MX2012001058A - Metodos para diagnosticar o predecir el resultado de hepatitis c en pacientes infectados con hcv. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos in vitro para determinar una susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C o una susceptibilidad a eliminación espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C.

Description

METODOS PARA DIAGNOSTICAR O PREDECIR EL RESULTADO DE HEPATITIS C EN PACIENTES INFECTADOS CON HCV CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con métodos in vitro para determinar la susceptibilidad a no respuesta a un tratamiento para hepatitis C o la susceptibilidad para depuración espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El virus de la hepatitis C (HCV) es un ARN virus de cadena sencilla que infecta de modo crónico a más de 200 millones de personas, es decir, ~3% de la población mundial [1-4]. La infección aguda con el virus de hepatitis C (HCV) induce una amplia gama de respuestas inmunitarias innatas y adaptables que producen un control permanente de HCV en 20-50% de las personas [5] . La incapacidad de eliminar el virus genera hepatitis C crónica. La infección crónica se asocia con morbilidad y mortalidad significativas, lo que resulta principalmente del progreso a cirrosis y carcinoma hepatocelular [6] . El tratamiento estándar habitual de interferón pegilado y ribavirina ( PEG-IFN/RBV) resulta en una tasa de respuesta sostenida en 30-80% de individuos infectados crónicamente [7-9].

Las pruebas cada vez mayores sugieren que factores genéticos del hospedador influyen tanto en el curso natural de infección crónica por hepatitis C como la respuesta al tratamiento [10-13]. En dos grupos de embarazadas infectadas bajo condiciones similares a partir de preparación de inmunoglobulina contaminadas con una sola cepa de HCV, la mitad eliminaron de manera espontánea la infección y la mitad progresaron a hepatitis C crónica [14, 15]. Entre las pacientes infectadas crónicamente, la respuesta al tratamiento difiere, incluso entre los casos con niveles similares de HCV-RNA y genotipos idénticos [6, 7, 9]. Las tasas de respuesta se asocian fuertemente con la raza y el género [16]. Reportes previos han mostrado la influencia de polimorfismos genéticos de antigenos leucocitarios humanos (HLA) [10, 13], receptores similares a inmunoglobulina destructora (KIR) [17], citocinas (WO 00/08215), quimiocinas e interleucinas asi como genes estimulados con interferón [18-22] en los resultados de infección por HCV.

Estudios previos han utilizado el enfoque de un gen candidato en base en un conocimiento a priori del papel potencial de un gen en la infección por HCV. No obstante, los datos anteriores no permiten predicción precisa de eliminación espontánea o respuesta a tratamiento [13] .

Pese a la solución mencionada antes, aún existe una - - necesidad grande de desarrollar un método de predicción eficaz para determinar susceptibilidad o carencia de respuesta a un tratamiento contra hepatitis C en un sujeto que padece de hepatitis C crónica o la susceptibilidad a eliminación espontánea o no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado de modo agudo con el virus de hepatitis C.

Hasta ahora no se han desarrollado métodos o estrategias eficaces para resolver este problema.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION Este objetivo se obtiene al proporcionar un método para determinar susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento contra hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del suj eto .

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método para determinar la susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico dentro del locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del suj eto .

Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para tratar a un paciente por hepatitis C crónica que comprende i) determinar si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto en donde por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente se selecciona del grupo que consiste de rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, S251910, rs7539953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, s30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii) y tratar al paciente en base en por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está asociado con susceptibilidad aumentada o carencia de respuesta al tratamiento para hepatitis C.

Un objetivo adicional de la presente invención es un método para tratar a un paciente por hepatitis C crónica que comprende i) determinar si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del paciente en donde por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente se selecciona del grupo que comprende rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, s251910, rs7539953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, s30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii) determinar el genotipo viral de HCV en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del paciente, iii) y tratar al paciente en base en si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente y el genotipo viral de HCV están asociados con susceptibilidad aumentada o carencia de respuesta al tratamiento para hepatitis C.

Esta invención también proporciona un método para determinar la susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método comprende: i) distinguir en los sujetos aquellos que presentan susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C al determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica del sujeto, la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a no respuesta al tratamiento de hepatitis C, ii) establecer un régimen de tratamiento de hepatitis C.

Esta invención también se relaciona con un método para determinar la susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método comprende: i) distinguir en los sujetos aquellos que tienen susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C al determinar: la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C, y el genotipo viral de HCV, la presencia del genotipo 1 ó 4 es una indicación de que el sujeto presenta una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C, ii) establecer un régimen de tratamiento para hepatitis C.

La presente invención también se relaciona con un equipo para determinar susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica de acuerdo con la invención, el equipo comprende: i) reactivos para detectar selectivamente la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, y ii) instrucciones para uso.

También se proporciona en la presente invención un equipo para determinar susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C de acuerdo con la invención, el equipo comprende: i) reactivos para detectar selectivamente la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico dentro del locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, y ii) instrucciones para su uso.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 representa una gráfica Manhattan. Los valores P para la totalidad de 2.5 polimorfismos del nucleótidos únicos (SNP) están indicados (en una escala -loglO) .

La figura 2 representa la distribución de genotipos en una población infectada. (A) Genotipos que contienen el alelo G se reducen en individuos con eliminación espontánea de HCV en comparación con la infección crónica. (B) En el estudio del grupo de hepatitis C Swiss (SCCS) , existe un incremento en la frecuencia del alelo G en la totalidad de los tres siguientes grupos de pacientes: aquellos con eliminación espontánea viral < aquellos con eliminación después de tratamiento (es decir, quienes responden al tratamiento) < aquellos quienes no responden al tratamiento.

La figura 3 es una representación gráfica de los valores P de diferentes SNP que muestran un patrón de asociación concordante tanto para la eliminación espontánea como la carencia de respuesta a tratamiento en el bloque de haplotipo IL28B (A) bloques de haplotipo. La asociación genética más fuerte se localiza en el bloque de haplotipo que está más cercano al gen IL28B. (B) Asociación genética de los SNP con HCV en los locus IL28B/A e IL-29. La asociación fuerte de los SNP localizada cerca de los loci IL28B e IL28A está presente para ambos criterios de valoración, depuración espontánea de hepatitis C y carencia de respuesta a tratamiento basado en interferón.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un método para determinar susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del suj eto .

La presente invención también se relaciona con un método para determinar la susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico dentro del locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto.

Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias que se mencionan en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. Las publicaciones y solicitudes descritas en la presente se proporciona únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de esta solicitud. Nada en esos documentos debe considerarse como admisión de que la presente invención no está capacitada para antefechar la publicación en virtud de la invención previa. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

A menos que se defina en otro sentido, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado al entendido habitualmente por una persona habitualmente experta en el ámbito a la cual pertenece la materia de este documento. De la manera en que se utiliza en la presente, las siguientes definiciones se proporcionan con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención.

El término "que comprende" generalmente se utiliza en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.

Como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias a las formas plurales a menos que el contexto claramente lo determine en otro sentido.

De la manera en que se utiliza en la presente, "respuesta viral sostenida" se define como una viremia indetectable durante más de 24 semanas después de que ha finalizado el tratamiento.

De la manera en que se utiliza en la presente, "por lo menos uno" significa "uno o más".

De la manera en que se utiliza en la presente los términos, "sujeto" o "paciente" son bien reconocidos en el ámbito y se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a un mamífero, que incluye un perro, gato, rata, ratón, mono, vaca, caballo, chivo, borrego, cerdo, camello y, de manera más preferible, un humano. En algunas modalidades, el sujeto es un sujeto en necesidad de tratamiento de hepatitis C. No obstante, en otras modalidades, el sujeto puede ser un sujeto normal.

Los términos "sujeto" o "paciente" no indican edad o sexo particular. De esta manera, se pretende abarcar a adultos, lactantes y sujetos recién nacidos, hombres o mujeres .

De manera alternativa, el sujeto o paciente está coinfectado con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , preferiblemente VIH-1 o VIH-2.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "susceptibilidad" se refiere a la probabilidad, para el sujeto o una predisposición a no responder al tratamiento de hepatitis C o a una predisposición, para el sujeto, a una eliminación no espontánea de hepatitis C.

De la manera en que se utiliza en la presente, un "alelo" se refiere a una forma específica de una secuencia genética o una posición nucleotidica única dentro de una secuencia genética (tal como un gen) dentro de una célula, un individuo o dentro de una población, la forma especifica difiere de otras formas del mismo gen en la secuencia de por lo menos uno, y con frecuencia más de uno sitios variantes dentro de la secuencia del gen. La secuencia puede o no estar dentro de un gen. Las secuencias en estos sitios variantes que diferente entre alelos diferentes de denominan "variaciones", "polimorfismos" o "mutaciones". En cada ubicación cromosómica especifica autosómica o "locus", una persona presenta dos alelos, uno heredado de uno de los padres y el otro heredado del otro de los padres, por ejemplo uno de la madre y otro del padre.

El término "polimorfismo" como se utiliza en la presente, se refiere a la presentación de dos o más secuencias alternativas o alelos, determinados genéticamente, en una población. Un "marcador polimórfico" o sitio es el locus en el cual se produce la divergencia. Los marcadores preferidos tienen por lo menos dos alelos, cada uno presentándose a una frecuencia preferiblemente mayor de 1% y de modo más preferible mayor de 10% o 20% de una población seleccionada. Un polimorfismo puede comprender uno o más cambios de base, una inserción, una repetición o una supresión. Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismos de longitud de fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem (VNTR) , regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones dinucleotidicas, repeticiones trinucleotidicas, repeticiones tetranucleotidicas , repeticiones de secuencia sencilla, variaciones en el número de copias (CNV) y elementos de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada se denomina arbitrariamente como la forma de referencia y las otras formas alélicas se denominan como alelos alternativos o variantes. La forma alélica que se presenta con mayor frecuencia en una población seleccionada algunas veces se denomina como la forma natural. Un polimorfismo dialélico tiene dos formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas. Un polimorfismo entre dos ácidos nucleicos puede presentarse de modo natural o puede ser causado por exposición o contacto con sustancias químicas, enzimas u otros agentes o exposición a agentes que provocan daño a ácidos nucleicos, por ejemplo radiación ultravioleta, mutágenos o carcinógenos. Una clase particular de polimorfismo, denominado polimorfismo nucleotídico único o SNP, es un cambio genético pequeño o una variación que puede presentarse dentro de la secuencia de ADN de una persona. El código genético está especificado por cuatro "letras" nucleótidos ; A (adenina) , C (citosina) , T (timina) , y G (guanina) . La variación SNP se produce cuando un nucleótido único, tal como una A es sustituida por otro de las tres letras nucleotidicas - C, G o T.

El término "virus de hepatitis C" o "HCV" se utiliza en la presente para definir una especie de ARN viral del cual las cepas patogénicas provocan hepatitis C, también conocida como hepatitis no A, no B. En base en las diferencias genética entre los aislados de HCV, las especies de virus de hepatitis C se clasifican en seis genotipos (1-6) con varios subtipos dentro de cada genotipo. Los subtipos se descomponen adicionalmente en cuasiespecies basadas en su diversidad genética. La preponderancia y distribución de los genotipos de HCV varia mundialmente . Por ejemplo, en Norteamérica, predomina el genotipo la seguido por Ib, 2a, 2b y 3a. En Europa predomina el genotipo Ib seguido por 2a, 2b, 2c y 3a. Los genotipos 4 y 5 se encuentran casi exclusivamente en África. El genotipo viral es clínicamente importante para determinar la respuesta potencial a un tratamiento basado en interferón y la duración requerida de tal tratamiento. Los genotipos 1 y 4 generalmente responden menos a tratamiento basado en interferón en comparación con los otros genotipos (2, 3, 5 y 6) . Debe hacerse notar que los genotipos 5 y 6 son raros en la población.

La "hepatitis C" es una enfermedad infecciosa que afecta al hígado, provocada por el virus de hepatitis C (HCV) . La infección con frecuencia es asintomática, pero, una vez establecida, la infección de hepatitis C crónica puede progresar a cicatrización del hígado (fibrosis) y cicatrización avanzada (cirrosis) lo cual generalmente es evidente después de muchos años. En algunos casos, quienes presentan cirrosis avanzarán a desarrollar fallo hepático u otras complicaciones de la cirrosis que incluyen cáncer de hígado.

La "hepatitis C crónica" se define como infección con el virus de hepatitis C que persiste durante más de seis meses. Clínicamente, con frecuencia es asintomático (sin síntomas) y es descubierta en la mayoría de las veces de modo accidental. El curso natural de la hepatitis C crónica varía considerablemente de una persona a otra. Aunque casi todas las personas infectadas con HCV presentan pruebas de inflamación al realizar una biopsia hepática, la velocidad de progreso de cicatrización del hígado (fibrosis) muestra variabilidad significativa entre individuos. Los cálculos precisos del riesgo con respecto al tiempo son difíciles de establecer debido al limitado tiempo en que las pruebas para este virus han estado disponibles.

Tan pronto como se ha identificado el virus de hepatitis C (HCV) , diversos estudios transversales en personas con anticuerpos al virus demuestran que algunos parecen mostrar "eliminación espontánea de hepatitis C" mientras que otros mantienen un estado de viremia. Desde ese momento, muchos investigadores se han dado a la tarea de caracterizar la patogénesis de la infección de hepatitis C, que incluye la velocidad, curso en el tiempo y elementos de predicción de la eliminación viral espontánea. Los cálculos respecto a las velocidades de eliminación han variado de 10 a 50% y la duración de tiempo de eliminación se ha encontrado que es tan grande como 3 años en algunos casos. Las revisiones clínicas autorizadas generalmente han indicado velocidades de eliminación tan bajas como 10-15%.

La "eliminación no espontánea de hepatitis C" se refiere en la presente a una situación en donde un sujeto no presentaría eliminación espontánea de manera que la infección evolucionaría en hepatitis C crónica. Con fines de claridad, no hace referencia a una eliminación inducida por tratamiento .

El término "locus IL28B/A y/o IL-29" se refiere de modo general, en humanos, a una región de ADN genómico que se localiza dentro de la región de 80 kb en el brazo grande del cromosoma 19 que codifica para tres genes para citocina, es decir, IL28B, IL28A e IL29 (los cuales pertenecen a la familia de IFNX) . Estos tres genes tienen varios exones, 5 para IL-28 (también denominado como INFNAl) y 6 exones para IL-28A (IFNA2) e IL-28B (IFNA3) . Codifican para proteínas monoméricas secretadas de 20 kDa. Recientemente se ha reportado que la citocinas IL28B, IL28A e IL29 pueden ser un sustituto interesante a IFNOÍ para el tratamiento de pacientes infectados con HCV quienes son o se vuelven resistentes a IFNOÍ ( [38] ) .

En el caso de un método de determinación de una susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto que padece de hepatitis C crónica, de acuerdo con la presente invención, la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C.

Por otra parte, en el caso de un método para determinar una susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C, de acuerdo con la presente invención, entonces la presencia de el por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a eliminación no espontánea de hepatitis C.

Están disponibles muchos métodos para analizar la presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotídico único (SNP) , los cuales se pueden aplicar al locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto. Los análisis para detección de polimorfismos o mutaciones se encuentran en varias categorías que incluyen pero que no se limitan a análisis de secuenciado directo, análisis de polimorfismo de fragmento, análisis de hibridación y análisis de datos basados en computadora. Los procedimientos y equipos o servicios disponibles comercialmente para realizar variaciones múltiples de estos análisis están disponibles. En algunas modalidades, los análisis se realizan en combinación o en híbrido (por ejemplo, reactivos o tecnologías diferentes de varios análisis se combinan para proporcionar un análisis) . Los siguientes análisis son útiles en la presente invención y si se describen en relación a la detección de diversos SNP encontrados en el locus IL28B/A y/o IL-29.

En un aspecto de la presente invención, los SNP se detectan utilizando una técnica de secuencia directo. En estos análisis, las muestras de ADN primero se aislan de un sujeto utilizando cualquier método adecuado. En algunas modalidades, la región de interés se clona en un vector adecuado y se amplifica por crecimiento en una célula hospedadora (por ejemplo, una bacteria) . En otras - - modalidades, se amplifica el ADN en la región de interés utilizando reacción en cadena de polimerasa (PCR) .

Después de la amplificación, se secuencia el ADN en la región de interés (por ejemplo la región que contiene el SNP) utilizando cualquier método adecuado que incluye pero que no se limita a secuenciado manual utilizando nucleótidos marcadores radioactivos, o secuenciado automatizado. Los resultados del secuenciado se muestran utilizando cualquier método adecuado. La secuencia se examina y se determina la presencia o ausencia de un SNP dado.

En un aspecto de la presente invención, se detectan los SNP utilizando un análisis basado en PCR. En algunas modalidades, el análisis PCR comprende el uso de cebadores oligonucleotidicos ("cebadores") para amplificar un fragmento que contiene el polimorfismo repetido de interés. La amplificación de una secuencia polinucleotidica objetivo se puede llevar a cabo por cualquier método conocido por un experto en el ámbito. Véase, por ejemplo, [41] y [42]. Los métodos de amplificación incluyen, pero no se limitan a PCR que incluye PCR en tiempo real (RT-PCR) , amplificación por desplazamiento de cadena [43]; [44], amplificación por desplazamiento de cadena utilizando ADN polimerasa Phi29 (patente de E.U.A. número 5,001,050), amplificación basada en transcripción [45], replicación de secuencia autosostenida ( " 3SR" ) [46]; [47], el sistema de replicasa Q.beta ([48]; [49]), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico ( "NASBA" ) ([50]), la reacción en cadena de reparación ( "RCR" ) ([50], supra) y amplificación de ADN bumerang (o "BDA") ([50]). La PCR es el método preferido de amplificación de la secuencia polinucleotidica objetivo.

La PCR se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas por los expertos en el ámbito. En general, PCR involucra, en primer lugar, tratar una muestra de ácido nucleico (por ejemplo en presencia de una ADN polimerasa estable al calor) con un par de cebadores de amplificación. Un cebador del par hibridiza con una cadena de una secuencia polinucleotidica objetivo. El segundo cebador del par hibridiza con la otra cadena complementaria de la secuencia nucleotidica objetivo. Los cebadores se hibridizan con sus cadenas de secuencia polinucleotidica objetivo bajo condiciones tales que se sintetiza un producto de extensión de cada cebador el cual es complementario a cada cadena de ácido nucleico. El producto de extensión sintetizado desde cada cebador, cuando se separa de su complemento, puede servir como una plantilla para la síntesis del producto de extensión del otro cebador. Después de la extensión del cebador la muestra se trata en condiciones desnaturalizantes para separar los productos de extensión de cebador de sus plantillas. Estas etapas se repiten cíclicamente hasta que se obtiene el grado deseado de amplificación.

El polinucleótido objetivo amplificado se puede utilizar en uno de los análisis de detección descritos en otra parte en este documento para identificar el polimorfismo repetido GT presente en la secuencia polinucleotídica objetivo amplificada.

En un aspecto de la presente invención, los SNP se detectan utilizando un análisis de polimorfismo de longitud de fragmento. En un análisis de polimorfismo de longitud de fragmento, se genera un patrón de bandas de ADN único en base en la separación de ADN en una serie de posiciones, utilizando una enzima (por ejemplo, una endonucleasa de restricción) . Los fragmentos de ADN de una muestra que contiene un polimorfismo tendrán un patrón de generación de bandas diferente que la forma natural.

En un aspecto de la presente invención, el análisis de determinación de tamaño de fragmento se lleva a cabo utilizando el sistema de análisis genético Beckman Coulter CEQ 8000, un método bien conocido en el ámbito para determinación de polimorfismo de microsatélite.

En un aspecto de la presente invención, los SNP se detectan utilizando un análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RPLP) . La región de interés primero se aisla utilizando PCR. Los productos de PCR después se separan con enzimas de restricción conocidas que proporcionan un fragmento de longitud única para un polimorfismo dado. Los productos de PCR digeridos con enzimas de restricción se separan por electroforesis en gel de agarosa y se visualizan por tinción con bromuro de etidio y se comparan con controles (naturales) .

En un aspecto, se detectan los polimorfismos utilizando el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento CLEAVASE (CFLP; Third ave Technologies, Madison, Wis.; véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5, 888, 780). Este análisis se basa en la observación de que, cuando las cadenas únicas de ADN se pliegan sobre si mismas, pueden adquirir estructuras de orden superior que son altamente individuales para la secuencia precisa de la molécula de ADN. Estas estructuras secundarias involucran regiones parcialmente dúplex de ADN de manera que las regiones de cadena sencilla se yuxtaponen con horquillas de ADN de cadena doble. La enzima CLEAVASE I es una nucleasa termoestable, especifica de estructura que reconoce y separa las uniones entre estas regiones de cadena sencilla y de cadena doble.

La región de interés se aisla primero, por ejemplo, utilizando PCR. Después las cadenas de ADN se separan por calentamiento. A continuación las reacciones se enfrian para permitir que se forme la estructura secundaria dentro de la cadena. Los productos de PCR después se tratan con la enzima CLEAVASE I para generar una serie de fragmentos que son únicos para un polimorfismo dado. Los productos de PCR tratados con la enzima CLEAVASE se separan, se detectan (por ejemplo por electroforesis en gel de agarosa) , se visualizan (por ejemplo con tinción con bromuro de etidio) y se comparan con controles (naturales) .

En otros aspectos de la presente invención, los SNP se detectan por análisis de hibridación. En un análisis de hibridación se determina la presencia o ausencia de un polimorfismo o mutación dados en base en la capacidad del ADN a partir de la muestra para hibridizar con una molécula de ADN complementaria (por ejemplo una sonda oligonucleotidica) . Están disponibles una diversidad de análisis de hibridación utilizando una diversidad de tecnologías para hibridación y detección. Se proporciona a continuación una descripción de una selección de análisis.

En un aspecto preferido, los ácidos nucleicos hibridizados se detectan al detectar una o más etiquetas unidas a ácidos nucleicos de muestra. Las etiquetas se pueden incorporar por cualquiera de numerosos medios bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito. En una modalidad, la - - etiqueta se incorpora simultáneamente durante la etapa de amplificación en la preparación de los ácidos nucleicos de muestra. Asi, por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores etiquetados o nucleótidos etiquetas proporcionará un producto de amplificación etiquetado. En otra modalidad, la amplificación de transcripción utilizando un nucleótido etiquetado (por ejemplo UTP y/o CTP etiquetado con fluoresceínas) incorpora una etiqueta en los ácidos nucleicos transcritos.

De manera alternativa, se puede agregar una etiqueta directamente a la muestra original de ácido nucleico (por ejemplo ARNm, poliA ARNm, ADNc, ADN genómico, etc.), o al producto de amplificación después de que se completa la amplificación. Los medios de unión de etiquetas a ácidos nucleicos son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito e incluyen, por ejemplo, traducción de secuencias o etiquetado en el extremo (por ejemplo con un ARN etiquetado) mediante someter a cinasa el ácido nucleico y unión (ligación) subsecuente de un enlazante de ácido nucleico que se une al ácido nucleico de muestra a una etiqueta (por ejemplo un fluoróforo) . En otra modalidad se agrega una etiqueta al extremo de fragmentos utilizando desoxitransferasa terminal (TdT) .

Las etiquetas detectables adecuadas para uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos , eléctricos, ópticos o químicos. Las etiquetas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a: biotina para tinción con conjugado de estreptavidina etiquetado; anticuerpos anti-biotina , esferas magnéticas (por ejemplo DynabeadsMR) ; colorantes fluorescentes (por ejemplo fluoresceína, tojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde y similares) ; radioetiquetas (por ejemplo 3H, 125I, 35S, 14C o 32P) ; etiquetas fosforescentes; enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras utilizadas habitualmente en una prueba de ELISA) ; y etiquetas calorimétricas tales como oro coloidal o esferas de vidrio o plástico coloreado (por ejemplo poliestireno, polipropileno, látex, etc . ) .

Los medios para detectar tales etiquetas son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito. Así, por ejemplo, se pueden detectar radioetiquetas utilizando película fotográfica o contadores de centelleo; se pueden detectar marcadores fluorescentes utilizando un fotodetector para detectar luz emitida. Las etiquetas enzimáticas típicamente se detectan al proporcionar la enzima con un sustrato y detectar el producto de reacción generado por la acción de la enzima sobre el sustrato, y las etiquetas calorimétricas se detectan simplemente al visualizar la etiqueta coloreada.

La etiqueta se puede agregar a uno o varios ácidos nucleicos objetivo antes de o después de la hibridación. Las denominadas "etiquetas directas" son etiquetas detectables que se unen directamente o que se incorporan en el ácido nucleico objetivo antes de hibridación. En contraste, la denominadas "etiquetas indirectas" se unen a un dúplex híbrido después de hibridación. Con frecuencia, la etiqueta indirecta se une a una porción de unión que se ha unido a ácido nucleico objetivo antes de la hibridación. Así, por ejemplo, el ácido nucleico objetivo puede ser biotinado antes de la hibridación. Después de la hibridación, un fluoróforo conjugado a avidina se unirá a las cadenas dúplex híbridas que presenten biotina proporcionando una etiqueta que se detecta con facilidad. Para una revisión detallada de los métodos de etiquetado de ácidos nucleicos y detección de ácidos nucleicos hibridizados etiquetados véase Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hibridization with Nucleic Acids Probes, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para todo propósito.

En un aspecto, la hibridación de una sonda de la secuencia de interés (por ejemplo polimorfismo similar a SNP) se detecta directamente al visualizar una sonda unida (por ejemplo un análisis Northern o Southern; véase, por ejemplo, Ausabel et al. (Eds.), 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) . En estos análisis, se forma ADN genómico (Southern) o ARN (Northern) a partir de un sujeto. El ADN o ARN después se separa con una serie de enzimas de restricción que separan de manera poco frecuente en el genoma y que no se acercan a alguno de los marcadores que es analizado. El ADN o ARN después se separa (por ejemplo electroforesis en gel de agarosa) y se transfiere a una membrana. Una sonda o sondas etiquetadas (por ejemplo al incorporar un radionucleótido) especificas para la mutación que se detecta se permite que se pongan en contacto con la membrana bajo una condición de rigurosidad baja, media o alta. La sonda no unida se retira y se detecta la presencia de unión al visualizar la sonda etiquetada.

En un aspecto de la presente invención, se detectan los SNP utilizando el análisis de hibridación de chip de ADN. En este análisis, se fijan una serie de sondas oligonucleotidicas a un soporte sólido. Las sondas oligonucleotidicas se diseñan para ser únicas para un polimorfismo nucleotidico único dado. La muestra de ADN de interés se pone en contacto con el "chip" de ADN y se detecta la hibridación.

En algunas modalidades, el análisis de chip de ADN es un análisis GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, Calif; véase por ejemplo, la patente de E.U.A. número 6,045,996). La tecnología GeneChip utiliza arreglos de alta densidad miniaturizados de sondas oligonucleotídicas fijas a un "chip". Los arreglos de sondas se fabrican por procedimientos de síntesis químicas dirigidos por luz de Affymetrix, los cuales combinan síntesis química en fase sólida con técnicas de fabricación fotolitográfica utilizadas en la industria de semiconductores. Utilizando una serie de protectores fotolitográficos para definir sitios de exposición de chip, seguido por etapas de síntesis química específicas, el procedimiento construye arreglos de alta densidad de oligonucleótidos con cada sonda en una posición predefinida en el arreglo. Los arreglos de sondas múltiples se sintetizan simultáneamente en una oblea de vidrio grande. Las obleas después se cortan y los arreglos de sondas individuales se empacan en cartuchos de plástico moldeados por inyección, los cuales los protegen del ambiente y sirven como cámaras para hibridación.

El ácido nucleico que va a ser analizado se aisla de una muestra biológica obtenida de un sujeto, se amplifica por PCR y se etiqueta con un grupo indicador fluorescente. El ADN etiquetado después se incuba con el arreglo utilizando una estación fluida. El arreglo después se inserta en el explorador, en donde se detectan patrones de hibridación. Los datos de hibridación se recolectan como luz emitida desde los grupos indicadores fluorescentes ya incorporados en el objetivo, los cuales se unen al arreglo de sonda. Las sondas que coinciden perfectamente con el objetivo generalmente producen señales más fuertes que aquellas que presentan malos pareamientos . Dado que la secuencia y posición de cada sonda en el arreglo es conocida, por complementariedad se puede determinar la identidad del ácido nucleico objetivo aplicado al arreglo de sonda.

En otro aspecto, se utiliza un microchip de ADN que contiene sondas captadas electrónicamente (Nanogen, San Diego, Calif , ) (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 6,068,818). Mediante el uso de microelectrónica, la tecnología de Nanogen permite el movimiento activo y concentración de moléculas cargadas hacia y desde sitios de prueba designados en su microchip semiconductor. Las sondas de captación de ADN única para un polimorfismo o mutación dada se colocan electrónicamente en, o se "direccionan" a sitios específicos en el microchip. Puesto que el ADN tiene una fuete carga negativa, puede ser movido electrónicamente a un área de carga positiva.

En primer lugar, un sitio de prueba o una hilera de sitios de prueba en el microchip se activa electrónicamente con una carga positiva. Después se introduce en el microchip una solución que contiene las sondas de ADN. Las sondas cargadas negativamente se mueven rápidamente a los sitios cargados positivamente, en donde se concentran y se unen químicamente a un sitio en el microchip. Posteriormente el microchip se lava y se agrega otra solución de sondas de ADN distintas hasta que se completa el arreglo de sondas de ADN unidas específicamente.

Después una muestra de prueba se analiza para determinar la presencia de moléculas de ADN objetivo al determinar cual de las sondas de captación de ADN hibridiza, con ADN complementario en la muestra de prueba (por ejemplo, un gen de interés amplificado por PCR) . También se utiliza una carga electrónica para mover y concentrar moléculas objetivo a uno o más sitios de prueba en el microchip. La concentración electrónica del ADN de muestra en cada sitio de prueba promueve una hibridación rápida del ADN de muestra con sondas de captación complementarias (la hibridación se puede llevar a cabo en minutos) . Para eliminar cualquiera de ADN no unido o unido de manera no específica de cada sitio, se revierte la polaridad de la carga de sitio a negativa con lo que se obliga a cualquier ADN no unido o unido de manera no específica a regresar a la solución alejándose de las sondas de captura. Se utiliza un escáner de fluorescencia basado en láser para detectar la unión.

En otro aspecto adicional, se utiliza una tecnología de arreglo basada en la segregación de fluidos en una superficie plana (chip) por diferencias en la tensión superficial (ProtoGene, Palo Alto, Calif . ) (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 6,001,311). La tecnología de Protogene se basa en el hecho de que los fluidos se pueden segregar sobre una superficie plana por diferencias en la tensión superficial que han sido impartidas por recubrimientos químicos. Una vez separado de esta manera, las sondas oligonucleotídicas se sintetizan directamente en el chip por impresión a chorro de tinta de los reactivos. El arreglo con estos sitios de reacción definidos por tensión superficial se monta en una placa de traducción X/Y bajo un conjunto de cuatro boquillas piezoeléctricas , una para cada una de las cuatro bases de ADN estándar. La placa de traducción se mueve a lo largo de cada una de las hileras del arreglo y se suministra el reactivo apropiado a cada uno de los sitios de reacción. Por ejemplo, se suministra una amidita A únicamente a los sitios con amidita A que se van a acoplar durante esa etapa de síntesis, y así sucesivamente. Los reactivos comunes y los lavados se suministran por inundación de la totalidad de la superficie seguido por extracción por centrifugación.

Las sondas de ADN únicas para el polimorfismo de interés se fijan al chip utilizando la tecnología de Protogene. El chip después se pone en contacto con los genes amplificados por PCR de interés. Después de la hibridación, el ADN que no se ha unido se separa y la hibridación se detecta utilizando cualquier método adecuado (por ejemplo por fluorescencia, des-extinción de un grupo fluorescente incorporado) .

En otros aspectos adicionales se utiliza un "arreglo de esferas" para detección de los SNP (Illumina, San Diego, Calif; véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 99/67641 y WO 00/39587, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia) . Illumina utiliza una tecnología de arreglo de esferas que combina conjunto de fibras ópticas y esferas que se autoensamblan en un arreglo. Cada conjunto de fibra óptica contiene miles a millones de fibras individuales que dependen del diámetro del conjunto. Las esferas se recubren con un oligonucleótido específico para la detección de un polimorfismo o mutación dados. Los lotes de esferas se combinan para formar un acumulado específico para el arreglo. Para realizar un análisis, el arreglo de esferas se pone en contacto con una muestra objeto preparada (por ejemplo ADN) . La hibridación se detecta utilizando cualquier método adecuado como detección enzimática de hibridación.

En algunos aspectos de la presente invención, se generan perfiles genómicos utilizando un análisis que detecta hibridación por separación enzimática de estructuras especificas (análisis INVADER, Third Wave Technologies; véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 6.001,567). El análisis INVADER detecta secuencias especificas de ADN y ARN mediante la utilización de enzimas especificas de estructura para separar un complejo formado por la hibridación de sondas oligonucleotidicas que se superponen. La temperatura elevada y un exceso de una de las sondas permite que las . sondas múltiples se separen para cada secuencia objetivo presente sin ciclos de temperatura. Estas sondas separadas después dirigen la separación de una segunda sonda etiquetada. El oligonucleótido de sonda secundario puede estar etiquetado en el extremo 5' con fluoresceina que es extinguida por un colorante interno. Ante la separación, el producto etiquetado con fluoresceina y desextinguido se puede detectar utilizando un lector de placa de fluorescencia estándar.

El análisis INVADER detecta mutaciones y polimorfismos específicos en un ADN genómico no amplificado. La muestra aislada de ADN se pone en contacto con la primera sonda específica ya sea para un polimorfismo/mutación o con una secuencia natural y se permite que hibridice. Después una sonda secundaria, especifica para la primera sonda y que contiene una etiqueta de fluoresceina se hibridiza y la enzima se agrega. La unión se detecta utilizando un lector de placa fluorescente y se compara la señal con la muestra de prueba con controles conocidos positivos y negativos.

En algunos aspectos, la hibridación de una sonda unida se detecta utilizando el análisis TaqMan (PE Biosystems, Foster, City, Calif; véase, por ejemplo, patente de E.U.A. número 5,962,233). El análisis se realiza durante una reacción de PCR. El análisis TaqMan aprovecha la actividad de 5 '-3' exonucleasa de la ADN polimerasa AMPLITAQ GOLD. Se incluye una sonda especifica para un alelo o mutación dados en la reacción de PCR. La sonda consiste de un oligonucleótido con un colorante indicador 5' (por ejemplo, un colorante fluorescente) y un colorante extintor 3'. Durante la PCR, si la sonda sé une a su objetivo, la actividad nucleotidica 5' -3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD separa la sonda entre el indicador y el colorante de extinción. La separación del colorante indicador del colorante de extinción resulta en un incremento de fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede ser monitoreada por un fluorimetro.

En algunos aspectos se utiliza el sistema MassARRAY (Sequenom, San Diego, Calif.) para detectar polimorfismos (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 6,043,031). El ADN se aisla de muestras de sangre utilizando procedimientos estándar. Después se amplifican por PCR regiones de ADN especificas que contienen el polimorfismo de interés. Los fragmentos amplificados después se unen por una cadena a una superficie sólida y las cadenas no inmovilizadas son retiradas por desnaturalización estándar y lavado. La cadena única inmovilizada remanente sirve después como una plantilla par reacciones enzimáticas automatizadas que producen productos de diagnóstico específicos para el genotipo .

Después se transfieren cantidades muy pequeñas de productos enzimáticos, habitualmente de cinco a diez nanolitros a un arreglo SpectroCHIP para análisis automatizado subsecuente con el espectrómetro de masas SpectroREADER. Cada punto se precarga con cristales absorbentes de luz que forman una matriz con el producto de diagnóstico suministrado. El sistema MassARRAY utiliza la espectrometría de masas MALDI-TOF (ionización de desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo) . En un procedimiento conocido como desorción la matriz es golpeada por un pulso de un haz láser. La energía del haz láser se transfiere a la matriz y es vaporizada lo que resulta en una cantidad pequeña de producto de diagnóstico que es expulsada en un tubo de vuelo. Conforme el producto de diagnóstico se carga cuando un pulso de campo eléctrico se aplica subsecuentemente al tubo son expulsados hacia abajo del tubo de vuelo, hacia un detector. El tiempo entre la aplicación de un pulso de campo eléctrico y la colisión del producto de diagnóstico con el detector se denomina como el tiempo de vuelo. Esta es una medida muy precisa del peso molecular del producto, dado que una masa de moléculas se correlaciona directamente con el tiempo de vuelo, con moléculas más pequeñas que vuelan más rápido que las moléculas más grandes. El análisis total se completa en menos de 0.0001 segundos, habilitando muestras que van a ser analizadas en un total de 3-5 segundos que incluye recolección de datos repetitiva. El programa SpectroTYPER después calcula, registra, compara y reporta los genotipos a una velocidad de tres segundos por muestra .

Habitualmente, la "muestra de ácido nucleico" de la invención se aisla de una muestra biológica obtenida del sujeto, tal como sangre completa, suero, semen, saliva, lagrimas, orina, materia fecal, sudor, frotis bucal, piel y biopsias de músculo, hígado, tejido cerebral, tejido nervioso y pelo. La muestra de ácido nucleico puede ser una porción de un gen, una secuencia reguladora, ADN genómico, ADNc y ARN (que incluye ARNm, ARNmi y ARNr) .

Las muestras de ADN genómico habitualmente se amplifican antes de ponerse en contacto con una sonda. El ADN genómico se puede obtener de cualquier muestra biológica. La amplificación de ADN genómico que contiene un SNP genera una especie única de ácido nucleico si el individuo de quien se obtiene la muestra es homocigoto en el sitio polimórfico, o dos especies de ácido nucleico si el individuo es heterocigoto .

Las muestras de ARN con frecuencia también se pueden someter a amplificación. En este caso la amplificación típicamente está precedida por transcripción inversa. La amplificación de todo ARNm expresado se puede realizar como se describe, por ejemplo, en [39] y [40], las cuales se incorporan como referencia en su totalidad. La amplificación de una muestra de ARN a partir de una muestra diploide puede generar dos especies de moléculas objetivo si el individuo que proporciona la muestra es heterocigoto en el sitio polimórfico que se presenta dentro del ARN que se expresa, o posiblemente más si la especie del ARN se somete a empalme alternativo. La amplificación generalmente se puede llevar a cabo utilizando métodos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) conocidos en el ámbito. Los ácidos nucleicos en una muestra objetivo se pueden marcar en el · curso de amplificación por inclusión de uno o más nucleótidos etiquetados en la mezcla de amplificación. Las etiquetas también se pueden unir a productos de amplificación después de la amplificación (por ejemplo mediante etiquetado en el extremo) . El producto de amplificación puede ser ARN o ADN, en base en la enzima y los sustratos utilizados en la reacción de amplificación.

El genotipo de un polimorfismo individual comprende la suma de por lo menos dos alelos y pueden ser homocigotos (es decir, constituidos por alelos idénticos) o heterocigotos (es decir, constituidos por alelos diferentes) .

En algún aspecto de la invención, la muestra aislada de ácido nucleico de la presente invención se puede producir o sintetizar utilizando síntesis de ácido nucleico convencional o por métodos de ácido nucleico recombinante conocidos en el ámbito (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Ausubel et al. (2001, Current Protocols un Molecular Biology, Green & Wíley, New York) .

De manera sorprendente, los inventores de la presente invención han demostrado que la presencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida de un sujeto que padece de hepatitis C crónica es una indicación de que el sujeto presenta una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C.

De manera sorprendente los inventores de la presente invención también han demostrado que la presencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida de un sujeto infectado con hepatitis C es una indicación de que el sujeto presenta una susceptibilidad aumentada a eliminación no espontánea de hepatitis C.

Preferiblemente, por lo menos un SNP de la invención se localiza en el cromosoma 19 humano dentro de una región que comprende aproximadamente 80 kb. Los bloques de haplotipo mapeados muestran (figura 3) una fuerte asociación genética entre los SNP y: i) por una parte una susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto que padece de hepatitis C crónica, ii) y, por otra parte, una susceptibilidad aumentada a eliminación no espontánea de hepatitis C.

De manera más preferible, por lo menos un SNP de la invención se localiza en un segmento de ácido nucleico que consiste esencialmente en las regiones de ADN que flanquean el SNP que se selecciona del grupo que comprende la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5. SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7 , SEC ID NO : 8, SEC IC NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 30, SEC ID NO 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34 (como se incluye en la tabla 1) - La presente invención también contempla determinar la presencia o ausencia de por lo menos uno, es decir uno o más como se define en lo anterior, es decir, una combinación de un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto.

Preferiblemente, el marcador polimórfico es un sitio polimórfico asociado con por lo menos un SNP que se selecciona del grupo que comprende rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, s251910, rs7539953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, s30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480. De manera más preferible, el SNP se selecciona del grupo que comprende -G/T para rs8099917, G/G para rs8099917, C/G para rs576832, C/C para rs576832, G/A para rsl2980275 o G/G para rsl2980275.

De manera preferible también, en por lo menos un marcador polimórfico es un sitio polimórfico que está en desequilibrio de enlace completo o fuerte con por lo menos un SNP que se selecciona del grupo que comprende rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, S251910, rs7539953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, s30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480.

Por ejemplo, cuando el alelo G de rs8099917 está presente en un cromosoma (o una de las dos posiciones alélicas) confiere el genotipo heterocigoto G/T. En contraste, cuando está presente en los dos cromosomas (o posición alélica) confiere el genotipo homocigoto G/G.

En un aspecto, la muestra de ácido nucleico útil para la determinación del genotipo viral y la muestra de ácido nucleico útil para la determinación del polimorfismo, como se describe en la presente, son aisladas de la misma muestra biológica obtenida del sujeto. La muestra biológica - - después se prepara, por una parte, para el aislamiento de la muestra de ácido nucleico útil para determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico de la invención y, por otra parte, para determinar el genotipo viral HCV.

En otro aspecto, la muestra de ácido nucleico útil para la determinación del genotipo viral y la muestra de ácido nucleico útil para la determinación del polimorfismo, como se describe en la presente, se aislan de dos muestras biológicas diferentes obtenidas del sujeto. En este caso, la primera muestra biológica se prepara después para el aislamiento de la muestra de ácido nucleico útil para determinar la presencia o ausencia de por loo menos un marcador polimórfico de la invención mientras que la segunda muestra biológica se prepara para el aislamiento de la muestra de ácido nucleico útil para determinar el genotipo viral de HCV.

Estas dos muestras biológicas pueden ser de la misma naturaleza (por ejemplo, sangre completa en los dos casos) o diferentes (por ejemplo sangre completa y biopsia de hígado) .

El ácido nucleico de HCV, habitualmente ARN que va a ser analizado generalmente se aisla, se someta a transcripción inversa en ADNc y se amplifica, por ejemplo, por PCR como se describe en el documento WO 96/14839 y WO 97/01603. Se puede aplicar cualquier otra técnica conocida en el ámbito.

El "desequilibrio de enlace" (LD) describe una situación en la cual algunas combinaciones de alelos o marcadores genéticos se producen más o menos frecuentemente en una población que se esperaría de una formación aleatoria de haplotipos a partir de alelos basados en sus frecuencias. Cuando un alelo particular en un locus se encuentra junto con el mismo cromosoma con un alelo específico en un segundo locus, con mayor frecuencia que la esperada si los loci son segregantes independientemente en una población - los loci están en desequilibrio. Este concepto de LD se ha formalizado por una de las primeras mediciones de desequilibrio que se han propuesto (simbolizada por D) . D, en común con la mayor parte de las otras medidas de LD, cuantifica el desequilibrio como la diferencia entre la frecuencia observada de un haplotipo de dos locus y la frecuencia que se esperaría para mostrar si los alelos están segregando de manera aleatoria. Adoptando la notación estándar para dos loci adyacentes A y B, con dos alelos (A, a y B, b) en cada locus, la frecuencia observada del haplotipo que consiste de los alelos A y B está representada por PAB. Suponiendo la asignación independiente de alelo en los dos loci, se calcula la frecuencia de halotipo esperada como el producto de la frecuencia de alelo de cada uno de los dos alelos, o PAxPB, en donde PA es la frecuencia del alelo A en el primer locus y PB es la frecuencia del alelo B en el segundo locus. De este modo, una de las medidas más sencillas de desequilibrio es D = PAB -PAxPB. Se genera LD cuando se produce una mutación nueva en un cromosoma que presenta un alelo particular en un locus cercano, y se erosiona gradualmente por recombinación. Las mutaciones de corriente también pueden disminuir la asociación entre alelos en los loci adyacentes. La importancia de recombinación en patrones de conformación de los LD es reconocida por el apodo de "enlace". El grado de LD en poblaciones se espera que disminuya tanto con el tiempo (t) como con la distancia recombinatoria (r o fracción de recombinación) entre marcadores. Teóricamente, LC disminuye con el tiempo y la distancia de acuerdo con la siguiente fórmula en donde DO es el grado de desequilibrio en algún punto inicial y Dt es el grado de desequilibrio t generaciones después: Dt = (l-r)tDO.

Se han propuesto una amplia variedad de procedimientos estadísticos para medir la cantidad de LD y estos tienen diferentes potencias dependiendo del contexto. Auque la medida D tiene los conceptos intuitivos de LD, su valor numérico es de poco uso para medir la fuerza y para comparar niveles de LD. Esto se debe a la dependencia de D de las frecuencias de alelo. Las dos medidas más comunes son el valor absoluto de D' y r2.

El valor absoluto de D' se determina al dividir D entre su valor posible máximo dada las frecuencias de alelo en los dos loci. El caso de D' = 1 se conoce como LD completo. Valores de D'<1 indican que se han roto en LD ancestral completo. La magnitud de los valores de D'<1 no tiene interpretación clara. Los cálculos de D1 se amplían fuertemente en muestras pequeñas. Por lo tanto, valores estadísticamente significativos de D que sean cercanos a uno proporcionan una indicación útil de recombinación histórica mínima, pero valores intermedios no deben ser utilizados para comparaciones de la fuerza de LD entre estudios o para medir el grado de LD.

La medida r2 en algunas maneras es complementaria a D' . El valor r2 es igual a D2 dividido entre el producto de las frecuencias de alelo en los dos loci. Hill y Roberson dedujeron que E [r2] = 1/1 + 4Nc en donde c es la tasa de recombinación en unidades morgan entre dos marcadores y N es el tamaño de población efectivo. Esta ecuación ilustra dos propiedades importantes de LD. En primer lugar, los niveles esperados de LD son una función de recombinación. Cuanto mayor sea la recombinación entre dos sitios más probablemente serán barajados con respecto uno al otro, disminuyendo LD. En segundo lugar, LD es una función de N, enfatizando que LD es una propiedad de poblaciones.

En la presente solicitud, el desequilibrio de enlace fuerte presenta una correlación denominada r2 de por lo menos 0.6 y/o una D' de 0.5 con los SNP en el conjunto de datos Hap ap European y/o en la población analizada experimentalmente por los inventores.

De acuerdo con la presente invención, si el rs8099917 alelo G o rs576832 C está presente (en uno o dos ejemplares) esto es una indicación de que el sujeto que padece de hepatitis C crónica presenta una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C. La presencia de dos ejemplares de rs8099917 alelo G o rs576832 C, en vez de un alelo, en comparación con ningún alelo G o C (respectivamente) incrementa aún más el riesgo de carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C.

De manera similar, si está presente rs8097917 alelo G o rs576832 C (en uno o dos ejemplares), esto es una indicación de que un sujeto infectado con hepatitis C tiene una susceptibilidad aumentada a eliminación no espontánea de hepatitis C (o a evolucionar en hepatitis C crónica) . La presencia de dos ejemplares de rs8099917 alelo G o rs576832 C, en vez de un alelo, en comparación con alelo no G o C (respectivamente) incrementa aún más el riesgo de eliminación no espontánea.

Por otra parte, los pacientes quienes presentan el riesgo de alelo G de rsl2980275 es más probable que sean pacientes que no responden en comparación con otros pacientes (OR = 1.99, 95% CI 1.57-2.54, P = 1.74E-8). Esta asociación aún es significativa después de ajuste para covariaciones relevantes (edad, sexo, genotipo de HCV, estado de gravedad de fibrosis y carga viral de HCV, ajustada P = 4.61E-09). De manera similar, los pacientes quienes presentan los genotipos A/G y G/G es más probable que no respondan en comparación con los portadores A/A (OR = 2.65 [95% CI: 2.18-3,18], P = 2.67E-7, ajustado P = 9.90E-8 para A/G; o = 3.68, [95% ci : 2.77-4.88]. P = 4.05E-6, ajustado P = 1.13E-5 para G/G, utilizando A/A como una referencia) .

También se ha encontrado que la asociación entre la presencia de los SNP y la susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C o con eliminación no espontánea se observa tanto en individuos monoinfectados con HCV como coinfectados con HCV/VIH.

Se debe hacer notar que los SNP indicados en tabla 1 entre corchetes no están en un orden particular relación a los alelos natural versus riesgo (menor) y por tanto no son indicativos o limitantes a este respecto.

Generalmente, el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón. De manera más preferible, el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que consiste de INFa, IFNA o cualquier interferón pegilado. Habitualmente, el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina. Las combinaciones alternativas pueden incluir medicamentos antiproteasa u otros medicamentos antivirales.

En la presente invención se incluye adicionalmente un método para determinar la susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método comprende: i) distinguir en los sujetos aquellos que tienen susceptibilidad o carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C al determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en los locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto presenta una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C, ii) establecer un régimen de tratamiento de hepatitis C.

La determinación del polimorfismo en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica permitirá al médico establecer el mejor régimen de tratamiento de hepatitis C para el sujeto (naturaleza, dosis y duración de tratamiento de hepatitis C y/u otros medicamentos antivirales) . Por ejemplo, si el método anterior muestra que por lo menos un SNP está presente en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto, indicando que el sujeto presenta una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C, entonces este sujeto se puede considerar un buen candidato para estrategias de tratamiento más novedosas (tal como tratamiento con dosis más elevadas de los medicamentos disponibles actualmente, duración de tratamiento más prolongado con los medicamentos disponibles actualmente y/o medicamentos más nuevos) .

Adicionalmente, los inventores han encontrado que un sujeto infectado con HCV genotipo 1 ó 4 presenta por lo menos un SNP en el locus IL28B/A y/o IL-29 de la invención, particularmente en condición homocigótica, presentará una probabilidad muy baja de eliminación inducida por tratamiento (es decir, "respuesta a tratamiento" o "éxito del tratamiento") , como se muestra tanto en la tabla 4 como en la 5. La tabla 4 proporciona datos más específicos respecto a la distribución de cada genotipo (TT, GT y GG) en la población infectada mientras que la tabla 5 considera la presencia o ausencia de un alelo de riesgo. Simplemente se hace notar que las tablas 4 y 5 se basan en números ligeramente diferentes de pacientes en los diversos grupos. Por ejemplo, la tabla 5 muestra que entre los pacientes infectados con los genotipos 1 o 4, la falla de tratamiento se presenta en 72% de los portadores del alelo de riesgo infectados, en comparación con solo 38% de los no portadores (OR = 6.54 [95% CI; 4.65-9.20]. P = 3.70E-8). Desde otro punto de vista, se debe hacer notar que la falla de tratamiento se presenta en solo 16% de los pacientes tanto con parámetros de bajo riesgo (es decir, aquellos infectados con el genotipo viral 2 y 3 y en donde rs8099917 G alelo está ausente del locus IL28B) en comparación con 72% entre aquellos con ambos parámetros de alto riesgo (es decir, aquellos infectados con el genotipo viral 1 y 4 y en donde rs8099917 G alelo está presente en el locus IL28B) (OR 18.89 [95% CI: 12.87-27.71]. P = 1.84E-14).

Estos resultados también muestran una asociación entre las variaciones genéticas en el locus IL28B/A y la respuesta a la terapia (por ejemplo tratamiento basado en interferón) entre sujetos infectados con HCV genotipos 2 ó 3 (OR = 3.32 [95% CI: 2.21-4.99], P = 3.27E-3). La fuerza de esta asociación no obstante es menor que en el caso de sujetos infectados con HCV genotipos 1 ó 4. Estas presentaciones demuestran que el conocimiento tanto del genotipo viral como de los polimorfismos del hospedador son importantes para predecir respuesta al tratamiento.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención comprende las determinaciones combinadas del genotipo viral y de la determinación del polimorfismo como se describe en la presente en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, de manera que determina con mayor precisión la susceptibilidad a la carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C o la susceptibilidad a carencia de eliminación espontánea de sujetos infectados con HCV.

Estas determinaciones combinadas se pueden presentar de manera concomitante o no. Si no es concomitante, el genotipo viral se puede determinar primero y después, después de un tiempo determinado, la determinación del polimorfismo como se describe en la presente se lleva a cabo. También se considera que la determinación del polimorfismo como se describe en la presente se produce primero y después, después de un tiempo determinado se establece el genotipo viral .

Habitualmente, el tiempo determinado, el cual es el tiempo o duración transcurrido entre la determinación del genotipo viral y la determinación del polimorfismo (y viceversa) puede estar comprendido entre algunos segundos y varios años.

También se abarca en la presente invención un equipo para determinar la susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica de acuerdo con la presente invención, el equipo comprende i) reactivos para detectar selectivamente la presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, y ii) instrucciones para uso.

En la presente invención se abarca también un equipo para determinar la susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C de acuerdo con la presente invención, el equipo comprende: i) reactivos para detectar selectivamente la presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, y ii) instrucciones para uso.

De manera alternativa, los reactivos utilizados en los equipos comprenden un ácido nucleico aislado, preferiblemente un cebador, un conjunto de cebadores o un arreglo de cebadores, como se describe en otra parte en este documento. Los cebadores pueden estar fijos a un sustrato sólido. Los equipos pueden comprender además un ácido nucleico objetivo control y cebadores. Una persona experta en el ámbito, si experimentos indebidos, será capaz de seleccionar los cebadores de acuerdo con los requerimientos habituales. Los ácidos nucleicos aislados del equipo pueden comprender una etiqueta o marca molecular.

Habitualmente, el cebador, conjunto de cebadores o arreglo de cebadores se dirigen para detectar la presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A y/o IL-29.

La presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A puede, por ejemplo, pero no de manera exclusiva ser determinado utilizando un conjunto de cebadores de PCR o cebadores de secuenciado que se seleccionan de aquellos descritos en la tabla 6 (SEC ID NO: 35 a 58) .

Además de los cebadores, el conjunto de cebadores o arreglo de cebadores dirigidos para detectar la presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A y/o IL-29 a partir de una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida de un sujeto, los reactivos del equipo pueden comprender, por ejemplo, otro cebador, conjunto de cebadores o arreglo de cebadores dirigidos para detectar por separado el genotipo viral aislado de una muestra biológica obtenida de un sujeto. Este conjunto de cebadores o arreglos de cebadores utilizados generalmente se conocen en el ámbito o se pueden generar fácilmente conociendo los requerimientos habituales.

En modalidades adicionales, los equipos de la presente invención comprenden diversos reactivos tales como amortiguadores necesarios para llevar a la práctica los métodos de la invención, como se conocen en el ámbito.

Estos reactivos o amortiguadores pueden ser útiles, por ejemplo, para extraer y/o purificar el material nucleico de la muestra biológica obtenida del sujeto.

El equipo también puede comprender todo el material necesario tal como tubos de microcentrifuga necesarios para llevar a la práctica los métodos de la invención.

La invención contempla además un método para tratar un paciente para hepatitis C crónica que comprende: i) determinar su por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del paciente que se selecciona del grupo que comprende rsll879005,. rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, s251910, rs7539953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, s30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii) y tratar al paciente en base en si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está asociado con susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta al tratamiento para hepatitis C.

Generalmente, el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón. De manera más preferible, el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que comprende IFNa, INFNA o cualquier interferón pegilado. Habitualmente, el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina. Las combinaciones alternativas pueden incluir medicamentos antiproteasa u otros medicamentos antivirales.

La invención también considera un método para determinar una susceptibilidad a carencia de respuesta a citomegalovirus (CMV) , virus de herpes simple 1 ó 2 (HSV-1 o HSV-2) , virus de hepatitis B (HBV) o tratamiento para el virus de influenza, o eliminación espontánea en un sujeto infectado con uno o más de este o estos virus, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un polimorfismo nucleotidico único (SNP) en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto.

Los expertos en el ámbito apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible a variaciones y modificaciones además de las descritas - - específicamente. Debe entenderse que la invención incluye la totalidad de las variaciones y modificaciones sin por esto apartarse del espíritu o características esenciales del mismo. La invención también incluye la totalidad de las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en esta especificación, de manera individual o colectiva y cualquiera y la totalidad de las combinaciones en cualquiera dos o más de las etapas o características. Por lo tanto, la presente descripción debe considerarse en todos los aspectos como ilustrada y no restrictiva, el alcance de la invención está indicada por las reivindicaciones anexas y todos los cambios los cuales se encuentren dentro del significado y alcance de equivalencia se pretende que estén abarcados por la misma.

Se mencionan diversas referencias en esta especificación, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

La siguiente descripción se entenderá de manera más completa con referencia a los siguientes ejemplos. No obstante, tales ejemplos son ejemplares de los métodos para llevar a la práctica la citada invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Pacientes y métodos Los pacientes se incluyen dentro de la infraestructura del estudio del grupo de hepatitis C Swiss (SCCS) y el estudio del grupo VIH Swiss (SHCS) , dos estudios de centros múltiples llevados a cabo en ocho hospitales en suiza y sus centros afiliados locales [23] . Para la inclusión en el estudio era obligatorio consentimiento informado escrito que incluye pruebas genéticas y el estudio se aprobó por todos los comités éticos locales. Debido a los diferentes elementos de predicción genéticos de los resultados de hepatitis C en poblaciones racialmente diversas [10, 13, 24, 25] , los inventores limitaron el análisis a personas caucásicas. Se debe hacer notar únicamente que los genotipos 1, 2, 3 y 4 estaban presentes en este estudio.

Eliminación espontánea de hepatitis C La infección crónica por HCV se define como seropositividad a HCV (utilizando la prueba de ELISA y confirmado por inmunotransferencia ( Immunoblot ) ) y ARN de HCV detectable por análisis cuantitativos. La eliminación espontánea de hepatitis C se define como seropositividad a HCV y ARN de HCV no detectable antes del inicio del tratamiento contra HCV. Para evitar las fluctuaciones de los niveles de ARN de HCV durante el primer año de infección (revisado en [26] ) , los inventores determinaron los niveles de ARN de HCV por lo menos 1 año después de la primera serologia HCV positiva documentada.

Determinación del genotipo La determinación del genotipo se realizó utilizando la plataforma genómica Illumina en el National Centre of Competence in Research "Frontiers in Genetics", en Ginebra, Suiza, mediante la utilización del equipo Illumina HumanlM-Dúo BeadChip, HumanHap550 o Human600 -Quad. La llamada de genotipo se realizó utilizando ajustes implícitos del programa Beadstudio. Las llamadas con clasificación de determinación de genotipo inferiores a 0.2 se excluyeron de análisis adicional. Los SNP con una tasa de llamada inferior a 90% y los individuos con una tasa de llamada inferior a 95% se eliminaron por filtración. La imputación se llevó a cabo utilizando MACH basada en los SNP medidos con >90% de tasa de llamada, frecuencia de alelo menor (MAF) > 1%, valor p de Ardy-Weinberg >10~7. En los datos introducidos resultantes, los SNP con una baja precisión de imputación (r2-hat<0.3) se ignoraron. La estratificación de la población y la determinación de la relación se determinó utilizando los componentes principales de ancestros como se describe en [28] . Se excluyó de un análisis adicional uno de cada par individual genéticamente relacionado/idéntico (nivel de relación >0.25) . Se determinó el sexo de cada individuo sometido a determinación de genotipo para concordancia con los datos clínicos. Se realizó análisis de asociación utilizando regresión logística con cálculo de probabilidad máxima exacta. Las covariaciones tales como los primeros dos valores de componente principal y el estado de infección por virus de hepatitis B (definido como la presencia o ausencia de HBs-Ag) se incluyeron en el modelo. Se utilizó la corrección de Bonferroni para controlar la tasa de error relacionada con la familia. Se supusieron un millón de pruebas independientes [Han et al 2009 Píos Genetics] lo que proporciona el umbral utilizado habitualmente de 5*10~8.

Influencia de coinfección por VIH Para tomar en consideración la influencia potencial de coinfección por VIH en la eliminación espontánea de HCV, se analizaron primero por separado individuos monoinfectados con HCV y coinfectados y posteriormente los inventores meta-analizaron por amplitud de genoma los dos grupos. Las señales de asociación obtenidas de cada grupo se meta-analizaron utilizando ponderación de varianza inversa. El análisis de asociación se realizó utilizando un modelo de regresión logístico con cálculos de probabilidad máxima exacta. Las covariaciones influyen en el resultado en el análisis univariable (P<0.1), junto con los primeros dos componentes principales ancestrales se incluyeron en el modelo. Los inventores utilzaron un limite de valor p moderado como un criterio de inclusión para covariaciones con el fin de no descartar factores potencialmente importantes. Para tomar en consideración el hecho de que se utilizaron diferentes plataformas de determinación de genotipo, los inventores excluyeron cualquier SNP cuya frecuencia de alelo (entre pacientes con infección crónica) fuera significativamente diferente (prueba de ?2, P<10-4) entre cualesquiera dos plataformas .

El control genómico se aplicó a valores p de amplitud de genoma lo que proporciona ? = 1.04 (para el grupo monoinfectado) y 1.02 (para el grupo coinfectado).

Estos valores sugieren una inflación ligera y confirmaron que la posible estratificación de la población está corregida lo suficiente al incluir los primeros dos componentes principales de ancestro en los modelos. Se utilizó la corrección de Bonferroni para ajustar la prueba múltiple; se utilizó un valor de 5*10-8 como umbral de significancia .

EJEMPLO 2 Resultados El estudio incluyó 1142 pacientes infectados con HCV (726 monoinfectados y 416 coinfectados con VIH) de entre quienes 245 presentaron eliminación viral espontánea y 897 presentaron infección crónica (Tabla 3) . Entre los pacientes infectados de manera crónica, 404 son susceptibles para respuesta a tratamiento combinado de a interferón pegilado y ribavirina. Como se esperaba, los factores asociados con eliminación espontánea incluyen edad más grande (P<0.001), sexo femenino (P<0.001) y hepatitis B activa (P<0.001). Los factores asociados con respuesta al tratamiento incluyen edad menor (P=0.05), sexo femenino (0.03), genotipo viral 2 ó 3 (P<0.001), carga viral menor (P<0.001) y fibrosis limitada (P=0.02) .

Los SNP rs8099917 se asocian claramente con eliminación espontánea de hepatitis C (Figura 1) . La frecuencia de los genotipos T/T (alelo ancestral), G/T (heterocigoto) y G/G (homocigoto) son de 0.79, 0.20 y 0.01 entre pacientes con eliminación espontánea, versus 0.57, 0.38 y 0.05 entre aquellos con infección crónica, respectivamente (OR = 0.38, 95% de intervalo de confianza [CI] 0.27-0.53, P=2.86E-08, bajo el modo aditivo, Tabla 4, Figura 2A) . La asociación de rs8099917 con eliminación espontánea aún está presente en un análisis de multivariación de acuerdo con la edad, sexo, hepatitis B activa y grupo de riesgo con HCV (OR=0.38, 95% CI 0.28-0.53, P=6.81E-09, bajo el modo aditivo, Tabla 4) .

El alelo G de rs8099917 también está asociado con carencia de respuesta al tratamiento combinado de -interferón pegilado y ribavirina (Figura 2B) . Las frecuencias de los genotipos T/T, G/T y G/G son de 0.68, 0.29 y 0.03 entre pacientes con respuesta viral sostenida versus 0.43, 0.50 y 0.07 entre quienes no responden, respectivamente (OR=0.36, 95% CI 0.23-0.53, P=8.96E-07, bajo el modo dominante, OR=0.38, 95% CI 0.27-0.53, P=2.86E-06, bajo el modo aditivo, Tabla 4, Figura 2B) . La asociación de rs8099917 con la carencia de respuesta a tratamiento aún está presente en un modelo de multivariación que toma en consideración la edad, sexo, ARN de HCV, genotipo de HCV, etapa de fibrosis y diabetes (OR = 0.29, 95% CI 0.16-0.53, P=6.96E-05, bajo el modo aditivo). En general, existe un incremento progresivo en la frecuencia de alelo menor de rs8099917 entre pacientes con eliminación espontánea (0.07), respuesta viral sostenida (0.17) y quienes no responden al tratamiento (0.32).

El SNP rs8099917 se localiza dentro de una región ~80kB en el brazo largo del cromosoma 19 humano (en caso de que el sujeto sea un humano) que codifica para tres genes para citocina, es decir, IL28B, IL28A e IL29 (Figura 3A) . El mapeo de los bloques de haplotipos muestra que rs8099917 es parte de un bloque de haplotipos que abarcan la totalidad del gen IL28B. Una representación gráfica de los valores P de los diferentes SNP muestra un patrón de asociación concordante tanto para la eliminación espontánea como la respuesta al tratamiento en el bloque de haplotipo IL28B (Figura 3B) . La asociación se observó en individuos monoinfectados con HCV (OR=2.49, 95% CI=1.64-3.79, P=l.96*10-5) asi como en individuos coinfectados con HCV/VIH (OR=2.16, 95% CI=1.47-3.18, P=8.24*10-5) . En el caso de eliminación espontánea, la Tabla 4 muestra una distribución de los diversos genotipos entre los grupos de pacientes monoinfectados y coinfectados y la frecuencia de eliminación asociada.

EJEMPLO 3 Determinante de riesgo genético de patógeno Los inventores determinaron además la contribución conjunta del hospedador y los determinantes de riesgo genéticos del patógeno. Se estratificaron a los pacientes en cuatro grupos de acuerdo con los genotipos virales (genotipos virales 2 ó 3 versus genotipos virales 1 ó 4) y polimorfismos del hospedador (hospedadores portadores del alelo de riesgo rs8099917 G versus no portadores, Tabla 5) . La falla de tratamiento se presentó en sólo 16% de los pacientes con ambos parámetros de riesgo bajo, en comparación con 72% entre aquellos con ambos parámetros de riesgo alto (OR=18.89 [95% CI: 12.87-27.71], P=1.84E-14, Tabla 5). Entre los pacientes infectados con los genotipos 1 ó 4, la falla de tratamiento se presentó en 72% de los portadores de alelo de riesgo infectados en comparación con sólo 38% de los no portadores (OR=6.54 [95% CI: 4.65-9.20], P=3.70E-8). Entre pacientes infectados con los genotipos 2 ó 3, la falla de tratamiento se presenta en 25% de los portadores de alelo de riesgo en comparación con 16% de no portadores (OR=3.32 [95% CI : 2.21-4.99], P=3.27E-3) . Nuevamente, la Tabla 4 muestra una distribución de los diversos genotipos (TT, TG, GG) entre los grupos de pacientes infectados con genotipos virales 1 y 4 ó 2 y 3, respectivamente, y las frecuencias correspondientes de respuesta o carencia de respuesta al tratamiento.

Notas para la Tabla 2 Debe hacerse notar que los alelos naturales/de riesgo de los SNP que se proporcionan en la Tabla 2 se pueden leer en la misma cadena o en una cadena opuesta en comparación con la secuencia correspondiente mencionada en la Tabla 1.

Notas para la Tabla 3 """SCCS significa estudio del grupo de hepatitis C Swiss y SHCS indica estudio del grupo de VIH Swiss; 38 pacientes SCCS infectados con VIH se analizaron junto con pacientes SHCS. 2Antigeno HBs se perdió en 352 pacientes monoinfectados y 56 coinfectados. 3E1 ARN de HCV en el punto establecido (para determinación de criterio de valoración de eliminación) y antes del tratamiento (para criterios de valoración de tratamiento) . 4Bebedor fuerte se define como el uso de más de 40 g de alcohol al dia durante más de 5 años. 5Los datos de biopsia antes del tratamiento se perdieron en 128 pacientes. La fibrosis grave e inflamación se determinó por calificación METAVIR >2.

Notas para la Tabla 4 1Modelo más probable 2Ajustado para edad, sexo, HBs AG y tipo de riesgo. 3Ajustado para edad, sexo, ARN de HCV, genotipo de HCV, etapa de fibrosis y diabetes 4Ajustado para edad, sexo, ARN de HCV, etapa de fibrosis y diabetes Notas para la Tabla 5 •""Ajustado para etapa de fibrosis, sexo, edad, carga viral de HCV de valor inicial y los primeros dos componentes principales de ancestros. 2Cuando se analizan los pacientes con los genotipos 1 a 4, la falla de tratamiento se produce en 72% de portadores de alelo de riesgo en comparación con solo 38% de no portadores (OR=6.54 [95% CI : 4.65-9.20], P=3.70E-8).

Tabla 2 10 15 Tabla 3. Datos Demográficos de los Pacientes pacientes monoinfectados con HCV pacientes co-infectados (SHCS)1 respuesta a tratamiento (SC (SCCS) características eliminación infección P eliminación infección P pacientes que pacientes (N, proporción) espontánea crónica espontánea crónica responden de que no manera responden sostenida N 42 684 207 231 257 147 edad (mediana, IQR) 37 (9) 45(15) <0.0C 39 (8) 39(10) 0.3 44(16) 47(13) sexo masculino 19 (0.45) 419(0.61) 0.04 108 (0.52) 157(0.68) <0.001 150 (0.58) 102 (0.62) raza blanca 42 (1.0) 684(1.0) 207(1.0) 231 (1.0) 257(1.0) 147(1.0) grupo de riesgo 5 uso de drogas 23 (0.52) 291 (0.43) Ref. 160 (0.77) 176(0.76) Ref. 104 (0.40) 58 (0.39) transfusión 4 (0.09) 136 (0.19) 0.09 2(0.01) 4 (0.02) 0.5 46 (0.18) 28 (0.19) procedimiento invasivo 9(0.21) 170 (0.24) 0.4 58 (0.23) 31 (0.21) otro/desconocido 7(0.17) 87 (0.13) 0.9 45 (0.22) 51 (0.22) 0.9 49 (0.19) 30 (0.20) antígeno HB positivo2 2 (0.07) 6 (0.02) 0.06 21 (0.11) 8 (0.04) 0.01 5 (0.03) 1 (0.01) 10 VIH positivo 0(0) 0(0) 207(1.0) 231 (1.0) 8 (0.04) 0(0) genotipos de HCV 1 334 (0.49) 95 (0.41) 81 (0.32) 91 (0.62) 2 72 (0.11) 7 (0.03) 48 (0.19) 6 (0.04) 3 180 (0.26) 69 (0.30) 106 (0.41) 21 (0.14) 15 4 62 (0.09) 24 (0.10) 14(0.05) 16(0.11) otro/desconocido 36 (0.05 36 (0.16) 8 (0.03) 13(0.09) Log de ARN de HCV 5.8(1.0) 5.8(1.3) 6.0 (0.9) (mediana, IQR)3 bebedor 83 (0.33) 57 (0.40) consetudinario4 biopsia de hígado5 fibrosis grave 50(0.29) 45(0.43) inflamación grave 35 (0.20) 20 (0.20) esteatosis 120(0.69) 73(0.75) 10 15 Tabla 4. Asociación de Polimorfismos en el Locus IL28A/B con Eliminación Viral eliminación no eliminación univariante multivariante grupo/criterio de genotipos N frecuencia N frecuencia herencia OR (95% Cl) P OR (95% Cl) P valoración rs8099917 monoinfectados TT 36 0.86 380 0.56 Rec. 0.21 (0.09-0.50) 4.84E-04 0.20 (0.08-0.49) 4. espontáneos GT 6 0.14 268 0.39 Dom. 0.21 (0.09-0.50) 4.84E-04 0.20 (0.08-0.49) 4.

GG 0 0.00 34 0.05 Add. 0.24 (0.10-0.57) 1.29E-031 0.21 (0.09-0.51 ) 5. co-infectados TT 158 0.78 131 0.62 Rec. 0.20 (0.04-0.93) 0.04 0.20 (0.04-0.95) 0. espontáneos GT 43 0.21 72 0.34 Dom. 0.46 (0.30-0.70) 3.43E-04 0.45 (0.29-0.70) 4.

GG 2 0.01 10 0.05 Add 0.50 (0.32-0.77) 1.88E-031 0.47 (0.31 -0.70) 2. todos TT 194 0.79 511 0.57 Rec. 0.16 (0.04-0.66) 0.01 0.16 (0.04-0.68) 0. espontáneos GT 49 0.20 340 0.38 Dom. 0.35 (0.25-0.49) 8.60E-10 0.36 (0.25-0.51 ) 1.

GG 2 0.01 44 0.05 Add 0.38 (0.27-0.53) 2.86E-081 0.38 (0.28-0.53) 6. respuesta a sin respuesta a I univariante multivariante tratamiento tratamiento grupo/criterio de genotipos N frecuencia N frecuencia herencia OR (95% Cl) P OR (95% Cl) P valoración rs8099917 todos TT 174 0.68 63 0.43 Rec. 0.39(0.14-1.04) 0.06 0.67(0.15-2.95) 0. respuesta a GT 74 0.29 74 0.50 Dom. 0.35(0.23-0.53) 8.96E-071 0.20(0.10-0.40) 7. tratamiento GG 7 0.03 10 0.07 Add 0.36(0.23-0.56) 4.10E-06 0.29(0.16-0.53) 6. SCCS Gen.1 y 4 TT 67 0.72 42 0.39 Rec. 0.12(0.01-0.95) 0.04 0.76(0.07-8.40) 0. respuesta a GT 25 0.27 56 0.52 Dom. 0.25(0.14-0.46) 5.46E-061 0.29(0.12-0.71) 6. tratamiento GG 1 0.01 9 0.08 Add 0.28(0.15-0.51) 4.17E-05 0.35(0.15-0.81) 1. SCCS Gen.2 y 3 TT 101 0.66 15 0.56 Rec. 0.66 (0.29-1.50) 0.3 respuesta a GT 47 0.31 12 0.44 Dom. 0.66(0.29-1.50) 0.3 tratamiento GG 6 0.04 Add 0.58(0.25-1.34) 0.2 10 15 - Tl - TABLA 5. Análisis conjunto de determinantes genéticos virales y del hospedador de la respuesta de tratamiento Falla del Exito de Porcentaje OR (95% CI)1 Valor P tratamiento tratamiento del falla N Frec N Frec Genotipo Alelo G de IL28B de HCV rs8099917 2/3 Ausente 29 0.13 154 0.40 2/3 Presente 26 0.12 79 0.21 3.32 (2.21- Ref. 4.99) 3.27E- 03 1/4 Ausente 66 0.30 109 0.29 38%2 3.23 (2.25- 1.17E- 4.64) 03 18.89 (12.87- 27.71 ) 1/4 Presente 101 0.46 39 0.10 72%' 1.84E- 14 TABLA 6. Cebadores de PCR y secuenciado (locus IL2 - - REFERENCIAS (1) Seeff LB, . Hollinger FB, Alter HJ, right EC, Cain CM, Buskell ZJ, et al. Long-term mortality and morbidity of transfusion-associated non-A, non-B, and type C hepatitis: A National Heart, Lung, and Blood Institute collaborative study. Hepatology 2001 Feb; 33 (2 ): 455-463. (2) Davila JA, Morgan RO, Shaib Y, McGlynn KA, El Serag HB. Hepatitis C infection and the increasing incidence of hepatocellular carcinoma: a population-based study. 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Claims (48)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar una susceptibilidad a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C.

3. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico se localiza en el cromosoma 19 dentro de una región que comprende aproximadamente 80 kb.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico se localiza en un segmento de ácido nucleico que consiste en las secuencias que se seleccionan del grupo que comprende la SEC ID NO: 1 a la SEC ID NO: 34.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico es un sitio polimórfico asociado con por lo menos un SNP que se selecciona del grupo que comprende rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico es un sitio polimórfico que está en desequilibrio de enlace completo o fuerte con por lo menos un SNP que se selecciona del grupo de conformidad con la reivindicación 5.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico es una combinación de por lo menos dos SNP que se seleccionan del grupo de conformidad con la reivindicación 5.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico se selecciona del grupo que comprende -G/T para rs8099917, G/G para rs8099917, C/G para rs576832, C/C para rs576832, G/A para rsl2980275 o G/G para rsl2980275.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que comprende IFNa, IFNA o cualquier interferón pegilado.

11. El método de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina o cualquier medicamento antiproteasa o cualquier otro medicamento antiviral o cualquier combinación de los mismos.

12. El método de conformidad con las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la hepatitis C crónica es causada por un genotipo viral 1, 2, 3 ó 4 de HCV.

13. El método de conformidad con cualquiera' de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende además determinar el genotipo viral de HCV en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica del sujeto.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el sujeto está coinfectado con VIH.

15. Un método para determinar una susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C, el método comprende determinar la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico dentro del locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del su eto .

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a eliminación no espontánea de hepatitis C.

17. El método de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, en donde por lo menos un marcador polimórfico se localiza en el cromosoma 19 dentro de una región que comprende aproximadamente 80 kb.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico se localiza en un segmento de ácido nucleico que consiste esencialmente en las secuencias que se seleccionan del grupo que comprende la SEC ID NO: 1 a la SEC ID NO: 34.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico es un sitio polimórfico asociado con por lo menos un SNP que se selecciona del grupo que comprende rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque por lo menos un marcador polimórfico es un sitio polimórfico que está en desequilibrio de enlace completo o fuerte con por lo menos un SNP que se selecciona del grupo de conformidad con la reivindicación 19.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque el marcador polimórfico es una combinación de por lo menos dos SNP que se seleccionan del grupo de conformidad con la reivindicación 19.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque el marcador polimórfico se selecciona del grupo que comprende -G/T para rs8099917, G/G para rs8099917, C/G para rs576832, C/C para rs576832, G/A para rsl2980275 o G/G para rsl2980275.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque la hepatitis C es causada por un genotipo viral 1, 2, ó 4 de HCV.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, caracterizado porque comprende además determinar el genotipo viral de HCV en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del su eto .

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24, caracterizado porque el sujeto está coinfectado con VIH.

26. Un método para tratar a un paciente para hepatitis C crónica, caracterizado porque comprende: i) determinar si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está en el locus IL-28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del paciente en donde por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente se selecciona del grupo que comprende: rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii) y tratar al paciente en base en si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está asociado con susceptibilidad aumentada a la carencia de respuesta al tratamiento de hepatitis C.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que comprende IFNa, IFNA o cualquier interferón pegilado.

29. El método de conformidad con las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina o cualquier medicamento antiproteasa o cualquier otro medicamento antiviral o cualquier combinación de los mismos.

30. Un método para tratar a un paciente para hepatitis C crónica, caracterizado porque comprende: i) determinar si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente está en el locus IL-28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del paciente, en donde por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente se selecciona del grupo que comprende: rsll879005, rsl2975799, rsll083519, rs955155, rsl2972991, rsl2980275, rs8105790, rsll881222, rsl0853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rsl6973285, rsl0853728, rs4803223, rsl2980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rsll671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rsll665818, rs570880, rs503355, rs30461, rsl94014, rs251903, rsl2979175, rs39587, rs30480, ii) determinar el genotipo viral de HCV en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del paciente, iii) y tratar al paciente en base en si por lo menos uno de los marcadores polimórficos del paciente y el genotipo viral de HCV está asociado con susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que comprende IFN , IFNX o cualquier interferón pegilado.

33. El método de conformidad con las reivindicaciones 31 ó 32, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina o cualquier medicamento antiproteasa o cualquier otro medicamento antiviral o cualquier combinación de los mismos.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizado porque el paciente está coinfectado con VIH.

35. Un método para determinar una susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C en un sujeto que padece de hepatitis C crónica, el método está caracterizado porque comprende: i) distinguir en los sujetos aquellos que tienen una susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C mediante la determinación de la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica del sujeto, la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto presenta una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C, ii) establecer un régimen de tratamiento de hepatitis C.

36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón.

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que comprende IFNor, IFNX o cualquier interferón pegilado.

38. El método de conformidad con las reivindicaciones 36 ó 37, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina o cualquier medicamento antiproteasa o cualquier otro medicamento antiviral o cualquier combinación de los mismos.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque el sujeto está coinfectado con VIH.

40. Un método para determinar una susceptibilidad a una carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C en un sujeto quien padece de hepatitis C crónica, el método está caracterizado porque comprende: i) distinguir en los sujetos aquellos que tienen una susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C al determinar: la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, la presencia de por lo menos un marcador polimórfico es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C, y el genotipo viral de HCV, la presencia del genotipo 1 a 4 es una indicación de que el sujeto tiene una susceptibilidad aumentada a carencia de respuesta a tratamiento de hepatitis C, ii) establecer un régimen de tratamiento de hepatitis C.

41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el tratamiento de hepatitis C es un tratamiento basado en interferón.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se selecciona del grupo que comprende IFNa, IFNA o cualquier interferón pegilado.

43. El método de conformidad con las reivindicaciones 41 ó 42, caracterizado porque el tratamiento basado en interferón se combina con ribavirina o cualquier medicamento antiproteasa o cualquier otro medicamento antiviral o cualquier combinación de los mismos.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, caracterizado porque el sujeto está coinfectado con VIH.

45. Un equipo para determinar una susceptibilidad a carencia de respuesta a un tratamiento de hepatitis C en un sujeto que padece de hepatitis C crónica de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, el equipo está caracterizado porque comprende: i) reactivos para detectar selectivamente la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico en el locus IL-28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, y ii) instrucciones para uso.

46. Un equipo para determinar una susceptibilidad a eliminación no espontánea de hepatitis C en un sujeto infectado con hepatitis C, de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, el equipo está caracterizado porque comprende: i) reactivos para detectar selectivamente la presencia o ausencia de por lo menos un marcador polimórfico dentro del locus IL28B/A y/o IL-29 en una muestra de ácido nucleico aislada de una muestra biológica obtenida del sujeto, y ii) instrucciones para uso.

47. El equipo de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizado porque los reactivos comprenden además otro cebador, conjunto de cebadores o arreglo de cebadores dirigidos para detectar el genotipo viral.

48. El equipo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, caracterizado porque el sujeto está coinfectado con VIH.