CN101392282B - 一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 - Google Patents
一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101392282B CN101392282B CN2008101675738A CN200810167573A CN101392282B CN 101392282 B CN101392282 B CN 101392282B CN 2008101675738 A CN2008101675738 A CN 2008101675738A CN 200810167573 A CN200810167573 A CN 200810167573A CN 101392282 B CN101392282 B CN 101392282B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- proline
- trimethyl
- glycine
- pro
- mixed solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于核酸扩增领域的技术。优化的扩增高GC含量片段的专用缓冲液,用于一般PCR方法无法实现的高GC含量和具有复杂二级结构DNA模板的扩增。优化的高GC PCR缓冲液系统能协助高GC含量和具有复杂二级结构DNA模板解链,提高引物结合的特异性,从而有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。应用该缓冲液可以提高核酸扩增保真度,复杂模板的扩增。
Description
技术领域
本发明属于利用聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增领域的技术。
背景技术
利用聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增以及包括PCR扩增的分析众所周知。参见美国专利第4683202、第4683195号和第4965188号,以及通常参见PCRPROTOCOLS,a guide to Methods and Applications,Innis等人编辑,AcademicPress(San Diego,CA(USA)1990)。通常,聚合酶链式反应必须保证扩增反应的特异性,保真度,扩增片段的长度,通过优化退火温度,引物设计和镁离子浓度使用标准PCR反应体系足以对大多数模板进行高特异性的扩增,但是,某些模板,包括高GC含量的模板,需要其他的措施。
影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外,二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。有研究报告显示调节离子浓度(Na+和K+)或反应组分的量能影响模板的二级结构(Le Rudulier,D,etal,Science 224;1064(1984);Buche,A,etal,J.Biomolec.Struct.Dyn.8(3);601(1990);Marquet,R,and Houssier,C,J,Biomolec.Struct.Dyn.9(1):159(1991);Buche,A,etal,J.Biomolec.Struct.Dyn.11(1):95(1993);Woodford,K.,etal.,Nucl,AcidsRes.23(3):539(1995);Flock,S.,etal.,Biophys.J.70:1456(1996);Flock,S.,etal.,Biophys.J.,71:1519(1996);EP0821059A2);还有研究报告显示,在体外,核酸构象和稳定性可以通过往缓冲液内添加一定量的化合物如多糖(Carninci,P.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:520-524(1998)),某些助溶剂如甘油和DMSO(Varadaraj,K.,and Skinner,D.M.,Gene 140;1(1994))和其他含N化合物和氨基酸如脯氨酸和甜菜碱(Rees,W.A.,etal.,Biochemistry32:137-144(1993);WO 95/20682;DE 44 11 588 C1;DE 44 11 594 C1;Mytelka,D.S.,etal.,Nucl Acids Res.24(14):2774(1996);Baskaran,N.,etal.,Genome Res.6:633(1996);Weissensteiner,T.,and Lanchbury,J.S.,BioTechniques 21(6):1102(1996);Rajendrakumar,C.S.V.,etal,FEBSLetts.410:201-205(1997);Henke,W.,etal.,Nucl.AcidsRes.25(19):3957(1997);)。
本发明在常规PCR反应液中添加了一定浓度的甜菜碱和脯氨酸组合,比添加单组分甜菜碱(0.5M)或脯氨酸(0.4M)(WO9946400)的特异性,扩增效率高,并能获得保真度较高的DNA及对一些有特殊结构如GC含量高(60%<GC%<74.8%), 有二级结构模板等进行很好地扩增。
发明内容
在常规PCR反应液中,通过优化退火温度,引物设计和镁离子浓度足以对大多数模板进行高特异性的扩增,但是,某些模板,包括高GC含量的或含有二级结构的,就很难扩增,因此在常规PCR反应液中添加了一定浓度的甜菜碱和脯氨酸,能获得保真度较高的DNA并能对一些有特殊结构如GC含量高(60%<GC%<74.8%),有二级结构模板等进行很好地扩增。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是:
1、设计四对引物APOE(F/R),JUNB(F/R),TGF61(F/R)和TGF70(F/R)均以人基因组为模板
基因 | 产物大小 | GC含量 | 引物序列 |
APOE | 448bp | 74.8% | APOE-F5’TCGGAACTGGAGGAACAACTGACC3’APOE-R5’TCCGGCTGCCCATCTCCTCCATCC3’ |
JUN-B | 1090bp | 68.1% | JUN-B-F5’GCCGCCCGGATGTGCACTAAAATG3’JUN-B-R5’CCAAGCGAGGGGGTGTCCGTAAAG3’ |
BetalTGF | 1527bp | 61.5% | TGF-61F5’CCGCGCCCAGCCAAGGTATTT3’ TGF-61R5’CGGGGGTGGGGGAGAGTCGTAGAA3’ |
BetalTGF | 1915bp | 70.4% | TGF-70F5’CCCCCTATTGCTTGTCTCCCTCTA3’TGF-70R5’AGCCTGACTCTCCTTCCGTTCTG3’ |
2、配制扩增高GC含量片段的专用混合液2×GC-RICH master mix,该混合液含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mM MgCl2,1—20%甘油(V/V),1—2%Tween—20(V/V),1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶,0.1-1M甜菜碱和0.1-1M脯氨酸。
在一个优选的实施例中,所述混合液含有10%甘油(V/V),1.4%Tween—20(V/V),0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸。
在另一个优选的实施例中,所述混合液含有20%甘油(V/V),2%Tween—20(V/V),0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸。
3、PCR反应循环的设置:
本发明还涉及上述混合液在扩增高GC含量片段中的应用。
附图说明
图1、琼脂糖凝胶电泳图显示单组分的甜菜碱和脯氨酸终浓度对APOE和JUNB的扩增
1、DNA MARKER;2、1.5M甜菜碱;3、1×CES;4、0.4M脯氨酸
5、0.6M MMNO;6、1×GC II;7、1×GC I;8、无添加剂
9、无添加剂和模板
图2、琼脂糖凝胶电泳图显示不同组合的甜菜碱和脯氨酸终浓度对APOE和JUNB的扩增
1、无甜菜碱和脯氨酸;2、0.5M甜菜碱;3、1.0M甜菜碱
4、1.5M甜菜碱;5、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸
6、1.0M甜菜碱和0.3M脯氨酸;7、1.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸
8、DNA MARKER;9、无甜菜碱和脯氨酸;10、0.5M甜菜碱;
11、1.0M甜菜碱;12、1.5M甜菜碱;
13、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸;14、1.0M甜菜碱和0.3M脯氨酸;
15、1.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸;
A、JUNB;B、APOE
图3、琼脂糖凝胶电泳图显示甜菜碱和脯氨酸组合后终浓度对APOE的扩增
1、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸;2、0.5M甜菜碱和0.3M脯氨酸
3、0.5M甜菜碱和0.2M脯氨酸;4、0.5M甜菜碱和0.1M脯氨酸
5、0.5M甜菜碱和0M脯氨酸;6、DNA MARKER
图4、琼脂糖凝胶电泳图显示0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸组合浓度对TGF61和TGF70的扩增
1、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸;2、无甜菜碱和脯氨酸
3、DNA MARKER;4、0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸
5、无甜菜碱和脯氨酸;A、TGF70;B、TGF61
图5琼脂糖凝胶电泳图显示0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸组合浓度对APOE,JUNB,TGF61和TGF70的扩增
1、TGF70;2、TGF61;3、JUNB;4、APOE;5、DNA MARKER
具体实施方式:
实施例1:
1、以人基因组DNA为模板(Template),在不同的助熔剂(甜菜碱、CES、 脯氨酸、MMNO、GCII、GCI)下扩增APOE(448bp,GC74.8%)片段,反应体系为20μl(如反应体系不同,可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mMMgCl2,1%甘油(V/V),1%Tween—20(V/V),1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
反应组分 | 甜菜碱(1.5M) | 1×CES | 脯氨酸 (0.4M) | MMNO(0.6M) | 1×GCII | 1×GCI | 无添加 剂 | 无添加剂和模板 |
2×GC-RICH mastermix | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
Primer1(10μM) | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl |
Primer2(10μM) | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl | 0.4μl |
Template | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg |
ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置:
3、结果检测:反应结束后取5μl反应产物,琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图1)。
实施例2:
1、以人基因组DNA为模板,不同组合的甜菜碱(Betaine)和脯氨酸(Proline)终浓度对APOE和JUNB的扩增,反应体系为20μl(如反应体系不同,可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mMMgCl2,5%甘油(V/V),1.2%Tween—20(V/V),1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
反应组分 | 0.5M betaine | 1M betaine | 1.5M betaine | 0.5M betaine0.4M proline | 1M betaine0.3M proline | 1.5M betaine0.1M proline | 无添加 剂 |
2×GC-RICH master mix | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
JUN/APOE Primer FR(10μM) | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl |
Template | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg |
ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置:
3、结果检测:反应结束后取5μl反应产物,琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图2)。
实施例3:
1、以甜菜碱和脯氨酸组合后终浓度对APOE的扩增APOE(448bp,GC74.8%)片段,反应体系为20μl(如反应体系不同,可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mMMgCl2,10%甘油(V/V),1.4%Tween—20(V/V),1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
反应组分 | 0.5M betaine0.4M proline | 0.5M betaine0.3M proline | 0.5M betaine0.2M proline | 0.5M betaine0.1M proline | 0.5M betaine |
2×GC-RICH master mix | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
APOE Primer FR(10μM) | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl | 0.8μl |
Templ ate | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg | <1μg |
ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置:
3、结果检测:反应结束后取5μl反应产物,琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图3)。
实施例4:
1、以人基因组DNA为模板,0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸组合浓度对TGF61和TGF70的扩增TGF61和TGF70片段,反应体系为20μl(如反应体系不同,可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mMMgCl2,15%甘油(V/V),1.8%Tween—20(V/V),1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
反应组分 | 0.5M betaine0.4M proline | OM betaine0M proline |
2×GC-RICH master mix | 10μl | 10μl |
TGF61\TGF70Primer FR(10μM) | 0.8μl | 0.8μl |
Template | <1μg | <1μg |
ddH2O | 补水至20μl | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置:
3、结果检测:反应结束后取5μl反应产物,琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图4)。
实施例5:
1以人基因组DNA为模板,0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸组合浓度对APOE,JUNB,TGF61和TGF70片段,反应体系为20μl(如反应体系不同,可按此比例增加或减少用量)。
配制的2×GC-RICH master mix含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mMMgCl2,20%甘油(V/V),2%Tween—20(V/V),1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶以及下表浓度的甜菜碱和脯氨酸。
反应组分 | 0.5M betaine0.5M proline |
2×GC-RICH master mix | 10μl |
APOE,JUNB,TGF61和TGF70Primer FR(10μM) | 0.8μl |
Template | <1μg |
ddH2O | 补水至20μl |
2、PCR反应循环的设置:
3、结果检测:反应结束后取5μl反应产物,琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图5)。
根据上述实施例的结果可以看出,本发明的扩增高GC含量片段的专用混合液能协助高GC含量的DNA模板解链,提高引物结合的特异性,从而有助于DNA聚合酶延伸通过二级结构区。应用该缓冲液可以提高核酸扩增保真度,复杂模板的扩增。
Claims (4)
1.一种扩增高GC含量片段的专用混合液2×GC-RICH master mix,其特征在于:该混合液含有40mM Tris-HCl pH8.0,40mM KCl,3mM MgCl2,1-20%甘油,1-2%Tween-20,1mM dNTP,0.1U Taq DNA聚合酶,0.02U pfu DNA聚合酶,0.5-1M甜菜碱和0.2-0.5M脯氨酸。
2.根据权利要求1的混合液,其特征在于:所述混合液含有10%甘油,1.4%Tween-20,0.5M甜菜碱和0.4M脯氨酸。
3.根据权利要求1或2的混合液,其特征在于:所述混合液含有20%甘油,2%Tween-20,0.5M甜菜碱和0.5M脯氨酸。
4.一种权利要求1或2或3的混合液在扩增高GC含量片段中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008101675738A CN101392282B (zh) | 2008-10-13 | 2008-10-13 | 一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2008101675738A CN101392282B (zh) | 2008-10-13 | 2008-10-13 | 一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101392282A CN101392282A (zh) | 2009-03-25 |
CN101392282B true CN101392282B (zh) | 2011-04-27 |
Family
ID=40492793
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008101675738A Expired - Fee Related CN101392282B (zh) | 2008-10-13 | 2008-10-13 | 一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101392282B (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101643762B (zh) * | 2009-09-02 | 2013-05-01 | 陈依军 | 一种用于高gc含量基因的pcr扩增体系及扩增方法 |
CN103443293B (zh) * | 2011-04-06 | 2015-04-08 | 瑞基海洋生物科技股份有限公司 | 聚合酶链式反应用的混合液 |
CN103981172A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-08-13 | 江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司 | 一种用于高gc含量基因的pcr扩增添加剂组合物及高gc含量基因的pcr扩增方法 |
CN105861489B (zh) * | 2016-04-15 | 2017-07-11 | 青岛海大蓝科生物科技有限公司 | 直用型高gc含量核酸pcr扩增混合试剂 |
CN105671033B (zh) * | 2016-04-15 | 2017-07-11 | 青岛海大蓝科生物科技有限公司 | 直用型高保真pcr扩增混合试剂 |
CN106281967A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-01-04 | 周辉 | 一种Taq Plus聚合酶试剂盒及其使用方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1299419A (zh) * | 1998-03-13 | 2001-06-13 | 茵维特罗根公司 | 增强核酸分子合成的组合物和方法 |
CN1548548A (zh) * | 2003-05-20 | 2004-11-24 | 徐定邦 | 含高浓度甘油的pcr和rt-pcr全预混试剂 |
CN1548544A (zh) * | 2003-05-20 | 2004-11-24 | 徐定邦 | 一种使用高浓度甘油的pcr方法及其反应液和应用 |
CN101187633A (zh) * | 2007-12-18 | 2008-05-28 | 中国农业大学 | 一种双链核酸精确定量的方法 |
-
2008
- 2008-10-13 CN CN2008101675738A patent/CN101392282B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1299419A (zh) * | 1998-03-13 | 2001-06-13 | 茵维特罗根公司 | 增强核酸分子合成的组合物和方法 |
CN1548548A (zh) * | 2003-05-20 | 2004-11-24 | 徐定邦 | 含高浓度甘油的pcr和rt-pcr全预混试剂 |
CN1548544A (zh) * | 2003-05-20 | 2004-11-24 | 徐定邦 | 一种使用高浓度甘油的pcr方法及其反应液和应用 |
CN101187633A (zh) * | 2007-12-18 | 2008-05-28 | 中国农业大学 | 一种双链核酸精确定量的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101392282A (zh) | 2009-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101392282B (zh) | 一种扩增高gc含量片段的pcr专用混合液及其应用 | |
Madi et al. | The determination of tissue‐specific DNA methylation patterns in forensic biofluids using bisulfite modification and pyrosequencing | |
CN101952461B (zh) | 用于检测核糖核酸的组合物、方法和试剂盒 | |
CN105358714B (zh) | 从含有少量靶标dna的样品富集dna测序文库 | |
CN110699426B (zh) | 基因目标区域富集方法及试剂盒 | |
CN105603535B (zh) | 构建dna文库的试剂盒和方法 | |
WO2007149789A3 (en) | Conversion of target specific amplification to universal sequencing | |
WO2009102896A3 (en) | Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions | |
US20090325183A1 (en) | Sequencing methods | |
WO2018196763A1 (zh) | 一种去除rna样本中非目标rna的方法 | |
CN104263726A (zh) | 适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法 | |
WO2009045067A3 (en) | Primers for pcr amplification comprising abasic parts within the primer sequences | |
CN107904667A (zh) | 一种新型甲基化建库试剂盒及其应用 | |
CN104428415A (zh) | 5’保护依赖性扩增 | |
EP2559774A1 (en) | Improved method for amplification of target nucleic acids using a multi-primer approach | |
US20240117343A1 (en) | Methods and compositions for preparing nucleic acid sequencing libraries | |
CN102534004B (zh) | 用于多重连接扩增技术的探针制备方法 | |
CN108166068A (zh) | 一种新型dna建库试剂盒及其应用 | |
Brouilette et al. | A simple and novel method for RNA‐seq library preparation of single cell cDNA analysis by hyperactive Tn5 transposase | |
CN105861489B (zh) | 直用型高gc含量核酸pcr扩增混合试剂 | |
CN105274629B (zh) | 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 | |
CN109563530A (zh) | 乳液中的RNase H突变体 | |
CN114277447A (zh) | 靶序列随机sgRNA全覆盖组的制备方法 | |
CN106591287A (zh) | 一种聚合酶链式反应增强的方法 | |
CN108166069A (zh) | 一种新型甲基化建库方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110427 Termination date: 20141013 |
|
EXPY | Termination of patent right or utility model | ||
DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Yu Ping Document name: Notification of Termination of Patent Right |