CN1688719A - 确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂易感性的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种确定抗病毒药有效性的算法的研究方法，所述方法基于表型临床临界值指导的配对表型数据和基因型数据的综合分析。一方面，该算法允许使用者为患者提供有效治疗。该算法有助于预测受感染的个体是否对抗病毒化合物治疗发生应答，从而允许设计有效治疗方案而不会给患者带来不需要的副作用。而且由于避免了施用无效药物，故可以节省大量的时间和费用。

Description

确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂易感性的组合物和方法
1.发明领域
本发明涉及确定致病性病毒对抗病毒化合物易感性的组合物和方法。所述组合物和方法可用于鉴别治疗病毒感染的有效药物治疗方案，以及鉴别和确定潜在治疗化合物的生物学有效性。
2.发明背景
自二十世纪八十年代早期以来，感染人免疫缺陷病毒(“HIV”)(获得性免疫缺陷综合征(“AIDS”)的致病因素)的人数已超过6千万。参见Lucas，2002，Lepr Rev.73(1)：64-71。HIV/AIDS如今在亚撒哈拉非洲是导致死亡的最主要原因，而且其在世界范围内导致死亡的原因中位列第四。在2001年末，全球大约有4千万HIV携带者。参见Norris，2002，Radiol Technol.73(4)：339-363。
现代抗-HIV药的靶点是HIV生命周期的不同阶段和HIV复制和/或生存必需的多种酶。已批准用于AIDS治疗的药物包括核苷逆转录酶抑制剂例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韦、核苷酸逆转录酶抑制剂例如替诺福韦，非核苷逆转录酶抑制剂例如奈韦拉平、依法韦仑、地拉韦啶和蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
抗病毒药作用的一个结果是其能够对病毒复制施加足以使其选择抗药性突变株的选择压力(Herrmann等，1977，Ann NY Acad Sci 284：632-637)。当药物量增加时，复制病毒种群所受的选择压力增加从而促进抗药性突变株更快速生成。
由于抗药性的出现不可避免，因此必须设计在面对抗性病毒种群时能够最优化治疗的策略。确定抗药性对药物治疗失败的影响是困难的，因为可能产生抗药性的患者也有可能具有其它能够使患者易于发生预后不良的其它因素(Richman，1994，AIDS Res Hum Retroviruses10：901-905)。另外，每个患者通常都含有病毒突变株的不同混合物，所述混合物具有对抗病毒药不同易感性的不同突变株。
用于评估抗病毒药抗性的传统方法是不足够的；确定HIV对抗病毒剂的抗性的经典检测法复杂、费时、昂贵、具有潜在危险，且不能针对特定患者的治疗进行定制。参见Barre-Sinoussi等，1983，Science 220：868-871；Popovic等，1984，Science 224：497-500)和其变化形式(例如参见，Goedert等，1987，JAMA 257：331-334；Allain等，1987，N.Engl.J.Med.317：1114-1121；Piatak等，1993，Science 259：1749-1754；Urdea，1993，Clin.Chem.39：725-726；Kellam和Larder，1994，Antimicrobial Agents and Chemo.38：23-30)。
目前通常使用两种方法检测对抗病毒药的抗性。第一种方法，称为表型分析，直接检测获自感染者病毒的病毒对特定抗病毒药的易感性。Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928和Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother 42(2)：269-76描述了目前广泛使用的表型分析。Gunthard等，1998，AIDS Res Hum Retroviruses 14：869-76和Schuurman等，1999，JClin Microbiol.37：2291-96描述了目前流行的基因型测定法。Hirsch等，2000，JAMA 283：2417-26对目前分析药物易感性的可用检测法作了一般性分析。
第二种方法，称为基因型分析，检测病毒中能够影响药物易感性的突变并可将特定基因突变和抗药性及药物失败联系起来。基因型分析检测取自患者的病毒，寻找与对特定药物抗性相关的特定基因突变的存在。基因型分析有一些优于表型分析的优势，最显著的是检测试验可以相对简易和快速地实施。检测可在短至数日的时间内完成，并且由于其复杂性较低，因此其在实施上会稍便宜。然而，基因型数据的解读要依赖于先前关于特定突变和药物易感性改变间的相关性的认识。
迄今为止关于使用降低的易感性的基因型相关性来预测抗病毒药，特别是靶向针对不断进化的HIV的药物的有效性的努力充其量也是有缺陷的。能够更精确的预测给定抗病毒药或药物组合是否在对特定患者的治疗中有效的算法通过将不大可能成功的药物在其施用给该患者前鉴别出来从而节省时间和费用。更重要地是，其可通过减少在用不会改善他或她的HIV感染的强效毒素治疗时给他或她带来的损害从而提高患者的生活质量。因此，迫切需要一种预测特定药物是否在对特定患者的治疗中有效的更为精确的算法。此外，基于基因型的分析法比表型分析更快速并具有更高的成本效率。
3.发明概述
本发明提供了用于研发和使用确定抗病毒疗法或联合疗法有效性的算法的方法和组合物。该算法基于由表型临床临界值(对治疗的抗性开始而敏感性终止的点)指导的配对的表型和基因型数据的分析。该算法显著地改善了患者的生活质量，这是因为该算法精确预测给定的抗病毒药在治疗患者时是否有效，从而减少用不会改善他或她的HIV感染的强效毒素治疗时产生的对他或她产生的伤害。
一方面，本发明提供了确定病毒对抗病毒疗法易感性的方法，包括在病毒基因组或病毒酶中检测是否存在与对抗病毒疗法的高易感性相关的突变。
另一方面，本发明提供了确定抗病毒疗法对感染病毒的个体的有效性的方法，该方法包括在来自所述个体的样品中检测是否存在与对抗病毒疗法的高易感性相关的突变。
本发明还提供了通过如上所述测定相同或不同的抗病毒疗法的有效性而监测接受抗病毒疗法的个体中病毒感染的临床进展的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了包括人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的核酸和多肽。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
另一方面，本发明提供了一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性是否增加的方法，包括检测所述蛋白酶氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的突变，其中所述突变的存在表明HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性增加，前提是所述突变不是L33F。
另一方面，本发明提供了一种确定HIV感染个体对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性是否增加的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测HIV蛋白酶氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的突变，其中所述突变的存在表明个体对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性增加，前提是所述突变不是L33F。
在另一个实施方案中，所述人免疫缺陷病毒是1型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。
另一方面，本发明提供了长度为约10～约40个核苷酸的编码HIV蛋白酶的一部分的寡核苷酸，该部分包括位于所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93的突变，前提是所述突变不是L33F。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少10个连续残基的分离多肽，其中该多肽包括前面所列的本发明的至少一个突变，并且其中该突变与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关。
在另一个实施方案中，包括所述一个或多个突变的多肽与具有SEQID NO：1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但小于100％的同一性；该多肽具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有大于80％同一性的氨基酸序列；或该多肽具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有大于90％同一性的氨基酸序列；其中该突变与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关。
在一个实施方案中，本发明提供了通过序列特异性寡核苷酸探针与编码所述突变的人免疫缺陷病毒的核酸序列杂交检测蛋白酶中是否存在突变的方法，其中杂交的发生指示所述突变是否存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过确定编码突变的核酸序列而检测蛋白酶中是否存在突变的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过扩增核酸而检测蛋白酶中是否存在突变的方法，所述核酸扩增是通过例如聚合酶链反应而进行的。
在一个实施方案中，个体正在进行或已经进行抗病毒药物治疗。在另一种实施方案中，抗病毒药物是所述蛋白酶抑制剂或不同的蛋白酶抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了检测在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸位置是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的突变的方法。
另一方面，本发明提供了一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括：检测所述HIV编码的蛋白酶在所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置10、15、36、41、57、60、63、71或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性负相关的突变，其中所述突变的存在指示HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性增加。
另一方面，本发明提供了一种确定HIV感染个体对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测HIV蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置10、15、36、41、57、60、63、71或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性负相关的突变，其中所述突变的存在指示该个体对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性增加。
4.附图简述
图1图解说明HIV-1的基因组结构。
图2表示蛋白酶抑制剂倍数改变分布。
图3表示对蛋白酶抑制剂具有高易感性的样品的抑制曲线。
图4表示具有与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的样品的蛋白酶抑制剂易感性。
图5表示B分化体(clade)和非B分化体病毒的蛋白酶抑制剂易感性。
图6表示不同分化体病毒的蛋白酶抑制剂易感性。
图7表示不同对蛋白酶抑制剂的易感性协方差。
图8表示不同蛋白酶抑制剂的RC与蛋白酶抑制剂FC的图表。
图9A显示了NL4-3HIV(GenBank登录号AF324493)蛋白酶的氨基酸序列(SEQ.ID.NO：1)。
图9B显示了NL4-3HIV(GenBank登录号AF324493)蛋白酶基因的核酸序列(SEQ.ID.NO：2)。
5.发明详述
本发明提供了一种确定抗病毒药有效性的算法的研究方法，所述方法基于表型临床临界值指导的配对表型数据和基因型数据的综合分析。本发明还提供了确定病毒对抗病毒疗法易感性的方法，确定抗病毒疗法对感染病毒个体有效性的方法，和监测接受抗病毒疗法的个体中病毒感染的临床进展的方法。另一方面，本发明还提供了核酸和多肽，它们包含人免疫缺陷病毒(“HIV”)的蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变。
5.1缩略语
“ APV”是蛋白酶抑制剂安泼那韦的缩写。
“ IDV”是蛋白酶抑制剂茚地那韦的缩写。
“ LPV”是蛋白酶抑制剂洛匹那韦的缩写。
“ NFV”是蛋白酶抑制剂奈非那韦的缩写。
“ RTV”是蛋白酶抑制剂利托那韦的缩写。
“ SQV”是蛋白酶抑制剂沙奎那韦的缩写。
“ PI”是蛋白酶抑制剂的缩写。
“ PT-HS”是“表型高易感性”的缩写。
“ GT-HS”是“基因型高易感性”的缩写。
“ PCR”是“聚合酶链反应”的缩写。
“ FC”是“倍数改变”的缩写。
“ RC”是“复制能力”的缩写。
本文中使用的20种遗传编码的L-氨基酸的氨基酸表示法是常规的，如下所述：
  氨基酸   单字母缩写   三字母缩写
  丙氨酸   A   Ala
  精氨酸   R   Arg
  天冬酰胺   N   Asn
  天冬氨酸   D   Asp
  半胱氨酸   C   Cys
  谷氨酰胺   Q   Gln
  谷氨酸   E   Glu
  甘氨酸   G   Gly
  组氨酸   H   His
  异亮氨酸   I   Ile
  亮氨酸   L   Leu
  赖氨酸   K   Lys
  甲硫氨酸   M   Met
  苯丙氨酸   F   Phe
  脯氨酸   P   Pro
  丝氨酸   S   Ser
  苏氨酸   T   Thr
  色氨酸   W   Trp
  酪氨酸   Y   Tyr
  缬氨酸   V   Val
除非另有描述，当多肽序列用一串单字母和/或三字母缩写表示时，该序列是以N→C方向的，这与习惯作法一致。
在本文中将序列中的各氨基酸表示为AN，其中A是序列中氨基酸的标准单字母标记，而N是序列中的位置。在本文中将氨基酸序列中的突变表示为A1，NA2，其中A1，是参照蛋白质序列中的氨基酸的标准单字母标记，A2是突变的蛋白质序列中氨基酸的标准单字母标记，而N是氨基酸序列中的位置。例如，G25M突变表示在第25位氨基酸上甘氨酸改变为甲硫氨酸。本文中，还可以将突变表示为NA2，其中N是氨基酸序列中的位置而A2是突变的蛋白质序列中氨基酸的标准单字母标记(例如，25M，是指在第25位氨基酸上野生型氨基酸改变为甲硫氨酸)。此外，本文中突变还可以表示为A1N，其中A1是参照蛋白质序列中的氨基酸的标准单字母标记和N是氨基酸序列中的位置(例如，G25表示在第25位氨基酸上甘氨酸改变为任何氨基酸)。该表示法通常在当突变的蛋白质序列中的氨基酸或者是未知的或者(如果突变的蛋白质序列中的氨基酸可以是任何氨基酸)是除参照蛋白质序列所发现氨基酸之外的那些时使用。氨基酸位置根据包含突变的区域来源的蛋白质的全长序列进行计数。DNA序列中的核苷酸和点突变的表示法是类似的。
本说明书全文所使用的涉及包括特定核酸碱基序列的核酸的缩写是一般的单字母缩写。因此，当包括于核酸中时，天然存在的编码核酸碱基缩写如下：腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另有所指，将表示为一串单字母缩写的单链核苷酸序列和双链序列的上链以5’- 3′的方向表示。
5.2定义
如本文所使用的，下述术语具有如下含义：
除非另有所指，“ 主要突变”是指影响酶活性位点，即在酶底物复合物相关的、或当将病毒置于抗病毒剂的选择压力下时在复制早期重复出现的，或对针对抗病毒剂的突变的表型易感性具有强作用的那些氨基酸位置的突变。
“ 次要突变”是指不是主要突变的且促成易感性降低或补偿由主要突变所加的总体缺陷的突变。
“ 表型分析”是检测病毒(例如HIV)对特定抗病毒剂的易感性的检测法。
“ 基因型分析”是确定生物体、生物体的部分、基因或基因部分的基因序列的检测法。所述检测法经常在HIV中使用以确定是否存在与抗药性相关的特定突变。
如本文所使用的，“ 基因型数据”是关于例如病毒基因型的数据。基因型数据的实例包括，但不限于，病毒、病毒部分、病毒基因、病毒基因部分、或与病毒核酸或蛋白质中一个或多个核苷酸或氨基酸残基具有同一性的核苷酸或氨基酸序列。
“ 易感性”是指病毒对特定药物的反应。对药物易感性减少或降低的病毒对药物的抗性增高或敏感性降低。对药物易感性增加或增强或更大的病毒对药物的敏感性增高或抗性降低。
病毒对特定药物的表型易感性是连续统一体。然而，其事实上可用于划定一个阈值或多个阈值用于简化对特定倍数改变结果的解读。对于已经收集了充分临床结果数据的药物，能够确定“临床临界值”，如下文所述。
“ 高易感性”(“HS”)是指对药物的严格性增强或增加，对药物的敏感性增高或对药物的抗性降低。高敏感性定义为等于或低于每个蛋白酶抑制剂的倍数改变分布的第10个百分位的倍数改变(“FC”)(参见下文)。
“ 临床临界值”是指一个具体的点，在这个点抗性开始而敏感性性终止。其可通过患者用特定药物治疗失败可能性显著增加的药物易感性水平进行确定。如临床研究中所确定的，对于不同的抗病毒剂来说临界值不同。通过评估抗性和结果数据可在临床试验中确定临床临界值。治疗开始时检测药物易感性(表型)。可在治疗过程的每个预定的时间点监测治疗应答，例如病毒负荷的改变。药物易感性与治疗应答相关联并通过与治疗失败相关的抗性水平可确定临床临界值(总体实验结果的统计学分析)。
Figure A0382074700121
是指抑制浓度。其是在患者的血液或体外抑制致病性微生物(例如HIV)复制n％所需的药物浓度。因此， 是指将病毒复制抑制了不存在药物时观测的水平的50％的抗病毒剂浓度。“患者IC50”是指抑制来自患者的病毒的复制50％所需的药物浓度，“参照IC50”是指抑制参照或野生型病毒复制50％所需的药物浓度。类似地，“IC90”是指抑制病毒复制90％的抗病毒剂浓度。
“ 倍数改变”是患者病毒和药物敏感的参照病毒的药物易感性的数值对比。其是患者IC50与药物敏感的参照IC50的比值，即，患者IC50/参照IC50＝倍数改变(“FC”)。倍数改变为1.0提示患者病毒表现出与药物敏感的参照病毒一样的药物易感性程度。倍数改变低于1提示患者病毒比药物敏感的参照病毒更敏感。倍数改变高于1提示患者病毒的易感度低于药物敏感的参照病毒。倍数改变等于或高于临床临界值是指患者病毒具有对药物应答的较低的可能性。倍数改变低于临床临界值是指患者病毒对该药物敏感。
如果分别具有小于2.5的APV、IDV、NFV、SQV和RTV倍数改变，则病毒对APV、IDV、NFV、SQV和RTV“敏感”。如果具有小于10的LPV倍数改变，则病毒对LPV敏感。
如果分别具有2.5或更高的APV、IDV、NFV、SQV和RTV倍数改变，则病毒对APV、IDV、NFV、SQV和RTV“有抗性”。如果具有10或更高的LPV倍数改变，则病毒对LPV有抗性。
如果病毒具有一种特性，例如与对抗病毒疗法的高易感性相关的突变，则该病毒具有对抗病毒疗法“ 具有高易感性的可能性增加”。如果具有该特性的病毒种群，平均来说，与其它不具有所述特性的相似病毒种群相比对抗病毒疗法更易感，则该病毒的特性与高易感性相关。因此，特性存在和高易感性间的相关性既不必绝对化，也不需要该特性对于赋予高易感性是必要的(即，该特性在增加易感性方面发挥诱发性的作用)或充分的(即，特性单独存在即为充分的)。
本文中术语“ ％序列同源性”与术语“ ％同源性”、“ ％序列同一性”和“ ％同一性”互换使用并是指当用序列比对程序进行比对时，2个或多个肽序列间氨基酸序列同一性的水平。例如，如本文所用的，80％同源性是指由确定的算法所确定的80％序列同一性的相同事物，并相应地与具有在给定序列长度上的高于80％序列同一性的给定序列同源。序列同一性的示例性水平包括，但不限于，具有与给定序列60、70、80、85、90、95、98％或更高的序列同一性。
可用于确定两个序列间同一性的示例性计算机程序包括，但不限于，BLAST程序包，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其已经公开于互联网上，其网址为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。还可参见Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(特别参考公开的缺省分配，即，参数w＝4，t＝17)和Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402。当评估给定氨基酸序列相对于GenBank蛋白质序列和其它公开数据库中的氨基酸序列时，通常采用BLASTP程序实施序列检索。优选使用BLASTX程序在GenBank蛋白质序列库及其他公共数据库中检索在全部可读框中翻译为氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX均使用开放空位罚分为11.0和延伸空位罚分为1.0的缺省参数以及用BLOSUM-62矩阵运行。参见Altschul等，1997。
为了确定2个或多个序列间的“％同一性”，使用例如，MacVector6.5版中的CLUSTAL-W程序实施优选的所选序列的比对，所述程序以缺省参数，开放空位罚分为10.0，延伸空位罚分为0.1，和BLOSUM 30相似性矩阵运行。
“ 极性氨基酸”是指含有在生理pH下不带电荷的侧链，但含有至少一个其中由双原子共享的电子对且靠一个原子保持得更近的键的亲水性氨基酸。遗传编码的极性氨基酸包括Asn(N)、GLN(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“ 非极性氨基酸”是指含有在生理pH下不带电荷的侧链并含有其中由双原子共享的电子对且由双原子的每个原子同等保持的键(即，侧链是非极性的)的疏水性氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(1)、Leu(L)、Met(M)和Val(V)。
“ 亲水性氨基酸”是指表现为根据Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179：125-142)的标准化一致疏水性尺度低于0的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)和Thr(T)。
“ 疏水性氨基酸”是指表现为根据Eisenberg等(1984，J.Mol.Biol.179：125-142)的标准化一致疏水性尺度高于0的疏水性的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)，Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)和Val(V)。
“ 酸性氨基酸”是指含有pK值低于7的侧链的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常具有由于缺失氢离子而在生理pH下带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp(D)和Glu(E)。
“ 碱性氨基酸”是指含有pK值高于7的侧链的亲水性氨基酸。碱性氨基酸通常具有由于水合氢离子的联合而在生理pH下带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg(R)，His(H)和Lys(K)。
“ 突变”是与参照核酸或多肽相比，氨基酸序列或相应核酸序列中存在的变化。对于本发明包括HIV蛋白酶或逆转录酶的实施方案，编码蛋白酶或逆转录酶的参考核酸是分别存在于NL4-3HIV(GenBank登录号AF324493)中的蛋白酶或逆转录酶编码序列。虽然肽的氨基酸序列可直接用，例如，埃德曼降解或质谱分析法进行确定，更典型地，肽的氨基酸序列可由编码该肽的核酸的核苷酸序列推导得出。任何本领域已知的用于确定核酸序列的方法都是可用的，例如，Maxam-Gilbert测序(Maxam等，1980，Method in Enzymology 65：499)，双脱氧法测序(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)或基于杂交的方法(例如参见，Maniatis等，1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates和Wiley InterScience，NY)。
病毒中的“ 抗性相关突变”(“RAM”)是与病毒对抗病毒剂易感性的降低相关的突变。RAM可在一些病毒，包括，但不限于人免疫缺陷病毒(“HIV”)的任意一种中发现。所述突变可在一种或多种病毒蛋白质，例如，HIV的蛋白酶、整合酶、包膜或逆转录酶中发现。RAM可相对于参照株进行确定。对于本发明包括HIV蛋白酶的实施方案，所述参照蛋白酶是由NL4-3HIV(GenBank登录号AF324493)编码的蛋白酶。
病毒中的“ 高易感性相关突变”(“HSAM”)是与病毒对抗病毒剂的高易感性相关的突变。HSAM可在一些病毒，包括，但不限于人免疫缺陷病毒(“HIV”)的任意一种中发现。所述突变可在一种或多种病毒蛋白质，例如，HIV的蛋白酶、整合酶、包膜或逆转录酶中发现。HSAM可相对于参照株进行确定。对于本发明包括HIV蛋白酶的实施方案，所述参照蛋白酶是由NL4-3HIV(GenBank登录号AF324493)编码的蛋白酶。
“ 突变体”是含有相对于参照病毒、基因或蛋白质的一个或多个改变的序列的病毒、基因或蛋白质。
本文通篇所使用的术语“ 肽”、“ 多肽”和“ 蛋白质”可彼此互换。
术语“ 参照”和“ 野生型”在本文全文中可互换使用。本文通篇所使用的术语“ 多核苷酸”、“ 寡核苷酸”和“ 核酸”可彼此互换。
5.3 高易感性相关突变
一方面，本发明提供了包括HIV蛋白酶中突变的核酸和多肽。优选地，HIV是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。HIV还可以是，例如，II型人免疫缺陷病毒(“HIV-2”)。在一个实施方案中，所述突变与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关。蛋白酶抑制剂可以是本领域技术人员已知的任何蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
一方面，本发明提供了包括HIV蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的肽、多肽或蛋白质。在一个实施方案中，本发明提供了源自HIV蛋白酶的并包括与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的多肽。在另一个实施方案中，所述多肽包括超过一个与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变。本发明的多肽包括由这些多肽修饰或来源自这些多肽的肽、多肽和蛋白质。在一个实施方案中，所述多肽包括翻译后修饰。在另一个实施方案中，所述多肽包括一个或多个氨基酸类似物。
在优选实施方案中，所述多肽包括一个或多个与对一种或多种蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变。表1提供了与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的列表。
在另一个优选实施方案中，本发明提供了源于HIV蛋白酶并且包含位于选自下组的氨基酸位置的至少一个突变的多肽：10、15、36、41、57、60、63、71和93。在一个优选实施方案中，第33位的氨基酸不是F。
在另一个优选实施方案中，包含所述突变的该多肽包含SEQ IDNO：1的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、85、90或95个连续的氨基酸，所述序列可以存在所述一个或多个突变。
在另一个实施方案中，所述多肽与含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽具有至少70％，但低于100％的同一性；所述多肽含有与SEQID NO：1的氨基酸序列具有高于80％同一性的氨基酸序列；或所述多肽含有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有高于90％同一性的氨基酸序列；其中所述突变与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关。
在一个实施方案中，所述多肽是天然存在的。在另一个实施方案中，所述多肽是人工设计的。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，将序列比对以便实现最佳比较目的(例如，可将空位引入第一个氨基酸或核酸序列中以便与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳对比)。然后比较位于相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被第二个序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸所占据，则该分子在这一位置是同一的。两个序列间的同一性百分比是序列间共有相同位置数的函数(％同一性＝相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。
两个序列间同一性百分数的测定可采用数学算法完成。用于两个序列比较的数学算法的一个优选的，非限制性的实例是按Karlin和Altschul修改的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，(1993))Karlin和Altschul算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，(1990))。所述算法已引入Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215：403-410)的NBLAST和XBLAST程序中。可采用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12实施BLAST核苷酸检索以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可采用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3实施BLAST蛋白质检索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得为了用于比较目的的有空位的比对，可使用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所描述的Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast来实施多重检索来检测分子间的距离关系。同前。当使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于序列比较的数学算法的另一优选的，非限制性的实例是Myers和Miller的算法(CABIOS(1989))。所述算法已引入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是CGC序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12和空位罚分4。用于序列分析的其它算法是本领域已知的，并包括如描述于Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，10：3-5中的ADVANCE和ADAM和描述于Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-8的FASTA。在FASTA中，ktup是分配检索灵敏度和速度的控制性选择。如果ktup＝2，可通过寻找比对的残基对发现所比较的两个序列中的相似区；如果ktup＝1，可检测单个比对的氨基酸。对于蛋白质序列可将ktup设为2或1，或对于DNA序列设为1～6。如果ktup不是特别指定的，则其缺省值对于蛋白质是2而对于DNA是6。
两个序列间的同一性百分数可使用与上述方法相似的技术进行确定，含有或不含有允许的空位。在计算同一性百分数时，通常计算精确匹配。
另一方面，本发明提供了编码或与本发明的多肽或其生物活性部分相关的多核苷酸、寡核苷酸或核酸，包括，例如，足以用作鉴别、分析、突变或扩增本发明的核酸的杂交探针、PCR引物或测序引物的核酸分子。
在一个实施方案中，所述核酸编码包括对HIV蛋白酶中与对蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦的高易感性相关的突变的多肽。在一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的核酸，所述多肽源自HIV蛋白酶并包括一个或多个与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变。本发明的核酸包括由这些核酸序列修饰或衍生的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。在一个实施方案中，核酸包括核苷酸类似物。
在一个实施方案中，核酸是天然存在的。在另一个实施方案中，核酸是人工设计的。
核酸可以是任何长度。例如，核酸的长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450，475或500个核苷酸。核酸的长度可以是，例如，小于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500或9000个核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述核酸具有适于检测本文所描述的突变，例如作为探针或引物的长度和序列。
在一个实施方案中，所述核酸编码包括一个或多个与对一种或多种蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的多肽。表1提供了与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的列表。
在另一个优选实施方案中，本发明提供了寡核苷酸，它编码源于HIV蛋白酶并且包含位于选自下组的氨基酸位置的至少一个突变的多肽：10、15、36、41、57、60、63、71和93。在一个优选实施方案中，第33位的氨基酸不是F。
在另一个优选实施方案中，包含所述突变的所述寡核苷酸包含SEQID NO：2的15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、180、210、240、255、270或285个连续的核酸，所述序列可以存在所述一个或多个突变。
在另一个实施方案中，包含所述一个或多个突变的寡核苷酸与含有SEQ ID NO：2的核酸序列的寡核苷酸具有至少60％，但低于100％的同一性；所述寡核苷酸含有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高于70％的同一性的核苷酸序列；所述寡核苷酸含有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高于80％的同一性的核苷酸序列；或所述寡核苷酸含有与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有高于90％的同一性的核苷酸序列。两个核苷酸序列的同一性百分数可按前面所述进行确定。
除SEQ ID NO：2的核苷酸序列外，本领域技术人员会认识到导致氨基酸序列改变的DNA序列多态性可存在于种群中(例如，人群)。由于天然等位基因变异，所述遗传多态性可存在于种群中的个体中。天然等位基因变异通常能导致特定基因的核苷酸序列中1-5％的变异。作为天然等位基因变异结果的并且不改变功能活性的任何和全部所述核苷酸变异和得到的氨基酸变异或多态性均包含在本发明的范围中。
在另一个实施方案中，本发明提供了适于用作检测本发明的核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。本发明的核酸分子可仅包括编码全长的本发明多肽的核酸序列的部分例如，可用作探针或引物的片段或编码本发明的多肽的生物活性部分的片段。该探针可包括与其连接的标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。在各实施方案中，本发明的核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸主链上进行修饰。
另一方面，本发明提供了一种确定HIV，如HIV-1对蛋白酶抑制剂的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括：检测所述HIV-1编码的蛋白酶在所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置10、15、36、41、57、60、63、71或93是否存在与对蛋白酶抑制剂的易感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示HIV-1对蛋白酶抑制剂治疗的易感性降低的可能性增加。总体上，该方法可以包括检测此处所列的与对蛋白酶抑制剂的易感性降低相关的突变的任意组合。例如，该方法可以包括检测在2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸位置是否存在与对蛋白酶抑制剂的易感性降低相关的突变。
另一方面，本发明提供了一种确定HIV，如HIV-1感染个体对蛋白酶抑制剂治疗的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测所述HIV-1编码的蛋白酶在所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置10、15、36、41、57、60、63、71或93是否存在与对蛋白酶抑制剂的易感性降低相关的突变，其中所述突变的存在指示HIV-1对蛋白酶抑制剂治疗的易感性降低的可能性增加。总体上，该方法可以包括检测此处所列的与对蛋白酶抑制剂的易感性降低相关的突变的任意组合。例如，该方法可以包括检测在2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸位置是否存在与对蛋白酶抑制剂的易感性降低相关的突变。
5.4发现高易感性相关的病毒突变
另一方面，本发明提供了在病毒或病毒衍生物中发现易感性相关的突变的方法。
5.4.1病毒和病毒样品
根据本发明的高易感性相关的突变(“HSAM”)可存在于任何类型的病毒，例如在动物中发现的任何病毒中。在本发明的一个实施方案中，所述病毒包括已知感染哺乳动物的病毒，所述哺乳动物包括狗、猫、马、羊、牛等。在一个优选的实施方案中，所述病毒是已知感染灵长类动物的病毒。在一个更优选的实施方案中，所述病毒是已知感染人类的病毒。感染人类病毒的实例包括，但不限于，人免疫缺陷病毒(“HIV”)、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、其它人疱疹病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲、乙和丙型肝炎病毒、鼻病毒和人乳头状瘤病毒。在本发明的一个实施方案中，病毒是HIV。优选地，病毒是I型人免疫缺陷病毒(“HIV-1”)。上述是目前存在对其有效抗病毒化疗的特定病毒的代表并表示逆转录病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒、微小RNA病毒、黄病毒、肺病毒和肝DNA病毒科。本发明可用于由这些科内的其它病毒所产生的其它病毒感染以及从其它病毒科中的目前是否存在有效治疗的病毒引起的病毒感染。
根据本发明的HSAM可在用本领域任何已知的获取病毒样品的方法获得的病毒样品中发现。所述方法包括，但不限于，从病毒感染的人或动物获取病毒样品或从病毒培养物中获取病毒样品。在一个实施方案中，所述病毒样品获自病毒感染的人类个体。所述病毒样品可获自感染个体的身体的任何部分或任何预期含有病毒的分泌物。所述部分的实例包括，但不限于血液、血清、血浆、唾液、淋巴液、精液、阴道粘液和其它体液的样品。在一个实施方案中，所述样品是血液、血清或血浆样品。
在另一个实施方案中，根据本发明的HSAM存在于获自培养物的病毒中。在某些实施方案中，所述培养物可获自实验室。在其它实施方案中，所述培养物可获自保藏中心，例如，美国典型培养物保藏中心。
在某些实施方案中，根据本发明的HSAM存在于病毒衍生物中。在一个实施方案中，病毒衍生物自身不具有病原性。在另一个实施方案中，病毒的衍生物是基于质粒的系统，其中质粒的复制或用所述质粒转染的细胞的复制受选择压力的是否存在的影响，从而选择增加对选择压力抗性的突变。在某些实施方案中，病毒衍生物包括感兴趣的核酸或蛋白质，例如作为抗病毒疗法靶位的那些核酸或蛋白质。在一个实施方案中，可将感兴趣的基因掺入载体中。例如参见，美国专利号5,837,464和6,242,187以及PCT公开WO99/67427，上述各专利引入本文作为参考。在一个优选的实施方案中，基因可以是编码蛋白酶或逆转录酶的基因。
在另一个实施方案中，无须使用完整病毒。代替地，可使用掺入载体的病毒部分。优选地，抗病毒药靶向于所使用的该病毒部分。
在另一个实施方案中，根据本发明的HSAM存在于遗传修饰的病毒中。可使用本领域中已知任何用于遗传修饰病毒的方法对病毒进行遗传修饰。例如，可将病毒在实验室培养物中按需要的次数培养传代。在一个实施方案中，不施加选择压力(即，不对病毒施加适于具有特定特征的病毒的复制的处理)，经过随机遗传漂移(drift)而累积新的突变。在另一个实施方案中，病毒在培养物中生长时(即，该病毒在适于具有一个或多个特性的病毒的复制的条件下培养)，将选择压力施加于该病毒。在一个实施方案中，选择压力是抗病毒疗法。任何已知的抗病毒疗法均可用作选择压力。在一个实施方案中，所述病毒是HIV而所述选择压力是蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，所述病毒是HIV-1而所述选择压力是蛋白酶抑制剂。任何蛋白酶抑制剂均可用于施加选择压力。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在另一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂是安泼那韦。通过用蛋白酶抑制剂，例如，安泼那韦处理体外培养的HIV，技术人员可选择具有对所述蛋白酶抑制剂，如安泼那韦抗性增加的HIV的突变株。可调整所述选择压力的严紧性以便增加或降低不具有所选特性的病毒的存活。
另一方面，根据本发明的HSAM可通过诱变处理病毒、病毒基因组或病毒基因组的部分进行制备。本领域中已知的任何诱变方法均可用于该目的。在一个实施方案中，所述诱变基本上是随机的。在另一个实施方案中，基本上随机的诱变通过对病毒、病毒基因组或病毒基因组的部分进行诱变处理进行实施。在另一个实施方案中，对编码作为抗病毒疗法的靶位的病毒蛋白的基因进行诱变处理。基本随机的诱变处理的实例包括，例如，暴露于诱变剂(例如，溴乙锭、乙基甲烷磺酯、乙基亚硝基脲(ENU)等)、放射(例如，紫外线)、插入和/或除去可转座元件(例如，Tn5、Tn10)或在细胞、细胞提取物或在具有增高的诱变率的体外复制系统中的复制。例如参见，Russell等，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 76：5918-5922；Russell，W.，1982，Environmental Mutagens and Carcinogens：Proceedings of theThird International Conference on Environmental Mutagens。本领域技术人员将能认识到虽然每一个这些诱变方法基本上在分子水平是随机的，每个都具有其自身优选的靶位。
另一方面，可能影响病毒对抗病毒治疗的敏感性的突变采用定点诱变进行制备。可使用本领域已知的任何定点诱变方法(例如参见，Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates和Wiley InterScience，NY)。可将所述定点诱变实施于，例如，特定的基因或基因组区、基因或基因组区的特定部分、或基因或基因组区中的一个或几个特定核苷酸。在一个实施方案中，将所述定点诱变实施于病毒基因组区、基因、基因片段或基于一个或多个标准的核苷酸。在一个实施方案中，对基因或基因的部分实施定点诱变，因为其编码已知为或疑为抗病毒疗法靶位的蛋白质，例如，编码HIV蛋白酶的基因。在另一个实施方案中，选择基因的部分或基因中的一个或少数几个核苷酸进行定点诱变。在一个实施方案中，将要进行诱变处理的核苷酸编码已知或疑为与抗病毒化合物相互作用的氨基酸残基。在另一个实施方案中，将要诱变处理的核苷酸编码已知或疑为在具有针对抗病毒治疗高易感性的病毒株中突变的氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述诱变处理的核苷酸编码的氨基酸残基毗邻或靠近已知或疑为与抗病毒化合物相互作用的或已知或疑为在具有针对抗病毒疗法高易感性的病毒株中突变的蛋白质残基一级序列。在另一个实施方案中，诱变处理的核苷酸编码毗邻或靠近已知为或疑为与抗病毒化合物发生相互作用或已知为或疑为在具有对抗病毒疗法增高的易感性的病毒株中突变的蛋白质残基的二级、三级或四级结构氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述诱变处理的核苷酸编码氨基酸残基位于或靠近已知为或疑为与抗病毒化合物结合的蛋白质的活性位点。例如参见，Sarkar和Sommer，1990，Biotechniques，8：404-407。
5.4.2检测病毒中是否存在突变
可通过本领域中已知的任何用于检测突变的方法检测病毒中是否存在根据本发明的RAM。可在编码特定蛋白质的病毒基因中或在该蛋白质自身，即在该蛋白质的氨基酸序列中检测突变。
在一个实施方案中，所述突变位于病毒基因组中。所述突变可位于，例如，编码病毒蛋白质的基因中，在编码病毒蛋白的基因的顺式或反式作用调控序列、基因间序列或内含子序列内。突变能够影响改变病毒针对抗病毒疗法的易感性的病毒结构、功能、复制或环境的任何方面。在一个实施方案中，突变位于是抗病毒疗法靶位的编码病毒蛋白质的基因内。
可使用多种技术检测病毒基因中的突变。病毒DNA或RNA可用作所述试验技术的起点，并可根据本领域技术人员所众所周知的标准方法进行分离。
可以通过多种方法检测特定核酸序列中的突变，如病毒基因特定区域中的突变，所述方法包括，但不限于基于等位基因特异性限制内切酶切割的限制片段长度多态性检测(Kan和Dozy，1978，Lancet ii：910-912)，错配修复检测(Faham和Cox，1995，Genome Res 5：474-482)、MutS蛋白的结合(Wagner et al.，1995，Nucl Acids Res23：3944-3948)、变性梯度凝胶电泳(Fisher et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：1579-83)、单链构象多态性检测(Orita et al.，1983，Genomics 5：874-879)、在错配碱基对的RNA酶切割(Myers et al.，1985，Science 230：1242)、异双链体DNA的化学(Cotton et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：4397-4401)或酶促(Youil et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：87-91)切割、基于寡核苷酸特异性引物延伸的方法(Syvnen et al.，1990，Genomics 8：684-692)，遗传位分析(Nikiforov et al.，1994，Nucl Acids Res 22：4167-4175)、寡核苷酸连接分析(Landegren et al.，1988，Science 241：1077)、寡核苷酸特异性连接链反应(″LCR″)(Barrany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：189-193)、空位-LCR(Abravaya et al.，1995，Nucl Acids Res 23：675-682)、用本领域公知的标准程序进行的放射性或荧光DNA测序、和肽核酸(PNA)分析(Orum et al.，1993，Nucl.Acids Res.21：5332-5356；Thiede etal.，1996，Nucl.Acids Res.24：983-984)。
此外，病毒DNA或RNA可用于杂交或扩增试验中，从而检测涉及基因结构异常情况，包括点突变、插入、缺失和基因组重排。所述试验可包括，但不限于，Southern分析(Southern，1975，J.Mol.Biol.98：503-517)，单链构象多态性分析(SSCP)(Orita等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2766-2770)，和PCR分析(美国专利号4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，Academic Press，Inc.)。
用于检测基因特异性突变的所述诊断方法可包括例如，将所述病毒核酸与一个或多个标记的核酸试剂，包括重组DNA分子、克隆的基因或其简并变体，在适于这些试剂与其互补序列特异性退火的条件下进行接触和孵育。优选地，这些核酸试剂的长度是至少15～30个核苷酸。在孵育后，从所述核苷酸分子杂交体中除去所有非退火的核酸。如果存在任何所述分子，则可检测到发生杂交的核酸的存在。使用所述检测方案，可将来自所述病毒的核酸固定于，例如，固体载体例如膜，或塑料表面例如微量滴定板或聚苯乙烯珠上。在该情况下，在孵育后，非退火的，标记的上述类型的核酸试剂可被很容易的去除。使用本领域技术人员众所周知的标准技术实施对剩下的，退火的，标记的核酸试剂的检测。可将核苷酸试剂退火所对的基因序列与从正常基因序列中推测的退火模式相比较从而确定基因突变是否存在。
检测基因特异性核酸分子的选择性诊断方法可包括核酸分子的扩增，例如通过PCR(美国专利号4,683,202；4,683,195；4,800,159；和4,965,188；PCR Strategies，1995 Innis等(eds.)，AcademicPress，Inc.)，随后用本领域技术人员所众所周知的技术检测扩增的分子。可将得到的扩增的序列与如果扩增的核酸仅含有各基因的正常拷贝时所期望的那些序列相比较以便测定基因突变是否存在。
此外，可采用本领域中任何已知测序方法对所述核苷酸测序。例如，所述病毒DNA可通过描述于Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463，进一步描述于Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9：309的双脱氧法，或通过描述于Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65：499的方法进行测序。还可参见Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates和Wiley InterScience，NY所描述的技术。
针对所述病毒基因产物，即，病毒蛋白质或病毒肽片段的抗体也可用于在病毒蛋白质中检测突变。或者，所述病毒蛋白质或肽片段可采用本领域中任何已知的为了产生所述蛋白质的氨基酸序列的测序方法测序。所述方法的一个实例是可用于小蛋白质或多肽测序的埃德曼降解法。较大蛋白质可最初用本领域中已知的化学或酶试剂，例如，溴化氰、羟胺、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶剪切，然后通过埃德曼降解法进行测序。
5.5检测突变病毒的表型易感性
本领域中任何已知方法均可用于测定突变病毒或病毒种群对抗病毒疗法的表型易感性。例如参见美国专利号5,837,464和6,242,187，将其全文引入此处作为参考。在某些实施方案中，实施表型分析，即病毒对给定抗病毒剂的易感性可针对无所述突变的参照病毒的易感性进行检测。该检测是药物易感性的直接、定量的检测并可通过本领域中确定病毒针对抗病毒剂的易感性的任何已知方法进行实施。所述方法的实例包括，但不限于，针对参照病毒确定IC50值的倍数改变。表型分析检测了特定病毒株在存在药物抑制剂时在体外的生长能力。当与抑制所述参照病毒所需药物量相比，抑制病毒活性需要更少药物时，该病毒具有对特定药物更高的易感性。
在一个实施方案中，对病毒株实施表型分析并用于计算药物的IC50或IC90。也可将分析的结果表示为每个病毒株的与药物易感性对照株或来自同一患者的先前的病毒株相比的IC50或IC90的倍数改变。因为将所述病毒直接暴露于每个可获得的抗病毒药物治疗，故可将结果直接与治疗反应相关联。例如，如果该患者病毒显示了对特定药物的抗性，则将该药物从该患者的治疗方案中除去或省略，这可使得医师可以设计在较长期更可能有效的的治疗方案。相反，如果患者病毒表现出对特定药物的易感性增加，可以重复该药物。
在另一个实施方案中，采用重组病毒试验(“RVAs”)实施所述表型分析。RVAs使用通过病毒载体和扩增自患者病毒的病毒基因序列间的同源重组产生的病毒原种。在某些实施方案中，所述病毒载体是HIV载体而所述病毒基因序列是蛋白酶和/或逆转录酶序列。
在一个优选实施方案中，使用PHENOSENSETM(ViroLogic Inc.，South San Francisco，CA)实施所述表型分析。参见Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928；美国专利号5,837,464和6,242,187。PHENOSENSETM是实现表型分析优势并克服先前分析法的缺陷的表型分析法。因为该分析法已经实现自动化，PHENOSENSETM在受控的条件下能够提供较高通量。结果得到能够准确确定患者的HIV分离物对目前所有可获得的抗逆转录病毒药的易感性图谱的检测，并将结果在收到样品后约10～约15日内直接传送给医师。PHENOSENSETM是准确的并能在仅一个病毒复制周期内即可获得结果，从而避免选择病毒亚群。该结果是定量的，用于衡量药物易感性的不同程度，同时也是灵敏的，该检测可实施于病毒负荷约500拷贝/ml的样品并能检测浓度为总病毒种群的浓度的10％或更低的某些药物抗性病毒的少数种群。而且，所述结果为可重复的且在所实施的约95％的试验中的改变(依赖于药物)低于约1.4-2.5倍。
PHENOSENSETM可使用来自扩增的病毒基因序列的核酸。如5.4.1节中所述，包含病毒的样品可以是来自所述病毒感染的人或动物的样品或来自病毒细胞培养物的样品。在一个实施方案中，所述病毒样品包括遗传修饰的实验室株。
然后可采用本领域中任何已知的将基因序列掺入至载体的方法将扩增的病毒基因序列掺入复制缺陷型病毒载体，从而构建抗性测试载体(“RTV”)。在一个实施方案中，使用限制性内切酶和常规克隆方法。参见Maniatis等，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and Wiley InterScience，NY。在某些实施方案中，使用限制性内切酶ApaI和PinAI。优选地，复制缺陷型病毒载体是指示基因病毒载体(“IGVV”)。在某些实施方案中，所述病毒载体包含检测RTV复制的元件。优选地，病毒载体包含荧光素酶表达盒。
所述测定可通过首先用RTV DNA和表达另一逆转录病毒，例如，双嗜性鼠白血病病毒(MLV)的包膜蛋白的质粒共转染宿主细胞进行实施。转染后，收集病毒颗粒并用于感染新鲜靶细胞。单个病毒复制周期的完成可通过用于检测载体中复制的方法进行检测。在一个实施方案中，单个病毒复制周期的完成导致荧光素酶的生成。可在转染步骤或感染步骤以一系列浓度加入抗病毒剂。
对抗病毒剂的易感性可通过比较载体在存在和不存在抗病毒剂时的复制进行检测。例如，对抗病毒剂的易感性可通过比较在存在和不存在抗病毒剂时荧光素酶活性进行检测。易感性病毒在存在抗病毒剂时将产生低水平的荧光素酶活性，而具有降低的易感性的病毒将产生较高水平的荧光素酶活性。
在一个优选实施方案中，将PHENOSENSETM用于评价HIV-1对抗病毒药的表型易感性。优选地，所述抗病毒药是蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的例子包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在优选实施方案中，参照病毒株是HIV株NL4-3或HXB-2.
在一个实施方案中，病毒核酸，例如，HIV-1RNA可提取自血浆样品，完整病毒基因或其片段可采用例如(但不限于)PCR的方法进行扩增。参见例如，Hertogs等，1998，Antimicrob Agents Chemother42(2)：269-76。在一个实例中，包含全部HIV-1PR-和RT-编码序列的2.2-kb片段可采用巢式逆转录-PCR进行扩增。然后可将扩增的核酸合并物，例如，PR-RT-编码序列，与pGEMT3deltaPRT质粒共转染至宿主细胞例如CD4+T淋巴细胞(MT4)中，所述质粒中去除了大部分PR(密码子10～99)和RT(密码子1～482)序列。同源重组导致含有病毒编码序列，例如源自血浆中HIV-1RNA的PR-和RT-编码序列的嵌合病毒产生。嵌合病毒针对目前所有靶向转染基因的产物的有效抗病毒剂(例如proRT和/或PR抑制剂)的易感性，可通过本领域已知的任何细胞存活试验进行测定。例如，可以在能够实现高样品通量的自动化系统中使用基于MT4细胞-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化二苯基四唑的细胞存活试验。对所有抗病毒剂例如RT和PR抑制剂的抗性图谱可用单PR-RT-抗病毒图(Antivirogram)进行图解显示。
本领域技术人员已知的其它用于评价病毒对抗病毒药的表型易感性的实验也可使用。例如参见，Shi和Mellors，1997，AntimicrobAgents Chemother.41(12)：2781-85；Gervaix等，1997，Proc NatlAcad Sci U.S.A.94(9)：4653-8，这些文件全文引入此处作为参考。
在另一个实施方案中，病毒对用抗病毒疗法治疗的易感性通过检测在存在所述抗病毒疗法时，该抗病毒疗法的靶位的活性进行测定。在一个实施方案中，所述病毒是HIV，所述抗病毒疗法是蛋白酶抑制剂，而抗病毒疗法的靶点是HIV蛋白酶。例如参见，美国专利号5,436,131；6,103,462，这些文件全文引入此处作为参考。
5.6将表型易感性和基因型高易感性相关联
可将本领域中任何已知方法用于确定突变是否与病毒对抗病毒疗法的易感性的增加相关联并因此是根据本发明的HSAM。在一个实施方案中，P值用于确定相关性的统计学显著性，这样P值越小，检测值的显著性越高。优选地，P值低于0.05。更优选地，P值低于0.01。P值可按本领域技术人员已知的任何方法进行计算。在一个实施方案中，采用Fisher′s精确检验计算P值。例如参见，David Freedman，Robert Pisani & Roger Purves，1980，STATISTICS，W.W.Norton，New York。在另一实施方案中，采用t检验和非参数kruskal-Wallis检验计算P值(Statview 5.0软件，SAS，Cary，NC)。
在一个优选实施方案中，将某些含有被分析的、IC50倍数改变等于或低于每种蛋白酶抑制剂倍数改变分布的第10个百分位的样品与不含所述突变的某些样品比较。可构建2×2表并且可使用Fisher′s精确检验计算P值(参见实施例1)。将小于0.05或0.01的P值归为具有统计学显著性。
5.7确定对抗病毒疗法的高易感性
另一方面，本发明提供了一种确定病毒对抗病毒疗法的高易感性的方法。高易感性相关突变(HSAMs)可被鉴定并将其与病毒对抗病毒疗法的易感性增加相关联，如上述5.3-5.6节中所述。可采用本领域的任何已知方法例如上述5.4.2节中所述检测病毒中HSAM的存在。病毒中HSAM的存在可指示该病毒对所述抗病毒疗法易感性增高的可能性增加。在一个实施方案中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。在另一个实施方案中，所述病毒是I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。在另一个实施方案中，所述抗病毒疗法是蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性是否增加的方法，包括检测所述HIV编码的蛋白酶在所述蛋白酶氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的突变，其中所述突变的存在表明HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性增加，前提是所述突变不是L33F。
另一方面，本发明提供了一种确定病毒感染个体对抗病毒疗法的易感性的方法。可鉴定高易感性相关突变(HSAMs)并将其与病毒对抗病毒疗法的增加的易感性相关联，如上述5.3-5.6节所述。可采用本领域的任何已知方法例如上述5.4.2节中所述检测存在于来自所述个体的样品中的病毒中HSAM的存在。病毒中HSAM的存在可指示该个体具有对所述抗病毒疗法具有增高的易感性的可能性增加。在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在另一个实施方案中，病毒是HIV-1。在另一个实施方案中，所述抗病毒疗法是蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂选自沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种确定HIV感染个体对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性是否增加的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测HIV蛋白酶氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的突变，其中所述突变的存在表明个体对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性增加，前提是所述突变不是L33F。
5.8构建算法
一方面，本发明提供了一种将病毒的基因型数据与所述病毒的表型数据相关联的算法的构建方法。在一个实施方案中，该表型数据涉及病毒对抗病毒疗法的易感性。在另一个实施方案中，所述抗病毒疗法是抗病毒化合物。在另一个实施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
在一个实施方案中，构建所述算法的方法包括建立将关于病毒组的基因型数据与关于病毒组的表型数据相关联的一个规则或多个规则。
在一个实施方案中，建立包括病毒组中每一病毒的基因型数据和表型数据的数据组。可使用本领域中任何已知方法来收集关于病毒的基因型数据。上面已经提供了收集所述数据的方法的实例。可使用本领域中任何已知方法收集关于病毒的表型数据。所述方法的实例如上文所述。在优选实施方案中，数据组包括一个或多个上述HSAMs。在一个实施方案中，每一基因型数据均为病毒组中病毒的病毒蛋白质的全部或部分序列。在另一个实施方案中，数据组中的每一基因型数据均为由病毒编码的蛋白质中相对参照病毒中的参照蛋白质的单氨基酸改变。在其它实施方案中，所述基因型包括所述病毒蛋白质中2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸改变。在另一个实施方案中，病毒是HIV，而蛋白质是HIV蛋白酶。在一个实施方案中，病毒是HIV-1。在另一个实施方案中，所述参照蛋白质是来自NL4-3HIV的蛋白酶。
在一个实施方案中，数据组中的每一表型数据均为病毒组中病毒对抗病毒疗法的易感性。在一个实施方案中，抗病毒疗法是抗病毒化合物。在另一个实施方案中，抗病毒化合物是蛋白酶抑制剂。在一个实施方案中，所述易感性按病毒相对参照病毒的易感性的改变进行检测。在另一个实施方案中，所述易感性按病毒IC50相对参照病毒的改变进行检测。在另一个实施方案中，将IC50的改变表示为IC50的倍数改变。在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在另一个实施方案中，所述病毒是HIV-1。在另一个实施方案中，所述参照HIV是NL4-3HIV。
数据组中的基因型数据和表型数据可用本领域任何已知方法进行表示或组织。在一个实施方案中，用图表的方式显示所述数据。在这类表示方法中，Y轴表示该数据组中病毒的IC50相对参照病毒的倍数改变。图表中的每个点均与该数据组中的一个病毒相对应。X轴表示该数据组中病毒所含有的突变数量。点的位置同时表示突变的数量和抗病毒治疗中病毒所具有的倍数改变，上述二者均相对参照株进行检测。在另一个实施方案中，用图解的形式显示数据组中的基因型和表型数据。
一方面，按将数据组中的基因型数据与表型数据相关联的方式建立算法。在一个实施方案中，确定表型临界点。在另一个实施方案中，该表型是对抗病毒疗法的易感性。在另一个实施方案中，所述表型是对抗病毒疗法的易感性相对参照病毒的改变，而临界点是如下的值，即低于该值的病毒或病毒种群被确定为具有对抗病毒疗法的表型高易感性，而高于该值的病毒或病毒种群被确定为具有对抗病毒疗法不具有高易感性(尽管是表型敏感的)。在其它实施方案中，所述临界点是相对于参考病毒IC50的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.07、0.05、0.03、0.02、或0.01的倍数改变。在优选实施方案中，病毒是HIV而抗病毒疗法是用蛋白酶抑制剂的治疗。在更优选的实施方案中，病毒是HIV-1。
在另一个实施方案中，将所述表型临界点用于确定基因型临界点。在一个实施方案中，其通过将数据组的病毒中突变的数量与病毒的表型易感性相关联来实施。这可以通过前面的讨论来完成。选择基因型临界点以便使得具有超过所述数据组中的突变数量的最多的病毒具有表型高易感性(“PT-HS”)，而且使得具有少于所述数据组中的突变数量的大多数病毒不是PT-HS。经过确定，数据组中具有等于或高于所述基因型临界值的突变数量的病毒具有对抗病毒疗法的基因型高易感性(“GT-HS”)，而数据组中具有低于所述基因型临界值的突变数量的病毒对抗病毒疗法不是GT-HS。
虽然该算法能够提供数据组中基因型和表型数据间相关性的有用近似值，但在大多数情况下存在显著数量的GT-HS但不是PT-HS，或PT-HS但不是GT-HS的菌株。因此，在优选实施方案中，还要修改所述算法以便降低数据组中不一致结果的百分比。例如，其通过在由测试算法所考虑的单个位置，从数据组中除去对应于包括含有包括野生型的突变混合的病毒种群的每个数据点来实施。
在另一个实施方案中，给在数据组中观测到的一个或多个突变分配不同的加权值。不包括该步骤的算法假定数据组中的每个突变对病毒或病毒种群对抗病毒治疗总抗性的贡献相等。在很多情况下这不正确。在一个实施方案中，一些突变是“被加权的”即，被分配了增高的突变评分。突变可被分配如下权重，例如，2、3、4、5、6、7、8或更高。例如，被分配权重2的突变将作为病毒中的2个突变进行计数。还可分配分数加权值。在另一个实施方案中，可分配低于1和低于0的值，其中突变与病毒对抗病毒疗法敏感性降低相关。
本领域技术人员将意识到存在给某些突变分配增高的权重时有关的交替。随着突变的权重增高，GT-HS、但非PT-HS不一致结果的数量可增加。因此，如果分配给某突变的权重值过高，可使算法总体不一致性升高。因此，在一个实施方案中，分配给突变一个权重，该权重能够平衡PT-HS但非GT-HS不一致结果的减少与GT-HS但非PT-HS不一致结果的增加。
在另一个实施方案中，数据组中不同突变间的相互作用也作为因子纳入算法中。例如，可发现2个或多个突变以协同方式发挥作用，即，病毒中的突变同时发挥作用时对病毒高易感性的促成作用要显著高于根据各突变彼此独立时的作用所预测的促成作用。或者，可能会发现病毒中2个或多个突变同时发挥作用时对病毒高易感性的促成作用相对于根据各突变独立存在时所预期的对病毒抗性的促成作用较不显著。而且，可发现2个或多个突变一起存在要比突变独立存在频繁得多。因此，在一个实施方案中，给一起存在的突变一起加权。例如，为了避免GT-HS但非PT-HS不一致结果数量的增加，仅给一个突变分配权重1或更大，而给其它一个突变或多个突变分配权重0。
另一方面，通过将数据组的病毒中的突变的数量和类型与病毒的表型易感性相关联可将表型临界点用于确定基因型临界点。突变类型的实例包括，但不限于，主要氨基酸突变、次要氨基酸突变、多肽上为保留净电荷的突变和不会改变特定位置氨基酸的极性、疏水性或亲水性的突变。根据本说明的技术，本发明的范围内还包括其它类型的突变是本领域技术人员所显而易见的。
在一个实施方案中，构建将一个或多类突变所需条件因子化的算法。在另一个实施方案中，算法将一个或多个突变类型的最小数量所需条件因子化。在另一个实施方案中，算法将主要或次要突变的最低数量所需条件因子化。在另一个实施方案中，主要或次要突变联合其它突变的所需条件也作为因子而纳入算法中。例如，可发现具有特定突变组合的病毒具有对抗病毒疗法的高易感性，而当该组合中任一突变单独或与不是该组合部分的其它突变联合而存在于病毒中时，该病毒不具有对抗病毒疗法的高易感性。
通过使用，例如，上述方法，可设计所述算法以便获得任何需要的结果。在一个实施方案中，设计所述算法以便将总一致性(PT-HS、GT-HS和非PT-HS、非GT-HS组的百分数之和或100-(PT-HS、非GT-HS+非PT-HS、GT-HS组的百分数)最大化。在优选实施方案中，总一致性高于约75％、80％、85％、90％或95％。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-R、非GT-HS结果的百分数最小化。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将非PT-HS、GT-HS结果的百分数最小化。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-HS、非GT-HS结果的百分数最大化。在另一个实施方案中，设计所述算法以便将PT-HS、GT-HS结果的百分数最大化。
在算法构建期间或其构建后的任何时间点，其还可以在第二数据组中进行测试。在一个实施方案中，所述第二数据组由不包含于数据组中的病毒组成，即，第二数据组是原始(naive)数据组。在另一个实施方案中，所述第二数据组包括存在于数据组中的一个或多个病毒和不存在于数据组中的一个或多个病毒。将所述算法用于第二数据组，特别是原始数据组，能够评估所述算法的预测能力。因此，在一个实施方案中，使用第二数据组评估算法的精确度，然后如上述修改所述算法的规则以便提供其精确度。在另一个优选实施方案中，将迭代法用于建立所述算法，由此检测算法并随后对其重复修改直至达到需要的精确度水平。
5.9采用算法预测病毒的高易感性
另一方面，本发明还提供了采用本发明的算法预测病毒或病毒衍生物对基于病毒的基因型的抗病毒疗法的表型高易感性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中检测，是否存在一个或多个HSAMs，将该算法规则用于病毒，其中满足所述算法规则的病毒具有对抗病毒治疗的基因型高易感性，而不满足所述算法规则的病毒不具有对抗病毒疗法的基因型高易感性。在另一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中检测是否存在一个或多个HSAMs，将该算法规则用于检测到的HSAMs，其中得分等于或大于基因型临界值则提示该病毒具有对抗病毒疗法的基因型高易感性，而得分低于基因型临界值，则提示该病毒不具有对抗病毒疗法的基因型高易感性。
本发明的算法可用于任何抗病毒药易感性是关注因素的病毒病，如5.4.1节中所述。在特定的实施方案中，本发明的测定法可用于测定逆转录病毒对抗病毒药的易感性。在一个实施方案中，逆转录病毒是HIV。优选地，病毒是HIV-1.
本发明的抗病毒剂可以是抗病毒的任何有效治疗。本发明的实施可用于，例如，理解可在本发明的药物易感性实验中进行检测的病毒的结构、生命周期和遗传成分。这些将被本领域技术人员知晓并提供，例如关键酶和抗病毒剂可靶向的其它分子。本发明的抗病毒剂的实例包括，但不限于，核苷逆转录酶抑制剂例如AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、阿巴卡韦(abacavir)，核苷酸逆转录酶抑制剂例如替诺福韦(tenofovir)，非-核苷逆转录酶抑制剂例如奈韦拉平、依非韦仑、地拉韦定，融合抑制剂例如T-20和T-1249和蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
在本发明的某些实施方案中，将抗病毒剂施用于逆转录病毒。在特定的实施方案中，抗病毒剂是蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
某些与抗病毒剂治疗高易感性相关的突变是现有技术中已知的，如对于蛋白酶抑制剂安泼那韦是N88S。Ziermann et al.，2000，JVirol 74：4414-4419。例如，表1提供了与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变列表。
5.10使用算法预测抗病毒疗法对个体的有效性
另一方面，本发明还提供了一种使用本发明的算法基于病毒对抗病毒疗法的基因型从而预测抗病毒疗法对感染了病毒的个体的有效性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，检测是否存在一个或多个HSAMs，将该算法规则用于病毒，其中满足所述算法规则的病毒具有对抗病毒疗法的基因型高易感性，而不满足所述算法规则的病毒不具有对抗病毒疗法的基因型高易感性。在另一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒的衍生物中，检测是否存在一个或多个HSAMs，将该算法规则用于检测到的HSAMs，其中得分等于或大于基因型临界值提示该病毒具有对抗病毒疗法的基因型高易感性，而得分低于基因型临界值则提示该病毒不具有对抗病毒疗法的基因型高易感性。
如上面5.4.1节中所述，本发明的算法可用于任何抗病毒药易感性是关注因素的病毒病，而本发明的抗病毒剂可以是任何对病毒有效的治疗法。在特定的实施方案中本发明的测定法用于测定逆转录病毒对抗病毒药的易感性。在一个优选实施方案中，逆转录病毒是HIV。优选地，病毒是HIV-1。在本发明的某些实施方案中，将所述抗病毒剂导向逆转录病毒。在特定的实施方案中，抗病毒剂是蛋白酶抑制剂例如沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。
如上面5.9节中所述，与抗病毒剂治疗易感性的降低相关的突变可获自现有技术或采用如上面5.4-5.8节中所述方法测定。
在某些实施方案中，本发明提供了一种在感染了病毒并在之前正在进行或已经进行了相同或不同抗病毒疗法治疗的患者中监测抗病毒疗法有效性的方法，包括在所述个体的样品中检测，是否存在与对抗病毒疗法治疗的高易感性相关的氨基酸残基，其中所述残基的存在与所述抗病毒疗法治疗的高易感性相关。
5.11 将对一种抗病毒疗法的高易感性与对另一种抗病毒疗法的高 易感性相关联
另一方面，本发明提供了一种采用本发明的算法，基于病毒对不同抗病毒疗法的基因型易感性，预测抗病毒疗法对病毒的有效性。在一个实施方案中，所述方法包括在病毒或病毒衍生物中检测，是否存在一个或多个与对抗病毒疗法的高易感性相关的突变并将本发明的算法规则用于检测到的突变，其中得分等于或高于基因型临界值则表明该病毒具有对不同抗病毒疗法的基因型高易感性，而得分低于基因型临界值时则表明该病毒不具有对不同抗病毒疗法的基因型高易感性。在另一个实施方案中，所述两种抗病毒疗法影响相同的病毒蛋白质。在另一个实施方案中，所述两种抗病毒疗法均为蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的实例包括，但不限于，沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、奈非那韦、安泼那韦和洛匹那韦。而在另一实施方案中，与对一种蛋白酶抑制剂的抗性相关的突变还与对另一蛋白酶抑制剂的抗性相关。
6.实施例
下述实施例用于举例说明本发明而并非对本发明主题的限制。
6.1实施例1：分析患者样品以鉴定高易感性相关突变
本实施例证明了分析患者样品从而鉴定与对蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变的方法。
为了测定HIV-1病毒株的蛋白酶序列和其对蛋白酶抑制剂治疗的易感性之间的关系，将患者血浆样品的数据组进行基因型和表型分析。采用PHENOSENSETM(Virologic，South San Francisco，CA)HIV分析法(Petropoulos等，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928；美国专利号5,837,464和6,242,187)实施表型分析。血浆样品取自HIV-1感染患者。除去来自相同患者的重复样品以便避免因突变的独特组合引起的可能偏差。此外，排除了在HIV-1蛋白酶或HIV-1逆转录酶中具有任何抗性选择的突变的样品(见表2)。这产生了1515个样品的数据组。在分析中考虑了在样品组的至少1％(即至少15个样品)中改变的蛋白酶位置。从患者样品获得HIV-1对一些蛋白酶抑制剂的IC50值。将其与蛋白酶抑制剂抗NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照病毒株的IC50进行比较。将表型数据表示为蛋白酶抑制剂的50％抑制浓度(IC50)时的“倍数改变”(或log倍数改变)。通过用蛋白酶抑制剂抗来自患者血浆样品的HIV-1的IC50除以蛋白酶抑制剂抗NL4-3(GenBank登录号AF324493)参照病毒株的IC50计算倍数IC50值。
从图2中可以看出，观察到的倍数改变值对于所有蛋白酶抑制剂都是正态分布。表3表示安泼那韦(″APV″)，茚地那韦(″IDV″)，奈非那韦(″NFV″)，利托那韦(″RTV″)，沙奎那韦(″SQV″)和洛匹那韦(″LPV″)的平均、中值、第90个百分位和第10个百分位值。
高敏感性定义为等于或小于每种蛋白酶抑制剂的倍数改变分布的第10个百分位的倍数改变。图3表示野生型或参照病毒的不同蛋白酶抑制剂以及对不同蛋白酶抑制剂具有高易感性的样品的抑制曲线。抑制百分比作图于Y轴，蛋白酶抑制剂浓度(以nM为单位)作图于X轴。从图中可以看出，与野生型病毒相比，对蛋白酶抑制剂具有高易感性的样品的曲线(实线)向左移，表示与野生型相比，样品具有较低的IC50(因此易感性增加)。
通过t检验和非参数Kruskal-Wallis检验比较在每个位置有或无突变的样品的平均对数转化的倍数改变。用Fisher精确检验比较确定为高易感性的在每个位置有或无突变的样品数。0.05或更小的P值被认为是显著的。表1列出了通过所有三种统计学检验发现与对不同蛋白酶抑制剂的高易感性相关的位置。“正相关”列的突变在发现对蛋白酶抑制剂具有高易感性的样品中表现过度，而“负相关”列的突变在发现对蛋白酶抑制剂具有高易感性的样品中表现不足。具有列于“负相关”列的位置的突变的病毒很可能对蛋白酶抑制剂的易感性降低。但是，降低的易感性将是低水平的。加下划线的位置与平均倍数改变中的最大改变相关。图4表示野生型病毒(″wt″)、含有野生型病毒和所指出的突变体的样品的混合物(″mix″)、和含有指定突变体(″mt″)的不同蛋白酶抑制剂的logFC。选择这些突变体中平均倍数改变最大的那些(如对于APV是P39，对于IDV是E65，等)。
列于表1并且与高易感性相关的一些突变通常同时存在，如69+89、20+36和36+89位置的突变。由于M36I，R41K，H69K和L89M是非B分化体HIV的标志突变，非B分化体HIV可能对某些蛋白酶具有增加的易感性。图5表示B分化体和非B分化体病毒的蛋白酶抑制剂易感性。从图中可以看出，非B分化体病毒通常(SQV除外)通常比B分化体病毒具有更高的对蛋白酶抑制剂的易感性。这在HIV-1感染个体的治疗中具有重要意义。与感染B分化体HIV的个体相比，感染非B分化体HIV的个体对蛋白酶具有高易感性的可能性增加。
图6表示对通过分化体划分的HIV的蛋白酶抑制剂易感性。分化体HIV和含每种分化体的样品数目表示于图的右边。从图中可以看出，不同的分化体HIV对不同的蛋白酶抑制剂具有不同易感性。如果已知感染个体的分化体HIV，则可以使用该分化体HIV最易感的蛋白酶抑制剂。
6.2实施例2：与针对一种蛋白酶抑制剂的高易感性相关的突变 对针对另一种蛋白酶抑制剂的高易感性的影响
为了证实PhenoSenseTM测定行为能够区别野生型病毒中观察到的变异范围内表型易感性的小差异，检验了蛋白酶抑制剂对之间的关系。如果所有的变异都是因为测定行为，预计在一种药物的FC和另一种药物的FC之间没有关联。相反，在许多蛋白酶抑制剂对中观察到了密切相关。表4概括了每对的回归系数。图7表示两对蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂易感性协方差。从图中可以看出，蛋白酶抑制剂之间的关联非常高(相关系数，对于IDV和RTV，R2＝0.69；对于LPV和APV，R2＝0.74)。
为了确定对蛋白酶抑制剂的高易感性是否与降低的复制能力(″RC″)相关，采用获自未接触药物的、最近感染的、缺乏对任何药物的降低的易感性(FC＞2.5)的患者或获自具有也对任何药物缺乏降低的易感性(FC＞2.5)的病毒RC数据的数据库样品随机取样的402个病毒的数据组，产生每种蛋白酶抑制剂与RC的散点图。从图中可以看出，尽管对于某些药物存在弱的相关性(如SQV和LPV)，在所有情况下存在许多具有低RC但正常(非HS)的FC，以及具有高RC(是HS)的样品。因此，HS表型不能总是通过低RC进行解释。
本说明书所引用的全部参考文件均为全文引入作为参考。
此处提供的实际的和预测的实施例仅用于具体描述本发明而不意欲以任何方式限制本发明。
                                             表1
  与高易感性相关的蛋白酶位置
  蛋白酶抑制剂   正相关   负相关
  APV   20，36，39，65，69，77，89   10，15
  IDV   16，39，65   10，57，63，93
  NFV   16，39，65，69，89   10，57，63，71
  RTV   39，65，93   15，57
  SQV   33*，37，45，65，77   15，36，41，57，60
  LPV   33*，39，65，77，93   无
*33位的所有突变，除33F
加下划线的位置与平均FC的最大改变相关
                                        表2
  抗性相关突变
  蛋白   氨基酸位置
  蛋白酶   23，24，30，32，33F，46，47，48，50，54，82(不是I)，84，88，90
逆转录酶   41，62，65，67，69，70，74，75，77，98G，100，101，103，106，108，115，116，151，181，184，188，190，210，215，219，225，227，236
                                             表3
  倍数改变值的分布
  倍数改变   APV   IDV   NFV   RTV   SQV   LPV
  平均值   0.69   0.78   1.05   0.82   0.70   0.68
  中值   0.71   0.78   1.05   0.81   0.71   0.69
  第90个百分位   1.32   1.35   2.09   1.55   1.12   1.15
  第10个百分位   0.35   0.44   0.54   0.45   0.44   0.40
                        表4
  每对蛋白酶抑制剂的回归系数总结
  IDV   NFV   RTV   SQV   LPV
  APV   0.64   0.58   0.70   0.48   0.71
  IDV   0.79   0.68   0.62   0.71
  NFV   0.71   0.49   0.58
  RTV   0.60   0.77
  SQV   0.72
                 序列表
<110>ViroLogic，Inc.
     Parkin，Neil T.
     Paxinos，Ellen
     Chappey，Colombe
     Wrin，Mary T.
     Gamarnik，Andrea
     Beauchaine，J.
     Whitcomb J.M.
     Petropoulos，Christos J.
<120>确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂易感性的组合物和方法
<130>11068-015-228
<140>
<141>
<150>60/393,234
<151>2002-07-01
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>99
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>1
Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly
1               5                   10                  15
Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val
            20                  25                  30
Leu Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile
    50                  55                  60
Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr
65                  70                  75                  80
Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr
                85              90                      95
Leu Asn Phe
<210>2
<211>297
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<400>2
cctcagatca ctctttggca gcgacccctc gtcacaataa agataggggg gcaattaaag     60
gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag aagaaatgaa tttgccagga    120
agatggaaac caaaaatgat agggggaatt ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat    180
cagatactca tagaaatctg cggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca    240
cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg actcagattg gctgcacttt aaatttt       297

Claims (23)

1.一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性是否增加的方法，包括检测所述蛋白酶氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的至少一种突变，其中所述突变的存在表明HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性增加，前提是所述突变不是L33F。
2.一种确定HIV感染个体对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性是否增加的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测HIV蛋白酶氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的至少一种突变，其中所述突变的存在表明个体对蛋白酶抑制剂治疗具有高易感性的可能性增加，前提是所述突变不是L33F。
3.一种长度为约10～约40个核苷酸的编码HIV蛋白酶的一部分的分离的寡核苷酸，该部分包括位于所述人免疫缺陷病毒中所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置16、20、33、36、37、39、45、65、69、77、89或93的至少一种突变，前提是所述突变不是L33F。
4.权利要求1或2的方法，其中所述人免疫缺陷病毒是1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)。
5.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶具有与SEQ ID NO：1的同一性大于90％的序列。
6.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是安泼那韦。
7.权利要求6的方法，其中所述氨基酸位置是20、36、39、65、69、77或89。
8.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是茚地那韦。
9.权利要求8的方法，其中所述氨基酸位置是16、39或65。
10.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是奈非那韦。
11.权利要求10的方法，其中所述氨基酸位置是16、39、65、69或89。
12.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是利托那韦。
13.权利要求12的方法，其中所述氨基酸位置是39、65或93。
14.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是沙奎那韦。
15.权利要求14的方法，其中所述氨基酸位置是33、37、45、65或77。
16.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是洛匹那韦。
17.权利要求16的方法，其中所述氨基酸位置是33、39、65、77或93。
18.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶中是否存在所述突变是通过序列特异性寡核苷酸探针与编码所述突变的人免疫缺陷病毒的核酸序列杂交而检测的。
19.权利要求1或2的方法，其中所述蛋白酶中是否存在所述突变是通过确定编码所述突变的核酸序列而检测的。
20.权利要求2的方法，其中所述个体正在进行或已经进行抗病毒药物治疗。
21.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括检测在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸位置是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性相关的突变。
22.一种确定HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括：检测所述HIV编码的蛋白酶在所述蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置10、15、36、41、57、60、63、71或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性负相关的至少一种突变，其中所述突变的存在指示HIV对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性增加。
23.一种确定HIV感染个体对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性是否增加的方法，包括：在来自所述个体的样品中检测HIV蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸位置10、15、36、41、57、60、63、71或93是否存在与对所述蛋白酶抑制剂治疗的高易感性负相关的至少一种突变，其中所述突变的存在指示该个体对蛋白酶抑制剂治疗具有低水平的易感性降低的可能性增加。
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