KR100658606B1

KR100658606B1 - Ｃ형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법

Info

Publication number: KR100658606B1
Application number: KR1020050033624A
Authority: KR
Inventors: 장승기; 노정민
Original assignee: (주)팬바이오넷
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2006-12-15
Also published as: KR20060111179A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 C형 간염 바이러스의 RNA 시료의 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응기안에서 연속적으로 실시하여 시간을 단축시키고 교차오염의 문제점을 최소화할 수 있는 C형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법을 제공한다.

C형 간염 바이러스, 유전자형

Description

Ｃ형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법{METHOD FOR DETERMINATION OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPE}

도 1은 본원발명의 C형 간염 바이러스 유전자형 특이적 프로브를 이용하여 시료 DNA의 유전자형을 분석하는 방법에 관한 것으로, 프로브(Genotype specific capture probe)에 혼성화된 바이러스 유전물질의 증폭산물(PCR product to be analyzed)은 증폭산물 5’말단에 표지된 비오틴(Biotin)을 감지하는 스트랍타비딘(Straptavidin)과 여기에 폴리머로 연결된 호스레디쉬퍼옥시데아제(Horse radish peroxydase)에 의해 혼성화 신호가 감지되는 기작을 나타낸 개략도이다.

도 2는 본 발명에서 C형 간염 바이러스 유전자형의 판별을 위한 실험 단계를 나타낸 도면이다.

도 3은 96웰 플레이트의 16개의 웰에 고정된 C형 간염 바이러스 유전자형 특이적인 각 프로브의 배열순서를 나타낸 그림이다.

도 4는 시료 DNA를 각각의 C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프라이머 세트로 증폭한 후, C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프로브가 고정된 플레이트에 반응시킨 결과와, 상기 결과로부터 분석된 시료 DNA의 유전자형을 나타낸 것이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 C형 간염 바이러스의 RNA 시료의 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응기안에서 연속적으로 실시하는 신속, 정확한 C형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법에 관한 것이다.

[종래기술]

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)는 비A형 및 비B형 간염을 일으키는 속에 속하는 바이러스로서, HCV 게놈은 단일가닥 RNA로 이루어져 있으며 약 3,010개의 아미노산으로 이루어진 단일복합단백질을 발현한다(Choo et al., 1989, Science, vol.244, 359-362). HCV 게놈의 양 말단에는 보존이 잘되어 존재하는 5‘ 비번역영역(5‘ non-trnaslated region)과 3’ 비번역영역(3’ non-translated region)이 존재하고 있으며, 이들 영역은 비교적 다양한 유전적 변이를 가지는 HCV 게놈 중 염기 서열이 잘 보존되어 바이러스 감염여부의 진단 혹은 유전자형의 판별에 있어 중요하게 사용되고 있다.

HCV에 감염된 환자의 70-80%이상이 만성간염으로 발전하고 많은 경우 간경화나 간암으로 이어져 치명적일 수 있으며, 전세계 인구의 3% 이상이 HCV에 감염되어 있는 것으로 알려져 있다(Miller and Purcell, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2057-2061). 우리 나라에서도 약 1-2%의 사람이 감염되어 있을 것으로 추정되며, 50-60세를 전후하여 발병하는 간암의 주요인자의 하나로 알려져 있다.

HCV 감염환자를 치료하는 종래에 널리 알려진 방법은, 알파-인터페론(alpha-interferon)을 사용하는 것이다. 그러나, 알파-인터페론에 반응하는 환자의 비율은 약 50%정도이며, 반응하는 환자의 50%는 C형 간염 바이러스가 재발하는 것으로 보고 되고 있다(Hino et al., 1994; Tsubota et al., 1994). 또한 최근에는 인터페론과 리바비린을 같이 투여하는 병용요법이 개발되어 있으며, 인터페론의 생체내 지속 시간을 증가시키기 위한 페길레이티드 인터페론(Pegylated Interferon)도 상용화되어 있다.

인터페론 만을 투여한 단일요법 또는 인터페론과 리바비린 병용요법에 의한 C형 간염환자의 반응성은, 환자가 가지는 HCV의 유전자형에 따라 많은 차이를 보인다는 것이 임상적으로 관찰되었다. 최근에는 이러한 관찰에 기초하여 C형 간염 환자의 치료를 위한 인터페론 또는 인터페론 병용요법의 적용시 반드시 해당 환자가 감염되어 있는 C형 간염 바이러스 유전자형을 결정하고 이에 따라 인터페론의 투여 기간 등을 조절하도록 권장하고 있다.

C형 간염 바이러스는 유전적 다양성에 따라 계통적으로 분류가 가능하고, 염기서열이 70%이상의 유사성을 갖는 경우 한가지 군(genotype)에 속한 것으로 간주한다. C형 간염 바이러스의 유전자형의 분류는 Enomoto등이 NS5B의 340bp 염기서열 분석을 통하여 4개의그룹(PT, K1, K2a, K2b)으로 나눈 것이 최초이며, 이후 여러 가지 분류방법이 제안되면서 이 염기서열 분석에 따른 계통발생학적 지도를 작성하고 유전자형(Genotype), 아형(Subtype), 분리형(isolate)으로 분류하였다(Enomoto et al.. 1990; Simmonds et al.. 1994; Stuyver etal.. 1994). 최근에 이르러는 여러 그룹의 분류를 통합 누적하고 서로간의 연관성을 조사하여 6개의 주요 유전자형과 28개의 아형으로 구분하고 있다.

상용화된 C형 간염 바이러스의 유전자형 결정 기술로는, 나이트로셀룰로스 막대(Nitrocellulose membrane strip)위에 HCV의 5‘NTR 염기서열 중 각 유전자형 별로 특이적으로 나타나는 프로브를 합성하여 고정하여 두고 여기에 환자혈청에서 분리한 바이러스 RNA를 역전사(reverse transcription)한 다음 바이오틴으로 표지된 프라이머를 사용하여 두 번에 걸쳐 중합효소 반응(polymerase chain reaction)으로 증폭한 산물을 하이브리다이제이션(hybridization)시키고 여기서 C형 간염 바이러스 각 유전자형에 특이적으로 증폭산물과 프로브가 결합하면 이 결합을 바이오틴에 결합하는 알칼라인 포스포타아제가 결합된 스트랍타비딘(Alkaline phosphatase conjugated straptavidin)을 사용하여 탐지하여 유전자형을 결정하는 방법과, HCV 5' NTR을 직접 염기서열을 분석하여 그 서열정보로부터 유전자형을 분석하는 방법이 있다. 이상의 방법들은 각각 장, 단점을 가지는데 나이트로셀룰로스 막대(Nitrocellulose membrane strip)를 이용한 방법은 지금까지 사용하는 방법 중 가장 민감하면서, 비교적 간단하게 유전자형을 결정할 수 있어 일반적으로 사용된다. 그러나 막대를 사용함에 따라 자동화가 어렵고 유전자형의 판정시 정량적 데이터에 근거한 판단이 아닌 실험자가 직접 눈으로 20종이 넘는 각 프로브에 반응하는 반응 패턴을 보고 이를 종합하여 판정하는 데 따른 부정확성이 문제가 될 수 있다. 상기 염기서열 분석에 의한 방법은 바이러스 염기서열을 직접 분석함으로 가장 정확한 유전자형 결정법이라 할 수 있으나 환자의 혈청 내에 HCV의 유전자형 중 두 가지 이상이 존재할 경우 이를 효과적으로 탐지하여 낼 수 없다는 단점을 가진다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자형을 쉽고 간단, 정확하게 판정할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자형을 판별함에 있어서, C형 간염 바이러스의 RNA 시료의 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응기안에서 연속적으로 실시하여 시간을 단축시키고 교차오염(cross-contamination)의 문제점을 최소화할 수 있는 방법에 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법에 관한 것으로, 구체적으로는, (a) 하기 표 1의 C형 간염 바이러스 유전자형을 나타내는 서열번호 1 내지 16의 올리고머 각각을 독립적으로 분리된 16개의 플레이트 웰에 각각 고정하는 단계; (b) C형 간염 바이러스에 감염된 것으로 추정되는 혈청으로부터 RNA 시료를 분리하고, 상기 RNA 시료에 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 서열번호 17로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 18로 기재된 염기서열을 포함하는 프라이머를 가한 후 PCR 반응을 실시하며, 상기 프라이머는 5‘말단이 검출가능한 수단으로 표지된 것인 단계; (c) 상기 PCR 산물을 단일 가닥 형태로 변성시킨 후 상기 (a)의 각각의 올리고머가 고정된 16개의 플레이트 웰에 각각 가하여 혼성화 반응을 유도하는 단계; (d) 상기 16개의 플레이트 웰 각각의 혼성화 반응 여부를 검출하는 단계; 및 (e) 혼성화된 플레이트 웰에 고정된 올리고머를 확인하여 표 1에 따라 핵산 시료의 C형 간염 바이러스 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

유전자형	염기서열	서열번호
All types	TTTTTTTTTTTTGGGCGYGCCCCCGC	1
1/6.	TTTTTTTTTTTCTCCAGGCATTGAGC	2
1a/2	TTTTTTTTTTCCCCGCAAGACTGCTA	3
1b	TTTTTTTTTTGCTCAGTGCCTGGAGA	4
1b/3c/5	TTTTTTTTTTCCGCGAGACYGCTAGC	5
2	TTTTTTTTTTTAGCGTTGGGTTGCGA	6
4f4g/6/2a/2b/2c	TTTTTTTTTTGAGTGTCGTACAGCCT	7
2a/b	TTTTTTTTTTTTRCCGGRAAGACTGG	8
3	TTTTTTTTTTAATCGCTGGGGTGACC	9
3	TTTTTTTTTTTTTCTGGGTATTGAGC	10
3a/b	TTTTTTTTTTTCTTGGARCAACCCGC	11
4	TTTTTTTTTTTTCTTGGAACTAACCC	12
4a/b/c/d/e/g/h	TTTTTTTTTTGAGTGTTGTRCAGCCT	13
5A/5	TTTTTTTTTTGAGTGTCGAACAGCCT	14
5A	TTTTTTTTTTTCTCCGGGCATTGAGC	15
6a/6	TTTTTTTTTTGGGTCCTTTCCATTGG	16

상기 표 1에서, Y는 C 또는 T 이고, R은 A 또는 G 이며, 바람직하기로는 Y는 C :T 가 내지 1:1 비율로 포함되며, R은 A:G가 1:1 비율로 포함된다.

상기 표 1의 올리고머는 각각 프로브로 이용할 수 있으며, 특히 기질, 예컨대 유리, 금속, 폴리카보네이트, 실리콘 웨이퍼, 막(membrane), 폴리스틸렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름 등에 고정된 형태로 이용할 수 있다. 프로브의 고정화 방법은 통상의 공지된 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있으며, 시판되는 올리고머 고정용 기질 및 고정화 용액을 이용할 수 있다.

상기 (b) 단계는, C형 감염바이러스의 RNA가 함유된 시료를 서열번호 17 및 18의 염기서열을 포함하는 각각의 프라이머로 PCR을 실시하는 단계이다. 상기 PCR은 RNA로부터 cDNA를 합성하는 역전사 PCR과 cDNA로부터 목적 핵산 서열 부위를 증폭시키는 PCR을 모두 포함한다. 상기 서열번호 17 및 18의 염기서열을 포함하는 프라이머는 C형 간염 바이러스의 내부 라이보좀 도입 자리(internal ribosomal entry site)를 포함하는 5' 비번역 영역(5'-untranslated site)을 증폭하며, 특히 이들은 5'말단 또는 3‘ 말단이 검출가능한 수단으로 표지된 것이다. 바람직하기로는 5’ 말단이 표지된 것이다. 상기 검출가능한 수단은 형광물질, 방사능 동위원소, 화학발광체 또는 효소일 수 있으며, 그 예로는 Cy3, Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), d-NTP (including d-UTP), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 양고추냉이 과산화효소, 바이오틴 등이 있다.

상기 PCR 반응은 역전사 반응 및 중합반응이 하나의 반응기 안에서 진행되는 것으로, 통상적으로 역전사 반응 후 중합반응을 각각 진행하는 방법에 비하여 간단하고 이차 오염 위험이 없으며 시간이 단축되는 효과가 있다. 본 발명의 PCR 반응은 역전사 반응 및 중합반응의 실시를 위해, PCR 반응을 위한 PCR 조성물은, 역전사 효소, 중합효소, 프라이머 세트, dNTP, PCR 완충액 및 잔량의 물로 구성된다. 상기 구성성분은 모두 시판되거나 공지된 물질을 사용하며, 이들의 조성은 주형이 되는 시료의 농도에 따라 적절히 조절하여 사용한다. 또한 PCR 반응은 50℃, 30분 -> 95 ℃, 15분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 35회 반복 -> 72 ℃, 10분으로 이루어진다.

상기 (c) 단계는 PCR 산물을 단일가닥으로 변성시키고, 이를 (a)의 고정화된 올리고머에 혼성화 반응을 유도하는 것으로, 변성은 소듐 하이드록사이드 및 에틸렌디아민테트라아세틱산을 포함하는 변성용액으로 실시될 수 있으며, 혼성화 반응은 통상적인 혼성화 완충액으로 실시될 수 있다. 구체적으로는 혼성화 완충액은 테트라메틸암모늄 클로라이드, 하이드록시 메틸아미노메탄, 에틸렌디아민테트라아세트산, 덴하드트‘스 용액, 소디움도데실설페이트 및 연어 정자 DNA를 포함한다. 혼성화 반응은 40 내지 60 ℃, 바람직하기로는 50 내지 57 ℃에서 실시된다.

상기 역전사 반응 및 PCR의 연속 반응을 위하여 Qiagen사에서 혼합물로 제공하는 역전사 및 중합반응 효소 혼합물을 사용한다. 효소 혼합물에는 대장균에서 발현시켜 정제한 Molony murine leukemia virus(MMLV) 혹은 avian myeloblastosis virus(AMV)에서 유래한 역전사 효소가 아닌 다른 두 종류의 역전사 효소와 Thermus aquaticus의 94KDa DNA중합효소에서 유래한 변화된 DNA 중합효소가 들어있다. 역전사 반응과 PCR이 동시에 일어나지 않고 연쇄적으로 일어나는 이유는 PCR반응에 사용되는 DNA중합효소가 95℃에서 15분 이상 열에 의한 활성화 과정을 거쳐야 비로소 중합효소로서 작동하기 때문이다. 따라서 먼저 50℃에서 역전사 반응을 수행되도록 세팅 한 후 이후 15분간 95℃에서 DNA중합효소를 활성화시켜 중합효소반응이 진행되도록 Thermal cycler를 세팅하면 역전사반응과 PCR이 연쇄적으로 일어나도록 할 수 있게 된다.

상기 (d) 단계에서는, 상기 (c)에서 혼성화 반응 유도한 고정화된 올리고머를 세척하여 비혼성화된 프라이머를 제거한 후, 올리고머에 혼성화된 프라이머의 검출가능한 수단, 즉 표지물을 확인하여, 혼성화된 올리고머를 분석하는 단계이다. 상기 검출가능한 수단의 종류에 따라 적절한 검출 방법을 수행할 수 있음은, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시가능한 일이다.

상기 (e) 단계는, PCR 반응 산물과 혼성화된 올리고머가 해당되는 C형 간염 바이러스의 유전자형을 파악하는 단계로, 이는 상기 표 1에 기재된 바와 같이 올리고머의 종류에 따른 C형 간염 바이러스의 유전자형이 결정되어 있으므로, 표 1을 통하여, 시료의 C형 간염 바이러스의 감염 여부 및 감염된 경우 C형 간염 바이러스의 유전자형을 결정할 수 있다.

본 발명에 따라, C형 감염 바이러스의 유전자형을 간단하고 F은 시간내에 수행함으로써, 향후 C형 간염 바이러스의 유전자형에 따른 치료를 가능하게 한다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: C형 간염 바이러스 유전자형 검출용 키트 제조

1-1: C형 간염 바이러스 유전자형 특이적인 프로브의 합성

상기 표1과 같이 C형 간염 바이러스 유전자형 특이적인 프로브를 각각 합성하였다.

표 1의 프로브는 고정을 위하여 5’말단에는 아민기(amine)를 표지하였다. 프로브의 합성은 화학합성법으로 하였고, 합성된 프로브는 폴리아크릴아미드젤을 이용한 전기영동법에 의해 분리 정제한 후, 질량분석분광계로 분자량을 검증하였다.

1-2: 프로브의 고정

5'말단에 아민(amine)기를 가진 프로브를 Nunc사의 Nucleolink 96 웰 플레이트의 각 웰에 고정하였다.

10 mM 1-메틸이미다졸(1-Methylimidazole)용액에 최종농도 10 mM로 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)를 용해한 다음, 100 picomole/㎕ 의 농도로 물에 녹인 표 1의 각각의 프로브를 1/1000의 비율로 첨가하여 고정 용액을 제조하였다. 상기 고정 용액 100 ㎕을 96 플레이트의 각 웰에 분주하고, 50℃에서 24시간동안 배양하여 프로브를 공유결합으로 플레이트 표면에 고정하였다. 고정반응 후 플레이트는 증류수로 세척한 후 200㎕ 의 1% 보바인 시럼 알부민 (Bovine serum albumin)을 포함하는 완충액 (100 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(TrisCl, Hydroxymethylamonomethane. pH7.5), 150 mM 소디움클로라이드 (Sodium Chloride) 및 0.1% 트윈 20(Tween20))을 분주하여 실온에서 4시간 배양하여 blocking 을 실시하고 이를 제거 한 후 건조한 후 실리카겔 을 포함하는 포장용기에 보관하였다.

실시예 2: C형 간염 바이러스의 유전자형 분석

2-1. 혈청으로부터 바이러스 RNA의 분리정제, cDNA합성, 중합효소 증폭

2-1-1. 바이러스 RNA의 분리정제

C형 간염 바이러스의 RNA 게놈을 시료혈청으로부터 분리정제하기 위하여 Qiagen사의 Ultrasense virus kit을 이용하였고, 1 ml의 혈청으로부터 RNA를 분리하였다. C형 간염 바이러스 각 유전자형의 반응 여부 시험을 위한 샘플혈청은, 보스톤바이오메디카(Boston Biomedica, Inc.)사로부터 구입하였고 이로부터 C형 간염 바이러스 유전자형 1a, 1b, 2b, 3a, 4h, 5a를 가지는 RNA를 분리정제 하였다.

2-1-2. cDNA합성 및 중합효소 증폭반응

C형 간염 바이러스의 내부 라이보좀 도입 자리(Internal Ribosomal Entry site; IRES)를 포함하는 5' 비번역영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 합성하였다.

정방향 프라이머: 5'-TCTAGCCATGGCGTTAGTRYGAGTGT-3'(서열번호 17)

역방향 프라이머: 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3'(서열번호 18)

R은 A 또는 G이고,

Y는 C 또는 T이다.

상기 프라이머는 5’말단에 비오틴(biotin)이 표지되어 있다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 RNA 게놈을 주형으로 PCR을 실시하여 cDNA를 합성하된 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드와 혈청에서 분리한 RNA게놈을 주형으로 하여 cDNA를 합성하고 바로 PCR을 실시하였다.

cDNA 합성과 PCR은 Qiagen사의 ‘One-step RT-PCR kit’를 사용하여, 하나의 반응용기 안에서 cDNA 합성과 PCR을 퍼킨엘머사의 GeneAmp PCR system 9600을 사용하여 동시에 실시하였다.

- 역전사반응 및 PCR 반응의 조성물 -

: RNA 35 ㎕, 5X 역전사 및 PCR 반응 완충액 10 ㎕, 2.5 mM dNTP 2㎕, 50 pmole/㎕ 정방향 프라이머 0.5 ㎕, 50 pmole/㎕ 역방향 프라이머 0.5 ㎕, 역전사효소 및 중합효소 혼합물 2 ㎕

- 역전사 및 PCR 조건 -

: 50℃, 30분 -> 95 ℃, 15분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 35회 반복) -> 72 ℃, 10분 -> 4℃ 보관.

2-2. 증폭산물을 이용한 C형 간염 바이러스 유전자형 결정

2-2-1: 증폭산물의 변성

역전사 반응 및 중합효소반응에 의해 증폭된 C형 간염 바이러스 유전자 산물은 20 ㎕에 변성용액(Denaturation solution: 400 mM 수산화나트륨(Sodium Hydroxide) 및 10 mM 에틸렌디아민테트라아세틱에시드(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic Acid)) 80 ㎕를 더하여 잘 섞은 후 상온에서 10분간 방치하여 두가닥 DNA로 이루어진 증폭산물이 단일가닥으로 변성되도록 하였다.

2-2-2. 혼성화 반응

변성된 증폭산물에 1700 ㎕의 하이브리다이제이션 완충액(Hybridization Buffer: 3 M 테트라메틸암모늄 클로라이드(Tetramethylammonium Chloride), 50 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(Tris-Cl, Hydroxymethylamonomethane, pH 6.8), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세틱에시드(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic Acid), 5X 덴하드트 용액 (Denhardt's solution), 0.6 % 소디움도데실설페이트(SDS, Sodium dodecyl sulfate), 100 ㎍/㎖ 분쇄 연어 정자 DNA(sheared salmon sperm DNA))를 더하여 잘 섞은 후, 100 ㎕씩 C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프로브가 고정된 96 웰 플레이트에 분주하였다. 분주 후 플레이트를 55 ℃에서 두 시간 동안 진탕배양하여 플레이트 표면에 고정된 프로브와 증폭산물 간에 혼성화 반응이 일어나도록 하였다.

2-2-3. 세척

혼성화 반응 후 완충액을 제거하고, 각 웰에 스트린전트 워시 완충액(Stringent Wash Buffer: 3 M 테트라메틸암모늄 클로라이드(Tetramethylammonium Chloride), 50 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(Tris-Cl, Hydroxymethylamonomethane. pH 8.0) 및 0.2% 소디움도데실설페이트(SDS, Sodium dodecyl sulfate))를 120 ㎕ 넣어 30초 후에 바로 제거하고, 동량의 스트린전트 워시 완충액을 넣고 30분간 55℃에서 진탕배양 후 완충액을 제거하였다. 여기에 다시 세척 완충액(100 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(TrisCl, Hydroxymethylamonomethane. pH7.5), 150 mM 소디움클로라이드 (Sodium Chloride) 및 0.1% 트윈 20(Tween20))를 200 ㎕넣어 30초후 제거하기를 3회 반복하여 남아있는 부산물이 없도록 하였다.

2-2-4. 비오틴 존재여부 감지

세척과정이 끝난 96웰 플레이트에 프로브와 결합하여 남아 있는 비오틴으로 표지된 증폭산물의 존재유무를 탐지하여 유전자형의 판별하고자 하였다. 비오틴에 결합하는 스트랍타비딘(STR, Straptavidin)에 호스레디쉬 퍼옥시데아제(HRP, Horse Radish Peroxydase) 폴리머(polymer)가 공유결합된 신호증폭 분자(STR-HRP)를 이용하였다.

먼저 어세이 완충액(100 mM 하이드록시메틸 아미노메탄(TrisCl, Hydroxymethylamonomethane. pH7.5), 150 mM 소디움클로라이드(Sodium Chloride), 0.1% 트윈 20(Tween20), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, Bovine serum albumin))에 1/4000으로 희석된 STR-HRP 100 ㎕를 각 웰에 분주하고, 이를 30분간 37 ℃에서 진탕배양하였다. 진탕배양 후 플레이트는 세척 완충액 200 ㎕ 이용하여 5회 반복 세척하였다. 세척 후 HRP의 신호를 감지하기 위하여 HRP의 기질 중 하나인 TMB(tetramethylbenzidine) 기질을 100 ㎕ 분주하였다. 발색 반응은 상온에서 10분간 일어나도록 하였고, 이후 2 M 황산수용액 50 ㎕를 분주하여 발색 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 각 웰에서 일어난 발색 반응의 정도는 흡광도 측정기기(Spectrophotometer)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

도 3은 C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프로브가 고정된 96웰 플레이트와, 이에 시료 DNA(유전자형: 1a, 1b, 2b, 3a, 4h, 5a)를 반응 구획을 도시한 것이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 16종의 C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프로브는 16개의 웰에 각각 고정되어 있으며, 하나의 시료 DNA는 서로다른 C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프로브가 고정된 16개의 웰에 반응시킨다.

도 4는 시료 DNA를 각각의 C형 간염 바이러스 프라이머 세트로 증폭한 후, C형 간염 바이러스 유전자형 특이 프로브가 고정된 플레이트에 반응시킨 결과(좌측)와, 상기 결과로부터 분석된 시료 DNA의 유전자형을 나타낸 것(우측)으로, 6종의 유전자형을 갖는 6종의 시료 DNA 각각은 유전자형에 특이적인 프로브가 고정된 플레이트에서 발색을 나타내었다.

비교예

실시예 2에서 사용한 동일한 시료 DNA에 대하여 기존의 C형 간염 바이러스 유전자형 분석 키트(Innogenetics, Inc., INNO-LiPa)로 C형 간염 바이러스 유전자형을 분석하였다.

INNO-LiPa를 이용한 C형 간염 바이러스 유전자형 분석은 상기 키트를 나이트로셀룰로스막 위에 분석하고자 하는 탐침을 결합하고 이에 대하여 혈청에서 유래한 증폭산물을 혼성 교잡하여 보는 방법을 통하여 C형 간염 바이러스 유전자형을 결정하였다. 상기 방법에 따른 분석과정은 실험자가 모두 직접 수행하였고, 분석 결과 또한 직접 눈으로 보고 결과를 판독하였다.

실험예 : C형 간염 바이러스의 유전자형 분석

실시예 2의 결과와 비교예의 결과를 비교하여, 하기 표 2로 나타내었다.

시료 DNA	기원	Roche Amplicor HCV Monitor V 2.0 (copies/ml)	비교예	실시예 2
PHW201-01	미국	4 x 104	1a	1a
PHW201-02	미국	6 x 103	1b	1b
PHW201-03	미국	2 x 104	2b	2
PHW201-04	대만	1 x 104	3a	3
PHW201-06	이집트	9 x 103	4h	4
PHW201-08	남아프리카	2 x 104	5a	5

표 2에서, 실시예 2의 방법의 결과와 기존의 키트의 결과가 유전자형의 구분에 있어서는 동일함을 알 수 있다. 그러나 본원발명의 방법은 비교예에 비하여 손쉬운 자동화 설비 구축이 가능한 96well 플레이트의 사용 및 이에 따른 한 실험자당 동시 분석 가능한 샘플의 수 증가, 정량적인 분석결과의 제공이 가능 하다는 점에서 보다 우수하다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 C형 간염 바이러스의 유전자형 분석방법은 쉽고 간단, 정확하게 C형 간염 바이러스의 유전자형을 판정할 수 있으며, C형 간염 바이러스의 RNA 시료의 역전사 반응 및 PCR 반응을 하나의 반응기안에서 연속적으로 실시하여 시간을 단축시키고, 교차오염(cross-contamination)의 문제점을 최소화할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) 하기 표 1의 C형 간염 바이러스 유전자형을 나타내는 서열번호 1 내지 16의 올리고머 각각을 독립적으로 분리된 16개의 기질에 각각 고정하는 단계;

(b) C형 간염 바이러스에 감염된 것으로 추정되는 혈청으로부터 RNA 시료를 분리하고, 상기 RNA 시료에 dNTP, 역전사 효소, 중합효소, 서열번호 17로 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 18로 기재된 염기서열로 이루어지는 프라이머를 가한 후 PCR 반응을 실시하며, 상기 프라이머는 5‘말단이 검출가능한 수단으로 표지된 것인 단계;

(c) 상기 PCR 산물을 단일 가닥 형태로 변성시킨 후 상기 (a)의 각각의 올리고머가 고정된 16개의 플레이트에 각각 가하여 혼성화 반응을 유도하는 단계;

(d) 상기 16개의 플레이트 각각의 혼성화 반응 여부를 검출하는 단계; 및

(e) 혼성화된 플레이트에 고정된 올리고머를 확인하여 표 1에 따라 핵산 시료의 C형 간염 바이러스 유전자형을 결정하는 단계

를 포함하는 C형 간염 바이러스 유전자형 분석방법:

(표1)

상기 표 1에서, Y는 C 또는 T 이고, R은 A 또는 G 이다.

제1항에 있어서, 상기 검출가능한 수단은 형광물질 표지, 방사성 동위원소 표지, 화학발광체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 PCR 반응 조건은 50℃, 30분 -> 95 ℃, 15분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 20 내지 40회 반복 실시 -> 72 ℃, 1 내지 20분으로 이루어지는 방법.