CN104120194B - 一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒 - Google Patents

一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104120194B
CN104120194B CN201410390106.7A CN201410390106A CN104120194B CN 104120194 B CN104120194 B CN 104120194B CN 201410390106 A CN201410390106 A CN 201410390106A CN 104120194 B CN104120194 B CN 104120194B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
primer
sequence
kit
small fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410390106.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104120194A (zh
Inventor
李金明
陈利达
李文丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Hospital
Original Assignee
Beijing Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Hospital filed Critical Beijing Hospital
Priority to CN201410390106.7A priority Critical patent/CN104120194B/zh
Publication of CN104120194A publication Critical patent/CN104120194A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104120194B publication Critical patent/CN104120194B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种病毒RNA检测引物的设计方法及试剂盒，尤指一种新型的病毒RNA小片段引物设计方法和以此方法设计的HCV？RNA检测试剂盒，属于临床检验学领域。本发明通过对HCV？RNA的5’–UTR区不同位置的引物设计，发现在HCV？RNA降解的患者血清中，目的片段为小片段的检测效率明显高于长片段；并用上述最小片段的引物建立了相应的检测试剂盒。本发明的特点是：本发明所描述的小片段引物设计方法提供了一种新型的、涉及二级结构的、可靠的小片段引物设计原则；尤其适用于RNA降解标本的检测；可以推广到其他病毒RNA的检测中；可降低对标本采集、运输、保存中的要求，提高检测效率。

Description

一种病毒RNA检测引物的设计方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种新型的病毒RNA小片段引物设计方法和以此方法设计的HCVRNA检测试剂盒，属于临床检验学领域。
背景技术
病毒RNA定量检测是病毒感染辅助诊断和疗效观察的重要依据。然而，诸多研究证实：病毒RNA在标本采集、运输、保存、检测前处理等过程中存在降解现象，若RNA降解，以目前的试剂盒来看，检测效率将普遍降低，进而影响诊断治疗。这是由于：以HCV为例，目前国内外检测HCVRNA的商品化试剂盒通常是扩增5’-UTR的150-250bp左右的片段。5’-UTR是HCVRNA的最保守序列，长341nt，其保守性使其成为引物设计最集中的区域。然而，商品化试剂盒通常忽略了5’-UTR的二级结构降解时对检测的影响。
HCVRNA的5’-UTR大部分序列自身互补，因而形成了充满了“茎环”的二级结构。①该结构存在热不稳定性，运输和保存中环境温度的变化会导致5’-UTR二级结构打开，使得靠近其5’端的序列容易被外切酶降解。目前商品化试剂盒检测片段普遍较长，不可避免地靠近5’端而易被外切酶降解，使得检测效率降低。
②该结构存在酶不稳定性，在“环”的区域常常比“茎”区更容易被多种内切酶降解，使RNA5’-UTR被酶降解成长短不一的小片段。若引物刚好设计在“环”上充满酶切位点的区域，则当RNA被内切酶降解，引物无法和模板结合，检测效率也将降低。目前商品化试剂盒的检测片段普遍较长，不可避免地含盖诸多“茎”区而易被内切酶降解，使得检测效率降低。
因此，对于RNA降解标本，目前商品化试剂盒的检测效率都会有不同程度的降低，检测结果可能会影响用药和疗效观察，或者造成HCVRNA阳性献血者血液漏检。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是建立一种新型的病毒RNA检测的小片段引物设计方法。
本发明要解决的第二个技术问题是以HCV为例，用上述方法设计引物，建立HCVRNA小片段检测试剂盒。
本发明要解决的第三个技术问题是提供上述试剂盒的应用，并和其他试剂盒进行检测性能比较。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种病毒RNA检测引物的设计方法，由以下原则组成：
(1)选择病毒基因组RNA最保守区域，通常为5’–UTR区进行引物设计；
(2)将该病毒各型别在5’–UTR区的共同序列作为引物设计的选择区域，并将共同序列在二级结构中定位；
(3)共同序列中位于5’–UTR二级结构的“茎”上的区域作为引物设计的首选区，尽量避开“环”结构；
(4)正反引物设计应尽量靠近5’–UTR的3’端；
(5)将最靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为forward引物互补区；
(6)将第二靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为probe探针的互补区；
(7)将第三靠近5’–UTR的3’端，位于“茎”上的18-21nt的序列选为reverse引物；
(8)forward引物、probe探针、reverse引物之间不要有重合区域；
(9)扩增的目的片段跨越的“环”越少越好，即目的片段越小越好。
所述(1)的5’-UTR的二级结构为各RNA病毒专属的、国际公认的二级结构。
所述(2)共同序列是该病毒各亚型的RNA序列通过clustalX多重序列比对程序比对所得的共同序列。
一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列，包括引物序列、探针序列和阳性序列，其中引物序列为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，探针序列为序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，阳性序列为序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。
本发明通过对HCVRNA的5’–UTR区不同位置的引物设计，发现在HCVRNA降解的患者血清中，目的片段为小片段的检测效率明显高于长片段；并用上述最小片段的引物建立了相应的检测试剂盒。
一种HCV病毒RNA检测试剂盒，由以下检测试剂组成：
(1)HCVRNA提取试剂：
1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；
2)RNaseinhibitor：含有RNase抑制剂的溶液；
3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；
4)漂洗液：含有75％的乙醇的溶液；
5)洗脱液：RNasefreewater；
6)RNA吸附柱；
(2)OneStepRT-PCR荧光检测试剂：
1)PCR反应液(PCRbuffer)；
2)dNTP混合液(dNTPmix)；
3)引物A(primerforward)：5’-GCTGCACGGTCTACGAGAC-3’(SEQIDNo.1)；
4)引物B(primerreverse)：5’-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3’(SEQIDNo.2)；
5)荧光探针(probe)：5’-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3’(SEQIDNo.3)；
6)酶混合物(EnzymeMix)：含有Taq酶和逆转录酶；
(3)对照品
1)阴性对照：HCV阴性的健康人血清；
2)强阳性对照：含有3×107的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA(SEQIDNo.4)；
3)弱阳性对照：含有3×103的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA(SEQIDNo.4)。
阳性对照(SEQIDNo.4)：
5’-AGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGGGUGCUUGCGAGUGCCCCGGGAGGUCUCGUAGACCGUGCACC-3’
所述(2)中引物A为5’-GCTGCACGGTCTACGAGAC-3’，是根据本发明的引物设计原则选出的最靠近5’–UTR的3’端区域的互补序列。
所述(2)中引物B为5’-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3’，是根据本发明的引物设计原则选出的第三靠近5’–UTR的3’端的序列。
所述(2)中荧光探针(probe)：5’-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3’，是根据本发明的引物设计原则选出的第二靠近5’–UTR的3’端区域的互补序列。
所述的一种病毒RNA检测引物的设计方法在HCVRNA发生降解的血清检测中的应用、在临床上检测HCV感染患者血清中的应用、在献血者血液筛查中的应用、或在检测其他RNA病毒中的应用。
所述的一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列或一种HCV病毒RNA检测试剂盒在HCVRNA发生降解的血清检测中的应用、在临床上检测HCV感染患者血清中的应用、在献血者血液筛查中的应用、或在检测其他RNA病毒中的应用。
所述的HCVRNA小片段检测试剂盒的应用。例如：
(1)HCVRNA小片段检测试剂盒在检测临床HCV感染者血清RNA水平中的应用，可以为临床治疗和用药提供辅助诊断依据；
(2)HCVRNA小片段检测试剂盒在献血者的血液筛查中的应用，可以发现HCV阳性的血液或处于HCV感染窗口期的献血者血液，保护输血的安全性；
(3)HCVRNA小片段检测试剂盒在检测HCVRNA发生降解的标本中的应用。本试剂盒可以检测那些由于采集、运输、保存不当发生降解的RNA标本。用本试剂盒检测HCVRNA降解前后标本，发现：在降解前，长片段和小片段扩增的Ct值相近，即检测RNA含量差距不大；在降解后，长片段扩增的Ct差值比小片段扩增的Ct差值明显增大，即RNA含量用长片段方法时检测效率下降，而用本发明中的小片段检测方法可以最大限度地还原降解标本的原始模板量，进而提高检测效率。
(4)所述的病毒RNA检测的小片段引物设计方法在其他病毒RNA检测中的应用。本发明得到了一整套新的RNA引物设计原则，考虑到了二级结构和片段长短的因素，较大程度地克服了由于RNA降解所导致的检测效率降低，可以推广到其他病毒RNA检测中。
本发明试剂盒的简要检测程序为：
(1)提取HCVRNA；
(2)配制RT-PCR主反应混合液；
(3)分别加入forward引物与reverse引物；
(4)加入Taqman探针作为实时荧光PCR的监测工具；
(5)设定程序并扩增；
(6)得到结果和结果分析。
本发明的优点：本发明提供了一种病毒RNA小片段的引物设计方法以及HCVRNA小片段检测试剂盒，①可以最大限度地还原病毒RNA降解标本的原始病毒载量，提高检出率，防止血液筛查的漏检；②可以不用严格要求标本的采集、运输、保存条件；③可以推广到其他病毒的引物设计中，使病毒RNA降解不再较大影响检测结果；④灵敏度高、使用方便、操作简单、特异性强。
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换，均属于本发明保护范围。
附图说明
图1：用本发明的小片段方法来设计HCVRNA引物，在HCVRNA5’-UTR二级“茎环”结构上，设计了R1(reverse1)、F(forward)引物和一个探针P(probe)；为验证本方法，另设计了R2、R3、R4(reverse2、3、4)引物作对比。
图2：HCVRNA降解前后，不同长度目的片段检测HCVRNA病毒含量的Ct差值。
图3：本发明的小片段试剂盒与科华、罗氏试剂盒在RNA降解前后的临床标本中的检测性能比较。
具体实施方式
以下为实施例中涉及的主要材料和试剂：
病毒裂解液，国药集团，中国
RNaseinhibitor，Promega，美国
去蛋白液，国药集团，中国
漂洗液，国药集团，中国
RNA吸附柱，天根生化，中国
OneStepRT-PCRBuffer，Qiagen，德国
dNTPmix，Qiagen，德国
Primerforward，invirogen，美国
Primerreverse，invirogen，美国
Probe，invirogen，美国
RNasefreewater，康为世纪，中国
OneStepRT-PCREnzymeMix，科华生物，中国
TemplateRNA，从血清标本中提取的HCVRNA
引物、探针和阳性对照均委托英潍捷基上海(贸易)有限公司合成，探针标记：5’荧光基团是FAM标记，3’淬灭基团是MGB标记。
实施例1：检测HCVRNA小片段的试剂盒
一.试剂盒组成
1.HCVRNA提取试剂：
1)病毒裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；
2)RNaseinhibitor：含有RNase抑制剂的溶液；
3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；
4)漂洗液：含有75％的乙醇的溶液(无水乙醇用纯水1:3稀释)；
5)洗脱液：RNasefreewater；
6)RNA吸附柱(硅基质膜)。
2.OneStepRT-PCR荧光检测试剂：
1)PCR反应液(PCRbuffer)：Qiagen，德国；
2)dNTP混合液(dNTPmix)：Qiagen，德国；
3)引物A(primerforward)：5’-GCTGCACGGTCTACGAGAC-3’，自主设计；(SEQIDNo.1)使用浓度10μM；
4)引物B(primerreverse)：5’-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3’，自主设计；(SEQIDNo.2)使用浓度10μM；
5)荧光探针(probe)：5’-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3’，自主设计；(SEQIDNo.3)使用浓度10μM；探针标记：5’荧光基团是FAM标记，3’淬灭基团是MGB标记；
酶混合物(EnzymeMix)：含有Taq酶和逆转录酶，来源为OneStepRT-PCRKit；
3.对照品
1)阴性对照：HCV阴性的健康人血清；
2)强阳性对照：含有3×107的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA；(SEQIDNo.4)
3)弱阳性对照：含有3×103的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA，(SEQIDNo.4)。
二.人血清HCVRNA检测条件及方法：
1.HCVRNA的提取
1)将血清与裂解液等体积混匀；
2)加入RNaseinhibitor，混匀后70℃加热10min；
3)再加入等体积无水乙醇，震荡混匀；
4)将3)中的混合液全部转入RNA吸附柱，离心弃液；
5)吸附柱中加入去蛋白液，离心弃液；
6)吸附柱中加入漂洗液，离心弃液；
7)加入RNasefreewater，静置1min，离心，收集液为模板RNA。
2.OneStepRT-PCR扩增体系
表1
3.循环参数：
表2
4.结果获取和分析
在RealTimePCRSystem中选择“Auto”—“Analyse”，得到每个标本的HCVRNA检测结果。
实施例2：上述试剂盒在临床上检测HCVRNA降解标本的应用，并与国内外检测试剂盒的性能比较。
一.材料
1.实施例1所述的试剂盒；国产较好的上海科华丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒；国际上公认的罗氏COBASAmpliPrep/COBASTaqManHCVTest试剂盒。
2.血清：30份HCVRNA阳性患者血清，每份分为降解前原始血清和降解后血清。
二.方法
1.血清的处理：
将每份血清等量分装为2支，1支-40℃冻存；另1支37℃处理6h使RNA发生降解，-40℃冻存，检测时同时取出复融。
2.样本RNA的提取
(1)小片段方法的RNA提取：按实施例1中“HCVRNA的提取”操作。
(2)上海科华的RNA提取：按其说明书操作。
(3)罗氏公司的RNA提取：按其说明书操作。
3.提取的RNA进行扩增
(1)小片段方法的RNA扩增：按实施例1中“OneStepRT-PCR”操作。
(2)上海科华的RNA提取：按其说明书操作。
(3)罗氏公司的RNA提取：按其说明书操作。
三.结果
1.用本发明的小片段方法来设计HCVRNA引物
用本发明的小片段方法来设计HCVRNA引物，在HCVRNA5’-UTR二级“茎环”结构上，设计了小片段R1(reverse1)、F(forward)引物和一个探针P(probe)；为验证本方法，另设计了R2、R3、R4(reverse2、3、4)引物，以扩增比小片段更长的片段作对比。
图1为小片段和长片段引物、探针在HCV5’–UTR区的位置。其中R1：引物1(reverse1)，目的片段62bp；R2：引物2(reverse2)，目的片段157bp；R3：引物3(reverse3)，目的片段221bp；R4：引物4(reverse4)，目的片段253bp；F互补：引物forward的互补区；P互补：探针probe的互补区。
图1结果显示，扩增目的片段长度由小到大依次为(小片段R1+F)<(R2+F)<(R3+F)<(R4+F)。
R2：5’-CGACCGGGTCCTTTCTTGGAT-3’(SEQIDNo.5)
R3：5’-ACCCCCCCTCCCGGGAGAGCC-3’(SEQIDNo.6)
R4：5’-GGCGTTAGTATGAGTGTC-3’(SEQIDNo.7)
2.用小片段引物和长片段引物检测HCVRNA降解样本
HCVRNA降解前后，不同长度目的片段检测HCVRNA病毒含量的Ct差值，差值越大，说明RNA降解对检测的影响越大。图2为各长度目的片段的引物对降解前和降解后RNA扩增的差异。(1)中降解前各长度目的片段扩增的RNA水平没有显著性差异，p＝0.9422；(2)中降解后各长度目的片段扩增的RNA水平有显著性差异，p<0.0001。可见扩增的目的片段越长，检测受RNA降解的影响越大；目的片段越小，在降解标本中检测到的RNA水平越接近降解前RNA的原始值。
图2结果显示，小片段(R1+F)引物比其他长片段引物在扩增RNA降解标本中具有明显优势，Ct值下降幅度最小。即小片段方法能够最大限度地还原降解标本的原始RNA含量，检测敏感性高，符合统计学差异(p<0.0001)，也证明了本发明的病毒RNA的小片段引物设计方法理论的正确性。
3.本发明的小片段试剂盒与科华、罗氏试剂盒在RNA降解的临床标本中的检测性能比较
目前临床上检测HCVRNA的试剂盒种类繁多，其中国产的比较好的为上海科华丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，国际上公认的为罗氏的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHCVTest试剂盒。因此，本发明中的试剂盒与这两者进行比较。
图3为小片段试剂盒与不同试剂盒对降解前和降解后HCVRNA检测的差别。(1)中降解前各试剂盒扩增的RNA水平没有显著性差异，p＝0.8716；(2)中降解后小片段与其他试剂盒扩增的RNA水平有显著性差异，p<0.05。
图3结果显示，降解前，小片段方法与罗氏检测RNA含量相当，略高于科华；而降解后，小片段方法的RNA含量基本不下降，罗氏略有下降，科华下降明显，符合统计学差异(p<0.05)。说明小片段方法在HCVRNA标本不降解时，检测性能和罗氏相当，比科华略好；在RNA降解时，更是表现出优势，比罗氏略好，优于科华。

Claims (2)

1.一组检测HCV病毒RNA的核苷酸序列，其特征在于：包括引物序列、探针序列和阳性序列，其中引物序列为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，探针序列为序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，阳性序列为序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。
2.一种HCV病毒RNA检测试剂盒，其特征在于由以下检测试剂组成：
(1)HCVRNA提取试剂：
1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；
2)核糖核酸酶抑制剂：含有核糖核酸酶抑制剂的溶液；
3)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；
4)漂洗液：含有75％的乙醇的溶液；
5)洗脱液：无核酸酶水；
6)RNA吸附柱；
(2)一步法RT-PCR荧光检测试剂：
1)PCR反应液；
2)dNTP混合液；
3)引物A：5’-GCTGCACGGTCTACGAGAC-3’；
4)引物B：5’-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3’；
5)荧光探针：5’-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3’，探针标记：5’荧光基团是FAM标记，3’淬灭基团是MGB标记；
6)酶混合物：含有Taq酶和逆转录酶；
(3)对照品
1)阴性对照：HCV阴性的健康人血清；
2)强阳性对照：含有3×107IU/ml的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA，为序列表SEQIDNo.4所示序列；
3)弱阳性对照：含有3×103IU/ml的HCV5’-UTR的非传染性体外转录RNA，为序列表SEQIDNo.4所示序列。
CN201410390106.7A 2014-08-08 2014-08-08 一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒 Expired - Fee Related CN104120194B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410390106.7A CN104120194B (zh) 2014-08-08 2014-08-08 一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410390106.7A CN104120194B (zh) 2014-08-08 2014-08-08 一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104120194A CN104120194A (zh) 2014-10-29
CN104120194B true CN104120194B (zh) 2016-05-18

Family

ID=51765824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410390106.7A Expired - Fee Related CN104120194B (zh) 2014-08-08 2014-08-08 一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104120194B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104946624A (zh) * 2015-04-23 2015-09-30 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种贝类总病毒核酸的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268575A (zh) * 1999-02-03 2000-10-04 奥索临床诊断有限公司 有效的多重检测丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺损病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法
CN101812536A (zh) * 2009-02-24 2010-08-25 江苏默乐生物科技有限公司 丙型肝炎病毒荧光定量检测的引物和探针

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268575A (zh) * 1999-02-03 2000-10-04 奥索临床诊断有限公司 有效的多重检测丙型肝炎病毒(hcv)和人免疫缺损病毒(hiv)的寡核苷酸引物及其使用方法
CN101812536A (zh) * 2009-02-24 2010-08-25 江苏默乐生物科技有限公司 丙型肝炎病毒荧光定量检测的引物和探针

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丙型肝炎病毒NS5b区与5’-非编码区不同基因区RNA检测结果的比较;许青田等;《临床肝胆病杂志》;20001125;第16卷(第4期);第214-215页，参见第3部分，讨论 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104120194A (zh) 2014-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ambrosi et al. SARS-CoV-2: Comparative analysis of different RNA extraction methods
Batten et al. A real time RT-PCR assay for the specific detection of Peste des petits ruminants virus
La Rosa et al. Molecular detection of hepatitis E virus in sewage samples
EP3636769A1 (en) Sample nucleic acid measurement test kit, reagent, and application thereof
CN106755571B (zh) 一种用于检测寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒的试剂盒
CN106957925A (zh) 一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针
CN105368817A (zh) 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法
CN109182600B (zh) 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒
CN101144771B (zh) 检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒
CN102586473A (zh) 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒
CN109402239A (zh) 一种用于实时荧光定量pcr的免提取直接扩增试剂及其应用
CN101633964A (zh) 一种甲型h1n1流感病毒rna检测试剂盒
CN102559930A (zh) 一种荧光定量rt-pcr检测丙型肝炎病毒的试剂盒
WO2023109031A1 (zh) 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN105483283A (zh) 丙型肝炎病毒hcv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN103966356A (zh) 人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量pcr检测试剂盒
CN101921870B (zh) 用于检测人甲型流感病毒的核苷酸序列、方法及试剂盒
CN103173568B (zh) 一种快速鉴定1型登革热病毒的引物组、试剂盒及方法
CN102367488A (zh) 肠道病毒三联实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒
Saha et al. Development of rapid, sensitive one-tube duplex RT-PCR assay for specific and differential diagnosis of Chikungunya and dengue
CN104120194B (zh) 一种病毒rna检测引物的设计方法及试剂盒
CN104593357A (zh) 用于检测肠道病毒的核酸及其应用
Saha et al. A novel nested reverse-transcriptase polymerase chain reaction method for rapid hepatitis C virus detection and genotyping
CN106716140A (zh) 用于干斑的自动化hiv‑1病毒载量测试程序
CN106244730B (zh) 猴嗜t淋巴细胞病毒i型的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160518

Termination date: 20170808

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee