KR20070037228A - Ｈｃｖ 특이 유전자 검출키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PCR 반응혼합물, HCV의 5' UTR부위(5' UTR region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 양성대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 HCV 특이 유전자 검출키트 및 전기 키트를 이용하여 HCV 특이 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HCV 검출키트를 사용할 경우, C형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있으므로, C형 간염의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
HCV 특이 유전자, HCV 특이 유전자 검출키트

Description

ＨＣＶ 특이 유전자 검출키트{Kit for Detecting of HCV Specific Gene}
본 발명은 HCV 특이 유전자 검출키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 PCR 반응혼합물, HCV의 5' UTR부위(5' UTR region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 양성대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 HCV 특이 유전자 검출키트 및 전기 키트를 이용하여 HCV 특이 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus: HCV)는 간염의 원인 바이러스로 급성간염에서 만성간염, 간경변 및 간암으로 진행되는 매우 위험한 질병을 일으키는 요인으로서, 주로 수혈과 체액에 의해 감염되는 것으로 알려져 있다(참조: Choo et al., Science, 244:359-362, 1989). 전기 바이러스는 전세계적으로 약 4억 명 가량이 감염되어 있는 것으로 추정되는데, 유럽, 북미, 일본 등의 선진국에서는 전 인구의 0.2-2%, 남미, 아시아 등에서는 2-5%, 대부분의 아프리카 국가 에서는 5% 이상이 감염되어 있으며, 우리나라에서도 전 인구의 1.6%인 80만명 가량이 HCV에 감염되어 있는 것으로 추정되고 있다(참조: Park et al., J. Viral Hepat., 2:195-202, 1995). 이와 같이 HCV는 인류건강을 위협하는 매우 무서운 바이러스로 C형 간염 바이러스(Hepatitis B virus: HCV)와는 달리 감염자의 50-85%가 만성간염으로 진행될 정도로 예후가 좋지 않은 바이러스임에도 불구하고, RNA 바이러스라는 특성때문에 아직까지 적절한 치료제 및 백신개발은 물론 기초적인 연구도 확립되지 못한 실정이다. 그러나, 분자생물학의 발전에 따라서 진단방법들이 개발되어 수혈에 따른 감염 위험에서 벗어날 수가 있게 되었으나, 아직도 감염자의 많은 수의 감염경로가 불분명하여 감염의 위험은 계속 남아있는 상태이다.
HCV는 1989년 츄(Choo) 등에 의해 침팬지의 혈장에서 얻은 non-A, non-B(NANB)형 간염의 바이러스로부터 밝혀진 50nm 정도 크기로 약 9,500개의 염기와 3,000여개의 아미노산으로 이루어진 양성 단일사슬 RNA(positive-single strand linear RNA) 바이러스이다. HCV 유전자의 기본 구조는 핵, 뉴클레오캡시드 및 외막 당단백질을 포함하는 3개의 구조 단백질과 헬리카제, 단백질분해효소, RNA 중합효소, 전사효소 및 조절펩티드를 포함하는 6개의 비구조 단백질을 생성하는 하나의 개방해독틀(open reading frame, ORF)로 이루어져 있다(참조: Chou et al., Jpn. J. Med. Sci. Biol., 4:147-157, 1991). ORF의 양쪽 끝에는 5'-비해독영역(untranslated region, 5'UTR)과 3'UTR이 존재하는데, 5'UTR은 약 340 bp로 HCV 유전자에서 가장 보존이 잘되어 있는 부위로서 스템-루프(stem-loop) 구조로 되어 있다(참조: Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:1711-1715, 1991). HCV는 매우 높은 돌연변이율을 나타내지만, HCV 유전자 중에서 5'UTR과 뉴클레오캡시드는 보존이 잘되어 있고, E1 유전자와 E2 유전자에서 변이가 가장 많이 나타나고 있다(참조: Ogata et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:3392-3396, 1991).
이로 인하여, HCV는 매우 높은 유전자 다형성을 나타내고 있는데, 현재까지 크게 6개의 형으로 분류를 하고 그 속에 속하는 아형도 수종에서 수십종까지 분포하고 있다(참조: Simmonds et al., J. Gen. Virol., 74:2391-2399, 1993; Cha et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89:7144-7148, 1992). 아직까지는 이들 형을 분류하는데 있어 표준화된 방법이 없어 연구자마다 서로 다른 명명법을 사용하고 있으나, 현재는 시몬즈(Simmomds) 등이 제안한 분류법이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 즉, 유전자형에 숫자(1, 2, 3 등)를 붙이고 아형에 알파벳 문자 (a, b, c 등)를 붙이는 방법으로서, 이들 분류법을 사용하면, HCV는 유전자형간에는 31-35%의 차이가 있고 아형간에는 20-23%의 차이를 나타내고 있으며, 같은 아형 내에서도 1-10%의 차이를 보이고 있다는 사실이 보고되었다(참조: Simmonds et al., J. Gen. Virol., 74:661-668, 1993). HCV 유전자형의 분석은 HCV 감염의 확인, 감염 경로, 및 IFN-α의 치료효과를 예측하는 등에 이용되고 있고, 지역과 민족에 따라 다른 분포를 보이고 있기 때문에 분포도 조사 및 백신 개발에도 이용되고 있다(참조: Hinoet al., J. Med. Virol., 42:299-305, 1994; Greene et al., J. Gen. Virol., 76:211-215, 1995).
현재 HCV를 치료하는데 가장 보편적인 항바이러스 치료제는 IFN-α인데, 대 개 치료자의 50% 이상이 효과를 보이나 25% 정도만이 간의 작용이 정상으로 돌아오고 혈청내 HCV가 사라진다고 한다. 이때, IFN-α의 치료효과와 HCV 유전자형과의 관련성이 보고되고 있는데, 유전자형 1a, 2, 3, 및 5에서는 치료효과가 뛰어나지만, 1b와 4에서는 효과가 떨어지며, 1b와 4는 만성간염으로의 전환이 빠른데 반하여 1a와 2a는 증상 호전이 훨씬 우수함이 보고되어 있다(참조: Yoshioka et al., Hepatology. 16:293-299, 1992; Lopez-Labrador, et al., J. Hepatol., 27:959-965, 1997).
이처럼 HCV는 대부분 만성 간질환을 유발시킬 수 있기 때문에, 조기진단의 필요성이 계속적으로 요구되었으나, RNA 바이러스라는 특성으로 인하여, HCV의 조기진단에 큰 어려움을 겪고 있다. 이에, 아직 만성 간질환이 발병하지 않은 상태에서, HCV에 감염되었는지를 확인하여 HCV로 인한 간질환의 발병을 조기진단할 수 있는 방법을 개발하려는 노력이 계속되어 왔다.
예를 들어, 대한민국 특허등록 제 137173호에는 항 HCV, HIV-1, HIV-2 및 HTLV-1 항체를 이용한 항원-항체반응에 의하여, HCV, HIV-1, HIV-2 및 HTLV-1를 동시진단할 수 있는 진단시약 및 이를 포함하는 진단키트가 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 206150호에는 HCV 폴리프로테인의 C 도메인으로부터 유래된 에피토프를 포함하는 제1HCV 항원, HCV 폴리프로테인의 NS3 도메인으로부터 유래된 에피토프를 포함하는 HCV 항원, HCV 폴리프로테인의 NS4 도메인으로부터 유래된 에피토프를 포함하는 HCV 항원, HCV 폴리프로테인의 S 도메인으로부터 유래된 에피토프를 포함하는 HCV 항원, HCV 폴리프로테인의 NS5 도메인으로부터 유래된 에피토프를 포 함하는 HCV 항원이 고체 매트릭스 표면상에 고정화되어, 면역학적 분석에 의한 HCV의 검출에 사용될 수 있는 C형 간염 바이러스(HCV)항원의 조합체가 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제 390371호에는 C형 간염 바이러스의 증식조절 단백질인 NS3 헤리카제 활성부위와 특이적으로 결합하는 RNA 및 상기 RNA와 HCV에 의해 발현되는 복합단백질의 NS3 헤리카제 활성부위의 특이적 결합을 검출하여 HCV 감염을 진단할 수 있는 HCV 감염 진단용 키트가 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 434117호에는 HCV의 유전자 구조 중 핵(Core), 비구조3(NS 3), 비구조5A(NS 5A) 단백질 부위를 포함하는 HCV cDNA의 342번부터 860번 염기서열로 부터 발현되는 항원 및 전기 항원에 대한 항체를 검출하여, HCV의 감염여부를 확인할 수 있는 진단용 키트가 개시되어 있으며. 대한민국 특허등록 제 451049호에는 ＨＣＶ의 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 유전자칩 및 이를 포함하는 HCV 감염진단용 키트가 개시되어 있다. 상기 개발된 다양한 기술 중에서 유전자칩을 이용한 기술은 다른 기술에 비하여, 민감도가 우수하고, 비특이적인 단백질에 의한 간섭을 방지할 수 있어, HCV의 진단에 있어 주된 방법으로 이용되고 있으나, HCV의 유전자가 충분히 존재하지 않은 시료를 대상으로 사용할 경우에는 비특이적인 유전자의 증폭에 의하여 오차가 발생될 가능성이 높기 때문에, HCV가 충분히 감염되지 않은 초기 환자로부터 수득한 시료에서는 검출이 용이하지 않다는 단점이 제기되었다.
상술한 단점을 극복하기 위한 방법으로, 최근에는 미량의 시료로부터 표적 RNA의 정량까지 가능한 실시간 RT-PCR 방법을 활용한 진단 키트들이 개발되어 시판 되고 있다. 그러나, 상기 진단키트들은 표준 유전자로 RNA를 제공함으로써 안정성 및 재현성의 문제점을 내포하고 있거나, 표준화에 사용되는 참조 유전자정량용 프라이머 및 프로브가 포함되어 있지 않아, 정확한 진단이 수행될 수 없다는 단점이 지적되어, 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 HCV 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
따라서, 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 HCV 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 HCV 특이 유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, HCV 특이 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브와 내부대조군 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 HCV 특이 유전자 검출키트를 사용할 경우, 보다 간편하고, 정확하게 HCV 특이 유전자를 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 간편하면서도 정확하게 HCV 특이 유전자를 검출할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 키트를 이용하여, HCV 특이 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 HCV 검출키트는 (ⅰ) 완충용액, DNA 중합효소, KCl, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 포함하는 PCR 반응혼합물; (ⅱ) HCV의 HCV의 5' UTR부위(5' UTR region) 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)로 구성된 HCV 프로브 및 프라이머 혼합물; (ⅲ) 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 TaqMan프로브(서열번호 6)로 구성된 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물; (ⅳ) HCV UTR부위(5' UTR region) 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 양성대조군 유전자시료; (ⅴ) 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 내부대조군 유전자시료; 및, (ⅵ) 반응용 멸균수를 포함한다. 이때, 완충용액은 특별히 이에 제한되지 않으나, pH 7 내지 8의 중성완충용액을 사용함이 바람직하고, 전기 PCR 반응혼합물에 (NH4)2SO4, 송아지혈청알부민, EDTA, ROX(6-carboxy-X-rhodamine) 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수도 있다. 또한, HCV 특이적 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 5' 말단이 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein) 또는 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)으로 표지되고, 3' 말단이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6- carboxytetramethyl-rhodamine)으로 표지된 것을 사용함이 바람직하고, 내부대조군 특이적 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 5'말단이 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지되고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지되며, 3'말단이 인산화된 것을 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 환자에게서 HCV를 검출할 수 있는 방법을 다각적으로 연구하던 중, 종래의 키트를 개량하는 방법을 모색하게 되었다.
지금까지 사용된 환자에게서 HCV를 검출하는 키트 중에서 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 이용하는 키트의 경우, 상대적으로 정확도가 우수함이 알려져 있는데, 이의 기술적 원리는 다음과 같다: 먼저, 시료에 존재하는 HCV 특이 유전자를 주형으로 하고, 적절한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행할 때, HCV 특이 유전자와 결합할 수 있는 프로브를 첨가한다. 이때, 사용되는 프로브는 3'말단과 5'말단에 각각 서로 다른 2종류의 형광물질로 표지하도록 제조되는데, 사용되는 2종류의 형광물질은 일정한 간격내에 존재할 경우, 발색되는 형광이 상호 간섭현상을 나타내어, 형광이 발색되지 않는 것을 사용하게 된다. 결과적으로, 중합효소 연쇄반응을 수행할 때, 주형의 일측방 말단에는 프라이머가 결합하고 이를 인식하는 DNA 중합효소에 의하여 중합효소 연쇄반응이 순차적으로 수행되고, 주형의 가운데 부분에는 2종류의 형광물질로 표지된 프로브가 결합된다. 이어, 중합효소가 전기 프로브가 결합된 부위에 도달하면, 프로브를 형광물질이 표지된 5'말단부터 순차적으로 분해시키면서, 중합반응을 계속적으로 수행하게 되므로, 5'말단에 표지된 형광물질이 소실되는 결과를 초래한다. 이에 따라, 간섭현상이 소실되어, 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색반응을 수행하여, HCV 특이 유전자가 증폭되고 있음을 나타내게 된다.
또한, 본 발명자들은 PCR이 정상적으로 수행되었는지의 여부를 확인할 수 있도록, 내부대조군을 이용하였다. 즉, 환자로부터 수득한 검체시료에서 HCV의 감염여부에 상관없이 정상적으로 발현되는 유전자를 내부대조군으로 활용하여, HCV 특이 유전자와 함께 PCR을 수행하였을 경우, 내부대조군이 증폭되지 않았다면, PCR이 정상적으로 수행되지 않은 것으로 간주할 수 있으므로, 검출된 결과에 대한 신뢰성을 높일 수 있었다.
본 발명의 HCV 검출키트를 사용할 경우, C형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있으므로, C형 간염의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다: 즉, 유전자분석시료 및 전기 HCV 검출키트의 양성대조군 유전자시료와 내부대조군 유전자시료에, 각각 전기 HCV 검출키트의 HCV 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 및 PCR 반응혼합물을 가하고 혼합한 다음, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 유전자분석시료 및 양성대조군의 HCV PCR 산물과 내부대조군 PCR 산물을 각각 수득하고, 전기 유전자분석시료, 양성대조군 유전자시료 및 내부대조군 유전자시료의 증폭여부를 확인함으로써, 유전자분석 시료에 존재하는 HCV 특이 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있다.
아울러, 이러한 측정방법은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 실행될 수 있는데, 실시간 중합효소 연쇄반응기기는 특별히 이에 제한되지는 않으나, LightCyclerTM(Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 사용함이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: HCV 검출키트의 제조
PCR 반응혼합물 1.25㎖, HCV 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 양성대조군 유전자시료 50㎕, 내부대조군 유전자시료 400㎕ 및 반응용 멸균수 l㎖로 구성된 HCV 검출키트를 제조하였다.
실시예 1-1: PCR 반응혼합물, HCV 프로브 및 프라이머 혼합물 및 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물의 제조
먼저, PCR 반응혼합물은 100mM Tris/HCl(pH 8.3), 20mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 7mM MgCl2, 1.625U DNA 중합효소, 0.8mM dUTP, 0.8mM dATP, 0.8mM dCTP 및 0.8mM dGTP를 혼합하여 제조하였다.
다음으로, HCV 프로브 및 프라이머 혼합물은 하기의 염기서열을 갖는 HCV 특이 유전자에 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)를 혼합하여 제조하고, 이들의 5' 말단을 VIC로 표지하고, 3' 말단을 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지하였다.
센스 프라이머 : 5'-cccctgtgaggaactactgtcttca-3'(서열번호 1)
안티센스 프라이머 : 5'-cctggcaattccggtgtactc-3'(서열번호 2)
프로브 : 5'-tcccgggagagccatagtggtctgc-3'(서열번호 3)
끝으로, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물은 하기의 염기서열을 갖는 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 프로브(서열번호 6)를 혼합하여 제조하였다. 이때, 프로브의 5'말단은 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지하고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지시켰으며, 3'말단을 인산화시켰다.
센스 프라이머 : 5'-cagactgtccacagcattcc-3'(서열번호 4)
안티센스 프라이머 : 5'-ccaacgagcggcttcact-3'(서열번호 5)
프로브 : 5'-agaccctgaggctcaaagtcagatgctact-3'(서열번호 6)
실시예 1-2: 양성대조군 유전자시료의 제조
양성대조군 유전자시료로는 140bp의 HCV 5' UTR 유전자의 일부를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하였다. 구체적으로, ACCURUN 305 HCV RNA positive control(BBI Diagnostics, MA, USA)로부터 분리된 RNA를 역전사 키트(SuperScript III first strand cDNA synthesis kit, Invitrogen, USA)에 적용하여, cDNA를 수득하였다. 이어, 전기 cDNA를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 140bp의 HCV 5' UTR 유전자의 일부를 얻었으며, 이를 발현벡터(PCR 2.1 TOPO vector)에 삽입하여 제조한 재조합 플라스미드 DNA를 양성대조군 유전자시료로 사용하였다.
센스 프라이머 : 5'-cccctgtgaggaactactgtcttca-3'(서열번호 7)
안티센스 프라이머 : 5'-cctggcaattccggtgtactc-3'(서열번호 8)
실시예 1-3: 내부대조군 유전자시료의 제조
내부대조군 유전자시료로는 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자인 b3a2 융합 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하였다. 구체적으로, RNA 추출키트(RNAqueous kit, Ambion, USA)을 사용하여, K-562 세포주 (ATCC No. CCL-243)로부터 K562 RNA를 추출하고, 전기 K562 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하여 443bp의 b3a2 융합 유전자를 얻었으며, 이를 발현벡터(PCR 2.1 TOPO vector)에 삽입하여 재조합 플라스미드 DNA를 수득한 다음, 이를 200카피수로 희석시켜 내부대조군 유전자시료를 제조하였다.
실시예 1-4: HCV 검출키트의 제조
전기 실시예 1-1에서 제조한 PCR 반응혼합물 1.25㎖, 전기 실시예 1-1에서 제조한 HCV 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 전기 실시예 1-1에서 제조한 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 전기 실시예 1-2에서 제조한 양성대조군 유전자시료 50㎕, 전기 실시예 1-3에서 제조한 내부대조군 유전자시료 400㎕ 및 반응용 멸균수 l㎖로 구성된 HCV 검출키트를 제조하였다.
실시예 2: HCV 검출키트를 이용한 HCV 특이 유전자의 검출
전기 실시예 1에서 제조한 HCV 검출키트를 이용하여, 정상인과 C형 간염환자의 시료로부터 HCV 특이 유전자를 검출하여, 정상인과 C형 간염환자를 구별할 수 있는지의 여부를 확인하였다.
실시예 2-1: 측정할 시료의 준비
먼저, 치료된 C형 간염 환자의 혈청 1, 0.5 및 0.2ml(실험군 1-1 내지 1-3)과 치료되지 않은 C형 간염 환자의 혈청 1, 0.5 및 0.2ml(실험군 2-1 내지 2-3)를 각각 수득하고, 전기 각 혈청을 DNA 정제키트(High pure nucleic acid purification kit, Roche, Germany)에 적용하여 각각의 DNA를 추출하고, 이를 시료로서 사용하였다.
실시예 2-2: 시료의 증폭 및 증폭결과의 분석
PCR용 튜브에 전기 실시예 1-1에서 제조한 PCR 반응혼합물 12.5㎕, HCV 프로브 및 프라이머 혼합물 3㎕, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 3㎕, 및 멸균수 1.5㎕를 분주하여, 반응용 튜브를 준비하였다. 이어, 전기 준비된 각각의 반응용 튜브에 전기 실시예 1-2에서 제조한 양성대조군 유전자시료, 전기 실시예 1-3에 서 제조한 내부 대조군 유전자시료 및 전기 실시예 2-1에서 수득한 실험군 1-1 내지 2-3의 DNA를 각각 5㎕씩 분주하고, 이를 실시간 중합효소 연쇄반응기기인 ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA)에 적용하고, PCR을 수행하여, HCV 양성대조군 PCR 산물과 시료 PCR 산물을 각각 수득하였다. 이때, PCR은 95℃에서 10분간 변성(denaturation)시키고, 95℃에서 20초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초동안 반응시키는 일련의 과정을 45회 반복수행하여 증폭(amplification)을 수행하였다. 증폭을 수행하는 중, 3' 말단에 표지된 6-카르복시테트라메틸-로다민으로부터 유래된 형광이 지속적으로 발색됨을 확인하였으므로, 정상적으로 증폭이 수행됨을 알 수 있었다. 이어, 전기 증폭된 PCR 절편을 수득한 다음, 전기영동하여, 목적하는 절편의 존재유무를 확인하여 O와 X로 표시하였다(참조: 표 1). 이때, O는 목적 유전자가 증폭되어 전기영동상에 밴드로 확인됨을 의미하고, X는 목적 유전자가 증폭되지 않아 전기영동상에 밴드로 확인되지 않음을 의미한다.
각 시료의 PCR 증폭 결과
실험군 양성대조군 유전자 내부대조군 유전자 시료 유전자
실험군 1-1 O O X
실험군 1-2 O O X
실험군 1-3 O O X
실험군 2-1 O O O
실험군 2-2 O O O
실험군 2-3 O O O
상기 표 1에서 보듯이, 정상인을 대상으로 한, 실험군 1-1 내지 1-3의 시료 유전자는 증폭되지 않았고, C형 간염환자를 대상으로 한, 실험군 2-1 내지 2-3의 시료 유전자는 증폭되었으므로, 본 발명의 HCV 검출키트를 이용할 경우, C형 간염환자를 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 모든 실험군에서 140bp의 양성대조군 유전자와 443bp의 내부대조군 유전자가 모두 증폭됨을 알 수 있었다. 이때, 양성대조군 유전자는 센스프라이머(서열번호 1)에 의하여 증폭되는데, 증폭된 양성대조군 유전자로부터 시료 유전자가 비특이적으로 증폭되지 않았다고 분석되었고, 증폭된 내부대조군 유전자로부터 전기 PCR 증폭에 오류가 없다고 분석되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 PCR 반응혼합물, HCV의 5' UTR부위(5' UTR region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 양성대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 HCV 특이 유전자 검출키트 및 전기 키트를 이용하여 HCV 특이 유전자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 HCV 검출키트를 사용할 경우, C형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 검출할 수 있으므로, C형 간염의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
<110> BIOSEWOOM INC. <120> Kit for Detecting of HCV Specific Gene <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cccctgtgag gaactactgt cttca 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cctggcaatt ccggtgtact c 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tcccgggaga gccatagtgg tctgc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagactgtcc acagcattcc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccaacgagcg gcttcact 18 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 agaccctgag gctcaaagtc agatgctact 30 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cccctgtgag gaactactgt cttca 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cctggcaatt ccggtgtact c 21

Claims (3)

  1. (ⅰ) 완충용액, DNA 중합효소, KCl, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 포함하는 PCR 반응혼합물;
    (ⅱ) HCV의 HCV의 5' UTR부위(5' UTR region) 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)로 구성된 HCV 프로브 및 프라이머 혼합물;
    (ⅲ) 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 TaqMan프로브(서열번호 6)로 구성된 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물;
    (ⅳ) HCV UTR부위(5' UTR region) 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 양성대조군 유전자시료;
    (ⅴ) 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 내부대조군 유전자시료; 및,
    (ⅵ) 반응용 멸균수를 포함하는, HCV 검출키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    HCV 특이적 프로브는 5' 말단이 6-카르복시플루오레세인(6- carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein) 또는 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)으로 표지되고, 5'으로부터 10 내지 20번째 염기중 티민이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine)으로 표지되며, 3'말단이 인산화되고, 내부대조군 특이적 프로브는 5'말단이 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지되고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지되며, 3'말단이 인산화된 것을 특징으로 하는
    HCV 검출키트.
  3. 유전자분석시료, 제 1항의 양성대조군 유전자시료 및 제 1항의 내부대조군 유전자시료에, 각각 제 1항의 HCV 검출키트의 HCV 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 및 PCR 반응혼합물을 가하고 혼합한 다음, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 유전자분석시료 및 양성대조군의 HCV PCR 산물과 내부대조군 PCR 산물을 각각 수득하고, 전기 유전자분석시료, 양성대조군 유전자시료 및 내부대조군 유전자시료의 증폭여부를 확인하는 단계를 포함하는, HCV 특이 유전자의 검출방법.
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