역과 민족에 따라 다른 분포를 보이고 있기 때문에 (Greene et al.,J. Gen. Virol.76, 211-215, 1995), 분포도 조사 및 백신 개발에도 이용되고 있다. 현재 HCV를 치료하는데 가장 보편적인 항바이러스 치료제는 IFN-α인데, 대개 치료자의 50% 이상이 효과를 보이나 25% 정도만이 간의 작용이 정상으로 돌아오고 혈청내 HCV가 사라진다고 한다. 이때 IFN-α 치료 효과와 HCV 형과 관련성이 보고되고 있는데, 유전자형 1a, 2, 3, 및 5에서는 치료 효과가 뛰어나지만, 1b와 4에서는 효과가 떨어진다고 한다 (Yoshioka et al.,Hepatology16, 293-299, 1992). 또한 1b와 4는 만성간염으로의 전환이 빠른데 반하여 1a와 2a는 증상 호전이 훨씬 좋다고 나타나 있다(Lopez-Labrador, et al.,J. Hepatol. 27, 959-965, 1997).

일반적으로 HCV 유전자형을 분석하는 데는 다음과 같은 방법이 사용되고 있다. 첫째는 HCV 유전자형에 특이성을 지닌 PCR 프라이머를 사용하는 SSP-PCR 이다. 이는 core 부위에서 여러 유전자형에 특이한 PCR 프라이머를 조합하여 RT-PCR을 실시하는 것인데, 이는 RT-PCR 후에 바로 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 프라이머 인식 부위에 돌연변이가 발생하거나 새로운 형에 대하여서는 결정을 못하는 단점이 있다. 이로 인하여 변이가 많은 HCV 유전자형 분석에는 바람직하지 않은 방법이다. 둘째는 5'UTR 부위를 RT-PCR로 증폭하고 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP 법인데(Park et al.,J. Med. Microbiol.47, 1998), 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 사용하는 제한효소가 변이 부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하는 단점이 있다. 셋째는 5'UTR 부위를 RT-PCR로 증폭하여 유전자형에 특이한 올리고뉴크레오티드 프로브가 붙어있는 필터와 교잡반응을 시키는 것이다. 이것은 프로브의 종류에 따라 정확한 결과를 얻을 수 있으나 필터를 사용함에 따라서 많은 수의 프로브를 찍는데 한계가 있으며, 하나의 필터에서 한명만을 분석해야 하기 때문에 많은 검체를 처리하고 분석하는데 있어 시간과 노동력이 많이 소모가 된다. 넷째는 마이크로 칩 기술를 이용한 HCV 유전자형 분석키트(바이오코아, 한국)는 슬라이드상에서 반응하는 2차원적인 방법으로 교잡반응 후에 2차에 걸쳐서 세척과정을 거쳐야 하는 번거러움이 있으며 이미지 작업시 기준점을 정하기 어려운 단점이 있다. 서스펜션 어레이의 특징은 한 튜브(Tube)안에서 교잡반응이 일어나는 3차원적 방법으로 반응 후 Luminex 100(Luminex사, 미국)시스템에서 동시에 565-585nm과657-677nm파장을 측정함으로써 형광값을 표시하게 된다. 657-677nm 파장에서 측정된 형광값은 마이크로스피어 비드를 식별하며, 565-585nm 파장에서 측정된 형광값은 각 프로브와 반응한 PCR 산물이 Streptavidin-Cy3 또는Streptavidin-Phycoerythrin 결합으로 나타난 값이다(Kejiet al.,Cytometry33:318-323, 1998)

서스펜션 어레이는 플루오로메트리(Fluorometry)기술을 이용한 Luminex 100(Luminex사, 미국)시스템을 사용함으로써 고속측정이 가능하며, 1회 측정으로 100-300개의 마이크로스피어 비드의 형광값의 평균치를 확인하기 때문에 정확한 분석이 가능하며, 형광반응의 결과가 수치값으로 나타남으로써 정량 분석 및 자동화 시스템 적용이 용이하다(Armstronget al., Cytometry40:102-108,2000).

본 발명은 상기한 방법의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 C형 간염바이러스 유전자형을 분석하기 위한 발전된 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 조성물을 이용하여 발전된 HCV 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다.

도 1은 C형 간염 바이러스 (HCV) 서스펜션 어레이의 마이크로스피어에 대한 모식도이다. 즉, 마이크로스피어 제작시 서로 다른 파장을 나타내는 형광물질 2종류를 특정 비율로 배합하여 각각의 마이크로스피어를 인식할 수 있는 신호로 이용한다. 따라서, 여러 종류의 마이크로스피어를 섞었을 때에 각각의 마이크로스피어를 인식할 수 있도록 한 것이다. 상기와 같이 제작된 고유한 마이크로스피어에 HCV 유전자형을 구분하는 13개의 프로브와 양성 및 음성 컨트롤로 사용되는 2개의 프로브를 결합한 후 혼합하였다.

도 2는 HCV 서스펜션 어레이의 HCV 1b type에 관한 형광 반응 결과로각각의 마이크로스피에서 측정된 형광값을 그래프 및 수치화로 나타낸 것이다.

도 3은 HCV 서스펜션 어레이의 HCV 2a type에 관한 형광 반응 결과로각각의 마이크로스피에서 측정된 형광값을 그래프 및 수치화로 나타낸 것이다.

도 4는 서스펜션 어레이와 마이크로 어레이(Microarray)의 비교실험을 위한 것이다. 서스펜션 어레이에 사용한 것과 동일한 프로브를 알데하이드 슬라이드에고정한 후 교잡반응을 통한 형광반응의 결과를 나타낸 것이다. ①은 마이크로 어레이상에 각 HCV 유전자형 프로브가 고정된 위치를 도식화한 것이며,②은 HCV 1b형,③은 HCV 2a형의 형광사진 결과이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열정보 1에서 15까지의 염기서열을 포함하고 있는 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물을 제공한다.

본 발명의 각 올리고뉴크레오티드 프로브는 HCV 유전자형 결정을 위한 프로브이고, 상기의 올리고뉴크레오티드 프로브는 마이크로스피어에 고정화되어 있는것을 특징으로 한다.

또, 본 발명은 상기의 프로브와 타겟 유전자와의 결합을 검출하는데 사용되는 서열정보 16에서 19에 기재된 일차 또는 이차 프라이머 서열을 제공한다.

상기의 이차 프라이머 중 서열정보 19의 앤티센스 프라이머는 바이오틴이 부착된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 혈장 및 혈청으로부터 HCV RNA를 추출하는 단계, 추출한 RNA를 이용하여 RT-1차 PCR을 실시하는 단계, 상기 1차 PCR 후 2차 비대칭 PCR을 실시하는 단계, 상기의 2차 비대칭 PCR 부산물과 프로브를 결합시키는 단계 및 상기의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 HCV 유전자형 분석방법을 제공한다.

상기의 확인단계는 바이오틴과 결합하는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin-Phycoerythrin의 형광을 서스펜션 어레이 시스템인 Luminex 100(Luminex사, 미국)을 사용하여 확인하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 최근에 Lumiex사에서 개발된 서스펜션 어레이 기술을 이용하여 HCV 유전자형 분석 서스펜션어레이를 개발하였다. 즉, HCV 유전자형을 결정하기 위하여 HCV 5'UTR에서 6개 형과 10개의 아형 및 52개 종에 특이적으로 반응할 수 있는 15개의 올리고뉴크레오티드를 제작하였으며, 이를 각각의 마이크로스피어에 고정하였다. 이는 슬라이드상에서 반응하는 2차원적 방법이 아닌 3차원적 방법을 이용함으로써 HCV 유전자형 분석을 극대화하였다. RT-PCR 법을 사용하여 증폭시킨 HCV 유전자 PCR 산물과 마이크로스피어에 고정된 올리고뉴크레오티드 프로브와 교잡반응하여 나타난 프로브를 분석하여 HCV에 대한 6개의 유전자형과 10개의 유전자아형을 구분하였다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

실시예 1: HCV 프라이머의 합성 및 염기서열

RT-PCR에 사용한 HCV PCR 프라이머는 표 1에 나타난 것과 같은 5'UTR에서 6개 형에 공통적으로 반응 할 수가 있는 부위를 분석하여 사용하였다.

2차 비대칭 PCR에 사용하는 앤티센스 프라이머는 교잡반응을 시켜 형광반응으로 확인하기 위한 것으로 바이오틴을 붙였다. 여기서 사용한 프라이머는 Molecular cloning 3판 (Sambrook과 Rusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 oligonucleotide 합성과 같은 방법을 사용하여 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다.

실시예 2: HCV RNA의 추출, 역전사-일차 PCR 및 이차 PCR 반응

1) HCV RNA 추출 버퍼(1 ml 중 DEPC-DW 860 ul, Taq 10X buffer 100 ul, 1M DTT 20 ul, 10% NP40 20 ul) 5 ul와 혈장 또는 혈청 10 ul를 잘 섞었다.

2) PCR 기기의 온도를 92℃로 맞추어 놓은 상태에서 혼합된 혈청이 들어있는튜브를 꽂아 2분간 가열한 후에 준비된 얼음에 바로 꽂았다.

3) 5-10초간 원심분리시켜 놓았다.

4) 표 2와 같은 방법으로 역전사 반응 및 일차 PCR 반응을 GeneAmp PCR system 9600 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에서 연속적으로 시행하였다.

5) 일차 PCR 산물 2 ul를 사용하여 표 3과 같은 방법으로 2차 비대칭 PCR 반응을 시행하였다.

6) 2차 비대칭 PCR이 끝난 산물 5 ul에 젤 로딩 버퍼(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll 400) 1 ul를 넣고 1 μg/ml ethidium bromide (EtBr)가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer (Vilber Lourmat, France)에서 236 bp 또는 261 bp의 밴드를 확인하였다.

실시예 3: HCV 서스펜션어레이 제작을 위한 프로브 합성 및 염기서열

마이크로스피어의 카르복실기와 공유결합을 시키기 위하여 모든 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 붙이고 교잡 반응시 반응을 용이하게 하기 위하여 10개의 올리고(dT)를 부착한 다음 표 5와 같은 염기서열을 붙여 합성하였다. 즉, "Amino link-Oligo(dT)₁₀-프로브 염기서열"의 순서로 하여 독일의 Metabion 사에 의뢰하여 합성하였다. 이때 결정한 HCV 유전자형의 염기서열은 표 4에서 나타낸 것 같이 6개형의 총 52종의 HCV 유전자를 분석하여 결정하였다.

표 5에서 나타낸 염기서열에서 중앙에 대문자로 표기된 염기서열이 가장 중요 부분으로 이를 중심으로 하여 약 15 bp에서 25 bp의 크기로 하여 62℃를 전후하여 Tm 값을 설정하여 합성하였다.

실시예 4: HCV 유전자형 특이 마이크로스피어 제작

1) 100pmole의 아미노기가 붙어있는 프로부를 0.1M MES(M2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid pH4.5)에 10 μM 이 되도록 희석하였다.

2) 마이크로스피어를 제작하기 위하여 Miraibio LabMaP bead(미국)에서 구입하여 사용하였다. LabMAP 마이크로스피어를 10ul를 1.5ml tube로 분주한후 50 ul의0.1M MES buffer(pH 4.5)를 넣고, 10,000g에서 1분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하였다.

3) 침사물에 25ul의 0.1M MES buffer(pH 4.5)를 넣고 sonication 하였다.

4) 10 μM 프로부 2.5ul를 취하여 상기 제조된 마이크로스피어 비드에 첨가하였다.

5) 1%(w/v) EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 용액 2.5ul를 첨가하여 암소에서 30분간 반응하였다.

6) 5)번 과정을 1회 반복하였다.

7) 0.02% Tween 20 용액 200ul를 첨가한 후 10,000g에서 1분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다.

8) 0.1% SDS 용액 200ul을 첨가한 후 10,000g에서 1분간 원심 분리 후 상층액을 제거 하였다.

9) 침사물을 0.1M MES(pH 4.5) 100ul에 녹인 후 암소에서 냉장보관 하였다.

전체적인 반응을 모식도로 나타내면 다음과 같다.

R : 올리고뉴크레오티드, X : 마이크로스피어

실시예 5: HCV PCR 산물과의 결합 반응

1) 바이오틴이 부착된 프라이머로 증폭된 HCV PCR 산물 5ul, 하이브리다이제이션 용액(6X SSC, 0.5% SDS) 12.5ul, 마이크로스피어 혼합액 5ul, Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin-Phycoerythrin(1/50 희석액) 2.5ul를 혼합하였다.

2) 68℃에서 1시간 동안 반응하였다.

3) 0.1X SSC 50ul를 첨가하여 반응을 중지하였다.

4) 결과 확인

Luminex 100 LabMAP (Luminex사, 미국)를 사용하여 형광을 나타내는 HCV 유전자형을 분석하였다.

그 결과를 도2에서 4에 나타내었다.

도 2는 HCV 서스펜션 어레이의 HCV 1b type에 관한 형광 반응 결과로각각의 마이크로스피에서 측정된 형광값을 그래프 및 수치화로 나타낸 것으로, HCV 1b type은 한국인에게 가장 많이 발생하는 형으로 15개의 probe 중에서 표 5의 "반응 HCV형"에 표시된 것과 같이 프로브 1번, 2번과 3번에 동시에 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 14번은 양성(Positive) 컨트롤로서 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 15번은 음성(Negative) 컨트롤로서 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다.

도 3은 HCV 서스펜션 어레이의 HCV 2a type에 관한 형광 반응 결과로각각의 마이크로스피에서 측정된 형광값을 그래프 및 수치화로 나타낸 것으로, HCV 1b type은 15개의 probe 중에서 표 5의 "반응 HCV형"에 표시된 것과 같이 프로브 4번, 5번과 6번에 동시에 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 14번은 양성(Positive) 컨트롤로서 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 15번은 음성(Negative) 컨트롤로서 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다.

도 4는 서스펜션 어레이와 마이크로 어레이(Microarray)의 비교실험을 위한 것으로, 서스펜션 어레이에 사용한 것과 동일한 프로브를 알데하이드 슬라이드에 고정한 후 교잡반응을 통한 형광반응의 결과를 나타낸 것이다. ①은 마이크로 어레이상에 각 HCV 유전자형 프로브가 고정된 위치를 도식화한 것이며,②은 HCV 1b형,③은 HCV 2a형의 형광사진 결과이다.

본 발명에서는 HCV 5'UTR의 유전자를 분석하여 유전자형을 진단하는 서스펜션어레이를 개발하였다. 이 HCV 서스펜션어레이는 기존의 칩이 가지고 있는 단점을 수정 보완하였다. 즉, 기존의 프로브에 2개의 프로브를 추가함으로써 1a와 4a의 일부 다양성을 추가적으로 확인이 가능하게 되었다.

이를 이용한 HCV 유전자형의 분석은 HCV 감염의 확인, 감염 경로, 및 IFN-α의 치료 효과를 예측하는 등에 이용할 수가 있다. 또한 유전자형의 분포를 참고하여 지역과 민족에 가장 적합한 HCV 백신 개발에도 이용할 수가 있을 것이며, HCV와 관련된 만성 간염, 간경화, 및 간암을 연구하는데도 도움을 줄 수 있을 것이다.

<110> BIOCORE. CO., LTD. <120> Microsphere composition of suspension array for analyzing Hepatitis C virus (HCV) genotype and detecting method thereof <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 1 attgccagga cgaccgggtc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 2 attgccagga tgaccgggtc c 21 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 3 cccccgcgag actgc 15 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 4 ttggataaac ccactctatg cccgg 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 5 attgccggga agactgggtc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 6 cccactctat gtccggtcat ttg 23 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 7 ctatgcccag ccatttg 17 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 8 ggaatcgctg gggtgaccgg gtcct 25 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 9 ccgcgagatc actagccga 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 10 tatgagtgtt gtacagcctc 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 11 tttcttggaa ctaacccgct caa 23 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 12 tgagtgtcga acagcctc 18 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 13 ccgggtcctt tccattggat caaa 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 14 agtggtctgc ggaaccggtg agtac 25 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genotype <400> 15 ggtctgcggg accggtgag 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for primary PCR <400> 16 ctgtgaggaa ctactgtctt 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for primary PCR <400> 17 actcgcaagc accctatcag g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for secondary PCR <400> 18 ttcacgcaga aagcgtctag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for secondary PCR <400> 19 tatcaggcag taccacaagg 20

Claims (7)

1. 서열정보 1 에서 15의 염기서열을 포함하고 있는 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기의 각 올리고뉴크레오티드 프로브는 HCV 유전자형 결정을 위한 프로브인 것을 특징으로 하는 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기의 올리고뉴크레오티드 프로브는 마이크로스피어에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기의 프로브와 타겟 유전자와의 결합을 검출하는데 사용되는 서열정보 16에서 19에 기재된 일차 또는 이차 프라이머 서열.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기의 이차 프라이머 중 서열정보 19의 앤티센스 프라이머는 바이오틴이 부착된 것을 특징으로 하는 프라이머 서열.
6. a) 혈장 및 혈청으로부터 HCV RNA를 추출하는 단계;

   b) 추출한 RNA를 이용하여 RT-1차 PCR을 실시하는 단계;

   c) 상기 1차 PCR 후 2차 비대칭 PCR을 실시하는 단계;

   d) 상기의 2차 비대칭 PCR 산물과 프로브를 결합시키는 단계; 및

   e) 상기의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 HCV 유전자형 분석방법.
7. 제 6 항에 있어서,

   상기의 e)의 확인단계는 바이오틴과 결합하는 스트렙타비딘(Streptavidin)-Cy3 또는 스트렙타비딘(Streptavidin)-피코에리트린(Phycoerythrin)을 동시에 반응시켜, 루미넥스(Luminex) 100 LabMAP를 사용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 HCV 유전자형 분석방법.