KR100910545B1 - Ｃ형 간염 바이러스(ｈｃｖ) 및 사람 면역결핍 바이러스(ｈｉｖ)의 효과적인 다중 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 이용 방법, 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents
Ｃ형 간염 바이러스(ｈｃｖ) 및 사람 면역결핍 바이러스(ｈｉｖ)의 효과적인 다중 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이의 이용 방법, 및 이를 포함하는 키트 Download PDFInfo
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Abstract
사람 피검체로 부터의 생물학적 샘플 중의 C형 간염 바이러스 및 사람 면역결핍 바이러스의 동시 검출을 위한 방법 및 키트가 기술되어 있다.
C형 간염 바이러스(HCV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 다중 검출, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 키트
Description
본 발명은 생물학적 샘플 중에서 핵산 서열, 특히 감염성 미생물로부터 유래된 서열을 검출하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
사람 면역결핍 바이러스(HIV)는 전세계의 수백만의 사람을 감염시켜 결국 심각한 공중 건강 문제를 나타낸다. 오염된 혈액 제품을 통한 HIV 감염의 확산은 환자의 샘플 중에서 소량의 HIV RNA를 검출할 수 있는 스크리닝 방법이 요구됨을 의미한다. 더욱이, HIV 감염에 대한 개선적인 치료 가능성의 증가는, 환자의 감염의 조기 검출이 적절한 치료 개입을 시작하기 위하여 중요함을 의미한다.
C형 간염 바이러스(HCV)는 전세계적으로 수혈후 간염의 대부분의 사례 및 산재성(또는 집단 획득성) 간염 사례의 상당 부분에 대한 관련된 비경구적으로 전염되는 바이러스이다. 세계 인구의 1% 이상이 HCV에 감염된 것으로 추산된다. HCV 감염은 급성 간염, 만성 간염, 경변증 및 후속의 간세포 암종과 연관된다.
HCV는 현재 플라비비리데과(family Flaviviridae)에서 분리된 속인 헤파시바이러스(Hepacivirus)로서 분류된다. 이의 게놈은 약 3,000개 아미노산의 다단백질 전구체를 암호화하는 하나의 거대한 개방 판독 프레임(ORF)을 갖는 약 9,500개 뉴클레오티드의 + -쇄형 RNA 분자로 이루어져 있다. 거대한 ORF의 상부에는, 게놈 중에서 가장 잘 보존된 부위인 약 340 뉴클레오티드의 5' 비-암호화 (non-coding; NC) 부위가 존재한다. ORF의 5'부위(5'-에서-3' 방향으로)는 캡시드 단백질, 두개의 외피 당단백질(E1 및 E2), 및 기능을 모르는 작은 단백질(P7)을 암호화 한다. ORF의 3'부위는 프로테아제, 프로테아제/헬리카제 양-기능성 단백질, RNA 폴리머라제, 및 조절성 펩티드를 포함하는 비구조적 단백질을 암호화한다.
전세계로 부터의 HCV 암호화 서열의 분석에 의해, 개개인의 바이러스 분리체 사이에는 상당한 서열 차이가 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 개개 환자로 부터의 HCV 서열의 분석은, 바이러스가 관련되나 동일하지 않은 서열을 포함하는 소위 "유사-종(quasi-species)"으로서 순환함을 나타냈다. 분리체 사이 및 개개 환자 내에 존재하는 변이는 바이러스-암호화된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제의 낮은 정확도(fidelity)의 결과로 믿어지고 있다. HCV의 유전적 변이의 정도는 감염의 예방, 진단 및 조절에 대한 중요한 연관성을 가진다.
HCV 감염의 혈청진단법은 전형적으로 재조합 HCV 단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체를 검출하는 시판되는 효소면역검정법(EIA)에 의해 측정된다. 양성의 EIA 결과는 재조합 면역블롯 검정법(Recombinant immunoblot assay; RIBA)에 의해 확인될 수 있으나, EIA 검정법이나 RIBA 검정법은 모두 현재의 감염과 과거의 감염을 구별하지 못한다. 순환하는 바이러스의 전형적으로 낮은 역가(titer) 때문에, 바이러스 단백질의 직접적인 검정법은 성공적으로 개발되지 않았다. 더욱이, 항체에 기초한 검정법은 보통 노출후 2 내지 3 개월 동안의 HCV 감염을 검출하지 못한다.
따라서, HIV 및 HCV 둘다에 대해 환자 샘플의 동시 스크리닝을 허용하는 개선된 검정법이 당업계에 요구된다.
본 발명은 다중 검정법을 사용하여 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스(HCV) 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 존재를 동시에 검출하기 위한 방법을 제공한다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스(HCV) RNA 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를 공동 검출하기 위한 방법과 관련된다. 본 방법은,
(A) 생물학적 샘플로 부터 유래된 RNA를 주형으로서 사용하고 HCV RNA로부터 DNA의 역전사를 시작시키는 하나 이상의 역전사 프라이머 및 HIV RNA로부터 DNA의 역전사를 시작시키는 하나 이상의 역전사 프라이머를 사용하여 역전사 반응을 수행함으로써, (a) HCV-특이적 역전사 생성물, (b) HIV-특이적 역전사 생성물, 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합물을 포함하는 역전사 생성물을 생성시키는 단계;
(B) HCV의 5' 비암호화 부위에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍 및 HIV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍을 사용하여 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, (a) HCV-특이적 증폭 생성물, (b) HIV-특이적 증폭 생성물, 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합물을 포함하는 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, HCV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
삭제
(i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 1) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 2>를 포함하고;
HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하며,
HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함한다]; 및
(C) 단계(B)의 증폭 생성물을 검출하는 단계[여기서, HCV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA가 존재함을 나타내고, HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HIV RNA가 존재함을 나타내고, HCV-특이적 증폭 생성물 및 HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA 및 HIV RNA가 존재함을 나타낸다]를 포함한다.
두번째 양태에서, 본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV) DNA 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV) DNA를 공동 증폭시키기 위한 방법과 관련된다. 본 방법은,
(A) HCV DNA, HIV DNA, 또는 HCV DNA 및 HIV DNA의 조합물을 함유하는 것으로 추정되는 DNA 샘플 상에서 HCV의 5'비암호화 부위에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍 및 HIV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, (a) HCV-특이적 증폭 생성물, (b) HIV-특이적 증폭 생성물, 또는 (c) (a) 및 (b) 중의 임의의 조합물을 포함하는 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, HCV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
삭제
(i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 1) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 2>를 포함하고;
HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하며,
HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함한다]를 포함한다.
세번째 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 C형 간염 바이러스(HCV) RNA 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를 공동 검출하기 위한 방법과 관련된다. 본 방법은,
(A) 생물학적 샘플로부터 유래된 RNA 및 내부 양성 대조군(internal positive control;IPC) RNA를 주형으로서 사용하고, IPC RNA로부터 DNA의 역전사를 시작시키는 하나 이상의 역전사 프라이머, HCV RNA로부터 DNA의 역전사를 시작시키는 하나 이상의 역전사 프라이머 및 HIV RNA로부터 DNA의 역전사를 시작시키는 하나 이상의 역전사 프라이머를 사용하여 역전사 반응을 수행함으로써, (a) IPC-특이적 역전사 생성물, (b) HCV-특이적 역전사 생성물, (c) HIV-특이적 역전사 생성물, 또는 (d) (a), (b) 및 (c) 중의 임의의 조합물을 포함하는 역전사 생성물을 생성시키는 단계;
(B) IPC에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍, HCV의 5'비암호화 부위에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍 및 HIV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍을 사용하여 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, (a) IPC-특이적 증폭 생성물, (b) IPC-특이적 증폭 생성물 및 HCV-특이적 증폭 생성물, (c) IPC-특이적 증폭 생성물 및 HIV-특이적 증폭 생성물, 또는 (d) 상기 생성물들의 임의의 조합물을 포함하는 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, IPC에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
삭제
(i) 정방향 프라이머 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'(IPCF1)<서열 번호 8) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'(IPCR1)<서열 번호 9>를 포함하고;
HCV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
(i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 10) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 11>를 포함하고;
HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하며,
HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함한다]; 및
(C) 단계(B)의 증폭 생성물을 검출하는 단계[여기서, IPC-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 IPC RNA가 존재함을 나타내고, HCV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA가 존재함을 나타내고, HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HIV RNA가 존재함을 나타내고, HCV-특이적 증폭 생성물 및 HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에 HCV RNA 및 HIV RNA가 존재함을 나타낸다]를 포함한다.
네번째 양태에서, 본 발명은 내부 양성 대조군(IPC) DNA, C형 간염 바이러스(HCV) DNA 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV) DNA를 공동 증폭시키기 위한 방법과 관련된다. 본 방법은,
(A) IPC DNA를 함유하고, HCV DNA, HIV DNA, 또는 이들 DNA의 임의의 조합물을 함유하는 것으로 추정되는 DNA 샘플 상에서 IPC에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍, HCV의 5'비암호화 부위에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍 및 HIV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 중 하나 이상의 쌍을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행함으로써, (a) IPC 증폭 생성물, (b) HCV-특이적 증폭 생성물, (c) HIV-특이적 증폭 생성물, 또는 (d) (a), (b) 및 (c) 중의 임의의 조합물을 포함하는 증폭 생성물을 생성시키는 단계[여기서, IPC에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
삭제
(i) 정방향 프라이머 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'(IPCF1)<서열 번호 8) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'(IPCR1)<서열 번호 9>를 포함하고;
HCV에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
(i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 10) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 11>를 포함하고;
HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하며,
HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍 각각은
서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함한다]를 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 역전사 반응은 랜덤 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행되고; 달리는, 하나 이상의 HCV-특이적 역전사 프라이머 및 하나 이상의 HIV-특이적 역전사 프라이머, 즉 HCV 또는 HIV RNA 내의 서열에 상응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
증폭의 검출 방법은, 제한없이, (a) 전기영동 및 (b) IPC-, HCV-, 또는 HIV-특이적 프로브가 부착된 고형 지지체 상에 증폭 생성물을 포획한 후에 비색 검정법을 사용하여 결합된 생성물을 정량하는 것을 포함한다. 유용한 IPC-특이적 포획 프로브는, 제한없이, 5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'<서열 번호 17>을 포함한다. 유용한 HCV-특이적 5'포획 프로브는, 제한없이, 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'<서열 번호 12>을 포함한다. 유용한 HIV-1 특이적 포획 프로브는, 제한없이, 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'<서열 번호 13>을 포함하고 유용한 HIV-2 특이적 포획 프로브는, 제한없이, 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'<서열 번호 14>를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 HCV RNA 및 HIV RNA를 공동 검출하기 위한 키트와 관련된다. 본 키트는,
(a) (i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 1) 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 2>를 포함하는 HCV의 5'비암호화 부위에 대해 특이적인 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(b) 서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
(c) 서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에서 HCV DNA 및 HIV DNA를 공동 검출하기 위한 키트와 관련된다. 본 키트는,
(a) (i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 1> 및
(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 2>를 포함하는 HCV의 5'비암호화 부위에 대해 특이적인 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머;
(b) 서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및
(c) 서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 발명자들은 C형 간염 바이러스(HCV) RNA 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를 함유하는 생물학적 샘플에서, (i) 생물학적 샘플로부터 유래되는 RNA 상에서 역전사 반응을 수행하고 (ii) HCV 및 HIV RNA에 존재하는 특정한 서열에 상보적인 서열을 갖는 특정 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, 다중 검정법에 의해 저농도의 HCV 및 HIV RNA를 동시 검출할 수 있음을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 동일 샘플 중에서 낮은 복제 농도의 HCV 및 HIV RNA를 검출하는 개선된 1회전의, 다중 역전사/증폭 검정법을 제공한다.
올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 보존, 세포내 및 세포간 상호작용, 및 앰플리콘과 주변 서열의 예상되는 2차 구조를 고려하여 선택한다. 또한, 프라이머 및 분석 시스템은 HCV 및 HIV 게놈의 다수의 영역, 다수 바이러스 종 및 내부 양성 대조군(IPC) RNA(또는 DNA)를 공동-증폭(및 공동 검출)할 수 있도록 고안한다. 바이러스성 게놈의 다수의 영역의 공동 증폭/검출은 분석 민감도를 증가시키고, IPC의 동시 증폭은 PCR 억제로 인해 잘못된 음성적 결과를 야기시킬 가능성을 감소시킨다.
분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 단백질 생화학에서의 다수의 기법(문헌 참조; Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II and III, 1997, F.M., Ausubel ed.; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985(D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M. L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984(Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); 및 Protein Purification: Principle and Practice, Second Edition(Springer-Verlag, N. Y.)이 본 발명을 수행하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 푸린- 및 피리미딘-함유 중합체, 폴리리보뉴클레오티드 폴리데옥시리보뉴클레오티드 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보 뉴클레오티드를 나타낸다. 이는 일본쇄 및 이본쇄 분자, 예를 들면, DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드 뿐만 아니라 염기를 아미노산 주쇄에 접합시켜 형성된 "단백질 핵산"(PNA)을 포함한다. 이들은 또한 변형된 염기를 함유하는 핵산을 포함한다.
본원에서 사용되는 핵산 서열의 "상보체"는 원 서열과의 와트슨-크릭 염기-쌍 형성(Watson-Crick base-pairing)에 관여하는 안티센스(anti-sence) 서열을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "프라이머"는 목적하는 일본쇄 핵산 서열과 이중체를 형성하고 예를 들면, 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 쇄를 중합시킬 수 있는, 약 5 내지 약 50개, 바람직하게는 약 6 내지 약 25개, 가장 바람직하게는 약 6 내지 약 18개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 분리된 올리고뉴클레오티드이다.
본원에서 사용되는 "분리된" 핵산은 이의 고유 환경으로부터 제거된 성분(예를 들면, 이들이 천연 발생적일 경우, 이의 천연 환경 또는 이들이 합성된 것일 경우, 반응 혼합물)을 나타낸다. 분리된 핵산은 원래 관여된 성분을 통상적으로 약 50% 미만, 바람직하게는 약 75% 미만, 가장 바람직하게는 약 90% 미만의 양으로 함유한다.
지정 서열로부터 "유래된" 핵산 서열은 지정 서열 영역에 상응하는 서열을 나타낸다. 이는 지정 서열과 상동이거나 이에 상보적인 서열을 포함한다.
내부 양성 대조군
(IPC) 표적 핵산은 플라즈미드 벡터내로 클로닝된 다음 통상적으로 제한 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 선형화되는 합성 핵산 서열을 나타낸다. IPC는 통상적으로 일반적 프로브-결합 영역을 둘러싸는 다수의 프라이머 결합 서열을 가지며, 핵산 증폭 반응에서 잘못된 음성적 결과에 대한 일반적 대조군으로서 작용한다.
바람직한 내부 양성 대조군 표적 DNA의 서열은 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'<서열 번호 15>이다.
본원에 기술된 서열 및 이의 하위서열 중의 어느 하나를 포함하는 핵산은 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, DNA는 포스포르아미다이트 고형 지지체 방법(문헌 참조; Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 및 Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem/ 764: 17078) 또는 그외의 잘 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 핵산은 또한 당해 기술분야에 공지된 다수의 방법으로 변형시킬 수 있다. 이러한 변형 방법에 대한 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡(cap)", 하나 이상의 천연 뉴클레오티드의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드간 변형, 예를 들면, 비하전된 결합(예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 결합(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 사용한 변형방법이 있다. 핵산은 하나 이상의 추가의 공유결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(intercalator)(예를 들면, 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들면, 금속, 방사능 금속, 아연, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. PNA도 또한 "핵산"이라는 용어에 포함된다. 핵산은 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미데이트 결합의 형성에 의해 유도체화될 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 서열은 검출이능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지에 의해 개질시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광 분자, 비오틴 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 증폭이란, 핵산이 복제되는 반복적인 과정을 나타낸다. 적합한 증폭 방법에는 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 쇄 치환 증폭, 핵산 단일 염기 증폭 및 전사 중재된 증폭이 포함되지만 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 생물학적 샘플 중에서 HCV 및 HIV를 검출하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 (i) 샘플 내에 함유되어 있거나 샘플로부터 유래된 RNA를 주형으로서 사용하여 역전사 반응을 수행하고, (ii) HCV의 게놈 내, 바람직하게는 HCV의 5' 비암호화 영역의 서열에 상응하는 서열을 갖는 증폭 프라이머 쌍 하나 이상 및 HIV의 게놈 내 서열에 상응하는 서열을 갖는 증폭 프라이머 쌍 하나 이상을 사용하여 역전사 생성물을 증폭시킴으로써, HCV-특이적 및 HIV-특이적 증폭 생성물을 제조하며, (iii) HCV-특이적 및 HIV-특이적 증폭 생성물을 검출함으로써 수행된다. HCV-특이적 및 HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 각각 샘플 중에서의 HCV 및 HIV RNA의 존재 유무를 나타낸다.
본 발명에 따라, 생물학적 샘플은 임의의 통상의 수단에 의해 환자로부터 입수된다. 적합한 생물학적 샘플에는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 유즙 및 뇌척수액이 포함되지만 이에 국한되는 것은 아니다.
생물학적 샘플은 샘플 내에 함유되어 있는 RNA, 특히 바이러스성 RNA에 역전사 시약을 접근시킬 수 있는 모든 방법으로 처리할 수 있다. 생물학적 샘플로부터 "유래된" RNA는 샘플 중에 원래 존재하며 샘플을 처리함으로써 입수되는 모든 RNA이다. 바람직하게는, RNA는 당해 기술분야에 익히 공지된 모든 방법, 예를 들면, 구아니디늄 티오시아네이트를 사용하거나 시판되는 시약을 사용하는 방법 및 예를 들면, 퓨어스크립트(PureScript, 제조원; Gentra Systems, Inc. Minneapolis MN)와 같은 방법을 사용하여 샘플로부터 추출한다. RNA를 RNase, 다른 단백질 및/또는 역전사를 방해할 수 있는 모든 다른 성분으로부터 분리시키는 어떠한 추출 방법이라도 사용가능하다.
그후, 샘플을 랜덤 헥사머 프라이머(제조원; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)와 같은 랜덤 프라이머(a) 및/또는 HCV RNA 게놈 서열의 5' 또는 3' 비암호화 영역으로부터 유도된 프라이머(b)를 사용하여 역전사시킨다. 역전사는 문헌(참조; Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II and III, 1997, F. M., Ausubel ed.; 미국 특허 제5,322,770호; Young et al., J. Clin. Microbiol. 31(4):882, 1993; Myers et al., Biochemistry 30(3):7661, 1991) 또는 계류중인 특허원 제60/118,520호(대리인 관리 번호 2094/0E287)에 기술된 바와 같은 통상의 방법을 사용하여 수행한다.
역전사 반응 후, 생성물을 증폭시킨다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응, 쇄 치환 반응, 전사 매개된 증폭 또는 핵산 단일 염기 증폭을 포함하지만 이에 국한되지 않는 모든 증폭방법을 사용할 수 있다. PCR을 사용하는 것이 바람직하다. 통상적으로, PCR에 필요한 모든 성분을 함유하는 반응 혼합물을 역전사 반응 혼합물에 직접 가한다. 그후, 사용되는 프라이머 쌍에 의해 명시된 조건을 사용하여 증폭을 수행한다.
본 발명자들은 특정 쌍의 HCV-특이적 및 HIV-특이적인 증폭 프라이머를 사용하여 환자 샘플 중에서 저농도의 HCV 및 HIV RNA를 둘다 동시에 검출할 수 있음을 발견하였다. 본 발명을 수행하는데 사용할 수 있는 프라이머의 비제한적인 예로는 하기 표 1에 열거되어 있는 것들이 포함된다.
| ID | 공급원 | 서열 | 서열 번호 |
| JBLTR4 | HIV-1(s) | 5'-CTG CTT AAG CCT CAA TAA AGC TTG CCT TGA-3' | 3 |
| JBLTR6 | HIV-1(as) | 5'-GGG TCT GAG GGA TCT CTA GTT ACC AGA GT-3' | 4 |
| JBLTR8 | HIV-1(as) | 5'-TGT TCG GGC GCC ACT GCT AGA GA-3' | 5 |
| 2LTRe | HIV-2(s) | 5'-GGG AGG TTC TCT CCA GCA CTA GCA-3' | 6 |
| 2LTR-R1 | HIV-2(as) | 5'-GCG ACT AGG AGA GAT GGG AAC ACA CA-3' | 7 |
| C131F25 | HCV5'(s) | 5'-GGG AGA GCC ATA GTG GTC TGC GGA A-3' | 10 |
| C294R25 | HCV5'(as) | 5'-CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC A-3' | 11 |
(s) = 센스 쇄; (as) = 안티센스 쇄
증폭시킨 후, 증폭된 생성물을 아가로스 또는 아크릴아미드 겔에서의 겔 전기영동법; 비-동위원소 비색 검출법(예를 들면, SureCell system, 제조원; Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY)(하기 실시예 1 참조); ECi 검출법; 화학발광법 및 형광법을 포함하지만 이에 국한되지 않는 것으로서 당해 기술분야에 공지되어 있는 모든 방법을 사용하여 검출한다.
바이러스-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플 중에서의 바이러스성 RNA의 존재 유무를 나타낸다. 겔 전기영동법을 사용할 경우, 바이러스-특이적 증폭 생성물은 반응에 사용된 증폭 프라이머에 상응하는 서열을 갖는 각각의 바이러스성 RNA 내의 위치에 의해 예견되는 바와 같이, 이들의 크기에 의해 확인된다.
본 발명은 환자의 HIV 및 HCV 감염을 진단하고, 항-바이러스성 치료 섭생의 효능을 시험하며, HCV-감염 및 HIV-감염 샘플에 대한 혈액 공급물을 검사하는데 사용된다.
바람직한 양태에 대한 설명
하기의 실시예에서는 본 발명을 제한하지 않고 예시한다.
실시예 1 : 생물학적 샘플 중에서 HCV 및 HIV의 다중 검출
하기의 실험은 본 발명의 방법에 따라 HCV 및 HIV의 다중 검출의 민감도를 측정하기 위해 수행한다.
A. 방법
1. 환자 샘플 :
HIV 양성 환자의 혈장 및 HCV 양성 환자의 혈장 중의 바이러스 부하량을 제조업자의 설명서에 따라 로슈 임플리커 분석(Roche Amplicor Assay)을 사용하여 정량한다. 먼저, HIV-함유 혈장 및 HCV-함유 혈장 샘플을 각각 1,000개 내지 10,000개 카피/㎖를 함유하도록 희석시킨다. 그후, 이들을 다음과 같이 배합한다; 25개 카피의 바이러스성 게놈 RNA/PCR 반응을 제공하기 위해, HCV 혈장 50㎕와 HIV 혈장 500㎕를 음성 혈장 450㎕에 가한다. 5개 카피/PCR 반응을 제공하기 위해, HCV 혈장 10㎕와 HIV 혈장 100㎕를 음성 혈장 890㎕에 가한다.
2. 샘플 준비 :
RNA를 퓨어스크립트 RNA 분리 시약(제조원; Genta Systems, Minneapolis MN)을 사용하여 혈장 샘플로부터 준비한다. 체액에 대한 제조업자의 프로토콜의 변형사항에는 바이러스성 RNA를 침전시키는데 도움을 주는 담체로서 글리코겐을 20㎍이 아니라 40㎍의 양으로 사용함이 포함된다. 추가로, 대부분의 경우, RNA의 이소프로필 알콜 침전 및 에탄올을 사용한 RNA 펠렛의 세척 단계 이후, RNA 펠렛을 제조업자에 의해 제공되는 RNA 수화 용액이 아니라 RT 완충 혼합물에 재현탁시킨다.
3. 역전사 :
RNA로부터의 cDNA 합성단계는 50mM 트리스 HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 0.4mM의 각각의 dNTP(제조원; Pharmacia Biotech), 4μM 랜덤 헥사머(제조원; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 또는 특이적 역전사 프라이머로 이루어진 용액 50㎕ 중의 재조합 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MLV) 역전사효소(RT)(제조원; Gibco BRL, Gaithersberg, Maryland) 100U 및 디에틸피로카보네이트(DEPC)-처리된 물 중의 RNasin(Promega, Madison, Wisconsin) 200unit를 첨가함으로써 촉매된다. 42℃에서 30분 동안 항온처리한 후, RT 반응물을 100℃에서 5분 동안 방치하여 RT 활성을 파괴한다. 각각의 반응물을 1분 동안 냉각시킨 다음 1600×g에서 4초 동안 미세원심분리시킨다.
4. PCR 증폭 :
PCR은 25mM 트리스-HCl, 3mM MgCl2, 0.725mM EDTA, 54mM KCl, 3.72mM NaCl, 40μM DTT, 108㎍/㎖ 젤라틴(유형 IV), 9.5% 글리세롤, 0.02% 트윈 20, 0.02% NP40, 송아지 흉선 DNA(2㎍), 1.2mM의 각각의 dNTP, 0.4μM의 각각의 프라이머, 선형화된 내부 양성 대조군(IPC) 플라즈미드 DNA 10개 카피 및 16U Taq 폴리머라제로 이루어진 100㎕ 용액 중에서 PE9600 서모사이클러(thermocycler, 제조원; Perkin-Elmer)를 사용하여 수행한다. 미국 특허 제5,338,671호에 제조방법이 기재되어 있는, Taq에 대한 모노클로날 항체인 TP1-12 및 TP4-9를 각각 50:1과 5:1의 몰 비로 반응물에 가하여 Taq 폴리머라제에 대한 항체의 몰 비가 55:1이 되도록 한다. 96℃에서 3분 동안 초기 변성시킨 후, 96℃에서 5분 동안 그리고 68℃에서 40초 동안 40주기의 증폭 과정을 수행한다. 사이클링을 완료한 후, 후-가열 단계를 103℃에서 5분 동안 수행하여 Taq 폴리머라제를 불활성화시킨다.
5. PCR 생성물의 검출 :
PCR 생성물은 4% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음 에티듐 브로마이드로 염색함으로써 검출한다. 또는, PCR 생성물은 증폭시키는 동안 5'-비오틴-표지된 프라이머(센스 쇄)를 사용하여 비오티닐화시킨다. 생성물을 유동성 막(SureCell) 시험 표면에 용착되어 있는 라텍스 입자에 공유결합된 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화시켜 생성물을 포획시킨다. HIV-1 프로브는 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'(JBLTRpr)<서열 번호 13> 및 5'-GAACAGATGGGCACACTCACTGCT-3'(JBATRpr4)<서열 번호 16>이고, HIV-2 프로브는 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1)<서열 번호 14>이며, HCV 프로브는 5'-CCT TTC GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3'(C252-27P)<서열 번호 12>이다. 프로브/생성물 복합체를 염료 전구체의 염료(청색)로의 산화적 전환을 촉매하는 스트렙타비딘(SA)-호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합체와 반응시킨다. 청색의 강도는 색 강도를 표준색과 비교함으로써 육안으로 스코어를 매긴다(0 내지 10). 모든 가시적 색 스코어가 3을 초과하면 양성 결과인 것으로 간주한다.
B. 결과 :
겔 전기영동한 결과, 하기의 증폭 생성물이 밝혀졌다: 188nt(HCV), 160nt(IPC) 및 150nt(HIV LTR-장쇄 생성물). 조합된 HIV와 HCV 분석법으로 인해, PCR 시험당 25개 카피로 모든 조합된 HIV 및 HCV 샘플을 검출할 수 있었다(500개 바이러스 입자/혈장 ㎖). 또한, 5개 카피/PCR 시험에서는, 배합된 양성 샘플 중의 50 내지 90%가 검출되었다(100개 바이러스 입자/혈장 ㎖). 결과가 하기 표 2에 요약되어 있다.
| PCR 반응당 바이러스성 RNA 카피수 | n=8 HCV 프로브 양성 | n=8 HIV 프로브 양성 |
| 0 | 0% | 0% |
| 5 | 88% | 50% |
| 25 | 100% | 100% |
상기한 모든 특허, 특허원, 논문, 공보 및 시험 방법은 이의 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.
상기한 상세한 설명 측면에서 당해 기술분야의 숙련가들은 본 발명에 대한 다수의 별법들을 제안할 수 있을 것이다. 이러한 명백한 별법은 첨부된 청구항의 범위내에 포함된다.
본발명에 따른 다중 검정법에 의해 생물학적 샘플 중의 C형 간염 바이러스(HCV) 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 존재를 동시에 검출할 수 있다.
<110> Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.
<120> Oligonucleotide primers for efficient multiplex detection of hepatitis C virus (HCV)
and human immunodeficiency virus (HIV), methods of use thereof and kits comprising them
<140> 10-2000-0005172
<141> 2000-02-02
<150> US 60/118,498
<151> 1999-02-03
<160> 17
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 1
gggagagcca tagtggtctg cggaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 2
cggggcactc gcaagcaccc tatca 25
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 3
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 4
gggtctgagg gatctctagt taccagagt 29
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 5
tgttcgggcg ccactgctag aga 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 6
gggaggttct ctccagcact agca 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 7
gcgactagga gagatgggaa cacaca 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 8
cgccagcgtg gaccatcaag tagtaa 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 9
cacgatcctg gagcagacac tgaaga 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 10
gggagagcca tagtggtctg cggaa 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 11
cggggcactc gcaagcaccc tatca 25
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 12
cctttcgcga cccaacacta ctcggct 27
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 13
caacagacgg gcacacacta ct 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 14
ccacgcttgc ttgcttaaag acctc 25
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> target nucleic acid for an internal positive control
<400> 15
cgccagcgtg gaccatcaag tagtaatgaa cgcacggacg aggacatcat agagattaca 60
cctttatcca cagttctcgg tctaacgcag cagtcagtgt atcagcacca gcatccgtag 120
tgagtcttca gtgtctgctc caggatcgtg 150
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 16
gaacagatgg gcacacactg ct 22
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 17
ctgcgttaga ccgagaactg tggataaagg 30
Claims (42)
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- (a) (i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 10) 및(ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 11>를 포함하는 HCV의 5'비암호화 부위에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;(b) 서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머; 및서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-2에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 포함하는, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 유즙 또는 뇌척수액으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 생물학적 샘플 중의 HCV RNA 및 HIV RNA를 함께 검출하기 위한 키트.
- 제31항에 있어서, 정방향 프라이머 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'(IPCF1)<서열 번호 8> 및 역방향 프라이머 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'(IPCR1)<서열 번호 9>를 포함하는 IPC에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 키트.
- 제31항에 있어서, 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'(C252-27-PRB)<서열 번호 12>, 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'(JBLTRpr3)<서열 번호 13>, 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'(JBLTRpr4)<서열 번호 16> 및 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1)<서열 번호 14>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
- 제32항에 있어서,IPC-특이적 프로브 5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'(IPC1P)<서열 번호 17>;HCV-특이적 프로브 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'(C252-27-PRB)<서열 번호 12>; 및(a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'(JBLTRpr3)<서열 번호 13>; (b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'(JBLTRpr4)<서열 번호 16>; 및 (c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1)<서열 번호 14>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-특이적 프로브로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
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- (a) (i) 정방향 프라이머 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'(C131F25)<서열 번호 10) 및 (ii) 역방향 프라이머 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(C294R25)<서열 번호 11>를 포함하는 HCV의 5'비암호화 부위에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍;(b) 서열 5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)<서열 번호 3>을 갖는 정방향 프라이머, 및 (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'(JBLTR6)<서열 번호 4> 및 (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'(JBLTR8)<서열 번호 5>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-1에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-1에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및서열 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'(2LTRe)<서열 번호 6>을 갖는 정방향 프라이머, 및 서열 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'(2LTR-R1)<서열 번호 7>을 갖는 HIV-2에 특이적인 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-2에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 포함하는, DNA 샘플 중의 HCV DNA 및 HIV DNA를 공동 증폭시키기 위한 키트.
- 제37항에 있어서, 정방향 프라이머 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'(IPCF1)<서열 번호 8> 및 역방향 프라이머 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'(IPCR1)<서열 번호 9>를 포함하는 IPC에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 키트.
- 제37항에 있어서, 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'(C252-27-PRB)<서열 번호 12>, 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'(JBLTRpr3)<서열 번호 13>, 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'(JBLTRpr4)<서열 번호 16> 및 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1)<서열 번호 14>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
- 제38항에 있어서,IPC-특이적 프로브 5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'(IPC1P)<서열 번호 17>;HCV-특이적 프로브 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'(C252-27-PRB)<서열 번호 12>; 및(a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'(JBLTRpr3)<서열 번호 13>; (b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'(JBLTRpr4)<서열 번호 16> 및 (c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1)<서열 번호 14>로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 HIV-특이적 프로브로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
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