CN106716140A - 用于干斑的自动化hiv‑1病毒载量测试程序 - Google Patents

用于干斑的自动化hiv‑1病毒载量测试程序 Download PDF

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Abstract

本发明提供可用于诊断和监测治疗进展的、对干血斑检测HIV‑1病毒载量的新的和非显而易见的改进。

Description

用于干斑的自动化HIV-1病毒载量测试程序
背景
人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体。(Barre-SinoussiF, Chermann JC, Rey F等，从面临获得性免疫缺陷综合征(AIDS)风险的患者分离T-亲淋巴逆转录病毒(Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at riskfor acquired immune deficiency syndrome (AIDS)). Science 1983, 220:868-71;Popovic M, Sarngadharan MG, Read E等，来自AIDS和前-AIDS患者的细胞病变的逆转录病毒(HTLV-I)的检测、分离和连续生产(Detection, isolation and continuousproduction of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS andpre-AIDS). Science 1984, 224:497-500; Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M等，从AIDS和面临AIDS风险的患者频繁检测和分离细胞病变的逆转录病毒(HTLV-I) (Frequentdetection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from patientswith AIDS and at risk for AIDS). Science 1984, 224:500-3)。它可以通过性接触、暴露于受感染的血液或血液制品，或从被感染的母亲到胎儿传播。(Curran JW, Jaffe HW,Hardy AM等，HIV感染和AIDS在美国的流行病学(Epidemiology of HIV infection andAIDS in the United States). Science 1988, 239:610-16)。急性HIV综合征，以流感样症状为特征，在开始感染后发展3-5周并与高水平的病毒血症相关。(Daar ES, Moudgil T,Meyer RD, Ho DD. 原发性人类免疫缺陷病毒1型感染患者中短暂的高水平病毒血症(Transient high levels of viremia in patients with primary humanimmunodeficiency virus type 1 infection). New Engl J Med 1991, 324:961-4;Clark SJ, Saag MS, Decker WD. 有症状的原发性HIV-1感染患者血浆中高滴度的细胞病变的病毒(High titers of cytopathic virus in plasma of patients withsymptomatic primary HIV-1 infection). New Engl J Med 1991, 324:954-60)。在症状发作的4-6周内，HIV特异性免疫应答是可检测的。(Albert J, Abrahamsson B, Nagy K等，在原发性HIV-1感染和随后的抗自体血清中和的病毒变种出现后，分离株-特异性中和抗体的快速发展(Rapid development of isolate-specific neutralizing antibodiesafter primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variantswhich resist neutralization by autologous sera). AIDS 1990, 4:107-12;Horsburgh CR Jr, Ou CY, Jason J等，在抗体检测前，人类免疫缺陷病毒感染的持续时间(Duration of human immunodeficiency virus infection before detection ofantibody). Lancet 1989, 334:637-40)。在血清转化后，在外周血中的病毒载量下降并且大多数患者进入可持续数年的无症状阶段。(Pantaleo G, Graziosi C, Fauci AS. 人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的免疫发病机理的新概念(New concepts in theimmunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection). New Engl J Med 1993, 328:327-35)。外周血中HIV水平的定量测量大大有助于对HIV感染的发病机理的理解(Ho DD, Neumann AU, Perelson AS等，HIV-1感染中血浆病毒体和CD4淋巴细胞的快速周转(Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1infection). Nature 1995, 373:123-6; Wei X, Ghosh SK, Taylor ME等，人类免疫缺陷病毒1型感染的病毒动力学(Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1infection). Nature 1995, 373:117-22)并且已被证明是HIV感染个体的预后与管理中的一个重要参数。(Mellors JW, Rinaldo CR JR, Gupta P等，通过血浆中病毒的量预测的HIV-1感染的预后(Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity ofvirus in plasma). Science 1996, 272:1167-70; Mellors JW, Munoz A, Giorgi JV等，作为HIV-1感染的预后标记物的血浆病毒载量和CD4+淋巴细胞(Plasma viral loadand CD4+ lymphocytes as prognostic markers of HIV-1 infection). Ann Intern Med 1997, 126(12):946-54; Chene G, Sterne JA, May M等，在开始有效的抗逆转录病毒疗法的HIV-1感染患者中初始应答的预后意义：前瞻性研究的分析(Prognosticimportance of initial response in HIV-1 infected patients starting potentantiretroviral therapy: analysis of prospective studies). Lancet 2003, 362:679-86; Egger M, May M, Chene G等，开始高活性抗逆转录病毒药物疗法的HIV-1感染患者的预后：一项前瞻性研究的合作分析(Prognosis of HIV-1 infected drug patientsstarting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis ofprospective studies). Lancet 2002, 360:119-29; Wood E, Hogg RS, Yip B等，血浆人类免疫缺陷病毒1型RNA的较高基线水平与在三联药抗逆转录病毒疗法开始后死亡率增加有关(Higher baseline levels of plasma human immunodeficiency virus type 1RNA are associated with increased mortality after initiation of triple-drugantiretroviral therapy). J Infect Dis 2003, 188:1421-5; 美国卫生和人类服务部(US Department of Health and Human Services). 2004年HIV-1感染的成人和青少年中抗逆转录病毒药物的使用指南(2004 guidelines for the use of antiretroviralagents in HIV-1 infected adults and adolescents). 在：AIDSinfo.nih.gov/guidelines在线获得)。关于抗逆转录病毒疗法的开始或变化的决定通过监测血浆HIV RNA水平(病毒载量)、CD4+ T细胞计数，和患者的临床病症来指导。美国卫生和人类服务部(USDepartment of Health and Human Services). 2004年HIV-1感染的成人和青少年中抗逆转录病毒药物的使用指南(2004 guidelines for the use of antiretroviral agentsin HIV-1 infected adults and adolescents). 在：AIDSinfo.nih.gov/guidelines在线获得; Yeni PG, Hammer SM, Hirsch MS等，成人HIV感染的治疗(Treatment for AdultHIV Infection). 2004年国际AIDS协会-美国小组的建议(2004 Recommendations of theInternational AIDS Society-USA Panel). JAMA 2004, 292:251-65)。抗逆转录病毒疗法的目的是减少血浆中的HIV病毒至低于可利用的病毒载量试验的可检测水平。(美国卫生和人类服务部(US Department of Health and Human Services). 2004年HIV-1感染的成人和青少年中抗逆转录病毒药物的使用指南(2004 guidelines for the use ofantiretroviral agents in HIV-1 infected adults and adolescents). 在：AIDSinfo.nih.gov/guidelines在线获得; AS, Essunger P, Cao Y等，在组合疗法期间HIV-1感染的隔室的衰减特性(Decay characteristics of HIV-1 infectedcompartments during combination therapy). Nature 1997, 387(6629):188-91)。血浆中的HIV RNA水平可通过现有技术程序，用核酸扩增或信号扩增技术量化。(Mulder J,McKinney N, Christopher C等，用于血浆中人类免疫缺陷病毒1型RNA的定量的快速和简单的PCR测定：急性逆转录病毒感染的应用(Rapid and simple PCR assay forquantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma:application to acute retroviral infection). J Clin Microbiol 1994, 32:292-300; Dewar RL, Highbarger HC, Sarmiento MD等，分支DNA信号扩增以监测人血浆中的人类免疫缺陷病毒1型负担的应用(Application of branched DNA signalamplification to monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in humanplasma). J Inf Diseases 1994, 170:1172-9; Van Gemen B, Kievits T, Schukkink R等，在HIV-1原发性感染期间，使用NASBA™量化血浆中的HIV-1 RNA (Quantification ofHIV-1 RNA in plasma using NASBA™ during HIV-1 primary infection). J Virol Methods 1993, 43:177-87)。
发明概述
外周血中的HIV-1水平的定量测量是确定受感染患者的疾病预后和抗逆转录病毒治疗疗程的基本参数。由于有限的病毒RNA稳定性，自血浆进行的常规的HIV-1病毒载量(VL)测试对样品采集、处理和装运施加了限制性要求，其在资源有限的环境中可能阻碍VL测试的进一步扩展。包括干血斑(DBS)的干斑(DS)代表一个绕过这些后勤和技术限制的可行的选择。并非DBS的DS可以是，例如，血浆、唾液、血清等。本发明提供新的HIV-1 DS/DBS VL测定的新的和不显而易见的方法和程序。
用于HIIV-1 RNA和前病毒DNA (掺入宿主细胞的DNA的病毒基因组或其部分)定量的DBS测定的开发尚处于初始阶段。迄今本领域开发的测定法深受与成本和效率相关的几个缺点的困扰。例如，目前许多程序需要手动转移DS或DBS洗脱液，用于进一步的核酸提取程序，这提供了误差和污染进入测定的机会。如果DNase处理在现有技术测定中是理想的或需要的，程序经常涉及使用额外的试剂(特异性DNase反应缓冲液和去活化缓冲液)、设备(加热装置)、时间(用于完成DNase程序步骤)和额外的手动操作。
本发明的程序减少和消除了现有技术的这些缺点。本发明的DS/DBS HIV-1 VL测定利用新的工作流程和创新的洗脱/反应缓冲系统。超过现有技术的这些改进导致可以是几乎完全自动化的，伴有超过现有技术的增加的精度和效率的测定。此外，超过现有技术的这些改进允许使用DNase，而没有使用DNase的现有技术程序固有的额外时间和不便。
本发明期望一种检测血液样品中的HIV-1核酸的自动化方法，该方法包括：a) 提供：i) 在固体载体上干燥的疑似感染HIV的血液样品，ii)洗脱缓冲液，iii) 自动化的、可编程样品制备仪器，iv) 自动化的、可编程PCR仪器，v) DNase和vi) 适合于检测HIV-1核酸的PCR试剂；b) 用洗脱缓冲液从固体载体洗脱血液样品以创建洗脱的样品；c) 将洗脱的样品装入自动化的、可编程样品制备仪器中，供进一步的核酸提取和纯化，以创建处理过的样品；d) 将PCR试剂装入自动化的、可编程PCR仪器中；e) 启动自动化程序以将PCR试剂的等分量分配到处理过的样品中；f) 用自动化的、可编程PCR仪器对处理过的样品中提取的核酸进行PCR；g) 分析用自动化的、可编程PCR仪器生成的PCR结果，以确定是否任何样品包含HIV-1核酸；h) 其中，所述洗脱缓冲液包含约3.5 M GITC、约5% Tween® 20 (聚山梨醇酯20的商品名；也称为聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇单月桂酸酯)、约50 mM KOAc (乙酸钾)(约pH 6.0)；i) 其中，任选地，在PCR试剂加入到处理过的样品中后，将DNase加入到处理过的样品、PCR试剂或完全的PCR反应物的一种或多种中。
本发明还期望所述方法另外包括阴性对照和阳性对照。
本发明还期望步骤b)于室温下以温和的间歇混合进行约20分钟，或于55℃以温和的间歇混合进行30分钟。
本发明还期望通过软件命令编程自动化程序。
本发明还期望进行步骤i)，并且所述DNase不需要特定的DNase反应缓冲液，于室温或在PCR循环阶段期间采用的温度下是有效的，在30分钟的时间段内有效地降解DNA，有效地降解DNA后不需要灭活并且对RNA序列的检测没有负面的影响。
本发明还期望固体载体是滤纸。
本发明还期望核酸是RNA。
本发明还期望核酸是前病毒DNA。
附图简述
图1显示有效地除去DNA并且对RNA信号没有负面的影响的DNase (Ambion DNase 1(无RNase) (Cat # AM2222)或等效物)。DNase在进行PCR反应之前被用来直接处理提取的核酸。
图2显示不能有效地除去DNA并且对RNA信号没有负面的影响的DNase (NewEngland Biolabs DNase I (无RNase) (Cat # MO303S)或等效物)。DNase在进行PCR反应之前被用来直接处理提取的核酸。
图3显示有效地除去DNA并且负面地影响RNA信号的DNase (Sigma-Aldrich DNase1 (扩增级) (Cat # AMPD1)或等效物)。DNase在进行PCR反应之前被用来直接处理提取的核酸。
图4显示有效地除去DNA并且对RNA信号没有负面的影响的DNase (Promega RQ1无RNase的DNase (Cat # M6101)或等效物)。DNase在进行PCR反应之前被用来直接处理提取的核酸。
图5显示在1000拷贝/mL的HIV-1下，于55℃ 30分钟对比室温20分钟的DBS洗脱条件的比较。每种条件使用71次重复。于55℃ 30 min的循环阈值(Ct)早于在室温下20分钟的Ct。于55℃ 30分钟的最大比例(MR；信号强度的量度)高于在室温下20分钟的MR。
图6显示在范围从52至65℃的温度下，从25至45分钟的DBS洗脱。虽然Ct值在各条件之间是可比较的，但具有最高MR值的条件是55℃ 30分钟。
图7显示于55℃ 10、20和30分钟的DBS洗脱。不断增加的洗脱时间显示了改善Ct和增加MR的趋势，虽然各个时间点之间的差别并不明显。于55℃温育30分钟后，于室温下进一步温育至多24小时不影响PCR结果。
发明详述
到目前为止，血浆样品的测试是HIV-感染的个体对于抗逆转录病毒疗法(ART)的病毒载量(VL)评价的金标准。在资源有限的环境下，干血斑(DBS)的使用是一种用于VL测试和基因分型二者的很有前途的替代样品类型。DBS与基于自动化样品处理和实时PCR的系统组合将允许在中心实验室中的VL测量或基因分型试验。
为使HIV病毒载量测定适合于DBS，最重要的技术问题是测定灵敏性和特异性。DBS病毒载量测定的临床灵敏性和特异性在世界卫生组织(WHO) 2013年抗逆转录病毒治疗指南中通过使用1000拷贝/mL的阈值定义。在ART启动后，具有血浆VL <1000拷贝/mL 12个月或更长时间的患者的比例是作为获得性耐药调查的一部分测定的一个重要结果。具有低于这个水平的VL的患者被分类为具有成功的药物疗法(Parkin, 2014 AIDS Rev)。
测定特异性与相对于细胞-相关的DNA或RNA的无细胞RNA的分离/扩增相关。如果一种测定获得无细胞RNA和细胞-相关的DNA或RNA二者，一种在低血浆VL浓度下的显著的过度量化(over-quantification)将被观察到，因为细胞DNA是干血斑中非-血浆病毒-衍生的核酸的主要来源。(Parkin, 2014 AIDS Rev.)。Abbott实时HIV-1 m2000系统结合对RNA为特异性或至少选择性的试剂和方法(Parkin, 2014 AIDS Rev.)。报告也要求使用Abbott实时HIV-1测定的在血浆和DBS样品中病毒载量之间的可接受的相关性(Marconi, A.等,2009 Clin Microbiol Infect; Arredondo等, 2012 J Clin Micro)。
测定灵敏性通常由测定检测限度(LOD)表示。DBS灵敏性的主要挑战是体积限制限定输入拷贝数(由Nell T. Parkin评述, 2014)。Abbott实时HIV-1 DBS测定的改良版本(Abbott实时HIV-1 DBS测定开放模式)被开发，其涉及使用一个不需要切除的穿孔的70µlDBS斑点。此外，不需要各管之间的样品传输。DBS在1300µl缓冲液中洗脱，其中1000µl用作输入处理。因此，为提取而转移的全血的实际量是约53.8µl。采用当前室温洗脱条件(概述于初始DBS开放模式方案中)，实验-确定的DBS洗脱回收率(与血浆比较)范围从24%至43%(与血浆比较)，平均为35%，这导致1080拷贝/mL-1934拷贝/mL的计算LOD范围。(在这些实验中，全血和血浆二者中掺入相同浓度的HIV；血细胞比容的影响不包括)。因为WHO提出了确定成功的ART疗法的阈值是VL ≤1000拷贝/mL (WHO实施HIV病毒载量测试的技术和操作考虑，2014年7月)，HIV DBS VL测定需要具有≤ 1000拷贝/mL的检测限(LOD)。为获得这种灵敏性，使用一个70µL DBS，DBS洗脱效率需要提高10%或以上，以降低LOD至少于1000 cp/mL。
本发明的DS/DBS HIV-1 VL测定被设计在可对本发明的核酸提取和扩增参数进行编程的自动化装置上运行。Abbott实时m2000sp和m2000rt仪器(装置；Abbott Molecular,Abbott Park, IL)是用于本发明的DBS HIV-1 VL测定的合适的自动化和可编程装置的实例。用于Abbott实时m2000sp和m2000rt仪器(和从其它来源可获得的合适的仪器)的操作指令/参数是本领域普通技术人员已知的并通过引用结合到本文中。本发明不限于该装置的使用，而在本发明的时候的其它类似装置是本领域普通技术人员已知的。本发明的HIV-1测定优选地使用带有同质实时荧光检测的聚合酶链反应(PCR)技术。部分双链荧光探针设计允许不同的HIV-1变种包括M、O和N群的检测。测定可针对来自AIDS临床试验组的病毒学质量保证(VQA)实验室的病毒标准或其它标准(Yen-Lieberman B, Brambilla D, Jackson B等，评价AIDS临床试验组病毒学实验室的血浆中人类免疫缺陷病毒1型RNA的定量的质量保证程序(Evaluation of a quality assurance program for quantitation of humanimmunodeficiency virus type 1 RNA in plasma by the AIDS clinical trials groupvirology laboratories), J Clin Microbiol,1996, 34:2695-701)，和针对世界卫生组织WHO)对于HIV-1 RNA的国际标准(NIBSC; Holmes H, Davis C, Heath A等，一项建立用于基于核酸的技术的HIV-1 RNA的第一个国际标准的国际合作研究(An internationalcollaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNAfor use in nucleic acid-based techniques), J Virol Methods,2001, 92:141-50；Davis C, Heath A, Best S等，针对HIV-1 RNA的第一个国际标准的核酸扩增技术的HIV-1工作试剂的标定(Calibration of HIV-1 working reagents for nucleic acidamplification techniques against the 1st international standard for HIV-1RNA), J Virol Meth,2003, 107:37-44)进行标准化。测定结果可以拷贝/mL、Log拷贝/mL、国际单位/mL (IU/mL)或Log IU/mL报告。
如WHO的早期婴儿HIV诊断–全球HIV Web研究(depts.washington.edu/ghivaids/reslimited/case7/discussion.html)所指出的，干血斑测试是一种可接受的采集样品以供分析的方法并引起比液体样品更小的生物危害风险。此外，同行评述的文章已表明，对于灵敏性和可靠性，当与血浆样品比较时，DBS样品的使用是可行的(J. Clin Microbiol,2011, 50(3): 569-572)。
自动化样品制备和分析系统例如Abbott 样品制备系统(m2000sp)和Abbott实时PCR分析仪(m2000rt)的效率、功效和准确性已在同行评述的期刊文章中得到证实(Marconi等, 用干血斑标本评价Abbott实时HIV-1定量测定(Evaluation of the Abbott Real-Time HIV-1 quantitative assay with dried blood spot specimens), Clin.Microbiol. Infect, 2009, 15:93-97)。更进一步地，用于DBS收集的各种纸的比较已经公开(Rottinghaus等, J. Clin. Microbiol., 2012, 51(1): 55-60)。
虽然大量的工作已经研究了在自动化制备和测定系统中DBS的使用，仍然需要在工作流程和试剂化学中的改进以提供增加的可用性和增加的灵敏度。本发明使用自动化系统，提供超过现有技术DBS HIV-1 VL测定程序的改进的效率、工作流程和性能。
DBS样品采集的优点
DBS收集超过液体血液样品的优点很多。DBS容易采集；仅仅需要手指刺(fingerprick)或医治刺(heal prick)，绕开了对静脉穿刺的需要。放血的技能是不必要的。采集设备是最小的。样品卡片通常有斑点大小(直径)的指示，以确保足够的样品大小。约70 µl的样品体积通常是足够的。样品在环境条件下风干。DBS不需要冷冻贮存。DBS可以在密闭容器(例如Tupper Wear®或密封封套)中贮存或传送。样品容易传送且在环境条件下在长的时间段(数周至数月)内是稳定的。因此，样品可在外部场所收集并传送到一个中心测试设施中。由于DS/DBS样品提供的较低的生物危害，适当包装的样品可以邮寄到测试设施(干血斑标本的运输指南(Shipping Guidelines for Dried-Blood Spot Specimens)，CDC,www.cdc.gov/labstandards/pdf/nsqap/Bloodspot_Transportation_Guidelines.pdf，和其中包含的参考文献；临床实验室和标准研究所. 在滤纸上的血液收集用于新生儿筛查计划(Clinical Laboratory and Standards Institute. Blood collection on filterpaper for newborn screening programs)；批准的标准–第5版. CLSI文件LA4-A6.Wayne, PA：临床和实验室标准研究所; 2012)。一旦在测试设施中，样品可使用自动化系统或者手动程序(如果需要的话)提取。
定义
以下定义与本公开内容相关：
术语“约"或“大约”，除非另外指明，指偏离所述值的+/-10%变化。要理解，这样的变化总是包括在本文提供的任何给定值内，无论是否特别地提及它。此外，所有叙述的范围包括在该范围内发现的所有值，无论是否实际上叙述了具体的值。因此，1-10的范围包括，例如，2、3.6、9.015等值。
术语“聚合酶链反应(PCR)"指制备DNA序列的拷贝的方法。该方法采用热循环(即，加热和冷却循环，分别用于DNA的变性(或熔化)和复制)。引物(其为含有与要拷贝的DNA序列互补的序列的短DNA片段)和热稳定的DNA聚合酶例如来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(其被称为Taq聚合酶)被用来选择DNA序列并拷贝它(见例如，美国专利号4,683,195；4,800,195，和4,965,188，其全部通过引用将其关于相同内容的讲述结合到本文中)。以重复循环，将所制得拷贝用作生成更多拷贝的模板(即，链反应)。PCR技术包括，但不限于，标准PCR、等位基因-特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、数字PCR、热启动PCR、序列间(intersequence)-特异性PCR、反向PCR、连接-介导的PCR、甲基化-特异性PCR、小-引物PCR、巢式PCR、重叠-延伸PCR、实时PCR、逆转录-PCR、固相PCR、热不对称交错PCR，和降落(Touchdown) PCR。
术语逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)指通过从RNA创建互补的DNA (cDNA)转录物，定性检测基因表达的方法。
术语“实时聚合酶链反应”、“实时PCR”和定性PCR” (qPCR)指使用荧光探针定量测量DNA的扩增的方法。
如本文所用的术语“引物"指启动模板-依赖性核酸合成的寡核苷酸。在核酸模板、三磷酸核苷前体、聚合酶和辅因子的存在下，在合适的温度和pH的条件下，引物可通过聚合酶在其3'末端加入核苷酸而延长，得到引物延长产物。引物的长度可以变化，这取决于所用的具体条件和扩增的目的。例如，用于诊断目的的扩增的引物的长度通常从约15至约35个核苷酸。引物必须对所需模板具有足够的互补性，以引发所需延长产物的合成。换言之，引物必须能够以足以在用于通过聚合酶在合成起始的适当的并列位置提供引物的3'羟基部分的方式与所需模板链退火。引物不必是所需模板的精确互补体。例如，非互补核苷酸序列可以存在于在他处互补的引物的5'末端。或者，非互补碱基可以穿插在寡核苷酸引物内，条件是引物序列与所需模板链的序列具有充分的互补性，以提供用于延长产物合成的模板-引物复合物。
PCR
目标序列用本领域已知的技术扩增。选择的技术是聚合酶链反应(PCR)。PCR扩增可用标准PCR技术，遵循制造商的指示进行。Abbott m2000系统包括基于从用户输入使样品制备和PCR反应自动化的装置。
扩增反应可以并且优选地应包括内部对照(IC)核酸和一对用于扩增IC核酸的引物。当扩增反应包含IC核酸时，促进扩增的条件也促进IC核酸的扩增。任何合适的序列可用作IC。IC目标序列的实例包括用于下面实验部分的那些。
虽然组织或体液的任何合适的样品可用作本发明的核酸，即DNA或RNA样品的来源，样品从DBS洗脱。如果必要或需要的话，可将蛋白酶，例如蛋白酶K，加入到样品中以消化不需要的蛋白。
可使用如本领域已知的任何合适的方法，制备用于测定的样品。理想地，所述方法提取和浓缩核酸。所述方法也合乎需要地使目标序列容易扩增，并从提取物中除去扩增的潜在抑制剂。在本发明中，核酸用本发明的洗脱缓冲液从DBS中洗脱。
一旦样品被洗脱，RNA可经分离，逆转录和可扩增生成的cDNA (如，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，例如如在美国专利号5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864;和5,693,517中所述)。此外，DNA可不使用逆转录酶而直接扩增。前病毒DNA可以这种方式扩增。
如果目标序列存在于样品中，目标核酸可以与导致目标序列的特异性扩增的引物接触。"特异性扩增"意指引物扩增特异性目标序列而不是其它序列。见例如，PCR技术：DNA扩增的原理和应用(PCR Technology: Principles and Applications for DNAAmplification) (Erlich编辑, Freeman Press, NY (1992))；PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) (Innis等编辑, AcademicPress, San Diego, CA (1990))；分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology) (Ausubel, 1994-1999, 包括直至2004年4月的最新增刊)；和分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (Sambrook & Russell, 第3版, 2001)以及在国际专利申请公布号WO 93/22456和美国专利号4,851,331；5,137,806；5,595,890；和5,639,611中描述的方法，其全部通过引用将其关于相同内容的讲述特别地结合到本文中。
引物可用可以被例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测到的标记物可检测地标记(见例如，Sambrook等)。有用的标记物包括染料，例如荧光染料、放射性标记物例如32P、电子致密试剂(electron-dense reagent)、酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶、生物素，或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。在本发明中，荧光染料是优选的。在这方面，可检测的寡核苷酸可以被标记，如用荧光素。如果引物用染料标记，而可检测的寡核苷酸用荧光素标记，并且被设计结合到与染料相对的新生链，DNA螺旋间的荧光共振能量转移(FRET)可以发生。其它可检测的寡核苷酸包括分子探针、TAQMAN®探针、单链DNA探针、双链DNA探针等。
核酸扩增试剂(PCR试剂)包括具有聚合酶活性的酶(如，AmpliTaq Gold®)、一种或多种酶辅助因子(如，MgCl2)，和三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs；如，dATP、dGTP、dCTP，和dUTP或dTTP)。
促进扩增的条件是促进引物的退火和核酸序列的延伸的那些。退火依赖于各种参数，例如温度、离子强度、要扩增的序列的长度、互补性，和要扩增的序列的G:C含量。例如，降低温度促进互补的核酸序列的退火。高G:C含量和较长的长度稳定双链形成。一般来说，约30 bp或更少且具有高G:C含量的引物和可检测的寡核苷酸功能良好。优选的扩增条件、引物和可检测的寡核苷酸在此是示例性的。
扩增可通过使反应混合物热循环约10和约100次之间，例如约20和约75次之间，例如约25和约50次之间，重复任何合适的次数。
一旦扩增反应完成，扩增产物的存在可使用任何合适的方法检测。这样的方法包括，但不限于，本领域已知的那些，例如用或不用荧光染料的凝胶电泳(取决于产物是否用染料-标记的引物扩增)，使用嵌入染料的解链曲线图(见例如，用于DNA扩增的PCR技术、原理和应用(PCR Technology, Principles, and Applications for DNA Amplification),Erlich编辑, W. H. Freeman and Co., New York, 1992, 第7章)，和与内部可检测的寡核苷酸杂交。方法的其它实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、电化学发光、反向斑点杂交(reverse dot blots)、高压液相色谱(HPLC) (见例如，Lazar, Genome Res. 4: S1-S14(1994))，和单链PCR产物的单链构象多态性分析也可采用(见例如，Orita等, PNAS USA86: 2766-2770 (1989))。在本发明中，荧光标记物用自动化PCR反应装置自动地检测。
扩增的核酸可通过监测反应混合物中双链DNA (dsDNA)的总量的增加来检测(见例如，美国专利号5,994,056和欧洲专利公布号487,218和512,334)。使用DNA-结合染料，例如SYBR Green。染料当结合于dsDNA时会发荧光，而荧光的增加被用来确定dsDNA的增加。
作为选择并且优选地，扩增和检测可在实时PCR测定中结合。当使用实时PCR时，混合物还可包含核酸检测试剂。实例包括嵌入任何双链DNA或序列-特异性DNA可检测的寡核苷酸的非-特异性荧光染料，其允许仅仅在可检测的寡核苷酸与其互补DNA目标杂交后检测，从而能够同时扩增和检测。当在扩增期间，可检测的寡核苷酸存在于混合物时，可检测的寡核苷酸在促进扩增的条件下应该是稳定的，应该不干扰扩增，在扩增条件下应结合于其目标序列，并且仅在结合其目标序列时发出信号。特别适合于这方面的可检测的寡核苷酸的实例包括分子信标可检测的寡核苷酸、TAQMAN®可检测的寡核苷酸，和线性可检测的寡核苷酸，例如由Abravaya等(美国专利申请公布号2005/0227257)描述的那些。可检测的寡核苷酸可与分子信标结合形成环和茎排列。可检测的寡核苷酸也可用作线性可检测的寡核苷酸，其在一端具有荧光团(如，FAM)和在另一端具有高效猝灭剂，例如黑洞猝灭剂(Black Hole Quencher) (BHQ®；BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA)。
已采用的术语和措辞被用作描述而不是限制的术语。在这一方面，当某些术语在此被定义、描述或讨论时，所有这样的定义、描述或讨论意欲归属于这样的术语。也不意欲使用排除所显示和描述的特征的任何等效物或其部分的此类术语和措辞。
要认识到在要求的本发明范围内的各种修饰是可能的。因此，应该理解，虽然本发明已在优选的实施方案和任选的特征的情况下具体地公开，本领域技术人员可采取在此公开的概念的修饰和变化。这样的修饰和变化被认为是在由所附权利要求书限定的本发明范围内。
本说明书中提及的所有专利、专利申请公布、杂志文章、教科书，和其它出版物是本公开所述领域技术人员技术水平的指示。所有这样的出版物均通过引用结合到本文中，如同各个独立的出版物特别地和单独地指明通过引用结合到本文中的程度一样。
在此示例性描述的本发明在本文并没有具体地公开的任何要素或限制不存在的情况下，可以适当地实行。因此，例如，任何术语"包含"、"基本由…组成"和"由…组成"在本文的每种情况下，可用另外两个术语的任何一个替代。同样，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文中另外清楚地指明。因此，例如，提及"方法"时包括一种或多种方法和/或步骤类型，其在本文中被描述和/或其在本领域普通技术人员阅读本公开内容后将变得显而易见。
范例
实施例1
本发明优选地在自动化的、可编程PCR装置上进行，几种装置是本领域普通技术人员已知的并适用于本发明的任何程序性改变，所述程序性改变对于使用特定系统可能是必要的，同时不背离本发明的发明概念。在其它情况下，本发明可手动进行。然而，本发明的手动执行导致增加的时间投入并可能由于操作误差降低准确度。
本范例利用包括m2000sp (样品制备)和m2000rt (实时核酸扩增)仪器和Abbott实时HIV-1试剂的Abbott m2000系统。
用于与Abbott m2000仪器(或类似的)和Abbott实时HIV-1试剂(或类似的)联合的干血斑标本的HIV-1病毒载量测试
以下描述的程序应用于干血斑(DBS)标本的HIV-1病毒载量测试。以下描述的该程序被用于与Abbott m2000sp和m2000rt仪器和Abbott实时HIV-1试剂联合。其它系统和装置是本领域可获得的，并且本领域普通技术人员可基于本说明书的教导修改以下公开的程序用于其它可获得的系统和装置，而不偏离本说明书的发明概念。
设备程序
用于HIV-1 DBS病毒载量测试的应用程序文件(即，软件)在进行测定之前，必须安装在Abbott m2000sp和Abbott m2000rt系统上。
标本收集和操作说明
DBS可在Munktell TFN (Sweden)纸卡片(或等效纸卡片，如本领域普通技术人员已知的)上，通过以下的这些步骤制备：
● 将全血点样在Munktell TFN纸卡片(或等效物)的半英寸(12-毫米)圆圈上，确保整个圆圈被覆盖。建议每个圆圈使用至少70 μI血液(~3-5滴；不要压迫或挤压手指)，以确保完全覆盖。如果全血已被收集在血液收集管中，新鲜抽出的血可在点样前于从2-8℃(冰箱温度)至15-30℃(环境温度)保持至多24小时。此外，在点样前，应使用吸液管混合血液。
● 于室温下风干卡片。
● 为运输或储存，将每个卡片包装在具有干燥剂包的袋或其它可密封容器中。卡片可在环境条件下贮存至多12周。或者，卡片可于2-8℃或-10℃或更冷的温度下贮存至多24周。
● 如果必要或需要，根据以上列出的建议的贮存温度和时间装运标本。对于国内和国际货运，标本的包装和标记应符合覆盖临床、诊断或生物标本的运输的适用的州、联邦和国际法规。
测定方案
1. 这个示例性方案采用Abbott实时系统。本领域普通技术人员将能够使该方案适应其它类似的装置和系统，而无需过度的实验。每次运行可以处理总共96份样品。在每次运行中包括阴性对照、低阳性对照，和高阳性对照，因此当校准品不包括在内时，允许每次运行处理最多93份DBS标本。这些步骤不适用于Abbott的对照和校准品，其应直接作为液体样品被处理。通过以下这些步骤处理DBS标本：
● 准备装有1.3 ml DS/DBS洗脱缓冲液(洗脱缓冲液包含约3.5 M GITC (硫氰酸胍)、约5% Tween® 20、约50 mM KOAc (乙酸钾)，约pH 6.0)的Abbott输送管(AbbottTransport Tubes)。Tween®是ICI Americas, Inc., Bridgewater, New Jersey的注册商标。Tween® 20是聚山梨醇酯20的商品名。其它商标的聚山梨醇酯20也将有用于本发明的方法中。[GITC的用量可以是1.0-5.5 M、2.0-4.5 M、3.0-4.0 M和约3.5 M；Tween20的用量可以是0-20 %、2 %-8 %、4 %-6 %和约5 %；乙酸钾的用量可以是10-500 mM、20 mM-300 mM、30 mM-200 mM、40 mM-100 mM和约50 mM；和pH可以是从5-10、5.2-8、5.6-7、5.8-6.5和约6.5]。
● 对每份标本从Munktell TFN纸卡片(或等效物)分离一个(1)完整的DBS。每个DBS的直径应该是约半英寸(12毫米)。注意：如果适用，避免切割表面与DBS标本的直接接触。如果必要，根据良好实验室实践，在标本之间清洁用来切割DBS的仪器。将DBS置于含有DS/DBS洗脱缓冲液的Abbott输送管中。确保DBS完全浸没在DS/DBS洗脱缓冲液中。注意：在该DBS转移步骤期间，穿孔的Munktell TFN纸卡片可置于Abbott输送管上，其中使用清洁的吸液管尖将DBS推出卡片并进一步直接推入管中。
● 在样品被置于Abbott m2000sp仪器或其它机器人系统之前，于室温下温育约20分钟或于55℃温育30分钟，伴有间歇的温和混合(步骤7)。
2. 于15-30℃或于2-8℃(和之间)解冻适当的测定对照品和内部对照品(IC)。如果仅进行校准运行，于15-30℃或于2-8℃(和之间)解冻校准品。
● 一旦解冻，测定对照品、IC和校准品可在使用前于2-8℃贮存至多24小时。
● 使用前，涡流(即，例如用涡流混合器或等效物极其剧烈地混合)各个测定校准品和各个对照品3次，每次2-3秒。在涡流后通过在工作台上轻叩小瓶以使液体到达瓶子的底部，确保每个小瓶的内容物在瓶底。确保不产生气泡或泡沫；和如果存在，用无菌吸液管尖除去气泡，对每管使用一个新的管尖。
● 按照生产商的指示制备内部对照品(IC)，如本领域已知的。
3. 于15-30℃或于2-8℃ (和之间)解冻扩增试剂并于2-8℃贮存，直到需要扩增主混合程序。
● 一旦解冻，扩增试剂如果不立即使用，可于2-8℃贮存至多24小时。
● 按照生产商的指示准备扩增试剂(PCR试剂)，如本领域已知的。
● 将在Abbott输送管中的低和高阳性对照品、阴性对照品、校准品，如果适用的话，以及DBS标本置于Abbott m2000sp样品架上。注意：确保Abbott m2000sp样本架已被特别校准用于这种HIV-1 DBS病毒载量程序。
● 仔细装载样品架以避免飞溅。如果使用，试管标签上的条形码必须面对扫描的正面。确保各管被牢固地放置在样品架中，以致试管的底部到达样品架的内底。
● 将满载的样本架以连续的样品架位置装载到Abbott m2000sp上，第一样品架离开工作台右边最远，而任何额外的样品架逐次排到到第一个样品架的左边。
5. 将5 ml反应容器置于Abbott m2000sp 1 ml子系统载体中。
6. 将Abbott mSample制备系统试剂和Abbott 96深孔板装载到Abbott m2000sp工作台上。
7. 从Protocol屏幕，选择HIV-1 DBS病毒载量应用文件。启动样品提取方案。
● 在样品提取：工作台设置、校准品和对照品区域中输入校准品(如果校准曲线尚未在Abbott m2000rt中存储则需要)和对照批的具体值。批的具体值在各Abbott实时HIV-1校准品和对照品试剂盒卡片中指定。
● Abbott m2000sp主混合加入(Abbott m2000sp Master Mix Addition)方案(步骤9)必须在完成样品制备后1小时内启动。
注意：在处理扩增试剂前更换手套。
8. 在样品制备完成后，在Abbott m2000sp工作台上装载扩增试剂和主混合小瓶。
9. 选择匹配相应的样品制备提取的适当的深孔板。启动Abbott m2000sp主混合加入(Abbott m2000sp Master Mix Addition)方案。
● 在样品提取完成后，当在运行中有大于48份处理的样品时，Abbott m2000sp自动地填满Abbott 96-孔光学反应板(Abbott 96-Well Optical Reaction Plate)中的任何空孔。对于含有48份样品或更少样品的运行，不进行板填充。
10. 在扩增区打开和启动Abbott m2000rt仪器。
11. 在Abbott m2000sp仪器已完成添加样品和主混合后，根据Abbott m2000sp操作手册, 操作指令(Abbott m2000sp Operations Manual, Operating Instructions)部分，密封Abbott 96-孔光学反应板(Abbott 96-Well Optical Reaction Plate)。
12. 将密封的光学反应板放入Abbott无飞溅支持基座(Abbott Splash-FreeSupport Base)中以转移至Abbott m2000rt仪器中。
13. 将Abbott 96-孔光学反应板(Abbott 96-Well Optical Reaction Plate)置于Abbott m2000rt仪器中。从Protocol屏幕，选择HIV-1 DBS病毒载量应用文件。如在Abbott m2000sp操作手册, 操作指令部分中所述启动方案。
14. 在加入PCR试剂至洗脱的样品后，如果操作员确信有必要，可将DNase加入到洗脱的样品、PCR试剂和完全的PCR反应物的一种或多种中。DNase反应试剂/缓冲液和去活化试剂/缓冲液不是必需的。
结果
从存储的校准曲线计算标本或对照品中的病毒HIV-1 RNA浓度。Abbott m2000rt仪器在Abbott m2000rt工作台上自动地报告结果。测定结果可以拷贝/ml、log [拷贝/ml]、国际单位(IU)/mL，或log [IU/mL]报告。对于结果的解释见下表1。
表1
结果的解释
结果 解释
未检测到 目标未检测到
<7.00 Log (拷贝/mL) 检测到*
>7.00 Log (拷贝/mL) > ULQa
a ULQ = 定量上限
*对于研究AppSpec File (v4或更高)，所有检测的标本将用VL结果报告。实际LOD将在验证研究后提供。一旦获得验证LOD值，“检测到的”结果将分成两类：1). “检测到”，2).“检测到，< LOD值”。
实施例2
范例显示能够使本发明的自动化DBS测定程序以超过现有技术方法的提高的效率和灵敏性工作的设计特征。
所述程序包括以下步骤：
1. 从DBS卡片分离DBS。
2. 在处理缓冲液中温育DBS。
3. 将含有在缓冲液中的DBS的反应容器装载在自动化机器人系统(如，Abbottm2000sp)上。
4. 机器人系统由一个脚本驱动以通过核酸提取方法处理DBS样品，该方法是直接处理其中DBS已被温育而没有手动干预的试管。
5. 核酸提取后，机器人系统形成PCR主混合物(即，无目标核酸的完全的PCR反应物)。或者，如果PCR主混合物已事先形成并被加载在系统上，可绕过这个步骤。
6. 通过使在步骤4结束时获得的提取的核酸与在步骤5结束时获得的PCR主混合物合并，机器人系统形成完全的PCR反应物。
7. 在分析仪器(如，实时PCR仪器例如Abbott m2000rt)上执行PCR循环和数据整理/结果报告。
8. 如果需要特殊的应用，在在步骤4获得的提取的核酸中加入DNase并温育以消除/减少DNA内容物。在这样一种情况下，DNase处理的核酸将从步骤6开始得到进一步的处理。备选地，在PCR主混合物形成之前或期间，DNase可加入到PCR试剂中。进一步备选地，DNase可在PCR试剂中配制。在这样一种情况下，含有DNase的PCR主混合物将从步骤6开始得到进一步处理。在步骤6期间，DNase被机器人系统分配到各样品，绕开了DNase的手动分配。此外，在步骤6之后，步骤7之前可需要DNase处理温育。
注意：其中可需要DNase的使用的特殊应用是HIV RNA特异性PCR，其中来自前病毒DNA的干扰可被消除/减少。
能够进行以上测定程序和测定执行的技术包括：
1. 从DS/DBS高效洗脱核酸的处理缓冲液。本公开内容包括使用Abbott的mWash 1缓冲液(3.5M GITC；5% Tween 20；50mM KOAc, pH 6.0)作为DBS处理/洗脱缓冲液。注意：Abbott先前已提供市售的HIV DBS VL方案和市售的CE-IVD HIV定性DBS测定，其使用AbbottmLysis缓冲液作为处理缓冲液(4.66M GITC；10% Tween 20；100mM Trizma, pH 7.8)。这两个程序的比较在下文提供并显示出本发明程序的意外优越性。
2. 脚本参数，其能够使机器人吸液管系统将液体从含有固体DBS材料的试管直接转移，用于以可靠和准确的方式进一步处理，同时在液体转移后，在试管中留下≤300 ul的死体积。
3. 使用DNase，其在提取的核酸中有效地降解DNA，而不包括特异性DNase反应缓冲液。
4. 使用具有如在项目3中所述特性的DNase，其于室温下有效地降解DNA。
5. 使用具有如在项目3和4中所述特性的DNase，其在30分钟的时间段内有效地降解DNA。
6. 使用具有如在项目3-5中所述特性的DNase，其不需要用引入试剂或者升高温度灭活。
7. 使用DNase，其在当DNase暴露于提取的核酸之前已被引入PCR试剂，或在形成PCR反应期间引入时，有效地降解PCR反应中的DNA。
8. 使用具有如在项目7中所述特性的DNase，而不包括特定的DNase反应缓冲液。
9. 使用具有如在项目7和8中所述特性的DNase，其于室温和在各种PCR循环阶段期间的温度下有效地降解DNA。
10. 使用具有如在项目7-9中所述特性的DNase，其在10分钟的时间段内有效地降解DNA。优选地，在其中各种PCR循环阶段期间的温度可支持DNase功能的情况下，DNase处理不需要超出PCR循环所包括的时间或循环阶段的额外的时间或循环阶段。
11. 使用具有如在项目7-10中所述特性的DNase，其在PCR之前和PCR期间不需要用引入试剂或者升高温度灭活。
12. 使用在项目3-11中的DNase和相关的DNase处理条件，其对RNA序列的检测没有负面的影响。
13. “PCR体积”设置(作为热循环参数)至低于实际PCR体积的使用。这种设置消除了在全PCR板中观察到的“边缘”效应，其当与部分PCR板运行比较时负面影响灵敏性。如采用一些现有技术实时PCR循环仪所见的“边缘”效应由温度控制单元的温度过高引起。较低的PCR体积设置导致更慢和更精确的热控制，从而减轻了大部分的温度过热。
14. PCR反应截止由本领域技术人员根据什么是适合于特定的DS/DBS目标样品来确定。
本发明的技术范例的细节
1. 机器人从含有DBS的试管转移液体由以下步骤组成：
● 使用“检测管底(Detect Tube Bottom)”算法，用一次性管尖将DBS推入样品输入管的底部。
● 将一次性管尖从样品输入管的底部缓慢缩回很小的距离(如，3 mm)，并进行小体积的抽吸(如，50 µl)以证实DBS不干扰一次性管尖。在小体积抽吸完成后，一次性管尖被缩回到液体表面上方一点点。
● 使用同样的一次性管尖，检测液体的表面并从该位置进行部分体积跟踪抽吸(如，450 µl以达到1 mL)。在第一次部分体积抽吸完成后，将一次性管尖中包含的液体转移至反应试管，用于进一步的核酸提取步骤。
● 重复这些步骤以获得总样品转移体积。
2. 在特异性DNase反应缓冲液的不存在下，当用于与本发明的方法和组合物联合时，当加入到提取的核酸(对RNA检测没有负面影响)中时，有效地降解DNA且不需要用引入试剂或者升高温度灭活的示例性DNases是：
● Promega (Madison, WI) RQ1无RNase的DNase (Cat # M6101)；2U /反应；室温；30分钟。
● Ambion (Grand Island, NY) DNase I (无RNase) (Cat # AM2222)；2U/反应；室温；30分钟。
● Roche (Basel, Switzerland) DNase I重组体，(无RNase) (Cat #04716728001)；20U/反应；室温；30分钟。
● 其它合适的DNases可以是本领域普通技术人员已知的并可由本领域普通技术人员使用在此描述的方法，而不用过度的实验鉴定。本发明不限于任何特定的DNase，只要它满足本说明书所列的标准即可。下图中描述的测定仅仅是示例性的并不用于将本发明限制至任何特定的DNase或任何特定的筛选方法。
对有效地除去DNA并且对RNA信号没有负面的影响的DNase参考图1。图1显示在与PCR试剂合并前从用DNase处理的HIV阳性干血斑提取的核酸洗脱液(虚线)与对照品(无DNase处理，实线)的比较。然后用针对β球蛋白DNA信号的β球蛋白实时PCR和针对HIV和ICRNA信号的HIV-1实时RT-PCR测定核酸。a) β球蛋白DNA信号，以显示DNase处理的有效性，b)HIV RNA信号，以显示DNase处理的影响，c) IC RNA信号，以显示DNase处理的影响。用于DNase处理的条件：Ambion DNase 1 (无RNase) (Cat # AM2222)；2U/反应；室温；30分钟。
对不能有效地除去DNA并且对RNA信号没有负面的影响的DNase参考图2。图2显示在与PCR试剂合并前从用DNase处理的HIV阳性干血斑提取的核酸洗脱液(虚线)与对照品(无DNase处理，实线)的比较。然后用针对β球蛋白DNA信号的β球蛋白实时PCR和针对HIV和IC RNA信号的HIV-1实时RT-PCR测定核酸。a) β球蛋白DNA信号，以显示DNase处理的有效性，b) HIV RNA信号，以显示DNase处理的影响，c) IC RNA信号，以显示DNase处理的影响。用于DNase处理的条件：New England Biolabs DNase I (无RNase) (Cat # MO303S)；2U/反应；室温；30分钟。
对有效地除去DNA并且负面地影响RNA信号的DNase参考图3。图3显示在与PCR试剂合并前从用DNase处理的HIV阳性干血斑提取的核酸洗脱液(虚线)与对照品(无DNase处理，实线)的比较。然后用针对β球蛋白DNA信号的β球蛋白实时PCR和针对HIV和IC RNA信号的HIV-1实时RT-PCR测定核酸。a) β球蛋白DNA信号，以显示DNase处理的有效性，b) HIV RNA信号，以显示DNase处理的影响，c) IC RNA信号，以显示DNase处理的影响。用于DNase处理的条件：Sigma-Aldrich DNase 1 (扩增级) (Cat # AMPD1)；2U/反应；室温；30分钟。
3. 当DNase在暴露于提取的核酸之前已被引入PCR试剂，或在形成PCR反应期间引入时，有效地降解PCR反应中的DNA (对RNA检测没有负面影响)的示例性DNases是：
● Promega RQ1无RNase的DNase (Cat # M6101)；2U/反应；室温；10分钟
● Ambion DNase I (无RNase) (Cat # AM2222)；2U/反应；室温；30分钟
● 其它可以是本领域普通技术人员已知的并可使用在此描述的方法，而不用过度的实验鉴定。本发明不限于任何特定的DNase，只要它满足本说明书中所列的标准即可。下图中描述的测定仅仅是示例性的并不用于将本发明限制至任何特定的DNase。
对有效地除去DNA并且对RNA信号没有负面的影响的DNase参考图4。在图4中，DNase被加入到PCR试剂，其随后合并到PCR主混合物中(虚线)。作为对照品，没有DNase加入到PCR试剂(实线)中。提取的核酸然后通过PCR主混合物测定，其中β球蛋白DNA信号，和HIV和IC RNA信号被检测。a) β球蛋白DNA信号，以显示DNase处理的有效性，b) HIV RNA信号，以显示DNase处理的影响，c) IC RNA信号，以显示DNase处理的影响。用于DNase处理的条件：Promega RQ1无RNase的DNase (Cat # M6101)；2U /反应；室温；10分钟。
Abbott先前已提供现有技术方案。该方案被优化到初始HIV-1 DBS VL开放模式(见下表)。初始的开放模式方案被进一步优化到目前的开放模式并用于CE产物的开发。下表2显示现有技术方案、初始开放模式方案和进一步改进的方案之间的差别。字母"CE"是法语短语"欧共体(Conformité Européene)"的缩写，其在字面上的意义是"欧洲共同体(European Conformity)"。
表2 现有技术方案、初始开放模式方案和进一步改进的方案之间的差别。
如在表2中详述的测定的变化导致超过现有技术方法的巨大的、意想不到的和令人惊讶的改进。表3显示通过本发明的方法达到的增加的灵敏性。与100 %检测相关的目标水平从现有技术测定的10,000拷贝/ml下降至当使用本发明的方法时的2,000拷贝/ml。
表3 对于本发明的开放模式方案(DBS洗脱条件RT 20分钟)与现有技术方案在检测灵敏性的方面的比较见下表
实施例3
进行灵敏性和测定鲁棒性改进的研究
关于初始开放模式测定，约2-3%的内部研究样品和> 5%的外部研究样品具有m2000rt4450或4442的误差，因而是无效的。已确定剩余胍导致抑制频率和4450和4442误差增加。HIV-1 DBS应用规范文件被修改以减少胍遗留的数量和频率。减少废物去除过程中的回缩速度降低了从吸液管尖悬挂的任何液滴的扩散。由于DBS样品以1ml作为样品输入存在于Wash 1缓冲液(DBS洗脱缓冲液)中，反应中的溶胞缓冲液的体积可从2400减少至1600 µl，减少每次反应存在的GITC的量。通过增加Wash 2体积从700至750µl来增加洗涤效力。实施这些变化减少4450和4442误差的频率至约0.2%(数据未示出)。这种优化显著提高测定的鲁棒性。
通过增加样品输入，使用两个70 µL DBS (干血斑)/每患者，可改进测试的测定灵敏性。评价数据(数据未示出)提示，于室温下洗脱，两个DBS与一个DBS比较，改进了HIV低端检测率。于55℃ 30分钟洗脱条件下，两个DBS与一个DBS比较的低HIV浓度检测率的提高不是那么明显。
测定灵敏性也可通过增加洗脱效率来提高。进行室温下20分钟洗脱和55℃ 30分钟洗脱的直接比较。结果(图5)提示Ct (循环阈值)和MR (最大比例)二者通过增加温度至55℃ 30分钟而显著地改善。55℃温度和定时被设置在防护带(分别在图6和7)。结果(图6)显示高于60℃的温度导致较低MR值。总的来说，最高MR是在55℃。图7显示于55℃ 30分钟对于更有效的DBS洗脱是需要的。于55℃温育30分钟后，进一步于室温下温育至多24小时不影响PCR结果。此外，从DBS回收的RNA材料与直接加入样品缓冲液的全血的比较在室温20分钟和55℃ 30分钟之间进行。结果显示55℃洗脱条件比室温洗脱条件增加回收率约10% (表4)。连续搅动缓冲液中的DBS样品与55℃洗脱条件相结合。结果显示了从DBS的低HIV回收率有稍微的提高；所述提高没有统计学意义(数据未示出)。
表4. 与全血比较的%回收率的计算
当DBS于55℃洗脱30分钟对比室温下20分钟时，与全血比较的%回收率的提高被观察到为约10%。
一项初步分析的灵敏性评价被进行，以使用病毒学质量保证(VQA) HIV-1稀释平板(平板批号#2)于55℃ 30分钟评估灵敏性。还使用得自SeraCare的灭活HIV-1进行了试验，所述灭活HIV-1使用3批校准品进行定量。用来定量的校准品使用VQA HIV-1稀释平板(平板批号#1)进行定量。结果示于表5中。LOD估计为约800拷贝/mL。
表5. 灵敏性估计
*使用3批校准品进行定量的得自SeraCare的灭活HIV-1，所述校准品从VQA1进行定量。
目前有多个商业可获得的DBS纸卡片。重要的是显示性能是否是可比较的。对3个不同的销售商的DBS纸卡片进行了研究以并行比较。如果可获得，则使用多批次的纸卡片。结果概述于表6中。基于低HIV浓度Ct、MR和检测率的性能是类似的。差别无统计学意义。
表6. 购自不同销售商的DBS纸的比较
。

Claims (11)

1.一种检测血液样品中的HIV-1核酸的自动化方法，该方法包括：
a) 提供：i) 在固体载体上干燥的疑似感染HIV的血液样品，ii)洗脱缓冲液，iii) 自动化的、可编程样品制备仪器，iv) 自动化的、可编程PCR仪器，v) DNase和vi) 适合于检测HIV-1核酸的PCR试剂；
b) 用洗脱缓冲液从固体载体洗脱血液样品以创建洗脱的样品；
c) 将洗脱的样品装入自动化的、可编程样品制备仪器中，供进一步的核酸提取和纯化，以创建处理过的样品；
d) 将PCR试剂装入自动化的、可编程PCR仪器中；
e) 启动自动化程序以将PCR试剂以等分的量分配到处理过的样品中；
f) 用自动化的、可编程PCR仪器对处理过的样品中提取的核酸进行PCR；
g) 分析用自动化的、可编程PCR仪器生成的PCR结果，以确定是否任何样品包含HIV-1核酸；
h) 其中，所述洗脱缓冲液包含约3.5 M GITC、约5%聚山梨醇酯20、约50 mM KOAc，约pH6.0；
i) 其中，任选地，在PCR试剂加入到处理过的样品中后，将DNase加入到处理过的样品、PCR试剂或完全的PCR反应物的一种或多种中。
2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括阴性对照和阳性对照。
3.权利要求1的方法，其中步骤b)是于室温下约20分钟。
4.权利要求3的方法，其中步骤b)用温和的间歇混合法进行。
5.权利要求1的方法，其中步骤b)是于约55℃下约30分钟。
6.权利要求5的方法，其中步骤b)用温和的间歇混合法进行。
7.权利要求1的方法，其中所述自动化程序是通过软件命令编程的。
8.权利要求1的方法，其中进行步骤i)和所述DNase不需要特定的DNase反应缓冲液，于环境温度或PCR循环阶段期间使用的温度下是有效的，在30分钟的时间段内有效地降解DNA，在有效地降解DNA后不需要被灭活，并且对RNA序列的检测没有负面的影响。
9.权利要求1的方法，其中所述固体载体是滤纸。
10.权利要求1的方法，其中所述核酸是RNA。
11.权利要求1的方法，其中所述核酸是前病毒DNA。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021119124A1 (en) * 2019-12-09 2021-06-17 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
CN112210625A (zh) * 2020-11-02 2021-01-12 中山大学达安基因股份有限公司 定量检测人类免疫缺陷病毒1型dna载量的试剂盒及方法
WO2023034222A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-09 Abbott Molecular Inc. Selective purification of rna

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100291666A1 (en) * 2004-12-23 2010-11-18 Gordon Bruce Collier Molecular diagnostics system and methods
USD636414S1 (en) * 2010-06-18 2011-04-19 Janome Sewing Machine Company Limited Pressing machine
US20140038172A1 (en) * 2012-08-06 2014-02-06 Vivebio, Llc Matrix and System for Preserving Biological Specimens for Qualitative and Quantitative Analysis

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5284940A (en) * 1990-11-14 1994-02-08 Hri Research, Inc. Preparation for nucleic acid samples
US20020022261A1 (en) 1995-06-29 2002-02-21 Anderson Rolfe C. Miniaturized genetic analysis systems and methods
RU2119954C1 (ru) * 1996-12-27 1998-10-10 Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот
US6936414B2 (en) 1999-12-22 2005-08-30 Abbott Laboratories Nucleic acid isolation method and kit
ITRM20050068A1 (it) 2005-02-17 2006-08-18 Istituto Naz Per Le Malattie I Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine.
US8247167B2 (en) 2005-12-05 2012-08-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey HIV-1 latency model for high throughput screening
WO2009033185A1 (en) * 2007-09-06 2009-03-12 University Of Massachusetts Virus-specific mirna signatures for diagnosis and therapeutic treatment of viral infection
US8222048B2 (en) * 2007-11-05 2012-07-17 Abbott Laboratories Automated analyzer for clinical laboratory
CN102803956A (zh) 2009-06-12 2012-11-28 纳内克蒂斯生物技术公司 用于检测在aids患者的抗逆转录病毒疗法后剩余的病毒hiv dna的高灵敏方法
CN106461514B (zh) * 2014-04-14 2020-01-21 雅培分子公司 用于血液样品收集和运输的介质

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100291666A1 (en) * 2004-12-23 2010-11-18 Gordon Bruce Collier Molecular diagnostics system and methods
USD636414S1 (en) * 2010-06-18 2011-04-19 Janome Sewing Machine Company Limited Pressing machine
US20140038172A1 (en) * 2012-08-06 2014-02-06 Vivebio, Llc Matrix and System for Preserving Biological Specimens for Qualitative and Quantitative Analysis

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOFGREN ET AL.: "Evaluation of a dried blood spot HIV-1 RNA program for early infant diagnosis and viral load monitoring at rural and remote healthcare facilities", 《AIDS》 *
OLSVIK ET AL.: "Evaluation of potential reference genes in real-time RT-PCR studies of Atlantic salmon", 《BMC MOLECULAR BIOLOGY》 *
SCOTT ET AL.: "Evaluation of the Abbott m2000 RealTime human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) assay for HIV load monitoring in South Africa compared to the Roche Cobas AmpliPrep-Cobas Amplicor, Roche Cobas AmpliPrep-Cobas TaqMan HIV-1, and BioMerieux NucliSENS EasyQ", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 *

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