KR100869261B1

KR100869261B1 - Ｃ형 간염 바이러스(ｈｃｖ)를 효과적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 이의 이용 방법 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR100869261B1
Application number: KR1020000005409A
Authority: KR
Inventors: 린넨제프리엠; 고르만케빈엠
Original assignee: 오르토-클리니칼 다이아그노스틱스, 인코포레이티드
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2008-11-18
Also published as: EP1026262A2; KR100901086B1; ATE428003T1; CN1274757A; EP1026262A3; CA2296144A1; AU1487900A; CA2296144C; KR20000076603A; KR20080014130A; NO329925B1; ES2322752T3; PT1026262E; NO20000536L; KR20070052723A; JP2000279200A; KR20080014129A; JP5450914B2; KR100898711B1; CN1827780A

Abstract

본원에는 사람 피검자로부터 수득된 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스 RNA을 검출하는 방법 및 이를 위한 키트가 기재되어 있다. 본 발명은 C형 간염 바이러스 RNA로부터 유래된, DNA의 증폭에 유용한 신규의 증폭용 프라이머 및 프로브; 및 이러한 신규의 프라이머를 포함하는 키트 및 방법을 포함한다.

C형 간염 바이러스, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오타이드, 전기영동, 비색정량 분석법, HCV 핵산 증폭 키트

Description

Ｃ형 간염 바이러스(ＨＣＶ)를 효과적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 이의 이용 방법 및 이를 포함하는 키트{Oligonucleotide primers for efficient detection of hepatitis C virus(HCV), methods of use thereof, and kits comprising them}

본 발명은 생물학적 샘플 중에서 핵산 서열, 특히 감염성 미생물로부터 유도된 서열을 검출하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(HCV)는 대다수의 수혈-후 간염 사례와 전세계적으로 산발적인(또는 집단으로 획득된) 간염 사례의 상당 부분의 원인이 되는, 비경구적으로 전염되는 바이러스이다. 전세계 인구의 1% 이상이 HCV에 감염된 것으로 추정된다. HCV 감염은 급성 간염, 만성 간염, 간경변 및 간세포 암종과 연관이 있다.

HCV는 플라비비리대(Flaviviridae) 과의 별도의 속인 헤파시바이러스 (Hepacivirus)로서 현재 분류된다. 이의 게놈은 약 3,000개 아미노산의 폴리단백질 전구체를 암호화하는 단일의 큰 개방 판독 프레임(ORF)을 갖는 약 9,500개 뉴클레오타이드의 +-쇄형 RNA 분자로 이루어진다. 이와 같이 큰 ORF의 앞에는, 상기 게놈의 가장 고도로 보존된 영역인, 약 340개 뉴클레오타이드의 5' 비-암호화 영역(NCR)이 존재한다. 이러한 ORF의 5' 영역은 (5' 방향에서 3' 방향으로) 캡시드 단백질, 두개의 외막 당단백질(E1 및 E2), 및 공지되지 않은 기능의 작은 단백질(P7)을 암호화한다. 상기 ORF의 3' 영역은 프로테아제, 프로테아제/헬리카제 이-작용성 단백질, RNA 폴리머라제 및 조절성 펩타이드를 포함하는 비-구조 단백질을 암호화한다. 이러한 3' 영역은 또한 NCR를 포함한다.

전세계적으로 HCV 암호화 서열을 분석한 결과, 개개인의 바이러스 분리물 간에는 상당한 서열 변이가 존재하는 것으로 나타났다. 추가로, 개개 환자로부터의 HCV 서열을 분석한 결과, 상기 바이러스는 동일하지는 않지만 관련된 서열을 함유하는 소위 "유사(quasi)-종"으로서 순환되는 것으로 밝혀졌다. 상기 분리물과 개개 환자들 간에 존재하는 변이는 바이러스적으로 암호화된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 정확도(fidelity)가 낮기 때문인 것으로 여겨진다. HCV의 유전적 변이 정도는 감염을 예방, 진단 및 억제하는데 중요한 영향을 미친다.

HCV 감염의 혈청 진단은 전형적으로, 재조합 HCV 단백질 또는 펩타이드와 결합되는 항체를 검출하는 시판용 효소 면역 분석법(EIA)에 의해 결정한다. 포지티브 EIA 결과는 재조합 면역블롯 분석법(RIBA)에 의해 확인할 수 있는데, 어떠한 EIA 분석법이나 RIBA 분석법도 과거에 있었던 감염과 현재의 감염을 구별하지 못한다. 이러한 순환성 바이러스의 전형적인 낮은 역가로 인해, 바이러스 단백질을 직접적으로 분석하는 방법이 성공적으로 개발되지 못하였다. 더욱이, 항체를 이용한 분석법은 통상 감염 2 내지 3개월 후까지는 HCV 바이러스 감염을 검출하지 못한다.

따라서, 당해 분야에서는, 특정 환자가 HCV에 최초 감염된지 수 일 이내에 HCV 바이러스혈증을 검출하기에 충분하게 민감한, HCV에 대한 개선된 분석법이 요망된다.

따라서, 제1 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스(HCV) RNA의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(A) 상기 샘플로부터 유래된 RNA를 주형으로서 이용하여 역전사 반응을 수행함으로써, HCV-특이적 역전사 생성물을 생성시키는 단계;

(B) HCV에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 사용하여 상기 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 각각의 프라이머 쌍은

(a) (ⅰ) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

(ⅱ) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 및

(ⅲ) 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'(C143F26) <서열 3>으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 정방향 프라이머; 및

(b) (ⅰ) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>,

(ⅱ) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>,

(ⅲ) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 및

(ⅳ) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25) <서열 7>로 이루어진 그룹 중에서 선택된 역방향 프라이머를 포함한다]; 및

(C) 상기 증폭 생성물을 검출하는 단계(여기서, 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA가 존재한다는 것을 나타낸다)를 포함한다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV) DNA를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(A) HCV에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 사용하여 HCV DNA를 함유하는 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 각각의 프라이머 쌍은

(a) (ⅰ) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

(ⅱ) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 및

(b) (ⅰ) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>,

(ⅱ) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>,

(ⅲ) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 및

(ⅳ) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25) <서열 7>로 이루어진 그룹 중에서 선택된 역방향 프라이머를 포함한다]를 포함한다.

제3 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스(HCV) RNA의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(B) 하나의 정방향 프라이머와 하나의 역방향 프라이머를 사용하여 상기 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 정방향 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어지고 역방향 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진다]; 및

제4 양태에 있어서, 본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV) DNA를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(A) 하나의 정방향 프라이머와 하나의 역방향 프라이머를 사용하여 HCV DNA를 함유하는 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 정방향 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어지고 역방향 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진다]를 포함한다.

제5 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스 (HCV) RNA의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(A) 상기 샘플로부터 유래된 RNA를 주형으로서 이용하여 역전사 반응을 수행하여, HCV-특이적 역전사 생성물을 생성시키는 단계;

(B) HCV에 특이적인 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상과 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 사용하여 상기 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 각각의 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은

(a) (ⅰ) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

(ⅱ) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 및

(b) (ⅰ) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>,

(ⅱ) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>,

(ⅲ) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 및

(ⅳ) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25) <서열 7>로 이루어진 그룹 중에서 선택된 역방향 프라이머를 포함하고,

각각의 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함한다]; 및

제6 양태에 있어서, 본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV) DNA를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(A) HCV에 특이적인 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상과 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 사용하여 HCV DNA를 함유하는 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 각각의 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은

(a) (ⅰ) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

(ⅱ) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 및

(b) (ⅰ) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>,

(ⅱ) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>,

(ⅲ) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 및

각각의 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함한다]를 포함한다.

이러한 방법의 몇몇 양태에서는, 역전사 반응이 수행되는 경우, 이러한 역전사 반응을 랜덤 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행하며; 또 다른 한편으로는, 하나 이상의 HCV-특이적 역전사 프라이머, 즉 HCV RNA 내의 서열에 상응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다. 증폭 검출 방법에는 (a) 전기영동 및 (b) HCV-특이적 프로브가 부착된 고체 지지체 상에 증폭 생성물을 포획시킨 다음 비색정량 분석법을 사용하여 결합된 생성물을 정량화하는 방법이 포함되는데, 이에 제한되지는 않는다.

추가의 양태에 있어서, 본 발명은 HCV RNA로부터 유래된 HCV DNA를 증폭시키기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 포함하며, 각각의 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은

(a) (ⅰ) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

(ⅱ) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 및

(b) (ⅰ) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>,

(ⅱ) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>,

(ⅲ) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 및

(ⅳ) 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25) <서열 7>로 이루어진 그룹 중에서 선택된 역방향 프라이머를 포함한다.

추가의 양태에 있어서, 본 발명은 HCV RNA로부터 유래된 HCV cDNA를 증폭시키기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 포함하며, 각각의 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함한다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 HCV DNA의 존재를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 포함하며, 각각의 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은

(a) (ⅰ) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

(ⅱ) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 및

(b) (ⅰ) 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>,

(ⅱ) 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>,

(ⅲ) 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 및

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 HCV RNA의 존재를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상을 포함하며, 각각의 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프 라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함한다.

본 발명자들은 생물학적 샘플 중에서의 C형 간염 바이러스(HCV) RNA의 검출이, HCV RNA에 존재하는 특정 서열에 대해 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 증폭용 프라이머로서 사용하는 경우에 보다 효과적이라는 사실을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 낮은 복사체 수준의 HCV RNA를 검출하는, 개선된 1회전의 역전사/증폭 분석법을 제공한다. 서열 보존도, 분자내 및 분자간 상호작용, 및 앰플리콘 서열과 주변 서열의 예상된 2차 구조를 이론적으로 고려하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 선별한다. 추가로, HCV 게놈의 다수의 영역, 다수의 바이러스 종 및 내부 포지티브 대조군(internal positive control; IPC) RNA(또는 DNA)를 공-증폭(및 공-검출)시키도록 상기 프라이머와 분석 시스템을 고안한다. HCV 게놈의 다수의 영역을 동시에 증폭/검출시키면, 분석 민감도가 증가되고 IPC를 공-증폭시키면, PCR 억제로 인한 위-네가티브 결과가 생길 가능성이 감소된다.

예를 들면, 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Volumes Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, 1997(F.M., Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes Ⅰ and Ⅱ, 1985(D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984(Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); and Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition(Springer-Verlag, N.Y.)]에 기재된 바와 같은, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 단백질 생화학 분야의 많은 기술이 본 발명의 실시에 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같은 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 퓨린- 및 피리미딘-함유 중합체, 즉 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 이는 일본쇄 및 이본쇄 분자, 예를 들면, DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드 뿐만 아니라 염기를 아미노산 골격에 접합시킴으로써 형성된 "단백질 핵산"(PNA)을 포함한다. 이는 또한, 변형된 염기를 함유하는 핵산을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 핵산 서열의 "상보체"는 본래의 서열과 왓트슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 형성에 참여하는 안티센스(antisense) 서열을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "프라이머"는 관심있는 일본쇄 핵산 서열과 이중체를 형성하고 예를 들면, 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제를 사용한 상보적 쇄의 중합을 가능하게 하는, 길이가 약 10 내지 약 50개인 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 12 내지 약 25개인 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 12 내지 약 18개인 뉴클레오타이드인 분리된 올리고뉴클레오타이드이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "분리된" 핵산은 이의 본래의 환경으로부터 제거되는 성분(예를 들면, 성분이 천연 성분인 경우에는 이의 천연의 환경으로부터 제거된 성분이고 합성 성분인 경우에는 반응 혼합물로부터 제거된 성분이다)을 지칭한다. 분리된 핵산은 전형적으로, 본래부터 연합된 성분을 약 50% 미만, 바람직하게는 약 75% 미만, 가장 바람직하게는 약 90% 미만으로 함유한다.

지정된 서열로부터 "유도되는" 핵산 서열은 이러한 지정된 서열의 일정 영역에 상응하는 서열을 지칭한다. 이는 지정된 서열과 상동이거나 이에 상보적인 서열을 포함한다.

내부 포지티브 대조군(IPC) 표적 핵산은 전형적으로, 제한 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 후속적으로 선형화되는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된 합성 핵산 서열을 지칭한다. IPC는 전형적으로, 전체적인 프로브-결합 영역을 둘러 싸고 있는 다수의 프라이머 결합 서열을 가지며, 핵산 증폭 반응에서 위-네가티브 결과(false negative result)에 대한 전체적인 대조군으로서 작용할 것이다.

바람직한 내부 포지티브 대조군 표적 DNA의 서열은

5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATC CACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3' <서열 10>이다.

본원에 기재된 서열 또는 이의 서브 서열을 포함하는 핵산은 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185]의 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 문헌[참조: Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078]의 방법을 사용하거나, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. PNA도 또한 용어 "핵산"에 포함된다. 이러한 핵산은 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미데이트 연결체를 형성함으로써 유도체화할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 증폭은 핵산을 복사시키는 반복적 과정을 지칭한다. 적합한 증폭 방법으로는 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 쇄 치환 증폭(strand displacement amplification), 전사 중재된 증폭 및 핵산 단일 염기 치환 방법이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 생물학적 샘플 중에서 HCV를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은

(i) 상기 샘플 내에 함유되거나 이로부터 유래된 RNA를 주형으로서 이용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;

(ii) HCV RNA의 5' 또는 3' 비-암호화 영역 내의 서열에 상응하는 서열을 갖는 증폭용 프라이머 쌍을 사용하여 상기 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계; 및

(iii) 상기 HCV-특이적 증폭 생성물을 검출하는 단계에 의해 수행된다.

HCV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA가 존재한다는 것을 나타낸다.

본 발명에 따르면, 생물학적 샘플은 통상적인 모든 수단에 의해 환자로부터 수득된 것이다. 적합한 생물학적 샘플로는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 유즙 및 뇌척수액이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 혈장이 HCV RNA의 공급원으로서 사용된다.

이러한 생물학적 샘플은, 역전사 시약이 이 샘플 내에 함유된 RNA, 특정하게는 HCV RNA에 접근하도록 해주는 모든 방식으로 처리할 수 있다. 생물학적 샘플로부터 "유래된" RNA는 샘플 내에 본래 존재하고 샘플을 처리함으로써 접근이 허용된 모든 RNA일 수 있다. 바람직하게는, RNA를 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들면, 구아니디늄 티오시아네이트를 이용하거나 시판용 시약 및 방법, 예를 들면, 젠트라 시스템즈, 인코포레이티드(Gentra Systems, Inc.; Minneapolis MN)로부터의 퓨어스크립트(PureScript) 방법을 사용하여 상기 샘플로부터 추출한다. RNAase, 기타 단백질 및/또는 역전사를 방해할 수도 있는 임의의 기타 성분으로부터 RNA를 분리시켜 주는 모든 추출 과정을 사용할 수 있다.

이어서, 상기 샘플을 (a) 랜덤 헥사머 프라이머(Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey로부터 수득 가능함) 등의 랜덤 프라이머 및/또는 (b) HCV RNA 게놈 서열의 5' 또는 3' NCR로부터 유래된 프라이머를 사용하여 역전사시킨다. 역전사는 통상적인 과정, 예를 들면, 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Volumes Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, 1997(F.M., Ausubel ed.); 미국 특허 제5,322,770호; Young et al., J. Clin. Microbiol. 31(4):882(1993); Myers et al., Biochemistry 30(3):7661(1991)]에 기재된 바와 같은 과정을 이용하여 수행한다. 역전사 프라이머로서 사용하기에 적합한 기타 프라이머 및 본 발명에서 사용할 수 있는 역전사 방법으로는 현재 계류중인 미국 특허원 제09/118,520호(대리인 등록 번호 2904/0E287)에 기재된 방법이 있다.

역전사 반응을 수행한 후, 상기 생성물을 증폭시킨다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응, 쇄 치환 반응, 핵산 단일 염기 증폭 및 전사 중재된 증폭 방법을 포함하긴 하지만, 이에 제한되지는 않는 임의의 증폭 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, PCR을 사용한다. 전형적으로, PCR에 필요한 성분 모두를 함유하는 반응 혼합물을 역전사 반응 혼합물에 직접적으로 가한다. 이어서, 사용되는 프라이머 쌍에 의해 특정화된 조건을 이용하여 증폭을 수행한다.

본 발명자들은 특정 쌍의 HCV-특이적 증폭 프라이머가 환자 샘플에서 HCV RNA를 검출하는데 특히 유리하다는 사실을 밝혀내었다. HCV 게놈의 5' NCR로부터 유래된 유용한 프라이머의 비-제한적인 예를 다음 표 1에 나타낸다.

프라이머	서열	위치	S^*	SIN^**
C69f28	5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'	69-96	S	1
C131F25	5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'	131-155	S	2
C143R26	5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'	143-168	S	3
C133F26	5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'	133-158	AS	4
C282R26	5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'	282-308	AS	5
C287R27	5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'	287-313	AS	6
C294R25	5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'	294-318	AS	7
* 쇄 배향 : S = 센스; AS = 안티센스; ** 서열 번호

센스 올리고뉴클레오타이드와 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 어떠한 조합이라도 정방향 및 역방향 증폭 프라이머로서 각각 사용될 수 있다. 증폭에 사용하기에 바람직한 5' NCR 프라이머 쌍에는

(a) 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' <서열 1>과

5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' <서열 4>; 및

(b) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' <서열 2>와

5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' <서열 7>이 포함된다.

하나의 바람직한 양태에서는, 증폭용 프라이머 쌍은 5'-CAGAAAGCGTC TAGCCATGGCGTTAGTA-3' <서열 1>과 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' <서열 4>로 이루어진다. 또 다른 바람직한 양태에서는, 증폭용 프라이머 쌍은 5'-GGGAGAGCCA TAGTGGTCTGCGGAA-3' <서열 2>와 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' <서열 7>로 이루어진다.

HCV 게놈의 3' NCR로부터 유래된 유용한 프라이머의 비-제한적인 예에는 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머가 포함된다.

본 발명은 또한, 다중 증폭 반응, 즉 동일한 반응 혼합물에서 프라이머의 상이한 세트를 이용하여 상이한 서열들을 동시에 증폭시키는 반응을 포함한다. 다중 증폭 반응에 동시에 사용될 수 있는 바람직한 프라이머 쌍 세트는

(a) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' <서열 2>와

5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' <서열 7>(5' 쌍); 및

(b) 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' <서열 8>과

5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' <서열 9>(3' 쌍)이다.

증폭 반응을 수행한 후, 증폭된 생성물을 아가로즈 또는 아크릴아미드 중에서의 겔 전기영동; 슈어셀(SureCell) 시스템(예를 들면, 다음 실시예 1 참조) 등의 비-동위원소성 비색정량 검출법; ECi 검출법; 형광 및 화학 발광법을 포함하긴 하지만 이에 제한되지는 않는, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 검출 방법에 유용한 시약은 제조원[예를 들면, Molecular Probes, Eugene, Oregon and Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY]으로부터 시판중이다.

HCV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA가 존재한다는 것을 나타낸다. 겔 전기영동을 이용하는 경우에는, 상기 반응에 사용된 증폭용 프라이머에 상응하는 서열의 HCV RNA 내의 위치에 의해 예상되는 바와 같이, HCV-특이적 증폭 생성물을 이들의 크기로써 확인한다. 비색정량 검출에 유용한 HCV-특이적 5' NCR 포획 프로브로는 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3' <서열 11>, 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' <서열 12> 및 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' <서열 13>이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 유용한 HCV-특이적 3' NCR 포획 프로브로는 5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' <서열 14> 및 5'-ATGCGGCTCACGGAC CTTTCACAGC-3' <서열 15>가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

정방향 및 역방향 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상[여기서, 정방향 프라이머는 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>, 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25) <서열 2> 또는 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGT GAGTACAC-3'(C143F26) <서열 3>일 수 있고, 역방향 프라이머는 5'-CGGTTCCGCAGACC ACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>, 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(C282R27) <서열 5>, 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'(C287R27) <서열 6> 또는 5'-CGGGG CACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25) <서열 7>일 수 있다]을 함유하는, HCV RNA로부터 유래된 HCV DNA를 증폭시키기 위한 키트를 제조할 수 있다.

정방향 및 역방향 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍 하나 이상[여기서, 정방향 프라이머는 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>일 수 있고 역방향 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>일 수 있다]을 함유하는, HCV RNA로부터 유래된 HCV DNA를 증폭시키기 위한 키트를 제조할 수 있다.

HCV RNA로부터 유래된 HCV DNA의 증폭을 위해 상기 언급된 5' 및 3' NCR 프라이머를 포함하는, HCV DNA의 존재를 검출하기 위한 키트도 또한 본 발명의 범주 내에 속한다.

이러한 키트는 역전사, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 역전사효소, 데옥시뉴클레오타이드, DNA 증폭 반응에 적합한 열안정성 폴리머라제, 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 함유할 수 있다.

본 발명은 환자에게서 HCV 감염을 진단하고; 항-HCV 치료 섭생의 효능을 시험하며; HCV-감염된 샘플에 대한 혈액 공급물을 스크리닝하는데 사용된다.

바람직한 양태에 대한 기술

다음 실시예는 본 발명을 제한하지 않고 예시하는 것이다.

실시예 1

생물학적 샘플에서의 HCV의 검출: 5' HCV 증폭용 프라이머와 로쉬 앰플리커(Roche Amplicor) HCV 분석법의 비교

다음 실험을 수행하여 본 발명의 HCV 분석법과 로쉬 앰플리커 시스템을 비교한다.

A. 방법

1. 샘플 제조:

퓨어스크립트 RNA 분리 시약(Genta Systems, Minneapolis MN)을 사용하여 혈장 샘플로부터 RNA를 제조한다. 체액에 대한 제조업자의 프로토콜에 대한 변형에는 바이러스성 RNA의 침전을 보조하기 위한 담체로서 20㎍이 아닌 40㎍의 글리코겐을 사용하는 것이 포함된다. 부가적으로, 대부분의 경우에는, RNA를 이소프로필 알콜 침전시키고 이러한 RNA 펠렛을 에탄올로 세척한 후, RNA 펠렛을 제조업자에 의해 제공된 RNA 수화 용액에서가 아니라 RT 완충액 혼합물에 재현탁시킨다.

2. 역전사:

50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM DTT, 각 dNTP(Pharmacia Biotech) 0.4mM, 4μM 랜덤 헥사머(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 또는 특이적 역전사 프라이머의 50㎕ 용액 중의 100U 재조합 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소(RT)(Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland), 및 디에틸피로카보네이트(DEPC)-처리된 수 중의 20단위 RNasin(Promega, Madison, Wisconsin)을 가함으로써, RNA로부터의 cDNA의 합성을 촉매시킨다. 42℃에서 30분 동안 항온 처리한 후, 상기 RT 반응물을 100℃에서 5분 동안 유지하여 RT 활성을 파괴시킨다. 각 반응물을 1분 동안 냉각시킨 다음, 16000 x g로 4초 동안 미량원심분리시킨다.

3. PCR 증폭:

PCR을 25mM 트리스-HCl, 3mM MgCl₂, 0.725mM EDTA, 54mM KCl, 3.72mM NaCl, 40μM DTT, 108㎍/ml 젤라틴(유형 Ⅳ), 9.5% 글리세롤, 0.02% 트윈 20, 0.02% NP40, 송아지 흉선 DNA(2㎍), 각 dNTP 1.2mM, 각 프라이머 0.4μM, 선형화된 내부 포지티브 대조군(IPC) 플라스미드 DNA 10개 복사체, 및 Taq 폴리머라제 16U의 100㎕ 용액 중에서 PE9600 더머사이클러(thermocycler; Perkin-Elmer)로 수행한다. Taq, TP1-12 및 TP4-9에 대한 모노클로날 항체(이의 제조는 미국 특허 제5,338,671호에 기재되어 있다)를 상기 반응물에 각각 50:1 및 5:1 몰 비로 가하여, 항체 대 Taq 폴리머라제의 55:1 몰 비를 제공한다. 96℃에서 3분 동안 초기 변성시킨 후, 96℃에서 5초 동안 및 68℃에서 40초 동안 40 사이클의 증폭을 수행한다. 사이클이 끝날 무렵, 후-가열 단계를 103℃에서 5분 동안 수행하여 Taq 폴리머라제를 불활성화시킨다. 사용된 프라이머를 다음 표 2에 나타낸다.

프라이머	서열	위치	S^*	SIN^**
C69f28	5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'	69-96	S	1
C131F25	5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'	131-155	S	2
C143F26	5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'	143-168	S	3
C133R26	5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'	133-158	AS	4
C282R26	5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'	282-308	AS	5
C287R27	5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3'	287-313	AS	6
C294R25	5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'	294-318	AS	7
* 쇄 배향 : S = 센스; AS = 안티센스; ** 서열 번호

예상되는 생성물 크기를 다음 표 3에 나타낸다.

정방향	역방향	생성물 크기(bp)
C69F28	C133R26	90
C131F25	C294R25	188
C143F26	C282R27	166
C143F26	C282R27	171

4. PCR 생성물의 검출:

PCR 생성물을 증폭 동안 5'-바이오틴-표지된 프라이머(센스 쇄)를 사용하여 바이오티닐화한다. 병류 막(SureCell tests, Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY)의 표면 상에 침전된 라텍스 입자에 공유적으로 부착된 올리고뉴클레오타이드 프로브에 하이브리드화시켜 생성물을 포획한다. 이 프로브는 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB로 명명됨) <서열 11>; 5'-CCTTTCGCGA CCCAACACTACTCGGCT-3'(C252-27-PRB로 명명됨) <서열 12>; 및 5'-TTTCGCGACCCAACAC TACTCGGCT-3'(C252-25-PRB로 명명됨) <서열 13>이다. 이러한 프로브/생성물 복합체를, 염료 전구체의 염료로의 산화적으로 전환(청색)을 촉매해 주는 스트렙타비딘(SA)-서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합체와 반응시킨다. 표준 색상에 대한 색도를 비교함으로써 청색도를 가시적으로 점수를 매긴다(0 내지 10). 가시적인 색도 점수가 >3인 것은 모두 포지티브 결과로 간주된다.

5. 로쉬 앰플리커 분석법:

로쉬 앰플리커 분석법(Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Switzerland)을 제조업자의 지시에 따라서 수행한다.

B. 결과:

브라질인 환자와 이집트인 환자로부터의 42개 샘플 패널을 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같이 HCV에 대해 시험한다. 이들 샘플 중 몇몇을 대상으로 하여, 또한 키론(Chiron) B-DNA 분석법을 이용하여 시험한다. 브라질인 샘플은 미국인 샘플과 비교해서 상당 부분의 HCV 유전자형 3을 함유하는 것으로 예상되고, 이집트인 샘플은 미국인에게서 거의 발견하기 힘든 유전자형인 HCV 유전자형 4를 대부분 함유하는 것으로 예상된다.

모든 반응을 이중으로 수행한다. 포지티브 점수는 두 번의 반응 모두가 포지티브라는 것을 나타낸다. 그 결과를 다음 표 4에 나타낸다.

국가	bDNA(c/㎖)	로쉬 앰플리커	131F/294R 5'NC(6/18/97)	69F/133R 5'NC	143F/283R 5'NC	143F/287R 5'NC
브라질	1258000	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	-	-	-	ND	ND
브라질	ND	-	-	-	ND	ND
브라질	2265000	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	-	-	-	ND	ND
브라질	253000	-/-	+	+	+	+
브라질	524000	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	-	-	-	ND	ND
브라질	ND	+	+	+	+	+
브라질	2089000	+	+	+	ND	ND
브라질	391000	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	-/+	+	+	+	+
브라질	234000	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	-	+/-	+/-	-	-
브라질	371000	+	+	+	ND	ND
브라질	703000	+	+	+	ND	ND
브라질	ND	-	-	-	-	-
브라질	298000	+	+	+	ND	ND
브라질	251000	+	+	+	ND	ND
브라질	267000	+	+	+	ND	ND
브라질	503000	+	+	+	ND	ND
이집트	ND	-	+/-	+	-	+/-
이집트	ND	+	+	+	ND	ND
이집트	ND	-	+	+	+	+
이집트	ND	-	+/-	+	-	-
이집트	ND	+	+	+	ND	ND
이집트	ND	+	+	+	ND	ND
이집트	ND	-	-	+/-	-	-
이집트	ND	+	+	+	ND	ND
이집트	ND	+	+	+	+/-	-
이집트	ND	-	-	-	ND	ND
이집트	ND	-	-	+	-	-
이집트	566000	-	+	+	ND	ND
이집트	205000	-	+	+	+/-	+
이집트	ND	-	-	-	ND	ND
이집트	ND	+	+	+	ND	ND
이집트	ND	-	+WK	+	-	-
이집트	ND	-	-	+	-	-
이집트	ND	-	-	+	-	-
이집트	ND	-	-	+/-	ND	ND
이집트	ND	+	+	+	+	+

본 발명의 5' NCR 프라이머를 사용하여 수득된 결과와 로쉬 분석 시스템을 사용하여 수득된 결과에 관한 비교를 다음 표 5 및 표 6에 요약한다.

	로쉬 앰플리커 + -
+ C131/C294 (긴 생성물) -	21	5
	0	16

	로쉬 앰플리커 + -
+ 69F/133R (짧은 생성물) -	21	11
	0	10

본 발명의 프라이머 모두는 로쉬 앰플리커 분석법과 비교해서 탁월한 민감도를 나타내었다. 프라이머 쌍 69F/133R을 사용하여, 가장 높은 민감도를 수득하였다. 로쉬 앰플리커 분석법을 사용해서는 네가티브였던 5개 샘플이 본 발명의 C131/C294 프라이머 쌍을 사용해서는 포지티브였고, 한편 로쉬 앰플리커 분석법을 이용해서는 네가티브였던 11개 샘플이 본 발명의 69F/133R 프라이머 쌍을 사용해서는 포지티브였다. 더욱이, 키론 bDNA 분석법에 의해 검출 가능한 바이러스가 포함된 모든 샘플은 본 발명의 프라이머를 사용해서 검출된 반면, 이들 중 3개는 로쉬 앰플리커 분석법에 의해서는 검출되지 않았다. 본 발명에 따르는 분석법에서는 어떠한 네가티브 대조군도 포지티브의 점수를 기록하지 못하였다.

일련의 두 번째 실험에서는, HCV 항체에 대해 포지티브인 것으로 이미 결정된 브라질인으로부터의 150개 혈장 샘플을 대상으로 하여, 로쉬 앰플리커 분석법과 본 발명의 프라이머를 사용하여 시험한다. 다음 표 7 및 표 8은 슈어셀 색상 점수를 기준으로 한 결과가 제시되어 있다. 각 반응에 대해, 생성물을 겔 상에서 검사하여 이러한 결과를 확인한다. 네가티브 혈장 샘플과 물로 이루어진(RNA를 함유하지 않음) 네가티브 대조군(임상 샘플 전반에 걸쳐 산재됨)이 각 프라이머 세트에 포함되어 있다. 모든 네가티브 대조군의 결과는 네가티브이다.

	로쉬 앰플리커 + -
+ 131F/294R -	90	4
	0	56

	로쉬 앰플리커 + -
+ 69F/133R -	90	7
	0	53

본 발명에 따르는 5' NCR 프라이머 쌍은 로쉬 분석법 시스템에 비해 탁월한 민감도를 나타내었다. 가장 높은 민감도는 69F/133R 프라이머 쌍을 사용하여 성취하였는데, 이는 C131/C294 프라이머 쌍과 비교해서 3개 더 많은 샘플에서 HCV RNA 의 존재를 검출하였다.

실시예 2

5' NCR HCV 분석법의 민감도 분석

다음 실험을 수행하여, 본 발명의 5' NCR 프라이머 쌍을 사용한 HCV 분석법의 민감도를 시험한다.

1. 3명의 환자 샘플을 HCV RNA의 이론적인 복사체 수를 기준으로 하여 희석시키고 로쉬 앰플리커 시스템과 본 발명의 프라이머 쌍을 사용하여 HCV RNA에 대해 분석한다. 그 결과를 다음 표 9에 나타낸다.

	이론적인 복사체/ ㎖	로쉬 앰플리커	5' NC 131F/294R
JJCD 코드	이론적인 복사체/ ㎖	로쉬 앰플리커	5' NC 131F/294R
A1	500	+	+
A2	100	+	+
A3	10	-	+
A4	5	-	+
A5	1	-	-
B1	500	+	+
B2	100	+	+
B3	10	+	+
B4	5	+	+
B5	1	+	+
C1	500	+	+
C2	100	+	+
C3	10	-	+
C4	5	-	+/-
C5	1	-	-

3가지 세트의 희석된 환자 샘플 모두에서, 본 발명의 5' NCR 프라이머를 이용하는 분석법이 로쉬 분석법보다 더 높은 민감도를 나타내었다.

2. HCV에 대해 포지티브인 것으로 공지된 혈장을 HCV-네가티브 혈장으로 희석시키고, 상기와 같이 시험한다. 내부 포지티브 대조군(IPC) 플라스미드를 10개 복사체 수/반응물로 상기 반응 혼합물에 혼입시킨다. 그 결과(5회 실험을 편집한 것임)를 다음 표 10에 나타낸다.

			5' NC IPC
복사체 수/㎖	n	복사체 수/반응물	포지티브 결과(%)	포지티브 결과(%)
1000	24	50	100%	100%
200	24	10	100%	100%
100	59	5	100%	100%
20	64	1	69%	100%

C131F/C294R 5' NCR 프라이머 쌍은 우수한 민감도를 나타내었고 포이슨 (Poisson) 분포 분석에 의해 예견된 바와 같이 PCR 반응당 단일 바이러스 입자 만큼이나 적은 양을 검출할 수 있다.

3. HCV 바이러스가 적게 포함된(범위 = 16 내지 404개 복사체 수/PCR 반응에 상응하는 316 내지 8080개 복사체 수/ml) 환자로부터의 18명 환자 샘플.

시험된 18개 샘플 중에서 17개가 본 분석법에서 포지티브이다.

실시예 3

생물학적 샘플 중에서의 HCV의 검출: 3' NCR HCV 증폭용 프라이머와 로쉬 앰플리커 HCV 분석법의 비교

HCV 항체에 대해 포지티브인 것으로 이미 결정된 브라질인으로부터의 150개 혈장 샘플을 대상으로 하여, 로쉬 앰플리커 분석법과 본 발명의 3' NCR 프라이머를 사용하여 시험한다. 역전사 및 증폭을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행한다. 역전사는 서열 5'-GTATCAGCACTC-3' <서열 16>을 갖는 프라이머를 사용하여 수행하고, 증폭은 X1F27/57R27 프라이머 쌍을 사용하여 수행한다. 각 반응물은 플라스미드 DNA의 내부 포지티브 대조군(IPC)을 함유하고 있다. 포획 프로브로서 3X30PRB25를 사용하여, 상기 슈어셀 시스템을 이용하여 증폭 생성물을 검출시킨다. 각 반응에 대해, 생성물을 겔 상에서 검사하여 이러한 결과를 확인한다. 네가티브 혈장 샘플과 물로 이루어진(RNA를 함유하지 않음) 네가티브 대조군(임상 샘플 전반에 걸쳐 산재됨)이 포함되고 모두 RT-PCR에서 네가티브이다. 본 발명의 프라이머를 사용하여 수득된 결과와 로쉬 분석 시스템을 사용하여 수득된 결과에 대한 비교를 다음 표 11에 요약한다.

	로쉬 앰플리커 + -
+ 1F27/57R2 3' 분석법 -	85	0
	3	62

실시예 4

생물학적 샘플 중에서의 HCV의 검출: 본 발명과 로체스터 종합 병원(RGH) 5' NCR 집합적 PCR 분석법의 비교

다음 실험을 수행하여 본 발명의 3' NCR HCV 프라이머와 RGH 집합적 PCR(Nested PCR) 검출 시스템을 비교한다.

83개 혈장 샘플을 57R27 프라이머를 사용하여 역전사시키고, 이러한 역전사 생성물을 상기 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 3X1F27/57R27 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시킨다. 각 반응에 대해, 생성물을 겔 상에서 검사하여 이러한 결과를 확인한다. 네가티브 혈장 샘플과 물로 이루어진(RNA를 함유하지 않음) 네가티브 대조군(임상 샘플 전반에 걸쳐 산재됨)이 포함되고 모두 상기 분석법에서 네가티브이다.

본 발명의 프라이머를 사용하여 수득된 결과와 로쉬 분석 시스템을 사용하여 수득된 결과에 관한 비교가 다음 표 12에 요약되어 있다.

	5' 집합적 분석법(RG) + -
+ 1F27/57R2 3' 분석법 -	56	1
	1	25

이들 결과는 본 발명의 검출 시스템이 RGH 집합적 PCR 시스템과 비교해서 더 민감하고 특이적이라는 것을 입증해준다. 본 발명에 따르는 분석법은 26개 네가티브 샘플 중에서 25개 샘플에 대해서는 RGH 분석법과 일치한다. 본 발명의 잇점은 집합적 PCR을 수행하는 경우 보다 캐리오버(carryover)될 가능성이 더 적다는 것이며, 후자의 경우에서 처럼, 튜브는 반응 동안에 새로운 시약이 가해지도록 개방되어야만 한다. 위-네가티브적 결과를 나타내는 단일 샘플은 집합적 PCR 프로토콜에 의해 유발된 캐리오버의 한 예일 수 있다.

실시예 5

3' NCR HCV 분석법의 복사체 민감도

다음 실험을 수행하여 본 발명의 3' NCR HCV 분석법의 검출 민감도를 결정한다.

로쉬 모니터와 키론 B-DNA 분석법을 사용하여 HCV에 대해 시험된 바 있는 혈장 샘플을 제조원[Boston Biomedica, Inc.]으로부터 수득한다. RNA를 준비하고, 20 내지 1000개 복사체 수의 HCV RNA/ml를 함유하도록 희석시키며, 상기 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 역전사 및 증폭을 수행한다. 역전사는 66RT(12량체) 프라이머(표 13) 또는 57R27(27량체) 프라이머(표 14)를 사용하여 수행하고, PCR은 1F27 및 57R27 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 사용하여 수행한다. 내부 포지티브 대조군(IPC) 프라이머를 또한 본 분석법에 혼입시키면, 각 샘플에 대해 포지티브의 점수가 생겨나게 된다. 결과는 포획 프로브로서 3X-30PRB25를 사용하여 겔 밴드와 슈어셀을 기준으로 하여 포지티브인 샘플의 백분율(%)로서 나타낸다.

n	복사체 수/㎖	복사체 수/반응물	포지티브 결과(%)
16	1000	50	100%
16	200	10	88%
57	100	5	49%
64	20	1	20%

n	복사체 수/반응물	평균 가시 색상	포지티브 결과(%)
9	50	8	100%
10	10	8	100%
10	0	0	0%

3' NCR HCV 분석법은 100%에서 1000개의 바이러스 복사체 수/ml를 검출하였고 88 내지 100%에서 200개의 복사체 수/ml를 검출하였다. 100개 복사체 수/ml에서, 바이러스는 샘플의 약 50%에서 검출되었다(12량체 RT 프라이머를 사용한 경우). 포이슨 분포(Poisson distribution)는 반응 당 1개 복사체 수(20개 바이러스 입자/ml)에서, 포지티브 결과의 빈도가 대략 60%여야 한다고 예견하고 있다. 이러한 수준의 바이러스에서 20% 검출이 발견되는 것은 HCV의 3' 비-암호화 영역이 모든 바이러스 입자에 존재하지는 않거나, 또는 짧은 (12량체) 역전사 프라이머를 사용하는 경우에 본 분석법에서 본래부터 민감도 상실이 내재하고 있을 가능성 때문일 수 있다. 후자의 설명은 20개 복사체 수/ml에서 보다 높은 수준의 검출을 가져다 주는, 5' NCR 프라이머를 사용하여 동일한 샘플 상에서 역전사/증폭 분석법을 수행함으로써 뒷받침된다. 이들 결과는, 3' NCR 분석법의 민감도가, 보다 긴 역전사용 (27량체) 프라이머를 사용함으로써 증가될 수 있다는 것을 나타낸다(12량체 프라이머와 27량체 프라이머를 사용한 10개 복사체 수/반응물의 검출 비교가 표 13 및 14에 각각 제시되어 있다).

실시예 6

상이한 HCV 유전자형을 갖는 환자 샘플 분석

다음 실험을 수행하여 상이한 유전자형을 갖는 HCV의 검출을 평가한다.

1. 유전자형 봉입도

HCV의 각종 유전자형을 나타내는 침팬지 혈장을 공급처[National Institutes of Health(NIH)]로부터 수득한다. 혈장을 준비하고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리한다. 5' NCR 프라이머는 C131F 및 C294R(각각 정방향 및 역방향 프라이머)이고, 3' NCR 프라이머는 1F27 및 57R27(각각 정방향 및 역방향 프라이머)이다. 에티듐 브로마이드로 염색된 4% 아가로즈 겔 상에서 PCR 생성물을 분석함으로써 결과를 수득한다. 포지티브 결과는 복제 샘플을 기준으로 한 것이다. 이 결과가 다음 표 15(5' NCR 프라이머를 사용함) 및 표 16(3' NCR 프라이머를 사용함)에 제시되어 있다.

유전자형	균주	포지티브 결과(%)
1a	H77	+
1b	H-J4	+
2a	H-J6	+
2b	C-J8	+
3a	S52	+
5a	SA13	+

n	유전자형	균주	복사체수/rxn.	포지티브 결과(%)
4	1a	H77	100	100%
4	1b	H-J4	100	100%
4	2a	H-J6	100	100%
4	2b	C-J8	100	100%
4	3a	S52	100	100%
4	5a	SA13	100	100%

2. 환자 샘플:

공지된 유전자형의 희석되지 않은 27명 환자 샘플을 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같은 C131F 및 C294R 프라이머를 사용하여 분석한다. 슈어셀 검출(SureCell detection)을 이용하여 결과를 확인한다(포획 프로브 HCV 및 IPC 생성물로서 각각 C252-PRB25 및 IPC-1P를 사용함). 이 패널에는 HCV 유전자형 1 내지 4 및 6으로 감염된 대표적인 혈장 샘플이 포함되어 있다. 환자 샘플은 여러 지리학적 영역으로부터의 것이다(스코틀랜드, 튀니지, 사우디아라비아, 및 홍콩). 각 샘플을 이중으로 시험한다(예를 들면, 유전자형 1의 6개 샘플을 시험한다).

본 발명의 프라이머 시스템은 본 패널에 포함된 모든 유전자형 샘플을 증폭시킬 수 있다. C131F25/C294R25 프라이머가 지금까지 가능한 모든 HCV 유전자형(유전자형 1 내지 6)을 동정하였다.

3. 낮은 복사체 수 샘플:

상이한 유전자형(1 내지 6, 미국, 스코틀랜드, 튀니지, 사우디아라비아 및 홍콩인으로부터 수득된 것임)의 HCV를 함유하는 샘플을 로쉬 모니터 분석법을 이용하여 정량화하고, PCR 반응당 50개 바이러스 복사체 수(1000개 복사체 수/ml)가 되도록 희석시키며, 상기 언급된 바와 같은 C131F 및 C294R 프라이머를 사용하여 분석한다.

본 발명의 프라이머를 사용하여 모든 샘플을 검출한다.

실시예 7

5' 및 3' 증폭용 프라이머 쌍 둘다를 이용한 다중 분석법

다음 실험을 수행하여 단일 반응 혼합물에서 HCV 게놈의 5' NCR 영역과 3' NCR 영역을 동시에 증폭시킨 효과를 분석한다.

A. 로쉬 모니터 분석법과의 비교

한 반응 당 45 내지 170,000개 바이러스 복사체 수의 등가물을 함유하는 73명 환자 샘플을 시험한다. 이 샘플은 인터페론으로 치료된 바 있는, HCV에 감염된 것으로 공지된 환자로부터의 것이다. 결과로서, 몇몇 환자는 순환성 바이러스를 거의 또는 전혀 갖고 있지 않았다. 이 패널을, 5' NCR 프라이머 쌍 131F/294R 및 3' NCR 프라이머 쌍 1F27/57R27 뿐만 아니라 IPC 프라이머를 사용하여 다중 형식으로 시험한다. 네가티브 임상 샘플을 시험 샘플 곳곳에 놓아 둔다. 모든 네가티브 샘플은 네가티브 RT-PCR 결과를 나타낸다. 이 결과를 정량적 로쉬 모니터 분석법(Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Switzerland)을 이용하여 수득된 것과 비교한다. 그 결과가 다음 표 17에 요약되어 있다.

	로쉬 모니터 + -
+ 다중 분석법 -	60	1
	0	12

본 발명의 5' 및 3' NCR 프라이머 쌍을 사용한 경우, 로쉬 모니터 결과에 따라서는 검출할 수 없었던 부가적인 샘플 하나가 5' NCR 및 3' NCR 분석법으로 검출되었는데, 이는 소량의 바이러스를 함유하는 샘플을 분석하는 경우에 본 발명의 프라이머를 이용하는 분석법이 로쉬 분석법 보다 더 민감하다는 것을 나타낸다. 로쉬 분석법에 의해서는 검출되지 않았던 상기 포지티브 샘플은 다른 5' NCR 프라이머 69F/133R을 사용하여 확인하였다.

B. 로쉬 앰플리커 분석법과의 비교:

재조합 면역블롯 분석법(RIBA)을 이용하여 불확실한 것으로서 시험된 바 있는 16명 환자 샘플을 대상으로 하여, 5' 프라이머 쌍 131F/294R 및 3' 프라이머 쌍 1F27/57R27을 사용하여 다중 형식으로 시험한다. 이 결과를 정량적 로쉬 앰플리커 분석법을 사용하여 수득된 것과 비교한다. 그 결과가 다음 표 18에 제시되어 있다.

	로쉬 앰플리커 + -
+ 다중 분석법 -	4	0
	0	12

본 발명의 분석법과 로쉬 분석법 간의 일치도는 100%이다. 모든 PCR 반응을 단일 RNA 추출물로부터 이중으로 수행한다. 또 다른 5' NCR 프라이머 세트 (69F/133R)를 사용하여 증폭시킴으로써 네가티브 반응물을 확인한다. 재시험된 모든 네가티브 반응물은 "진정한" 네가티브인 것으로 확인되었다.

상기 언급된 모든 특허, 특허원, 문헌, 공보 및 시험 방법은 이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다. 상기 상세한 설명으로부터, 당해 분야의 숙련인은 본 발명의 많은 변형을 인지할 것이다. 이러한 명백한 변형은 첨부된 특허청구의 범위 내에 전부 포함된다.

본 발명은 HCV 바이러스에 감염된 지 수 일내에 HCV 바이러스혈증을 검출하기에 충분하게 민감한, HCV에 대한 개선된 분석법을 제공한다.

<110> Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. <120> Oligonucleotide primers for efficient detection of hepatitis C virus(HCV), methods of use thereof and, kits comprising them <130> 100E286-US1 <150> US 60/118,497 <151> 1999-02-03 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 1 <211> LENGTH: 28 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 1 cagaaagcgt ctagccatgg cgttagta 28 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 2 <211> LENGTH: 25 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 2 gggagagcca tagtggtctg cggaa 25 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 3 <211> LENGTH: 26 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 3 gtggtctgcg gaaccggtga gtacac 26 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 4 <211> LENGTH: 26 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 4 cggttccgca gaccactatg gctctc 26 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 5 <211> LENGTH: 27 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 5 gcaagcaccc tatcaggcag taccaca 27 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 6 <211> LENGTH: 27 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 6 cactcgcaag caccctatca ggcagta 27 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 7 <211> LENGTH: 25 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 7 cggggcactc gcaagcaccc tatca 25 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 8 <211> LENGTH: 27 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 8 ggtggctcca tcttagccct agtcacg 27 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 9 <211> LENGTH: 27 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 9 aggccagtat cagcactctc tgcagtc 27 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 10 <211> LENGTH: 150 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: target nucleic acid for an internal positive control <400> SEQUENCE: 10 cgccagcgtg gaccatcaag tagtaatgaa cgcacggacg aggacatcat agagattaca 60 cctttatcca cagttctcgg tctaacgcag cagtcagtgt atcagcacca gcatccgtag 120 tgagtcttca gtgtctgctc caggatcgtg 150 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 11 <211> LENGTH: 27 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 11 gggtcctgga ggctgcacga cactcat 27 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 12 <211> LENGTH: 27 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 12 cctttcgcga cccaacacta ctcggct 27 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 13 <211> LENGTH: 25 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 13 tttcgcgacc caacactact cggct 25 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 14 <211> LENGTH: 25 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 14 gcggctcacg gacctttcac agcta 25 <200> SEQUENCE CHARACTERISTICS: <210> SEQ ID NO 15 <211> LENGTH: 25 <212> TYPE: DNA <213> ORGANISM: Artificial Sequence <220> FEATURE: <223> OTHER INFORMATION: Oligonucleotide primer <400> SEQUENCE: 15 atgcggctca cggacctttc acagc 25

Claims

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정방향 프라이머 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>과 역방향 프라이머 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>로 이루어진, C형 간염 바이러스(HCV)에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 HCV DNA를 함유하는 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계(A)를 포함하여, C형 간염 바이러스(HCV) DNA를 증폭시키는 방법.
제9항에 있어서,

증폭 생성물을 검출하는 단계(B)(여기서, 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV DNA가 존재한다는 것을 나타낸다)를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 검출 단계가 겔 전기영동에 의해 증폭 생성물을 가시화함을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 검출 단계가 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCA CGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>로 이루어진 HCV-특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브를 함유하는 고체 지지체 상에 증폭 생성물을 포획시키고, 포획된 생성물을 비색정량 분석법을 이용하여 정량화함을 포함하는 방법.
제10항에 있어서,

프로브가 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>을 포함하는 방법.
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(A) HCV에 특이적인 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍과 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 HCV DNA를 함유하는 DNA 샘플 상에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, HCV-특이적 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, 상기 5' NCR 프라이머 쌍은 정방향 프라이머 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>과 역방향 프라이머 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>로 이루어지고;

각각의 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍은 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함한다]를 포함하여, C형 간염 바이러스(HCV) DNA를 증폭시키는 방법.
제35항에 있어서, (B) 상기 증폭 생성물을 검출하는 단계(여기서, 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV DNA가 존재한다는 것을 나타낸다)를 추가로 포함하는 방법.
제36항에 있어서, 검출 단계가 겔 전기영동에 의해 증폭 생성물을 가시화함을 포함하는 방법.
제36항에 있어서, 검출 단계가 하나 이상의 HCV-특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브들을 함유하는 고체 지지체 상에 증폭 생성물을 포획시키고[여기서, 상기 프로브들은 (a) 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>; 및 (b) 5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3'(30PRB25) <서열 14> 또는 (c) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3'(32PRB25) <서열 15>를 포함한다], 포획된 생성물을 비색정량 분석법을 이용하여 정량화함을 포함하는 방법.
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5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>,

5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>, 또는

5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-22-PRB) <서열 11> 중에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드.
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>, 또는

5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4> 중에서 선택되는 HCV-특이적 증폭 프라이머 올리고뉴클레오타이드.
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프로브.
정방향 프라이머 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>과 역방향 프라이머 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>로 이루어진 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 포함하는, HCV RNA로부터 유래된 HCV DNA를 증폭시키기 위한 키트.
제43항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTA GCCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 키트.
제43항에 있어서, 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 키트.
제44항에 있어서, (a) 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>; 및 (b) 5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3'(30PRB25) <서열 14> 또는 (c) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3'(32PRB25) <서열 15>로 이루어진 프로브들을 추가로 포함하는 키트.
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정방향 프라이머 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'(C69F28) <서열 1>과 역방향 프라이머 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26) <서열 4>로 이루어진 5' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 포함하는, HCV DNA의 존재를 검출하기 위한 키트.
제54항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 5'-GGTGGCTCCATCTTAG CCCTAGTCACG-3'(1F27) <서열 8>로 이루어진 정방향 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'(57R27) <서열 9>로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하는 3' NCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 키트.
제54항에 있어서, 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>로 이루어진 프로브를 추가로 포함하는 키트.
제55항에 있어서, (a) 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCAC GACACTCAT-3'(C96-27-PRB) <서열 11>; 및 (b) 5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3'(30PRB25) <서열 14> 또는 (c) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3'(32PRB25) <서열 15>로 이루어진 프로브들을 추가로 포함하는 키트.
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