CN102994459A - 一种对蛋白酶抑制剂耐药的hiv毒株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对蛋白酶抑制剂耐药的HIV毒株。本发明提供了一种重组HIV病毒，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子、第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子、第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒。本发明对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。本发明构建的耐药毒株对克力芝（LPV/r）具有良好的耐药性，可以体外模拟病人由于使用此蛋白酶抑制剂所产生的耐药性，如果新药对此毒株有良好的抗病毒效果，那么此药才有上市的必要。
Description
技术领域
本发明涉及一种对蛋白酶抑制剂耐药的HIV毒株。
背景技术
人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，自1981年美国首次诊断出艾滋病以来，艾滋病在全球范围内迅速传播，2010年底全球约3400万人携带HIV，我国截止2011年底有78万HIV感染者和艾滋病病人。
HIV基因组由两条相同的正链RNA组成，每条RNA长约9.2-9.8kb，包括如下9个基因：（1）gag基因（编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17，P24、P7、P6等核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏）；（2）pol基因（编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需）；（3）env基因（编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，并切割形成gp120和gp41）；（4）tat基因（编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译）；（5）rev基因（产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白）；（6）nef基因（编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用）；（7）vif基因（可以介导机体细胞内的天然抗病毒蛋白APOBEC3G的降解，影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播）；（8）vpu基因（为HIV-1所特有，可以介导机体细胞内的天然抗病毒蛋白Tetherin的降解，为HIV的有效复制所必需）；（9）vpr基因（编码蛋白是一种弱的转录激活物，具有致凋亡和细胞周期改变功能，在病毒体内繁殖周期中起一定作用）。
1996年高效抗反转录病毒联合治疗(HAART)的出现和应用成为艾滋病(AIDS)抗病毒治疗史上具有里程碑意义的重大事件。临床观察表明，抗病毒治疗对减轻病情、提高病人生活质量、延长生命具有很好的作用。目前已经应用于临床的药物包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、整合酶抑制剂和CCR5受体拮抗剂六类。
蛋白酶抑制剂包括沙奎那韦（saquinavir）、茚地那韦（indinavir）、利托那韦（ritonavir）、奈非那韦（nelfinavir）、安普那韦（amprenavir）、福司安普那（fosamprenavir）、洛匹那韦（lopinavir）、安扎那韦（atazanavir）、替派那韦（tipranavir）和达如那韦（darunavir）共十种。利托那韦（ritonavir）一般作为药代动力学增强剂，与其他药物配伍，提高血药浓度，减少单一突变对药物活性的影响。克力芝（洛匹那韦/利托那韦；LPV/r）是由蛋白酶抑制剂洛匹那韦和利托那韦组成的复方制剂，是目前最有效的临床治疗药物之一。
美国卫生与公共服务部(DHHS)于2011年10月发布了最新成人及青少年HIV/AIDS抗病毒治疗指南，其中对于孕妇的HAART首选方案、成人及青少年多个备选抗病毒方案和一些可以接受的抗病毒治疗方案中均包括蛋白酶抑制剂。可见在美国的临床治疗观察中，蛋白酶抑制剂是一种非常有效的抗病毒治疗药物。我国从2003年开始在全国范围内逐步实施免费的艾滋病抗病毒治疗，现免费提供的抗艾滋病药物有七种，包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂三类。克力芝（LPV/r）是其中唯一的免费蛋白酶抑制剂。我国2012年发布的第三版《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》对于妊娠、分娩、哺乳期的感染女性推荐的治疗方案也包括克力芝（LPV/r）。
在我国对艾滋病感染者提供的免费治疗包括一线和二线药物治疗方案。其中一线药物治疗方案只包括两种核苷类逆转录酶抑制剂和一种非核苷类逆转录酶抑制剂，是我国刚开始提供免费抗艾滋病病毒治疗时采用的方案。然而，随着其应用范围的不断扩大和应用时间的不断延长，耐药性问题已经日益凸显，部分地区治疗病人中HIV耐药性发生率已经超过了60％，成为制约HIV免费治疗的一个主要瓶颈。HIV是一种能够产生高度变异的病毒，它复制更新很快，缺乏逆转录酶的校对功能，致使它能很快产生继发性耐药毒株，甚至当治疗失败后，病人已经对多种药物产生耐药性，或者因HIV的原发性耐药，病人对初始方案就不敏感。所以，现今的临床治疗会先检测病人体内病毒的耐药性，根据病人情况为其制定治疗方案。在一线药物无法有效抑制病毒复制时，需要更换使用二线药物。二线药物一般包括两种核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。截止2012年7月31日，全国正在接受抗病毒治疗的人数为146635例，其中服用二线药物的有22003例，全国儿童正在服用二线药物的人数为223例，毋庸置疑，随着耐药性问题的日益严重，蛋白酶抑制剂的应用将越来越广泛。
由于合成工艺比较困难，中国蛋白酶抑制剂的仿制落后于核苷类、非核苷类逆转录酶抑制剂，我国面临必须填补蛋白酶抑制剂生产空白的现状，为HIV感染者提供更多的抗病毒治疗选择。根据新药研发的有关规定，新型抗HIV药物上市前必须评价其耐药性，即使用蛋白酶抑制剂耐药的HIV毒株检测其抗病毒效果，再进行临床观察。
发明内容
本发明的目的是提供一种对蛋白酶抑制剂耐药的HIV毒株。
本发明提供了一种重组HIV病毒，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸（G）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子、第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸（I）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子、第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸（V）的密码子突变为丙氨酸（A）的密码子，得到的重组HIV病毒。
所述蛋白酶可为序列表的序列3所示的蛋白质。
所述野生型HIV病毒可为野生型的HIV-1B亚型病毒。
所述“第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸（G）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第143位核苷酸由g突变为t。
所述“第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸（I）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第160位核苷酸由a突变为g。
所述“第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸（V）的密码子突变为丙氨酸（A）的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第245位核苷酸由t突变为c。
以上任一所述编码蛋白酶的基因可为序列表的序列2所示的DNA分子。
所述重组HIV病毒是将重组质粒导入离体的哺乳动物细胞并培养哺乳动物细胞得到的；所述重组质粒为将特异DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述特异DNA分子为将野生型HIV病毒的基因组DNA中编码蛋白酶自N末端第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸（G）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子、第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸（I）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子、第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸（V）的密码子突变为丙氨酸（A）的密码子，得到的DNA分子。
所述蛋白酶可为序列表的序列3所示的蛋白质。
所述野生型HIV病毒可为野生型的HIV-1B亚型病毒。
所述“第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸（G）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第143位核苷酸由g突变为t。
所述“第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸（I）的密码子突变为缬氨酸（V）的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第160位核苷酸由a突变为g。
所述“第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸（V）的密码子突变为丙氨酸（A）的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第245位核苷酸由t突变为c。
以上任一所述编码蛋白酶的基因可为序列表的序列2所示的DNA分子。
所述重组质粒具体可为将pNL4.3质粒中序列表的序列2所示DNA分子取代为序列表的序列4所示DNA分子得到的重组质粒。
所述重组质粒具体可为将pNL4.3质粒中HIV-1B亚型野生株的蛋白酶的编码基因）自5’末端第143位核苷酸由g突变为t，第160位核苷酸由a突变为g，第245位核苷酸由t突变为c，获得的重组质粒G48V-I54V-V82ApNL4-3。
所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。
所述培养的方法具体可为：37℃培养18-48h。
所示重组HIV病毒的基因组DNA具体可为将序列表的序列1自5’末端第2253至2549位核苷酸所示的DNA分子取代为序列4所示DNA分子得到的DNA分子。
以上任一所述的重组HIV病毒可用于筛选抗HIV病毒的药物。
本发明对于抗HIV药物的筛选具有重大价值，进而对艾滋病的治疗具有深远影响。
本发明构建的耐药毒株对克力芝（LPV/r）具有良好的耐药性，可以体外模拟病人由于使用此蛋白酶抑制剂所产生的耐药性，如果新药对此毒株有良好的抗病毒效果，那么此药才有上市的必要。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.2，0.01M的PBS缓冲液。
pMD18-T载体：TaKaRa公司。
293T细胞（人肾上皮细胞系）：购自中国医学科学院基础医学研究所。
Lipofectamine 2000：购自Invitrogen，Cat No：11668-019。
Luciferase Assay System:购自Promega，Cat No：E1500。
pNL4.3质粒：公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得；参考文献：Wang C,Mitsuya Y,Gharizadeh B,Ronaghi M,Shafer RW.Characterization of mutation spectra with ultra-deep pyrosequencing:application to HIV-1 drug resistance.Genome Res.2007;17(8):1195-201.；Hoffmann C,Minkah N,Le ipzig J,Wang G,Arens MQ,Tebas P,Bushman FD.NA barcoding and pyrosequencing to identify rare HIV drug resistance mutations.Nucleic Acids Res.2007;35(13):e91.；pNL4.3质粒含有HIV-1B亚型野生株的全基因组序列，转染细胞并表达可以得到HIV-1B亚型野生株。HIV-1B亚型野生株的基因组DNA如序列表的序列1所示，其中自5’末端第2253至2549位核苷酸（也就是序列表的序列2所示的核苷酸）为野生型蛋白酶的编码基因，编码序列表的序列3所示的野生型蛋白酶。
MT-4细胞（人T淋巴细胞系）：参考文献：Harada S,Koyanagi Y,Yamamoto N.Infection of HTLV-III/LAV in HTLV-I-carrying cells MT-2 and MT-4 andapplication in a plaque assay.Science 1985;229:563-566,。
TZM-bl细胞：参考文献：Platt EJ,Bilska M,Kozak SL,Kabat D,MontefioriDC.Evidence that ecotropic murine leukemia virus contamination in TZM-bl cellsdoes not affect the outcome of neutralizing antibody assays with humanimmunodeficiency virus type 1.J Virol.2009;83(16):8289-92.。
克力芝（LPV/r）：由雅培公司所生产的蛋白酶抑制剂，商品名是“克力芝（Kaletra）”，药物名称是“洛匹那韦/利托那韦软胶囊”，每粒软胶囊中的药物含量为“洛匹那韦133.3mg/利托那韦33.3mg”。
实施例1、HIV耐药株的构建
一、构建具有定点突变的重组质粒
1、以pNL4.3质粒为模板，用PI-1和PI-2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（约1360bp）。
PI-1:5’-AGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAAC-3’；
PI-2:5’-TCTGTTTTAACCCTGCAGGATGTGGTATTC-3’。
2、设计用于定点突变的引物如下：
PI-3:5’-TTCCCACTATCATTTTTGGTTTCC-3’，
PI-4:5’-TTGGAGGTTTTGTCAAAGTAAGA-3’。
PI-5:5’-TACTAATACTGTACCTATAGCTTTATGTCC-3’,
PI-6:5’-GGACCTACACCTGCCAACATAAT-3’。
3、将步骤1的PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，得到重组质粒甲。
4、以重组质粒甲为模板，用PI-3和PI-4组成的引物对进行PCR扩增，并在T4DNA连接酶的作用下得到重组质粒乙（因为是对环状DNA进行扩增，PI-3和PI-4分别扩增环状DNA的正义链和反义链，PCR扩增结束后，扩增产物在T4 DNA连接酶的作用下形成新的环形DNA，即重组质粒乙；重组质粒乙和重组质粒甲的区别仅在于：将重组质粒甲中携带的野生型蛋白酶编码基因自5’末端第143位核苷酸由g突变为t，第160位核苷酸由a突变为g）。
5、以重组质粒乙为模板，用PI-5和PI-6组成的引物对进行PCR扩增，并在T4DNA连接酶的作用下得到重组质粒丙（重组质粒丙和重组质粒甲的区别仅在于：将重组质粒甲中携带的野生型蛋白酶编码基因自5’末端第143位核苷酸由g突变为t、第160位核苷酸由a突变为g、第245位核苷酸由t突变为c，从而使得序列表的序列3所示的野生型蛋白酶自N末端第48位氨基酸残基由G突变为V、第54位氨基酸残基由I突变为V、第82位氨基酸残基由V突变为A；即将重组质粒甲中携带的序列表的序列2所示的野生型蛋白酶编码基因突变为了序列表的序列4所示的突变型蛋白酶编码基因；序列4所示的突变型蛋白酶编码基因编码序列表的序列5所示的突变蛋白酶）。
6、用限制性内切酶SpeI和Sse8387I双酶切重组质粒丙，回收酶切产物（约1340bp）。
7、用限制性内切酶SpeI和Sse8387I双酶切pNL4.3质粒，回收载体骨架（约13kb）。
8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒丁（又称重组质粒G48V-I54V-V82A-pNL4-3）。根据测序结果，对重组质粒丁进行结构描述如下：将pNL4.3质粒中，序列表的序列2所示的野生型蛋白酶编码基因替换成为了序列表的序列4所示的突变型蛋白酶基因。
二、构建三突变（G48V、I54V、V82A）的HIV耐药株
1、用DMEM培养基（含100μg/ml青霉素和100U/ml链霉素）重悬293T细胞，得到4×105个细胞/ml的细胞悬液。
2、将细胞悬液加入6孔培养板，每孔2ml，37℃培养24小时，然后弃除上清，用PBS缓冲液洗涤两次。
3、借助Lipofectamine 2000（按说明书操作），将重组质粒丁转染步骤2的细胞（每孔转染4微克重组质粒），37℃培养36小时，收集培养上清。
4、将步骤3得到的培养上清进行P24抗原测定（P24试剂盒：Vironostika＠HIV-1Antigen Microelisa system,生产商：BiomeriEUX,产地：法国），结果为阳性，该培养上清即为即为HIV耐药株病毒液，分装后-80℃保存。
三、HIV-1B亚型野生株的获得
将pNL4.3质粒代替重组质粒丁，其它同步骤二，获得HIV野生株病毒液。
实施例2、突变病毒株的病毒感染力鉴定
将实施例1的步骤二得到HIV耐药株病毒液和实施例1的步骤三得到的HIV野生株病毒液分别进行如下鉴定：
1、在96孔板中每孔加入100μl含体积百分比为10%的FBS的RPMI1640培养液。
2、吸取25μl待测病毒液于第1列孔中，混匀，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀释11次，每个稀释度设置4个复孔，设置最后一列不加入病毒液的孔作为对照孔。
3、每孔中加入100μl MT-4细胞液（MT-4细胞液是用含体积百分比为10%的FBS的RPMI1640培养液悬浮MT-4细胞得到的，100μl MT-4细胞液中含有10000个细胞）。37℃培养3天，取培养上清。
4、取荧光检测96孔板（品牌：Greiner；生产商：Greiner Bio-One；产地：德国；产品目录号：655086），每孔加入100μl步骤3得到的培养上清和100μl TZM-bl细胞液（TZM-bl细胞液是用含体积百分比为10%的FBS的DMEM培养液悬浮TZM-bl细胞得到的，100μl TZM-bl细胞液中含有10000个细胞），37℃培养1天，使用荧光素酶检测试剂盒（英文名：Luciferase Assay System；品牌：Promega；生产商：PromegaCorporation；产地：美国；产品目录号：E1501）检测病毒感染情况。
TCID50（Tissue culture infective dose,半数组织培养感染剂量）指引起50%细胞发生感染(cytopathic effect,CPE)的病毒量。
HIV耐药株病毒液的病毒感染力为217166TCID50/ml。
HIV野生株病毒液的病毒感染力为456878TCID50/ml。
HIV耐药株的病毒感染力较HIV野生株更强。
实施例3、突变病毒株的耐药性鉴定
将实施例1的步骤二得到HIV耐药株病毒液和实施例1的步骤三得到的HIV野生株病毒液分别进行如下鉴定：
1、在96孔板中每孔加入100μl含体积百分比为10%的FBS的RPMI1640培养液。
2、使用RPMI1640培养液稀释克力芝，使洛匹那韦的浓度为10μM（洛匹那韦的分子量为628.81）。
3、吸取25μl药物溶液于第1列孔中，混匀，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀释11次，每个稀释度设置4个复孔，设置最后一列不加入药物的孔作为对照孔。
4、取新的96孔板（用于细胞培养），每孔中加入100μl MT-4细胞液（MT-4细胞液是用含体积百分比为10%的FBS的RPMI1640培养液悬浮MT-4细胞得到的，100μl MT-4细胞液中含有10000个细胞）。
5、用PBS缓冲液调整待测病毒液的浓度，得到病毒量为4000TCID50/ml的病毒稀释液。
6、在步骤4的细胞培养板中每孔加入50μl步骤5的病毒稀释液，然后分别每孔加入50μl步骤3配置的依次稀释的药物，37℃培养3天，取培养上清。
7、同实施例2的步骤4。
8、计算50%细胞出现CPE时的药物浓度，即IC50值。
HIV耐药株病毒液的IC50值为0.07127μM。
HIV野生株病毒液的IC50值为0.001899μM。
耐药倍数=HIV耐药株病毒液的IC50值/HIV野生株病毒液的IC50值=37.53。
Claims (10)
1.一种重组HIV病毒，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子、第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子、第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒。
2.如权利要求1所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述野生型HIV病毒为野生型的HIV-1B亚型病毒。
3.如权利要求1或2所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述“第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第143位核苷酸由g突变为t。
4.如权利要求1或2或3所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述“第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第160位核苷酸由a突变为g。
5.如权利要求1或2或3或4所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述“第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第245位核苷酸由t突变为c。
6.如权利要求1或2所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述重组HIV病毒是将重组质粒导入离体的哺乳动物细胞并培养哺乳动物细胞得到的；所述重组质粒为将特异DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述特异DNA分子为将野生型HIV病毒的基因组DNA中编码蛋白酶自N末端第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子、第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子、第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，得到的DNA分子。
7.如权利要求6所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述“第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第143位核苷酸由g突变为t。
8.如权利要求6或7所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述“第54位氨基酸残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为缬氨酸的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第160位核苷酸由a突变为g。
9.如权利要求6或7或8所述的重组HIV病毒，其特征在于：所述“第82位氨基酸残基的密码子由缬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子”的实现方法如下：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶的基因的开放阅读框自5’末端第245位核苷酸由t突变为c。
10.权利要求1至9中任一所述的重组HIV病毒在筛选抗HIV病毒的药物中的应用。
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|---|---|
| CN (1) | CN102994459A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774971A (zh) * | 2015-04-17 | 2015-07-15 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种用于筛选和评价艾滋病治疗药物的毒株试剂盒 |
| CN118360259A (zh) * | 2024-06-18 | 2024-07-19 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种条件复制型hiv弱毒株及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1688719A (zh) * | 2002-07-01 | 2005-10-26 | 瓦罗洛吉克公司 | 确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂易感性的组合物和方法 |
| CN102392039A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-03-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | Hiv-1b亚型耐药突变株及其构建方法和应用 |
-
2012
- 2012-12-11 CN CN2012105335515A patent/CN102994459A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1688719A (zh) * | 2002-07-01 | 2005-10-26 | 瓦罗洛吉克公司 | 确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂易感性的组合物和方法 |
| CN102392039A (zh) * | 2011-11-04 | 2012-03-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | Hiv-1b亚型耐药突变株及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| AKBAR ALI ET AL.: "Molecular Basis for Drug Resistance in HIV-1 Protease", 《VIRUSES》 * |
| JOHN D. BAXTER ET AL.: "Genotypic Changes in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Protease Associated with Reduced Susceptibility and Virologic Response to the Protease Inhibitor Tipranavir", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 * |
| LI,H.ET AL.: "HIV-1 isolate B6 from China pol protein (pol) gene, partial cds", 《GENBANK: GU328958.1》 * |
| RHEE ET AL.: "Detailed DRM Phenotype Query", 《HIV DRUG RESISTANCE DATABASE》 * |
| VALENTINA SVICHER ET AL.: "Novel Human Immunodeficiency Virus Type 1 Protease Mutations Potentially Involved in Resistance to Protease Inhibitors", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774971A (zh) * | 2015-04-17 | 2015-07-15 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种用于筛选和评价艾滋病治疗药物的毒株试剂盒 |
| CN118360259A (zh) * | 2024-06-18 | 2024-07-19 | 苏州药明检测检验有限责任公司 | 一种条件复制型hiv弱毒株及其制备方法和应用 |
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