CN103443293B - 聚合酶链式反应用的混合液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚合酶链式反应(PCR)用的混合液，包括水、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、三(羟甲基)胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇(DDT)以及添加剂。

Description

聚合酶链式反应用的混合液
技术领域
本发明与聚合酶链锁反应(PCR)有关，特别是指一种聚合酶链锁反应用的混合液。
背景技术
聚合酶链锁反应(PCR)是一种用来扩增特定核酸序列的技术，目前已被广泛地应用于医学及生物学实验室。前述聚合酶链锁反应主要包括三个步骤：(a)变性反应(Denature)，将样品加热至高温，一般为95℃，使双股的模板DNA分离成单股DNA；(b)黏合反应(Annealing)，通常于55℃下，使引子(primer)与前述的单股DNA进行配对结合，形成DNA与引子复合物；(c)延伸反应(Extension)，通常于72℃下，使DNA与引子复合物中的引子开始延伸，产生与模板DNA各股互补的新单股DNA。
由于传统热对流式聚合酶链锁反应所使用的反应混合液流动速度较快，而聚合酶链锁反应刚开始进行时，模板DNA的数量较少，因此引子辨认模板DNA的时间不够，导致引子容易与模板DNA错误地结合，产生灵敏度降低、专一性不足以及容易复制出错误核酸序列复制物的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可提高聚合酶链锁反应的灵敏度、专一性以及核酸序列复制物产量的聚合酶链锁反应用的混合液。
为达成上述目的，本发明所提供的一种聚合酶链锁反应用的混合液，包含有：水、DNA聚合酶、dNTPs、三(羟甲基)胺基甲烷-盐酸、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇以及一添加剂，该添加剂为选自甘油、杏仁糖、蔗糖、麦芽糖、乳果糖、海藻糖、乙醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、葡萄糖醇、帕拉金糖醇、丙二醇、己六醇、NP-40、Tween20、Tween80、乙二胺四乙酸、二甲基亚砜、甲酰胺、甜菜碱、明胶、氯化钙、鸟胺酸、甘胺酸、丙胺酸、离胺酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸以及尿素所构成的族群中的至少一种化合物。
上述本发明的技术方案中，甘油、杏仁糖、蔗糖、麦芽糖、乳果糖、海藻糖、乙醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、葡萄糖醇、帕拉金糖醇、丙二醇或己六醇的含量为1至20wt％。
NP-40、Tween20、Tween80、甲酰胺、甜菜碱、明胶或氯化钙的含量为0.1至5wt％。
乙二胺四乙酸或二甲基亚砜的含量为0.3至5wt％。
鸟胺酸、甘胺酸、丙胺酸、离胺酸、柠檬酸、苹果酸或尿素的含量为1至15wt％。
酒石酸的含量为3至15wt％。
本发明所提供的混合液中，甘油、杏仁糖、蔗糖、麦芽糖、乳果糖、海藻糖、乙醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、葡萄糖醇、帕拉金糖醇、丙二醇或己六醇的含量可为1至20wt％；NP-40、Tween20、Tween80、甲酰胺、甜菜碱、明胶或氯化钙的含量可为0.1至5wt％；乙二胺四乙酸或二甲基亚砜的含量可为0.3至5wt％；鸟胺酸、甘胺酸、丙胺酸、离胺酸、柠檬酸、苹果酸或尿素的含量可为1至15wt％；酒石酸的含量则可为3至15wt％。
本发明所提供的聚合酶链锁反应用的混合液，在进行热对流时其流速较现有的混合液低，因此可延长引子辨认模板DNA的时间，降低引子与模板DNA错误结合的机率，以提升聚合酶链锁反应的灵敏度与专一性，并有效提高正确核酸序列复制物的产量。
具体实施方式
本发明所提供的一种聚合酶链锁反应用的混合液，其主要包含有水、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、三(羟甲基)胺基甲烷-盐酸(Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride，Tris-HCl)、氯化钾(potassiumchloride，KCl)、氯化镁(magnesium dichloride，MgCl2)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DDT)以及一添加剂。其中，DNA聚合酶可依据所需复制的DNA序列而加以选择，例如：Taq(Thermus aquaticus)DNA聚合酶或ventDNA聚合酶。其次，混合物中的三(羟甲基)胺基甲烷-盐酸、氯化钾、氯化镁以及二硫苏糖醇的莫耳数比为50：75：3：1。添加剂则可选用甘油(glycerol)、杏仁糖(marzipan)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、乳果糖(lactulose)、海藻糖(trehalose)、乙醇(ethanol)、木糖醇(xylitol)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、葡萄糖醇(glucitol)、帕拉金糖醇(palatinitol)、丙二醇(propylene glycol)、己六醇(dulcitol)、壬苯醇醚(tergitol，NP-40)、Tween20(美国sigma-aldrich corporation制造)、Tween80(美国sigma-aldrichcorporation制造)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺(formamide)、甜菜碱(betaine)、明胶(gelatin)、氯化钙(calcium chloride)、鸟胺酸(ornithine)、甘胺酸(glycine)、丙胺酸(alanine)、离胺酸(lysine)、柠檬酸(citric acid)、酒石酸(tartaric acid)、苹果酸(malic acid)或尿素(urea)等化合物中的一种或多种。
如添加剂选用甘油、杏仁糖、蔗糖、麦芽糖、乳果糖、海藻糖、乙醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇、葡萄糖醇、帕拉金糖醇、丙二醇或己六醇，其含量宜为1至20wt％。
如添加剂选用NP-40、Tween20、Tween80、甲酰胺、甜菜碱、明胶或氯化钙，其含量宜为0.1至5wt％。
如添加剂选用乙二胺四乙酸或二甲基亚砜，其含量宜为0.3至5wt％。
如添加剂选用鸟胺酸、甘胺酸、丙胺酸、离胺酸、柠檬酸、苹果酸或尿素，其含量宜为1至15wt％。
如添加剂选用酒石酸，其含量宜为3至15wt％。
若以含有不同比例添加剂的混合液作为实验例1～93，并以不含添加剂的混合液作为比较例，比较两者可发现在热对流式聚合酶链锁反应进行中的流速明显不同，详如下述：
<实验例1至93的反应混合液的配制>
以去离子水将pH值8.3的缓冲液稀释十倍，该缓冲液包含有500mM的Tris-HCl、750mM的KCl、30mM的MgCl2以及10mM的DDT，再于稀释后缓冲液中加入模板DNA、引子、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及一添加剂，配制成实验例1至93的反应混合液，其中，添加剂的种类以及含量如表一所示。
<比较例的反应混合液的配制>
依照前述反应混合液的配制方法，配制比较例的反应混合液，差别在于不加入任何添加剂。
依1：400的比例，将粒径约1μm的荧光乳胶微粒(Latex Beads，购自美国Sigma-aldrich corporation，型号088k1301)均匀分布于去离子水中，制得微粒悬浮液。之后，分别将48μL的实验例或比较例的反应混合液置入管径0.2公分的毛细管中，再添加2μL的微粒悬浮液，共50μL的液体液面高度为2公分，接着，加热毛细管底部至95～98℃，并利用粒子影像测速仪(Particle Image Velocimetry，PIV)测量反应混合液热对流的流速，并将结果显示于表一中。
【表一】
表一中，“起始时间”为反应混合液开始稳定热对流的时间点；“结束时间”为反应混合液完成一次热对流的时间点，实验时观察荧光乳胶微粒自液面移至毛细管底部，再回到液面，即完成一次热对流；“流速”则依据下列算式计算而得：
由表一显示的结果可知，包含有添加剂的实验例的反应混合液，在毛细管内的热对流流速比未含有添加剂的比较例的反应混合液低，实验例中反应混合液的流速均低于1.74mm／s，因此，使用本发明所提供的混合物来配制聚合酶链锁反应所需的反应混合液，可降低反应混合液热对流的流速，提供引子充足的时间辨认模板DNA并与之结合，降低引子与模板DNA错误结合的机率，因此能有效提高聚合酶链锁反应的灵敏度、专一性以及正确核酸序列复制物的产量。
基于本发明的精神，缓冲液的成份或稀释比例可依需要调整，而添加剂的比例也可调整，或可将多种添加剂同时加入混合液中，凡所属技术领域中具有通常知识者，在不违反本发明创作精神下所作的各种变化俱包含在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.一种聚合酶链锁反应用的混合液，包含有：
水、DNA聚合酶、dNTPs、三(羟甲基)胺基甲烷-盐酸、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇以及一添加剂，所述添加剂为选自鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、柠檬酸、苹果酸以及尿素所构成的族群中的至少一种化合物，其中该添加剂的含量为1至15wt％。
2.一种聚合酶链锁反应用的混合液，包含有：
水、DNA聚合酶、dNTPs、三(羟甲基)胺基甲烷-盐酸、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇以及一添加剂，所述添加剂为酒石酸，该酒石酸的含量为3至15wt％。
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