KR100785418B1 - Ｂ형 간염바이러스, ｃ형 간염 바이러스,인간면역결핍바이러스의 동시진단 분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염바이러스, C형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스의 동시진단 분석방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 각기 DNA 혹은 RNA로 이루어진 하나 이상의 서로 다른 바이러스 유전물질을 하나의 반응기 안에서 역전사 반응 및 PCR 반응을 연속적으로 실시하며 동시에 증폭하여 진단에 소요되는 시간 및 비용을 최소화 하고 PCR 증폭시 흔히 일어나는 교차오염의 문제점을 개선한 주요 병원성 바이러스의 탐지방법 및 탐지키트이다.

B형 간염바이러스, C형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스, 동시진단, 핵산검사법

Description

Ｂ형 간염바이러스, Ｃ형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스의 동시진단 분석방법 {METHOD FOR SIMULTANEOUS　DETECTION　OF　HEPATITIS B VIRUS, HEPATITIS C VIRUS AND HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS}

도 1은 본 발명의 일예에 따른 HBV, HCV, HIV 특이적 프로브를 이용하여 시료 DNA의 HBV, HCV, HIV의 감염여부를 분석하는 방법에 관한 것으로, 프로브(virus specific capture probe)에 혼성화된 바이러스 유전물질의 증폭산물(PCR product to be analyzed)은 증폭산물 5'말단에 표지된 비오틴(Biotin)을 감지하는 스트랍타비딘(Straptavidin)과 여기에 폴리머로 연결된 호스레디쉬퍼옥시데아제(Horse radish peroxydase)에 의해 혼성화 신호가 감지되는 기작을 나타낸 개략도이다.

도 2는 본 발명의 일예에 따른 HBV, HCV, 및 HCV 유전자형의 판별을 위한 분석방벙의 단계를 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 96웰 플레이트의 3개의 웰에 각각 고정된 HBVB형 간염바이러스, C형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스 특이적인 각 프로브 및 음성 대조구의 배열순서를 나타낸 그림이다.

도 4 및 도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 HBV 감염환자로부터 얻은 혈청 15종류, C형 간염 바이러스 감염환자로부터 얻은 혈청 14종류, HBV와 C형 간염 바 이러스 모두에 감염된 환자 혈청 2종, 인간면역결핍바이러스의인간면역결핍바이러스에 감염된 환자 혈청 1종 그리고 정상인 혈액 1종을 사용하여 유전물질을 증폭하고 각 바이러스 특이적인 프로브가 하나의 웰에 하나씩 고정되어 있는 플레이트를 사용하여 바이러스 감염여부를 분석한 결과를 나타낸 그림이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 HBV 감염환자로부터 얻은 혈청 15종류, C형 간염 바이러스 감염환자로부터 얻은 혈청 14종류, HBV와 C형 간염 바이러스 모두에 감염된 환자 혈청 2종, 인간면역결핍바이러스의인간면역결핍바이러스에 감염된 환자 혈청 1종 그리고 정상인 혈액 1종을 사용하여 유전물질을 증폭하고 각 바이러스 특이적인 프로브가 하나의 웰에 함께 고정하고 해당 시료가 HBV, C형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스 중 하나 혹은 그 이상에 감염되어 있을 경우 양성으로 판정할 수 있도록 고안하여 분석한 결과를 나타낸 그림이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 B형 간염바이러스, C형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스의 유전물질 동시진단 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B형 간염바이러스, C형 간염 바이러스, 인간면역결핍바이러스의 RNA 혹은 DNA 시료를 동시에 하나의 반응기 안에서 역전사 반응 및 PCR 반응을 연속적으로 실시하여 증폭하고 이를 96플레이트를 이용한 혼성화 반응을 통해 신속, 정확하게 병원성 바이러스 존재 여부를 진단하는 분석방법에 관한 것이다.

[종래기술]

혈액을 통하여 전파되는 주요 병원성 바이러스들인 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, HBV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV), 인간면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV)의 수혈을 통한 감염은 높은 민감도를 가지고 혈액 내에 존재하는 HBV의 표면항원 (HBsAg) 혹은 HCV 및 HIV에 대한 항체를 탐지하여 바이러스 감염 여부를 가려낼 수 있는 효소면역검사법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)방법에 의해 수혈혈액을 검사함으로써 그 수가 감소되어 왔다(Schreiber et al.,1996. N. Engl. J. Med. 334. 1685-1690). 그러나 이러한 검사법의 도입에도 불구하고 바이러스 감염 후 항체가 형성되기까지의 window period 존재, 면역활성이 다른 바이러스의 감염, 면역비활성 상태의 감염자등으로 인해 효소면역검사법으로는 탐지해 낼 수 없는 감염의 위험이 여전히 남아있게 된다 (Soldan et al., 2003. Vox. Sang. 84, 274-286; Widell et al., 1996. Vox. Sang. 71, 55-57). 이러한 효소면역검사법의 한계를 극복하고자 지난 십여 년간 개발되어온 방법이 DNA 혹은 RNA로 이루어진 바이러스 유전물질을 감지해내는 핵산검사법(Nucleic acid test, NAT)이다. 핵산검사법은 직접적으로 높은 염기서열 특이도를 가지고 바이러스 존재 유무를 효소면역검사보나 나은 민감도를 가지고 분석해 낼 수 있는 진단방법이다.

핵산검사법은 수혈혈액을 대상으로 혈액을 통하여 전염되는 병원성 바이러스들의 탐색에 적절히 활용될 수 있음이 예시되었지만 해당 검사법의 도입 및 활용 을 위해 사용해야 하는 비용의 문제로 인하여 대량의 검체를 대상으로 한 일상적인 검사법으로 활용하기에 어려움이 있다(Jackson et al., 2003. Transfusion 43, 721-729). 이러한 문제의 해결을 위하여 고려할 수 있는 방법으로서 핵산검사시 하나가 아닌 여러 검체를 하나의 샘플로 모아 검사하는 방법이 있을 수 있다. 그러나 이 방법은 임상시험 결과 샘플의 희석에 의한 민감도의 하락이 문제가 되거나(Stramer et al., 2000. Transfusion 40(Suppl.), S94-040A) 초원심분리를 통하여 바이러스들을 농축하였을 때 위양성의 비율이 높아지는 문제(Roth et al., 1999. Lancet. 353, 359-363)가 보고되고 있다. 두 번째 방법으로는 다중핵산검사(multiplex NAT)로서 동시에 여러 종류의 바이러스를 탐지하는 방법이다. 이러한 다중검사 방법의 도입은 시험의 효율성을 떨어뜨리지 않으면서 검사단가의 하락뿐 아니라 검사시간과 필요한 노력을 줄여주는 장점을 가진다(Elnifro et al., 2000. Clin. Microbiol. Rev. 13, 559-570).

다양한 핵산 검사법 개잘을 위하여 활용되고 있는 대표적인 핵산증폭기술 중의 하나인 중합효소반응법(Polymerase chain reaction: PCR)은 목적하는 DNA의 증폭방법으로 DNA중합효소를 사용하며 RNA의 경우 역전사효소에 의한 역전사 반응 후 DNA로 변환하여 증폭이 가능하다. 이 방법은 DNA 프라이머가 증폭하고자 하는 DNA의 양 말단에 붙어서 일어나게 되며 thermal cycler를 이용하여 증폭이 이루어진다. Thermal cycler의 매 사이클 마다 DNA의 수가 두 배로 늘어나게 되어 30-40회의 사이클을 거치면 시작 DNA로부터 약 10억개의 DNA조각으로 증폭이 가능하게 된다.

PCR 방법을 활용한 핵산검사 기술의 개발에 있어 충분한 민감도를 가진 특이도를 가진 검사방법의 개발을 위하여 종래의 기술은 다음과 같은 문제점을 가지고 있다.

첫 번째로 다중핵산검사에 PCR을 활용하는 경우 검사시료가 양성을 보일 경우 어쩐 종류의 바이러스에 대한 양성반응인지 판별이 불가능하다. 두 번째로는 PCR수행을 위한 바이러스 유전물질의 추출 및 정제 PCR의 수행과정 중에 교차오염에 의한 위양성 반응이 일어나기가 쉽다. 세 번째로는 대량의 검체를 대상으로 PCR증폭을 수행하는 경우 증폭산물을 손쉽게 분석할 수 있게 하는 분석기술이 없는 경우 예를 들어 PCR 증폭산물을 아가로스겔 상에서 전기영동하여 결과 분석을 수행하는 경우 결과 분석의 자동화가 어렵고 분석 결과의 신뢰성을 확보하기도 어렵다. 네 번째로는 PCR증폭의 경우 반응조건에 따라 비특이적인 증폭산물이 출현하는 경우가 있다. 이런 경우 위양성을 줄이기 위한 염기서열 특이적인 분석방법이 필요한데 종래의 핵산검사법은 이러한 요구를 만족하지 못한다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 HBV, HCV, HIV의 유전물질을 혈청 혹은 혈장으로부터 분리하여 쉽고 간단, 정확하게 감염여부를 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 HBV, HCV, HIV의 감염여부를 진단함에 있어서 RNA 혹은 DNA 혹은 RNA/DNA 혼합 시료의 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응기 안에서 연속적으로 실시하여 시간을 단축시키고 교차오염(cross-contamination)의 문제점 을 최소화할 수 있는 방법 및 탐지 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 HBV, HCV, HIV의 유전물질을 탐지함에 있어 PCR 증폭산물을 염기서열 특이적으로 혼성화 반응을 이용하여 탐지하여 종래의 핵산검사법에 비하여 탐지방법의 특이도 및 분석결과의 신뢰도를 개선하는 방법 및 HBV, HCV, HIV의 탐지키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 (a) B형 간염바이러스(HBV), C형 간염바이러스(HCV), 및 인간면역결핍바이러스(HIV)에 특이적인 염기서열을 포함하는 각 바이러스에 특이적프로브를 플레이트 웰에 고정하는 단계;

(b) 혈액 또는 혈장으로부터 시료 핵산을 분리하고, 상기 시료핵산을 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 및 HBV, HCV 및 HIV 특이적 프라이머쌍을 혼합하여 RT-PCR을 수행하여 증폭산물을 얻는 단계로서, 상기 프라이머쌍은 검출가능한 수단으로 5'말단이 표지되어 있으며, SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO:5에 기재된 염기서열로 이루어지는 HBV 특이적 PCR 프라이머쌍, SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열로 이루어지는 HCV 특이적 PCR 프라이머쌍, 및 SEQ ID NO: 8 내지 SEQ ID NO:9에 기재된 염기서열로 이루어지는 HIV 특이적 PCR 프라이머쌍이며;

(c) 상기 PCR 산물을 단일 가닥 형태로 변성시킨 후, 단계(a)의 프로브가 고정된 웰에 가하여 혼성화 반응을 유도하는 단계; 및

(d) 상기 표지된 검출수단을 이용하여 혼성화 반응 여부를 확인하여 HBV, HCV, 및 HIV 바이러tm의 감염여부를 동시에 탐지하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 SEQ ID NO:1 에 기재된 염기서열을 포함하는 HIV 바이러스 특이적 프로브, SEQ ID NO:2 에 기재된 염기서열을 포함하는 HBV 바이러스 특이적 프로브, 및 SEQ ID NO:3 에 기재된 염기서열을 포함하는 HCV 바이러스 특이적 프로브가 고정된 플레이트 웰;

혈액 또는 혈장으로부터 분리된 시료 핵산 및 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 및 HBV, HCV 및 HIV 특이적 프라이머쌍을 포함하는 RT-PCR용 반응 혼합물,

상기 프라이머쌍은 검출수단으로 탐지가능한 표지물질이 5'말단에 연결되어 있으며, SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO:5에 기재된 염기서열로 이루어지는 HBV 특이적 PCR 프라이머쌍, SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열로 이루어지는 HCV 특이적 PCR 프라이머쌍, 및 SEQ ID NO: 8 내지 SEQ ID NO:9에 기재된 염기서열로 이루어지는 HIV 특이적 PCR 프라이머쌍; 및

상기 프라이머의 5'말단에 연결된 표지수단을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는

상기 바이러스 특이적 프로브와 시료에서 증폭된 핵산산물과의 특이적 혼성화 반응 여부를 확인하여 HBV, HCV, 및 HIV 바이러tm의 감염여부를 동시에 탐지하는 키트에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 HBV, HCV, HIV의 진단방법에 관한 것으로, 구체적으로는, (a) 하기 표 1의 HBV, HCV, HIV에 염기서열 특지적으로 혼성교잡(hybridization) 가능한 1 내지 3의 올리고머 각각을 독립적으로 혹은 혼합하여 분리된 16개의 플레이트 웰에 각각 고정하는 단계; (b) HBV, HCV, HIV에 감염된 것으로 추정되는 혈장 혹은 혈청으로부터 RNA 혹은 DNA 시료를 분리하고, 상기 시료에 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 서열번호 4번부터 9번으로 기재된 염기서열들을 포함하는 프라이머 혼합물을 가한 후 PCR 반응을 실시하며, 상기 프라이머는 5'말단이 검출가능한 수단으로 표지된 것인 단계; (c) 상기 PCR 산물을 단일 가닥 형태로 변성시킨 후 상기 (a)의 각각의 올리고머혹은 올리고머 혼합물이 고정된 3개 또는 한 개의 플레이트 웰에 각각 가하여 혼성화 반응을 유도하는 단계; (d) 상기 3개 또는 한 개의 플레이트 웰 각각의 혼성화 반응 여부를 검출하는 단계; 및 (e) 혼성화된 플레이트 웰에 고정된 올리고머를 확인하여 (a)의 올리고머 혼합물을 사용한 경우 HBV, HCV, HIV중 하나가 감염되어 있음을 결정하거나 혹은 (a)의 올리고머 각각이 고정된 3개의 플레이트 웰을 사용한 경우 표 1에 따라 검체가 HBV, HCV, HIV 중 하나 혹은 그 이상의 바이러스에 감염되었는지 결정하는 것을 포함한다.

(표 1)

탐지 바이러스	염기서열	서열번호
HIV	TTTTTTTTTTGAGACCATCAATGAGGAAGC	1
HBV	TTTTTTTTTTCTTTATAAGGATCAATGTCC	2
HCV	TTTTTTTTTTCATAGTGGTCTGCGGAACCG	3

상기 표 1의 올리고머는 각각 프로브로 이용할 수 있으며, 특히 기질, 예컨대 유리, 금속, 폴리카보네이트, 실리콘 웨이퍼, 막(membrane), 폴리스틸렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름 등에 고정된 형태로 이용할 수 있다. 프로브의 고정화 방법은 통상의 공지된 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있으며, 시판되는 올리고머 고정용 기질 및 고정화 용액을 이용할 수 있다.

상기 (b) 단계는, HBV, HCV, HIV의 RNA 혹은 DNA가 함유된 시료를 서열번호 4부터 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 혼합물로 PCR을 실시하는 단계이다. 상기 PCR은 RNA로부터 cDNA를 합성하는 역전사반응과 cDNA로부터 목적 핵산 서열 부위를 증폭시키는 PCR을 모두 포함한다. 상기 서열번호 4 및 5를 포함하는 프라이머는 HBV 게놈의 pre-C와 C region을 사이(염기서열 1864-1967)를 증폭하며, 상기 서열번호 6 및 7을 포함하는 프라이머는 HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(internal ribosomal entry site)를 포함하는 5' 비번역 영역(5'-untranslated site)중 일부(56-299)를 증폭하며, 상기 서열번호 8및 9를 포함하는 프라이머는 인간면역결핍 바이러스의 gag 유전자의 일부분(905-1046)을 증폭하는 것으로서 특히 이들은 5'말단 또는 3' 말단이 검출가능한 수단으로 표지된 것이다. 바람직하기로는 5' 말단이 표지된 것이다. 상기 검출가능한 수단은 형광물질, 방사능 동위원소, 화학발광체 또는 효소일 수 있으며, 그 예로는 Cy3, Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), d-NTP (including d-UTP), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 양고추냉이 과산화효소, 바이오틴 등이 있다.

(표 2)

프라이머 이름	염기서열	서열번호
HBV-Forward	GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG	4
HBV-Reverse	TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT	5
HCV-Forward	CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT	6
HCV-Reverse	GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT	7
HIV-Forward	TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT	8
HIV-Reverse	AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT	9

상기 PCR 반응은 역전사 반응 및 중합반응이 하나의 반응기 안에서 진행되는 것으로, 통상적으로 역전사 반응 후 중합반응을 각각 진행하는 방법에 비하여 간단하고 교차오염 위험이 적으며 시간이 단축되는 효과가 있다. 본 발명의 PCR 반응은 역전사 반응 및 중합반응의 실시를 위해, PCR 반응을 위한 PCR 조성물은, 역전사 효소, 중합효소, 프라이머 세트, dNTP, PCR 완충액 및 잔량의 물로 구성된다. 상기 구성성분은 모두 시판되거나 공지된 물질을 사용하며, 이들의 조성은 주형이 되는 시료의 농도에 따라 적절히 조절하여 사용한다. 또한 PCR 반응은 50℃, 30분 -> 95 ℃, 15분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 35회 반복 -> 72 ℃, 10분으로 이루어진다.

상기 (c) 단계는 PCR 산물을 단일가닥으로 변성시키고, 이를 (a)의 고정화된 올리고머에 혼성화 반응을 유도하는 것으로, 변성은 소듐 하이드록사이드 및 에틸렌디아민테트라아세틱산을 포함하는 변성용액으로 실시될 수 있으며, 혼성화 반응은 통상적인 혼성화 완충액으로 실시될 수 있다. 구체적으로는 혼성화 완충액은 테트라메틸암모늄 클로라이드, 하이드록시 메틸아미노메탄, 에틸렌디아민테트라아세트산, 덴하드트'스 용액, 소디움도데실설페이트 및 연어 정자 DNA를 포함한다. 혼성화 반응은 40 내지 60 ℃, 바람직하기로는 50 내지 57 ℃에서 실시된다.

상기 역전사 반응 및 PCR의 연속 반응을 위하여 Qiagen사에서 혼합물로 제 공하는 역전사 및 중합반용 효소 혼합물을 사용한다. 효소 혼합물에는 대장균에서 발현시켜 정제한 Molony murine leukemia virus(MMLV) 혹은 avian myeloblastosis virus(AMV)에서 유래한 역전사 효소가 아닌 다른 두 종류의 역전사 효소와 Thermus aquaticus의 94KDa DNA중합효소에서 유래한 변화된 DNA 중합효소가 들어있다. 역전사 반응과 PCR이 동시에 일어나지 않고 연쇄적으로 일어나는 이유는 PCR반응에 사용되는 DNA중합효소가 95℃에서 15분 이상 열에 의한 활성화 과정을 거쳐야 비로소 중합효소로서 작동하기 때문이다. 따라서 먼저 50℃에서 역전사 반응을 수행되도록 세팅 한 후 이후 15분간 95℃에서 DNA중합효소를 활성화시켜 중합효소반응이 진행되도록 Thermal cycler를 세팅하면 역전사반응과 PCR이 연쇄적으로 일어나도록 할 수 있게 된다.

상기 (d) 단계에서는, 상기 (c)에서 혼성화 반응 유도한 고정화된 올리고머를 세척하여 비혼성화된 프라이머를 제거한 후, 올리고머에 혼성화된 프라이머의 검출가능한 수단, 즉 표지물을 확인하여, 혼성화된 올리고머를 분석하는 단계이다. 상기 검출가능한 수단의 종류에 따라 적절한 검출 방법을 수행할 수 있음은, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시가능한 일이다.

상기 (e) 단계는, PCR 반응 산물과 혼성화된 올리고머의 존재 유무에 따라 HBV, HCV, HIV 중 적어도 하나 이상에 감염되어 있음을 결정하거나 혹은 HBV, HCV, HIV 중 어떤 종류의 바이러스에 단일 혹은 교차감염 되었는지 결정하는 것으로서 감염된 바이러스의 종류를 판별하는 경우에는 상기 표 1을 통하여 결정이 가능하다.

본 발명에 따라, HBV, HCV, HIV의 감염여부를 간단하고 짧은 시간 내에 수행함으로써, 기존의 효소면역 검사법의 한계를 극복하면서도 기존의 효소면역 검사법의 장점을 활용하여 혈액의 대량 검사가 가능한 핵산검사법으로 활용이 가능하다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: HBV, HCV, 및 HIV 탐지용 키트 제조

1-1: HBV, HCV, HIV의 특이적인 프로브의 합성

HCV 유전자형 특이적인 프로브로 하기 표 1을 각각 합성하였다.

(표 1)

탐지 바이러스	염기서열	서열번호
HIV	TTTTTTTTTTGAGACCATCAATGAGGAAGC	1
HBV	TTTTTTTTTTCTTTATAAGGATCAATGTCC	2
HCV	TTTTTTTTTTCATAGTGGTCTGCGGAACCG	3

표 1의 프로브는 고정을 위하여 5'말단에는 아민기(amine)를 표지하였다. 프로브의 합성 및 검증에 대해서는대전광역시 대덕구 문평동 49-3 대전제3공단내에 위치하는 (주)바이오니아에 의뢰하여 수행하였으며, 즉 프로브 합성은 화학합성법으로 하였고, 합성된 프로브는 폴리아크릴아미드젤을 이용한 전기영동법에 의해 분리 정제한 후, 질량분석분광계로 분자량을 검증하였다.

1-2: 각각 별도의 웰에 프로브 고정

5'말단에 아민(amine)기를 가진 프로브를 Nunc사의 Nucleolink 96 웰 플레이트의 각 세 개의 웰에 각각고정하고, 음성대조군으로는 아무 프로브도 고정되지 않은 빈 웰(empty well)을 사용하였다.

10 mM 1-메틸이미다졸(1-Methylimidazole)용액에 최종농도 10 mM로 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)를 용해한 다음, 100 picomole/㎕ 의 농도로 물에 녹인 표 1의 각각의 프로브를 1/1000의 비율로 첨가하여 고정 용액을 제조하였다. 혼합물의 경우 각각의 프로브를 1/1000의 비율로 첨가하였다. 상기 고정 용액 100 ㎕을 96 플레이트의 각 웰에 분주하고, 50℃에서 24시간동안 배양하여 프로브를 공유결합으로 플레이트 표면에 고정하였다. 고정반응 후 플레이트는 증류수로 세척한 후 200㎕ 의 1% 보바인 시럼 알부민 (Bovine serum albumin)을 포함하는 완충액 (100 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(TrisCl, Hydroxymethylamonomethane. pH7.5), 150 mM 소디움클로라이드 (Sodium Chloride) 및 0.1% 트윈 20(Tween20))을 분주하여 실온에서 4시간 배양하여 blocking 을 실시하고 이를 제거한 후 건조한 후 실리카겔 을 포함하는 포장용기에 보관하였다.

1-3: 하나의 웰에 함께 프로브고정

하나의 웰에 항목 1-1에서 제조한 세가지 프로브를 모두 함께 고정한 것을 제외하고는, 실질적으로 상기 항목 1-2와 동일하게 제조하였다.

실시예 2: HBV, HCV 및 HIV 시료의 증폭 및 분석

2-1. 혈청으로부터 바이러스 핵산의 분리정제, cDNA합성, 중합효소 증폭

2-1-1. 바이러스 DNA 혹은 RNA의 분리정제

HBV, HCV, HIV의 DNA 혹은 RNA 게놈을 시료혈청으로부터 분리정제하기 위 하여 Qiagen사의 Ultrasense virus kit을 이용하였고, 1 ml의 혈청으로부터 DNA 혹은 RNA를 분리하였다.

2-1-2. cDNA합성 및 중합효소 증폭반응

HBV 게놈의 pre-C와 C region을 사이(염기서열 1864-1967), HCV의 내부 라이보좀 도입 자리(internal ribosomal entry site)를 포함하는 5' 비번역 영역(5'-untranslated site)중 일부(56-299), 인간면역결핍 바이러스의 gag 유전자의 일부분(905-1046)을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 합성하였다.

(표 2)

프라이머 이름	염기서열	서열번호
HBV-Forward	GTTCAAGCCTCCAAGCTGTG	4
HBV-Reverse	TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT	5
HCV-Forward	CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT	6
HCV-Reverse	GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT	7
HIV-Forward	TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT	8
HIV-Reverse	AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT	9

상기 프라이머는 5'말단에 비오틴(biotin)이 표지되어 있다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 RNA 게놈의 경우 역전사 반응을 실시하여 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 DNA 게놈과 함께 역전사 반응에 바로 이어지는 PCR을 실시하였다.

cDNA 합성과 PCR은 Qiagen사의 'One-step RT-PCR kit'를 사용하여, 하나의 반응용기 안에서 cDNA 합성과 PCR을 퍼킨엘머사의 GeneAmp PCR system 9700을 사용하여 동시에 실시하였다.

- 역전사반응 및 PCR 반응의 조성물 -

: 유전물질 추출물(바이러스의 DNA 혹은 RNA함유) 30㎕, 5X 역전사 및 PCR 반응 완충액 10 ㎕, 2.5 mM dNTP 2㎕, 프라이머 혼합물 (50 pmole/㎕ 농도의 HBV, HCV, HIV 프라이머를 동량으로 혼합) 3.6㎕, 역전사효소 및 중합효소 혼합물 2 ㎕, 멸균증류수 2.4㎕

- 역전사 및 PCR 조건 -

: 50℃, 30분 -> 95 ℃, 15분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 35회 반복) -> 72 ℃, 10분 -> 4℃ 보관.

2-2. 증폭산물을 이용한 HBV, HCV, HIV 감염여부결정

2-2-1: 증폭산물의 변성

역전사 반응 및 중합효소반응에 의해 증폭된 산물 3㎕에 변성용액(Denaturation solution: 400 mM 수산화나트륨(Sodium Hydroxide) 및 10 mM 에틸렌디아민테트라아세틱에시드(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic Acid)) 10 ㎕를 더하여 잘 섞은 후 상온에서 10분간 방치하여 두 가닥 DNA로 이루어진 증폭산물이 단일가닥으로 변성되도록 하였다.

2-2-2. 혼성화 반응

변성된 증폭산물에 500 ㎕의 하이브리다이제이션 완충액(Hybridization Buffer: 3 M 테트라메틸암모늄 클로라이드(Tetramethylammonium Chloride), 50 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(Tris-Cl, Hydroxymethylamonomethane, pH 6.8), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세틱에시드(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic Acid), 5X 덴하드트 용액 (Denhardt's solution), 0.6 % 소디움도데실설페이트(SDS, Sodium dodecyl sulfate), 100 ㎍/㎖ 분쇄 연어 정자 DNA(sheared salmon sperm DNA))를 더하여 잘 섞은 후, 100 ㎕씩 HBV, HCV, HIV 특이 프로브가 고정된 96 웰 플레이트에 분주하였다. 분주 후 플레이트를 55 ℃에서 두 시간 동안 진탕배양하여 플레이트 표면에 고정된 프로브와 증폭산물 간에 혼성화 반응이 일어나도록 하였다.

2-2-3. 세척

혼성화 반응 후 완충액을 제거하고, 각 웰에 스트린전트 워시 완충액(Stringent Wash Buffer: 3 M 테트라메틸암모늄 클로라이드(Tetramethylammonium Chloride), 50 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(Tris-Cl, Hydroxymethylamonomethane. pH 8.0) 및 0.2% 소디움도데실설페이트(SDS, Sodium dodecyl sulfate))를 120 ㎕ 넣어 30초 후에 바로 제거하고, 동량의 스트린전트 워시 완충액을 넣고 30분간 55℃에서 진탕배양 후 완충액을 제거하였다. 여기에 다시 세척 완충액(100 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(TrisCl, Hydroxymethylamonomethane. pH7.5), 150 mM 소디움클로라이드 (Sodium Chloride) 및 0.1% 트윈 20(Tween20))를 200 ㎕넣어 30초후 제거하기를 3회 반복하여 남아있는 부산물이 없도록 하였다.

2-2-4. 비오틴 존재여부 감지

세척과정이 끝난 96웰 플레이트에 프로브와 결합하여 남아 있는 비오틴으로 표지된 증폭산물의 존재유무를 탐지하여 유전자형의 판별하고자 하였다. 비오틴에 결합하는 스트랍타비딘(STR, Straptavidin)에 호스레디쉬 퍼옥시데아제(HRP, Horse Radish Peroxydase) 폴리머(polymer)가 공유결합된 신호증폭 분자(STR-HRP)를 이용하였다.

먼저 어세이 완충액(100 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(TrisCl, Hydroxymethylamonomethane. pH7.5), 150 mM 소디움클로라이드(Sodium Chloride), 0.1% 트윈 20(Tween20), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, Bovine serum albumin))에 1/4000으로 희석된 STR-HRP 100 ㎕를 각 웰에 분주하고, 이를 30분간 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 진탕배양 후 플레이트는 세척 완충액 200 ㎕ 이용하여 5회 반복 세척하였다. 세척 후 HRP의 신호를 감지하기 위하여 HRP의 기질 중 하나인 TMB(tetramethylbenzidine) 기질을 100 ㎕ 분주하였다. 발색 반응은 상온에서 10분간 일어나도록 하였고, 이후 2 M 황산수용액 50 ㎕를 분주하여 발색 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 각 웰에서 일어난 발색 반응의 정도는 흡광도 측정기기(Spectrophotometer)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

도 3은 HBV, HCV, HIV의 바이러스 유전자 특이적인 프로브가 고정된 96웰 플레이트와, 이에 고정된 프로브의 반응 구획을 도시한 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, HBV, HCV, HIV에 각각 특이적인 서로 다른 프로브가 3개의 웰에 고정되어 있으며 증폭된 하나의 시료 DNA는 서로 다른 HBV, HCV, HIV 특이적인 프로브가 고정된 세 개의 웰과 아무것도 고정되지 않은 nagative control 웰에 반응시킨다.

실험예 : HBV, HCV, HIV 감염 혈청의 바이러스 탐지 분석

HBV 감염환자로부터 얻은 혈청 15종류, HCV 감염환자로부터 얻은 혈청 14종류, HBV와 HCV에 감염된 환자 혈청 2종, HIV의HIV에 감염된 환자 혈청 1종 그리고 정상인 혈청 1종을 사용하여 각 바이러스 특이적인 탐침이 하나의 웰에 하나씩 고정되어 있는 플레이트를 사용하여 바이러스 특이적인 탐지가 가능하지 실험하여 그 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다. 또한 상기 실험에서 사용된 각 바이러스 특이적인 프로브를 하나의 웰에 모두 섞어서 고정하여 HBV, HCV, HIV의 구분은 어렵지만 하나의 웰만 사용해 세 종류의 바이러스중 하나 혹은 하나이상의 감염을 탐지해 낼 수 있는지를 시험하여 보았고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에서 나타난 결과를 보면 개발기술을 적용하여 정확하게 감염된 바이러스를 탐지하고 있음을 알 수 있다.

도 6에서 나타난 결과는 하나의 웰만 사용하여 탐지하고자 하는 HBV, HCV, HIV 중 어느 하나 혹은 그 이상이 감염되어 있음을 탐지하여 적절한 처리가 가능하도록 한다는 점에서 저 비용과 단위시간당 높은 검체처리능력을 가진 혈액 검사 시스템을 구축할 수 있도록 해주는 장점을 가진다.

이상과 같이 본 발명은 이전의 PCR에 기초한 핵산검사법이 증폭된 PCR산물의 분석에 있어 단순히 증폭여부를 가지고 양성 혹은 음성으로 구분하여 판정하던 것에 비하여 PCR증폭 산물을 2차로 해당 바이러스에 매우 특이적인 프로브를 이용하여 혼성화하여 검증하고 판정한다는 점에서 매우 정확하고 특이도가 높은 분석방법을 제공한다는 장점을 가진다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 HBV, HCV, HIV의 감염 진단을 위한 분석방법은 쉽고 간단, 정확하게 HBV, HCV, HIV의 감염여부를 판정할 수 있으며, HCV의 RNA 시료의 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응기 안에서 연속적으로 실시 하여 시간을 단축시키고, 교차오염(cross-contamination)의 문제점을 최소화할 수 있고 종래의 PCR법에 기초한 핵산검사법에 비하여 증폭산물을 2차적으로 혼성화 반응을 통한 염기서열 특이적인 검증이 가능한 분석 방법이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. (a) SEQ ID NO:1 에 기재된 염기서열로 이루어지는 HIV 바이러스 특이적 프로브, SEQ ID NO:2 에 기재된 염기서열로 이루어지는 HBV 바이러스 특이적 프로브, 및 SEQ ID NO:3 에 기재된 염기서열로 이루어지는 HCV 바이러스 특이적 프로브를 플레이트 웰에 고정하는 단계;

   (b) 혈액 또는 혈장으로부터 시료 핵산을 분리하고, 상기 시료핵산을 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 및 HBV, HCV 및 HIV 특이적 프라이머쌍을 혼합하여 RT-PCR을 수행하여 증폭산물을 얻는 단계로서, 상기 프라이머쌍은 검출가능한 수단으로 5'말단이 표지되어 있으며, SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO:5에 기재된 염기서열로 이루어지는 HBV 특이적 PCR 프라이머쌍, SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열로 이루어지는 HCV 특이적 PCR 프라이머쌍, 및 SEQ ID NO: 8 내지 SEQ ID NO:9에 기재된 염기서열로 이루어지는 HIV 특이적 PCR 프라이머쌍이며;

   (c) 상기 PCR 산물을 단일 가닥 형태로 변성시킨 후, 단계(a)의 프로브가 고정된 웰에 가하여 혼성화 반응을 유도하는 단계; 및

   (d) 상기 표지된 검출수단을 이용하여 혼성화 반응 여부를 확인하여 HBV, HCV, 및 HIV 바이러스의 감염여부를 동시에 탐지하는 방법.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계(a)에서, 상기 바이러스 특이적 프로브를 플레이트 웰에 각각 별도로 고정시키거나, 하나의 웰에 모두 함께 고정시키는 것인 HBV, HCV, 및 HIV 바이러스의 감염여부를 동시에 탐지하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지수단은 형광물질 표지, 방사성 동위원소 표지, 화학발광체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 HBV, HCV, 및 HIV 바이러스의 감염여부를 동시에 탐지하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 역적사 및 PCR 반응(RT-PCR) 조건은 50℃, 30분 -> 95 ℃, 15분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 20 내지 40회 반복 실시 -> 72 ℃, 1 내지 20분으로 이루어지는 방법.
6. SEQ ID NO:1 에 기재된 염기서열로 이루어지는 HIV 바이러스 특이적 프로브, SEQ ID NO:2 에 기재된 염기서열로 이루어지는 HBV 바이러스 특이적 프로브, 및 SEQ ID NO:3 에 기재된 염기서열로 이루어지는 HCV 바이러스 특이적 프로브가 고정된 플레이트 웰;

   혈액 또는 혈장으로부터 분리된 시료 핵산 및 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 및 HBV, HCV 및 HIV 특이적 프라이머쌍을 포함하는 RT-PCR용 반응 혼합물;

   상기 프라이머쌍은 검출수단으로 탐지가능한 표지물질이 5'말단에 연결되어 있으며, SEQ ID NO: 4 내지 SEQ ID NO:5에 기재된 염기서열로 이루어지는 HBV 특이적 PCR 프라이머쌍, SEQ ID NO: 6 내지 SEQ ID NO:7에 기재된 염기서열로 이루어지는 HCV 특이적 PCR 프라이머쌍, 및 SEQ ID NO: 8 내지 SEQ ID NO:9에 기재된 염기서열로 이루어지는 HIV 특이적 PCR 프라이머쌍; 및

   상기 프라이머의 5'말단에 연결된 표지물질을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는

   상기 바이러스 특이적 프로브와 시료에서 증폭된 핵산산물과의 특이적 혼성화 반응 여부를 확인하여 HBV, HCV, 및 HIV 바이러스의 감염여부를 동시에 탐지하는 키트.

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