JP4295955B2 - インターフェロンαレセプター２型遺伝子の多型およびその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、対象、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染者などのインターフェロンを投与されるべき対象においてインターフェロンの効果を予測するためのマーカー遺伝子、それを利用したインターフェロンの効果を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本にはＣ型肝炎ウイルス（以下ＨＣＶ）感染者が約２００万人存在する。ＨＣＶに感染した人の多くは、やがて慢性肝炎を発症し、その７０％近くの人が、更に１０年から２０年を経た後で肝癌を発症すると考えられている。現在、慢性肝炎の治療にはインターフェロン（以下ＩＦＮ）αないしβが有効であるとされている。しかしながら、ＩＦＮαおよびβの効果は、宿主とウイルスに関する幾つかの要因によって大きく左右される。
【０００３】
ＨＣＶ感染患者に対するＩＦＮαの治療効果に影響を与える因子としては次のようなことが知られている。まず、ウイルスの因子としては、血中のウイルス量が多い患者ほどＩＦＮαおよびβの効果が低く、また、タイプ１よりタイプ２のウイルスに感染している患者の方が治療効果は高い（Ａ． Ｔｓｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９， １０８８−１０９４ １９９４）。
【０００４】
一方、宿主の側の要因によってもＩＦＮαおよびβの治療効果は異なる。例えば、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の遺伝子の二箇所のＳＮＰｓの遺伝子型により（Ｍ． Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２９； ６９５−７００， １９９８）、また、ＭｘＡ遺伝子のプロモータ領域に存在するＳＮＰの遺伝子型（Ｍ． Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ， ４３； １２４−１２７， ２０００）、さらにはインターフェロンαレセプター１型遺伝子（以下ＩＦＮＡＲ１と記す）のマイクロサテライトのＧＴ反復配列の数（特願２００１−３１８４７２）によりその治療効果は左右される。
【０００５】
現在、ＩＦＮによる治療には、重大な副作用が伴うこと、治療期間も長期に及ぶこと、また、治療に係る費用が高額であること等の問題がある。このようなことを考慮すると、効果が期待できない患者にＩＦＮを投与することは患者を苦しめるばかりではなく、無駄に多額の医療費を患者や国に負担させることになる。従って、個々の患者についてＩＦＮ治療が期待できるかどうかを予め予測するための技術の開発が強く望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、対象、特に、インターフェロンを投与されるべき対象におけるＩＦＮの治療効果の予測をより精度よく行う方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下のような本発明によって解決される。即ち、
（I） インターフェロンαレセプター２型遺伝子のプロモーター領域の−１３４位の、対象においてインターフェロン治療の有効性を予測するための単塩基多型マーカー；
（II） インターフェロンαレセプター２型遺伝子のプロモーター領域の−７５位の、対象においてインターフェロン治療の有効性を予測するための単塩基多型マーカー；
（III） （１）前記対象に由来する核酸サンプルを得ることと、
（２）（１）の核酸サンプルについて、前記（I）および（II）に記載の単塩基多型マーカーの遺伝子型と、インターフェロンαレセプター１型遺伝子のプロモーター領域のマイクロサテライトマーカーの遺伝子型を決定することと、
（３）（２）で決定された遺伝子型からインターフェロン治療の有効性の予測を行うことと、
を具備する対象においてインターフェロン治療の有効性を予測する方法；
（IV） インターフェロンαレセプター２型遺伝子の遺伝子型を検出するための核酸プローブであって、配列番号１に記載の塩基配列およびその相補鎖からなる群より選択されるポリヌクレオチドに含まれる連続した８から５００塩基を含み、且つ配列番号１の塩基配列における１３６７位または１４２６位の少なくとも１の単塩基多型部位の塩基を含む核酸プローブ；および
（V） 上記（IV）に記載の核酸プローブを具備する塩基配列検出用チップ。
【０００８】
【発明の実施の形態】
１．用語の説明
本明細書において「インターフェロン」とは、インターフェロンα、β、γおよび／またはωを示す語として使用する（以下、インターフェロンをＩＮＦと記す）。ＩＦＮαおよびβのレセプターのうち、１型のレセプターをコードする遺伝子を「ＩＦＮＡＲ１遺伝子」と記し、同じく２型のレセプターをコードする遺伝子を「ＩＦＮＡＲ２遺伝子」と記す。またここで、「ＩＦＮの治療の有効性」とは、ＩＦＮにより治療され得る疾患を有する対象において、ＩＦＮが前記疾患を治療できる可能性の程度をいう。
【０００９】
従って、治療効果が低いと予測された場合には、ＩＦＮを投与してもその対象が罹患する疾患は治療される可能性が低いと考えられる。従って、そのような対象へのＩＦＮの投与は控えた方がよいであろう。一方、治療効果が高いと予測された場合には、ＩＦＮの投与により、その対象における疾患が治療される可能性は高い（または、低くはない）と考えられる。従って、そのような対象へのＩＦＮの投与は行って見る価値があると考えられる。
【００１０】
例えば、そのような疾患の例は、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎などの肝炎、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫、腎癌、多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、亜急性硬化性全脳炎、ウイルス性脳炎、免疫抑制患者の全身性帯状疱疹及び水痘、上咽頭未分化癌、聴力低下を伴うウイルス性内耳感染症、ヘルペス性角膜炎、偏平コンジローマ、尖圭コンジローマ、アデノウイルス及びヘルペスウイルス感染による結膜炎、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、子宮頸癌、癌性胸水症、角化棘細胞腫、基底細胞癌およびδ型慢性活動性肝炎などが挙げられるが、これに限定するものではない。また、対象の体質を調べる目的などのために、疾患を有さない健康な対象についてＩＦＮの有効性を調べてもよい。
【００１１】
ここにおいて「多型遺伝子」または「多型」とは、１つの遺伝子座を占める複数種の対立遺伝子群、又はこのような対立遺伝子群に属する個々の対立遺伝子を指称するものとする。また、多型部位の中で１塩基のみが異なるものを、「単塩基多型」（Single Nucleotide Polymorphism、以後、SNPと称する）と指称する。
【００１２】
ここで使用される「単塩基多型マーカー」とは、その単塩基多型の遺伝子型によって、ＩＦＮの治療効果を予測できる指標として使用されるマーカーである。具体的には、対象より採取されたサンプル中に含まれる特定の核酸の特定の部位を示す。また、ここで使用される「マイクロサテライトマーカー」とは、ＧＴの反復配列を指し、その反復回数、即ち、当該マイクロサテライト多型の遺伝子型、からＩＦＮの治療効果を予測できる指標として使用されるマーカーである。具体的には、対象より採取されたサンプル中に含まれる特定の核酸の特定の部位を示す。これらのマーカーは、ＩＦＮの治療効果を予測するために使用することが可能である。
【００１３】
ここで使用される「遺伝子型」の語は、注目している遺伝子座の対立遺伝子の存在状態を示す。またここで使用される「ＩＦＮ感受性関連多型」とは、ＩＦＮの有効性を左右する多型遺伝子をいう。
【００１４】
２．インターフェロンαレセプター２型の新規ＳＮＰ
今回、発明者らは、インターフェロンαレセプター２型（以下、ＩＦＮＡＲ２と記す）遺伝子に新規のＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）を見出した。更に鋭意研究の結果、この新規のＳＮＰは、ＨＣＶ感染者におけるＩＦＮの治療効果を予測するためのマーカー、即ち、対象のＩＦＮ感受性を判定するためのマーカーとして利用できることを見出した。このような知見に基づいて本発明は達成された。
【００１５】
今回、本発明者によって発見されたＩＦＮＡＲ２の新規ＳＮＰｓは、転写開始部位を＋１として、ＩＦＮＡＲ２のプロモーター領域の−１３４番目（以下−１３４または−１３４位と記す）と−７５番目（以下−７５または−７５位と記す）に存在する。図１にＩＦＮＡＲ２遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の１例を示す。配列の左側の数字は、ｍＲＮＡの転写開始点を＋１とした場合の位置を示す。図１の下線部が当該ＳＮＰの部位であり、この例では、当該単塩基多型マーカーである−１３４がチミン、−７５がシトシンである例が示される。
【００１６】
配列表には、配列番号１として、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のプロモーター領域を含む配列の例を示す。配列番号１で示される塩基配列では、当該ＳＮＰである−１３４は１３６７位、−７５は１４２６位に示される。本明細書の配列表および図面に記載された各配列中で、多型部位は任意の塩基を表す表記「Ｎ」または「ｎ」によって示される。「Ｎ」および「ｎ」はアデニン、チミン、グアニンまたはシトシンの何れかの塩基であればよい。
【００１７】
一般的には、−１３４の取り得る塩基は、チミン（以下、Ｔまたはｔと記す）またはグアニン（以下、Ｇまたはｇと記す）であり、詳しくは、Ｔ／Ｔホモ型、Ｇ／Ｇホモ型およびＴ／Ｇヘテロ型である。また、−７５の取り得る塩基は、シトシン（以下、Ｃまたはｃと記す）またはアデニン（以下、Ａまたはｃと記す）であり、詳しくは、Ｃ／Ｃホモ型、Ａ／Ａホモ型およびＣ／Ａヘテロ型である。
【００１８】
本明細書において、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の−１３４と−７５についてＳＮＰｓの遺伝子型の両方を一括して以下のように表記する。例えば、−１３４がＴ／Ｔホモ型であり、且つ−７５がＣ／Ｃホモ型である場合には、ＴＴ／ＣＣと記す。また、−１３４がＧ／Ｇホモ型であり、−７５がＡ／Ａホモ型である場合には、ＧＧ／ＡＡと記す。各表記と−１３４および−７５の遺伝子型の関係を表１に示す。
【００１９】
【表１】

【００２０】
３．ＩＦＮＡＲ２のＳＮＰｓの利用
上述したようにＩＦＮＡＲ２遺伝子に存在する２つのＳＮＰｓは、対象におけるＩＦＮの治療効果を予測するためのマーカーとして使用することが可能である。例えば、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の当該ＳＮＰｓの遺伝子型と、ＩＦＮＡＲ１遺伝子のプロモータ領域のマイクロサテライト多型の遺伝子型とを、対象について解析し、それらの遺伝子型からＩＦＮの治療効果を予測することが可能である。この場合、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の当該ＳＮＰｓは、ＩＦＮＡＲ１遺伝子の多型による予測を更に確実なものとし、予測の精度を向上できる。
【００２１】
本発明者らは、既に、特願２００１−３１８４７２によりＩＦＮＡＲ１のマイクロサテライト多型のＧＴ反復配列数によるＩＦＮ治療効果が予測することを提案している。本発明の態様に従うと、特願２００１−３１８４７２に開示される方法に比較して、より高い精度でＩＦＮ治療効果を予測することが可能である。また、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶ）感染者の場合には、一般的に罹患しているウイルスの型や量を特に考慮しなくともＩＮＦの治療効果を予測できる。本発明の態様に従う予測する方法の例についての説明は、次項のＩＦＮＡＲ１遺伝子の多型に関する説明の後に行う。
【００２２】
図２にＩＦＮＡＲ１のプロモーター領域からイントロン１の領域を示す。配列の左側の数字は、ｍＲＮＡの転写開始点を＋１とした場合の位置を示す。問題のマイクロサテライト多型は、−７７位から−６０位に存在し、図２に記載された配列の反復回数は９である。しかしながらこの反復回数は、遺伝子型の違いによって異なる反復回数で存在する。従って、反復回数に応じてマイクロサテライト多型の存在部位は変わる。即ち、例えば、反復回数が５の場合には、当該マイクロサテライト多型の部位は、転写開始点を＋１とした場合、−５９番目から−６０番目、即ち、−５９位から−６０位に存在する。また更なるＩＦＮ感受性に関連のないＳＮＰが−４０８位、−１８位および−３位に存在する。
【００２３】
ここで、図２および配列表に示される配列は、ＩＦＮ感受性に関連する多型およびＩＦＮ感受性に関連のないＳＮＰ部位以外の領域は何れの配列でも共通である。本明細書の配列表および図面に記載された各配列中で、多型部位は任意の塩基を表す表記「Ｎ」または「ｎ」によって示される。「Ｎ」および「ｎ」はアデニン、チミン、グアニンまたはシトシンの何れかの塩基を示す。
【００２４】
対象の対立遺伝子における当該マイクロサテライト多型の反復回数が５である５／５ホモ接合の場合、または対象の対立遺伝子の当該反復回数が５と１４である５／１４ヘテロ接合である場合に、対象におけるＩＦＮ治療の有効である可能性は高いと予測される（表２）。それに対して、対象の対立遺伝子の当該反復回数が、５／５ホモ接合または５／１４ヘテロ接合の何れでもない場合には、ＩＦＮ治療の有効である可能性は低いと予測される（表２）。
【００２５】
【表２】

【００２６】
５．ＩＦＮＡＲ２遺伝子とＩＦＮＡＲ１遺伝子の多型を用いたＩＦＮの治療効果の予測
上記のようなＩＦＮＡＲ１遺伝子のマイクロサテライト多型の遺伝子型に加えて、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＳＮＰｓの遺伝子型を考慮すれば、ＩＦＮ治療の効果はより精度よく予測することが可能である。
【００２７】
表３に示すように、対象のＩＦＮＡＲ１遺伝子のマイクロサテライト多型の遺伝子型が５／５および５／１４ではなく（即ち、ｎｏｎ５／５および５／１４であり）、且つＩＦＮＡＲ２の当該ＳＮＰｓの遺伝子型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡである場合、対象におけるＩＦＮの治療効果は低いと予測される（表３）。これに対して、対象のＩＦＮＡＲ１遺伝子のマイクロサテライト多型の遺伝子型が５／１４であり、且つＩＦＮＡＲ２の当該ＳＮＰｓの遺伝子型がＴＴ／ＣＣおよびＧＧ／ＡＡではない（即ち、ｎｏｎＴＴ／ＣＣおよびＧＧ／ＡＡである）場合、対象におけるＩＦＮの治療効果は高いと予測される。従って、このような知見を基に、対象におけるＩＦＮの効果をより高い精度で予測することが可能である。
【００２８】
【表３】

【００２９】
このように、ＩＦＮＡＲ２の当該ＳＮＰｓは、対象におけるＩＦＮの治療効果を予測するためのマーカーとして利用できる。本発明は、そのようなマーカーとしてのＩＦＮＡＲ２の当該ＳＮＰｓ、−１３４および−７５を提供するものである。
【００３０】
６．インターフェロン治療の有効性を予測する方法
本発明では、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のプロモーター領域に新たな２つのＳＮＰｓの存在を発見し、このＳＮＰｓを利用することにより、ＩＦＮの治療効果を予測できることを見出した。このような知見から、本発明は、対象においてＩＦＮの治療効果、即ち、ＩＦＮの有効性を予測する方法を提供する。
【００３１】
本発明によれば、ＩＦＮによる治療の実施に先立って、ＩＮＦを投与されるべき対象、例えば、ＨＣＶ感染者について、ＩＦＮＡＲ１の当該マイクロサテライト多型の遺伝子型とＩＦＮＡＲ２の当該ＳＮＰｓの遺伝子型とを決定し、その遺伝子型から、該ＨＣＶ感染者ではＩＦＮの治療が有効であるかどうかを予測することができる。
【００３２】
本発明に従うと、
（１）前記対象に由来する核酸サンプルを得ることと、
（２）（１）の核酸サンプルについて、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のプロモーター領域の−１３４と−７５に存在する単塩基多型マーカーの遺伝子型と、ＩＦＮＡＲ１遺伝子のプロモーター領域のマイクロサテライトマーカーの遺伝子型決定することと、
（３）（２）で決定された遺伝子型からＩＦＮ治療の有効性の予測を行うことと、
を具備する対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法
が提供される。
【００３３】
また、本発明に従うと、上記（３）の工程において、対象のＩＦＮＡＲ１の遺伝子型が５／５のホモ接合または５／１４のヘテロ接合であり、且つＩＦＮＡＲ２の遺伝子型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡの何れでもない場合に、インターフェロン治療が有効である可能性は高いと予測されることを特徴とする対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法が提供される。
【００３４】
また、上記（３）の工程において、対象のＩＦＮＡＲ１の遺伝子型が５／５でも５／１４ではなく（即ち、ｎｏｎ５／５および５／１４であり）、且つＩＦＮＡＲ２の遺伝子型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡでの何れかである場合には、ＩＦＮ治療が有効である可能性は低いと予測されることを特徴とする対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法が提供される。
【００３５】
本発明に従う「対象」とは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳動物などであってもよいが、ヒトがより好ましい。また、対象は、ＩＦＮが投与されるべきものであることが好ましい。
【００３６】
また、当該対象は、インターフェロンを投与されるべき対象であることが好ましい。ここで、「インターフェロンを投与されるべき対象」とは、ＩＦＮ治療が有効である疾患、好ましくはＩＦＮα、β、γまたはωが有効である疾患に罹患した患者であり得る。ＩＦＮα、β、γまたはωが有効である疾患には、Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎等の肝炎、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫、腎癌、多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、亜急性硬化性全脳炎、ウイルス性脳炎、免疫抑制患者の全身性帯状疱疹及び水痘、上咽頭未分化癌、聴力低下を伴うウイルス性内耳感染症、ヘルペス性角膜炎、偏平コンジローマ、尖圭コンジローマ、アデノウイルス及びヘルペスウイルス感染による結膜炎、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、子宮頸癌、癌性胸水症、角化棘細胞腫、基底細胞癌、並びにδ型慢性活動性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。また、前記対象は、前記のような疾患に罹患していない健康な者であってもよい。
【００３７】
図３を用いて本発明の１態様を説明する。以下の操作は全て実施者の手によって行われる。
【００３８】
ステップ３ａでは、実施者が、対象から血液サンプル等のサンプルを採取し、予測を開始する。採取されたサンプルは、必要に応じて精製および抽出等の処理がなされた後で、ＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型を順不同で決定し、ステップ３ｂへ移行する。
【００３９】
ステップ３ｂでは、ステップ３ａにおいて決定したＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型を判定し、当該ＩＦＮＡＲ１の遺伝子型が５／５ホモ接合または５／１４ヘテロ接合であり、且つＩＦＮＡＲ２の遺伝子型がＴＴ／ＣＣおよびＧＧ／ＡＡ以外である場合はステップ３ｃへ移行し、ＩＦＮＡＲ１の遺伝子型が５／５ホモ接合および５／１４ヘテロ接合以外であり、且つＩＦＮＡＲ２の遺伝子型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡである場合にはステップ３ｄへ移行する。
【００４０】
ステップ３ｃでは、ステップ３ｂの判定結果から、当該対象におけるＩＦＮ治療は有効である可能性が高いと予測し、全予測工程を終了する。
【００４１】
ステップ３ｄでは、ステップ３ｂの判定結果から、当該対象におけるＩＦＮ治療は有効である可能性が低いと予測し、全予測工程を終了する。
【００４２】
或いは、遺伝子型とＩＦＮ感受性を対応付けたテーブル、例えば、表３に表として示したデータテーブル３に従って、即ち、遺伝子型とＩＦＮの感受性を対応付けたデータテーブル３を検索して対応するＩＦＮ感受性を抽出し、当該対象におけるＩＦＮの有効性を決定してもよい。
【００４３】
ここで使用されるデータテーブルは遺伝子型とＩＦＮ感受性またはＩＦＮの効果を対応付けた情報である。データテーブルを表として示したものがテーブル番号に対応する表である。従って、上述の方法において使用した表３は、データテーブルの１例として示したものである。また、ここで使用されるデータテーブルは遺伝子型とＩＦＮの効果を対応付けたものであればよい。表３は、当該遺伝子型とＩＦＮの効果の関係を示す表である。表中の「ＩＦＮＡＲ１とＩＦＮＡＲ２の遺伝子型」の欄は「インターフェロンαレセプター遺伝子の遺伝子型」を示す。具体的には、そこには、ＩＦＮＡＲ１のプロモーター領域のマイクロサテライト多型とＩＦＮＡＲ２のプロモータ領域の−１３４と−７５の遺伝子型が示される。また、「有効性」はＩＦＮ治療の有効性を示す。
【００４４】
また、ここで使用される表３に記載される成分としての「高」および「低」の文字は、遺伝子型とＩＦＮ感受性またはＩＦＮの効果を対応付けた情報を示す表示の１例であり、当該表に記載の文字を限定しようとするものではない。即ち、遺伝子型と著効または非著効との相関関係を実質的に示すことが可能な表記であればよく、例えば、「○」、「×」、「△」であっても、数値、例えば、簡略化された数値によるスコア（例えば、１、２、３、４および５等）であってもよい。
【００４５】
ＩＦＮ感受性に関連する多型の遺伝子型を決定する手段は、それ自身公知の何れの手段を用いておこなってよい。例えば、対象となる対象から得たサンプル、より、目的のポリヌクレオチドを含む核酸を調製し、遺伝子型を決定すればよい。
【００４６】
ここで使用される「サンプル」とは、生物対象から採取した血液、血清、リンパ液および組織等の生物試料をいう。また、「サンプル」必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出等の必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００４７】
生物試料から調製される目的のポリヌクレオチドを含む核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡから調製すればよい。例えば、対象からゲノムＤＮＡサンプルを準備する手段は、対象から得た末梢血中の白血球、単球、リンパ球および顆粒球等の血球細胞からフェノールクロロホルム法、塩析法または市販のキット等を用いて抽出する方法等、一般的に使用される何れの手段を用いて行うことが可能であるmRNAを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。。
【００４８】
ポリヌクレオチドの量が少ないときには、必要に応じてポリヌクレオチドを増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ反応(RT-PCR)を含むポリメラーゼ連鎖反応（以下PCRと略記する）によって行い得る。
【００４９】
必要に応じて、抽出操作及び／又は増幅操作を行った後に、目的とする多型部位の遺伝子型を決定する。遺伝子型を決定する手段は、直接シークエンス法、ＳＳＣＰ法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、特異的プライマー法および塩基配列検出用チップ等の一般的に使用される何れの手段を使用してもよい。また、直接に塩基配列を決定してもよく、DHPLC（変性高速液体クロマトグラフィー）等を利用してもよい。
【００５０】
決定すべきヌクレオチドが、制限酵素の認識部位の中に存在している場合には、制限酵素断片長多型法を用いてもよい。
【００５１】
その他、多型を決定する方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ(PCR-specific sequence primers)法、ドットプロット法とＰＣＲを組み合わせたＰＣＲ−ＳＳＯ（PCR-sequence specific oligonucleotide）法、及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等の周知の方法を使用することもできるが、これらに限定されない。
【００５２】
なお、ドットブロット法とは、配列が既知のプローブ核酸鎖を用いて、試料中に含まれる特定の配列をもった核酸鎖を検出する一つの方法である。この方法では、例えば基板上の有機薄膜に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に蛍光物質等で標識した一本鎖のプローブ核酸鎖の溶液をこの薄膜上の試料に接触させる。試料がプローブ核酸鎖と相補的な配列を有していれば、プローブ核酸鎖とハイブリダイズして二本鎖を形成するので、基板上に固定される。したがって、洗浄により未反応の核酸鎖を除去した後、プローブに付された標識を検出することにより、プローブに対して相補的な配列を有する試料核酸鎖を検出することができる。従って、本発明は、ＩＦＮ感受性関連多型遺伝子の検出における、本発明によるポリヌクレオチドのプローブとしての使用をも含むものである。また、そのようなポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、インターフェロンを投与すべき対象に対してインターフェロン治療が有効であるかどうかを予測するための試験薬或いは塩基配列検出用チップもまた本発明に含まれる。
【００５３】
上記のような方法によって、ＩＦＮＡＲ１に存在する当該マイクロサテライト多型の遺伝子型とＩＦＮＡＲ２に存在する当該ＳＮＰｓの遺伝子型を決定し、その結果を基にＩＦＮ治療の有効性を予測することができる。
【００５４】
７．ＩＦＮ治療の有効性の判定の応用
また、上記した本発明に従う方法における判定は、ＩＮＦＡＲ１とＩＮＦＡＲ２の遺伝子型の情報と共に、更に、従来の公知の他のＩＦＮ感受性関連多型遺伝子の遺伝子型の情報を考慮して判定を行ってもよい。
【００５５】
例えば、ＨＣＶ感染患者に対するＩＦＮα／βの治療効果に影響を与える更なる因子としては、次のようなことが知られている。まず、ウイルスの因子として、血中のウイルス量が多い患者ほどＩＦＮα／βの効果が低いこと、また、タイプ１よりタイプ２のウイルスに感染している患者の方が治療効果の高いことが知られている（A.Tsubota et al., Hepatology 19, 1088-1094 1994）。
【００５６】
また、マンノース結合レクチンをコードするＭＢＬ遺伝子の２箇所のＳＮＰがＸＢタイプの遺伝子型の患者はＹＡタイプの遺伝子型の患者より、ＩＦＮα／βの効き目が悪いことが知られている（M.Matsushita et al.,J. Hepatology 29,695-700, 1998）。また、ＭｘＡタンパクをコードするＭｘＡ遺伝子プロモーター内に存在するＳＮＰがＣ型慢性肝炎患者のインターフェロン治療感受性に關係していることも知られている(M. Hijikata et al., Intervirology 43, 124-127, 2000)。これらＳＮＰの決定は、ＳＮＰを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、その塩基配列を決定することで行われている。
【００５７】
本発明に従うと、これら従来のＩＦＮ感受性関連多型遺伝子およびウイルスの型の情報を当該マイクロサテライト多型の遺伝子型の情報と共に考慮することによって、ＩＦＮを投与されるべき対象、例えば、ＨＣＶ感染者、Ｃ型肝炎患者またはＢ型肝炎患者においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法も提供される。また、上記以外の情報と組み合わせて考慮してもよい。
【００５８】
８．コンピュータを用いてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法
更に、上述したような本発明に従う方法は、コンピュータを用いて解析することも可能である。即ち、本発明は、コンピュータを用いて対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法であって、
（１）オペレータが前記対象に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報をコンピュータに入力すること、
（２）（１）で入力された前記遺伝子型に基づいて、予めコンピュータの記憶手段に記憶された遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたテーブルに従って、コンピュータがＩＦＮ治療の有効性を予測すること、および
（３）（２）で得られた予測結果をコンピュータがオペレータに示すこと、
を具備するコンピュータを用いて対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法も提供する。
【００５９】
図４に、本発明の方法を実施するための装置の１態様の構成図を示す。ここで処理手段４は入力手段２，表示手段３及び記憶手段５に接続されている。
【００６０】
図４に示す通り、本態様であるコンピュータ１は、コンピュータ１に人がデータを入力するための入力手段２と、種々の情報を表示する表示手段３と、当該コンピュータを制御したり種々の処理を行うためのプロセッサまたはＣＰＵ等の処理手段４と、プログラムおよびテーブル等を記憶する記憶手段５を少なくとも具備する。
【００６１】
コンピュータを用いてＩＦＮを投与されるべき対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法の例を図５を用いて以下に説明する。
【００６２】
。ここで処理手段４は、当該コンピュータの各部を統括して制御する主制御部であり、記憶部に記憶される予測プログラムを実行してＩＦＮ治療の有効性を予測する。
【００６３】
ステップ５ａでは、オペレータが、ＩＦＮを投与されるべき対象に由来するＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報を入力手段２から入力すると、入力された情報は、記憶手段５に記録され、ステップ５ｂへ移行する。ここで、入力される遺伝子型の情報は、具体的な遺伝子型であっても生データであってもよく、目的とする遺伝子型の情報を表す何れかの情報であればよい。
【００６４】
ステップ５ｂでは、処理手段４が、記録された情報から、記憶手段５に予め記憶されている遺伝子型とＩＦＮ有効性を対応付けたデータテーブル３（即ち、表３）を読み出し検索することによって対応するＩＦＮ有効性を抽出し、ステップ５ｃに移行する。
【００６５】
ステップ５ｃでは、処理手段４が、ステップ５ｂにおいて決定したＩＦＮ有効性から、当該有効性が「高」であればステップ５ｄへ移行することを判定し、「低」であればステップ５ｅへ移行することを判定する。
【００６６】
ステップ５ｄでは、処理手段４がステップ５ｃの結果から当該対象においてＩＦＮが有効である可能性は高いと予測し、ステップ５ｆに移行する。
【００６７】
ステップ５ｆでは、処理手段４が、ステップ５ｄで予測した結果を表示手段３に表示しおよび／または記憶手段５に記録し、全ての予測工程を終了する。ここでの表示は、予め記憶手段５に記憶したＩＦＮ治療の有効性を示す画像として出力されてもよい。また、必要に応じてステップ５ｆから５ａに移行するようなループを設定してもよい。
【００６８】
ステップ５ｅでは、処理手段４がステップ５ｃの結果から当該対象においてＩＦＮが有効である可能性は低いと予測し、ステップ５ｇに移行する。
【００６９】
ステップ５ｇでは、処理手段４が、ステップ５ｅで予測した結果を表示手段３に表示しおよび／または記憶手段５に記録し、全ての予測工程を終了する。ここでの表示は、予め記憶手段５に記憶したＩＦＮ治療の有効性を示す画像として出力されてもよい。また、必要に応じてステップ５ｇから５ａに移行するようなループを設定してもよい。
【００７０】
ここで使用される「データテーブル」とは遺伝子型とＩＦＮ治療の有効性を対応付けた情報である。例えば、データテーブル３を表として示した例を表３に示す。ここで使用されるテーブルは、遺伝子型とＩＦＮ治療の有効性を対応付けたものであればよい。即ち、遺伝子型とＩＦＮ治療の有効性との相関関係を実質的に示すことが可能な表記であれば、例えば、「○」、「×」、「△」であっても、簡略化された数値によるスコア（例えば、１、２、３、４および５等）であってもよい。
【００７１】
また、上述の方法では、当該ＩＦＮＡＲ１および２の遺伝子型のみを決定し情報として入力して予測を行っているが、当該遺伝子型の情報に加えて、例えば、それ自身公知の他のＩＦＮ感受性関連多型遺伝子および／またはＣ型肝炎ウイルスの型などのデータとＩＦＮ治療の有効性を考慮し、当該情報として入力して予測を行ってもよい。その場合、入力する情報に応じてそれに応じて使用するテーブルの構成を変更すればよい。
【００７２】
また、上述した本発明に従う方法は、所望に応じて本願発明の範囲を逸脱しない範囲において変更することが可能である。
【００７３】
更に、上述したコンピュータを用いて対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法を実行するためのプログラムも本発明の範囲内である。そのようなプログラムは、例えば、対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測するためにコンピュータを、
（１）前記対象に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報を記録させる手段、
（２）（１）で記録された遺伝子型から、予めコンピュータに記憶されている遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたデータテーブルに従って、ＩＦＮ治療の有効性を導出する手段、および
（３）（２）で得られた予測結果を出力する手段、
として機能させるためのプログラムである。
【００７４】
更に前記プログラムは、対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測するためにコンピュータを、前記対象に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報を入力する入力手段として機能させてもよい。
【００７５】
また、対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する有効性予測装置であって、
（１）遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたデータテーブルを記憶する記憶手段と、
（２）被検対象である対象に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報を入力する入力手段と、
（３）前記入力手段を通じて入力された遺伝子型と、前記記憶手段が記憶するデータテーブルとに基づいて、ＩＦＮ治療の有効性を予測する予測手段と、
（４）前記予測手段の予測結果を表示する表示手段とを具備することを特徴とする有効性予測装置も本発明の範囲内である。
【００７６】
また、本発明は、コンピュータを用いて対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法であって、
（１）前記対象に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報をデータ記録手段に記録すること、
（２）（１）で記録された遺伝子型から、予めコンピュータに記憶されている遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたデータテーブルに従って、ＩＦＮ治療の有効性を予測すること、
（３）（２）で得られた予測結果を出力すること、
を具備するコンピュータを用いて対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する方法も提供する。
【００７７】
また更に、対象においてＩＦＮ治療の有効性を予測する有効性予測方法であって、
（１）前記対象に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮレセプター遺伝子の遺伝子型の情報を入力する入力工程と、
（２）前記入力工程で入力された遺伝子型と、遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたデータテーブルが記憶するデータテーブルとに基づいて、ＩＦＮ治療の有効性を予測する予測工程と、
（３）この予測工程の予測結果を表示する表示工程と
を具備することを特徴とする有効性予測方法も本発明の範囲内である。
【００７８】
９．ＩＦＮ治療の有効性を予測するためのポリヌクレオチド
本発明は、ＩＦＮ治療の有効性を予測するためのポリヌクレオチドも提供する。
【００７９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオシドがリン酸エステル結合で結合されてなる物質を意味する。「ヌクレオシド」には、デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明において「ポリヌクレオチド」とは、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ-オリゴ核酸等の人工合成核酸も指称するものとする。
【００８０】
なお、本明細書において「プロモータ領域」とは、ＴＡＴＡボックス等の転写開始反応に直接関与する領域のみを指すのではなく、該領域の近傍または遠隔に存在して転写開始反応の効率に影響を与える調節配列を含む配列も指称するものとする。従って、「プロモータ領域」なる語には、転写開始反応に関与する配列のみ、調節配列のみ、及びその両者が連結された配列が含まれることに留意されたい。
【００８１】
ポリヌクレオチドは、所望の配列を有するように合成しても、また生体試料から調製してもよい。生体試料から調製する場合、対象から試料を採取した後、通常は、該試料からポリヌクレオチドを抽出する操作を行えばよい。生体成分からポリヌクレオチドを抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈澱の他、任意の抽出方法を使用し得る。mRNAを抽出する場合には、オリゴdTカラムにかけてもよい。
【００８２】
本発明にしたがって提供されるポリヌクレオチドは対象に由来するサンプルのポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのプローブやプライマーとして使用できる。
【００８３】
本発明に従って提供されるポリヌクレオチドには、以下の（ａ）〜（ｆ）が含まれる。
【００８４】
（ａ）配列番号１に示されるポリヌクレオチド。
【００８５】
（ｂ）前記（ａ）に示されるポリヌクレオチドにおいて、当該プロモーター領域のマイクロサテライト多型部位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加された修飾ポリヌクレオチド。
【００８６】
（ｃ）配列番号１に示される前記ポリヌクレオチドの塩基配列のうち、インターフェロン治療の有効性に関与しているのは当該プロモーター領域の−１３４位と−７５位に存在するＳＮＰのヌクレオチドであるので、本発明のポリヌクレオチドは、当該ＳＮＰ部位を含むポリヌクレオチドの断片であってもよい。（ｃ）で示される断片は対象に由来するサンプルのポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのプローブとして好適に利用され得る。例えば、プローブ核酸鎖として好ましい断片は、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のプロモーター領域の塩基配列であって少なくとも目的のＳＰＮ部位を含む８から５００の核酸鎖及びその相補鎖が挙げられる。さらに好ましくは１０ヌクレオチド以上１００ヌクレオチド以下、特に、塩基配列検出用チップのプローブとして用いる場合、ＰＮＡプローブでは１０ヌクレオチド以上１５ヌクレオチド以下、ＤＮＡプローブでは１１ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下が望ましい。ポリヌクレオチド断片の長さが過度に長いと、１個のヌクレオチドの相違を識別することが困難になる。一方、基板にポリヌクレオチドの長さが過度に短いと試料中に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列の決定が困難になる。また、プライマーとして使用する場合には、当該ＳＮＰ部位を増幅するための配列を有するポリヌクレオチドであればよいので、当該ＳＮＰ部位を含まない配列番号１に示される前記ポリヌクレオチドの塩基配列またはその断片であってもよい。
【００８７】
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）に示されるポリヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
【００８８】
また、これらのポリヌクレオチドは、標識物質、色素、蛍光物質、発光物質および放射性同位元素等の標識物質を具備していてもよい。
【００８９】
なお、配列表に記載した塩基配列中の「ｎ」は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから任意に選択されてよい。
【００９０】
１０．塩基配列検出用チップ
本発明は、前記ポリヌクレオチドまたは断片を具備する塩基配列検出用チップも提供する。そのような塩基配列検出用チップも本発明の範囲内である。
【００９１】
本発明の態様に従うと、上述したポリヌクレオチドまたはその断片を具備する塩基配列検出用チップが提供される。それらは、例えば、蛍光検出用ＤＮＡチップおよび電流検出型ＤＮＡチップ等であるが、これに限られるものではない。ウイルスの検出を、前記ポリヌクレオチドまたはその断片をプローブとして配置した塩基配列検出用チップを使用することにより行えば、検出方法は簡便化および効率化される。塩基配列検出用チップは、以下の手順により作成することができる。
【００９２】
（ａ） 蛍光検出用塩基配列検出用チップの作製
上述した本発明の態様に従うポリヌクレオチドまたはその一部の配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの配列に相補的な配列を有したポリヌクレオチドプローブ３１として基板３０に固定化する（図６）。基板は、例えば、ガラス基板およびシリコン基板等、従来用いられる何れの基板も使用することが可能である。固定化手段は、スポッター等を使用する手段、一般的な半導体技術を使用した手段等、当業者にそれ自身公知の手段を用いて固定することが可能である。
【００９３】
標識物質が蛍光物質の場合には、ハイブリダイゼーション反応の検出は、例えば、蛍光検出器を用いて試料中の標識された塩基配列又は２次プローブ中の標識物質から生じる蛍光信号を検出すればよい。同様に、蛍光標識以外の標識物質を利用してハイブリダイゼーションを検出するようなチップを作製してもよく、そのようなチップも本発明の範囲内である。標識物質を用いる方法の場合には、試料に含まれる核酸は、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５若しくはローダミンなどの蛍光色素、またはビオチン、ハプテン、オキシダーゼ若しくはポスファターゼ等の酵素、またはフェロセン若しくはキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識される。或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を行う。複数の標識物質を同時に使用してもよい。
【００９４】
（ｂ）電流検出型塩基配列検出用チップの作製
上述した本発明の態様に従うポリヌクレオチドまたはその一部の配列を有するポリヌクレオチド断片、またはそれらの配列に相補的な配列を有したポリヌクレオチドプローブ４１として、基板４０に具備された電極４２に共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着等によって固定化すればよい（図７）。電流検出型ＤＮＡチップの例は、平成８年１０月２４日に登録された特許番号第２５７３４４３号の遺伝子検出装置等であるが、これに限られるものではない。当該文献は引用することによりここに組み込まれる。
【００９５】
電気化学的方法の場合、以下のような手順で検出を行ってよい。まず、プローブ固定支持体（以下支持体とも記す）上で試料核酸と核酸プローブとを反応させた後、当該支持体を洗浄する。その後、電極としての長細担体表面に形成された二本鎖部分に選択的に結合する二本鎖認識体を作用させ、そこに結合した二本鎖認識体からの信号を電気化学的に測定すればよい。
【００９６】
二本鎖認識体の例は、これらに限定されるものではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター及びポリインターカレーター等である。また、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておいてもよい。
【００９７】
また電極を用いて遺伝子の検出を行なう場合には、電気化学発光を生じる挿入剤を利用することもできる。このような挿入剤は特に限定されるものではなく、例えば、ルミノ−ル、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセンおよびルブレンを挙げることができる。これらの挿入剤による電気化学発光は、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノ−ル、クロロフェノ−ルのようなフェノ−ル類もしくはナフト−ル類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
【００９８】
１つの塩基配列検出用チップに固定化するプローブとしては、上記したＩＦＮＡＲ２遺伝子の遺伝子型を決定するための塩基配列のプローブに加えて、ウイルス遺伝子の型を検出するプローブおよび／または他の公知のＩＦＮ感受性関連多型の遺伝子型を決定プローブ等を１つのチップに共に固定化されていても良い。それにより罹患したウイルスの遺伝子型や他の関連多型の遺伝子型も同時に検出することが可能である。
【００９９】
遺伝子型を検出可能なプローブを用いる際は、異なる遺伝子型に対応する複数のプローブを基板上に同時に固定化して用いることにより精度の高い検出が可能である。
【０１００】
試料物質中の病原微生物の遺伝子型を検出するには、試料物質中の病原微生物の遺伝子に対して予めその遺伝子型に特徴的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、その後ユニバーサルプローブを固定化したチップで検出することも可能である。
【０１０１】
本発明の態様に従って、ポリヌクレオチド類を具備するプローブおよび塩基配列検出用チップを用いて検出を行えば、その検出を簡便且つ効率よく行える。
【０１０２】
１１．キット
本発明のインターフェロン治療の有効性を予測する方法を行うために必要な要素からなるキットも本発明の範囲内である。例えばそのようなキットは、ＩＦＮＡＲ２の問題のＳＮＰｓの遺伝子型を決定するための核酸を具備していてもよく、或いは、ＩＦＮＡＲ１のマイクロサテライト多型の遺伝子型を決定するための核酸を共に具備していてもよい。また、このような核酸を上述の塩基配列検出用チップ上に固定された状態で具備してもよい。また、そのようなキットは、遺伝子型を決定するために必要な種々の試薬を具備してもよい。例えば、遺伝子型の決定を塩基配列検出用チップで行うための試薬、例えば、標識物質または二本鎖認識体等を具備してよい。或いは、ＰＣＲ反応により遺伝子型を決定する場合には、本発明のキットは、目的のＳＮＰｓおよび／またはマイクロサテライト多型を含む領域を増幅するためのプライマーおよび／または酵素を具備していてもよい。更に、本発明に従うキットは、本発明の方法に必要な容器等の器具を具備していてもよい。
【０１０３】
【実施例】
Ｉ．ＩＦＮＡＲ１とＩＦＮＡＲ２の遺伝子多型を利用したＨＣＶ感染者におけるＩＦＮαの治療効果の予測
（１）概要
ＩＦＮα治療効果を施した１５７人のＨＣＶ感染患者より血液を採取し、ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、解析用のサンプルとした。ＨＣＶのタイプの判定にはＲＮＡ画分を、ＩＦＮＲＡ２遺伝子のＳＮＰｓ解析にはＤＮＡ画分を利用してＰＣＲ法を用いて塩基配列を決めることにより解析した。この手法を用い個々の患者についてＩＦＮＡＲ２のＳＮＰｓの型決定を行い、ＩＦＮαの治療効果およびウイルスタイプ、さらにはＩＦＮＡＲ１のマイクロサテライトのＧＴ反復配列数を加えて関連性を検討した。
【０１０４】
（２）患者
肝臓の組織化学的検査により慢性肝炎Ｃであることが証明された１５７人のＨＣＶ感染患者のサンプルがこの研究に使用された。なお、すべての患者からは本研究の対象となることのインフォームドコンセントが得られている。ＩＦＮα治療を行った後の６ヶ月の追跡期間中に、血中のａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅが正常範囲であり、かつＨＣＶのＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、この追跡期間中にＨＣＶのＲＮＡが検出されるか、あるいはａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅが高値を示した患者は非著効とした。１５７人中ＨＣＶの遺伝子がタイプ１（正確には１ｂである）の感染者が１０１人でそのうち１６人が完全著効、残りの８５人が非著効であった。タイプ２（２ａか２ｂのいずれか）の感染者は５５人で、そのうち３４人が完全著効、残りの２１人が非著効であった。残りの１人は両方に感染しており、非著効であった。
【０１０５】
（３）ＨＣＶおよびＳＮＰのタイピング
血液より抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、その一部分をＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定しＨＣＶの遺伝子のタイピングを行った(K. Chayama et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 8, 40-44, 1993)。
【０１０６】
（４）ＩＦＮＡＲ２プロモーター部位のＳＮＰの探索
Ａｇｅｎｅボランティアサンプルを用いてＩＦＮＡＲ２プロモーター部位８００ｂｐについてＳＮＰの探索を行った。その結果、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ（ｎｔ１とする）上流−７５位及び−１３４位の２箇所に新たなＳＮＰｓを見出した。−７５番目のＳＮＰｓはｃ／ｃとａ／ａのホモ型およびｃ／ａのヘテロ型で、−１３４番目のＳＮＰｓはｔ／ｔとｇ／ｇのホモ型およびｔ／ｇのヘテロ型であった。
【０１０７】
例１ ＩＦＮＡＲ２遺伝子の遺伝子型について
東芝病院から供与されたＨＣＶ患者でインターフェロン治療効果が有効だったもの５０サンプル、無効だったもの１０７サンプル（合計１５７サンプル）の血液、または血清から抽出したＤＮＡを用いて上述のＩＦＮＡＲ２のＳＮＰｓ解析を行った。
【０１０８】
解析に用いた以下のＩＦＮＡＲ２の各プライマーはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ＃Ｘ７７７２２の配列より作製した。
【０１０９】
ＰＣＲプライマー：
R5L; 5’AGGCGGCGTTTTCCCTCCAGTCAGCTGGC 3’ （配列番号３）
F3L; 5’GACCTCAGATGGTCCATCTGCCTTGGCCTC 3’ （配列番号４）
シーケンシングプライマー(Sequencing primer)：
R4 ; 5’CTTCGCCGAGAAAGCTCCATA 3’ （配列番号５）
R3; 5’TTACCTTTGCAGCTCTCGCCTT 3’ （配列番号６）。
【０１１０】
ＤＮＡ約１ｐｇを鋳型とし、Ｒ５ＬとＦ３Ｌプライマーを用いてＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ９６００（Ｒｏｃｈ社製）でＩＦＮＡＲ２プロモーター断片の増幅を行った。ＳＮＰｓ解析には、その増幅断片をＭｉｌｌｉＰｏｒｅ ９６ｗｅｌｌｃｌｅａｎ ｕｐフィルターにて精製し、Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法によりＡＢＩ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて解析を行った。なおＰＣＲにはクローンテック社Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｍｉｘ ｋｉｔ^ＴＭを用いて反応溶液の調整を行い温度条件は９４℃で３０ｓｅｃ．、７０℃ ３ｍｉｎを５サイクル、９４℃ ３０ｓｅｃ． ６８℃ ３ｍｉｎ．で３０サイクル行い、最初に９５℃ ２ｍｉｎ．７２℃ ３ｍｉｎ、最後に６８℃ １０ｍｉｎを行った。
【０１１１】
解析した患者１５７人のＨＣＶタイプ、ＩＦＮα治療の効果、ＩＦＮＡＲ２の−１３４と−７５の遺伝子型の組み合わせは以下の通りである。即ち、ＨＣＶ２型感染患者の中でＩＦＮα治療により完全著効（ＳＲ）となった３４人のうち過半数を超える１８人（５２．９％）が、ＩＦＮＡＲ２の−１３４と−７５の遺伝子型の組み合わせがｔ／ｇヘテロ型およびｃ／ａヘテロ型の遺伝子型であった。これに対し、非著効（ＮＲ）患者内では、ｔ／ｇヘテロ型およびｃ／ａヘテロ型の遺伝子型を持っていた人は、２１人中８人の３８．１％であった（Ｐ＜０．００１）。一方、−１３４がｇ／ｇホモ型あるいは−１３４／−７５の遺伝子型の組み合わせがＧＧ／ＡＡであった人の非著効者の割合はそれぞれ５２．４％（１１人）および３８．１％（８人）で、完全著効者では３５．３％（１２人）そして２３．５％（８人）であった（Ｐ＜０．０１）。
【０１１２】
これらの結果は、ＨＣＶ２型感染患者ではＩＦＮＡＲ２の−１３４／−７５の遺伝子型の組み合わせがｔ／ｇとｃ／ａである人ではINFαによる治療効果を期待できるが、逆に−１３４にｇ／ｇホモ型、或いは−１３４／−７５の遺伝子型の組み合わせとしてＧＧ／ＡＡを持つ人は、比較的治療効果は低いと予測される。ただし、これら相関関連は、ＨＣＶ１型感染患者においては認められない。
【０１１３】
例２ ＩＦＮＡＲ１遺伝子の遺伝子型について
ＩＦＮＡＲ１のマイクロサテライトマーカーを利用してＩＦＮの効果について検討した結果を以下に示す。
【０１１４】
（１）概要
例１と同じ１５７人のＨＣＶ感染患者より血液を採取した。それらの採取された血液よりＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、解析用サンプルとした。ＲＮＡ画分を用いてウイルスのタイピングを行い、ＤＮＡを用いてＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰ解析およびマイクロサテライトマーカーのタイピングを行った。そして、ＩＦＮα／βの治療効果とウイルスのタイプおよびＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰ、或いはマイクロサテライトマーカーとの関連を調べた。
【０１１５】
（２）患者
肝臓の血液生化学的・組織学的・画像診断学的検査により慢性Ｃ型肝炎であることが証明された１５７人のＨＣＶ感染患者のサンプルをこの研究に使用した。なお、全ての患者から本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを取得した。ＩＦＮα／β治療を行った後の６ヶ月の追跡期間中に、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼが正常範囲であり、且つＨＣＶのＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、この追跡期間中にＨＣＶのＲＮＡが検出されたり、或いはアラニンアミノトランスフェラーゼが高値を示した患者は非著効とした。
【０１１６】
（３）ＨＣＶ、ＳＮＰおよびマイクロサテライトのタイピング
上述したＣ型肝炎患者でインターフェロン治療効果が有効だった症例５０サンプル、無効だった症例１０７サンプル（合計１５７サンプル）の血液、または血清から抽出したＤＮＡを用いて解析を行った。血液より抽出したＲＮＡからｃＤＡＮを作成し、その一部分をＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定しＨＣＶ遺伝子のタイピングを行った（K.Chayama et al., J.Gastroenterlo. Hepatol. 8,40-44, 1993）。血液より抽出したＤＮＡを用いてＩＦＮＡＲ１プロモーターの２箇所（nt-408,nt-18）のＳＮＰｓと１箇所のマイクロサテライト(GT:-79~-56)の多型(Genes and Immunity 2001; 2:159-160)についても検討した。
【０１１７】
また、これらプライマーに用いた配列はＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｘ６０４５９であるＩＦＮＡＲの配列に基づき作成し、転写開始部位をｎｔ１と記述している。プライマーはＤＮＡ約１ｎｇを鋳型とし、−６２９Ｆ（5’-TCTCGCCCCTCAGCCAAGTC-3’）と＋２０５Ｒ（5’-CAGCTGCGTGCCCTACCTCC-3’）プライマーを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ９６００（Ｒｏｃｈ）でＩＦＮＡＲ１プライマー断片の増幅を行った。
【０１１８】
ＳＮＰｓ解析には、その増幅断片をＭｉｉｌｉＰｏｒｅ ９６ｗｅｌｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ フィルタにて精製し、直接シーケンス法(direct Sequencing法)によりＡＢＩ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems）にて塩基配列を決定した。また、（ＧＴ）リピート数の決定は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析法を用いた。−６２９Ｆと＋２０５Ｒプライマーで得られたＰＣＲ断片を鋳型とし、更に片方のプライマーに蛍光色素（６−ＦＡＭ）をラベルした６ＦＡＭ＋９２Ｒと−２４５Ｆプライマーを用いて、再度ＰＣＲを行いＡＢＩ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＧｅｎｅＳｃａｎ（ver.3.7）で行った。なお、ＰＣＲは９５℃で１０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒、を３０〜３５サイクル行い、その前に９５℃で２分、後に７２℃７分の処理を行った。
【０１１９】
（４）結果
マイクロサテライトのＧＴ反復配列より表される遺伝子型とＩＦＮα／βの治療効果の関係を示す。遺伝子型は５、６、１０〜１８の１１種類存在する。５又は１４の何れかの遺伝子型を持つ場合は、完全著効が非著効を上回っているのに対し、それ以外では非著効が完全著効を上回っていた（図８）。
【０１２０】
これより、５又は１４の遺伝子型を持つ場合、即ち、５／５ホモ接合または５／１４ヘテロ接合の場合には、ＩＦＮ治療が有効となる可能性が期待される。さらに詳しくこの遺伝子型とIFNα／βの治療効果との関係をまとめたものが表４である。ウイルスタイプ１型に感染した患者の中で完全著効にいたった１６人中、５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者は１３人（８１％）であるのに対し、それ以外の遺伝子型を持つものは３人（１９％）であった。また、ウイルスタイプ２型に感染している患者においても、完全著効者３４人中２７人（７９％）が５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者で、それ以外の遺伝子型を持つ者７人（２１％）を大きく上回っていた。一方、非著効者１０７人における５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者およびそれ以外の遺伝子型を持つ者の割合は、ウイルス両タイプを合わせるとそれぞれ５９％（６３人）と４１％（４４人）であるので、完全著効者に占める５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者の出現頻度（８０％）が統計的に優位であることが示された（P=0.009）。これは、５／５のホモ接合または５/１４のヘテロ接合の遺伝子型を持つ場合には、IFNα／β治療によって完全著効に至る可能性が高いことを示している。一方、５または１４の遺伝子型を持たない人の中に完全著効を認めなかったのは、対象となる患者数（４／１５７）が少なかったとは言え注目に値する。
【０１２１】
【表４】

【０１２２】
ＩＩ．まとめ
例１と例２の結果についてχ^２検定を行い、ＩＦＮＡＲ２遺伝子とＩＦＮＡＲ１遺伝子の多型とＩＦＮの有効性について得られた結果を表５に示す。
【０１２３】
【表５】

【０１２４】
ＩＦＮＡＲ１の多型がｎｏｎ５／５および５／１４であり、ＩＦＮＡＲ２の多型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡである場合は、非著効の患者が有意に多かった。また、ＩＦＮＡＲ１の多型が５／５または５／１４であり、且つＩＦＮＡＲ２の多型がｎｏｎＴＴ／ＣＣおよびＧＧ／ＡＡである場合は、他の遺伝子型である場合に比べて完全著効である患者が有意に多くいた。
【０１２５】
【発明の効果】
以上のような本発明により、対象におけるＩＦＮの治療効果の予測をより精度よく行う方法が提供された。
【０１２６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＦＮＡＲ２遺伝子のプロモータ領域を含む配列を示す図。
【図２】ＩＦＮＡＲ１遺伝子のプロモータ領域を含む配列を示す図。
【図３】本発明に従う方法の１例を示す図。
【図４】本発明の従い使用される装置の１例を示すブロック図。
【図５】本発明に従う方法の１例を示す図。
【図６】本発明の態様に従うＤＮＡチップの１例を示す模式図。
【図７】本発明の態様に従うＤＮＡチップの１例を示す模式図。
【図８】完全著効および非著効であったインターフェロン治療患者内で認められたＩＦＮＡＲ１のマイクロサテライト（ＧＴ）数の出現頻度を示すグラフ。
【符号の説明】
１．コンピュータ ２．入力手段 ３．表示手段 ４．処理手段 ５．記憶手段 ３０．基板 ３１．プローブ ４０．基板 ４１．プローブ

Claims (2)

1. （１）対象から採集された核酸サンプルについて、インターフェロンαレセプター２型遺伝子のプロモーター領域の−１３４位（配列番号１の塩基配列において１３６７番目の塩基）および−７５位（配列番号１の塩基配列において１４２６番目の塩基）に位置する多型、並びにインターフェロンαレセプター１型遺伝子プロモーター領域の−６０位（配列番号２の塩基配列において５９２番目の塩基）を含んで存在するＧＴ反復配列である多型の遺伝子型を決定することと、
   （２）（１）で決定された遺伝子型からＣ型肝炎に対するインターフェロン治療の有効性の予測を行うことと、
   を具備するＣ型肝炎に対してインターフェロンα、ωおよび／またはβにより行われるインターフェロン治療の有効性を予測する方法。
2. 前記（２）の工程が：
   （ａ）インターフェロンαレセプター１型遺伝子のプロモーター領域の−６０位（配列番号２の塩基配列において５９２番目の塩基）を含んで存在するマイクロサテライトマーカーの遺伝子型が反復回数５／５ホモ接合および５／１４ヘテロ接合以外であり、且つインターフェロンαレセプター２型遺伝子プロモーター領域の−１３４位（配列番号１の塩基配列において１３６７番目の塩基）および−７５位（配列番号１の塩基配列において１４２６番目の塩基）の単塩基多型の遺伝子型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡである場合に、インターフェロンの治療効果は低いと予測すること、および
   （ｂ）インターフェロンαレセプター１型遺伝子のプロモーター領域の−６０位（配列番号２の塩基配列において５９２番目の塩基）を含んで存在するマイクロサテライトマーカーの遺伝子型が反復回数５／５ホモ接合または５／１４ヘテロ接合であり、且つインターフェロンαレセプター２型遺伝子プロモーター領域の−１３４位（配列番号１の塩基配列において１３６７番目の塩基）および−７５位（配列番号１の塩基配列において１４２６番目の塩基）の単塩基多型の遺伝子型がＴＴ／ＣＣまたはＧＧ／ＡＡの何れでもない場合に、他の遺伝子型に比較してインターフェロンの治療効果は高いと予測すること
   を具備する請求項１に記載の方法。

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