KR100451049B1 - Ｃ형 간염 바이러스 (ｈｃｖ) 유전자형 분석을 위한올리고뉴크레오티드 칩 조성물 및 그 검사 방법 - Google Patents

Ｃ형 간염 바이러스 (ｈｃｖ) 유전자형 분석을 위한올리고뉴크레오티드 칩 조성물 및 그 검사 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈장 및 혈청으로부터 RNA를 추출하고 C형 간염 바이러스 (HCV) RT-PCR을 시행한 후에 HCV 올리고뉴크레오티드 칩과 반응시킴으로써 HCV 유전자형을 분석하는 방법에 관한 발명으로, 하나의 슬라이드 위에서 4명에 대한 HCV 유전자 형의 분석을 간단하고 정확하게 검사하는 방법을 제공한다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 (ＨＣＶ) 유전자형 분석을 위한 올리고뉴크레오티드 칩 조성물 및 그 검사 방법{Oligonucleotide chip composition for analyzing Hepatitis C virus (HCV) genotype and detecting method thereof}
본 발명은 올리고 뉴크레오티드 칩 조성물 및 그 제조방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 C형 간염 바이러스 (HCV) 유전자형 분석을 위한 올리고뉴크레오티드 칩 (oligonucleotide chip) 조성물 및 그 제조방법에 관한 발명이다.
일반적으로, C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus; HCV)는 간염의 원인 바이러스로 급성간염에서 만성간염, 간경변 및 간암으로 진행되는 매우 위험한 질병을 일으키는 요인으로서, 주로 수혈과 체액에 의해 감염된다 (Choo et al.,Science244, 359-362, 1989). 이 바이러스는 전세계적으로 약 4억 명 가량이 감염되어 있는 것으로 추정되는데 유럽, 북미, 일본 등의 선진국에서는 전 인구의 0.2-2%, 남미, 아시아 등에서는 2-5%, 대부분의 아프리카 국가에서는 5% 이상이 감염되어 있으며, 우리나라에서도 전 인구의 1.6%인 80만명 가량이 HCV에 감염되어 있는 것으로 추정되고 있다 (Park et al.,J. Viral Hepat. 2, 195-202, 1995). 이와 같이 HCV는 인류건강을 위협하는 매우 무서운 바이러스로 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus; HBV)와는 달리 감염자의 50-85%가 만성간염으로 진행될 정도로 예후가 좋지 않은 바이러스임에도 불구하고, RNA 바이러스라는 특성 때문에 아직까지 적절한 치료제 및 백신개발은 물론 기초적인 연구도 확립되지 못한 실정이다. 그러나 분자생물학의 발전에 따라서 진단 방법들이 개발되어 수혈에 따른 감염 위험에서 벗어 날 수가 있게 되었으나, 아직도 감염자의 많은 수의 감염경로가 불분명하여 감염의 위험은 계속 남아있는 상태이다.
HCV는 1989년 Choo 등에 의해 침팬지의 혈장에서 얻은 non-A, non-B (NANB)형 간염의 바이러스로부터 밝혀진 50 nm 정도 크기로 약 9,500개의 염기와 3,000여개의 아미노산으로 이루어진 positive-single strand linear RNA 바이러스이다. 이 HCV 유전자의 기본 구조는 core, nucleocapsid 및 envelope glycoprotein과 같은 3개의 구조 단백질과 helicase, viral protease, RNA-dependent RNA polymerase, transcriptase 및 regulatory peptide 같은 6개의 비구조 단백질을 생성하는 하나의 open reading frame (ORF)으로 이루어져 있다 (Chou et al.,Jpn. J. Med. Sci. Biol.4, 147-157, 1991). ORF의 양쪽 끝에는 5'-untranslated region (5'UTR)과 3'UTR이 존재하는데, 5'UTR은 약 340 bp로 HCV 유전자에서 가장 보존이 잘되어 있는 부위로서 stem-loop 구조로 되어 있다 (Han et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88, 1711-1715, 1991).
HCV는 돌연변이율이 높아 1년에 (1.44-1.92) x 10-3bp 정도의 염기 치환이 발생하는데, HCV 유전자 중에서 5'UTR과 capsid가 가장 보존이 잘되어 있고 E1과 E2에서 변이가 가장 많이 나타나고 있다 (Ogata et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88, 3392-3396, 1991). 이로 인하여 HCV는 매우 높은 유전자 다형성을 나타내고 있는데 현재까지 크게 6개의 형으로 분류를 하고 그 속에 속하는 아형도 수종에서 수십종까지 분포하고 있다 (Simmonds et al.,J. Gen. Virol.74, 2391-2399, 1993; Cha et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89, 7144-7148, 1992). 아직까지 이들 형을 분류하는데 있어 표준화된 방법이 없어 연구자마다 서로 다른 명명법을 사용하고 있으나, 현재는 Simmomd 등이 제안한 분류법이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 이 분류법은 유전자형에 숫자 (1, 2, 3 등)를 붙이고 아형에 알파벳 문자 (a, b, c 등)를 붙이는 방법이다. 이들 분류법에 따르면 HCV는 유전자형간에는 31-35%의 차이가 있고 아형간에는 20-23%의 차이를 나타내고 있으며, 같은 아형 내에서도 1-10%의 차이를 보이고 있다 (Simmonds et al.,J. Gen. Virol.74, 661-668, 1993).
HCV 유전자형의 분석은 HCV 감염의 확인, 감염 경로, 및 IFN-α의 치료 효과를 예측하는 등에 이용되고 있다(Hino et al.,J. Med. Virol.42, 299-305, 1994). 또한 지역과 민족에 따라 다른 분포를 보이고 있기 때문에 (Greene et al.,J. Gen. Virol.76, 211-215, 1995), 분포도 조사 및 백신 개발에도 이용되고 있다. 현재 HCV를 치료하는데 가장 보편적인 항바이러스 치료제는 IFN-α인데, 대개치료자의 50% 이상이 효과를 보이나 25% 정도만이 간의 작용이 정상으로 돌아오고 혈청내 HCV가 사라진다고 한다. 이때 IFN-α 치료 효과와 HCV 형과 관련성이 보고되고 있는데, 유전자형 1a, 2, 3, 및 5에서는 치료 효과가 뛰어나지만, 1b와 4에서는 효과가 떨어진다고 한다 (Yoshioka et al.,Hepatology16, 293-299, 1992). 또한 1b와 4는 만성간염으로의 전환이 빠른데 반하여 1a와 2a는 증상 호전이 훨씬 좋다고 나타나 있다(Lopez-Labrador, et al.,J. Hepatol. 27, 959-965, 1997).
일반적으로 HCV 유전자형을 분석하는 데는 다음과 같은 방법이 사용되고 있다. 첫째는 HCV 유전자형에 특이성을 지닌 PCR 프라이머를 사용하는 SSP-PCR 이다. 이는 core 부위에서 여러 유전자형에 특이한 PCR 프라이머를 조합하여 RT-PCR을 실시하는 것인데, 이는 RT-PCR 후에 바로 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 프라이머 인식 부위에 돌연변이가 발생하거나 새로운 형에 대하여서는 결정을 못하는 단점이 있다. 이로 인하여 변이가 많은 HCV 유전자형 분석에는 바람직하지 않은 방법이다. 둘째는 5'UTR 부위를 RT-PCR로 증폭하고 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP 법인데(Park et al.,J. Med. Microbiol.47, 1998), 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나 사용하는 제한효소가 변이 부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하는 단점이 있다. 셋째는 5'UTR 부위를 RT-PCR로 증폭하여 유전자형에 특이한 올리고뉴크레오티드 프로브가 붙어있는 필터와 교잡반응을 시키는 것이다. 이것은 프로브의 종류에 따라 정확한 결과를 얻을 수 있으나 필터를 사용함에 따라서 많은 수의 프로브를 찍는데 한계가 있으며, 하나의 필터에서 한명만을 분석해야 하기 때문에 많은 검체를 처리하고 분석하는데 있어 시간과 노동력이 많이 소모가 된다.
본 발명은 상기한 방법의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 C형 간염바이러스 유전자형을 분석하기 위한 발전된 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 조성물을 이용하여 발전된 HCV 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다.
도 1은 C형 간염 바이러스 (HCV) 올리고뉴크레오티드 칩의 전체 슬라이드 형태에 대한 사진이다. 즉, 하나의 슬라이드에서 4명의 HCV 유전자형을 동시에 분석하기 위해 표시된 숫자와 같이 4개의 방으로 구성되어 있다. 이 슬라이드 위에 표 5에 나타낸 것과 같이 HCV 유전자형을 구분하는12개의 프로브를 2중으로 찍었으며, 양성 및 음성 컨트롤로 사용되는 2개 프로브는 4중으로 하여 총 32개의 프로브를 찍었다. 그리고 이 위에 coverwell perfusion chamber(Sigma Cat# Z37916-6, USA)를 붙여서 HCV 올리고뉴크레오티드 칩을 제작한 것이다.
도 2는 HCV 올리고뉴크레오티드 칩의 HCV 1b type에 관한 발색 반응 결과 사진으로, 도 1과 같은 슬라이드 형태의 4개의 방 중에서 하나의 방에서 일어난 반응을 이미지 확대하여 놓은 것이다. 이 사진은 한국인에게 가장 많이 발생하는 HCV 1b type으로 14개의 probe 중에서 표 5의 "반응 HCV형"에 표시된 것과 같이 프로브 1번과 2번에 동시에 반응이 일어난 것이다. 또한 프로브 13번은 양성(Positive) 컨트롤로서 모든 반응에 나타나게 하고, 프로브 14번은 음성(Negative) 컨트롤로서 모든 반응에서 나타나지 않게 함으로써 실험의 정확성을 확인하게 된다. 그리고각각 2개의 같은 점이 나타나게 한 것은 정확성을 기하기 위하여 같은 프로브를 2개씩 찍어 놓은 것이며, 프로브 13번과 14번은 음양성 컨트롤 및 위치 확인을 위하여 맨 위와 아래에 각각 2개씩 2번을 찍어 놓았다.
도 3은 HCV 올리고뉴크레오티드 칩의 HCV 1b type에 관한 형광 반응 결과 사진으로서 프로브와의 반응은 도 2와 동일하다. 차이점은 PCR과 하이브리다이제인션 반응 시에 형광용 프라이머 및 프로브를 사용하였고, 결과 해석 시에 Scanner (GenePiX4000, Axon instruments, U.S.A.)를 사용하여 형광을 나타내는 HCV 유전자형을 분석한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열정보 1에서 14까지의 염기서열을 포함하고 있는 복수의 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 각 올리고뉴크레오티드 프로브는 HCV 유전자형 결정을 위한 프로브이고, 상기의 올리고뉴크레오티드 프로브는 기질에 고정화되어 있는 것을 특징으로 한다.
또, 본 발명은 상기의 프로브와 타겟 유전자와의 결합을 검출하는데 사용되는 서열정보 15에서 20에 기재된 일차 또는 이차 프라이머 서열을 제공한다.
상기의 이차 프라이머 중 서열정보 18의 앤티센스 프라이머는 바이오틴이 부착된 것을 특징으로 하고, 상기의 이차 프라이머 중 서열정보 19의 앤티센스 프라이머는 형광용 프로브인 서열정보 20과 상호 작용하는 것을 특징으로 하며, 상기의 형광용 프로브는 바람직하게는 시아닌이 부착된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 혈장 및 혈청으로부터 HCV RNA를 추출하는 단계, 추출한 RNA를 이용하여 RT-1차 PCR을 실시하는 단계, 상기 1차 PCR 후 2차 비대칭 PCR을실시하는 단계, 상기의 2차 비대칭 PCR 부산물과 프로브를 결합시키는 단계 및 상기의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 HCV 유전자형 분석방법을 제공한다.
상기의 확인단계는 바이오틴과 결합하는 Streptavidin-Alkaline phosphatase 및 Nitroblue tetrazolium chloride/5-Bromo-4-chloro-3- indolyl-phosphate (NBT/BCIP)를 사용하여 확인하거나, 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 확인하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 최근에 개발된 DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 하나의 슬라이드 위에서 4명의 검체를 동시에 분석할 수 있는 HCV 올리고뉴크레오티드 칩을 개발하였다. 이는 기존에 개발한 올리고뉴크레오티드 칩을 더욱 향상시킨 것이다. 즉, HCV 유전자형을 결정하기 위하여 HCV 5'UTR에서 6개 형과 11개의 아형 및 53개 종에 특이적으로 반응할 수 있는 14개의 올리고뉴크레오티드를 제작하였으며, 이를 하나의 알데히드 글라스 슬라이드 위에 4개 세트로 집적하였다. RT-PCR 법을 사용하여 증폭시킨 HCV 유전자를 PCR 부산물과 슬라이드에 집적시킨 올리고뉴크레오티드 프로브와 교잡반응을 시켰다. 이를 발색반응법이나 형광반응법을 이용하여 반응이 나타난 프로브를 분석하여 HCV에 대한 6개의 유전자형과 11개의 유전자 아형을 구분하였다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 1: HCV 프라이머의 합성 및 염기서열
RT-PCR에 사용한 HCV PCR 프라이머는 표 1에 나타난 것과 같은 5'UTR에서 6개 형에 공통적으로 반응 할 수가 있는 부위를 분석하여 사용하였다.
2차 비대칭 PCR에 사용하는 앤티센스 프라이머는 확인 방법에 따라서 두 개로 나누었다. 첫째, 교잡반응을 시켜 발색반응으로 확인을 하기 위한 것으로는 바이오틴을 붙였다. 둘째, 교잡반응을 시켜 형광반응으로 확인하기 위한 것으로는 시아인을 사용하였다. 인위적으로 2차 PCR용 앤티센스 프라이머의 5' 끝에 25 bp 염기 (SP6)를 추가하여 합성하였고, 이 부위와 상보적인 시아닌과 결합된 염기를 합성하였다. 여기서 사용한 프라이머는 Molecular cloning 3판 (Sambrook과 Rusell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 oligonucleotide 합성과 같은 방법을 사용하여 독일의 MWG-biotech 사에 의뢰하여 합성하였다.
표 1. HCV 유전자형 분석을 위한 프라이머 염기 서열
프라이머 염기 서열 (HCV 5'UTR) 비고
일차 센스(서열정보 15) CTGTG AGGAA CTACT GTCTT PCR크기268bp
안티센스(서열정보 16) ACTCG CAAGC ACCCT ATCAGG
이차 센스(서열정보 17) TTCAC GCAGA AAGCG TCTAG PCR크기236bp
안티센스 발색반응법 Biotin-TATCA GGCAG TACCACAAGG(서열정보 18)
형광반응법 CGATT TAGGT GACAC TATAGGGAGG TATCA GGCAG TACCACAAGG(서열정보 19) PCR크기261bp
Cyanin-CCTTG TGGTA CTGCC TGATA CCTCC CTATA GTGTC(서열정보 20) 형광용프로브
실시예 2: HCV RNA의 추출, 역전사-일차 PCR 및 이차 PCR 반응
1) HCV RNA 추출 버퍼(1 ml 중 DEPC-DW 860 ul, Taq 10X buffer 100 ul, 1M DTT 20 ul, 10% NP40 20 ul) 5 ul와 혈장 또는 혈청 10 ul를 잘 섞었다.
2) PCR 기기의 온도를 92℃로 맞추어 놓은 상태에서 혼합된 혈청이 들어있는 튜브를 꽂아 2분간 가열한 후에 준비된 얼음에 바로 꽂았다.
3) 5-10초간 원심분리시켜 놓았다.
4) 표 2와 같은 방법으로 역전사 반응 및 일차 PCR 반응을 GeneAmp PCR system 9600 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에서 연속적으로 시행하였다.
5) 일차 PCR 산물 2 ul를 사용하여 표 3과 같은 방법으로 2차 비대칭 PCR 반응을 시행하였다.
6) 2차 비대칭 PCR이 끝난 산물 5 ul에 젤 로딩 버퍼(0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll 400) 1 ul를 넣고 1 ㎍/ml ethidium bromide (EtBr)가 함유된 2% 아가로스 젤에서 전기영동한 후 UV transilluminator가 부착된 Image analyzer (Vilber Lourmat, France)에서 236 bp 또는 261 bp의 밴드를 확인하였다.
표 2. HCV 역전사 및 일차 PCR 반응 조건
반응 조성물 조건 반응 온도 조건
DW 16.8 57℃, 3.0 분42℃, 45.0 분95℃, 3.0 분 1 회
10X buffer 3.0
2mM dNTP 1.5
10pmol 1차 프라이머 1.5
100mM DTT 1.5 94℃, 1.0 분52℃, 1.0 분72℃, 1.0 분 30 회
100U AMV RT 0.3
40U RNasin 0.3
5U Taq 0.1
HCV 핵산 추출물 5.0
합계 30 ul 72℃, 5.0 min 1 회
표 3. HCV 이차 PCR 반응 조건
반응 조성물 조건 반응 온도 조건
멸균 증류수 12.9 95℃, 3.0 분 1 회
10X buffer 2.0
2mM dNTP 1.0 94℃, 1.0 분53℃, 1.0 분72℃, 1.0 분 25 회
1pmol 2차 센스프라이머 1.0
10pmol 2차 앤티센스 프라이머 1.0
5U Taq 0.1
일차 PCR 산물 2.0
합계 20 ul 72℃, 5.0 분 1 회
실시예 3: HCV 올리고뉴크레오티드 칩 제작을 위한 프로브 합성 및 염기서열
알데히드 글라스 위에 공유결합을 시키기 위하여 모든 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 붙이고 교잡 반응시 반응을 용이하게 하기 위하여 10-20개의 올리고(dT)를 부착한 다음 표 5와 같은 염기서열을 붙여 합성하였다. 즉, "Amino link-Oligo(dT)10-20-프로브 염기서열"의 순서로 하여 독일의 MWG-biotech 사에 의뢰하여 합성하였다. 이때 결정한 HCV 유전자형의 염기서열은 표 4에서 나타낸 것 같이 6개 형의 총 53종의 HCV 유전자를 분석하여 결정하였다.
표 4. 분석한 HCV 유전자형 및 종류
HCV 형 HCV 종류
1a HCV-1(M62321), HCV-H(M67463), HC-J1(D10749), GM1(M61728), GM2(M61719), H90(M62382), US9(L38353), H77 (AF009606), H99, PT-1
1b HCV-J(D90208), HCV-BK(M58335), HCV-JK1(X61596), HCV-China (L02836), HCV-T(M84754), HCV-JT(D11168), HCV-J4/83(D13558), HCV-J4/91 (D10750), HCV-JT(D11355), HCV-N(S62220), HCV-C2(D10934), HCV-L2(U01214), CON1(AJ238799), NC1(L02836), FR3(L38351) HCV-K1-S1(D50483), HCV-K1-R1(D50480), HCV-TA
1c HC-G9(D14853)
2a HC-J6 (D00944), K2A(D12507), Eb-9, FR5(L38334)
2b HC-J8(D01221), MA(AB030907)), K2B-1(D12509)
2c BE136(L38322)
3a NZL1(D17763), HCV-K3a(D28917), Eb-1(D10123), CB(AF046866)
3b HCV-Tr(D26556), TR-KJ(D49374)
4a GB358(L29608), ED43(Y11604), Z4(M84848), ED43(Y11604)
5a BE96(L29585), EUH1480(Y13184), BE95(L29581)
6a QC26(U33431), HK2(D43679), EUHK2(Y12083), HK
표 5에서 나타낸 염기서열에서 중앙에 대문자로 표기된 염기서열이 가장 중요 부분으로 이를 중심으로 하여 약 15 bp에서 25 bp의 크기로 하여 62℃를 전후하여 Tm 값을 설정하여 합성하였다.
표 5. HCV 유전자형 결정을 위한 프로브 염기서열
프로브 이름 염 기 서 열 반응 HCV 형
HCV 01(서열정보 1) gaattgccaggaCgaccgggtcctt 1a, 1b, 1c
HCV 02(서열정보 2) gcccccgcGagactgct 1b, 4a(Z4), 5a
HCV 03(서열정보 3) cctttcttggatTaacccgctcaat 1c, 4a(ED43), 5a(BE95)
HCV 04(서열정보 4) ttggataaacccActctatgcccgg 2a, 2c
HCV 05(서열정보 5) aattgccgggaAgactgggtcct 2a
HCV 06(서열정보 6) acccactctatgTccggtcatttgg 2b
HCV 07(서열정보 7) ctctatgcccAgccatttggg 2c
HCV 08(서열정보 8) aatcgctgggGtgaccgggtc 3a
HCV 09(서열정보 9) cccgcgagatCactagccgag 3a, 3b
HCV 10(서열정보 10) tagtatgagtgtTgtacagcctcca 4a
HCV 11(서열정보 11) gtatgagtgtcgAacagcctccagg 5a
HCV 12(서열정보 12) ccgggtcctttcCattggatcaaa 6a
HCV 13(서열정보 13) agtggtctgcggAaccggtgagtac 모든형에 반응(양성 컨트롤)
HCV 14(서열정보 14) ggtctgcggGaccggtgag 모든형에 무반응(음성 컨트롤)
실시예 4: HCV 올리고뉴크레오티드 칩의 제작
1) 올리고뉴크레오티드 칩을 제작하기 위하여 Telechem사의 슈퍼알데히드 글라스 슬라이드를 사용하였다. 100 pmole의 아미노기가 붙어있는 프로브와 동량의 DMSO와 잘 혼합하여 slide위에 찍고, 0.2% SDS로 5분 동안 2회 세척한 후, 증류수로 5분간 2회 세척하였다. 그리고 95℃로 가열된 증류수로 2분간 1회 세척한 후 실온에서 증류수로 1회 세척하였다.
2) 소디움 보로하이브리드(1.3g NaBH4, 375ml PBS, 125ml 100% EtOH)에 슬라이드를 5분간 반응시킨 다음, 0.2% SDS로 1분간 3회 세척하고 증류수로 1분간 1회 세척한 후 실온에서 건조시켰다.
3) 4개의 검체를 분리하여 반응시키도록 하기 위하여 Sigma사의 coverwell perfusion chamber (4 chambers)를 붙여서 각각을 분리시켰다. 이와 같이 완성된 HCV 올리고뉴크레오티드 칩은 사용 전 까지 실온의 암소에서 보관하였다.
실시예 5: HCV PCR 산물과의 결합 반응
1) 프리하이브리다이제인션 버퍼(1% BSA, 5X SSC, 0.1% SDS) 20-200ul를 올리고뉴크레오티드가 결합된 슬라이드 위에 넣고 42℃에서 30-60분간 반응시켰다. 증류수로 5회 세척하고, 이소프로판올로 린스한 후 실온에서 건조시키고, 80℃에서 2시간 동안 건조시켰다.
2) 발색반응법에서는 바이오틴으로 결합된 HCV PCR 산물을 95℃에서 3분간 변성시킨 다음 하이브리다이제이션 용액(4X SSC, 0.3% SDS)과 l:3의 비율로 혼합하였다. 형광반응법으로는 SP6가 결합된 HCV PCR 산물을 95℃에서 3분간 변성시킨 다음, Cyanin-프로브, 하이브리다이제이션 용액(6X SSC, 0.5% SDS)과 동량으로 혼합하였다.
3) 챔버를 덮은 채로 50-200ul의 하이브리다이제이션 버퍼를 슬라이드 위의 챔버에 채우고, 63℃에서 1-3시간 동안 반응시켰다.
4) 1X SSC, 0.2% SDS로 실온에서 5-10분간 세척하고 0.1X SSC, 0.2% SDS로 63℃에서 5-10간 세척하고 0.1X SSC로 5-10분간 세척한 후에 실온에서 건조시켰다.
5) 결과 확인
A. 발색반응법 (Biotin 법); Blocking buffer 30-120ul로 실온에서 30분간 반응시키고 30-120ul의 1/2,000으로 희석된 Streptavidin-Alkaline phosphatase와 30분 동안 반응시켰다. 1/50로 희석된 40-160ul의 Nitroblue tetrazolium chloride/5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (NBT/BCIP)로 실온의 암소에서 1 시간동안 반응 시킨 후에 조심스럽게 증류수로 세척하였다. 발색 반응이 나타난 것을 보고 HCV 유전자형을 분석하였다.
B. 형광반응법 (Cyanin 법); Scanner (GenePiX4000, Axon instruments, U.S.A.)를 사용하여 형광을 나타내는 HCV 유전자형을 분석하였다.
이와같이 HCV 유전자형을 분석하는데 HCV 5'UTR을 PCR로 증폭하고 형에 따라 다르게 나타나는 염기를 분석하는 방법을 사용하였다. 이 5'UTR에서 HCV 유전자형을 분석한 것은 5'UTR 내의 염기 변화가 특정 부위에 국한되어 있어 프라이머 선택에 용이하고 돌연변이나 새로운 형에 대하여도 RT-PCR을 시행할 수 있는 장점이 있다 (Okamoto et al.,Jpn. J. Exp. Med.60, 215-222, 1990). 또한 이곳에서의 결과가 core, NS3, 및 NS5의 결과와 같기 때문에 5'UTR을 주로 이용하고 있어 (Karachristos et al.,J. Med. Microbiol.42, 367-371, 1995), 본 발명에서도 5'UTR을 이용하여 HCV 유전자형을 분석하였다.
본 발명에서는 HCV 5'UTR의 유전자를 분석하여 유전자형을 진단하는 올리고뉴크레오티드 칩을 개발하였다. 이 HCV 올리고뉴크레오티드 칩은 기존의 칩이 가지고 있는 단점을 수정 보완하였다. 즉, 기존의 프로브 2개를 수정하고 2개를 추가함으로써 1c와 2c가 추가적으로 확인이 가능하게 되었으며 4a와 5a에서의 분석이 더욱 명확하게 되었다.
이를 이용한 HCV 유전자형의 분석은 HCV 감염의 확인, 감염 경로, 및 IFN-α의 치료 효과를 예측하는 등에 이용할 수가 있다. 또한 유전자형의 분포를 참고하여 지역과 민족에 가장 적합한 HCV 백신 개발에도 이용할 수가 있을 것이며, HCV와 관련된 만성 간염, 간경화, 및 간암을 연구하는데도 도움을 줄 수 있을 것이다.
<110> BIOCORE.CO.,LTD. <120> Oligonucleotide chip composition for analyzing Hepatitis C virus (HCV) genotype and detecting method thereof <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 1 gaattgccag gacgaccggg tcctt 25 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 2 gcccccgcga gactgct 17 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 3 cctttcttgg attaacccgc tcaat 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 4 ttggataaac ccactctatg cccgg 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 5 aattgccggg aagactgggt cct 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 6 acccactcta tgtccggtca tttgg 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 7 ctctatgccc agccatttgg g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 8 aatcgctggg gtgaccgggt c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 9 cccgcgagat cactagccga g 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 10 tagtatgagt gttgtacagc ctcca 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 11 gtatgagtgt cgaacagcct ccagg 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 12 ccgggtcctt tccattggat caaa 24 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 13 agtggtctgc ggaaccggtg agtac 25 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for analyzing HCV genetic type <400> 14 ggtctgcggg accggtgag 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing HCV genetic type <400> 15 ctgtgaggaa ctactgtctt 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing HCV genetic type <400> 16 actcgcaagc accctatcag g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing HCV genetic type <400> 17 ttcacgcaga aagcgtctag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing HCV genetic type <400> 18 tatcaggcag taccacaagg 20 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing HCV genetic type <400> 19 cgatttaggt gacactatag ggaggtatca ggcagtacca caagg 45 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for analyzing HCV genetic type <400> 20 ccttgtggta ctgcctgata cctccctata gtgtc 35

Claims (9)

  1. 서열정보 1 에서 14의 염기서열을 포함하고 있는 복수의 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기의 각 올리고뉴크레오티드 프로브는 HCV 유전자형 결정을 위한 프로브인 것을 특징으로 하는 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기의 올리고뉴크레오티드 프로브는 기질에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 올리고뉴크레오티드 프로브 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기의 프로브와 타겟 유전자와의 결합을 검출하는데 사용되는 서열정보 16또는 서열정보 18내지 20에 기재된 프라이머 서열 중 하나의 프라이머.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기의 이차 프라이머 중 서열정보 18의 앤티센스 프라이머는 바이오틴이 부착된 것을 특징으로 하는 프라이머 서열.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기의 이차 프라이머 중 서열정보 19의 앤티센스 프라이머는 형광용 프로브와 상호작용하는 것을 특징으로 하는 프라이머 서열.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기의 형광용 프로브인 서열정보 20은 시아닌이 부착된 것을 특징으로 하는 프라이머 서열.
  8. a) 혈장 및 혈청으로부터 HCV RNA를 추출하는 단계;
    b) 추출한 RNA를 이용하여 RT-1차 PCR을 실시하는 단계;
    c) 상기 1차 PCR 후 2차 비대칭 PCR을 실시하는 단계;
    d) 상기의 2차 비대칭 PCR 부산물과 제1항의 프로브를 결합시키는 단계; 및
    e) 상기의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 HCV 유전자형 분석방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기의 e)의 확인단계는 바이오틴과 결합하는 Avidin-AP 및 NBT/BCIP를 사용하여 확인하거나,, 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 HCV 유전자형 분석방법.
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