KR20120040725A - Ｈｃｖ 감염 환자에서 ｃ형 간염 결과를 진단 또는 예측하기 위한 방법 - Google Patents

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안드리 라우흐
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위니버르시티 오브 베른
쌍트르 오스삐딸리에 위니베르씨떼 보두와
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Abstract

본 발명은 C형 간염에 감염된 대상에서의 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성 또는 자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, IL-28A, IL-28B 및/또는 IL-29 유전자좌 내 환자의 유전자형의 검출에 기반한다.

Description

ＨＣＶ 감염 환자에서 Ｃ형 간염 결과를 진단 또는 예측하기 위한 방법{METHODS FOR DIAGNOSING OR PREDICTING HEPATITIS C OUTCOME IN HCV INFECTED PATIENTS}
본 발명은 C형 간염에 감염된 대상에서의 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성 또는 자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것이다.
C형 간염 바이러스(HCV)는 세계 인구의 ~3%인 2억명 초과의 인간을 만성적으로 감염시키는 단일 가닥 RNA 바이러스이다[1-4]. C형 간염 바이러스(HCV)로의 급성 감염은 20-50%의 인간에서 HCV의 영구적인 통제를 달성하는 넓은 범위의 선천적 및 후천적 면역 반응을 유도한다[5]. 바이러스 제거 실패는 만성 C형 간염을 유발한다. 만성 감염은 유의한 유병률 및 사망률과 연관되어, 주로 간경화 및 간세포 암종으로의 진행이 야기된다[6]. 페길화 인터페론 및 리바비린(PEG-IFN/RBV)의 현행의 표준 요법은 만성적으로 감염된 개인의 30-80%에서 지속된 반응률을 야기한다[7-9].
숙주 유전적 인자가 만성 C형 간염 감염의 자연적인 과정 및 요법에 대한 반응 모두에 영향을 준다고 암시하는 증거가 증가하고 있다[10-13]. 유사한 조건하에서 HCV의 단일 균주로 오염된 면역글로불린 제제로부터 감염된 임신한 여성의 2 개의 코호트에서, 절반은 감염이 자발적으로 제거되었고, 절반은 만성 C형 간염으로 진행되었다[14, 15]. 만성적으로 감염된 환자 중에서, 치료에 대한 반응은 심지어 유사한 HCV-RNA 수준 및 일치하는 유전자형을 갖는 경우에서도 상이하다[6, 7, 9]. 반응률은 인종 및 성별과 크게 연관되어 있다[16]. 이전의 보고들은 HCV 감염 결과에 대한 인간 백혈구 항원(HLA)[10, 13], 킬러 면역글로불린-유사 수용체(KIR)[17], 사이토카인(WO 00/08215), 케모카인 및 인터류킨 뿐 아니라 인터페론-자극된 유전자[18-22]의 유전적 다형의 영향을 밝혔다.
이전의 연구는 HCV 감염에서 유전자의 잠재적인 역할의 종래 지식에 근거한 후보 유전자 접근법을 사용하였다. 그러나, 이전의 데이터로는 치료에 대한 자발적 제거 또는 반응의 정확한 예측은 가능하지 않다[13].
상기 언급된 접근법에도 불구하고, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 항 C형 간염 요법에 대한 무반응에 대한 민감성, 또는 C형 간염 바이러스로 급성으로 감염된 대상에서 자발적 또는 비자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하는 효과적인 예측 방법을 개발하기 위한 근본적인 요구가 여전히 존재한다.
지금까지, 상기 문제를 극복하기 위해 어떠한 효과적인 방법이나 전략이 개발되지 않았다.
본 발명의 목적은 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공함으로써 달성된다.
본 발명의 추가의 목적은 C형 간염에 감염된 대상에서 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염에 대해 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다: i) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에 있는지 여부를 측정하는 단계로서, 상기 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 단계, 및 ii) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성과 연관되는지 여부에 근거하여 환자를 치료하는 단계.
본 발명의 또다른 추가의 목적은 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염에 대해 환자를 치료하는 방법이다: i) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에 있는 지의 여부를 측정하는 단계로서, 상기 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 단계, ii) 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 HCV 바이러스 유전자형을 측정하는 단계, 및 iii) 환자의 다형 마커 중 하나 이상 및 HCV 바이러스 유전자형이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성과 연관되는지 여부에 근거하여 환자를 치료하는 단계.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 평가하는 방법을 제공한다: i) 상기 대상에서, 상기 대상의 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정함으로써 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 갖는 것을 구별하는 단계로서, 하나 이상의 다형 마커의 존재가 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 특징으로 하는 단계, ii) C형 간염 치료 섭생을 성립하는 단계.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 평가하는 방법에 관한 것이다: i) 상기 대상에서, 하기를 측정함으로써 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 갖는 것을 구별하는 단계:
- 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재, 하나 이상의 다형 마커의 존재가 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 특징으로 하는 단계, 및
- HCV 바이러스 유전자형, 유전자형 1 또는 4의 존재가 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 특징으로 하는 단계,
ii) C형 간염 치료 섭생을 성립하는 단계.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서의 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하기 위한 키트로서, i) 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하기 위한 시약 및 ii) 사용 지침을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 또한 제공되는 것은 본 발명에 따라 C형 간염에 감염된 대상에서의 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하기 위한 키트로서, i) 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내에서 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하기 위한 시약 및 ii) 사용 지침을 포함하는 키트이다.
도 1은 맨하탄(Manhattan) 플롯을 나타낸다. 모든 2.5M 결측 단일 뉴클레오티드 다형(Single Nucleotide Polymorphisms: SNP)에 대한 P-값이 표시된다(-log10 규모로).
도 2는 감염된 집단 내 유전자형의 분포를 나타낸다. (A) G-대립유전자를 함유하는 유전자형은 만성 감염과 비교하여 자발적 HCV 제거가 있는 개인에서 감소하였다. (B) 스위스 C형 간염 코호트 연구(Swiss Hepatitis C Cohort Study: SCCS)에서, 3개의 하기 환자 그룹: 자발적 바이러스 제거가 있는 환자 그룹 < 치료 후 제거가 있는 환자 그룹(즉, 치료에 대한 반응자) < 치료에 대해 무반응인 환자 그룹을 가로질러 G 대립유전자의 빈도가 증가하였다.
도 3은 IL28B 반수체형 블록에서 자발적 제거 및 치료에 대한 무반응에 모두에 대한 일치하는 연관 패턴을 보여주는 상이한 SNP의 P값의 그래프 도식이다. (A) 반수체형 블록. 가장 강한 유전적 연관은 IL28B 유전자와 가장 가까운 반수체형 블록에 위치한다. (B) SNP와 IL28B /A 및 IL -29 유전자좌 내 HCV와의 유전적 연관. IL28B 및 IL28A 유전자좌 근처에 위치한 SNP의 강한 연관성은 양 종결점, 자발적 C형 간염 제거 및 인터페론-기반 요법에 대한 무반응에 대해 존재하였다.
본 발명은 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 C형 간염에 감염된 대상에서 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내에 있는 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있을지라도, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재되어 있다. 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 기타 본원에 언급된 참조문헌은 전체가 참조로서 인용되어 있다. 본원에 논의된 공개문헌 및 출원은 본 출원의 출원일 전에 본 명세서에 대해 단독으로 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 이전 발명에 비추어 이러한 공개문헌을 선행하여 자격을 갖는 것이 아니라는 승인으로서 해석되는 것은 아니다. 또한, 물질, 방법 및 예는 오직 설명을 위한 것으로서, 제한하려는 목적이 아니다.
다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원의 주제가 속하는 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용되는 바와 같이, 하기 정의는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
"~을 포함한다"라는 용어는 일반적으로 포함한다는 의미로, 즉 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허가하는 의미로 사용된다.
명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형에는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 참조가 포함된다.
본원에서 사용되는 "지연된 바이러스 반응"은 치료가 종료된 후 24주 넘게 미검출가능한 바이러스 혈증으로서 정의되었다.
본원에서 사용되는, "하나 이상의"는 "1 이상"을 의미한다.
본원에서 사용되는 "대상" 또는 "환자"라는 용어는 당업계에 잘 인지되어 있으며, 개, 고양이, 래트, 마우스, 원숭이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 낙타를 비롯한 포유동물, 가장 바람직하게는, 인간을 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 대상은 C형 간염 치료를 필요로 하는 대상이다. 그러나, 다른 구현예에서, 대상은 보통의 대상일 수 있다.
"대상" 또는 "환자"라는 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인, 유아 및 신생아 대상이 남성 또는 여성과 관계없이 포함되는 것으로 의도된다.
대안적으로는, 상기 대상 또는 환자는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 바람직하게는 HIV-1 또는 HIV-2로 공감염된다.
본원에서 사용되는 "민감성"이라는 용어는 대상에 대해, 가망성 또는 C형 간염 치료에 반응하지 않는 소인 또는 대상에 대해, 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 소인을 말한다.
본원에서 사용되는 "대립유전자"는 세포, 개인 내 또는 집단 내 유전적 서열(예컨대 유전자) 내 유전적 서열 또는 단일 뉴클레오티드 위치의 하나의 특이적 형태를 말하며, 특이적 형태는 유전자의 서열 내 하나 이상의, 및 종종 하나 초과의, 변이체 부위의 서열 내 동일한 유전자의 다른 형태와 상이하다. 서열은 유전자 내에 있을 수도 또는 있지 않을 수도 있다. 상이한 대립유전자 사이에 상이한 이들 변이체 부위에서의 서열은 "변이", "다형", 또는 "돌연변이"라고 불린다. 각각의 상염색체의 특이적 염색체 위치 또는 "유전자좌"에, 개인은 하나는 한 부모로부터 물려받고 하나는 다른 부모로부터 물려받은, 예를 들어 하나는 모로부터 하나는 부로부터 물려받은 2개의 대립유전자를 소유한다.
본원에서 사용되는 "다형"은 집단 내 2개 이상의 유전학적으로 측정된 교대 서열 또는 대립유전자의 발생을 말한다. "다형 마커"또는 부위는 다양함이 발생하는 유전자좌이다. 바람직한 마커는 2개 이상의 대립유전자를 가지며, 각각은 선택된 집단의 바람직하게는 1% 초과, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 초과의 빈도로 발생한다. 다형은 하나 이상의 염기 변화, 삽입, 반복 또는 결실을 포함할 수 있다. 다형 유전자좌는 1개 염기 쌍 정도로 작을 수 있다. 다형 마커에는 제한 분절 길이 다형, 다양한 수의 탠덤 반복(VNTR), 과가변 영역, 미소부수체, 디뉴클레오티드 반복, 트리뉴클레오티드 반복, 테트라뉴클레오티드 반복, 단순 서열 반복, 복제본 수 변화(CNV) 및 Alu와 같은 삽입 요소가 포함된다. 첫번째 확인된 대립유전자 형태는, 참조 형태 및 다른 대립유전자 형태가 대안 또는 변이 대립유전자로서 지정되는 바와 같이 임의로 지정된다. 선택된 집단에서 가장 흔히 발생하는 대립유전자 형태는 종종 야생형 형태로서 언급된다. 2-대립유전자(diallelic) 다형은 2개의 형태를 갖는다. 3-대립유전자(triallelic) 다형은 3개의 형태를 갖는다. 2개의 핵산 사이의 다형은 자연적으로 일어날 수 있거나, 또는 화학약품, 효소, 또는 기타 작용제와의 접촉 또는 이에 대한 노출, 또는 핵산에 손상을 유발하는 작용제, 예를 들어, 자외선, 돌연변이 유발원 또는 발암물질에 대한 노출에 의해 야기될 수 있다. 단일 뉴클레오티드 다형, 또는 SNP로 불리는 특정 종류의 다형은 인간의 DNA 서열 내에서 발생할 수 있는 적은 유전적 변화 또는 변형이다. 유전적 코드는 4개의 뉴클레오티드 "글자" A(아데닌), C(시토신), T(티민), 및 G(구아닌) 에 의해 구체화된다. SNP 변형은 단일 뉴클레오티드, 예컨대 A 가 다른 3 가지 뉴클레오티드 글자 - C, G, 또는 T 중 하나로 대체되는 경우 발생한다.
"C형 간염 바이러스" 또는 "HCV"라는 용어는, 병원성 균주가 비-A, 비-B 형 간염이라고도 알려져 있는 C형 간염을 일으키는 RNA 바이러스 종을 규정하기 위해 본원에 사용된다. HCV 단리물 사이의 유전적 차이에 근거하여, C형 간염 바이러스 종은 각각의 유전자형 내에 여러 개의 서브유형을 갖는 6개의 유전자형 (1-6)으로 분류된다. 서브유형은 이들의 유전학적 다양성에 근거하여 유사 종으로 추가로 나뉜다. HCV 유전자형의 우세함 및 분포는 전세계적으로 다르다. 예를 들어, 북미에서는 유전자형 1a이 우세하고 1b, 2a, 2b, 및 3a이 뒤따른다. 유럽에서는 유전자형 1b 가 우세하고 2a, 2b, 2c, 및 3a가 뒤따른다. 유전자형 4 및 5 는 거의 오로지 아프리카에서만 발견된다. 바이러스 유전자형은 인터페론-기반 요법에 대한 잠재적인 반응 및 이러한 요법의 필요한 지속기간을 결정하는데 임상적으로 중요하다. 유전자형 1 및 4는 일반적으로 다른 유전자형(2, 3, 5 및 6)보다 인터페론-기반 치료에 대해 덜 반응성이다. 유전자형 5 및 6은 집단 내에서 흔치 않다고 명시된다.
"C형 간염"은 C형 간염 바이러스(HCV)에 의해 유발되는 간에 영향을 주는 감염성 질환이다. 감염은 종종 무증상이나, 일단 성립되면 만성 C형 간염 감염은 간의 상처(섬유증), 및 일반적으로 수 년 후에 명백해지는 진행된 상처(경화)로 진전될 수 있다. 일부 경우에서, 경화를 가진 환자는 계속되어 간부전 또는 간암을 비롯한 다른 경화 합병증으로 전개될 것이다.
"만성 C형 간염"은 6 개월 넘게 지속되는 C형 간염 바이러스로의 감염으로서 정의된다. 임상적으로는, 이것은 종종 무증상(증상 없이)이고, 이것은 대부분 우연히 발견된다. 만성 C형 간염의 자연적인 과정은 사람마다 서로 상당히 다르다. HCV에 감염된 대부분의 모든 인간은 간 생검 시 염증의 증거를 보임에도 불구하고, 간 상처(섬유증)의 진행 속도는 개인 간에 유의한 변동성을 보인다. 상기 바이러스에 대한 시험이 이용가능한 제한된 시간 때문에 시간에 따른 위험의 정확한 추정을 성립하기가 어렵다.
C형 간염 바이러스(HCV)가 확인된 후 곧, 바이러스에 대한 항체를 갖는 사람들에서의 많은 단면 연구법은 일부는 "자발적 C형 간염 제거"를 보이는 것으로 나타난 반면, 다른 사람들은 바이러스 혈증 상태를 유지하였음을 증명하였다. 그 이후로, 많은 연구자들이 자발적 바이러스 제거율, 시간 과정 및 예측변수를 비롯한 C형 간염 감염의 발병을 특징화하기 위해 노력하였다. 제거율의 추정은 10 내지 50%의 범위에 있고, 제거까지의 시간 기간은 일부 경우에는 3년 정도로 긴 것으로 밝혀졌다. 권위있는 임상적 리뷰에서 10 내지 15% 정도로 낮은 제거율이 일반적으로 인용되고 있다.
본원에서 "비-자발적 C형 간염 제거"는 대상에서 감염이 만성 C형 간염으로 발전될 것인, 자발적 제거가 존재하지 않을 상황을 말한다. 명확성을 위해, 이것은 치료-유도 제거를 말하지 않는다.
"IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌"는 일반적으로 인간에서, 3개의 사이토카인 유전자, 즉, IL28B, IL28A 및 IL29(이들은 IFNλ 계열에 속함)를 코딩하는 염색체 19의 긴 분지 내에서 80kb 영역 내에 위치하는 게놈 DNA 영역을 말한다. 상기 3개의 유전자는 여러 개의 엑손, IL-28(또한 IFNλ1로도 언급됨)의 경우에는 5개 및 IL-28A(IFNλ2) 및 IL-28B(IFNλ3)의 경우에는 6개의 엑손을 갖는다. 이들은 20 kDa의 분비된 단량체성 단백질을 코딩한다. 최근에는 IL28B, IL28A 및 IL29 사이토카인이 IFNα에 대한 저항력이 있거나 있게 된 HCV-감염 환자의 치료를 위한 IFNα에 대한 관심 있는 대체물일 것이라는 보고가 있었다 ([38]).
본 발명에 따라 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하는 방법의 경우에서, 하나 이상의 다형 마커의 존재는 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 지표이다.
한편, 본 발명에 따라 C형 간염에 감염된 대상에서 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하는 방법의 경우에서, 하나 이상의 다형 마커의 존재는 상기 대상이 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 지표이다.
상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에 적용될 수 있는, 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재를 분석하기 위해 다수의 방법이 이용가능하다. 다형 또는 돌연변이의 검출을 위한 어세이는, 직접 서열분석 어세이, 분절 다형 어세이, 혼성화 어세이, 및 컴퓨터 기반 데이터 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 카테고리로 나뉜다. 상기 어세이의 복합 변형을 수행하기 위한 프로토콜 및 시판되는 키트 또는 서비스가 이용가능하다. 일부 구현예에서, 어세이는 조합으로 또는 혼성물로(예를 들어, 여러 어세이로부터의 상이한 시약 또는 기술이 조합되어 하나의 어세이를 산출함) 수행된다. 하기 어세이는 본 발명에 유용하고, IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에서 발견되는 다양한 SNP의 검출과 관련되어 기재된다.
본 발명의 하나의 양상에서, SNP는 직접적 서열분석 기술을 사용하여 검출된다. 상기 어세이에서, DNA 샘플을 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상으로부터 먼저 단리한다. 일부 구현예에서, 관심의 영역을 적합한 벡터 내에 클로닝하고 숙주 세포(예를 들어, 박테리아)에서의 성장에 의해 증폭시킨다. 다른 구현예에서, 관심의 영역 내 DNA를 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭시킨다.
증폭 후, 관심의 영역 내 DNA(예를 들어, SNP를 함유하는 영역)를 방사능 마커 뉴클레오티드를 사용하는 수작업 서열 분석, 또는 자동화 서열분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 사용하여 서열분석한다. 서열분석 결과를 임의의 적합한 방법을 사용하여 제시한다. 서열을 검증하고, 제시된 SNP의 존재 또는 부재를 측정한다.
본 발명의 하나의 양상에서, SNP는 PCR-기반 어세이를 사용하여 검출된다. 일부 구현예에서, PCR 어세이는 관심의 반복 다형을 함유하는 분절을 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머("프라이머")의 사용을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, [41] 및 [42]를 참조한다. 증폭 방법에는 실시간 PCR(RT-PCR)을 비롯한 PCR, 가닥 대치 증폭[43]; [44], Phi29 DNA 폴리머라아제를 사용하는 가닥 대치 증폭(미국 특허 제5,001,050호), 전사-기반 증폭[45], 자가-유지 서열 복제("3SR")[46]; [47], Q.베타. 레플리카제 시스템([48]; [49]), 핵산 서열-기반 증폭("NASBA")([50]), 복구 연쇄 반응("RCR")([50], supra), 및 부메랑 DNA 증폭(또는 "BDA")([50])이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. PCR은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 바람직한 방법이다.
PCR은 당업자에 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다. 일반적으로, PCR에는 먼저, 증폭 프라이머의 쌍으로의 핵산 샘플(예를 들어, 열 안정성 DNA 폴리머라아제의 존재 하에)의 처리가 수반된다. 쌍의 하나의 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 하나의 가닥에 혼성화된다. 쌍의 두번째 프라이머는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 다른, 상보적 가닥에 혼성화된다. 프라이머는 각각의 프라이머의 확장 생성물이 각각의 핵산 가닥에 상보적인 것으로 합성되는 조건 하에서 이들의 표적 폴리뉴클레오티드 서열 가닥에 혼성화된다. 각각의 프라이머로부터 합성된 확장 생성물은, 이들이 보체로부터 분리되었을 때, 다른 프라이머의 확장 생성물의 합성을 위한 주형으로서 담당할 수 있다. 프라이머 확장 후, 샘플을 변성 조건에 처리하여 프라이머 확장 생성물을 이들의 주형으로부터 분리한다. 상기 단계는 원하는 증폭 정도가 수득될 때까지 주기적으로 반복된다.
증폭된 표적 폴리뉴클레오티드는 증폭된 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 GT-반복 다형을 확인하기 위해 본원에 다른 곳에 기재된 검출 어세이 중 하나에서 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, SNP는 분절 길이 다형 어세이를 사용하여 검출된다. 분절 길이 다형 어세이에서, 효소(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제)를 사용하여 일련의 위치에서의 DNA 분할에 근거한 독특한 DNA 밴딩 패턴이 생성된다. 다형을 함유하는 샘플로부터의 DNA 분절은 야생형과는 상이한 밴딩 패턴을 가질 것이다.
본 발명의 하나의 양상에서, 분절 크기 분석은 마이크로위성체 다형 측정을 위해 당업계에 잘 알려진 방법인 Beckman Coulter CEQ 8000 유전학적 분석 시스템을 사용하여 수행된다.
본 발명의 하나의 양상에서, SNP는 제한 분절 길이 다형 어세이(RPLP)를 사용하여 검출된다. 관심의 영역은 먼저 PCR을 사용하여 단리된다. 그 다음 PCR 생성물은 제시된 다형에 대해 독특한 길이 분절을 산출하는 것으로 공지된 제한 효소로 분할된다. 제한 효소로 소화된 PCR 생성물은 아가로오스 젤 전기영동에 의해 분리되고 브롬화 에티듐 염색에 의해 시각화되고, 대조군(야생형)과 비교된다.
하나의 양상에서, 다형은 CLEAVASE 분절 길이 다형 어세이(CFLP; Third Wave Technologies, Madison, Wis.; 예를 들어, 미국 특허 제5,888,780호 참조)를 사용하여 검출된다. 상기 어세이는 DNA의 단일 가닥이 스스로 폴딩될 때, 이들이 DNA 분자의 정확한 서열에 대해 고도로 독특한 고차 구조를 나타낸다는 관찰에 근거한것이다. 상기 2차 구조에는 단일 가닥 영역이 이중 가닥 DNA 헤어핀과 병치되는 식으로, DNA의 부분적 듀플렉스 영역이 포함된다. CLEAVASE I 효소는 상기 단일 가닥 및 이중 가닥 영역 사이의 연결점을 인지하고 분할하는 구조-특이적인, 열안정성 뉴클레아제이다.
관심의 영역은 먼저 예를 들어, PCR을 사용하여 단리된다. 그 다음, DNA 가닥이 가열에 의해 분리된다. 그 다음, 반응을 냉각하여 가닥-내(intrastrand) 이차 구조를 형성하도록 한다. 그 다음 PCR 생성물을 CLEAVASE I 효소로 처리하여, 제시된 다형에 독특한 일련의 분절을 발생시킨다. CLEAVASE 효소로 처리된 PCR 생성물을 분리하고, 검출하고(예를 들어, 아가로오스 젤 전기영동에 의해), 시각화하고(예를 들어, 에티듐 브로마이드 염색에 의해) 대조군(야생형)과 비교한다.
본 발명의 다른 양상에서, SNP는 혼성화 어세이에 의해 검출된다. 혼성화 어세이에서, 제시된 다형 또는 돌연변이의 존재 또는 부재는 샘플로부터 상보적 DNA 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 탐침)에 혼성화하는 DNA의 능력에 근거하여 측정된다. 혼성화 및 검출에 대한 다양한 기술을 사용하는 다양한 혼성화 어세이가 이용가능하다. 어세이의 선택에 대한 설명은 하기에 제시된다.
바람직한 양상에서, 혼성화된 핵산은 샘플 핵산에 부착된 하나 이상의 표지를 검출함으로써 검출된다. 표지는 당업자에게 잘 알려진 많은 수단 중 임의의 것에 의해 도입될 수 있다. 일구현예에서, 표지는 샘플 핵산의 제조 시 증폭 단계 동안 동시에 도입된다. 따라서, 예를 들어, 표지된 프라이머 또는 표지된 뉴클레오티드로의 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)이 표지된 증폭 생성물을 제공할 것이다. 또다른 구현예에서, 표지된 뉴클레오티드(예를 들어, 플루오레세인-표지된 UTP 및/또는 CTP)를 사용하는 전사 증폭으로 표지를 전사된 핵산 내로 도입한다.
대안적으로는, 표지는 본래 핵산 샘플(예를 들어, mRNA, polyA mRNA, cDNA, 게놈 DNA 등)에 또는 증폭이 완료된 후 증폭 생성물에 직접 첨가될 수 있다. 핵산에 대한 표지의 부착 수단은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 핵산 인산화(kinasing) 및 샘플 핵산을 표지(예를 들어, 형광단)에 연결시키는 핵산 링커의 후속 부착(라이게이션)에 의한 틈 번역 또는 말단-표지화(예를 들어, 표지된 RNA 로의)가 포함된다. 또다른 구현예에서, 표지는 말단 데옥시트랜스페라아제(TdT)를 사용하여 분절의 말단에 부가된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 검출가능한 표지에는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이 포함된다. 본 발명에서 유용한 표지에는 표지된 스트렙타비딘 공액체로의 염색을 위한 비오틴; 항-비오틴 항체; 자석 비이드(예를 들어, Dynabeads™); 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 녹색 형광 단백질 등); 방사능표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P); 인광 표지; 효소(예를 들어, 호스 래디쉬 페록시다아제, 알칼리 포스파타아제 및 기타 ELISA에 흔히 사용되는 것); 및 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비이드와 같은 비색성 표지가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
표지와 같은 검출 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 방사능표지는 사진 필름 또는 섬광 계수계를 사용하여 검출될 수 있고; 형광 마커는 발광을 검출하기 위해 광검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 효소 표지는 전형적으로 효소를 기질에 제공하고, 기질에 대한 효소의 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출되고, 착색 표지를 단순히 가시화함으로써 비색성 표지가 검출된다.
표지는 혼성화 전, 또는 후에 표적 핵산(들)에 부가될 수 있다. 소위 "직접 표지"는 혼성화 전에 표적 핵산에 직접 부착되거나 그 내에 도입된 검출가능한 표지이다. 반대로, 소위 "간접 표지"는 혼성화 후에 혼성 듀플렉스에 연결된다. 종종, 간접 표지는 혼성화 전에 표적 핵산에 부착되었던 결합 부분에 부착된다. 따라서, 예를 들어, 표적 핵산은 혼성화 전에 비오티닐화될 수 있다. 혼성화 후에, 아비딘-공액 형광단은 쉽게 검출되는 표지를 제공하는 혼성 듀플렉스를 갖는 비오틴과 결합할 것이다. 핵산 표지화 및 표지된 혼성화된 핵산의 검출 방법의 상세한 검토를 위해, 본원에 모든 목적을 위해 전체가 참조로서 인용되는 문헌 [Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes]를 참조한다.
하나의 양상에서, 관심의 서열(예를 들어, SNP와 같은 다형)에 대한 탐침의 혼성화는 결합된 탐침을 가시화함으로써 직접 검출된다(예를 들어, 노던 또는 서던 어세이; 예를 들어, Ausabel et al. (Eds.), 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY 참조). 상기 어세이에서, 게놈 DNA(서던) 또는 RNA(노던)가 대상으로부터 단리된다. 그 다음 DNA 또는 RNA는 게놈 내에서 드물게 분할하고 어세이되는 마커 중 임의의 것에 근접하지 않은 일련의 제한 효소로 분할된다. 그 다음 DNA 또는 RNA가 분리되고(예를 들어, 아가로오스 젤 전기영동), 멤브레인으로 옮겨진다. 검출되는 돌연변이에 특이적인 표지된(예를 들어, 방사성뉴클레오티드의 도입에 의함) 탐침(들)을 낮은, 중간 또는 높은 엄격함 조건의 조건 하에서 멤브레인에 접촉시킨다. 미결합된 탐침이 제거되고, 결합의 존재는 표지된 탐침을 가시화함으로써 검출된다.
본 발명의 하나의 양상에서, SNP는 DNA칩 혼성화 어세이를 사용하여 검출된다. 본 어세이에서, 일련의 올리고뉴클레오티드 탐침을 고체 지지체에 고정시킨다. 올리고뉴클레오티드 탐침은 제시된 단일 뉴클레오티드 다형에 독특하게 디자인된다. 관심의 DNA 샘플을 DNA "칩"과 접촉시키고, 혼성화를 검출한다.
일부 구현예에서, DNA칩 어세이는 GeneChip(Affymetrix, Santa Clara, Calif; 예를 들어, 미국 특허 제6,045,996호 참조) 어세이이다. GeneChip 기술은 "칩"에 고정된 올리고뉴클레오티드 탐침의 초소형, 고밀도 어레이를 사용한다. 탐침 어레이는 고상 화학 합성을 반도체 산업에 사용되는 포토리소그래피 제작 기술과 조합한 Affymetrix 광-유도 화학 합성 공정에 의해 제조된다. 칩 노출 부위를 정의하기 위한 일련의 포토리소그래피 마스크를 사용한 후, 특정 화학 합성 단계를 사용하여, 공정으로 어레이 내 미리 정의된 위치에 각각의 탐침이 있는 올리고뉴클레오티드의 고밀도 어레이를 구축한다. 복합 탐침 어레이가 대형 유리 와이퍼 상에 동시에 합성된다. 그 다음 와이퍼를 주사위 모양으로 자르고, 개개의 탐침 어레이를, 환경으로부터 어레이를 보호하고 혼성화에 대한 챔버로서 담당하는 사출-성형 플라스틱 카트리지 내에 패키징한다.
분석되는 핵산을 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리하고, PCR 에 의해 증폭하고, 형광 리포터기로 표지한다. 그 다음 표지된 DNA를 유체공학 스테이션(fluidics station)을 이용하여 어레이와 인큐베이션시킨다. 그 다음 어레이를 스캐너 내에 삽입하고, 혼성화 패턴을 검출한다. 혼성화 데이터를 탐침 어레이에 결합된, 표적 내에 이미 도입된 형광 리포터기로부터 방출된 광으로서 수집한다. 바람직하게는 표적과 부합하는 탐침은 일반적으로 비-부합을 갖는 탐침보다 강한 신호를 생성한다. 어레이 상에 각각의 탐침의 서열 및 위치가 알려져 있기 때문에 상보성에 의해, 탐침 어레이에 적용된 표적 핵산의 정체를 측정할 수 있다.
또다른 양상에서, 전자적으로 포획된 탐침을 함유하는 DNA 마이크로칩 (Nanogen, San Diego, Calif.)이 이용된다(예를 들어, 미국 특허 제6,068,818호 참조). 마이크로전자공학의 사용을 통해, Nanogen의 기술은 반도체 마이크로칩 상의 지정된 시험 부위까지 및 상기 부위로부터 하전된 분자의 능동 움직임 및 집중을 가능하게 한다. 제시된 다형 또는 돌연변이에 독특한 DNA 포획 탐침은 마이크로칩 상에 특정 부위에 전자적으로 위치하거나, 또는 "주소를 부여받는다(addressed)". DNA가 강한 음전하를 가지므로, 이것은 양전하 영역으로 전자적으로 이동될 수 있다.
먼저, 마이크로칩 상의 시험 부위 또는 시험 부위의 열을 양전하로 전자적으로 활성화시킨다. 그 다음, DNA 탐침을 함유하는 용액을 마이크로칩 상에 도입한다. 음전하 탐침은 양전하 부위로 빠르게 이동하고, 여기에서 집중되고 마이크로칩 상의 부위에 화학적으로 결합된다. 그 다음 마이크로칩을 세정하고, 특이적으로 결합된 DNA 탐침의 어레이가 완료될 때까지 또다른 별개의 DNA 탐침 용액을 첨가한다.
그 다음 시험 샘플을 DNA 포획 탐침 중 어느 것이 시험 샘플 내 상보적인 DNA(예를 들어, 관심의 PCR 증폭된 유전자)와 혼성화되는지를 측정함으로써 표적 DNA 분자의 존재에 대해 분석한다. 전자 전하가 또한 표적 분자를 마이크로칩 상에 하나 이상의 시험 부위로 이동시키고 집중시키기 위해 사용된다. 각각의 시험 부위에서 샘플 DNA의 전자 집중은 상보적인 포획 탐침과의 샘플 DNA의 급속한 혼성화를 촉진한다(혼성화는 수 분 내에 일어날 수 있음). 각각의 부위로부터 임의의 비결합된 또는 비특이적으로 결합된 DNA를 제거하기 위해, 부위의 극성 또는 전하가 음성으로 역전되어, 임의의 비결합된 또는 비특이적으로 결합된 DNA를 포획 탐침으로부터 용액으로 되돌린다. 결합을 검출하기 위해 레이저-기반 형광 스캐너를 사용한다.
여전히 또다른 양상에서, 표면 장력의 차이에 의한 평평한 표면(칩)상 유체의 구분에 근거한 어레이 기술(ProtoGene, Palo Alto, Calif.)을 이용한다(예를 들어, 미국 특허 제6,001,311호 참조). Protogene의 기술은 화학 코팅에 의해 부과되었던 표면 장력의 차이에 의해 유체가 평평한 표면상에서 구분될 수 있다는 사실에 근거한다. 이렇게 구분되면, 올리고뉴클레오티드 탐침은 시약의 잉크젯 프린팅에 의해 칩 상에 직접 합성된다. 표면 장력에 의해 정의되는 반응 부위를 갖는 어레이를 4개의 압전기 노즐 세트(4개의 표준 DNA 염기의 각각에 대해 하나) 하에서 X/Y 번역 스테이지 상에 고정시킨다. 번역 스테이지를 어레이의 열 각각을 따라 이동시키고, 적합한 시약을 반응 부위 각각에 전달한다. 예를 들어, A amidite를, amidite A 가 합성 단계 동안 커플링되는 부위 등으로 오직 전달한다. 통상의 시약 및 세정액을 전체 표면으로 흘려보낸 후 스피닝에 의해 제거함으로써 전달한다.
관심의 다형에 대해 독특한 DNA 탐침을 Protogene의 기술을 사용하여 칩에 고정한다. 그 다음 칩을 관심의 PCR-증폭 유전자와 접촉시킨다. 혼성화 후, 미결합된 DNA를 제거하고, 혼성화를 임의의 적합한 방법(예를 들어, 도입된 형광 기의 형광 탈-켄칭(de-quenching)에 의해)을 사용하여 검출한다.
또다른 양상에서, "비이드 어레이"는 SNP의 검출을 위해 사용된다 (Illumina, San Diego, Calif; 예를 들어, PCT 공개 WO99/67641 및 WO00/39587 참조, 이들 각각은 본원에 참조로서 인용됨). Illumina는 어레이로 자가-어셈블링되는 광섬유 번들 및 비이드를 조합하는 비이드 어레이 기술을 사용한다. 각각의 광섬유 번들은 번들 직경에 따라 수천 내지 수백만 개의 개개의 섬유를 함유한다. 비이드는 제시된 다형 또는 돌연변이의 검출에 특이적인 올리고뉴클레오티드로 코팅된다. 비이드의 배치가 조합되어 어레이에 특이적인 풀(pool)을 형성한다. 어세이를 수행하기 위해, 비이드 어레이를 제조된 대상 샘플(예를 들어, DNA)과 접촉시킨다. 혼성화의 효소 검출(Enzymatic Detection of Hybridization)과 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 혼성화를 검출한다.
본 발명의 일부 양상에서, 게놈 프로파일은 특이적 구조의 효소적 분할에 의해 혼성화를 검출하는 어세이를 사용하여 발생된다(INVADER 어세이, Third Wave Technologies; 예를 들어, 미국 특허 제6,001,567호 참조). INVADER 어세이는 중복되는 올리고뉴클레오티드 탐침의 혼성화에 의해 형성되는 복합체를 분할하는 구조-특이적 효소를 사용함으로써 특이적 DNA 및 RNA 서열을 검출한다. 승온 및 탐침 중 과량의 하나 이상은 복합 탐침이 온도 주기 없이 존재하는 각각의 표적 서열에 대해 분할되는 것을 가능하게 한다. 그 다음 상기 분할된 탐침은 2차의 표지된 탐침의 분할을 지정한다. 2차 탐침 올리고뉴클레오티드는 내부 염료에 의해 켄칭되는 플루오레세인으로 5'-말단 표지될 수 있다. 분할 시, 탈-켄칭되는 플루오레세인으로 표지된 생성물은 표준 형광 플레이트 판독기를 사용하여 검출될 수 있다.
INVADER 어세이는 미증폭된 게놈 DNA에서 특이적 돌연변이 및 다형을 검출한다. 단리된 DNA 샘플을 다형/돌연변이 또는 야생형 서열에 대해 특이적인 1차 탐침과 접촉시키고 혼성화되도록 한다. 그 다음 1차 탐침에 특이적이고 플루오레세인 표지를 함유하는 2차 탐침을 혼성화하고 효소를 첨가한다. 형광 플레이트 판독기를 사용하여 결합을 검출하고, 공지된 양성 및 음성 대조군과 시험 샘플의 신호를 비교한다.
일부 양상에서, 결합된 탐침의 혼성화는 TaqMan 어세이(PE Biosystems, Foster City, Calif; 예를 들어, 미국 특허 제5,962,233호 참조)를 사용하여 검출된다. 어세이는 PCR 반응 동안 수행된다. TaqMan 어세이는 AMPLITAQ GOLD DNA 폴리머라아제의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 활용한다. 제시된 대립유전자 또는 돌연변이에 특이적인 탐침이 PCR 반응에 포함된다. 탐침은 5'-리포터 염료(예를 들어, 형광 염료) 및 3'-켄쳐 염료를 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. PCR 동안, 탐침이 표적에 결합되는 경우, AMPLITAQ GOLD 폴리머라아제의 5'-3' 뉴클레오티드 용해(nucleolytic) 활성은 리포터와 켄처 염료 사이에 탐침을 분할한다. 켄처 염료로부터 리포터 염료의 분리는 형광의 증가를 야기한다. 신호는 PCR의 각각의 사이클과 함께 축적되고, 형광측정계에 의해 모니터링될 수 있다.
일부 양상에서, MassARRAY 시스템(Sequenom, San Diego, Calif.)이 다형을 검출하는데 사용된다(예를 들어, 미국 특허 제6,043,031호 참조). 표준 절차를 사용하여 DNA를 혈액 샘플로부터 단리한다. 그 다음, 관심의 다형을 함유하는 특이적인 DNA 영역을 PCR에 의해 증폭한다. 그 다음 증폭된 분절을 하나의 가닥에 의해 고체 표면에 부착시키고, 표준 변성 및 세정에 의해 비-고정된 가닥을 제거한다. 그 다음 남은 고정된 단일 가닥이 유전자형 특이적 진단 생성물을 산출하는 자동화 효소 반응에 대한 주형으로서 담당한다.
그 다음 매우 적은 양의 효소 생성물(전형적으로 5 내지 10나노리터)을 SpectroREADER 질량 분석기로의 후속 자동화 분석을 위해 SpectroCHIP 어레이로 옮긴다. 각각의 스폿에 분배된 진단 생성물과의 매트릭스를 형성하는 광 흡수 결정을 미리 적재한다. MassARRAY 시스템은 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 질량 분석기를 사용한다. 탈착으로서 공지된 방법에서, 매트릭스는 레이저 빔으로부터의 펄스로 타격을 받는다. 레이저 빔으로부터의 에너지는 매트릭스로 이동하고, 이것은 증발되어 비행 튜브 내로 배출되는 소량의 진단 생성물을 생성한다. 이후에 전기장 펄스가 튜브에 적용될 때 진단 생성물이 전하를 띠므로, 이들은 검출기를 향해 비행 튜브 아래로 발사된다. 전기장 펄스 적용과 검출기와의 진단 생성물의 충돌 사이의 시간이 비행 시간으로서 언급된다. 이것은 분자의 질량이 작은 분자가 큰 분자보다 빠르게 날아가는 비행 시간과 직접 연관되므로, 생성물의 분자량의 매우 정확한 측정값이다. 전체 어세이는 0.0001초 미만 내에 완료되고, 샘플을 반복적인 데이터 습득을 포함하여 총 3-5초 내에 분석되게 한다. 그 다음 SpectroTYPER 소프트웨어는 샘플당 3초의 속도로 유전자형을 계산하고, 기록하고, 비교하고, 보고한다.
통상적으로, 본 발명의 "핵산 샘플"은 전혈, 혈청, 정액, 타액, 눈물, 소변, 배설물, 땀, 볼 스미어(smear), 피부 및 근육, 간, 뇌 조직, 신경 조직의 생검 및 모발과 같이, 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된다. 핵산 샘플은 유전자, 조절 서열, 게놈 DNA, cDNA, 및 RNA(mRNA, mi RNA 및 rRNA를 포함함)의 일부일 수 있다.
게놈 DNA 샘플은 통상적으로 탐침과 접촉되기 전에 증폭된다. 게놈 DNA는 임의의 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있다. SNP를 함유하는 게놈 DNA의 증폭은 샘플이 수득되는 개체가 다형 부위에서 동종인 경우 단일 종의 핵산, 또는 개체가 이종인 경우 2개 종의 핵산을 생성한다.
RNA 샘플은 또한 종종 증폭에 적용될 수 있다. 이 경우, 증폭은 전형적으로 역전사에 선행한다. 모든 발현된 mRNA의 증폭은 예를 들어, 본원에 전체가 참조로서 인용되어 있는 [39] 및 [40]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 2배체 샘플로부터의 RNA 샘플의 증폭은 샘플을 제공하는 개체가 발현되는 RNA 내에 발생하는 다형 부위에서 이종인 경우, 또는 가능하게는 좀더 RNA의 종을 대안적인 스플라이싱에 적용하는 경우 표적 분자의 2개의 종을 생성할 수 있다. 증폭은 일반적으로 당업계에 공지된 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 표적 샘플 내 핵산은 증폭 혼합물 내 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드의 내포에 의해 증폭 과정에서 표지될 수 있다. 표지는 또한 증폭 후 증폭 생성물에 부착될 수 있다(예를 들어, 말단-표지화에 의해). 증폭 생성물은 증폭 반응에 사용되는 효소 및 기질에 따라 RNA 또는 DNA일 수 있다.
개인의 다형의 유전자형은 2개 이상의 대립유전자의 합을 포함하고, 동종(즉, 일치하는 대립유전자를 포함함) 또는 이종(즉, 상이한 대립유전자를 포함함) 일 수 있다.
본 발명의 일부 양상에서, 본 발명의 단리된 핵산 샘플은 당업계에 공지된 통상의 핵산 합성을 사용하여 또는 재조합 핵산 방법에 의해 제조되거나 합성될 수 있다(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 및 Ausubel et al.(2001, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York).
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재가 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 보여준다.
놀랍게도, 또한 본 발명의 발명자들은 C형 간염에 감염된 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재가 상기 대상이 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 보여준다.
바람직하게는, 본 발명의 하나 이상의 SNP는 약 80kb을 포함하는 영역 내에 인간 염색체 19상에 위치한다. 반수체형 블록 맵핑은 SNP 사이의 강한 유전적 연관성 및 i) 한편으로는 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서의 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성, 및 ii) 다른 한편으로는 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 증가된 민감성을 보여준다(도 3).
더욱 바람직하게는, 본 발명의 하나 이상의 SNP는 SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ ID No 33, SEQ ID No 34(표 1 에 열거된 바와 같음)를 포함하는 군으로부터 선택되는 SNP의 측면의 DNA 영역으로 본질적으로 이루어지는 핵산 분절에 위치한다.
본 발명은 또한 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 하나 이상, 즉, 상기 정의된 바와 같이 1 이상, 즉 이의 조합의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 고려한다.
바람직하게는, 다형 마커는 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와 연관된 다형 부위이다. 가장 바람직하게는, SNP는 rs8099917의 경우 G/T, rs8099917의 경우 G/G, rs576832의 경우 C/G, rs576832의 경우 C/C, rs12980275의 경우 G/A 또는 rs12980275의 경우 G/G를 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 또한, 하나 이상의 다형 마커는 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와 완전한 또는 강한 연관 불균형에 있는 다형 부위이다.
예를 들어, 상기 rs8099917 대립유전자 G가 하나의 염색체(또는 2개의 대립유전자 위치 중 하나) 상에 있는 경우, 이것은 이형접합 유전자형 G/T를 부여한다. 반대로, 2개의 염색체(또는 대립유전자 위치) 상에 존재하는 경우, 이것은 동형접합 유전자형 G/G를 부여한다.
하나의 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 유전자형 측정에 유용한 핵산 샘플 및 다형 측정에 유용한 핵산 샘플은, 대상으로부터 수득된 동일한 생물학적 샘플로부터 단리된다. 그 다음 생물학적 샘플은 한편으로는 본 발명의 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는데 유용한 핵산 샘플의 단리를 위해, 다른 한편으로는 HCV 바이러스 유전자형의 측정을 위해 제조된다.
또다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 유전자형 측정에 유용한 핵산 샘플 및 다형 측정에 유용한 핵산 샘플은 대상으로부터 수득된 2개의 상이한 생물학적 샘플로부터 단리된다. 이 경우, 첫번째 생물학적 샘플은 그 후 본 발명의 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는데 유용한 핵산 샘플의 단리를 위해 제조되는 반면, 두번째 생물학적 샘플은 HCV 바이러스 유전자형의 측정에 유용한 핵산 샘플의 단리를 위해 제조된다.
상기 2개의 생물학적 샘플은 동일한 특성의(예를 들어, 2개의 경우 전혈) 또는 상이한(예를 들어, 전혈 및 간 생검) 것일 수 있다.
분석되어지는 HCV 핵산, 통상적으로 RNA는 일반적으로 단리되고, 예를 들어, WO 96/14839 및 WO 97/01603에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 cDNA로 역전사되고, 증폭된다. 당업계에 공지된 임의의 다른 기술이 적용될 수 있다.
"연관 불균형"(LD)은 대립유전자 또는 유전적 마커의 일부 조합이, 빈도에 근거하여 대립유전자로부터 반수체형의 랜덤 형성으로부터 예상되는 것보다 집단 내에서보다 다소 자주 일어나는 상황을 말한다. 하나의 유전자좌에서 특정 대립유전자가 제 2유전자좌에서 특이적 대립유전자를 갖는 동일한 염색체상에서 함께 발견되는 경우 (유전자좌가 집단 내에서 독립적으로 분리되었던 경우 예상되는 것보다 더욱 종종) 유전자좌는 불균형에 있다. 상기 LD의 개념은 제안되는 불균형의 최단 측정 중 하나에 의해 형식화된다(D로 기호화됨). LD의 대부분의 다른 측정값과 마찬가지로 D는 2개의-유전자좌 반수체형의 관찰된 빈도와 빈도 사이의 차이로서 불균형을 정량화하며, 대립유전자가 랜덤으로 분리되어 있는 경우 나타나는 것으로 예상될 것이다. 2개의 인접 유전자좌에 대한 표준 표기법을 채용하면-각각의 유전자좌에서 2개의 대립유전자(A, a 및 B, b)가 있는 A 및 B-대립유전자 A 및 B로 이루어진 반수체형의 관찰된 빈도는 PAB로 나타내진다. 2개의 유전자좌에서의 대립유전자의 독립적인 모음을 가정하면, 예상되는 할로타입 빈도는 2개의 대립유전자 각각의 대립유전자 빈도의 산출물로서, 또는 PA×PB(PA는 제 1유전자좌에서의 대립유전자 A의 빈도이고, PB는 제 2유전자좌에서의 대립유전자 B의 빈도임)로서 계산된다. 따라서, 불균형의 가장 간단한 측정값 중 하나는 D=PAB-PA×PB이다. LD는 신규한 돌연변이가 가까운 유전자좌에 특정 대립유전자를 갖고 있는 염색체상에서 발생하는 경우 창조되고, 재조합에 의해 점차적으로 침식된다. 재발 돌연변이는 또한 인접한 유전자좌에서 대립유전자 사이의 회합을 줄일 수 있다. LD의 형상 패턴에서의 재조합의 중요성은 "연관"이라는 이름에 의해 인정된다. 집단 내 LD의 범위는 시간(t) 및 마커 사이의 재조합 거리(r, 또는 재조합 분획)와 함께 감소하는 것으로 예상된다. 이론적으로는, LD는 하기 식(D0는 일부 시작 지점에서의 불균형의 범위이고 Dt는, 이후 불균형 t 발생의 범위이다: Dt=(1-r)tD0)에 따라 시간 및 거리와 함께 침식된다.
다양한 통계학이 LD의 양을 측정하기 위해 제안되어 왔고, 이들은 내용에 따라 상이한 세기를 갖는다. 측정값 D가 LD의 추정 개념임에도 불구하고, 이의 수치 값은 LD의 세기를 측정하고 이의 수준을 비교하는데에는 크게 소용이 없다. 이것은 대립유전자 빈도에 대한 D의 의존성 때문이다. 2개의 대부분의 공통인 측정값은 D' 및 r2의 절대 값이다.
D'의 절대값은 2개의 유전자좌에서의 대립유전자 빈도를 제시한, 최대 가능 값으로 D를 나누어 측정된다. D'=1의 경우는 완전한 LD로서 알려진다. D'<1의 값은 완전한 선구적 LD가 파괴된 것을 나타낸다. D'<1 값의 규모는 명백한 해석이 없다. D'의 추정값은 적은 샘플에서 크게 과장된다. 따라서, 근처에 있는 D'의 통계적으로 유의한 값은 최소의 기록적인 재조합의 유용한 지표를 제공하나, 중간값은 연구 사이의 LD의 강도 비교에, 또는 LD의 범위의 측정을 위해 사용되지 않아야만 한다.
측정값 r2는 어떠한 점에서는 D'에 상보적이다. r2는 2개의 유전자좌에서의 대립유전자 빈도의 생성물에 의해 나뉘어진 D2와 일치한다. Hill 및 Roberson 은 E [r2]=1/1+4Nc(식 중, c는 2개의 마커 사이의 모르간(morgan) 내 재조합 비율이고, N은 효과적인 집단 크기임)을 추론하였다. 상기 방정식은 LD의 2가지 중요한 특성을 설명한다. 첫째로, LD의 예상되는 수준은 재조합의 함수이다. 2개 부위 사이에 재조합이 많을수록, 이들은 서로에 대해 좀더 셔플링되고, LD가 감소된다. 둘째로, LD는 LD가 집단의 특성임을 강조하는 N의 함수이다.
본 출원에서, 강한 연관 불균형은 HapMap European 데이터세트에서 및/또는 발명자에 의해 실험적으로 분석된 집단에서 상기 SNP와 적어도 0.6의 r2 및/또는 0.5의 D'로 칭해진 연관성을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 상기 rs8099917 대립유전자 G 또는 rs576832 C가 존재하는 경우(1 또는 2개의 예시에서), 이것은 만성 C형 간염을 앓는 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 지표이다. rs8099917 대립유전자 G 또는 rs576832 C의 2개의 예시의 존재는 하나의 대립유전자 대신, G 또는 C 대립유전자(각각)가 없는 것에 비해 C형 간염 치료에 대한 무반응에의 위험을 추가로 증가시킨다.
유사하게는, 상기 rs8099917 대립유전자 G 또는 rs576832 C가 존재하는 경우 (1 또는 2 개의 예시에서), 이것은 C형 간염에 감염된 대상이 비-자발적 C형 간염 제거(또는 만성 C형 간염으로 발전할)에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 지표이다. rs8099917 대립유전자 G 또는 rs576832 C의 2개의 예시의 존재는 하나의 대립유전자 대신, G 또는 C 대립유전자(각각)가 없는 것에 비해 비-자발적 제거의 위험을 추가로 증가시킨다.
다른 한편, rs12980275의 위험 대립유전자 G를 갖는 환자는 다른 환자보다 좀더 무반응일 것 같았다(OR=1.99, 95% CI 1.57-2.54, P=1.74E-8). 상기 연관성은 관련 공변량(연령, 성별, HCV 유전자형, 섬유증 경중 상태 및 HCV 바이러스 적재량, P= 4.61E-09 조정됨)의 조정 후에도 여전히 유의하였다. 유사하게는, A/G 및 G/G 유전자형을 가지고 있는 환자는 A/A 보유자에 비해 좀더 무반응일 것 같았다(OR=2.65 [95% CI: 2.18-3.18], P=2.67E-7, A/G에 대해 P=9.90E-8 조정됨; OR=3.68, [95% CI: 2.77-4.88], P=4.05E-6, G/G에 대해 P=1.13E-5 조정됨, 참조로서 A/A 사용).
또한 SN의 존재와 C형 간염 치료에 대한 비 반응성에 대한 또는 비 자발적 제거에 대한 민감성 사이의 연관성이 HCV 단일감염 및 HCV/HIV 공감염 개인 모두에서 관찰되었다는 것이 밝혀졌다.
SNP SEQ ID
N0 		측면 DNA 영역
rs30461 SEQ ID
No 1		 GTGGGTTGACGTTCTCAGACACAGGT[C/T]CCCATCGGCCACATATTTGAGGTCT
rs30480 SEQ ID
No 2		 TGAACTGGAAGACTCCGATGTGTTTT[C/T]CTCAGTCCCTCCCACTTTGACACTC
rs39587 SEQ ID
No 3		 GGGTCACAGAGCTAGCAAAAGGGGAA[C/T]CAGGATTTGAACCTGAGTCTGTTTG
rs194014 SEQ ID
No 4		 TGACCACAAGGCAACAAGTTTAGGGT[A/G]TGAAGCTATCATTTTGAGGAAGGTA
rs251903 SEQ ID
No 5		 TGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGGCT[C/G]GCCAACATGGTGAAACCCTATCTCT
rs251910 SEQ ID
No 6		 CATTTTTTCAGTGAGTGTAAAACATA[C/T]CCCAGAATTTGAAGATTTACTGTGG
rs503355 SEQ ID
No 7		 CCACTATCACTACAGACCTCATGGAC[A/G]TTAAAAGAATAATAAGGGAATACTG
rs570880 SEQ ID
No 8		 GTTCTTTTGTACCTTGATCAAAATTC[A/T]TTTGGGTATACTTATGTGGTTCTGT
rs576832 SEQ ID
No 9		 CAGAGAGAAAGGGAGCTGAGGGGATG[C/G]AGAGGCTGCCCACTGAGGGCAGGGG
rs664893 SEQ ID
No 10		 CAGGAATATGAGGCTCTGCTCAAGAA[C/T]TGAGGTGTGACGAAGGACTTGAAGG
rs955155 SEQ ID
No 11		 GGGAATTTTGTGTATTTTGTTCTCTG[C/T]TGGGCCCTCAGTGCACAGGACAGTG
rs2099331 SEQ ID
No 12		 ATCAGAGGTCAAGCACAGAGTTTTCA[A/C]GGTTCACCTATGTTGTAGCATACAT
rs4803223 SEQ ID
No 13		 CCTAAATATGATTTCCTAAATCATAC[A/G]GACATATTTCCTTGGGAGCTATACA
rs4803224 SEQ ID
No 14		 AAAAATAGAAGAATTATCTGGGCATG[C/G]TGGTGGGTGCCTGCAGCTCCAGCTG
rs7248668 SEQ ID
No 15		 CATGGTCTCAGTCTGTAGCCCAAGCT[A/G]GAGCATAGTAGTGGCACAATCGCCA
rs7359950 SEQ ID
No 16		 AAATCACTGGCAATTGTTGGGGGGAG[C/T]GGCTGTTGTTTTGTTCTTTTTGGGG
rs7359953 SEQ ID
No 17		 GAAAACACCAGTAGAAGAACCAGCTG[A/G]CCACCTGAGAATCTTGAGAAATTAC
rs8099917 SEQ ID
No 18		 CTTTTGTTTTCCTTTCTGTGAGCAAT[G/T]TCACCCAAATTGGAACCATGCTGTA
rs8105790 SEQ ID
No 19		 CTTCCTGACATCACTCCAATGTCCTG[C/T]TTCTGTGGTTACATCTTCCGCTAAT
rs8109886 SEQ ID
No 20		 TATTCATTTTTCCAACAAGCATCCTG[A/C]CCCAGGTCGCTCTGTCTGTCTCAAT
rs8113007 SEQ ID
No 21		 AGTAAGTCTTGTATTTCACCTCCTGG[A/T]GGTAAATATTTTTTAACAATTTGTC
rs10853727 SEQ ID
No 22		 CTGAACATACATCATATGAAGAGGCA[C/T]GCTTATGATCTGCACCTGCGTCTGG
rs10853728 SEQ ID
No 23		 TCGTAAGCAGCCTGGGAGATGTGGGC[C/G]TAAGCTTTGGTGAGGATGAGAGTCT
rs11083519 SEQ ID
No 24		 CTCAATTGAGGAAGAATAGCCTTTTC[A/T]ACAAATGGTGTTTGGACCAATTGGA
rs11665818 SEQ ID
No 25		 GCTTCAAAAACATCTGCCCCCAACTC[A/G]TTTGTGCTTTCACCACTGCTAGGAA
rs11671087 SEQ ID
No 26		 GCTCCTTTGCCGAGTAACATAAGATA[C/T]GCACAGGGTCCAGGGATGCGGTGCT
rs11879005 SEQ ID
No 27		 AACTGGATCTTCCCCAGGAGTCATCA[C/T]TGTAGCAGTGGGGTTGGGTTTTAAA
rs11881222 SEQ ID
No 28		 AGAGGGCACAGCCAGTGTGGTCAGGT[A/G]GGAGCAGAGGGAAGGGGTAGCAGGT
rs12972991 SEQ ID
No 29		 AGAACAAATGCTGTATGATTCCCCCT[A/C]CATGAGGTGCTGAGAGAAGTCAAAT
rs12975799 SEQ ID
No 30		 GACAAGAGGAAGTAGGAAGAGAAGAA[A/G]AGGATGGAGACAATGCTTGACAATT
rs12979175 SEQ ID
No 31		 TGGGCTTGGGAGGAGGCCCTGGGACT[A/G]CAGCACCCGCACCCACCTGTAGACG
rs12980275 SEQ ID
No 32		 CTGAGAGAAGTCAAATTCCTAGAAAC[A/G]GACGTGTCTAAATATTTGCCGGGGT
rs12980602 SEQ ID
No 33		 TCATATAACAATATGAAAGCCAGAGA[C/T]AGCTCGTCTGAGACACAGATGAACA
rs16973285 SEQ ID
No 34		 GCACGTTTCATTTGTTTATTGATTTC[C/T]GCCTGATTACTCCAGAAGGTAATTA
괄호 안의 표 1에 표시되는 SNP는 야생형 대 위험(소수) 대립유전자와 관련하여 특정 순서가 있는 것이 아니므로, 이와 관련하여 지시적이나 제한적인 것이 아니라는 것을 유념한다.
일반적으로, C형 간염 치료는 인터페론 기반 치료이다. 더욱 바람직하게는, 인터페론 기반 치료는 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택된다. 통상적으로, 상기 인터페론 기반 치료는 리바비린과 조합된다. 대안적인 조합은 항프로테아제 약물 또는 다른 항바이러스성 약물을 포함할 수 있다.
본 발명에 추가로 포함되는 것은 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하는 방법이다: i) 상기 대상에서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정함으로써 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 갖는 것을 구별하는 단계로서, 하나 이상의 다형 마커의 존재가 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 단계, ii) C형 간염 치료 섭생을 성립하는 단계.
만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서의 다형의 측정은 주치의에게 상기 대상에 대한 최고의 C형 간염 치료 섭생(C형 간염 치료 및/또는 기타 항바이러스성 약물의 특성, 투여량 및 지속기간)을 달성하도록 할 것이다. 예를 들어, 상기 방법이, 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 나타내는, 상기 대상으로부터 수득된 핵산 샘플 내 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에서 하나 이상의 SNP가 존재하는 것을 밝힌 경우에는, 본 대상은 신규 치료 전략(예컨대 현재 이용가능한 약물의 보다 높은 투여량으로의 요법, 현재 이용가능한 약물 및/또는 신규 약물로의 보다 긴 치료 기간)에 대한 양호한 후보자로서 고려될 수 있다.
부가적으로는, 본 발명자들은 본 발명의 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 SNP를 가지고 있는 HCV 유전자형 1 또는 4로 감염된 대상이(특히 동형접합에서), 표 4 및 5 모두에 제시되는 바와 같은 치료 유도 제거(즉, "치료에 대한 반응"또는 "치료 성공")의 매우 낮은 가망성을 가질 것임을 보여준다. 표 4는 감염된 집단 내에서 각각의 유전자형(TT, GT 및 GG)의 분포와 관련한 더욱 특이적인 데이터를 제공하는 반면, 표 5는 위험 대립유전자의 존재 또는 부재를 다루고 있다. 표 4 및 5가 다양한 그룹 내 약간 상이한 수의 환자에 기초한 것이라는 점을 간단히 유념한다. 예를 들어, 표 5는 유전자형 1 또는 4로 감염된 환자 중에서, 치료 실패가 비-보유자의 오직 38%에 비교하여 감염된 위험-대립유전자 보유자의 72%에서 일어났음을 보여준다(OR=6.54 [95% CI: 4.65-9.20], P=3.70E-8). 또다른 관점에서, 치료 실패는 고 위험 파라미터(즉, 바이러스 유전자형 1 또는 4로 감염되고, rs8099917 G 대립유전자가 IL28 B 유전자좌에 존재하는 환자)를 모두 가진 환자 중 72%와 비교하여, 저 위험 파라미터를 가진 환자의 오직 16%(즉, 바이러스 유전자형 2 또는 3으로 감염되고, rs8099917 G 대립유전자가 IL28 B 유전자좌로부터 부재하는 환자)에서 일어났다는 것을 유념한다(OR 18.89 [95% CI: 12.87-27.71], P=1.84E-14).
상기 결과는 또한 HCV 유전자형 2 또는 3으로 감염된 대상 중에서 IL28B/A 유전자좌 내 유전적 변이 및 요법(예를 들어, 인터페론 기반 치료)에 대한 반응 사이의 연관성을 보여준다(OR=3.32 [95% CI: 2.21-4.99], P=3.27E-3). 그럼에도 불구하고, 상기 연관성의 세기는 HCV 유전자형 1 또는 4로 감염된 대상의 경우보다 낮다. 상기 제시는 바이러스 유전자형 및 숙주 다형에 대한 지식 모두가 치료에 대한 반응을 예상하는데 중요하다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 또다른 양상은 HCV에 감염된 대상의 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성 또는 비-자발적 제거에 대한 민감성을 좀더 정확하게 평가하도록, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서의, 바이러스 유전자형의 조합된 측정, 및 본원에 기재된 다형의 측정을 포함한다.
상기 조합된 측정은 동시에 일어날 수도, 그렇지 않을 수도 있다. 동시에 일어나지 않는 경우, 바이러스 유전자형을 먼저 측정할 수 있고, 그 다음 측정된 시간 후, 본원에 기재된 다형의 측정이 일어난다. 본원에 기재된 다형의 측정이 먼저 일어난 다음, 측정된 시간 후, 바이러스 유전자형을 평가하는 것도 또한 포함된다.
통상적으로, 바이러스 유전자형의 측정과 다형의 측정(및 그 반대도 성립) 사이의 중복되는 시간 또는 기간인, 측정된 시간은 수 초 내지 수 년을 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 포함되는 것은 본 발명에 따라 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서의 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하기 위한 키트로서, i) 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하기 위한 시약 및 ii) 사용 지침을 포함하는 키트이다.
본 발명에 추가로 포함되는 것은 본 발명에 따라 C형 간염에 감염된 대상에서의 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하기 위한 키트로서, i) 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하기 위한 시약 및 ii) 사용 지침을 포함하는 키트이다.
대안적으로는, 키트에 사용되는 시약은 본원에 그밖에 기재된 바와 같이 단리된 핵산, 바람직하게는 프라이머, 프라이머 세트, 또는 프라이머 어레이를 포함한다. 프라이머는 고체 기질에 고정될 수 있다. 키트는 조절 표적 핵산 및 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이, 통상의 요건에 따라 프라이머를 선택할 수 있을 것이다. 키트의 단리된 핵산은 또한 분자 표지 또는 태그를 포함할 수 있다.
통상적으로, 프라이머, 프라이머 세트, 또는 프라이머 어레이는 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 지정된다.
IL28B/A 유전자좌 내 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재는 예를 들어, 표6 에 기재된 것들로부터 선택된 PCR 프라이머 또는 서열분석 프라이머 세트(SEQ ID No 35 내지 58)를 사용하여 측정될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플로부터의 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 프라이머, 프라이머 세트, 또는 프라이머 어레이 외에, 키트의 시약은 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 바이러스 유전자형을 개별적으로 검출하기 위한, 예를 들어, 기타 프라이머, 프라이머 세트, 또는 프라이머 어레이를 포함할 수 있다. 사용되는 상기 프라이머 세트, 또는 프라이머 어레이는 당업계에 일반적으로 알려져 있거나, 통상의 요건을 알고 쉽게 생성될 수 있다.
부가적인 구현예에서, 본 발명의 키트는 당업계에 공지된 바와 같이 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 다양한 시약, 예컨대 완충제를 포함한다.
상기 시약 또는 완충제는 예를 들어 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 핵산(nucleic)을 추출 및/또는 정제하는데 유용할 수 있다.
키트는 또한 본 발명의 방법의 실시에 필요한 마이크로원심분리 튜브와 같은 필요한 물질을 모두 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염에 대해 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다: i) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에 있는지 여부를 측정하는 단계로서, 상기 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 단계, 및 ii) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성과 연관되는지여부에 근거하여 환자를 치료하는 단계.
일반적으로, C형 간염 치료는 인터페론 기반 치료이다. 더욱 바람직하게는, 인터페론 기반 치료는 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택된다. 통상적으로, 상기 인터페론 기반 치료는 리바비린과 조합된다. 대안적인 조합에는 항프로테아제 약물 또는 다른 항바이러스성 약물이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 또는 2(HSV-1 또는 HSV-2), B형 간염 바이러스(HBV) 또는 인플루엔자 바이러스 치료에 대한 무반응, 또는 상기 바이러스(들) 중 하나 이상으로 감염된 대상에서의 자발적 제거에 대한 민감성 측정 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에서 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
당업자는 본원에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것 이외에도 변형 및 개질이 쉽게 이뤄질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 발명에는 이의 취지 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 모든 이러한 변형 및 개질이 포함되는 것으로 이해된다. 본 발명에는 또한 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에 언급되거나 나타내어진 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 및 모든 조합 또는 상기 단계 또는 특징 중 임의의 2 이상이 포함된다. 그러므로 본 명세서는 모든 양상으로 설명되는 것이지 제한되는 것이 아닌 것으로 간주되고, 본 발명의 범주는 특허청구범위에 의해 표시되고, 동등한 의미 및 범주 내에 있는 모든 변화가 이에 포함되는 것으로 의도된다.
다양한 참조가 본 명세서 전체에 인용되고, 이의 각각은 전체가 참조로서 본원에 인용된다.
상기 설명은 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 실시 방법의 예이고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
환자 & 방법
환자는 8개의 주요 스위스 병원 및 이들의 지점 계열 센터에서 수행된 2개의 다중심 연구인 스위스 C형 간염 코호트 연구(SCCS) 및 스위스 HIV 코호트 연구(SHCS)의 개요 내에 포함되었다[23]. 유전적 시험을 포함하는 서면 동의서가 포함되는 것의 의무적이었고, 연구는 모든 지역 윤리 협회에 의해 승인을 받았다. 인종적으로 다양한 집단에서 C형 간염의 상이한 유전적 예측변수가 산출되기 때문에[10, 13, 24, 25], 본 발명자들은 분석을 코카시안 종(Caucasians)에만 국한시켰다. 흥미롭게도 오직 유전자형 1, 2, 3 및 4 만이 본 연구에서 제시되었다.
자발적 C형 간염 제거
만성 HCV 감염은 정량적 어세이에 의해 HCV-혈청 반응 양성(ELISA를 사용하고 면역블롯에 의해 확인됨) 및 검출가능한 HCV RNA로서 정의되었다. 자발적 C형 간염 제거는 항-HCV 요법을 시작하기 전에 HCV-혈청 반응 양성 및 미검출가능한 HCV RNA로서 정의되었다. 감염 첫해 동안 HCV RNA 수준의 변동을 피하기 위해([26]에 리뷰됨), 본 발명자들은 첫번째 문서화된 양성 HCV-혈청분석 후 적어도 1 년에 HCV RNA 수준을 측정하였다.
유전형분석
유전형분석을 Illumina Human1M-Duo BeadChip, HumanHap550 또는 Human600W-Quad를 사용함으로써, 스위스 제네바의 국립연구센터 "Frontiers in Genetics"에서 Illumina 게놈 플랫폼을 사용하여 수행하였다. Beadstudio 소프트웨어의 디폴트 세팅을 사용하여 유전형 호출을 수행하였다. 0.2 미만의 유전형분석 점수를 갖는 호출은 추가 분석에서 배재시켰다. 90% 미만의 호출 비율을 갖는 SNP 및 95% 미만의 호출 비율을 갖는 개체를 걸러냈다. >90% 호출 비율, 소수 대립유전자 빈도(MAF) >1%, Hardy-Weinberg p-값 >10-7을 갖는 측정된 SNP에 근거하여 MACH를 사용하여 결측을 수행하였다. 산출된 결측치 데이터에서, 낮은 결측치 정확성을 갖는 SNP(r2-hat<0.3)는 무시하였다. 집단 층화 및 관련성을 [28]에 기재된 혈통 주성분을 사용하여 평가하였다. 각각 유전적으로 관련된/일치하는 개개의 쌍 중 하나(관련성>0.25)를 추가 분석에서 배제시켰다. 각각의 유전자형 분석된 개인의 성별을 임상적 데이터와의 부합에 대해 평가하였다. 연관성 분석을 정확한 최대-우도 추정으로 로지스틱 회귀를 사용하여 수행하였다. 첫번째 2개의 혈통 주성분 값 및 B형 간염 바이러스 감염 상황(HBs-Ag의 존재 또는 부재로서 정의됨)과 같은 공변량을 모델에 포함시켰다. 가족-방식 오류율을 통제하기 위해 본페로니 수정을 사용하였다. 백만번의 독립된 시험을 추정하여[Han et al 2009 Plos Genetics], 통상 사용되는 5*10-8 역치를 산출하였다.
HIV - 공감염의 영향
자발적 HCV 제거에 대한 HIV-공감염의 잠재적인 영향을 고려하기 위해, HCV-단일감염 및 공감염 개인을 먼저 개별적으로 그리고 후속하여 분석하였고, 발명자들은 2개의 코호트를 게놈방식 메타-분석하였다. 각각의 코호트로부터 수득된 연관성 신호를 역분산비중을 사용하여 메타-분석하였다. 연관성 분석을 정확한 최대-우도 추정으로의 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 수행하였다. 첫번째 2개의 혈통 주성분과 함께, 단변량 분석에서 결과에 영향을 주는 공변량 (P<0.1)을 모델에 포함시켰다. 본 발명자들은 잠재적으로 중요한 인자를 무시하지 않게 하기 위해 공변량에 대한 포함 기준으로서 경미한 p-값 절삭(cut-off)을 사용하였다. 상이한 유전형분석 플랫폼을 사용한다는 사실을 고려하기 위해, 본 발명자들은 임의의 2개의 플랫폼 사이에서 대립유전자 빈도(만성 감염 환자 중에서)가 유의적으로 상이한(카이-제곱 검정, P<10-4) 임의의 SNP를 배재시켰다. 게놈 대조군을 게놈-방식 p-값에 적용하여 람다 = 1.04(단일감염된 코호트의 경우), 1.02(공감염된 코호트의 경우)를 산출하였다.
상기 값은 매우 경미한 인플레이션을 암시하였고, 가능한 집단 층화가 모델에 첫번째 2개의 혈통 주성분을 포함시킴으로써 충분히 교정되었다는 것을 확인시켜주었다. 복합 시험을 조정하기 위해 본페로니 수정을 사용하였다; 유의성 역치로서 5*10-8을 사용하였다.
실시예 2
결과
연구에는 1142명의 HCV 감염 환자(726명의 단일감염 및 416명의 HIV 공감염)가 포함되었고, 이 중에서 245명이 자발적 바이러스 제거가 있었고 897명이 만성 감염이 있었다(표 3). 만성적으로 감염된 환자 중에서, 404명이 페길화-인터페론 알파 리바비린 조합 요법에 대한 반응에 대해 평가 가능하였다. 예상대로, 자발적 제거와 연관된 인자는 저연령(P<0.001), 여성 성별(P<0.001) 및 활성 B형 간염(P<0.001)을 포함하였다. 치료에 대한 반응과 연관된 인자는 저연령(P=0.05), 여성 성별(0.03), 바이러스 유전자형 2 또는 3(P<0.001), 적은 바이러스 적재량(P<0.001) 및 제한된 섬유증(P=0.02)을 포함하였다.
SNP rs8099917은 자발적 C형 간염 제거와 명백하게 연관이 있었다(도 1). 유전자형 T/T(선조 대립유전자), G/T(이종) 및 G/G(동종)의 빈도는 자발적 제거가 있는 환자 중에서는 0.79, 0.20 및 0.01이었던 것에 비해, 만성 감염 환자 중에서는 각각 0.57, 0.38 및 0.05였다(OR=0.38, 95% 신뢰 구간 [CI] 0.27-0.53, P=2.86E-08, 부가 방식 하에서, 표 4, 도 2A). rs8099917과 자발적 제거와의 연관성은 연령, 성별, 활성 B 형 간염 및 HCV 위험 그룹을 설명하는 다변량 분석에 여전히 존재하였다(OR=0.38, 95% CI 0.28-0.53, P=6.81E-09, 부가 방식 하에서, 표 4).
rs8099917의 G 대립유전자는 또한 페길화 인터페론 알파 리바비린 조합 요법에 대한 무반응과 연관이 있었다(도 2B). 유전자형 T/T, G/T 및 G/G의 빈도는 지연된 바이러스 반응이 있는 환자 중에서 0.68, 0.29 및 0.03이었던 것에 비해, 무반응자 중에서 각각 0.43, 0.50 및 0.07이었다(OR=0.36, 95% CI 0.23-0.53, P=8.96E-07, 우세 방식 하에서, OR=0.38, 95% CI 0.27-0.53, P=2.86E-06, 부가 방식 하에서, 표 4, 도 2B). rs8099917과 치료에 대한 무반응의 연관성은 연령, 성별, HCV RNA, HCV 유전자형, 섬유증 병기 및 당뇨를 설명하는 다변량 모델에 여전히 존재하였다(OR=0.29, 95% CI 0.16-0.53, P=6.96E-05, 부가 방식 하에서). 전체적으로, 자발적 제거 환자(0.07), 지연된 바이러스 반응이 있는 환자(0.17) 및 치료에 대한 무반응인 환자(0.32) 중에서 rs8099917의 소수 대립유전자 빈도의 점진적인 증가가 있었다.
rs8099917 SNP는 3개의 사이토카인 유전자, 즉 IL28B, IL28A 및 IL29를 코딩하는 인간 염색체 19(대상이 인간인 경우에서)의 긴 분지 내 ~80kB 영역 내에 위치하였다(도 3A). 반수체형 블록 맵핑은 rs8099917이 전체 IL-28B 유전자를 포함하는 반수체형 블록의 일부라는 것을 보여주었다. 상이한 SNP의 P값의 그래프 도식은 IL28B 반수체형 블록에서 자발적 제거 및 치료에 대한 반응 모두에 대해 조화된 연관성 패턴을 보였다(도 3B). 연관성은 HCV 단일감염(OR=2.49, 95% CI=1.64-3.79, P=1.96*10-5) 뿐만 아니라 HCV/HIV 공감염 개인(OR=2.16, 95% CI=1.47-3.18, P=8.24*10-5)에서 관찰되었다. 자발적 제거의 경우, 표 4는 단일감염 및 공감염 환자의 그룹 중에서 다양한 유전자형 빈도 및 제거의 연관된 빈도를 나타낸다.
실시예 3
병원체 유전적 위험 결정요인.
본 발명자는 추가로 숙주 및 병원체 유전적 위험 결정요인의 연합 기여를 평가하였다. 환자를 바이러스 유전자형(바이러스 유전자형 2 또는 3 대 바이러스 유전자형 1 또는 4) 및 숙주 다형(숙주 rs8099917 G 위험 대립유전자 보유자 대 비-보유자, 표 5)에 따라 4개 그룹으로 층화하였다. 치료 실패는 모든 고 위험 파라미터를 갖는 환자 중에서 72% 와 비교하여 모든 저 위험 파라미터를 갖는 환자의 오직 16%에서 발생하였다(OR=18.89 [95% CI: 12.87-27.71], P=1.84E-14, 표 5). 유전자형 1 또는 4로 감염된 환자 중에서, 치료 실패는 비-보유자의 오직 38% 에 비해 감염된 위험-대립유전자 보유자의 72%에서 발생하였다(OR=6.54 [95% CI: 4.65-9.20], P=3.70E-8).
유전자형 2 또는 3으로 감염된 환자 중에서, 치료 실패는 비-보유자의 16% 와 비교하여 위험-대립유전자 보유자의 25%에서 발생하였다(OR=3.32 [95% CI: 2.21-4.99], P=3.27E-3). 또다시, 표 4 는 바이러스 유전자형 1 및 4 또는 2 및 3 각각으로 감염된 환자 그룹 중에서 다양한 유전자형(TT, TG, GG)의 분포 및 치료에 대한 반응 또는 무반응의 상응하는 빈도를 나타낸다.
표 2에 대한 주석
표 2에 제시된 SNP의 야생형/위험 대립유전자는 표 1에 언급된 상응하는 서열과 비교하여 동일 또는 반대 가닥 상에서 해독될 수 있음을 유념한다.
표 3에 대한 주석
표 3: 환자의 인구통계
1 SCCS는 Swiss Hepatitis C Cohort Study에 대한 약어이고, SHCS는 Swiss HIV Cohort Study에 대한 약어이다; 38명의 HIV-감염 SCCS 환자를 SHCS 환자와 함께 분석하였다.
2 HBs 항원은 352명의 단일감염 및 56명의 공감염 환자에서 결여되었다.
3 설정 지점에서의(제거 종결점에 대한) 및 치료 전의(치료 종결점에 대한) HCV RNA
4 과 음주자는 5년 초과 동안 1일 당 40g 초과의 알코올을 섭취하는 것으로 정의하였다.
5 치료 전 생검 데이터가 128명의 환자에서는 결여되었다. 중증 섬유증 및 염증이 METAVIR 점수 > 2에 의해 정의되었다.
표 4에 대한 주석
표 4: IL28A/B 유전자좌 내 다형성과 바이러스 제거와의 연관성
1 최대 유망 모델
2 연령, 성별, HBs AG 및 위험 유형에 대해 조정됨
3 연령, 성별, HCV RNA, HCV 유전자형, 섬유증 병기 및 당뇨에 대해 조정됨
4 연령, 성별, HCV RNA, 섬유증 병기 및 당뇨에 대해 조정됨
표 5에 대한 주석
표 5: 치료 반응의 바이러스 및 숙주 유전적 결정요인의 연합 분석
1 섬유증 병기, 성별, 연령, 기저 HCV 바이러스 적하량 및 첫번째 2개의 혈통 주성분에 대해 조정됨.
2 유전자형 1 또는 4 환자를 분석할 때, 치료 실패는 비-보유자의 오직 38% 에 비해 위험-대립유전자 보유자의 72%에서 일어난다(OR=6.54 [95% CI: 4.65-9.20], P=3.70E-8).
표 6: PCR 및 서열분석 프라이머(IL 28B 유전자좌)
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00006
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참조문헌
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE VAUDOIS UNIVERSITY OF BERN <120> METHODS FOR DIAGNOSING OR PREDICTING HEPATITIS C OUTCOME IN HCV INFECTED PATIENTS <130> IP20121922FR <150> CH 01201/09 <151> 2009-07-31 <150> US 61/282,538 <151> 2010-02-26 <160> 58 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or t <400> 1 gtgggttgac gttctcagac acaggtnccc atcggccaca tatttgaggt ct 52 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or t <400> 2 tgaactggaa gactccgatg tgttttnctc agtccctccc actttgacac tc 52 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or t <400> 3 gggtcacaga gctagcaaaa ggggaancag gatttgaacc tgagtctgtt tg 52 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a or g <400> 4 tgaccacaag gcaacaagtt tagggtntga agctatcatt ttgaggaagg ta 52 <210> 5 <211> 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<211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or t <400> 22 ctgaacatac atcatatgaa gaggcangct tatgatctgc acctgcgtct gg 52 <210> 23 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or g <400> 23 tcgtaagcag cctgggagat gtgggcntaa gctttggtga ggatgagagt ct 52 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a or t <400> 24 ctcaattgag gaagaatagc cttttcnaca aatggtgttt ggaccaattg ga 52 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a or g <400> 25 gcttcaaaaa catctgcccc caactcnttt gtgctttcac cactgctagg aa 52 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or t <400> 26 gctcctttgc cgagtaacat aagatangca cagggtccag ggatgcggtg ct 52 <210> 27 <211> 52 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is c or t <400> 27 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Claims (48)

  1. 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커의 존재가, 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 약 80kb를 포함하는 영역 내에서 염색체 19 상에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 SEQ ID No 1 내지 SEQ ID No 34를 포함하는 군으로부터 선택되는 서열로 본질적으로 이루어지는 핵산 분절에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와 연관된 다형 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 제5항에 따른 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와 완전한 또는 강한 연관 불균형에 있는 다형 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 제5항에 따른 군으로부터 선택되는 2개 이상의 SNP의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 rs8099917의 경우 G/T, rs8099917의 경우 G/G, rs576832의 경우 C/G, rs576832의 경우 C/C, rs12980275의 경우 G/A 또는 rs12980275의 경우 G/G를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    C형 간염 치료가 인터페론 기반 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 리바비린 또는 임의의 항프로테아제 약물 또는 임의의 다른 항바이러스성 약물 또는 이의 임의의 조합과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 만성 C형 간염이 HCV의 바이러스 유전자형 1, 2, 3 또는 4에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상의 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플 내 HCV 바이러스 유전자형을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상이 HIV로 공감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. C형 간염에 감염된 대상에서 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하는 방법으로서, 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커의 존재가, 상기 대상이 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표인 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 약 80kb을 포함하는 영역 내에서 염색체 19상에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 SEQ ID No 1 내지 SEQ ID No 34를 포함하는 군으로부터 선택되는 서열로 본질적으로 이루어지는 핵산 분절에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 다형 마커가 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와 연관된 다형 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다형 마커가 제19항에 따른 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SNP와 완전한 또는 강한 연관 불균형에 있는 다형 부위인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    다형 마커가 제19항에 따른 군으로부터 선택되는 2개 이상의 SNP의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    다형 마커가 rs8099917의 경우 G/T, rs8099917의 경우 G/G, rs576832의 경우 C/G, rs576832의 경우 C/C, rs12980275의 경우 G/A 또는 rs12980275의 경우 G/G를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 만성 C형 간염이 HCV의 바이러스 유전자형 1, 2, 3 또는 4에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플 내 HCV 바이러스 유전자형을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상이 HIV로 공감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염에 대해 환자를 치료하는 방법:
    i) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에 있는지 여부를 측정하는 단계로서, 상기 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 단계, 및
    ii) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성과 연관되는지 여부에 근거하여, 환자를 치료하는 단계.
  27. 제26항에 있어서,
    C형 간염 치료가 인터페론 기반 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 리바비린 또는 임의의 항프로테아제 약물 또는 임의의 다른 항바이러스성 약물 또는 이의 임의의 조합과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염에 대해 환자를 치료하는 방법:
    i) 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌에 있는지 여부를 측정하는 단계로서, 상기 환자의 다형 마커 중 하나 이상이 rs11879005, rs12975799, rs11083519, rs955155, rs12972991, rs12980275, rs8105790, rs11881222, rs10853727, rs8109886, rs8113007, rs8099917, rs7248668, rs16973285, rs10853728, rs4803223, rs12980602, rs4803224, rs664893, rs576832, rs11671087, rs251910, rs7359953, rs7359950, rs2099331, rs11665818, rs570880, rs503355, rs30461, rs194014, rs251903, rs12979175, rs39587, rs30480을 포함하는 군으로부터 선택되는 단계,
    ii) 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 HCV 바이러스 유전자형을 측정하는 단계, 및
    iii) 환자의 다형 마커 중 하나 이상 및 HCV 바이러스 유전자형이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성과 연관되는지 여부에 근거하여, 환자를 치료하는 단계.
  31. 제30항에 있어서,
    C형 간염 치료가 인터페론 기반 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 리바비린 또는 임의의 항프로테아제 약물 또는 임의의 다른 항바이러스성 약물 또는 이의 임의의 조합과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자가 HIV로 공감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 평가하는 방법:
    i) 상기 대상에서, 상기 대상의 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 측정함으로써 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 갖는 것을 구별하는 단계로서, 하나 이상의 다형 마커의 존재가 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 지표를 나타내는 단계,
    ii) C형 간염 치료 섭생을 수립하는 단계.
  36. 제35항에 있어서,
    C형 간염 치료가 인터페론 기반 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 리바비린 또는 임의의 항프로테아제 약물 또는 임의의 다른 항바이러스성 약물 또는 이의 임의의 조합과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상이 HIV로 공감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 하기 단계를 포함하는, 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 평가하는 방법:
    i) 상기 대상에서, 하기를 측정함으로써 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 갖는 것을 구별하는 단계:
    - 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재, 여기서 하나 이상의 다형 마커의 존재는 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 것을 나타내는 지표임, 및
    - HCV 바이러스 유전자형, 여기서 유전자형 1 또는 4의 존재는 상기 대상이 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 증가된 민감성을 갖는 것을 나타내는 지표임,
    ii) C형 간염 치료 섭생을 수립하는 단계.
  41. 제40항에 있어서,
    C형 간염 치료가 인터페론 기반 치료인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 IFNα, IFNλ 또는 임의의 페길화-인터페론을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서,
    인터페론 기반 치료가 리바비린 또는 임의의 항프로테아제 약물 또는 임의의 다른 항바이러스성 약물 또는 이의 임의의 조합과 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상이 HIV로 공감염된 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 만성 C형 간염을 앓고 있는 대상에서 C형 간염 치료에 대한 무반응에 대한 민감성을 측정하기 위한 키트로서,
    i) 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하기 위한 시약 및 ii) 사용 지침을 포함하는, 키트.
  46. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항의 방법에 따라 C형 간염에 감염된 대상에서 비-자발적 C형 간염 제거에 대한 민감성을 측정하기 위한 키트로서,
    i) 상기 대상으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 단리된 핵산 샘플에서 IL28B/A 및/또는 IL-29 유전자좌 내 하나 이상의 다형 마커의 존재 또는 부재를 선택적으로 검출하기 위한 시약 및 ii) 사용 지침을 포함하는, 키트.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서,
    상기 시약이 바이러스 유전자형을 검출하기 위한 또다른 프라이머, 프라이머 세트, 또는 프라이머 어레이를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상이 HIV로 공감염된 것을 특징으로 하는 키트.
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