NO328535B1

NO328535B1 - Fremgangsmate for multipleksdeteksjon av Hepatitt C-virus (HCV) og human immunosviktvirus (HIV) samt kit for slik multipleksdeteksjon

Info

Publication number: NO328535B1
Application number: NO20000514A
Authority: NO
Inventors: David R Patterson; Keming Song; Jeffrey M Linnen; Kevin M Gorman
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2010-03-15
Also published as: NO20000514D0; AU1482800A; EP1035220A3; CA2296044A1; DE60009977D1; DK1035220T3; KR100910545B1; ATE264925T1; EP1035220A2; NO20000514L; ES2218067T3; KR20000076598A; AU783171C; CN1213150C; PT1035220E; US6623919B1; JP5442917B2; DE60009977T2; CN1268575A; JP2000279198A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbedrede fremgangsmåter for detekjon av hepatitt C-virus (HCV) og human immunosviktvirus (HIV) nukleinsyre-sekvenser i biologiske prøver.

Human immunosviktvirus (HTV) infiserer millioner av mennesker over hele verden og representerer derfor et alvorlig helseproblem. Spredning av HIV-infeksjon via kontaminerte blodprodukter betyr at det er et behov for screeningsmetoder som kan detektere små mengder HIV RNA i pasientprøver. Dessuten, økende tilgjengelighet for lindrende behandlinger for HIV-infeksjon betyr at tidlig deteksjon av infeksjon i en pasient er vital i forhold til å initiere egnede terapeutiske intervensjoner.

Hepatitt C-virus (HCV) er et parenteralt transmidert virus ansvarlig for hoveddelen av tilfeller av post-transfusjonshepatitt og en vesentlig del av sporadisk (eller miljøpådratt) hepatitt-tilfeller i hele verden. Det er estimert at mer enn 1% av verdens populasjon er infisert med HCV. HCV-infeksjon er assosiert med akutt hepatitt, kronisk hepatitt, cirrhose, og etterfølgende hepatocellulært karsinom.

HCV er for tiden klassifisert som et separat genus, Hepacivirus, i familien Flaviviridae. Genomet består av et positivt trådet RNA-molekyl på omtrent 9.500 nukleotider med en enkelt, stor åpen reseramme (ORF) som koder for en polyproteinforløper på omtrent 3.000 aminosyrer. Den store ORF forutgås av en 5' ikke-kodende (NC) region på omtrent 340 nukleotider, som er den mest konserverte regionen i genomet. Den 5'-regionen av ORF koder for (i en 5' til 3' retning) et kapsidprotein, to kappeglyko-proteiner El og E2) og et lite protein med ukjent funksjon (P7). Den 3' delen av oRF koder for ikke-strukturelle proteiner som inkluderer en protease, protease/helikase bi-funksjonelt protein, RNA-polymerase, og regulatoriske peptider.

Analyse av HCV-kodende sekvenser fra hele verden har gitt betraktelig sekvens-variasjoner blant individuelle virale isolater. Dessuten, analyser av HCV-sekvenser fra individuelle pasienter har vist at viruset sirkulerer som såkalt "kvasi-arter", som inneholder beslektede, men ikke identiske sekvenser. Variasjonen som eksisterer blant isolatene og innenfor individuelle pasienter, tror man er et resultat av lav kontroll av det viralt-kodede RNA-avhengige RNA-polymerasen. Grad av genetisk variabilitet hos HCV har viktige implikasjoner for forebygging, diagnose og kontroll av infeksjon.

Serodiagnose av HCV-infeksjon blir typisk bestemt ved kommersielt tilgjengelige enzymimmunoanalyser (EIA) som detekterer antistoffer som binder rekombinante

HCV-proteiner eller peptider. Positive EIA-resultater kan bekreftes ved en rekombinant immunoblotanalyse (RD3A), men hverken EIA- eller RIBA-analyser skjelner mellom tidlig og nåværende infeksjoner. På grunn av den typisk lave titeren av sirkulerende virus, har en direkte analyse for virale proteiner ikke vært utviklet. Dessuten, detekterer ikke antistoffbaserte analyser vanligvis HCV-infeksjon før 2 til 3 måneder etter eksponering.

En rekke fremgangsmåter for multipleks deteksjon av HIV og HCV RNA er tidligere beskrevet (Infusionstherapie und Transfusionsmedizin, 1998, v.25, side 164-169; Transfusion, 1998, v.38(10), side 261; Journal Of Virological Methods, 1991, v.35, side 297-304; Clin. Chem., 1995, vol.41(9), side 1681), men ingen av disse synes å beskrive en fremgangsmåte slik den er definert i foreliggende søknad.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metoder for en samtidig deteksjon av tilstedeværelse av hepatitt C-virus (HCV) RNA og human immunosviksvirus (HTV) RNA i en biologisk prøve ved å bruke en multipleksanalyse.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for å ko-detektere heptatitt C-virus (HCV) RNA og human immunsviktvirus (HTV) RNA i en biologisk prøve, kjennetegnet ved at nevnte metode omfatter:

(A) å utføre en reverstranskripsjonsreaksjon ved å bruke RNA avledet fra nevnte prøve som en templat og minst en reverstranskripsjonsprimer som vil prime reverstranskripsjon av DNA fra HCV RNA og minst en reverstranskripsjonsprimer som vil prime reverstranskripsjon av DNA fra HTV RNA for å produsere reverstranskripsjonsprodukter som omfatter (a) HCV-spesifikke reverstranskripsjonsprodukter, (b) HlV-spesifikke reverstranskripsjonsprodukter, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b);

(B) amplifisere nevnte reverstranskripsjonsprodukter ved å bruke en eller flere par av oligonukleotidprimere spesifikke for den 5' ikke-kodende regionen til HCV og

en eller flere par av oligonukleotidprimere spesifikke for HIV for å produsere amplifiseringsprodukter som omfatter (a) HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter, (b) HlV-spesifikke amplifiseringsprodukter, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b);

hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HCV består av:

(i) foroverprimer

(ii) reversprimer

hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HTV-1 består av en foroverprimer med sekvensen:

5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'(JBLTR4)

<SEQ ID NO. 3>, og en reversprimer spesifikk for HIV-1 valgt fra gruppen bestående av: (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3' (JBLTR6) <SEQ ID NO. 4>, og

(2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)

<SEQ ID NO. 5>,

hvori hvert av parene av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HTV-2 består av en foroverprimer med sekvensen

5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)

<SEQ ID NO. 6>, og en reversprimer spesifikk for HTV-2 med sekvensen

5' -GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)

<SEQ ID NO. 7>; og

(C) å detektere nevnte amplifiseringsprodukter;

hvori deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer

tilstedeværelse av HCV RNA i nevnte prøve, deteksjon av HTV-spesifikke amplifiseringsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HIV RNA i nevnte prøve og deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter og HIV-spesifikke amplifisereirngsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HCV RNA og HIV RNA i nevnte prøve.

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for ko-amplifisering av heptatitt C-virus (HCV) DNA og human immunosviktvirus (HIV) DNA, kjennetegnet ved at nevnte metode omfatter: (A) å utføre en polymerasekjedereaksjon på en DNA-prøve mistenkt for å inneholde HCV DNA, HIV DNA, eller en kombinasjon av HCV DNA og HTV DNA, ved å bruke en eller flere par av oligonukleotidprimere spesifikke for 5' ikke-kodende region av HCV og en eller flere par av oligonukleotidprimerne spesifikk for HTV for å produsere amplifiseringsproduktene som omfatter (a) HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter, (b) HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b); hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HCV består av: (i) foroverprimer 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) <SEQ ID NO. 1>, og (ii) reversprimer 5 '-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'

(C294R25) <SEQ ID NO. 2>;

hvori hver av parene av oligonukleotidprimerne spesifikk for HTV-1

består av en foroverprimer med sekvensen:

5' -CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4)

<SEQ ID NO. 3>, og en reversprimer spesifikk for HTV-1 valgt fra gruppen bestående av:

(1) 5 '-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3'

(JBLTR6) <SEQ TD NO. 4>, og

(2) 5-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'

(JBLTR8) <SEQ TD NO. 5>; og

hvori hver av parene av oligonukleotidprimerne spesifikke for HTV-2 består av en foroverprimer med sekvensen

5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe) <SEQ TD NO. 6>, og en reversprimer spesifikk for HTV-2 med sekvensen

5 '-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1)

<SEQ TD NO. 7>.

Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et kit for ko-detektering av HCV RNA og HIV RNA i en biologisk prøve, kjennetegnet ved at nevnte kit omfatter: (a) et par av oligonukleotidprimere spesifikk for den 5' ikke-kodende regionen av HCV som består av:

(i) foroverprimer

(ii) reversprimer (b) oligonukleotidprimere spesifikk for HIV-1 som består av en foroverprimer med sekvensen:

5 '-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4)

<SEQ DD NO. 3>, og en reversprimer spesifikk for HIV-1 valgt fra gruppen bestående av: (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3' (JBLTR6) <SEQ ID NO. 4>, og

(2) 5' -TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8)

<SEQ DD NO. 5>, og et par av oligonukleotidprimere spesifikk for HIV-2 som består av en foroverprimer med sekvensen

5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe)

<SEQ ID NO. 6>, og en reversprimer spesifikk for HTV-2 med sekvensen: 5' -GCGACT AGGAGAGATGGGAAC AC AC A-3' (2LTR-R1)

<SEQ ID NO. 7>.

Et fjerde aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et kit for ko-amplifisering av HCV DNA og HIV DNA i en DNA-prøve, kjennetegnet ved at nevnte kit omfatter oligonukleotid primerne definert ifølge det tredje aspekt ved oppfinnelsen.

I en utførelsesform ifølge det første eller andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse blir nevnte reverse transkripsjonsreaksjon utført ved bruk av tilfeldige oligonukleotidprimere.

I en ytterligere utførelsesform ifølge det første eller andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse blir nevnte amplifisering utført ved en metode valgt fra gruppen bestående av polymerasekjedereaksjon, ligasekjedereaksjon, trådforskyvnings-amplifisering, nukleinsyre enkelbaseamplifisering og transkripsjonsmediert amplifisering.

I en utførelsesform ifølge det første eller andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse omfatter nevnte detektering visualisering av nevnte amplifiseringsprodukter ved gelelektroforese eller eventuellt innfangning av nevnte amplifiseringsprodukter på et fast støttemateriale som inneholder (a) en eller flere IPC-spesifikke oligonukleotidprober, (b) en eller flere HCV-spesifikke oligonukleotidprober, (c) en eller flere HIV-spesifikke oligonukleotidprober, eller (d) en kombinasjon av enhver av (a), (b) og (c) og kvantifisere nevnte innfangede produkter ved å bruke kolorimetrisk analyse.

En egnet HCV-spesifikk probe består av

En egnet HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3)

<SEQIDNO. 13>;

(b) 5' -G AAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4)

<SEQ ID NO. 16>; og

(c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl)

<SEQ ID NO. 14>.

En egnet IPC-spesifikk probe består av

Oppfinnerne har oppdaget at samtidig deteksjon av lave nivåer av hepatitt C-virus (HCV) RNA og human immunosviktvirus (HTV) RNA i biologiske prøver som inneholder HCV og HTV RNA kan oppnås i en mulitpleksanalyse ved (i) å utføre en reverstranskirptasereaksjon på RNA avledet fra prøven og (ii) amplifisere det reverse transkripsjonsproduktet ved å bruke spesielle par av oligonukleotider som har sekvenser komplementære til visse sekvenser tilstede i HCV og HIV RNA. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer da forbedret enkeltrunde, multipleks reverstranskripsjon/amplifikasjonsanalyser som detekterer lave kopinivåer av HCV og HIV RNA i prøvene.

Oligonukleotidprimerne er valgt basert på betraktninger av sekvenskonservering, intra-og inter-molekylære interaksjoner, og den predikerte sekundærstrukturen av amplikonet og omkringliggende sekvens. Dessuten, er primerne og analysesystemet designet for å tillate ko-amplifisering (og ko-deteksjon) av mange regioner i HCV- og HIV-genomene, mange virale arter, og en intern positiv kontroll (TPC) RNA (eller DNA). Samtidig amplifisering/deteksjon av mange regioner av virale genomer øker analysesensitiviteten og ko-amplifiseringen av en TPC minsker sannsynligheten for falske negative resultater på grunn av PCR Inhibering.

Mange teknikker i molekylærbiologi, mikrobiologi, rekombinant DNA, og proteinbiokjemi ble brukt for å praktisere den foreliggende oppfinnelsen, slik som de som er beskrevet i, for eksempel, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II og Ul, 1997 (F.M. Ausubel et.); Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, andre utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I og II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); og Protein Purification: Principles and Practice, andre utgave (Springer-Verlag, N.Y.).

"Nukleinsyre" eller "polynukleotid" som brukt heri refererer seg til purin- og pyrimidininneholdende polymerer av enhver lengde, enten polyribonukleotider eller polydeoksyribonukleotider eller blandede polyribo-polydeoksyribonukleotider. Disse inkluderer enkle- og dobbeltrådede molekyler, slik som, for eksempel, DNA-DNA, DNA-RNA og RNA-RNA hybrider, såvel som, "proteinnukleinsyrer" (PNA) dannet ved konjugerende baser til en aminosyrehovedkjede. Dette inkluderer også nukleinsyrer som inneholder modifiserte baser.

Et "komplement" av en nukleinsyresekvens som brukt heri refererer seg til antisenssekvens som deltar i Watson-Crick baseparring med originalsekvensen.

En "primer" som brukt heri er en oligonukleotid mellom omtrent 5 og omtrent 50 nukleotider i lengde, fortrinnsvis mellom 6 og omtrent 25 nukleotider i lengde og mest foretrekkbart mellom omtrent 6 og omtrent 18 nukleotider i lengde, som danner en dupleks med en enkeltrådet nukleinsyresekvens av interesse og tillater polymerisering av en komplementær tråd ved å bruke f.eks. reverstranskriptase eller DNA-polymerase. En "isolert" nukleinsyre eller polypeptid som brukt heri refererer seg til en komponent som blir fjernet fra dets utgangsmiljø (for eksempel, dets naturlige miljø hvis den er naturlig forekommende eller en reaksjonsblanding hvis den er syntetisk). En isolert nukleotidsyre eller polypeptid inneholder typisk mindre enn omtrent 50% fortrinnsvis mindre enn 75% og mest foretrekkbart mindre enn 90% av komponenter som den i utgangspunktet var assosiert med.

En nukleinsyresekvens som er "avledet fra" er en designert sekvens som refererer seg til en sekvens som korresponderer til en region i den designerte sekvensen. Dette omfatter sekvenser som er homologe eller komplementære til sekvensen. En Intern positiv kontroll = (EPC) målnukleinsyre refererer seg til en syntetisk nukleinsyresekvens klonet inn i en plasmidvektor som deretter blir lineærisert, ved å anvende restriksjons-endonuklease. En TPC vil typisk ha mange primerbindingssekvenser rundt en generisk probebinderegion, og virker som en generisk kontroll mot falske negative resultater i nukleinsyreamplifi seringsreaksj onene.

Sekvensen av et foretrukket internt positivt kontrollmål DNA er:

Nukleinsyrer som omfatter enhver av disse sekvensene beksrevet heri eller subsekvenser derav kan bli fremstilt ved konvensjonelle metoder. For eksempel, kan DNA bli kjemisk syntetisert ved å bruke f.eks. fosforamidittfaststøttemateiralmetoden fra Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, the method of Yoo et al., 1989, J. Biol Chem.

764:17078, eller andre velkjente metoder. Nukleinsyrene kan også bli modifisert ved mange metoder kjent innen fagfeltet. Eksempler på slike modifikasjoner inkluderer metylering "caps", substitusjon av en eller flere av naturlig forekommende nukleotider med en analog, og internukleotidmodifiseringer slik som, for eksempel, de med uladede bindinger (f.eks. metylfosfonater, fosfotriestere, fosforoamidater, karbamater, etc.), eller ladede bindinger (f.eks. fosforotioater, fosforoditioater, etc). Nukleinsyrene kan inneholde en eller flere ytterligere kovalent bindende deler, slik som, for eksempel, proteiner (f.eks. nuklease, toksider, antistoffer, signalpeptider, poly-L-lysin, etc),

interkalatorer (f.eks. akridin, soralen, etc), chelatorer, (f.eks. metaller, radioaktive metaller, jern, oksidative metaller, etc), og alkylatorer. PNA er også omfattet av betegnelsen "nukleinsyre". Nukleinsyren kan bli avledet ved dannelse av en metyl eller etylfosfotriester eller en alkylfosforamidatbinding. Videre, kan nukleinsyresekvensene fra den foreliggende oppfinnelse også bli modifisert med en innmerking som er i stand til å tilveiebringe et detekterbart signal, enten direkte eller indirekte. Eksempler på innmerkinger inkluderer radioisotoper, fluorescensmolekyler, biotin og dets like.

Amplifisering som brukt heri refererer seg til en gjentagende prosess hvor en nukleinsyre blir kopiert. Egnede metoder for amplifisering inkluderer polymerasekjedereaksjon, ligasekjedereaksjon, og transkripsjonsmediert amplifisering.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metoder for deteksjon av HCV og HIV i biologiske prøver. Metodene ble utført som anført ovenfor.

Ifølge oppfinnelsen, blir en biologisk prøve ervervet fra pasienten ved enhver konvensjonell måte. Egnede biologiske prøver inkluderer blod, serum, plasma, urin, brystmelk og cerebrospinalvæske. Fortrinnsvis blir plasma brukt som kilde viralt RNA.

Den biologisk prøven blir behandlet på enhver måte som tilveiebringer tilgang på reverstranskripsjonsreagenser til RNA, spesifikt HIV RNA, som er i prøven. RNA

"avledet fra" en biolgisk prøve er ethvert RNA som var opprinnelige tilstede i prøven og hvis tilgang er som følge av behandling av prøven. Fortrinnsvis, blir RNA ekstrahert fra prøven ved å bruke enhver metode velkjent innen fagfeltet, slik som f.eks., metoder som anvender guanidiumtiocyanat, eller ved å bruke kommersielt tilgjengelige reagenser og metoder slik som f.eks. PureScript0 fra Gentra Systems, Inc. (Minneapolis MN). Enhver ekstraksjonsprosedyre kan brukes som resulterer separasjon av RNA fra RNasene, andre proteiner, og/eller enhver annen komponent som kan interferere med reverstranskripsj on.

Prøven blir deretter utsatt for reverstranskripsjon ved å bruke (a) tilfeldige primere, slik som tilfeldige heksamerprimere ervervet fra Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, og/eller (b) primere avledet fra de 5' eller de 3' ikke-kodende regioner av HCV RNA-genomisk sekvens. Reverstranskripsjon ble utført ved å bruke konvensjonelle prosedyrer, slik som beskrevet i Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II og DI, 1997 (F.M. Ausubel ed.); i U.S. patent nr. 5.322.770; i Young, et al., J. Clin. Microbiol. 31(49:882 (1993); Myers et al., Biochemistry 30(3):7661 (1991); eller som beskrevet i patent søknad EP1036847 (ref CDS-212).

Etter reverstranskripsjonsreaksjonen, blir produktene amplifisert. Enhver metode for amplifisering kan brukes, inklusiv, polymerasekjedereakjson (PCR), ligasekjedereaksjon, trådforflytningsreaksjon, transkripsjonsmediert amplifisering eller nukleinsyreenkelbaseampliifsering. Fortrinnsvis blir PCR bruk. Typisk vil en reaksjonsblanding inneholde de nødvendige komponentene for PCR blir tilsatt direkte til reverstranskripsjonsreaksjonsblandingen. Amplifiseringen blir deretter utført ved å bruke betingelser spesifisert av primerparene som blir brukt.

Oppfinnerne har oppdaget visse par av HCV-spesifikke og HIV-spesifikke amplifiseringsprimere som kan bli brukt samtidig for å detektere lavere nivåer av både HCV og HTV RNA i pasientprøver. Disse primerne er listet opp i Tabell 1 under.

Etter amplifisering, kan amplifiseringsproduktene bli detektert til å bruke enhver kjent metode innen fagfeltet, inklusiv gelelektroforese i agarose eller akrylamidgeler; ikke-isotopiske kolorimetrisk deteksjon slik som SureCellP systemet, tilgjengelig fra Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY (se, f.eks. eksempel 1 under); Eci-deteksjon; kjemiluminescens, og fluorescens.

Deteksjonen av viral-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer tilstedeværelse av viralt RNA i prøven. Når gelelektroforese blir brukt, blir viral-spesifikke amplifiseringsprodukter bekreftet ved deres størrelse, som predikert ved lokalisering i de respektive virale RNA av sekvensene korresponderende til amplifiseringsprimerne brukt i reaksjonen.

Den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes i diagnose av HTV- og HCV-infeksjon i pasienter; i å teste effektiviteten av anti-virale terapeutiske regimer; og i å screene blod fra HCV-infiserte og HIV-infiserte prøver.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1: Multipleksdeteksjon av HCV og HIV i biologiske prøver:

Følgende eksempler ble utført for å bestemme sensitiviteten av multipleksdeteksjon av HCV og HTV ifølge metodene fra den foreliggende oppfinnelsen.

A. Metoder:

1. Pasientprøver:

Virale ladninger i HlV-positivt pasientplasma og HCV-positivt pasientplasma ble kvantifisert ved å bruke Roche Amplicor-analyse ifølge forhandlerens instruksjoner. HlV-inneholdende og HCV-inneholdende plasmaprøver ble først fortynnet for å inneholde 1.000 kopier/ml og 10.000 kopier/ml respektivt. De ble deretter kombinert som følger: For å tilveiebringe 20 kopier av viralt genomisk RNA/PCR-reaksjon, 50 ul av HCV og 500 ul av HTV-plasma som ble tilsatt til 450 ul negativt plasma. For å tilveiebringe 5 kopier/PCR-reaksjon, ble 10 ul av HCV og 100 ul HIV-plasma tilsatt til 890 ul negativt plasma.

2. Prøvepreparering:

RNA ble fremstilt fra plasmaprøver ved å bruke PureScriptP RNA-isoleirngsreagenser (Gentra Systems, Minneapolis MN). Modifiseringer til forhandlerens protokoller av kroppsvæsker inkluderte anvendelse av 40 ug glykogen, heller enn 20 ug som en bærer for å hjelpe til i presipiteringen av viralt RNA. I tillegg, i de fleste tilfeller, isopropylalkoholpresipitering av RNA og vasking av RNA-pelleten med etanol, ble RNA-pelleten resuspendert i RT-buffermiks, fremfor RNA-hydreringsløsning tilveiebrakt av forhandleren.

3. Reverstranskripsjon:

Syntese av cDNA fra RNA ble katalysert ved tilsetning av 100 U rekombinant Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) reverstranskriptase (RT) (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) i en 501 løsning av 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM Kcl, 3 mM MgCl2,10 mM DTT, 0.4 mM av hver dNTP (Pharmacia Biotech), 4 M tilfeldige heksamerer

(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og/eller spesifikk reverstranskripsjonsprimer og 20 enheter RNasin (Promega, Madison, Wisconsin) i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann. Etter inkubering ved 42°C i 30 minutter, ble RT-reaksjonen holdt ved 100°C i 5 minutter for å ødelegge RT-aktiviteten. Hver reaksjon ble avkjølt i 1 minutt ettefulgt av mikrosentrifugering ved 16.000 x g i 4 sekunder.

4. PCR-amplifisering:

PCR ble utført i TN A PE9600 termocykler (Perkin-Elmer) i en 100 ul løsning av 25 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2,0.725 mM EDTA, 54 mM Kcl, 3.72 mM NaCl, 40 M DTT, 108 g/mL gelatin (type TV), 9.5% glyserol, 0.02% Tween 20,0.02% NP40, kalvetymus DNA (2 g), 1.2 mM av hver dNTP, 0.4 M av hver primer, 10 kopier lineærisert internpositiv kontroll (D?C) plasmid DNA og 16 U Taq-polymerase. Monoklonale antistoffer til Taq, TP1-12 og TP4-9 hvis fremstilling er beskrevet i U.S. patent 5.338.671 ble tilsatt til reaksjonen i en 50:1 og 5:1 molar ratio, respektiv for å tilveiebringe en 55:1 molar ratio av antistoff til Taq-polymerase. Etter initiell denaturering ved 96°C i 3 minutter, ble 40 cykler med amplifisering utført ved 96°C i 5 sekunder 68°C i 40 sekunder. Ved slutten på cyklene, ble et post-varmetrinn utført i 5 minutter ved 103°C for å inaktivere Taq-polymerasen.

5. Deteksjon av PCR-produkter:

PCR-produkter ble detektert ved elektroforese i 4% agarosegeler etterfulgt av etidiumbromidfarging. Alternativt, ble PCR-produktene biotinylert ved anvendelse av 5'-biotin-merkede primere (sens tråd) under amplifisering. Produktene ble fanget ved hybridisering til oligonukleotidprober kovalent bundet til latekspartikler, som ble deponert på overflaten av en gjennomstrømningsmembran (SureCellP-tester. HIV-1-probene var: 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT.3'(JBLTRpr) <SEQ ID NO. 13> og 5' -GAAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ ID NO. 16>; HIV-2-proben var 5 '-CCACGCTTGCTTAGACTTAAAGACCTC-3 '(2LTRprl)

<SEQ ID NO. 14>; og HCV-proben var 5'-CCT TTC GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT -3' (C252-27P) <SEQ ID NO. 12>. Proben/produktkomplekset reagerte med streptavidin (SA)-pepperotsperoksidase'(HRP)-konjugat, som katalyserer den oksidative konversjonen av en fargeforløper til en farge (blå farge). Blåfargens intensitet ble skåret visuelt (0-10) ved å sammenligne fargeintensiteten til fargestandarder. Alle visuelle fargescoringer < 3 ble betraktet som positive resultater.

B. Resultater:

Gelelektroforese fra følgende amplifiseringsprodukter; 188 nt (HCV), 160 nt (D?C), og 150 nt (HIV LTR-langt produkt). Den kombinerte HIV- og HCV-analysen var i stand til å detektere alle kombinerte HIV- og HCV-prøver ved 15 kopier pr. PCR-test (500 virale partikler/ml plasma). I tillegg, ble mellom 50-90% av de kombinerte positive prøvene detektert ved 5 kopier/PCR-test (100 virale partikler/ml plasma). Resultatene er satt opp i Tabell 2, under.

Claims

1. Fremgangsmåte for å ko-detektere heptatitt C-virus (HCV) RNA og human immunsviktvirus (HIV) RNA i en biologisk prøve, karakterisert ved at nevnte metode omfatter: (A) å utføre en reverstranskripsjonsreaksjon ved å bruke RNA avledet fra nevnte prøve som en templat og minst en reverstranskripsjonsprimer som vil prime reverstranskripsjon av DNA fra HCV RNA og minst en reverstranskripsjonsprimer som vil prime reverstranskripsjon av DNA fra HIV RNA for å produsere reverstranskripsjonsprodukter som omfatter (a) HCV-spesifikke reverstranskripsjonsprodukter, (b) HIV-spesifikke reverstranskripsjonsprodukter, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b); (B) amplifisere nevnte reverstranskripsjonsprodukter ved å bruke en eller flere par av oligonukleotidprimere spesifikke for den 5' ikke-kodende regionen til HCV og en eller flere par av oligonukleotidprimere spesifikke for HTV for å produsere amplifiseringsprodukter som omfatter (a) HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter, (b) HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b); hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HCV består av: (i) foroverprimer 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (Cl31F25) <SEQ ID NO. 1>, og (ii) reversprimer 5 '-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3 '(C294R25) <SEQIDNO. 2>; hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HIV-1 består av en foroverprimer med sekvensen: 5' -CTGCTT AAGCCTC AAT AAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) <SEQ ID NO. 3>, og en reversprimer spesifikk for HIV-1 valgt fra gruppen bestående av: (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3' (JBLTR6) <SEQ ID NO. 4>, og (2) 5' -TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8) <SEQIDNO. 5>, hvori hvert av parene av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HIV-2 består av en foroverprimer med sekvensen 5' -GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe) <SEQ DD NO. 6>, og en reversprimer spesifikk for HTV-2 med sekvensen 5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1) <SEQ DD NO. 7>; og (C) å detektere nevnte amplifiseringsprodukter; hvori deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer tilstedeværelse av HCV RNA i nevnte prøve, deteksjon av HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HTV RNA i nevnte prøve og deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter og HIV-spesifikke amplifisereirngsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HCV RNA og HTV RNA i nevnte prøve.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte reverse transkripsjonsreaksjon blir utført ved bruk av tilfeldige oligonukleotidprimere.

3. Fremgangsmåte ifølge i krav 1, karakterisert ved at nevnte amplifisering blir utført ved en metode valgt fra gruppen bestående av polymerasekj edereaksj on, ligasekj edereaksj on, trådforskyvnings-amplifisering, nukleinsyre enkelbaseamplifisering og transkripsjonsmediert amplifisering.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter visualisering av nevnte amplifiseringsprodukter ved gelelektroforese.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter innfangning av nevnte amplifiseringsprodukter på et fast støttemateriale som inneholder (a) en eller flere HCV-spesifikke oligonukleotidprober (b) en eller flere HIV-spesifikke oligonukleotidprober, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b) og kvantifisering av nevnte innfangede produkter ved å bruke en kolorometrisk analyse.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte HCV-spesifikke probe består av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ ID NO. 12> og nevnte HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) <SEQIDNO. 13>; (b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ ID NO. 16>; og (c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ ID NO. 14>.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte prøve er valgt fra gruppen bestående av blod, serum, plasma, urin, spytt og cerebrospinalvæske.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte ko-detektering er simultan.

9. Fremgangsmåte for ko-amplifisering av heptatitt C-virus (HCV) DNA og human immunosviktvirus (HIV) DNA, karakterisert ved at nevnte metode omfatter: (A) å utføre en polymerasekj edereaksj on på en DNA-prøve mistenkt for å inneholde HCV DNA, HIV DNA, eller en kombinasjon av HCV DNA og HIV DNA, ved å bruke en eller flere par av oligonukleotidprimere spesifikke for 5' ikke-kodende region av HCV og en eller flere par av oligonukleotidprimerne spesifikk for HIV for å produsere amplifiseringsproduktene som omfatter (a) HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter, (b) HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b); hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for HCV består av: (i) foroverprimer 5 '-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) <SEQ ID NO. 1>, og (ii) reversprimer 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) <SEQ ID NO. 2>; hvori hver av parene av oligonukleotidprimerne spesifikk for HIV-1 består av en foroverprimer med sekvensen: 5' -CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) <SEQ ID NO. 3>, og en reversprimer spesifikk for HIV-1 valgt fra gruppen bestående av: (1) 5 '-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3' (JBLTR6) <SEQ ID NO. 4>, og (2) 5-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8) <SEQ ID NO. 5>; og hvori hver av parene av oligonukleotidprimerne spesifikke for HTV-2 består av en foroverprimer med sekvensen 5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe) <SEQ ID NO. 6>, og en reversprimer spesifikk for HTV-2 med sekvensen 5' -GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3' (2LTR-R1) <SEQ TD NO. 7>.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at den ytterligere omfatter: (B) å detektere nevnte amplifiseringsprodukter, hvori deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer tilstedeværelse av HCV DNA i nevnte prøve, deteksjon av HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HIV DNA i nevnte prøve, og deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter og HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HCV DNA og HTV DNA i nevnte prøve.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter visualisering av nevnte amplifiseringsprodukter ved gelelektroforese.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter innfanging av nevnte amplifiseringsprodukter på et fast støttemateriale som inneholder (a) en eller flere HCV-spesifikke oligonukleotidprober, (b) en eller flere HIV-spesifikke oligonukleotidprober, eller (c) en kombinasjon av (a) og (b) og kvantifisering av nevnte innfangede produkter ved å bruke en kolorimetrisk analyse.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte HCV-spesifikke probe består av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ ID NO. 12> og nevnte HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) <SEQIDNO. 13>; (b) 5' -GAAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQIDNO. 16>; og (c) 5 '-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ JD NO. 14>.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte ko-amplifisering er simultan.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte reverstranskribsjonsreaksjon blir utført ved i tillegg å anvende intern positiv kontroll (D?C) RNA som et templat, og minst en revers transkripsjonsprimer som vil prime reverstranskripsjon av DNA fra D?C RNA, for å produsere reverstranskripsjons-produkter som omfatter (a) IPC-spesifikke reverstranskripsjonsprodukter; og hvori nevnte reverstranskripsjons-produkter blir amplifisert ytterligere ved bruk av en eller flere par av oligonukleotid primere spesifikke for D?C, for å fremstille amplifiseringsprodukter som omfatter TPC spesifikke amplifiseringsprodukter; hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere spesifikk for D?C omfatter: (1) foroverprimer 5' -CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (TJPCF1) <SEQ ID NO. 8>, og (2) reversprimer 5'CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (IPCR1) <SEQ ID NO. 9>; hvori deteksjon av IPC-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer tilstedeværelse av IPC RNA i nevnte prøve.

16. Fremgangsmåte som definert i krav 15, karakterisert ved at nevnte reverstranskripsjonsreaksj on blir utført ved å bruke tilfeldige oligonukleotidprimere.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte amplifisering blir utført ved en metode valgt fra gruppen bestående av polymerasekjedereaksjon, ligasekj edereaksj on, trådforskyvningsamplifisering, og transkripsjonsmediert amplifisering.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter visualisering av nevnte amplifiseringsprodukter ved gelelektroforese.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter innfanging av nevnte amplifiseringsprodukter på et fast støttemateriale som inneholder (a) en eller flere IPC-spesifikke oligonukleotidprober, (b) en eller flere HCV-spesifikke oligonukleotidprober, (c) en eller flere HIV-spesifikke oligonukleotidprober, eller (d) en kombinasjon av enhver av (a), (b) og (c) og kvantifisere nevnte innfangede produkter ved å bruke kolorimetrisk analyse.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte IPC-spesifikke probe består av

5 '-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' <SEQ DD NO. 17>, nevnte HCV-spesifikke probe består av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ DD NO. 12> og nevnte HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5' -C AAC AG ACGGGC AC AC ACT ACT-3' (JBLTRpr3) <SEQ DD NO. 13>; (b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ DD NO. 16>; og (c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ DD NO. 14>.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte prøve er valgt fra gruppen bestående av blod, serum, plasma, urin, spytt og cerebrospinalvæske.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte ko-detektering er simultan.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte polymerasekjedereaksjon blir utført på en DNA prøve som ytterligere inneholder D?C DNA og en eller flere par av oligonukleotid primere spesifikke for IPC, for p produsere amplifiseringsprodukter som omfatter TPC amplifiseringsprodukter; hvori hver av nevnte par av oligonukleotidprimere spesifikk for ff C omfatter: (1) foroverprimer 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (IPCF1) <SEQ ID NO. 8>, og (2) reversprimer 5' C ACG ATCCTGGAGC AG AC ACTGAAGA-3' (IPCR1) <SEQ ID NO. 9>;

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den ytterligere omfatter: (B) å detektere nevnte amplifiseringsprodukter, hvori deteksjon av ff C-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer tilstedeværelse av IPC DNA i nevnte prøve, deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter indikerer tilstedeværelse av HPC DNA i nevnte prøve, deteksjon av HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HTV DNA i nevnte prøve, og deteksjon av HCV-spesifikke amplifiseringsprodukter og HIV-spesifikke amplifiseringsprodukter som indikerer tilstedeværelse av HCV DNA og HIV DNA i nevnte prøve.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter visualisering av nevnte amplifiseringsprodukter ved gelelektroforese.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at nevnte detektering omfatter innfanging av nevnte amplifiseringsprodukter på et fast støttemateriale som inneholder (a) en eller flere IPC-spesifikke oligonukleotidprober, (b) en eller flere HCV-spesifikke oligonukleotidprober, (c) en eller flere HIV-spesifikke oligonukleotidprober, eller (d) enhver kombinasjon av enhver av de foregående og kvantifisering av nevnte innfangede produkter ved a bruke en kolorimetrisk analyse.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte IPC-spesifikke probe består av

5' -CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' <SEQ DD NO. 17>, hvor nevnte HCV-spesifikke probe består av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ DD NO. 12> og nevnte HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5' -C AAC AGACGGGC AC AC ACT ACT-3' (JBLTRpr3) <SEQ DD NO. 13>; (b) 5' -G AAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ DD NO. 16>; og (c) 5-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ DD NO. 14>.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at nevnte ko-amplifisering er simultan.

29. Kit for ko-detektering av HCV RNA og HIV RNA i en biologisk prøve, karakterisert ved at nevnte kit omfatter: (a) et par av oligonukleotidprimere spesifikk for den 5' ikke-kodende regionen av HCV som består av: (i) foroverprimer 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' (C131F25) <SEQ DD NO. 10>, og (ii) reversprimer 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' (C294R25) <SEQ DD NO. 11>; og (b) oligonukleotidprimere spesifikk for HIV-1 som består av en foroverprimer med sekvensen: 5 '-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3' (JBLTR4) <SEQ DD NO. 3>, og en reversprimer spesifikk for HIV-1 valgt fra gruppen bestående av: (1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC AGAGT-3' (JBLTR6) <SEQ DD NO. 4>, og (2) 5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3' (JBLTR8) <SEQ DD NO. 5>, og et par av oligonukleotidprimere spesifikk for HTV-2 som består av en foroverprimer med sekvensen 5' -GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3' (2LTRe) <SEQ DD NO. 6>, og en reversprimer spesifikk for HTV-2 med sekvensen: 5' -GCGACT AGGAGAGATGGGAAC AC AC A-3' (2LTR-R1) <SEQ DD NO. 7>.

30. Kit ifølge krav 29, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for D*C, hvori nevnte par av oligonukletodidprimere som er spesifikke for PC omfatter foroverprimeren 5-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (TPCF1) <SEQ DD NO. 8> og reversprimeren 5 '-CVACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (D>CR1) <SEQ DD NO. 9>.

31. Kit ifølge krav 29, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en eller flere prober.

32. Kit ifølge krav 30, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en eller flere prober.

33. Kit ifølge krav 31, karakterisert ved at nevnte prober er valgt fra gruppen bestående av

5' -CCTTTCGCGACCC AAC ACT ACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ DD NO. 12>, 5' -C AAC AGACGGGC AC AC ACT ACT-3' (JBLTRpr3) <SEQ DD NO. 13>, 5-GAAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ DD NO. 16>, og 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ DD NO. 14>.

34. Kit ifølge krav 32, karakterisert ved at nevnte JPC-spesifikke probe består av 5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' flPClP) <SEQ DD NO. 17>, nevnte HCV-spesifikke probe består av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ DD NO. 12>, og nevnte HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) <SEQ DD NO. 13>; (b) 5' -GAAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ DD NO. 16>; og (c) 5 '-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ DD NO. 14>.

35. Kit for ko-amplifisering av HCV DNA og HIV DNA i en DNA-prøve, karakterisert ved at nevnte kit omfatter oligonukleotid primerne definert i krav 29.

36. Kit ifølge krav 35, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et par av oligonukleotidprimere som er spesifikke for TPC, hvori nevnte par med oligonukleotidprimere spesifikk for D^C omfatter foroverprimeren 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' (D<>>CF1) <SEQ DD NO. 8> og reversprimeren 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' (D>CR1) <SEQ DD NO. 9>.

37. Kit ifølge krav 35, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en eller flere prober.

38. Kit ifølge krav 36, karakterisert ved at det omfatter en eller flere prober.

39. Kit ifølge krav 37, karakterisert ved at nevnte prober er valgt fra gruppen bestående av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (C252-27-PRB) <SEQ ID NO. 12>, 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) <SEQ JD NO. 13>,

5' -GAAC AGATGGGC AC AC ACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ ID NO. 16>, og 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQTX)NO. 14>.

40. Kit ifølge krav 38, karakterisert ved at nevnte IPC-spesifikke probe består av 5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' (IPC1P) <SEQ ID NO. 17>, nevnte HCV-spesifikke probe består av 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'(C252-27-PRB) <SEQ ID NO. 12>, og nevnte HIV-spesifikke probe er valgt fra gruppen bestående av: (a) 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' (JBLTRpr3) <SEQIDNO. 13>; (b) 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQIDNO. 16>; og (c) 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3' (2LTRprl) <SEQ ID NO. 14>.