CN101392282B - 一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸扩增领域的技术。优化的扩增高GC含量片段的专用缓冲液，用于一般PCR方法无法实现的高GC含量和具有复杂二级结构DNA模板的扩增。优化的高GC PCR缓冲液系统能协助高GC含量和具有复杂二级结构DNA模板解链，提高引物结合的特异性，从而有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。应用该缓冲液可以提高核酸扩增保真度，复杂模板的扩增。
Description
技术领域
本发明属于利用聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增领域的技术。
背景技术
利用聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增以及包括PCR扩增的分析众所周知。参见美国专利第4683202、第4683195号和第4965188号，以及通常参见PCRPROTOCOLS，a guide to Methods and Applications，Innis等人编辑，AcademicPress(San Diego，CA(USA)1990)。通常，聚合酶链式反应必须保证扩增反应的特异性，保真度，扩增片段的长度，通过优化退火温度，引物设计和镁离子浓度使用标准PCR反应体系足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。
影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。有研究报告显示调节离子浓度(Na+和K+)或反应组分的量能影响模板的二级结构(Le Rudulier，D，etal，Science 224；1064(1984)；Buche，A，etal，J.Biomolec.Struct.Dyn.8(3)；601(1990)；Marquet，R，and Houssier，C，J，Biomolec.Struct.Dyn.9(1)：159(1991)；Buche，A，etal，J.Biomolec.Struct.Dyn.11(1)：95(1993)；Woodford，K.，etal.，Nucl，AcidsRes.23(3)：539(1995)；Flock，S.，etal.，Biophys.J.70：1456(1996)；Flock，S.，etal.，Biophys.J.，71：1519(1996)；EP0821059A2)；还有研究报告显示，在体外，核酸构象和稳定性可以通过往缓冲液内添加一定量的化合物如多糖(Carninci，P.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：520-524(1998))，某些助溶剂如甘油和DMSO(Varadaraj，K.，and Skinner，D.M.，Gene 140；1(1994))和其他含N化合物和氨基酸如脯氨酸和甜菜碱(Rees，W.A.，etal.，Biochemistry32：137-144(1993)；WO 95/20682；DE 44 11 588 C1；DE 44 11 594 C1；Mytelka，D.S.，etal.，Nucl Acids Res.24(14)：2774(1996)；Baskaran，N.，etal.，Genome Res.6：633(1996)；Weissensteiner，T.，and Lanchbury，J.S.，BioTechniques 21(6)：1102(1996)；Rajendrakumar，C.S.V.，etal，FEBSLetts.410：201-205(1997)；Henke，W.，etal.，Nucl.AcidsRes.25(19)：3957(1997)；)。
本发明在常规PCR反应液中添加了一定浓度的甜菜碱和脯氨酸组合，比添加单组分甜菜碱(0.5M)或脯氨酸(0.4M)(WO9946400)的特异性，扩增效率高，并能获得保真度较高的DNA及对一些有特殊结构如GC含量高(60％＜GC％＜74.8％)， 有二级结构模板等进行很好地扩增。
发明内容
在常规PCR反应液中，通过优化退火温度，引物设计和镁离子浓度足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的或含有二级结构的，就很难扩增，因此在常规PCR反应液中添加了一定浓度的甜菜碱和脯氨酸，能获得保真度较高的DNA并能对一些有特殊结构如GC含量高(60％<GC％<74.8％)，有二级结构模板等进行很好地扩增。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：
1、设计四对引物APOE(F/R)，JUNB(F/R)，TGF61(F/R)和TGF70(F/R)均以人基因组为模板
| 基因 | 产物大小 | GC含量 | 引物序列 |
| APOE | 448bp | 74.8％ | APOE-F5’TCGGAACTGGAGGAACAACTGACC3’APOE-R5’TCCGGCTGCCCATCTCCTCCATCC3’ |
| JUN-B | 1090bp | 68.1％ | JUN-B-F5’GCCGCCCGGATGTGCACTAAAATG3’JUN-B-R5’CCAAGCGAGGGGGTGTCCGTAAAG3’ |
| BetalTGF | 1527bp | 61.5％ | TGF-61F5’CCGCGCCCAGCCAAGGTATTT3’ TGF-61R5’CGGGGGTGGGGGAGAGTCGTAGAA3’ |
| BetalTGF | 1915bp | 70.4％ | TGF-70F5’CCCCCTATTGCTTGTCTCCCTCTA3’TGF-70R5’AGCCTGACTCTCCTTCCGTTCTG3’ |
2、配制扩增高GC含量片段的专用混合液2×GC-RICH master mix，该混合液含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mM MgCl2，1—20％甘油(V/V)，1—2％Tween—20(V/V)，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶，0.1-1M甜菜碱和0.1-1M脯氨酸。
在一个优选的实施例中，所述混合液含有10％甘油(V/V)，1.4％Tween—20(V/V)，0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸。
在另一个优选的实施例中，所述混合液含有20％甘油(V/V)，2％Tween—20(V/V)，0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸。
3、PCR反应循环的设置：
本发明还涉及上述混合液在扩增高GC含量片段中的应用。
附图说明
图1、琼脂糖凝胶电泳图显示单组分的甜菜碱和脯氨酸终浓度对APOE和JUNB的扩增
1、DNA MARKER；2、1.5M甜菜碱；3、1×CES；4、0.4M脯氨酸
5、0.6M MMNO；6、1×GC II；7、1×GC I；8、无添加剂
9、无添加剂和模板
图2、琼脂糖凝胶电泳图显示不同组合的甜菜碱和脯氨酸终浓度对APOE和JUNB的扩增
1、无甜菜碱和脯氨酸；2、0.5M甜菜碱；3、1.0M甜菜碱
4、1.5M甜菜碱；5、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸
6、1.0M甜菜碱和0.3M脯氨酸；7、1.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸
8、DNA MARKER；9、无甜菜碱和脯氨酸；10、0.5M甜菜碱；
11、1.0M甜菜碱；12、1.5M甜菜碱；
13、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸；14、1.0M甜菜碱和0.3M脯氨酸；
15、1.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸；
A、JUNB；B、APOE
图3、琼脂糖凝胶电泳图显示甜菜碱和脯氨酸组合后终浓度对APOE的扩增
1、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸；2、0.5M甜菜碱和0.3M脯氨酸
3、0.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸；4、0.5M甜菜碱和0.1M脯氨酸
5、0.5M甜菜碱和0M脯氨酸；6、DNA MARKER
图4、琼脂糖凝胶电泳图显示0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸组合浓度对TGF61和TGF70的扩增
1、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸；2、无甜菜碱和脯氨酸
3、DNA MARKER；4、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸
5、无甜菜碱和脯氨酸；A、TGF70；B、TGF61
图5琼脂糖凝胶电泳图显示0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸组合浓度对APOE，JUNB，TGF61和TGF70的扩增
1、TGF70；2、TGF61；3、JUNB；4、APOE；5、DNA MARKER
具体实施方式：
实施例1：
1、以人基因组DNA为模板(Template)，在不同的助熔剂(甜菜碱、CES、 脯氨酸、MMNO、GCII、GCI)下扩增APOE(448bp，GC74.8％)片段，反应体系为20μl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mMMgCl2，1％甘油(V/V)，1％Tween—20(V/V)，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
| 反应组分 | 甜菜碱(1.5M) | 1×CES | 脯氨酸 (0.4M) | MMNO(0.6M) | 1×GCII | 1×GCI | 无添加 剂 | 无添加剂和模板 |
| 2×GC-RICH mastermix | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Primer1(10μM) | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl |
| Primer2(10μM) | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl |
| Template | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg |
| ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置：
3、结果检测：反应结束后取5μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图1)。
实施例2：
1、以人基因组DNA为模板，不同组合的甜菜碱(Betaine)和脯氨酸(Proline)终浓度对APOE和JUNB的扩增，反应体系为20μl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mMMgCl2，5％甘油(V/V)，1.2％Tween—20(V/V)，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
| 反应组分 | 0.5M betaine | 1M betaine | 1.5M betaine | 0.5M betaine0.4M proline | 1M betaine0.3M proline | 1.5M betaine0.1M proline | 无添加 剂 |
| 2×GC-RICH master mix | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| JUN/APOE Primer FR(10μM) | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl |
| Template | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg |
| ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置：
3、结果检测：反应结束后取5μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图2)。
实施例3：
1、以甜菜碱和脯氨酸组合后终浓度对APOE的扩增APOE(448bp，GC74.8％)片段，反应体系为20μl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mMMgCl2，10％甘油(V/V)，1.4％Tween—20(V/V)，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
| 反应组分 | 0.5M betaine0.4M proline | 0.5M betaine0.3M proline | 0.5M betaine0.2M proline | 0.5M betaine0.1M proline | 0.5M betaine |
| 2×GC-RICH master mix | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| APOE Primer FR(10μM) | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl |
| Templ ate | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg |
| ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置：
3、结果检测：反应结束后取5μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图3)。
实施例4：
1、以人基因组DNA为模板，0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸组合浓度对TGF61和TGF70的扩增TGF61和TGF70片段，反应体系为20μl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mMMgCl2，15％甘油(V/V)，1.8％Tween—20(V/V)，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
| 反应组分 | 0.5M betaine0.4M proline | OM betaine0M proline |
| 2×GC-RICH master mix | 10μl | 10μl |
| TGF61\TGF70Primer FR(10μM) | 0.8μl | 0.8μl |
| Template | <1μg | <1μg |
| ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置：
3、结果检测：反应结束后取5μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图4)。
实施例5：
1以人基因组DNA为模板，0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸组合浓度对APOE，JUNB，TGF61和TGF70片段，反应体系为20μl(如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mMMgCl2，20％甘油(V/V)，2％Tween—20(V/V)，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
| 反应组分 | 0.5M betaine0.5M proline |
| 2×GC-RICH master mix | 10μl |
| APOE，JUNB，TGF61和TGF70Primer FR(10μM) | 0.8μl |
| Template | <1μg |
| ddH2O | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置：
3、结果检测：反应结束后取5μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图5)。
根据上述实施例的结果可以看出，本发明的扩增高GC含量片段的专用混合液能协助高GC含量的DNA模板解链，提高引物结合的特异性，从而有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。应用该缓冲液可以提高核酸扩增保真度，复杂模板的扩增。
Claims (4)
1.一种扩增高GC含量片段的专用混合液2×GC-RICH master mix，其特征在于：该混合液含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mM MgCl2，1-20％甘油，1-2％Tween-20，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶，0.5-1M甜菜碱和0.2-0.5M脯氨酸。
2.根据权利要求1的混合液，其特征在于：所述混合液含有10％甘油，1.4％Tween-20，0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸。
3.根据权利要求1或2的混合液，其特征在于：所述混合液含有20％甘油，2％Tween-20，0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸。
4.一种权利要求1或2或3的混合液在扩增高GC含量片段中的应用。
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