CN102665753A

CN102665753A - 诊断或预测hcv感染的患者中丙型肝炎后果的方法

Info

Publication number: CN102665753A
Application number: CN2010800436612A
Authority: CN
Inventors: P-Y·博丘德; A·劳赫
Original assignee: Universitaet Bern; Centre Hospitalier Universitaire Vaudois CHUV
Current assignee: Universitaet Bern; Centre Hospitalier Universitaire Vaudois CHUV
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-09-12
Also published as: CA2768772A1; MX2012001058A; AU2010277239A1; WO2011013019A1; EP2459210A1; KR20120040725A; BR112012001931A2; US20110165124A1; JP2013500713A

Abstract

本发明涉及确定被丙型肝炎感染的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性或丙型肝炎自发清除的易感性的体外方法。所述方法是基于检测IL28A、IL28B和/或IL-29基因座内的患者基因型。

Description

诊断或预测HCV感染的患者中丙型肝炎后果的方法

技术领域

本发明涉及确定被丙型肝炎感染的受试者对丙型肝炎治疗无反应的易感性或丙型肝炎自发清除的易感性的体外方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是慢性感染超过2亿人(约占世界人口3％)的单链RNA病毒[1-4]。丙型肝炎病毒(HCV)的急性感染在20-50％的人中导致达到永久控制HCV的广泛的先天和适应性免疫反应[5]。不能清除所述病毒导致慢性丙型肝炎。慢性感染伴随高发病率和致死率，主要由向肝硬化和肝细胞癌的发展引起[6]。目前聚乙二醇化干扰素和利巴韦林(PEG-IFN/RBV)的标准疗法在30-80％的慢性感染个体中导致持续的反应率[7-9]。

更多的证据表明宿主遗传因子影响慢性丙型肝炎感染的自然过程和对治疗的反应[10-13]。在于相似条件下由被单链HCV污染的免疫球蛋白制剂感染的两组怀孕妇女中，一半自发地清除了所述感染，一半发展为慢性丙型肝炎[14，15]。在慢性感染的患者中，即使在具有相似HCV-RNA水平和相同基因型的病例之间，对治疗的反应也不同[6，7，9]。反应率与种族和性别强烈相关[16]。之前的报告揭示了人白细胞抗原(HLA)[10，13]、杀伤免疫球蛋白状受体(KIR)[17]、细胞因子(WO00/08215)、趋化因子和白细胞介素以及干扰素刺激基因[18-22]的遗传多态性对HCV感染后果的影响。

之前的研究已经使用以基因在HCV感染中的可能作用的现有知识为基础的候选基因方法。然而，之前的数据不能精确预测自发清除或对治疗的反应[13]。

尽管有上述方法，仍然强烈需要开发确定患慢性丙型肝炎的受试者中对抗丙型肝炎治疗无反应的易感性、或丙型肝炎急性感染的受试者中自发或非自发的丙型肝炎清除的易感性的有效预测方法。

迄今，尚未开发出克服此问题的有效方法或策略。

发明内容

此目的已通过提供确定患丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法而实现，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否。

本发明另一目的是提供确定丙型肝炎感染受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的方法，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否。

本发明另一目的是提供治疗慢性丙型肝炎患者的方法，包括i)确定至少一种所述患者的多态性标志是否位于从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因座内，其中所述至少一种所述患者的多态性标志选自rs11879005、rs12975799、rs11083519，rs955155，rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587、rs30480；ii)基于所述至少一种所述患者的多态性标志是否与对丙型肝炎治疗无反应的易感性增加相关而治疗患者。

本发明又另一目的是治疗慢性丙型肝炎患者的方法，包括i)确定至少一种所述患者的多态性标志是否位于从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因座内，其中所述至少一种所述患者的多态性标志选自rs11879005、rs12975799、rs11083519，rs955155，rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587、rs30480；ii)确定从来自所述患者的生物样本中分离的核酸样本中的HCV病毒基因型；iii)基于所述至少一种所述患者的多态性标志和HVC基因型是否与对丙型肝炎治疗无反应的易感性增加相关而治疗患者。

本发明还提供评估患慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括i)通过确定从所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否而辨别所述受试者中具有对丙型肝炎治疗无反应的易感性的患者，所述至少一种多态性标志的存在是所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征；ii)建立丙型肝炎治疗方案。

本发明还涉及评估患慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括i)通过确定

--从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否，所述至少一种多态性标志的存在是所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征，和

--HCV病毒基因型，基因型1或4的存在是所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征，

从而辨别所述受试者中具有对丙型肝炎治疗无反应的易感性的患者；

ii)建立丙型肝炎治疗方案。

本发明还涉及用于根据本发明确定患慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的试剂盒，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否的试剂和ii)使用说明书。

本发明还提供用于根据本发明确定丙型肝炎感染受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的试剂盒，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否的试剂和ii)使用说明书。

附图说明

图1是Manhattan图。示出了全部2.5M输入的单核苷酸多态性(SNP)的P值(以-log10为刻度)。

图2是感染群体中的基因型分布。(A)与慢性感染的个体相比，在HCV自发清除的个体中含有G-等位基因的基因型减少。(B)在瑞士丙型肝炎群体研究中(Swiss Hepatitis C Cohort Study，SCCS)，下面三组患者中的G等位基因的频率增加：自发病毒清除的患者＜治疗后清除的患者(即对治疗有反应者)＜对治疗无反应的患者。

图3是不同SNP的P值的图示，显示出在IL28B单倍型域中自发清除和对治疗无反应的一致的关联模式。(A)单倍型域。最强的遗传关联位于最接近IL28B基因的单倍型域中。(B)IL28B/A和IL-29基因座中SNP与HCV的遗传关联。位于IL28B和IL28A附近的SNP的强关联对于两个终点——自发丙型肝炎清除和基于干扰素的治疗无反应——均存在。

具体实施方式

本发明涉及确定患丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否。

本发明还涉及确定丙型肝炎感染受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的方法，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的的存在与否。

尽管与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，下文仍然描述了合适的材料和方法。所有本文提及的出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以引用的方式全文纳入本文。提供本文讨论的出版物和申请仅由于其公开在本申请提交日之前。本文任何内容都不应理解为承认本发明无权因现有的发明而先于这些出版物。此外，所述材料、方法和实例仅为示例而并非意图进行限制。

除非另有指出，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本文主题所属领域的技术人员通常理解的相同含义。给出本文使用的以下定义以帮助对本发明的理解。

术语“包含”常用意义包括，即允许一种或多种特征或成分的存在。

除非上下文另有明确指出，本说明书和所附权利要求所用的单数形式“a”、“an”、“the”也包括复数指代物。

本文使用的“持续的病毒反应”被定义为治疗终止超过24周后检测不到的病毒血症。

本文所用的“至少一种”是指“一种或多种”。

本文所用的术语“受试者”或“患者”为本领域公知，并在本文中互换使用，是指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、奶牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，以及最优选地，人。在某些实施方案中，所述受试者是需要丙型肝炎治疗的受试者。然而，在其他实施方案中，所述受试者可为正常人。

术语“受试者”或“患者”不指示特定年龄或性别。因此，意图涵盖不论男女的成人、婴儿和新生儿受试者。

或者，所述受试者或患者被人免疫缺陷病毒(HIV)优选HIV-1或HIV-2共感染。

本文使用的术语“易感性”是指所述受试者对丙型肝炎治疗无反应的可能性或倾向，或者是指所述受试者非自发丙型肝炎清除的倾向。

本文使用的“等位基因”，是指细胞、个体内或群体中特定形式的遗传序列或者遗传序列(例如基因)内的单核苷酸位点，所述特定形式在所述基因的序列内的至少一个且通常多个变体位点的序列上不同于所述相同基因的其他形式。所述序列可能在基因内，也可能不在基因内。在不同等位基因之间不同的这些变体位点处的序列被称为“差异(variance)”、“多态性(polymorphism)”或“突变(mutation)”。在每个常染色体特定的染色体位置或“基因座”上，个体具有两个等位基因，一个遗传自一个亲本，另一个遗传自另一个亲本，例如一个来自母亲，另一个来自父亲。

本文所用的“多态性”是指群体中两种或多种遗传决定的可选序列的出现。“多态性标志”或位点是出现趋异(divergence)的基因座。优选的标志具有至少两种等位基因，每一种在选定群体中出现的频率优选大于1％，更优选大于10％或20％。一个多态性可包含一个或多个碱基改变、插入、重复或缺失。一个多态基因座可小至一个碱基对。多态性标志包括限制性片段长度多态性、数目可变的串联重复序列(VNTR)、高变区、小卫星序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列、简单序列重复序列、拷贝数变异(CNV)和插入元件例如Alu。首先识别的等位基因形式被随意称作参考形式，其他等位基因形式被称作可选的或变异的等位基因。在选定群体中最常出现的等位基因形式有时称为野生型形式。双等位基因多态性有两种形式。三等位基因多态性有三种形式。两种核酸之间的多态性可天然存在，或通过暴露于或接触化学品、酶或其他试剂或者暴露于导致核酸破坏的试剂如紫外线照射、诱变剂或致癌物而引起。一种具体的多态性，称为单核苷酸多态性或SNP，是可见于人DNA序列内的微小遗传改变或变异。遗传密码用四个核苷酸“字母”A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)表示。当单核苷酸例如A取代其他三个核苷酸字母C、G或T之一时出现SNP变异。

本文所用的术语“丙型肝炎病毒”或“HCV”用于定义导致丙型肝炎(也称为非甲型、非乙型肝炎)的病原菌株的RNA病毒种。基于HCV分离株之间的遗传差异，所述丙型肝炎病毒种被分为6个基因型(1-6)，每个基因型内又分几个亚型。亚型基于其遗传多样性被进一步分为准种(quasi specie)。HVB基因型的优势和分布在全世界范围内有所不同。例如，在北美，基因型1a占优势，然后依次是1b、2a、2b和3a。在欧洲，基因型1b占优势，然后依次是2a、2b、2c和3a。基因型4和5几乎仅在非洲发现。在临床上，所述病毒基因型对于确定对基于干扰素的治疗的可能反应以及所述治疗所需的持续时间是重要的。基因型1和4对基于干扰素的治疗的反应通常较所述其他基因型(2、3、5和6)为低。应注意基因型5和6在群体中很少见。

“丙型肝炎”是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的感染肝脏的传染性疾病。所述传染经常无症状，但是一旦被感染，慢性丙型肝炎感染可发展为肝脏的疤痕化(纤维化)以及通常在许多年后才显现的晚期疤痕化(肝硬化)。在某些病例中，患有肝硬化的患者会继续发展成肝功能衰竭或其他肝硬化的并发症，包括肝癌。

“慢性丙型肝炎”被定义为持续超过6个月的丙型肝炎病毒的感染。临床上，其经常无症状(没有症状)并且其大部分是被偶然发现的。慢性丙型肝炎的自然过程在人与人之间有很大不同。尽管几乎所有感染HCV的人的肝活组织检查均有炎症迹象，然而肝脏疤痕化(纤维化)的发生率在个体中显示出显著差异。由于可用于检测此病毒的时间有限，因此难以建立对所述风险随时间的精确评估。

丙型肝炎病毒(HCV)被鉴定后不久，用对所述病毒的抗体在人中进行的若干横断研究(cross-sectional study)表明某些人似乎表现出“自发丙型肝炎清除”，而其他人保持病毒血症状态。从那以后，若干研究者尽力表征丙型肝炎感染的发病机理，包括自发病毒清除率、时程和预测物。清除率的估计值的范围为10-50％，并且在某些病例中清除的持续时间被发现长达3年。权威的临床综述通常提到清除率低至10-15％。

本文中的“非自发丙型肝炎清除”是指患者不显现自发清除，从而所述感染会发展为慢性丙型肝炎的情况。出于清楚的目的，其不指治疗引起的清除。

“IL28B/A和/或IL-29基因座”通常指位于人染色体19长臂中编码三种细胞因子基因即IL28B、IL28A和IL29(其属于IFNλ家族)的80kb区域内的基因组DNA区。这三个基因具有数个外显子，IL-28(也称为IFNλ1)5个外显子，IL-28A(IFNλ2)和IL-28B(IFNλ3)6个外显子。它们编码20kDa的单体分泌蛋白。最近已报道，IL28B、IL28A和IL29细胞因子可为用于治疗对IFN α有抗性或变得有抗性的HCV感染患者的重要IFN α替代物([38])。

对于本发明确定患丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述至少一种多态性标志的存在表明所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性。

另一方面，对于本发明确定丙型肝炎感染受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的方法，所述至少一种多态性标志的存在表明所述受试者具有增加的自发丙型肝炎清除的易感性。

若干方法可用于分析至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否，所述方法可用于从来自所述受试者的生物样本分离的核酸样本中的IL28B/A和/或IL-29基因座。用于检测多态性或突变的测定分为几类，包括但不限于直接测序测定、片段多态性测定、杂交测定和基于计算机的数据分析。用于进行这些测定的多种变型的方案以及市售的试剂盒或服务均可得到。在某些实施方案中，测定结合或混合进行(例如结合来自数种测定的不同试剂或技术以形成一种测定)。如下测定可用于本发明，并对于检测在IL28B/A和/或IL-29基因座中发现的不同SNP进行了描述。

在本发明的一个方面，使用直接测序技术来检测SNP。在这些测定中，首先使用任意合适的方法从受试者中分离DNA样本。在某些实施方案中，目的区域被克隆到合适的载体中并通过在宿主细胞(例如细菌)中生长扩增。在其他实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的区域中的DNA。

扩增后，使用任意合适的方法对目的区域(例如含有所述SNP的区域)中的DNA进行测序，包括但不限于使用放射性标记核苷酸的人工测序，或者自动测序。测序结果使用任意合适的方法显示。检查所述序列并确定给定SNP的存在与否。

在本发明的一个方面，使用基于PCR的测定来检测SNP。在某些实施方案中，所述PCR分析包括使用寡核苷酸引物(“引物”)来扩增含有目的重复多态性的片段。靶标多核苷酸序列的扩增可通过本领域技术人员已知的任意方法进行。参见例如[41]和[42]。扩增方法包括但不限于：包括实时PCR(RT-PCR)的PCR、链置换扩增[43][44]、使用Phi29DNA聚合酶的链置换扩增(美国专利5,001,050)、基于转录的扩增[45]、自主序列复制(″3SR″)[46][47]、Q β复制酶系统([48][49])、基于核酸序列的扩增(″NASBA″)([50])、修复链式反应(″RCR″)([50]，见上文)和回旋镖(boomerang)DNA扩增(″BDA″)([50])。PCR是扩增靶标多核苷酸序列的优选方法。

PCR可依照本领域技术人员已知的技术进行。通常，PCR首先包括用扩增引物对处理核酸样本(例如在热稳定DNA聚合酶的存在下)。所述引物对中的一条引物与靶标多核苷酸序列的一条链杂交。所述引物对中的第二条引物与所述靶标多核苷酸序列的另一条链即互补链杂交。所述引物与其靶标多核苷酸序列链在以下条件下杂交：即与每条核酸链互补的每条引物的延伸产物被合成。从每条引物合成的延伸产物，当与其互补物分离时，可用作合成另一条引物的延伸产物的模板。在引物延伸后，将所述样本处理至退火条件以使所述引物延伸产物与其模板分离。循环重复这些步骤直至获得所需程度的扩增。

扩增的靶标多核苷酸可用于本文他处记载的检测测定之一以识别扩增的靶标多核苷酸序列中存在的GT-重复多态性。

在本发明的一个方面，使用片段长度多态性测定来检测SNP。在片段长度多态性测定中，使用酶(例如限制性核酸内切酶)产生基于在一系列位点处切割DNA的独特DNA带型模式。来自含有多态性的样本的DNA片段与野生型具有不同的带型模式。

在本发明的一个方面，使用Beckman Coulter CEQ 8000遗传分析系统——一种本领域熟知的用于微卫星多态性确定的方法，进行片段大小分析。

在本发明的一个方面，使用限制性片段长度多态性测定(RPLP)来检测SNP。首先使用PCR分离目的区域。然后将PCR产物用已知限制性内切酶切割以得到对于给定多态性独特长度的片段。将限制性内切酶消化的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离并通过溴化乙锭染色可视化并与对照(野生型)比较。

在一个方面，使用CLEAVASE片段长度多态性(CFLP；Third WaveTechnologies，Madison，Wis.；see e.g.，US Patent No.5,888,780)测定来检测多态性。此测定是基于以下观察：当DNA的单链自身折叠时，其呈现对于所述DNA分子的精确序列高度独特的更高级的结构。这些二级结构包括部分双链化的DNA区，从而单链区与双链DNA发夹并置。CLEAVASE I酶是识别并切割这些单链和双链区之间联结区的结构特异的、热稳定的核酸酶。

首先，使用例如PCR分离目的区域。然后，通过加热使DNA链分开。接着，冷却所述反应以使链内二级结构形成。然后用CLEAVASE I酶处理所述PCR产物以生成一系列对于给定多态性独特的片段。将CLEAVASE酶处理的PCR产物分离、检测(例如通过琼脂糖凝胶电泳)、可视化(例如通过溴化乙锭染色)并与对照(野生型)比较。

在本发明的其他方面，通过杂交测定来检测SNP。在杂交测定中，基于来自所述样本的DNA与互补DNA分子(例如寡核苷酸探针)杂交的能力来确定给定多态性或突变的存在与否。使用多种杂交和检测技术的多种杂交测定是可用的。下面提供对如何选择测定的描述。

在一个优选的方面，通过检测一种或多种连接于所述样本核酸的标记来检测所述杂交的核酸。可通过任意数量的本领域技术人员熟知的手段纳入所述标记。在一个实施方案中，所述标记在制备所述样本核酸的扩增步骤中同时纳入。因此，例如，使用标记的引物或标记的核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)会提供标记的扩增产物。在另一实施方案中，使用标记的核苷酸的转录扩增(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)将标记纳入所转录的核酸中。

或者，可将标记直接加入原始核酸样本(例如mRNA、polyA mRNA、cDNA、基因组DNA等)中或在扩增完成后加入扩增产物中。将标记连接到核酸的手段是本领域技术人员熟知的，包括，例如，通过激活(kinasing)核酸并随后连接(联结)将所述样本核酸连接于标记(例如荧光团)的核酸接头而进行的缺口平移标记或末端标记(例如用标记的RNA)。在另一实施方案中，使用末端脱氧转移酶(TdT)将标记加至片段末端。

适用于本发明的可检测标记包括任何可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的组合物。本发明可用的标记包括但不限于：用于用标记的链霉抗生物素蛋白缀合物染色的生物素；抗生物素抗体；磁珠(例如Dynabeads^TM)；荧光染料(例如荧光素、Texas Red、罗丹明、绿色荧光蛋白等)；放射标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P)；磷光标记；酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)；以及量热标记例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。

检测所述标记的手段为本领域技术人员所熟知。因此，例如，可使用感光胶片或闪烁计数器来检测放射标记；可使用光检测器检测发射光来检测荧光标志物。通常通过提供酶以底物并检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测酶标记，以及通过仅可视化有色标记来检测量热标记。

所述标记可在杂交之前或之后被加至靶标核酸。所谓的“直接标记”是在杂交之前直接连接于或纳入靶标核酸的可检测标记。相反，所谓的“间接标记”在杂交后与杂交双链体结合。通常，所述间接标记连接于在杂交之前已经与靶标核酸连接的结合部分。因此，例如，所述靶核酸可在杂交前被生物素化。在杂交后，抗生物素蛋白缀合的荧光团会结合带有生物素的杂交双链体，从而提供易于检测的标记。对于标记核酸和检测标记的杂交核酸的方法的详细综述，参见Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization with Nucleic Acid Probes，其出于各种目的以引用的方式全文纳入本文。

在一个方面，通过可视化结合探针来直接检测探针与目的序列(例如，诸如SNP的多态性)的杂交(例如Southern或Northern测定；参见例如Ausabel et al.(Eds.)，1991，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，NY)。在这些测定中，从受试者中分离基因组DNA(Southern)或RNA(Northern)。然后用一系列在基因组中切割频率低并在不靠近任何要测定的标志处切割的限制性内切酶切割所述DNA或RNA。然后分离所述DNA或RNA(例如琼脂糖凝胶电泳)并转移至膜上。然后使对要检测的突变特异的标记(例如通过纳入放射性核苷酸)的一个探针或多个探针在低、中或高严格条件下与所述膜接触。将未结合的探针除去并通过可视化标记的探针来检测结合的存在。

在本发明的一个方面中，使用DNA芯片杂交测定来检测SNP。在此测定中，一系列寡核苷酸探针被固定在固态载体上。所述寡核苷酸探针被设计为对给定的单核苷酸多态性是独特的。将所述目的DNA样本与所述DNA“芯片”接触并检测杂交。

在某些实施方案中，所述DNA芯片测定是GeneChip(Affymetrix，Santa Clara，Calif；参见例如美国专利No.6,045,996)测定。所述GeneChip技术使用固定在“芯片”上的微型化的、高密度的寡核苷酸探针阵列。探针阵列由Affymetrix的光引导化学合成法制造，该方法将固相化学合成与用于半导体工业的光刻技术结合。使用一系列光刻掩膜来限定芯片暴露位点，然后进行特定化学合成步骤，所述方法构建寡核苷酸的高密度阵列，每种探针位于所述阵列的预定位置。多个探针阵列在大玻璃薄片上同时合成。然后将所述薄片切成小块，将各个探针阵列包装在注塑成型的塑料盒中，其保护所述阵列与环境隔离并用作杂交容器。

从来自受试者的生物样本分离要分析的核酸，通过PCR扩增，并用荧光报告基团标记。然后用流控工作站(fluidics station)将所述标记的DNA与所述阵列孵育。然后将所述阵列插入扫描器，在其中检测杂交模式。以从已经纳入所述靶标——其结合于所述探针阵列——的荧光报告基团激发的光的形式收集杂交数据。完美匹配所述靶标的探针通常比错配的探针产生更强的信号。由于每个探针的序列和在所述阵列上的位置是已知的，因此通过互补性，可确定施加于所述探针阵列的靶标核酸的性质。

在另一方面，使用含有电子捕获探针(Nanogen，San Diego，Calif.)的DNA微型芯片(参见例如美国专利6,068,818)。通过使用微电子技术，Nanogen技术使得带电分子主动移动并浓缩至其半导体微型芯片上的指定测试位点并从所述位点主动移动并浓缩。对给定的多态性或突变独特的DNA捕捉探针通过电子方式位于或定位或“寻址”于所述微型芯片的特定位点。由于DNA具有强负电荷，其可通过电子方式移动至正电区。

首先，所述微型芯片上的一个测试位点或一列测试位点被正电荷通过电子方式激活。接着，将含有所述DNA探针的溶液引至所述微型芯片上。带负电的探针快速移动到所述带正电的位点，在那里它们浓缩并化学地结合于所述微型芯片上的位点。然后洗涤所述微型芯片，并加入不同DNA探针的另一种溶液直至特异性结合DNA探针的阵列完成。

然后通过确定哪些DNA捕捉探针杂交测试样本中的互补DNA(例如PCR扩增的目的基因)来分析所述测试样本中靶DNA分子的存在。电荷也用于将靶标分子移动并浓缩至所述微型芯片上的一个或多个测试位点。样本DNA在每个测试位点处的电子浓缩促进样本DNA与互补捕捉探针的快速杂交(杂交可在数分钟内发生)。为从每个位点除去任何未结合或非特异性结合的DNA，将所述位点的极性或电荷反转为负，从而迫使任何未结合或非特异性结合的DNA离开所述捕捉探针回到溶液中。使用基于激光的荧光扫描器来检测结合。

在又一方面，使用基于流体通过表面张力差异在平面(芯片)上分离的阵列技术(ProtoGene，Palo Alto，Calif.)(参见例如美国专利6,001,311)。Protogene技术基于以下事实：流体可通过已由化学涂层赋予的表面张力差异在平面上分离。一旦这样分离，寡核苷酸探针就通过试剂的喷墨印刷而直接在所述芯片上合成。将具有由表面张力限定的反应位点的阵列安装在一组四个压电喷嘴——各自与四种标准DNA碱基分别对应——下的X/Y位移平台上。所述位移平台沿所述阵列的每一排移动，并且将合适的试剂递送至每个反应位点。例如，将amidite A仅递送至amidite A将在该合成步骤中被偶联的位点，以此类推。通过冲洗整个表面然后通过旋转除去来递送共用试剂和洗液。

使用Protogene技术将对于目的多态性独特的DNA探针固定于所述芯片。然后使所述芯片与PCR扩增的目的基因接触。杂交后，除去未结合的DNA并使用任何合适的方法来检测杂交(例如，通过纳入的荧光基团的荧光去猝灭)。

在再一方面，使用“珠阵列”来检测SNP(Illumina，San Diego，Calif；参见例如PCT公布WO99/67641和WO00/39587，其各自以引用的方式纳入本文)。Illumina使用结合纤维光束与自装配到阵列中的小珠的珠阵列技术。根据纤维光束的直径，每个纤维光束含有几千到几百万单独的纤维。所述珠被包覆以对于检测给定多态性或突变特异的寡核苷酸。将各批次的珠合并以形成对所述阵列特异的库。为进行测定，所述珠阵列与制备的受试者样本(例如DNA)接触。使用任何合适的方法如杂交的酶检测来检测杂交。

在本发明的某些方面，使用通过对特定结构的酶切来检测杂交的测定产生基因组谱(INVADER测定，Third Wave Technologies；参见例如美国专利6,001,567)。所述INVADER测定通过使用结构特异的酶来切割通过重叠寡核苷酸探针的杂交形成的复合物而检测特异性DNA和RNA序列。提高温度和所述探针之一过量使得因存在的每个靶标序列多个探针被切割，而无需温度循环。然后这些被切割的探针指导第二种标记探针的切割。所述第二种探针寡核苷酸可在5′末端标记以荧光素，所述荧光素被一种内部染料猝灭。切割后，所述去猝灭的荧光素标记的产物可使用标准荧光酶标仪检测。

所述INVADER测定检测未扩增的基因组DNA中的特定突变和多态性。使分离的DNA样品与对多态性/突变或野生型序列特异的第一种探针接触并使其杂交。然后对所述第一种探针特异并含有荧光标记的第二种探针杂交并加入酶。使用荧光酶标仪检测结合并比较测试样本与已知的阳性和阴性对照的信号。

在某些方面，使用TaqMan测定(PE Biosystems，Foster City，Calif；参见例如美国专利No.5,962,233)检测结合探针的杂交。所述测定在PCR反应期间进行。TaqMan测定利用AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。所述PCR反应包括对于给定等位基因或突变特异的探针。所述探针由含有5′-报告染料(例如荧光染料)和3′-猝灭染料的寡核苷酸构成。在PCR中，如果所述探针与其靶标结合，那么所述AMPLITAQ GOLD聚合酶的5′-3′核酸水解活性切割所述报告染料与所述猝灭染料之间的探针。所述报告染料与所述淬灭染料的分离导致荧光的增加。所述信号随每轮PCR逐渐聚积并可用荧光计监测。

在某些方面，使用MassARRAY系统(Nanogen，San Diego，Calif.)来检测多态性(参见例如美国专利6,043,031)。使用标准方法从血样中分离DNA。接着，通过PCR扩增含有目的多态性的特定DNA区域。然后通过一条链将所扩增的片段连接于固体表面并通过标准变性和洗涤除去未固定的链。然后剩余固定化的单链作为自动酶反应的模板，所述自动酶反应产生对于诊断产物特异的基因型。

然后将非常小量(通常5到10纳升)的酶产物转移到SpectroCHIP阵列，用SpectroREADER质谱仪进行随后的自动分析。每个点预装以光吸收晶体，所述光吸收晶体与分配的诊断产物形成基质。所述MassARRAY系统使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight))质谱。在称为解吸附的方法中，用来自激光束的脉冲打击所述基质。所述激光束的能量被转移至所述基质中，所述基质被蒸发，导致少量所述诊断产物被排到飞行管中。由于所述诊断产物带电，因此当随后施加电场脉冲于所述管时，他们沿飞行管向检测器发射。施加电场脉冲和所述诊断产物与检测器碰撞之间的时间称为飞行时间。这是产物的分子量的非常精确的度量，因为分子的质量直接对应飞行时间，小分子比大分子飞得更快。整个测定在小于0.0001秒内完成，使得样本在总共3-5秒内被分析，包括重复数据采集。然后SpectroTYPER软件以每个样本3秒的速率计算、记录、比较和报告所述基因型。

通常，从来自所述受试者的生物样本分离本发明的“核酸样本”，所述生物样品例如全血、血清、精液、唾液、眼泪、尿液、粪便、汗液、口腔涂片、皮肤以及肌肉、肝、脑组织、神经组织和头发的活组织检查。所述核酸样本可为基因、调控序列、基因组DNA、cDNA和RNA(包括mi RNA和rRNA)的一部分。

通常先对基因组DNA样本进行扩增，然后再使其与探针接触。基因组DNA可来自任何生物样本。如果提供样本的个体在所述多态性位点上是纯合的，则含有SNP的基因组DNA的扩增生成单种核酸，如果所述个体是杂合的，则生成两种核酸。

RNA样本通常也进行扩增。在此情况下，扩增前通常进行反转录。全部表达的mRNA的扩增可如例如在[39]和[40]中所述的进行，所述文献以引用的方式全文纳入本文。如果提供样本的个体在所表达的RNA内出现的多态性位点上是杂合的，则来自二倍体样本的RNA样本的扩增可生成两种靶标分子，或者如果所述RNA种类发生可变剪接，则可能产生更多种靶标分子。扩增通常可使用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)方法进行。靶标样本中的核酸可在扩增过程中通过在扩增混合物中包括一种或多种标记的核苷酸而被标记。标记也可在扩增后连接于扩增产物(例如通过末端标记)。根据在所述扩增反应中使用的酶和底物，所述扩增产物可为RNA或DNA。

各个多态性的基因型包含至少两种等位基因的总和并可为纯合的(即包含相同的等位基因)或杂合的(即包含不同的等位基因)。

在本发明的某些方面，本发明的分离核酸样本可使用常规核酸合成法或通过本领域已知的重组核酸方法产生或合成(2001，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York和Ausubel et al.2001，Current Protocols in Molecular Biology，Green&Wiley，New York)。

出乎意料的，本发明人已经证明，从来自患慢性丙型肝炎的受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内的至少一种多态性标志的存在表明所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性。

出乎意料的，本发明人还已经证明，从来自丙型肝炎感染受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内的至少一种多态性标志的存在表明所述受试者具有增加的对非自发丙型肝炎清除的易感性。

优选地，本发明的至少一种SNP位于人染色体19约80kb的区域内。单倍型域(haplotype blocks)作图(图3)显示出所述SNP i)一方面与患有丙型肝炎的受试者中的对丙型肝炎治疗无反应的易感性之间具有强相关，ii)另一方面与非自发丙型肝炎清除的易感性增加之间具有强关联。

更优选地，本发明的至少一种SNP位于基本由选自以下的在SNP两侧的DNA区域组成的核酸区段中：SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10、SEQ ID No 11、SEQID No 12、SEQ ID No 13、SEQ ID No 14、SEQ ID No 15、SEQ ID No16、SEQ ID No 17、SEQ ID No 18、SEQ ID No 19、SEQ ID No 20、SEQ ID No 21、SEQ ID No 22、SEQ ID No 23、SEQ ID No 24、SEQID No 25、SEQ ID No 26、SEQ ID No 27、SEQ ID No 28、SEQ ID No29、SEQ ID No 30、SEQ ID No 31、SEQ ID No 32、SEQ ID No 33、SEQ ID No 34(如表1中所列)。

本发明还包括确定从来自所述受试者的生物样本分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种，即如上面定义的一种或多种，即组合的，单核苷酸多态性(SNP)的存在与否。

优选地，所述多态性标志是与至少一种选自以下的SNP相关的多态性位点：rs11879005、rs12975799、rs11083519、rs955155、rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587，rs30480.Most更优选地，所述SNP选自rs8099917的G/T、rs8099917的G/G、rs576832的C/G、rs576832的C/C、rs12980275的G/A或rs12980275的G/G。

还优选地，所述至少一种多态性标志是与选自以下的至少一种SNP完全或强烈连锁不平衡的多态性位点：rs11879005，rs12975799，rs11083519，rs955155，rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587，rs30480.

例如，当所述rs8099917等位基因G位于一个染色体(或两个等位基因位置之一)上时，其形成杂合基因型G/T。相反，当位于两个染色体(或等位基因位置)时，其形成纯合基因型G/G。

在一个方面，本文所述的可用于确定所述病毒基因型的核酸样本和可用于确定所述多态性的核酸样本是从来自所述受试者的同一生物样本中分离的。因此制备用于分离核酸样本的生物样本，所述核酸样本一方面可用于确定本发明的至少一种多态性标志的存在与否，另一方面用于确定HCV病毒基因型。

在另一个方面，本文所述的可用于确定所述病毒基因型的核酸样本和可用于确定所述多态性的核酸样本是从来自所述受试者的两个不同的生物样本中分离的。在此情况下，则制备第一生物样本和第二生物样本，所述第一生物样本用于分离可用于确定本发明的至少一种多态性标志的存在与否的核酸样本，所述第二生物样本可用于分离可用于确定HCV病毒基因型的核酸样本。

这两种生物样本可为相同种类(例如在所述两种情况下均为全血)，也可为不同种类(例如全血和肝活检组织)。

要分析的HCV核酸——通常为RNA——通常被分离、反转录为cDNA并例如通过PCR扩增，如WO 96/14839和WO 97/01603所述。本领域已知的任何其他技术均可使用。

“连锁不平衡”(LD)描述以下情况，即其中等位基因或遗传标志的某些组合在群体中的出现频率高于或低于由等位基因的单倍体型基于其频率随机形成所预期的频率。当在一个基因座上的某个等位基因被发现与在第二个基因座上的某一等位基因一块在相同染色体上时——如果群体中所述两个基因座独立地分离，则通常高于预期——所述基因座是不平衡的。此LD的概念由人们提出的对不平衡的最早度量之一(符号为D)形成。D(与LD的大多数其他度量相同)将不平衡定量为双基因座单倍体的实测频率与在所述等位基因是随机分离的时所预期显示的频率之间的差异。采用两个相邻的基因座的标准符号——A和B，其中在每个基因座上有两个等位基因(A，a和B，b)——对由等位基因A和B构成的单倍体的实测频率由PAB表示。假设所述两个基因座上的等位基因是独立分配的，所预期的单倍体频率计算为每个所述两个等位基因的等位基因频率之积，即PA×PB，其中PA是在第一个基因座上的等位基因A的频率，PB是在第二个基因座上的等位基因B的频率。因此，不平衡的最简单的度量之一为D＝PAB-PA×PB。当新突变在具有附近基因座上的某一等位基因的染色体上发生并且逐渐通过重组削弱时，就形成LD。反复发生的突变也可降低相邻基因座上的等位基因之间的关联。“连锁”的名称包含了重组在LD的形成模式中的重要性。群体中LD的程度被预期随着时间(t)和标志之间的重组距离(r，或重组率)而降低。理论上，LD依照如下公式随时间和距离衰变，其中D0是在某个起点处不平衡的程度，Dt是t代后不平衡的程度：Dt＝(1-r)tD0。

已经提出大量统计数值来度量LD的量，这些LD根据其情况具有不同的强度。尽管度量D具有LD的直观概念，然而其数值对测量LD的强度及比较LD的水平用处不大。这是由于D对等位基因频率的依赖性。两个最常用的度量是D’的绝对值和r2。

D’的绝对值在给定两个基因座上的等位基因频率的情况下由D除以其最大可能值而确定。D’＝1的情况称为完全LD。＜1的D’值表明原来的完全LD已被破坏。＜1的D’值的大小没有清楚的解释。D’的估值在少量样本中被强烈放大。因此，统计上显著的接近1的D’值可用于指示过去存在微小的重组，但中等值不应用于比较研究之间的LD的强度或用于量度LD的程度。

度量r2在某些方面与D’互补。r2等于D2除以两个基因座上的等位基因频率的积。Hill和Roberson推导出E[r2]＝1/1+4Nc，其中c为以摩为单位的两个标志之间的重组率，N为有效群体大小。此等式说明LD的两个重要性质。首先，LD的期望水平取决于重组。两个位点之间的重组越多，其相互移动的程度越高，导致LD降低。第二，LD取决于N，强调LD是群体特征。

在本发明中，强连锁不平衡与HapMap European数据集中和/或发明人实验分析的群体中的所述SNP存在0.5的D′和/或至少0.6的称为r2的相关性。

依照本发明，如果存在所述rs8099917等位基因G或rs576832C(一个或者两个范例)，这表明患有慢性丙型肝炎的受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性。(分别)与无G或C等位基因相比，rs8099917等位基因G或rs576832C存在两个范例，而非一个等位基因，进一步增加对丙型肝炎治疗无反应的风险。

类似地，如果存在所述rs8099917等位基因G或rs576832C(一个或两个范例)，这表明丙型肝炎感染受试者具有增加的非自发丙型肝炎清除(或发展为慢性丙型肝炎)的易感性。(分别)与无G或C等位基因相比，rs8099917等位基因G或rs576832C存在两个范例，而非一个等位基因，进一步增加非自发丙型肝炎清除的风险。

在另一方面，携带rs12980275风险等位基因G的患者比其他患者更可能成为无反应者(OR＝1.99，95％ CI 1.57-2.54，P＝1.74E-8)。此关联在对相关协变量(年龄、性别、HCV基因型、纤维化严重程度和HCV病毒载量)校正后仍是显著的(校正的P＝4.61E-09)。类似地，携带A/G和G/G基因型的患者比A/A携带者更可能成为无反应者(对于A/G，OR＝2.65[95％CI：2.18-3.18]，P＝2.67E-7，校正的P＝9.90E-8；对于G/G，OR＝3.68，[95％ CI：2.77-4.88]，P＝4.05E-6，校正的P＝1.13E-5，使用A/A作为参照)。

还已发现，在HCV单感染和HCV/HIV共感染个体中均观察到了SNP的存在与对丙型肝炎治疗无反应的易感性或非自发清除的易感性之间的关联。

应注意，表1中括号之间注出的SNP没有关于野生型与风险(次要)等位基因的特定顺序，并因此不在此方面进行说明或限制。

通常，丙型肝炎治疗是基于干扰素的治疗。更优选地，基于干扰素的治疗选自IFN α、IFNλ或任何聚乙二醇化干扰素。通常，所述基于干扰素的治疗结合使用利巴韦林。其他结合可包括抗蛋白酶药物或其他抗病毒药物。

本发明还涵盖评估患有慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括：i)通过确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否而辨别所述患者中具有对丙型肝炎治疗无反应的易感性的患者，所述至少一种多态性标志的存在是所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征，ii)建立丙型肝炎治疗方案。

患有慢性丙型肝炎的受试者中多态性的确定使得医生可为所述受试者建立最好的丙型肝炎治疗方案(丙型肝炎治疗和/或其他抗病毒药物的性质、剂量和持续时间)。例如，如果上述方法揭示了来自所述受试者的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内存在至少一种SNP，表明所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性，那么此受试者可被认为是新治疗方案(例如用更高剂量的目前可用药物的治疗、用目前可用药物和/或新药物的更长治疗时间)的良好候选者。

此外，发明人已经证明在IL28B/A和/或IL-29基因座内携带至少一种本发明SNP的被HCV基因型1或4(具体为纯合)感染的受试者将具有非常低的治疗导致的清除(即“对治疗有反应”或“治疗成功”)的概率，如表4和5所示。表4给出了关于感染群体中每种基因型(TT、GT和GG)分布的更具体的数据，而表5关注风险等位基因的存在与否。容易注意到表4和5基于各组中数目稍有不同的患者。例如，表5示出了在基因型1或4感染的患者中，治疗失败在72％的感染的风险等位基因携带者中发生，而在非携带者中仅为38％(OR＝6.54[95％CI：4.65-9.20]，P＝3.70E-8)。从另一视角，注意到治疗失败仅在16％的具有两个低风险参数的患者(即被病毒基因型2或3感染并且IL28B基因座不存在rs8099917G等位基因的患者)中发生，相形之下，具有两个高风险参数的患者(即被病毒基因型1或4感染并且IL28B基因座存在rs8099917G等位基因的患者)中则为72％(OR 18.89[95％CI：12.87-27.71]，P＝1.84E-14)。

这些结果还表现出HCV基因型2或3感染的受试者中IL28B/A基因座内的遗传变异与对治疗(例如基于干扰素的治疗)的反应之间的关联(OR＝3.32[95％CI：2.21-4.99]，P＝3.27E-3)。然而此关联的强度低于HCV基因型1或4感染的受试者的情形。这些现象证明知晓病毒基因型和宿主多态性对预测对治疗的反应都是重要的。

因此，本发明的另一方面包括在患有慢性丙型肝炎的受试者中结合对所述病毒基因型的确定和如本文所述对所述多态性的确定，从而更精确地评估HCV感染受试者的对丙型肝炎治疗无反应的易感性或非自发清除的易感性。

这些结合的确定可同时或不同时进行。如果不同时，可首先评估所述病毒基因型，然后在确定的时间后进行如本文所述的对所述多态性的确定。还考虑到首先进行如本文所述的对所述多态性的确定，然后在确定的时间后评估所述病毒基因型。

通常，所述确定的时间——其是确定所述病毒基因型和确定所述多态性之间流逝的时间或持续时间(反之亦然)——可从几秒到几年。

本发明还涵盖用于根据本发明确定患慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的试剂盒，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否的试剂，和ii)使用说明书。

本发明还涵盖用于根据本发明确定丙型肝炎感染受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的试剂盒，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否的试剂，和ii)使用说明书。

或者，所述试剂盒所用的试剂包含分离的核酸，优选包括引物、引物组或引物阵列，如本文他处所述。所述引物可被固定于固体基质。所述试剂盒还可包含对照靶标核酸和引物。本领域技术人员无需过度实验就能够选出符合常规要求的引物。所述试剂盒的分离核酸还可包含分子标记或标签。

通常，所述引物、引物组或引物阵列旨在检测IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否。

IL28B/A基因座内至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否可例如但不限于使用选自表6所公开引物(SEQ Id No 35-58)的一组PCR引物或测序引物来确定。

除旨在检测从来自受试者的生物样本分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种单核苷酸多态性(SNP)的存在与否的引物、引物组或引物阵列之外，所述试剂盒的试剂还可包含例如旨在另行检测从来自受试者的生物样本分离的病毒基因型的其他引物、引物组或引物阵列。使用的这些引物组或引物阵列通常是本领域已知的或者在知晓常规要求的情况下可容易生成的。

在其他实施方案中，本发明的试剂盒包含本领域所知的实施本发明方法必需的多种试剂，例如缓冲液。

这些试剂或缓冲液可例如用于从来自所述受试者的生物样本中提取和/或纯化核酸。

所述试剂盒还可包含实施本发明方法必需的所有必需材料例如微量离心管。

本发明还涵盖治疗慢性丙型肝炎患者的方法，包括i)确定至少一种患者的多态性标志是否位于从来自所述患者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因座内，所述多态性标志选自rs11879005、rs12975799、rs11083519，rs955155，rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587、rs30480；ii)基于所述至少一种所述患者的多态性标志是否与对丙型肝炎治疗无反应的易感性增加相关而进行治疗。

本发明还关注确定被巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒1或2(HSV-1或HSV-2)、乙型肝炎病毒(HBV)或流感病毒中的一种或多种感染的受试者中对所述病毒的治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种单核苷酸多态性(SNP)标记的存在与否。

本领域技术人员会理解本文所述的发明可以进行未具体描述的变动和修改。应理解本发明包括所有这些不背离本发明精神或基本特征的变动和修改。本发明还单独或总体地包括此说明书中提到或注明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特征的任意和全部组合。因此，本公开被认为在所有方面均是说明性而非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书所给出，并且意图涵盖落在等同含义和范围内的所有变化。

本说明书全文引用了多篇参考文献，其各自以引用的方式全文纳入本文。

参照下面的实施例将更充分地理解前文的描述。然而，这些实施例是实施本发明的方法的例示，而非意图限制本发明的范围。

实施例

实施例1

患者和方法

将患者纳入瑞士丙型肝炎群体研究(Swiss Hepatitis C CohortStudy，SCCS)和瑞士HIV群体研究(Swiss HIV Cohort Study，SHCS)——在8家瑞士大医院及其当地社区中心进行的两个多中心研究——框架内[23]。必须得到包括遗传测试的书面知情同意，并且该研究被所有当地伦理委员会批准。由于在人种不同的群体中丙型肝炎后果的遗传预测物不同[10，13，24，25]，因此本发明人将分析限制于高加索人(Caucasian)。注意此研究仅显示基因型1、2、3和4。

自发丙型肝炎清除

慢性HCV感染被定义为HCV血清阳性(使用ELISA并用免疫印迹确证)并且可通过定量测定检出的HCV RNA。自发丙型肝炎清除被定义为HCV血清阳性并且在开始抗HCV治疗前检测不到HCVRNA。为避免在感染第一年中HCV RNA水平的波动([26]中综述的)，本发明人在第一次记录阳性HCV血清后至少一年确定HCV RNA水平。

基因型分型

使用Illumina Human1M-Duo BeadChip，HumanHap550或Human600W-QuadIllumina，在位于瑞士日内瓦的the National Centre ofCompetence in Research″Frontiers in Genetics″借助Illumina基因组平台进行基因型分型。使用Beadstudio软件的缺省设置进行基因型鉴定(genotype calling)。基因型鉴定得分低于0.2的被排除在进一步分析之外。鉴定率(call rate)低于90％的SNP和鉴定率低于95％的个体被筛除。使用基于鉴定率＞90％、最小等位基于频率(MAF)＞1％、Hardy-Weinberg p值＞10^-7的实测SNP的MACH进行推算(Imputation)。在得到的推算数据中，低推算准确度(r2-hat＜0.3)的SNP被忽略。使用[28]中所述的原始主成分(ancestry principal component)来评估分群和关联性。每个遗传相关/等同的个体对(关联度＞0.25)之一被排除在进一步分析之外。评估每个基因分型个体的性别以与临床数据一致。使用具有准确最大可能性估算的逻辑回归进行关联分析。此模型包括协变量例如前两个原始主成分值和乙型肝炎病毒感染状态(由HBs-Ag的存在与否定义)。Bonferroni校正用于控制家族方面的误差率。进行一百万个独立测试[Han et al 2009 PlosGenetics]，得到共用的5＊10^-8的阈值。

HIV共感染的影响

为考虑HIV共感染对自发HCV清除的可能影响，首先单独分析HCV单感染和共感染的个体，随后本发明人在基因组范围内对所述两个群体进行了meta分析。使用方差倒数加权(inverse-varianceweighting)对从每个群体得到的关联信号进行meta分析。使用具有准确最大可能性估算的逻辑回归模型进行关联分析。所述模型包括影响单变量分析结果的协变量(P＜0.1)，以及所述前两个原始主成分。本发明人使用中等p值取舍点作为协变量的准入标准以避免忽略潜在的重要因子。考虑到使用了不同基因分型平台，本发明人排除了在任意两个平台之间等位基因频率(慢性感染的患者中)明显不同(卡方检验(Chi-square test)，P＜10^-4)的任何SNP。将基因组控制应用于基因组方面的p值，得到λ＝1.04(对于单感染的群体)、1.02(对于共感染的群体)。

这些值表明有非常轻微的膨胀，并证实了通过在所述模型中包括前两个原始主成分充分校正了可能的分群。使用Bonferroni校正来校正多个试验；我们使用5＊10^-8作为显著性阈值。

实施例2

结果

本研究包括1142个HCV感染的患者(726个单感染和416个HIV共感染)，其中245个具有自发病毒清除，897个具有慢性感染(表3)。在慢性感染的患者中，404个可被评估对聚乙二醇化干扰素α-利巴韦林结合治疗有反应。如预期的，与自发清除有关的因子包括较低的年龄(P＜0.001)、女性(P＜0.001)和乙型肝炎有活性(P＜0.001)。与治疗反应性有关的因子包括较低的年龄(P＝0.05)、女性(0.03)、病毒基因型2或3(P＜0.001)、较低的病毒载量(P＜0.001)和有限的纤维化(P＝0.02)。

SNP rs8099917明显与自发丙型肝炎清除有关(图1)。在自发清除的患者中，基因型T/T(原始等位基因)、G/T(杂合子)和G/G(纯合子)的频率分别为0.79、0.20和0.01，在慢性感染的患者中分别为0.57、0.38和0.05(OR＝0.38，95％置信区间[CI]0.27-0.53，P＝2.86E-08，在共显性模式(additive model)下，表4，图2A)。在考虑年龄、性别、活性乙肝和HCV风险群体的多变量分析中，rs8099917与自发清除的关联仍然存在(OR＝0.38，95％ CI 0.28-0.53，P＝6.81E-09，在共显性模式下，表4)。

rs8099917的G等位基因也与对聚乙二醇化干扰素α-利巴韦林结合治疗无反应相关(图2B)。在具有持续病毒反应的患者中，基因型T/T、G/T和G/G的频率分别为0.68、0.29和0.03，在无反应患者中分别为0.43、0.50和0.07(OR＝0.36，95％ CI 0.23-0.53，P＝8.96E-07，在显性模式(dominant model)下，OR＝0.38，95％ CI 0.27-0.53，P＝2.86E-06，在共显性模式下，表4，图2B)。在考虑年龄、性别、HCV RNA、HCV基因型、纤维化阶段和糖尿病的多变量模型中，rs8099917与对治疗无反应的关联仍然存在(OR＝0.29，95％ CI 0.16-0.53，P＝6.96E-05，在共显性模式下)。综上，在自发清除(0.07)、持续病毒反应(0.17)和对治疗无反应(0.32)的患者中，rs8099917的次要等位基因频率逐渐增加。

rs8099917 SNP位于人染色体19长臂中编码三种细胞因子基因即IL28B、IL28A和IL29的约80kB区域内(如果所述受试者是人)(图3A)。单倍型域作图显示出rs8099917是包含整个IL-28B基因的单倍型域的一部分。不同SNP的P值的图示显示出在IL28B单倍型域中的自发清除和对治疗反应都具有一致的关联模式(图3B)。

在HCV单感染个体(OR＝2.49，95％CI＝1.64-3.79，P＝1.96＊10-5)以及HCV/HIV共感染个体(OR＝2.16，95％CI＝1.47-3.18，P＝8.24＊10-5)中均观察到了所述关联。对于自发清除，表4示出了在单感染和共感染患者组中不同基因型的分布和相关的清除频率。

实施例3

病原体遗传风险决定子。

本发明人还评估了宿主和病原体遗传风险决定子的联合贡献。根据病毒基因型(病毒基因型2或3，相对病毒基因型1或4)和宿主多态性(宿主rs8099917G风险等位基因携带者，相对非携带者，表5)将患者分为四组。治疗失败仅发生在16％的具有两种低风险参数的患者中，而在具有两种高风险参数的患者中则为72％(OR＝18.89[95％CI：12.87-27.71]，P＝1.84E-14，表5)。在被基因型1或4感染的患者中，治疗失败在72％的感染的风险等位基因携带者中发生，而在非携带者中仅为38％(OR＝6.54[95％CI：4.65-9.20]，P＝3.70E-8)。在被基因型2或3感染的患者中，治疗失败在25％的风险等位基因携带者中发生，而在非携带者中仅为16％(OR＝3.32[95％CI：2.21-4.99]，P＝3.27E-3)。此外，表4示出了分别被病毒基因型1&4或2&3感染的患者组中不同基因型(TT，TG，GG)的分布，以及相应的对治疗有反应或无反应的频率。

对表2的注解

应注意表2中给出的SNP的野生型/风险等位基因可在表1中提到的相应序列的相同或相反链上读出。

对表3的注解

¹ SCCS代表瑞士丙型肝炎群体研究，SHCS代表瑞士HIV群体研究；对38个被HIV感染的SCCS患者与SHCS患者一起进行了分析。

² HB抗原在352个单感染和56个共感染患者中缺失。

³ 在设定点(对于清除终点)和治疗前(对于治疗终点)的HCVRNA。

⁴ 严重饮酒者定义为每日使用超过40g酒精，多于5年。

⁵ 治疗前活组织检查数据在128个患者中缺失。严重纤维化和炎症被定义为METAVIR得分＞2。

对表4的注解

¹ 最可能的模型

² 对年龄、性别、HBs AG和风险类型校正

³ 对年龄、性别、HCV RNA、HCV基因型、纤维化阶段和糖尿病校正

⁴ 对年龄、性别、HCV RNA、纤维化阶段和糖尿病校正

对表5的注解

¹ 对纤维化阶段、性别、年龄、基线HCV病毒载量和前两个原始主成分校正。

² 在分析基因型1或4患者时，治疗失败在72％的风险等位基因携带者中发生，而在非携带者中仅为38％(OR＝6.54[95％CI：4.65-9.20]，P＝3.70E-8)。

表5治疗反应的病毒和宿主遗传决定子的联合分析

表6PCR和测序引物(IL28B基因座)

参考文献

(1)Seeff LB，Hollinger FB，Alter HJ，Wright EC，Cain CM，Buskel ZJ，et al.Long-term mortality andmorbidity of transfusion-associated non-A，non-B，and type C hepatitis：A National Heart，Lung，andBlood Iustiute collaborative study.Hepatology 2001 Feb；33(2)：455-463.

(2)Davila JA，Morgan RO，Shaib Y McGlynn KA，El Serag HB.Hepatitis C infection and the increasngincidence of hepatocelular carcinoma：a population-based study.Gastroenterology 2004Nov；127(5)：13721380.

(3)Thomas DL，Astemborski J，Rai RM，Anania FA，Schaeffer M，Galai N，et al.The natural history ofhepatitis C virus infection：host，viral，and environmental factors.JAMA 2000 Jul 26；284(4)：450-456.

(4)Williams R.Global challenges in liver disease.Hepatology 2006 Sep；44(3)：521-526.

(5)Thomas DL，Astemborski J，Rai RM，Anania FA，Schaeffer M，Galai N，et al.The natural history ofhepatitis C virus infe ction：host，viral，and environmental factors.JAMA 2000 Jul 26；284(4)：450-456.

(6)Lauer GM，Walker BD.Hepatitis C virus infection.N Engl J Med 2001 Jul 5；345(1)：41-52.

(7)Manns MP，McHutchison JG，Gordon SC，Rustgi VK，Shiffman M，Reindollar R，et al.Peginterferonalfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin or initial treatment of chronichepatitis C：a randomised trial.Lancet 2001 Sep 22；358(9286)：958-965.

(8)Chung RT，Andersen J，Voberding P，Robb ns GK，Liu T，Sherman KE，et al.Peginterferon Alfa-2aplus ribavirin versus interferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C in HIV-coinfected persons.N Engl J Med 2004 Jul 29；351(5)：451-459.

(9)Fried MW，Shiffman ML，Reddy KR，Smith C，Marinos G，Goncales FL，Jr.，et al.Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus in fection.N Engl J Med 2002 Sep 26；347(13)：975-982.

(10)Asselah T，Bieche I，Paradis V，Bedossa P，Vidaud M，Marcellin P.Genetics，genomics，andproteomics：implications for the diagnosis and the treatment of chronic hepatitis C.Semin Liver Dis2007 Feb；27(1)：13-27.

(11)Massard J，Ratziu V，Thabut D，Moussalli J，Lebray P，Benhamou Y，et al.Natural histoty andpredictors of disease severty in chronic hepatitis C.J Hepatol 2006；44(1 Suppl)：S19-S24.

(12)Thio CL.Host genetic factors and antiviral immune responses to hepatitis C virus.Clin Liver Dis 2008Aug；12(3)：713-26，xi.

(13)Yee LJ.Host genetic determinants in hepatitis C virus infection.Genes Immun 2004 Jun；5(4)：237-245.

(14)Kenny-Walsh E.Clinical outcomes after hepatitis C infection from contaminated anti-D immuneglobulin.Irish Hepatology Research Group.N Engl J Med 1999 Apr 22；340(16)：1228-1233.

(15)Muller R.The natural history of hepatitis C：clinical experiences.J Hepatol 1996；24(2Suppl)：52-54.

(16)Kau A，Vermehren J，Sarrazin C.Treatment predictors of a sustained virologic response in hepatitis Band C.J Hepatol 2008 Oct；49(4)：634-651.

(17)Grakoui A，Shoukry NH，Woollard DJ，Han JH，Hanson HL，Ghrayeb J，et al.HCV persistence andimmune evasion in the absence of memory T cell help.Science 2003 Oct 24；302(5645)：659-662.

(18)Knapp S，Yee LJ，Frodsham AJ，Hennig BJ，Hellier S，Zhang L，et al.Polymorphisms in interferoninduced genes and the outcome of hepatitis C virus infection：roles of MxA，OAS-1 and PKR.GenesImmun 2003 Sep；4(6)：411-419.

(19)Knapp S，Hennig BJ，Frodsham AJ，Zhang L，Hellier S，Wright M，et al Interleukin-10promoterpolymorphisms and the outcome of hepatitis C virus infection Immunogenetics 2003 Sep；55(6)：362-369.

(20)Wietzke-Brann P，Maouzi AB，Manhardt LB，Bickeboller H，Ramadori G，Mihm S.Interferonregulatory factor-1 promoter polymorphism and the outcome of hepatitis C virus infection.Eur JGastroenterol Hepatol 2006 Sep；18(9)：991-997.

(21)Yee LJ，Perez KA，Tang J，van Leeuwen DJ，Kaslow RA.Association of CTLA4 polymorphisms withsustained response to interferon and ribavirin th erapy for chronic hepatitis C virus infection.J InfectDis 2003 Apr 15；187(8)：1264-1271.

(22)Goulding C，McManus R，Murphy A，MacDonald G，Barrett S，Crowe J，et al.The CCR5-delta32mutation：impact on disease outcome in individuals with hepatitis C infection from a single source.Gut2005 Aug；54(8)：1157-1161.

(23)Prasad L，Spicher VM，Zwahlen M，Rickenbach M，Helbling B，Negro F.Cohort Profile：the SwissHepatitis C Cohort Study(SCCS).Int J Epidemiol 2007 Aug；36(4)：731-737.

(24)Neumann-Haefelin C，Thimme R.Impact of the genetic restriction of virus-specific T-cell responses inhepatitis C virus infection.Genes Immun 2007 Apr；8(3)：181-192.

(25)Singh R，Kaul R，Kaul A，Khan K.A comparative review of HLA associations with hepatitis B and Cviral infections across global populations.World J Gastroenterol 2007 Mar 28；13(12)：1770-1787.

(26)Hoofnagle JH.Course and outcome of hepatitis C.Hepatology 2002 Nov；36(5 Suppl 1)：S21-S29.

(27)Thomas DL.Hepatitis C and human immunodeficiency virus infection.Hepatology 2002 Nov；36(5Suppl 1)：S201-S209.

(28)Novembre J，Jo hnson T，Bryc K，Kutalik Z，Boyko AR，Auton A，et al. Genes mirror geography withinEurope.Nature 2008 Aug 31.

(29)Micallef JM，Kaldor JM，Dore GJ.Spontaneous viral clearance following acute hepatitis C infection：asystematic review of longitudinal studies.J Viral Hepat 2006 Jan；13(1)：34-41.

(30)Martin-Carbonero L，Barreiro P，Jimenez-Galan G，Garcia-Berriguete R，Nunez M，Rios P，et al.Clearance of hepatitis C virus in HIV-infected patients with multiple chron c viral hepatitis J ViralHepat 2007 Jun；14(6)：392-395.

(31)Wietzke-Braun P，Manhardt LB，Rosenberger A，Uy A，Ramadori G，Mihm S，Spontaneous eliminationof hepatitis C virus infection：A retrospcctivc study on dcmographic，clinical，and serologicalcorrelates.World J Gastroenterol 2007 Aug 21；13(31)：4224-4229.

(32)Gale M，Jr.，Foy EM.Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus.Nature 2005 Aug18；436(7053)：939-945.

(33)Sheppard P，Kindsvogel W，Xu W，Henderson K，Schlutsmeyer S，Whitmore TE，et al.IL-28IL-29and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol 2003 Jan；4(1)：63-68.

(34)Renauld JC.Class II cytokine receptors and their ligands：key antiviral and inflammatory modulators.Nat Rev Immunol 2003Aug；3(8)：667-676.

(35)Li M，Liu X，Zhou Y，Su SB.Interferon-lambdas：the modulators of antivirus，antitumor，and immuneresponses J Leukoc Biol 2009 Jul；86(1)：23-32.

(36)Kotenko SV，Gallagher G，Baurin VV，Lewis-Antes A，Shen M，Shah NK，et al.IFN-lambdas mediateantiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.Nat Immunol 2003Jan；4(1)：69-77.

(37)Filppini P，Coppola N，Scolastico C，Rossi G，Onofrio M，Sagnelli E，et al.Does HIV infection favorthe sexual transmission of hepatitis C？Sex Transm Dis 2001 Dec；28(12)：725-729.

(38)UzéG，Monneron D.IL-28and IL-29：newcomers to the interferon family.Biochimie 2007 Jun-Jul；89(6-7)：729-34.

(39)Innis MA et al.，1990.″Academic Press″.PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.

(40)Bustin SA 2000).″Journal of Molecular Endocrinology，25″.Absolute quantification of mRNA usingreal-time reverse transcription polymerase chain reaction assays.pp.169-193

(41)Kwoh et al ，1990 Am.Biotechnol.Lab.8：14-25.

(42)Hagen-Mann，et al.，1995Exp，Clin.Endocrinol.Diabetes 103：150-155.

(43)Walker et al.，1992PNAS，89：392-396.

(44)Walker et al.，1992Nucleic Acids Res.20：1691-1696.

(45)Kwoh et al，1989，PNAS 86：1173-1177.

(46)Guatelli et al，1990，PNAS 87：1874-1878

(47)Mueller et al.，1997，Histochem.Cell Biol.108：431-437.

(48)Lizardi et al.，1988，BioTechnology 6：1 197-1202.

(49)Cahill et al.，1991，Clin.Chem.37：1482-1485.

(50)Lewis，1992，Gen Eng.News 12(9)：1

Claims

1.一种确定患慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种多态性标志的存在是所述患者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征。

3.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种多态性标志位于染色体19上约80kb的区域内。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志位于基本由选自SEQ ID No 1到SEQ ID No 34的序列构成的核酸区段上。

5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志是与选自以下SNP组的至少一种SNP相关的多态性位点：

rs11879005，rs12975799，rs11083519，rs955155，rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs1083727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587，rs30480.。

6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志是与选自根据权利要求5的SNP组的至少一种SNP完全连锁不平衡或强连锁不平衡的多态性位点。

7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志是选自根据权利要求5的SNP组的至少两种SNP的组合。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志选自rs8099917的G/T、rs8099917的G/G、rs576832的C/G、rs576832的C/C、rs12980275的G/A或rs12980275的G/G。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述丙型肝炎治疗是基于干扰素的治疗。

10.权利要求9的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自IFNα、IFNλ或任何聚乙二醇化干扰素。

11.权利要求9或10的方法，其中所述基于干扰素的治疗与利巴韦林或任何抗蛋白酶药物或任何抗病毒药物或其任意组合结合。

12.权利要求9-11任一项的方法，其中所述慢性丙型肝炎由HCV的病毒基因型1、2、3或4导致。

13.权利要求1-12任一项的方法，还包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的HCV病毒基因型。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述受试者被HIV共感染。

15.一种确定丙型肝炎感染受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的方法，所述方法包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否。

16.权利要求15的方法，其中所述至少一种多态性标志的存在是所述患者具有增加的非自发丙型肝炎清除的易感性的指征。

17.权利要求15或16的方法，其中所述至少一种多态性标志位于染色体19上约80kb的区域内。

18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志位于基本由选自SEQ ID No 1到SEQ ID No 34的序列构成的核酸区段上。

19.权利要求15-17任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志是与选自以下SNP组的至少一种SNP相关的多态性位点：

rs11879005，rs12975799，rs11083519，rs955155，rs12972991，rs 12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587，rs30480.。

20.权利要求15-18任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志是与选自根据权利要求19的SNP组的至少一种SNP完全连锁不平衡或强连锁不平衡的多态性位点。

21.权利要求15-18任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志是选自根据权利要求19的SNP组的至少两种SNP的组合。

22.权利要求15-18任一项的方法，其中所述至少一种多态性标志选自rs8099917的G/T、rs8099917的G/G、rs576832的C/G、rs576832的C/C、rs12980275的G/A或rs12980275的G/G。

23.权利要求15-22任一项的方法，其中所述慢性丙型肝炎由HCV的病毒基因型1、2、3或4导致。

24.权利要求15-23任一项的方法，还包括确定从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的HCV病毒基因型。

25.权利要求15-24任一项的方法，其中所述受试者被HIV共感染。

26.一种治疗慢性丙型肝炎患者的方法，包括：

i)确定至少一种所述患者的多态性标志是否位于从来自所述患者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因内，其中所述至少一种所述患者的多态性标志选自

rs11879005，rs12975799，rs11083519，rs955155，rs12972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs 12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587，rs30480，

ii)基于所述至少一种所述患者的多态性标志是否与对丙型肝炎治疗无反应的易感性增加相关而对所述患者进行治疗。

27.权利要求26的方法，其中所述丙型肝炎治疗是基于干扰素的治疗。

28.权利要求27的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自IFNα、IFNλ或任何聚乙二醇化干扰素。

29.权利要求27或28所述的方法，其中所述基于干扰素的治疗与利巴韦林或任何抗蛋白酶药物或任何抗病毒药物或其任意组合结合。

30.一种治疗慢性丙型肝炎患者的方法，包括：

rs11879005，rs12975799，rs11083519，rs955155，rs2972991，rs12980275，rs8105790，rs11881222，rs10853727，rs8109886，rs8113007，rs8099917，rs7248668，rs16973285，rs10853728，rs4803223，rs12980602，rs4803224，rs664893，rs576832，rs11671087，rs251910，rs7359953，rs7359950，rs2099331，rs11665818，rs570880，rs503355，rs30461，rs194014，rs251903，rs12979175，rs39587，rs30480，

ii)确定从来自所述患者的生物样本中分离的核酸样本中的HCV病毒基因型，

iii)并且基于所述至少一种所述患者的多态性标志以及HCV病毒基因型是否与对丙型肝炎治疗无反应的易感性增加相关而对所述患者进行治疗。

31.权利要求30的方法，其中所述丙型肝炎治疗是基于干扰素的治疗。

32.权利要求31的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自IFNα、IFNλ或任何聚乙二醇化干扰素。

33.权利要求31或32的方法，其中所述基于干扰素的治疗与利巴韦林或任何抗蛋白酶药物或任何抗病毒药物或其任意组合结合。

34.权利要求30-33任一项的方法，其中所述受试者被HIV共感染。

35.一种评估患有慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括：

i)通过确定从所述受试者的生物样本中分离的核酸样本的IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否而辨别所述受试者中具有对丙型肝炎治疗无反应的易感性的受试者，所述至少一种多态性标志的存在是所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征，

ii)建立丙型肝炎治疗方案。

36.权利要求35的方法，其中所述丙型肝炎治疗是基于干扰素的治疗。

37.权利要求36的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自IFNα、IFNλ或任何聚乙二醇化干扰素。

38.权利要求36或37的方法，其中所述基于干扰素的治疗与利巴韦林或任何抗蛋白酶药物或任何抗病毒药物或其任意组合结合。

39.权利要求35-38任一项的方法，其中所述受试者被HIV共感染。

40.一种评估患有慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的方法，所述方法包括：

i)通过确定

--从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标记的存在与否，所述至少一种多态性标志的存在是所述受试者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征，和

--HCV病毒基因型，基因型1或4的存在是所述患者具有增加的对丙型肝炎治疗无反应的易感性的指征，

从而辨别所述受试者中具有对丙型肝炎治疗无反应的易感性的受试者，

ii)建立丙型肝炎治疗方案。

41.权利要求40的方法，其中所述丙型肝炎治疗是基于干扰素的治疗。

42.权利要求41的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自IFNα、IFNλ或任何聚乙二醇化干扰素。

43.权利要求41或42的方法，其中所述基于干扰素的治疗与利巴韦林或任何抗蛋白酶药物或任何抗病毒药物或其任意组合结合。

44.权利要求40-43任一项的方法，其中所述受试者被HIV共感染。

45.一种用于根据权利要求1-14任一项的方法确定患慢性丙型肝炎的受试者中对丙型肝炎治疗无反应的易感性的试剂盒，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中位于IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否的试剂和ii)使用说明书。

46.一种用于根据权利要求15-25任一项的方法确定患丙型肝炎的受试者中非自发丙型肝炎清除的易感性的试剂盒，所述试剂盒包含i)用于选择性检测从来自所述受试者的生物样本中分离的核酸样本中IL28B/A和/或IL-29基因座内至少一种多态性标志的存在与否的试剂和ii)使用说明书。

47.权利要求45或46的试剂盒，其中所述试剂还包含旨在检测所述病毒基因型的另一引物、引物组或引物阵列。

48.权利要求45-47任一项的方法，其中所述受试者被HIV共感染。