CN1237186C - 有效检测丙型肝炎病毒(hcv)的寡核苷酸引物及其应用方法 - Google Patents

有效检测丙型肝炎病毒(hcv)的寡核苷酸引物及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本文描述了检测取自人类受试者生物样品中的丙型肝炎病毒RNA的方法和试剂盒。本发明包括用于扩增来源于HCV RNA的DNA的新型扩增引物和探针，以及与这种新型引物相关的试剂盒和方法。

Description

有效检测丙型肝炎病毒(HCV) 的寡核苷酸引物及其应用方法
技术领域
本发明涉及检测生物样品中核酸序列，特别是来源于传染性微生物的序列的改良的方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是引起大多数输血后肝炎病例和全世界大部分偶发(或者群体获得性)肝炎病例的一种不经过肠胃传染的病毒。据估计世界人口的1％以上感染了HCV。急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌都与HCV感染相关。
当前HCV分类为一个单独的属，即黄病毒科中的Hepacivirus。其基因组由大约9,500个核苷酸的一个正链RNA分子构成，其中含有一个编码大约3,000个氨基酸聚多蛋白前体的大的单一开放式阅读框架(ORF)。在该大的开放式阅读框架之前加上一个大约340核苷酸的5’-非编码区(NCR)，这是基因组中最保守的区域。ORF的5’区域编码(5’→3’方向)一个衣壳蛋白，二种包膜糖蛋白(E1和E2)以及一种未知功能的小蛋白(P7)。ORF的3’部分编码非结构蛋白，包括一种蛋白酶，蛋白酶/解旋酶双功能蛋白，RNA聚合酶和调节肽。在3’端亦包含一个NCR。
分析取自世界各地的HCV编码序列揭示不同的病毒分离株间具有显著的序列差异。进一步分析不同病人的HCV序列显示病毒以所谓的含有相关但不相同序列的“准种(quasi-species)”而传播。据认为在分离株间和不同病人间存在的差异是病毒编码的依赖RNA的RNA聚合酶低保真度的结果。HCV的遗传变异性程度对预防、诊断和控制感染具有重要影响。
HCV感染典型的血清学诊断是通过可商业化购得的检测结合重组HCV蛋白或肽的酶免疫分析法(EIA)而进行测定。阳性EIA结果可由一种重组免疫印迹分析法(RIBA)证实，但EIA和RIBA分析法都不能辨别过去的和现在的感染。由于传染病毒的典型低滴度，还没有成功地开发出一种直接分析病毒蛋白的方法。此外，基于抗体的分析法没有检测出一般暴露2-3个月后的HCV感染。
因此，该领域需要改进的灵敏分析HCV方法，足以检测病人接触HCV最初几天内的HCV病毒血症。
发明内容
首先，本发明涉及一种检测生物样品中HCV RNA存在的方法。该方法包括：
(A)用样品来源的模板RNA进行逆转录反应以产生HCV特异的逆转录产物。
(B)用HCV特异性的一对或多对寡核苷酸引物扩增逆转录产物而产生HCV特异性扩增产物。
其中每对包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID NO.3>；
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，
(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287P27)<SEQ ID No.6>，
(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>：
(c)检测扩增产物
检测到扩增产物表明样品中存在HCV RNA。
另一方面，本发明涉及一种扩增HCV DNA的方法。该方法包括：
(A)用HCV特异的一对或多对寡核苷酸引物对含有HCV DNA的DNA样品进行PCR以产生HCV特异性扩增产物。
其中每对引物包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3，(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，
(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，
(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>。
第三，本发明涉及一种检测生物样品中HCV RNA存在的方法，该方法包括：
(A)用来源于样品的模板RNA进行逆转录反应以产生HCV特异性的反转录产物。
(B)用正向引物和反向引物扩增逆转录产物以产生HCV特异性扩增产物。
这里，正向引物包括寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>；反向引物包括寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>
(C)检测扩增产物
这里，检测到扩增产物表明样品中存在HCV RNA。
第四，本发明涉及一种扩增HCV DNA的方法。该方法包括：
(A)用正向引物和反向引物对含有HCV DNA的DNA样品进行PCR以产生HCV特异性扩增产物。
这里，正向引物包括寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3'(1F27)(SEQ ID No.8)和反向引物包括寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>
第五，本发明涉及一种检测生物样品中HCV RNA存在的方法。该方法包括：
(A)用来源于样品的模板RNA进行逆转录反应以产生HCV特异性逆转录产物。
(B)用HCV特异的一对或多对5’NCR寡核苷酸引物和一对或多对3’NCR寡核苷酸引物扩增逆转录产物以产生HCV特异性扩增产物。
这里，每对5’NCR寡核苷酸引物包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；
(b)选自以下序列的反向引物
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，
(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，
(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；
这里每对3’NCR寡核苷酸引物包括一个含有寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>的正向引物和含有寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNo.9>的反向引物。
(c)检测扩增产物
这里，检测到扩增产物表明样品中存在HCV RNA。
第六，本发明涉及一种扩增HCV DNA的方法。该方法包括：
(A)用一对或多对HCV特异的5’NCR寡核苷酸引物和一对或多对3’NCR寡核苷酸引物对含有HCV DNA的DNA样品进行PCR以产生HCV特异性扩增产物。
这里，每对5’NCR寡核苷酸引物包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<SEQ ID No.2>，
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；
(B)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，
(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，
或(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>；
这里，每对3’NCR寡核苷酸引物含有一个寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQID No.9>组成的反向引物。
在进行逆转录反应方法的具体例子中，采用随机的寡核苷酸引物进行逆转录反应；或者用HCV特异性的一个或多个逆转录引物，例如具有相应于HCV RNA序列的寡核苷酸。检测扩增的方法包括但不限于：(a)电泳、(b)在附着有HCV特异性探针的固相载体上俘获扩增产物，接着用比色分析法定量所结合的产物。
此外，本发明涉及一种扩增来源于HCV RNA的HCV DNA的试剂盒。该试剂盒包含一对或多对5’NCR寡核苷酸引物，这里，每对5’-NCR寡核苷酸引物包括：
(a)选自以下序列的正向引物
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；
(b)选自以下序列的逆向引物
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，
(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，
(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATC-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>。
另一方面，本发明涉及一种扩增来源于HCV RNA的HCV cDNA的试剂盒。该试剂盒包含一对或多对3’NCR寡核苷酸引物，这里每对3’NCR寡核苷酸引物包括一个寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACT-3’(1F27)<SEQID No.8>组成的正向引物和一个寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物。
另一方面，本发明涉及一个检测HCV DNA存在的试剂盒。该试剂盒包括一对或多对5’NCR寡核苷酸引物，每对5’NCR寡核苷酸引物包含：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>，
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，
(iii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>，
(iv)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>。
另一方面，本发明涉及一种检测HCV RNA存在的试剂盒。该试剂盒包括一对或多对3’NCR寡核苷酸引物，每对3’NCR寡核苷酸引物包括一个寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物。
本发明揭示用与HCV RNA中某序列具有序列互补的寡核苷酸作扩增引物来检测生物样品中HCV RNA更为有效。本发明提供了一种检测低拷贝HCV RNA的改进的单轮逆转录/扩增分析法。根据序列保存的理论价值、分子内和分子间相互作用、扩增子和周围序列预测的次级结构而选择寡核苷酸引物。此外，引物和分析系统的设计要允许HCV基因组的多个区域、多种病毒和一个内部阳性对照(IPC)RNA(或DNA)一起共扩增(或检测)。HCV基因组多个区域的同时扩增/检测增加了分析的灵敏性，而一种IPC的共扩增降低了由于PCR抑制产生错误阴性结果的可能性。
实施本发明中应用了许多分子生物学、微生物学、重组DNA和蛋白质生物化学方面的技术，例如在以下书目中都有说明。
Current Protocols in Molecular Biology，VolumesI，II，and III，1997(F.M..Ausubel ed.)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II，1985(D.N.Glover ed.)；Oligonucleotide Synthesis，1984，(M.L.Gait ed.)；Transcription and Translation，1984(Hames and Higgins eds.)；A Practical Guideto Molecular Cloning；the series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；and Protein Purification：Principles and Practice，Second Edition(Springer-Verlag，N.Y.).
这里所用的“核酸”或“多核苷酸”涉及任何长度的含嘌呤和嘧啶的多聚体，或是多核糖核苷酸，或是多脱氧核糖核苷酸，或者混合多核糖一多脱氧核糖核苷酸。这涉及单链和双链分子，例如DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂合物，以及碱基共轭结合到氨基酸骨架形成的“蛋白核酸”(PNA)。同时也涉及含有修饰喊基的核酸。
这里所用的核酸序列的“互补”涉及参与和原始序列以Watson-Crick碱基配对的反义序列。
这里所用的“引物”是一个长度约为10～50核苷酸的分离的寡核苷酸，优选长度约为12～25核苷酸，最佳长度约为12～18核苷酸，并与需要的单链核酸序列形成双链体，允许用逆转录酶或DNA聚合酶聚合互补链。
这里所用的“分离的”核酸涉及一种与其原初环境不同的组分(例如，如果是自然发生的就指其自然环境，如果是合成的就指其反应混合物)。一种分离的核酸含有与其最初联系在一起成分的典型含量少于约50％，优选其含量少于约75％，最佳含量少于约90％。
来源于一个设计序列的核酸序列涉及相应于设计序列一个区域的序列。这包括与该序列同源或互补的序列。
一种内阳性对照(IPC)靶核酸涉及克隆到随后由特定的限制性内切核酸酶作用而线性化的质粒载体中的一个合成核酸序列。一种IPC具有包围一般结合探针区域的多个引物结合序列，并作为在核酸扩增反应中错误阴性结果的一般对照。
优选的内阳性对照靶DNA序列为：
5′-
CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCA
TAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTG
TATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGT
G-3′
<SEQ ID NO.10>.
这里或随后公开的任何序列的核酸都可用常规方法制备。例如，用亚磷酰胺固相载体方法或其它熟知方法化学合成DNA，参考Matteucci et al.，1981，J.Am.Chem.Soc.103∶3185；Yoo et al.，1989，J.Biol.Chem.764∶17078。也可用该领域熟知的许多方法修饰核酸。这种修饰化的非限制性实例包括甲基化，“加帽子结构”，用类似物替代一个或多个自然发生的核苷酸，以及核苷酸间的修饰，例如，不带电键合(如，甲基磷酸酯，磷酸三酯、磷酸酰胺，氨基甲酸酯，等)或带电键合(如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)。核酸可能含有一个或多个附带共价结合部分，如，蛋白质(例如，核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚-L-赖氨酸等)，嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素，等)，螯合剂(例如，金属，放射金属，铁，氧化金属，等)，以及烷化剂。PNAs也包括在术语“核酸”范畴。核酸可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基磷酰安键而衍生化。此外，本发明的核酸序列也可以用提供直接或间接检测信号的标记进行修饰。典型的标记包括放射同位素、荧光分子、生物素等等。
这里所用的扩增涉及一种拷贝核酸的重复过程。合适的扩增方法包括不受限制的PCR，连接酶链式反应，链置换扩增，转录介导扩增，以及核酸单碱基扩增。
本发明提供检测生物样品中HCV的方法。方法如下进行：
<i>用内含有的或来源于样品的RNA作模板进行逆转录反应。
<ii>用具有相应于HCV RNA的5’或3’非编码区序列的扩增引物对来扩增逆转录产物，以产生HCV特异性扩增产物。
<iii>检测HCV特异性扩增产物。检测HCV特异扩增产物表明样品中HCV RNA的存在。
根据本发明，可用任何常规方法从病人获取生物样品。合适的生物样品不受限制，包括：血液，血清，血浆，尿，乳汁，脑脊液。优选血浆用作HCV RNA的来源。
生物样品用任何方法处理，为样品含有的RNA，特别是HCV RNA提供进行逆转录的试剂。来源于生物样品的RNA是最初存在于样品的任何RNA，并通过处理样品而获得。优选地，用该领域熟知的方法从样品中提取RNA，例如，用硫氰酸胍或可商业购得试剂的方法，以及采用Gentra系统的Purescript方法(Minneapolis MN)。能从Rnases，其它蛋白质和/或其它可能干扰逆转录的成分中分离出RNA的任何提取步骤都可应用。
然后对样品进行逆转录，采用(a)随机引物，例如从Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey得到的随机六聚体引物，和/或(b)来源于HCV RNA基因组序列5’或3’NCRs的引物。用常规程序完成逆转录，例如下列文献描述的方法，Current Protocols in Molecular Bidogy，Volumes I，II，III，1997(F.M.，Ausubel ed.)；U.SPatent 5,322,770；Young，et al.，J.Clm.Microbidl.31(4)∶882(1993)；Myers et al.，Biochemistry 30(3)∶7661(1991)。本发明中采用的适用于逆转录引物的其它引物和逆转录方法包括美国专利申请号为No.09/＿＿，受理号为2904/OE287的专利中的描述。
逆转录反应后进行产物扩增。任何扩增方法都可不受限制地采用，包括，PCR，连接酶链式反应，链置换反应，核酸单碱基扩增，以及转录介导扩增。优选采用PCR。典型地，含有PCR所有需要成分的反应混合物直接加到逆转录反应混合物中。然后采用所用引物对在特异性条件下进行扩增。
本发明公开了特别有利于检测病人样品中HCV RNA的一些HCV特异性扩增引物。来源于HCV基因组5’NCR的有用的引物的非限制实例包括下面表1所列举的例子。
  表1
  引物   序列  位置   S*  SIN**
  C69t28   5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’  69-96   S  1
  C131F25   5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’  131-155   S  2
  C143R26   5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’  143-168   S  3
  C133F26   5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’  133-158   AS  4
  C282R26   5’-GCAAGCACCCTACATCAGGCAGTACCACA-3’  282-308   AS  5
  C287R27   5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’  287-313   AS  6
  C294R25   5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’  294-318   AS  7
*标准取向：S＝有义；AS＝反义；**SEQ ID No.
任何组合的有义和反义寡核苷酸者阿分别用作正向和反向扩增引物。优选的用于扩增的5’NCR引物对包括：
(a)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’<SEQ ID No.1>，
   5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’<SEQ ID No.4>；
(b)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’<SEQ ID No.2>，
   5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’<SEQ ID No.7>。
在一个优选实例中，扩增引物对由5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’<SEQ ID No.1>和5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’<SEQ ID No.4>组成。在另一个优选实例中，扩增引物对包括5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’<SEQ ID No.2>和5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’<SEQ ID No.7>。
来源于HCV基因组3’NCR的有用引物的非限制实例涉及一个5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物。
本发明也包括多重扩增，即在同一反应混合物中用不同组引物同时扩增不同序列。能同时用于多重扩增反应的优选引物对是：
(a)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’<SEQ ID No.2>，
   5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(5’对)<SEQ ID No.7>；
(b)5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’<SEQ ID No.8>，
   5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(3’对)<SEQ ID No.9>。
扩增后接着不受限制地用该领域任何方法检测扩增产物，包括，琼脂或丙烯酰胺凝胶电泳；非同位素比色检测，如SureCell系统(见实施例1)；Eci检测；荧光和化学发光。这类检测方法所用试剂可从很多地方得到，例如，Molecular Probe，Eugene，Oregon and Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY。
检测HCV特异性扩增产物表明样品中HCV RNA的存在。当用凝胶电泳时，与相应于反应用到的扩增引物序列的HCV RNA定位预测相同，根据其大小来证实HCV特异性扩增产物。用于比色检测的HCV特异性5’NCR捕捉探针包括但不限于5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’<SEQ ID NO.11>，5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’<SEQ ID No.12>，5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’<SEQ ID No.13>。有用的HCV特异性的3’NCR捕捉探针包括但不限于5’-GCGGCTCACGGACCTTTCAC AGCTA-3’<SEQ ID No.14>和5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’<SEQ IDNo.15>。
制备扩增来源于HCV RNA的HCV DNA试剂盒，使其含有一对或多对正向和反向5’NCR寡核苷酸引物，正向引物可以是5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>或5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>，反向引物可以是5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ IDNo.4>，5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>，5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>，或5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<SEQ IDNo.7>。
来源于HCV RNA的HCV DNA扩增试剂盒也可以制备成含有一对或多对正向和反向3’NCR寡核苷酸引物，其中正向引物可能是5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>，反向引物可能是寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ IDNo.9>。
检测HCV DNA存在的试剂盒，包括上述用于扩增来源HCV RNA的HCVDNA的5’和3’NCR引物也属于本发明范围之内。
本试剂盒附含用于逆转录、扩增和产物检测的试剂和指导。例如，试剂盒可含有逆转录酶，脱氧核苷酸，适用于DNA扩增反应的热稳定聚合酶以及用于标记和检测核酸的试剂。
本发明可用于病人HCV感染的诊断，检验抗HCV治疗方案的功效，以及筛选提供感染HCV样品的血液。
具体实施方式
下列实施例没有限制地阐述了本发明。
实施例1：生物样品中HCV的检测：5’HCV扩增引物和Roche Amplicor HCV鉴定的比较。
进行下列实验以比较本发明和Roche Amplicor系统的HCV鉴定。
A方法：
1.样品制备：
用Pure Script RNA分离试剂(Gentra Systems，Minneapolis MN)从血浆样品中制备RNA。修改厂商的用体液制备方案，包括，用40克糖原而不是用20克糖原作为载体以辅助沉淀病毒RNA。此外，大多数情况下，用异丙醇沉淀RNA并用乙醇洗涤RNA沉淀之后，RNA沉淀再悬浮到RT缓冲混合液中，而不是悬浮到厂商提供的RNA水合溶液中。
2.逆转录
在下述溶液中加入100u重组莫洛尼鼠类白血病毒(M-MLV)逆转录酶(RT)(Gibco BRL，Gaithorsburg Maryland)催化由RNA合成cDNA，50mL溶液组成是：50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCL,3mM MgCl2，10mM DTT，0.4mM各种dNTP(Pharmacia Biotech)，4mM随机六聚体(Pharmacia Biotech, Piscataway，NJ)或特异性逆转录引物，以及用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过水中的20Units RNasin(Promega，Madison，Wisconsin)。在42℃培育30分钟后，RT反应在100℃持续5分钟以破坏RT活性。每个反应冷却1分钟，然后在16000xg微量离心4秒钟。
3.PCR扩增：
在PE9600热循环仪(Perkin-Elmer)中以100ml下述溶液进行PCR，25mMTris-HCl，3mM MgCl2，0.725mM EDTA，54mM KCl，3.72mM NaCl，40mM DTT，108mg/mL明胶(IV号)，9.5％甘油，0.02％吐温20，0.02％NP40，小牛胸腺DNA(2μg)，1.2mM各种dNTP，0.4mM各种引物，10拷贝线性化内阳性对照(IPC)质粒DNA，以及16u的Taq聚合酶。用美国专利5,338,671公开的制备方法制取的Taq的单克隆抗体TP1-12和TP4-9分别以50∶1和5∶1摩尔比加入到反应中，提供抗体和Taq聚合酶为55∶1的摩尔比。经96℃初始变性3分钟后，在96℃保温5秒钟，在68℃保温40秒钟进行扩增40循环。循环结束后，在103℃热处理5分钟使Taq聚合酶失活。所用的引物如下表2所示：
  表2
  引物   序列  位置   S*  SIN**
  C69f28   5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’  69-96   S  1
  C131F25   5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’  131-155   S  2
  C143R26   5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’  143-168   S  3
  C133R26   5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’  133-158   AS  4
  C282R26   5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’  282-308   AS  5
  C287R27   5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’  287-313   AS  6
  C294R25   5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’  294-318   AS  7
*标准取向：S＝有义；AS＝反义；**SEQ ID No.预期的产物大小在下面表3中显示。
  表3
  正向   反向   产物大小(bp)
  C69F28   C133R26   90
  C131F25   C294R25   188
  C143F26   C282R27   166
  C143F26   C282R27   171
4.PCR产物的检测
在扩增过程中，用5’-生物素标记引物(有义链)使PCR产物生物素化。用共价附着于乳汁颗粒的寡核苷酸探针杂交而捕获产物，在流动膜表面上沉积下来(Sure Cell tests，Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY)，该探针是，5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(标示为C96-27-PRB)<SEQ IDNo.11>；5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'(标示为C252-27-PRB)<SEQ ID No.12>；5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(标示为C252-25-PRB)<SEQ ID No.13>。用催化一种染料前体氧化成染料(蓝色)的链霉抗生物素(SA)-辣根过氧化酶(HRP)偶联物与探针/产物复合物反应。色强度与颜色标准比较将蓝色强度直观地做记号(0-10)。所有的视觉颜色记号大于3才视为阳性结果。
5.Roche Amplicor鉴定：
Roche Amplicor鉴定(Roche Diagnostics，Kaiseraugst，Switzerland)按照厂商说明实行。
B：结果：
一组来自巴西和埃及病人的42个样品用上述方法检测HCV。其中有些样品也用Chiron B-DNA分析方法作了检测。预期巴西样品比美国样品含有更大比例的HCV基因型3，而埃及样品主要含有HCV基因型4，这种基因型在美国很少发现。
所有反应都一式二份进行。阳性记录表明二个反应都呈阳性。结果如下表4所示：
用本发明5’NCR引物和Roche检测系统所得结果比较总结于下表5和表6：
表5
                                                                                                          Roche Amplicor+                -
  21   5
  0   16
+C131/C294 -(长产物)
表6
                                                                                                           Roche Amplicor+         -
  21   11
  0   10
+69F/133R   -(短产物)
本发明的各种引物都比Roche Amplicor检测的灵敏度高。采用引物对69F/133R给出最高灵敏度。用Roche amplicor检测呈阴性的五个样品，采用本发明的C131/C294引物对检查则呈阳性；而Roche amplicor检测呈阴性的11个样品，用本发明69F/133R引物对检查呈现阳性。此外，用Chiron bDNA检测法查出带有病毒的所有样品，用本发明的引物都能检测到，而用Roche Amplicor检测法检查不出其中的三个样品。按本发明方法检测，没有一个阴性对照呈现成阳性。
在第二组实验中，用Roche Amplicor检测法和本发明的引物检查了取自巴西的150个血浆样品，这些样品以前检测为HCV抗体阳性。下列表7和表8给出了基于SureCell颜色记录的结果。每一个反应产物都进行凝胶检查以证实结果。每组引物都包含阴性对照(散布于临床样品中)，阴性对照含有阴性血浆样品和水(无RNA)。所有阴性对照结果都是阴性。
表7
                                                                                                            Roche Amplicor+         -
90 4
  0   56
+131F/294R   -
表8
                                                                                                        Roche Amplicor+         -
  90   7
  0   53
+69F/133R    -
本发明的两个5’NCR引物对都比Roche检测系统的灵敏度更高。采用69F/133R引物对获得最高灵敏度，与C131/C294引物对相比，检测出另外三个样品中HCVRNA的存在。
实施例2：5’NCR HCV检测法灵敏度的分析。
用本发明的’NCR引物对进行下列实验以检验HCV检测方法的灵敏度。
1.根据HCV RNA的理论拷贝数稀释三个病人的样品，并用Roche Amplicor系统和本发明的引物对分析HCV RNA。结果如下表9所示：
  表9
  理论拷贝数/ml   RocheAmplicor  5’NC131F/294R
  JJCD密码
  A1   500   +  +
  A2   100   +  +
  A3   10   -  +
  A4   5   -  +
  A5   1   -  -
  B1   500   +  +
  B2   100   +  +
  B3   10   +  +
  B4   5   +  +
  B5   1   +  +
  C1   500   +  +
  C2   100   +  +
  C3   10   -  +
  C4   5   -  +/-
  C5   1   -  -
这三组稀释病人样品，用本发明的5’NCR引物分析比用Roche检测法分析的灵敏度更高。
2.用HCV阴性血浆稀释已知为HCV阳性血浆，并用上述方法检测。一种内部阳性对照(IPC)质粒以10拷贝/反应加入到反应混合物中。结果(五个实验汇编)如下表10所示。
  表10
  5’NC         IPE
  拷贝/ml   n   拷贝/rxn.   ％阳性结果   ％阳性结果
  1000   24   50   100％   100％
  200   24   10   100％   100％
  100   59   5   100％   100％
  20   64.   1   69％   100％
正如Poisson分布分析所预测，C131F/C294R 5’NCR引物对具有极好的灵敏度，即便每个PCR反应少到单个病毒粒子也能检测到。
3.来自带有少量HCV病毒(范围＝316-8080拷贝/ml，相应于16-404拷贝/PCR反应)病人的十八份病人的样品，在该检测中有十七个样品呈阳性。
实施例3：生物样品中HCV的检测：3’NCR HCV扩增引物和Roche Amplicor HCV分析的比较。
用Roche Amplicor鉴定和用本发明的3’NCR引物检查取自巴西的150份血浆样品，这些样品以前检测为HCV抗体阳性。如实施例1所述方法进行逆转录和扩增。用序列为5’GTATCAGCACTC-3’<SEQ ID No.16>的引物进行逆转录，用X1F27/57R27引物对进行扩增。每个反应含有质粒DNA的内阳性对照(IPC)。用Sure Cell系统，用一种捕获探针3X30PRB25检测扩增产物。每个反应的产物都进行凝胶检测以证实结果。含有阴性血浆样品和水(无RNA)的阴性对照(散布于临床样品)都被涉及到，在RT-PCR中都呈阴性。用本发明引物和Roche分析系统所得结果的比较总结于表11。
表11
                                                                                        ROCHE AMPLICOR+                        -
  85   0
  3   62
1F 27/57R2      +3’试验         -
实旋例4：生物样品中HCV的检测：本发明和Rochester综合医院(RGH)5’NCR嵌套式PCR分析法的比较。
进行下列实验以比较本发明3’NCR HCV引物和RGH嵌套式PCR检测系统。
用57R27引物逆转录八十三份血浆样品，用3X1F27/57R27引物对采用实施例1所述方法对逆转录产物进行扩增。每个反应产物进行凝胶检测以证实结果。含有阴性血浆样品和水(无RNA)的阴性对照(散布于临床样品)也被涉及，在该检测中都呈阴性。
用本发明引物和Roche分析系统所得结果的比较总结于表12。
表12
                                                                                  5’嵌合试验(RG)+                     -
  56   1
  1   25
1F 27/57R2    +3’试验       -
这些结果表明本发明的检测系统比RGH嵌套式PCR系统更加灵敏而特效。按本发明的分析与RGH分析的26个阴性样品中的25个结果相符。本发明的好处在于比进行嵌套式PCR的样品遗留可能性更小，因为对于后者，在反应过程中必须打开试管以添加新试剂。上述显示错误阴性结果的单个样品可能是嵌套式PCR方案引起的样品遗留的例证。
实施例5：3’NCR HCV分析法的拷贝灵敏性
进行以下实验以测定本发明3’NCR HCV分析法的检测灵敏性。
已有Roche Monitor和Chiron B-DNA分析方法检测HCV的血浆样品，获自Boston Biomedica，Inc.，制备RNA，稀释到含有20-1000拷贝HCV RNA/ml，并用实施例1所述方法进行逆转录和扩增。用66RT(12聚体)引物(表13)或57R27(27聚体)引物(表14)进行逆转录，分别以1F27和57R27作正向和反向引物进行PCR。在该分析中加进内阳性对照(IPC)引物，导致每个样品的阳性记录。以基于凝胶带和用3X-30PRB25作捕获探针的Surecell呈阳性的样品百分率来表示所得结果。
  表13
  n  拷贝数/ml 拷贝数/rxn.  ％阳性结果
  16  1000 50   100％
  16  200 10   88％
  57  100 5   49％
  64  20 1   20％
  表14
  n   拷贝/rxn   平均可见色   ％阳性结果
  9   50   8   100％
  10   10   8   100％
10 0 0 0％
3’NCR HCV分析方法检测1000病毒拷贝/ml·100％时间，和200拷贝/ml·88-100％时间。对于100拷贝/ml，在大约50％样品中检测到病毒(用一种12聚体RT引物时)。Poisson分布预测对于1拷贝/反应(20病毒粒子/ml)，阳性结果频率应大约为60％。对于这种水平的病毒只检测出20％，可能是由于并非在每个病毒粒子都存在HCV的3’-NCR，或者是由于在用短(12聚体)逆转录引物作检测时引起灵敏度降低。对同一样品用5’NCR引物进行逆转录/扩增检测，导致较高水平地检测到20拷贝/ml样品，从而有力地支持了后一种解释。这些结果表明采用较长(27体)引物进行逆转录可以增加3’NCR检测的灵敏度(如表13、表14，分别用12-聚体和27聚体引物对10拷贝/rxn检测的比较)。
实施例6：具有不同HCV基因型病人样品的分析
进行下列实验以评定对不同基因型HCV的检测。
1.基因型范围
黑猩猩血浆，代表各种基因型HCV，获自NIH。按实施例1所述方法制备并处理血浆。5’NCR引物是C131F和C294R(分别为正向和反向引物)，3’NCR引物是1F27和57R27(分别为正向和反向引物)，在4％琼脂凝胶上用溴化乙锭染色分析PCR产物得出结果。根据重复样品得到阳性结果。结果见下表15(用5’NCR引物)和表16(用3’NCR引物)所示。
  表15
  基因型   菌株   ％阳性结果
  1a   H77   +
  1b   H-J4   +
  2a   H-J6   +
  2b   C-J8   +
  3a   S52   +
5a SA13 +
  表16
  n   基因型   菌株  #拷贝数/rxn   ％阳性结果
  4   1a   H77  100   100％
  4   1b   H-J4  100   100％
  4   2a   H-J6  100   100％
  4   2b   C-J8  100   100％
  4   3a   S52  100   100％
  4   5a   SA13  100   100％
2.病人样品
用C131F和C294R引物采用上述方法分析二十七个没有稀释已知基因型的病人样品。采用SureCell检测以证实结果(分别用C252-PRB25和IPC-1P作为捕获探针HCV及IPC产物)。本组涉及受HCV基因型1到4以及6感染的典型的血浆样品。病人样品取自各种不同的地理区域(苏格兰、突尼斯，沙特阿拉伯以及香港)。每个样品进行一式二份检测(例如，检测6个基因型1样品)。
本发明的引物系统能够扩增本组涉及的所有基因型样品。C131F25/C294R25引物鉴定了当今所有HCV基因型(基因型1-6)。
3.低拷贝数样品：
采用Roche Monitor分析法定量含有不同基因型HCV的样品(基因型1-6，获自美国、苏格兰，突尼斯，沙特阿拉伯和香港)，稀释到50病毒拷贝/PCR反应(1000拷贝/ml)，并用上述C131F和C294R引物进行检测。
用本发明的引物检测所有样品。
实施例7：用5’和3’扩增引物对进行多重分析
进行下列实验以分析在单个反应混合物中同时扩增HCV基因组的5’NCR和3’NCR区域的效果。
A：与Roche Monitor分析比较：
检测含有相当于45和170,000病毒拷贝/反应的73份病人样品。这些样品取自己知感染了HCV并用干扰素治疗过的病人。结果，一些病人很少或者没有循环病毒。用5’NCR引物对131F/294R和3’NCR引物对1F27/57R27以及IPC引物以多重方案对该组进行检测。整个检测样品中安置阴性临床样品。所有的阴性都导致RT-PCR阴性。所得结果与用定量Roche Monitor分析所得结果比较(Roche诊断法，Kaiseraugst，瑞士)。结果总结于下表17。
表17
                                                                                          ROCHE监视器+                                 -
  60   1
  0   12
多重试验      +-
用本发明的5’和3’NCR引物对，对于按Roche Monitor结果检测不出的另一个样品，可以用5’NCR和3’NCR分析检测到，这表明在分析带有低量病毒样品时用本发明的引物分析比Roche分析法灵敏度更高。用Roche分析法检测不出的阳性样品，用另一5’NCR引物69F/133R得到了证实。
B：与Roche Amplicor分析法比较：
用5’引物对131F/294R和3’引物对1F27/57R27以多重方案检测了十六份病人样品，这些样品用重组免疫印迹分析法(RIBA)检测不出来。该结果与用定性Roche Amplicor分析所得结果作了比较。结果总结于下表18。
表18
                                                                                      ROCHE AMPLICOR+                     -
  4   0
  0   12
多重试验   +-
本发明分析法与Roche分析结果完全一致。用单个RNA提取物进行的所有PCR反应都是一式二份。以另一组5’NCR引物(69F/133R)进行扩增来证实阴性结果。所有阴性都重复检测以证实真实的阴性结果。
上面提及的所有专利、申请、论文、出版物及检测方法在这里都完整地作为参考文献而引用。熟悉该领域的技术人员可以根据以上具体描述对本发明进行一些变更。这种明显的变更都在附加权利要求的所有预期范围内。

Claims (45)

1、一种检测生物样品中丙型肝炎病毒(HCV)RNA存在的方法，该方法包括：
(A)用来源于所说样品的RNA作为模板进行逆转录反应以产生HCV特异性逆转录产物；
(B)用HCV特异的一对或多对寡核苷酸引物扩增所说的逆转录产物，以产生HCV特异性扩增产物，
其中所说引物对包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>；
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQID No.2>；
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>；
(ii)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQID No.7>：
(iii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>；
(iv)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>；和
(C)检测所说的扩增产物，
其中检测到所说扩增产物表明所说样品中HCV RNA的存在。
2、一种如权利要求1所限定的方法，其中所说逆转录反应采用随机寡核苷酸引物进行。
3、一种如权利要求1所限定的方法，其中所说逆转录反应采用具有相应于HCV RNA序列之序列的一个或多个寡核苷酸引物进行。
4、一种如权利要求1所限定的方法，其中所说的扩增用选自下述的方法进行：PCR、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。
5、一种如权利要求1所限定的方法，其中所说的检测包括用凝胶电泳显示所说的扩增产物。
6、一种如权利要求1限定的方法，其中所说的检测包括在含有一个或多个HCV特异寡核苷酸探针的固相支持物上俘获所说的扩增产物，以及用比色分析法定量所说的俘获产物。
7、一种如权利要求6限定的方法，其中：
(a)当所说的正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自以下序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNo.12>；以及
(b)当所说的正向引物是(C69F28)时，其中所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNo.11>。
8、一种如权利要求1限定的方法，其中所说的样品选自血液、血清、血浆、尿、唾液和脑脊液。
9、一种扩增HCV DNA的方法，所说方法包括：
(A)用一对或多对HCV特异的寡核苷酸引物对含HCV DNA的DNA样品进行PCR，以产生HCV特异的扩增产物，其中所说引物对包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQID No.2>，和
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；和
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQID No.7>，
(iii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，和
(iv)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>。
10、一种如权利要求9限定的方法，还包括：
(B)检测所说扩增产物，
其中检测到所说扩增产物表明所说样品中HCV DNA的存在。
11、一种如权利要求10限定的方法，其中所说的检测包括通过凝胶电泳显示所说的扩增产物。
12、一种如权利要求10所限定的方法，其中所说的检测包括在含有一个或多个HCV特异寡核苷酸探针的固相支持物上俘获所说的扩增产物，以及用比色分析法定量所说的俘获产物。
13、一种如权利要求10所限定的方法，其中：
(A)当所说的正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自以下序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNo.12)；和
(b)当所说的正向引物是(C69F28)时，其中所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNo.11>。
14、一种检测生物样品中HCV RNA存在的方法，所说方法包括：
(A)用来源于所说样品的RNA作为模板进行逆转录反应以产生HCV特异的逆转录产物：
(B)用一对HCV特异的5’NCR寡核苷酸引物和一对3’NCR寡核苷酸引物扩增所说的逆转录产物以产生HCV特异的扩增产物，
其中所说的5’NCR引物对包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQID No.2>，和
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；和
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQID No.7>，
(iii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，和
(iv)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQID No.6>；其中，所说的3’NCR寡核苷酸引物对包括一个由寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个由寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物，
(C)检测所说的扩增产物，
其中检测到所说的扩增产物表明所说的样品中HCV RNA的存在。
15、一种如权利要求14限定的方法，其中所说的逆转录反应用寡核苷酸随机引物进行。
16、一种如权利要求14限定的方法，其中所说的逆转录反应用具有相应于HCV RNA序列之序列的一个或多个寡核苷酸引物进行。
17、一种如权利要求14限定的方法，其中所说的扩增用选自下述的方法进行：PCR、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸单碱基取代、转录介导扩增。
18、一种如权利要求14限定的方法，其中所说的检测包括用凝胶电泳显示所说的扩增产物。
19、一种如权利要求14限定的方法，其中所说的检测包括在含有一个或多个HCV特异寡核苷酸探针的固相支持物上俘获所说的扩增产物，以及用比色分析法定量所说的俘获产物。
20、一种如权利要求19限定的方法，其中：
(a)当所说的5’NCR正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自下列序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNo.12>；以及
(b)当所说的5’NCR正向引物是(C69F28)时，其中所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNo.11>；以及
(c)其中所说的探针还包括选自下列序列中的一个：
5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNo.14>；和
5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNo.15>。
21、一种如权利要求14限定的方法，其中所说样品选自血液、血清、血浆、尿、唾液、和脑脊液。
22、一种扩增HCV DNA的方法，所说方法包括：
(A)用一对或多对HCV特异的5’NCR寡核苷酸引物和一对3’NCR寡核苷酸引物对含有HCV DNA的DNA样品进行PCR，以产生HCV特异的扩增产物，
其中所说的5’NCR引物对包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQID No.2>，和
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；和
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQID No.7>，
(iii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，和
(iv)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQID No.6>；
其中，所说的3’NCR寡核苷酸引物对包括一个由寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个由寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物。
23、一种如权利要求22限定的方法，还包括：
(B)检测所说的扩增产物，
其中检测到所说的扩增产物表明所说的样品中HCV DNA的存在。
24、一种如权利要求23限定的方法，其中所说的检测包括用凝胶电泳显示所说的扩增产物。
25、一种如权利要求23限定的方法，其中所说的检测包括在含有一个或多个HCV特异寡核苷酸探针的固相支持物上俘获所说的扩增产物，以及用比色分析法定量所说的俘获产物。
26、一种如权利要求25限定的方法，其中：
(a)当所说的5’NCR正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自下列序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ ID NO.13>，和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ ID NO.12>；
(b)当所说的5’NCR正向引物是(C69F28)时，其中所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ ID No.11>；
(c)其中所说的探针还包含选自下组中的一个：
5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ ID NO.14>；和
5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ ID NO.15>。
27、选自以下序列组中的一个寡核苷酸：
5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ IDNo.1>；
5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ IDNo.2>；
5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ IDNo.3>；
5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ IDNo.4>；
5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>；
5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>；
5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ IDNo.7>；
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID No.11>；
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID NO.12>；以及
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>。
28、选自以下序列组中一个HCV特异的扩增引物寡核苷酸：
5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ IDNo.1>；
5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ IDNo.2>；
5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ IDNo.3>；
5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ IDNo.4>；
5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNo.5>；
5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNo.6>；以及
5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ IDNo.7>。
29、一种含有选自以下序列组中的一个寡核苷酸的探针：
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQID No.11>：
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQID NO.12>；以及
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>。
30、一种扩增来源于HCV RNA的HCV DNA的试剂盒，所说的试剂盒含有一对或多对5’NCR寡核苷酸引物，其中所说的5’NCR引物对选自以下序列组：
(a)正向引物5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID NO.1>和反向引物5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID NO.4>；
(b)正向引物5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID NO.2>和反向引物5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID NO.7>；和
(c)正向引物5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3(C143F26)<SEQ ID NO.3>和选自下组中的一个反向引物
(i)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ IDNO.5>，
(ii)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ IDNO.6>。
31、一种如权利要求30限定的试剂盒，还包括一对3’NCR寡核苷酸引物，其中所说的3’NCR寡核苷酸引物对包括一个寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物。
32、一种如权利要求30限定的试剂盒，还包括一个或多个探针。
33、一种如权利要求31限定的试剂盒，还包括一个或多个探针。
34、一种如权利要求32限定的试剂盒，其中：
(a)当所说的5’NCR正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自以下序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNo.13>，和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNO.12>；和
(b)当所说的5’NCR正向引物是(C69F28)时，其中所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNO.11>。
35、一种如权利要求33限定的试剂盒，其中：
(a)当所说的5’NCR正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说探针选自以下序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>，和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNo.12>；
(b)当所说的5’NCR正向引物是(C69F28)时，所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(c96-22-PRB)<SEQ IDNO.11>；以及
(c)其中所说的探针还包含选自下列中的一个：
5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNO.14>；和
5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNO.15>。
36、一种如权利要求30限定的试剂盒，其中所说的5’NCR引物对由5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>组成。
37、一种如权利要求30限定的试剂盒，其中所说的5’NCR引物对由5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>组成。
38、一种检测HCV DNA存在的试剂盒，所说的试剂盒包含一对或多对5’NCR寡核苷酸引物，其中所说的5’NCR引物对包括：
(a)选自以下序列的正向引物：
(i)5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>，
(ii)5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQID No.2>，和
(iii)5’-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(C143F26)<SEQ ID No.3>；和
(b)选自以下序列的反向引物：
(i)5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>，
(ii)5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQID No.7>，
(iii)5’-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3’(C282R27)<SEQ ID No.5>，和
(iv)5’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’(C287R27)<SEQ ID No.6>。
39、一种如权利要求38限定的试剂盒，还包含一对3’NCR寡核苷酸引物，其中所说的3’NCR寡核苷酸引物对包含一个寡核苷酸5’-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3’(1F27)<SEQ ID No.8>组成的正向引物和一个寡核苷酸5’-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3’(57R27)<SEQ ID No.9>组成的反向引物。
40、一种如权利要求38限定的试剂盒，还包含一个或多个探针。
41、一种如权利要求39限定的试剂盒，还包含一个或多个探针。
42、一种如权利要求40限定的试剂盒，其中：
(a)当所说的5’NCR正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自以下序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNO.12>；以及
(b)当所说的5’NCR正向引物是(C69F28)时，所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNO.11>。
43、一种如权利要求41限定的试剂盒，其中：
(a)当所说的5’NCR正向引物是(C131F25)或者(C143F26)时，所说的探针选自以下序列：
5’-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-25-PRB)<SEQ IDNO.13>，和
5’-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3’(C252-27-PRB)<SEQ IDNO.12>；
(b)当所说的5’NCR(c)正向引物是(C69F28)时，其中所说的探针为
5’-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3’(C96-22-PRB)<SEQ IDNO.11>；和
(c)其中所说的探针还包含选自下组中的一个：
5’-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3’(30PRB25)<SEQ IDNO.14>；和
5’-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3’(32PRB25)<SEQ IDNO.15>。
44、一种如权利要求38限定的试剂盒，其中所说的5’NCR引物对由5’-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3’(C69F28)<SEQ ID No.1>和5’-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3’(C133R26)<SEQ ID No.4>组成。
45、一种如权利要求38限定的试剂盒，其中所说的5’NCR引物对由5’-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’(C131F25)<SEQ ID No.2>和5’-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3’(C294R25)<SEQ ID No.7>组成。
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