BR112017000581B1 - método automatizado para detectar ácidos nucleicos de hiv-1 em uma amostra de sangue - Google Patents

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Abstract

?PROCEDIMENTO DE TESTE DE CARGA VIRAL DE HIV-1 AUTOMATIZADO PARA PONTOS SECOS? A presente invenção fornece aperfeiçoamentos novos e não óbvios ao teste de ponto de sangue seco para carga viral de HIV-1 úteis para o diagnóstico e monitoramento da progressão do tratamento.

Description

MÉTODO AUTOMATIZADO PARA DETECTAR ÁCIDOS NUCLEICOS DE HIV-1 EM UMA AMOSTRA DE SANGUE FUNDAMENTOS
[001] O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). (Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, 220:868 a 71; Popovic M, Sarn-gadharan MG, Read E, et al. Detection, isolation and continuous production of cyto-pathic retroviruses (HTLV-I) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 1984, 224:497 a 500; Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-I) from pacientes with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984, 224:500 a 3). O vírus pode ser transmitido através de contato sexual, exposição ao sangue ou produtos sanguíneos infectados ou a partir de uma mãe infectada ao feto. (Curran JW, Jaffe HW, Hardy AM, et al. Epidemiology of HIV Infection and AIDS in the United States. Science 1988, 239:610 a 16). A síndrome do HIV aguda, caracterizada pelos sintomas do tipo gripe, se desenvolve 3 a 5 semanas depois da infecção inicial e está associada com altos níveis de viremia. (Daar ES, Moudgil T, Meyer RD, Ho DD. Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection. New Engl J Med 1991 , 324:961 a 4; Clark SJ, Saag MS, Decker WD. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New Engl J Med 1991, 324:954 a 60). Dentro de 4 a 6 semanas do início dos sintomas, a resposta imune específica do HIV é detectável. (Albert J, Abrahamsson B, Nagy K, et al. Rapid development of isolate-specific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera. AIDS 1990, 4:107 a 12; Horsburgh CR Jr, Ou CY, Jason J, et al. Duration of human immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet 1989, 334:637 a 40). Depois da soroconversão, a carga viral no sangue periférico declina e a maioria dos pacientes entra em uma fase assintomática que pode durar anos. (Pantaleo G, Graziosi C, Fauci AS. New concepts in the immunopathogenesis of human imsunodeficiency virus (HIV) infection. New Engl J Med 1993, 328:327 a 35). Quantitativo measurement of HIV levels in peripheral blood has greatly contributed to the understanding of the pathogenesis of HIV Infection (Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocites in HIV-1 infection. Nature 1995, 373:123 a 6; Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. A dinâmica viral na infecção pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (Nature 1995, 373: 117 a 22) foi mostrada como um parâmetro essencial no prognóstico e tratamento de indivíduos infectados por HIV. (Mellors JW, Rinaldo CR JR, Gupta P, et al. Prognosis in HIV-1 infection prediced by the quantity of virus in plasma. Science 1996, 272: 1167 a 70; Mellors JW, Munoz A, Giorgi JV, et al. Plasma viral load and CD4+ lymphocites as prognostic markers of HIV-1 infection. Ann Intern Med 1997, 126(12):946 a 54; Chene G, Sterne JA, May M, et al. Prognostic importance of initial response in HIV-1 infected patients starting potent antiretroviral therapy: analysis of prospective studies. Lancet 2003, 362:679 a 86; Egger M, May M, Chene G, et al. Prognosis of HIV-1 infected drug patients starting highly active antiretroviral therapy: a collaborative analysis of prospective studies. Lancet 2002, 360:1 19 a 29; Wood E, Hogg RS, Yip B, et al. Higher baseline levels of plasma human immunodeficiency virus type 1 RNA are associated with increased mortality after initiation of triple-drug antiretroviral therapy. J Infect Dis 2003, 188:1421 a 5; US Department of Health and Human Services. 2004 Diretrizes para o uso de agentes antirretrovirais em adultos e adolescentes infectados com HIV-1. Disponível online em: AIDSinfo.nih.gov/guidelines). As decisões com respeito à iniciação ou mudanças na terapia antirretroviral são guiadas pelo monitoramento dos níveis de RNA de HIV no plasma (carga viral), contagem de células T CD4+ e condição clínica do paciente. (US Department of Health and Human Services. 2004 diretrizes para o uso de agentes antirretrovirais em adultos e adolescentes infectados com HIV-1. Disponível online em: AIDSinfo.nih.gov/guidelines; Yeni PG, Hammer SM, Hirsch MS, et al. Treatment for Adult HIV Infection. 2004 Recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. JAMA 2004, 292:251 a 65). O objetivo da terapia antirretroviral é reduzir o vírus HIV no plasma abaixo de níveis detectáveis de testes de carga viral disponíveis. (US Department of Health and Human Services. 2004 diretrizes para o uso de agentes antirretrovirais em adultos e adolescentes infectados com HIV-1. Disponível online em: AIDSinfo.nih.gov/guidelines; AS, Essunger P, Cao Y, et al. Decay characteristics of HIV-1 infected compartments during combintion therapy. Nature 1997, 387(6629): 188 a 91). Os níveis de RNA de HIV no plasma podem ser quantificados pelos procedimentos da técnica anterior pela amplificação de ácido nucleico ou tecnologias de amplificação de sinal. (Mulder J, McKinney N, Christopher C, et al. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol 1994, 32:292 a 300; Dewar RL, Highbarger HC, Sarmiento MD, et al. Application of branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency vírus type 1 burden in human plasma. J Inf Diseases 1994, 170:1 172 a 9; Van Gemen B, Kievits T, Schukkink R, et al. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA™ during HIV-1 primary infection. J Virol Methods 1993, 43:177 a 87).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[002] A medição quantitativa dos níveis de HIV-1 no sangue periférico é um parâmetro essencial para determinar o prognóstico da doença e o curso da terapia antirretroviral para pacientes infectados. Devido à estabilidade do RNA viral limitada, o teste da carga viral (VL) de HIV-1 convencional a partir do plasma impõe exigências restritivas quanto à coleta, manejo e transporte da amostra, o que pode atrasar a expansão adicional do teste da VL em configurações limitadas de fonte. Pontos secos (DS), incluindo pontos de sangue secos (DBS), representam uma opção possível que ultrapassa estas limitações logísticas e técnicas. DS, exceto DBS, podem ser, por exemplo, plasma, saliva, soro, etc. Esta invenção fornece métodos e procedimentos novos e não óbvios de um recente ensaio VL DS/DBS HIV-1.
[003] O desenvolvimento de ensaios DBS para a quantificação de RNA de HIIV-1 e DNA pró-viral (um genoma viral, ou parte do mesmo, incorporado no DNA de uma célula hospedeira) ainda é muito recente. Os ensaios desenvolvidos na técnica até agora sofrem de várias desvantagens relacionadas ao custo e eficácia. Por exemplo, muitos entre os procedimentos correntes exigem transferência manual de eluatos de DS ou DBS para procedimentos de extração de ácido nucleico adicionais, fornecendo uma oportunidade para que erro e contaminação entrem no ensaio. Se tratamento com DNase é desejado ou exigido nos ensaios da técnica anterior, os procedimentos, frequentemente, envolvem o uso de reagentes adicionais (tampões de reação de DNase específico e tampões de desativação), equipamento (dispositivos de aquecimento), tempo (para que as etapas de procedimento de DNase sejam concluídas) e manipulação adicional.
[004] O procedimento da presente invenção reduz e elimina estas desvantagens da técnica anterior. O ensaio VL HIV-1 DS/DBS da presente invenção utiliza um novel fluxo de trabalho e um sistema tampão de eluição/reação inovador. Estes aperfeiçoamentos sobre a técnica anterior resultam em um ensaio que pode ser quase completamente automatizado com precisão e eficácia aumentadas sobre a técnica anterior. Além disso, estes aperfeiçoamentos sobre a técnica anterior permitem o uso de DNase sem o tempo adicionado e inconveniência inerente nos procedimentos da técnica anterior onde DNase é utilizada.
[005] A presente invenção considera um método automatizado para detectar ácidos nucleicos de HIV-1 em uma amostra de sangue, o método compreendendo: a) fornecer: i) uma amostra de sangue suspeita de estar infectada com HIV seca em um portador sólido, ii) um tampão de eluição, iii) um instrumento de preparação de amostra programável e automatizado, iv) um instrumento de PCR programável e automatizado, v) DNase e vi) reagentes de PCR adequados para detectar ácidos nucleicos de HIV-1; b) eluir a amostra de sangue a partir do portador sólido com o tampão de eluição para criar uma amostra eluída; c) carregar a amostra eluída no instrumento de preparação de amostra programável e automatizado para extração e purificação de ácidos nucleicos adicional para criar uma amostra processada; d) carregar os reagentes de PCR no instrumento de PCR programável e automatizado; e) iniciar um programa automatizado para colocar em alíquotas os reagentes de PCR na amostra processada; f) realizar a PCR sobre os ácidos nucleicos extraídos na amostra processada com o instrumento de PCR programável e automatizado; g) analisar os resultados da PCR gerados pelo instrumento de PCR programável e automatizado para determinar se quaisquer amostras compreendem ácidos nucleicos de HIV-1; h) em que, o dito tampão de eluição compreende aproximadamente 3,5 M de GITC, aproximadamente 5% de Tween® 20 (nome comercial para polissorbato 20; também referido como monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano), aproximadamente 50 mM de KOAc (acetato de potássio) aproximadamente ao pH 6,0; i) em que, opcionalmente, DNase é adicionada a uma ou mais entre a amostra processada, os reagentes de PCR ou a reação de PCR completa depois da adição dos reagentes de PCR à amostra processada.
[006] A invenção ainda considera que o método adicionalmente compreende controles negativos e positivos.
[007] A invenção ainda considera que a etapa b) é de cerca de 20 minutos na temperatura ambiente com mistura suave intermitente ou 55 °C durante 30 minutos com mistura suave intermitente.
[008] A invenção ainda considera que o procedimento automatizado é programado por comandos de software.
[009] A invenção ainda considera que a etapa i) é realizada e a dita DNase não exige tampões de reação de DNase específicos, é eficaz na ambiente temperatura ou temperaturas usadas durante os estágios de ciclização de PCR, degrada eficazmente o DNA no período de tempo de 30 minutos, não precisa ser inativada depois de degradar eficazmente o DNA e não impactar negativamente na detecção de sequências de RNA.
[010] A invenção ainda considera que o portador sólido é filtro de papel.
[011] A invenção ainda considera que o ácido nucleico é RNA.
[012] A invenção ainda considera que o ácido nucleico é DNA pró-viral.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[013] A Figura 1 mostra DNase (Ambion DNase 1 (Livre de RNase) (Cat # AM2222) ou equivalente) que removeu eficazmente o DNA e não impactou negativamente nos sinais de RNA. DNase foi usada para tratar diretamente ácidos nuclei-cos extraídos antes da realização de uma reação de PCR.
[014] A Figura 2 mostra DNase (New England Biolabs DNase I (Livre de RNase) (Cat # MO303S) ou equivalente) que não removeu eficazmente o DNA e não impactou negativamente nos sinais de RNA. DNase foi usada para tratar diretamente os ácidos nucleicos extraídos antes da realização de uma reação de PCR.
[015] A Figura 3 mostra DNase (Sigma-Aldrich DNase 1 (Grau de Amplificação) (Cat # AMPD1) ou equivalente) que removeu o DNA e impactou negativamente nos sinais de RNA. DNase foi usada para tratar diretamente os ácidos nucleicos extraídos antes da realização de uma reação de PCR.
[016] A Figura 4 mostra DNase (Promega RQ1 DNase Livre de RNase (Cat # M6101) ou equivalente) que removeu o DNA e não impactou negativamente nos sinais de RNA. A DNase foi usada para tratar diretamente os ácidos nucleicos extraídos antes da realização de uma reação de PCR.
[017] A Figura 5 mostra uma comparação de condições de eluição com DBS de 55 °C durante 30 minutos vs. temperatura ambiente durante 20 minutos em 1000 cópias/mL de HIV-1. Setenta e uma replicatas por condição foram usadas. O limiar de ciclo (Ct) a 55 °C durante 30 min foi mais precoce do que Ct na temperatura ambiente durante 20 minutos. Razão Máxima (MR; uma medição de concentração de sinal) a 55 °C durante 30 minutos foi maior do que MR na temperatura ambiente durante 20 minutos.
[018] A Figura 6 mostra a eluição com DBS em temperaturas variando de 52 a 65 °C a partir de 25 a 45 minutos. Embora os valores de Ct tenham sido comparáveis através das condições, a condição com o valor de MR mais alto foi 55 °C durante 30 minutos.
[019] A Figura 7 mostra a eluição com DBS a 55 °C durante 10, 20 e 30 minutos. O aumento do tempo de eluição mostrou uma tendência para aperfeiçoar Ct e aumentar MR, embora as diferenças entre cada ponto no tempo não tenham sido significantes. Depois da incubação a 55 °C durante 30 minutos, incubação adicional na temperatura ambiente durante até 24 horas não afetou os resultados da PCR.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[020] Até hoje, o teste das amostras de plasma é o padrão ouro para avaliação de carga viral (VL) em indivíduos infectados com HIV na terapia antirretroviral (ART). Em configuração limitadas de fonte, o uso de pontos de sangue secos (DBS) é um tipo de amostra alternativo promissor para teste e genotipagem de VL. DBS em combinação com processamento de amostra automatizado e sistemas com base em PCR em tempo real possibilitariam os testes de medição ou genotipagem de VL em laboratórios centrais.
[021] Para adaptar os ensaios de carga viral de HIV para DBS, os problemas técnicos mais importantes são sensibilidade e especificidade do ensaio. A sensibilidade e especificidade clínicas do ensaio de carga viral DBS são definidas por meio do uso de um limiar de 1000 cópias/mL nas diretrizes da Organização Mundial de Saúde (WHO) 2013 para o Tratamento Antirretroviral. A proporção de pacientes com VL no plasma <1000 cópias/mL 12 meses ou mais depois da iniciação da ART é um resultado principal medido como parte das pesquisas de resistência ao fármaco adquiridas. Os pacientes com VL abaixo deste nível são categorizados por apresentar terapia medicamentosa bem sucedida (Parkin, 2014 AIDS Rev.)
[022] A especificidade do ensaio está relacionada ao isolamento/amplificação de RNA livre de célula vs. DNA ou RNA associado à célula. Se um ensaio aumenta o RNA livre de célula e DNA ou RNA associado à célula, uma superquantificação sig-nificante nas concentrações de VL no plasma baixas será observada, visto que o DNA celular é a fonte predominante de ácido nucleico derivado de vírus sem plasma em pontos de sangue secos. (Parkin, 2014 AIDS Rev.). O sistema HIV-1 m2000 em Temo Real da Abbott incorpora reagentes e métodos que são específicos ou pelo menos seletivos para o RNA (Parkin, 2014 AIDS Rev.). Relatos também reivindicam a correlação aceitável entre cargas virais no plasma e amostras de DBS usando o ensaio HIV-1 em tempo Real da Abbott (Marconi, A., et al., 2009 Clin Microbiol Infect; Arredondo et al., 2012 J Clin Micro).
[023] A sensibilidade do ensaio é, normalmente, representada pelo limite de ensaio de detecção (LOD). O desafio principal para a sensibilidade DBS é que as limitações do volume restringem os números de cópia de entrada (revisão por Nell T. Parkin, 2014). Uma versão modificada do ensaio HIV-1 DBS e, Tempo Real da Abbott (ensaio HIV-1 DBS e Tempo Real da Abbott modo aberto) foi desenvolvida, a qual envolve o uso de um ponto DBS de 70 μΙ perfurado que não exige excisão. Adicionalmente, nenhuma transferência de amostra entre os tubos é exigida. Um DBS é eluído em 1300 μΙ de tampão com 1000 μΙ usado como entrada para o processamento. Portanto, a quantidade real de sangue total que é transferida para extração é de aproximadamente 53,8 μΙ. Uma taxa de recuperação de eluição com DBS experimentalmente determinada (em comparação ao plasma) usando a condição de eluição na temperatura ambiente corrente (esboçada no protocolo de modo aberto de DBS inicial) variou de 24% a 43% (em comparação ao plasma), com uma média de 35%, o que leva a uma faixa de LOD calculada de 1080 cópias/mL a 1934 có-pias/mL. (Nestes experimentos, sangue total e plasma foram monitorados com a mesma concentração de HIV; o efeito de hematócritos não foi incluído). Visto que o limiar proposto da WHO para determinar terapia ART bem sucedida é uma VL de <1000 cópias/mL (Considerações Técnicas e Operacionais da WHO para Implementar Teste da Carga Viral de HIV, Julho de 2014), o ensaio VL DBS HIV precisa ter um Limite de Detecção (LOD) ≤ 1000 cópias/mL. Para obter esta sensibilidade usando um DBS de 70 μL, a eficácia de eluição com DBS precisa ser aperfeiçoada em 10% ou mais para reduzir o LOD em menos do que 1000 cp/mL.
[024] O ensaio DS/DBS HIV-1 VL da presente invenção é designado para ser conduzido em um dispositivo automatizado que pode ser programado para os parâmetros de extração e amplificação de ácido nucleico da presente invenção. Os instrumentos m2000sp e m2000rt em Tempo real da Abbott (dispositivo; Abbott Molecular, Abbott Park, IL) são exemplos de dispositivos automatizados e programáveis adequados para o ensaio VL HIV-1 DBS da presente invenção. As instru-ções/parâmetros de operação para os instrumentos m2000sp e m2000rt em Tempo Real da Abbott (e instrumentos adequados disponíveis a partir de outras fontes) são conhecidas a uma pessoa de habilidade comum na técnica e são incorporadas neste relatório como referência. A presente invenção não é limitada ao uso deste dispositivo e outros dispositivos similares foram conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica no período desta invenção. O ensaio de HIV-1 da presente invenção, preferivelmente, utiliza a tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com detecção fluorescente em tempo real homogênea. O projeto da sonda fluorescente parcialmente de fita dupla possibilita a detecção de diversas variantes de HIV-1, incluindo os grupos M, O e N. O ensaio pode ser padronizado contra um padrão viral a partir da Virology Quality Assurance (VQA) Laboratory do AIDS Clínico Trial Group ou outro padrão (Yen-Lieberman B, Brambilla D, Jackson B, et al. Evaluation of a quality assurance program for quantitation of human virus immunodeficiency type 1 RNA in plasma by the AIDS clinical trials group virology laboratories, J Clin Microbiol, 1996, 34:2695 a 701), e contra os Padrões Internacionais da Organização Mundial de Saúde WHO para o RNA de HIV-1 (NIBSC; Holmes H, Davis C, Heath A, et al. An international collaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for the use in nucleic acid-based techniques, J Virol Methods, 2001 , 92:141 a 50; Davis C, Heath A, Best S, et al. Calibration of HIV-1 working reagents for nucleic acid amplification techniques against the 1 st international standard for HIV-1 RNA, J Virol Meth, 2003, 107:37 a 44). O resultados do ensaio podem ser relatados em có-pias/mL, cópias Log/mL, Unidades Internacionais/mL (lU/mL) ou Log lU/mL.
[025] Conforme indicado no Diagnóstico Infantil Precoce da WHO de HIV - Estudo Web de HIV Global (de- pts.washington.edu/ghivaids/reslimited/case7/debate.html), teste do ponto de sangue seco é um meio aceitável para coletar amostras para análise e propõe um risco patogênico menor do que as amostras líquidas. Além disso, artigos revisados em grupo mostraram que o uso de amostras de DBS é possível quando comparado às amostras de plasma para sensibilidade e confiabilidade (J. Clin Microbiol, 2011, 50(3):569 a 572).
[026] A eficácia e precisão da preparação de amostra automatizada e sistemas de análise, tais como o Sistema de Preparação de Amostra da Abbott (m2000sp) e analisador de PCR em Tempo Real da Abbott (m2000rt) foram confirmadas em artigos de jornal revisados em grupo (Marconi, et al., Evaluation of the Abbott Real-Time HIV-1 quantitative assay with dried blood spot specimens, Clin. Microbiol. Infect, 2009, 15:93 - 97). Além disso, comparações de vários documentos para a coleta de DBS foram publicadas (Rottinghaus, et al., J. Clin. Microbiol., 2012, 51 (1):55 a 60).
[027] Embora grandes quantidades de trabalho tenham investigado o uso de DBS em sistemas de preparação e ensaio automatizados, aperfeiçoamentos no fluxo de trabalho e química de reagentes ainda são necessários para fornecer utilização aumentada e sensibilidade aumentada. A presente invenção fornece eficácia, fluxo de trabalho e desempenho aperfeiçoados sobre os procedimentos do ensaio VL HIV-1 DBS da técnica anterior usando sistemas automatizados.
VANTAGENS DA COLETA DA AMOSTRA DE DBS
[028] As vantagens da coleta de DBS sobre as amostras de sangue líquido são numerosas. DBS são fáceis de coletar; apenas uma picada no dedo ou picada no calcanhar é necessária, contornando a necessidade quanto à punção da veia. Nenhuma habilidade de flebotomia é necessária. O equipamento de coleta é mínimo. Cartões de amostra, usualmente, apresentam uma indicação do tamanho do ponto (diâmetro) para garantir tamanho de amostra adequado. Um volume de amostra de cerca de 70 μΙ é usualmente adequado. As amostras são secas ao ar nas condições ambiente. DBS não exigem resfriamento para armazenagem. DBS podem ser armazenados ou transportados em um recipiente fechado (tal como Tupper Wear® ou um envelope vedado). As amostras são fáceis de transportar e são estáveis durante períodos de tempo longos nas condições ambiente (semanas a meses). Assim, as amostras podem ser coletadas em sítios externos e transportadas para uma instalação de teste centralizada. Por causa dos patógenos reduzidos fornecidos com amostras de DS/DBS, amostras apropriadamente embaladas podem ser enviadas para uma instalação de teste (Diretrizes de Remessa para Amostras de Ponto de Sangue Seco, CDC, www.cdc.gov/labstandards/pdf/nsqap/Bloodspot_Transportation_Guidelines.pdf, e referências contidas nas mesmas; Clinical Laboratory and Standards Institute. Blood collection on filter paper for newborn screening programs; Approved standard-quinta edição. Documento CLSI LA4-A6. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012). Uma vez na instalação de teste, as amostras podem ser extraídas usando sistemas automatizados ou procedimentos manuais, se desejado.
DEFINIÇÕES
[029] As seguintes definições são relevantes à presente divulgação:
[030] O termo “cerca de” ou “aproximadamente”, a menos que de outro modo estabelecido, se refere a uma variação de +/-10% a partir do valor estabelecido. Deve ser entendido que tal variação é sempre incluída em qualquer valor fornecido neste relatório, se referência específico ou não for feita ao mesmo. Além disso, todas as faixas citadas incluem todos os valores encontrados em tal faixa se o valor específico ou não for realmente citado. Assim, a faixa de 1 a 10 inclui, por exemplo, os valores 2, 3,6, 9,015, etc.
[031] O termo “reação em cadeia da polimerase (PCR)” se refere a um método para preparar cópias de uma sequência de DNA. O método emprega ciclização térmica (isto é, ciclos de aquecimento e esfriamento para desnaturação (ou fusão) e replicação do DNA, respectivamente. Os iniciadores, que são fragmentos de DNA curtos contendo sequências complementares à sequência de DNA que será copiada, e uma DNA polimerase estável ao calor, tal como aquela a partir de Thermus aquaticus, que é referida como Taq polimerase, são usados para selecionar a sequência de DNA e copiar a mesma (veja, por exemplo, as Patentes U.S. N⍛s 4.683.195; 4.800.195 e 4.965.188, as quais são integralmente incorporadas como referência neste relatório). Com ciclização repetida, as cópias que são feitas são usadas como moldes para gerar outras cópias (isto é, uma reação em cadeia). As técnicas de PCR incluem, mas não são limitadas à PCR padrão, PCR específica do alelo, PCR de montagem, PCR assimétrica, PCR digital, PCR com arranque a quente, PCR específica de intersequência, PCR inversa, PCR mediada por ligação, PCR específica de metilação, PCR com mini-iniciador, PCR aninhada, PCR com extensão por sobreposição, PCR em tempo real, PCR de transcrição reversa, PCR em fase sólida, PCR entrelaçada assimétrica térmica e Touchdown PCR.
[032] O termo reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) se refere a um método para detectar qualitativamente a expressão do gene através da criação de transcritos de DNA complementar (cDNA) a partir de RNA.
[033] O termo “reação em cadeia da polimerase em tempo real”, “PCR em tempo real” e “PCR qualitativa” (qPCR) se refere a um método para medir quantitativamente a amplificação de DNA usando sondas fluorescentes.
[034] O termo “iniciador”, conforme usado neste relatório, se refere a um oli-gonucleotídeo que inicia a síntese de ácido nucleico dependente do molde. Na presença de um molde de ácido nucleico, precursores de trifosfato de nucleosídeo, uma polimerase e cofatores, sob condições adequadas de temperatura e pH, o iniciador pode ser estendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela polimerase para fornecer um produto de extensão do iniciador. O iniciador pode variar em comprimento dependendo das condições particulares utilizadas e do propósito da amplificação. Por exemplo, um iniciador para amplificação para um propósito diagnóstico é, tipicamente, de cerca de 15 a cerca de 35 nucleotídeos em comprimento. O iniciador deve ser de complementaridade suficiente ao molde desejado para iniciar a síntese do produto de extensão desejado. Em outras palavras, o iniciador deve ser capaz de anelar com a fita de molde desejada em uma maneira suficiente para fornecer a porção hidroxila 3’ do iniciador em justaposição apropriada para o uso na iniciação de síntese por uma polimerase. Não é necessário que o iniciador seja um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos não complementar pode estar presente na extremidade 5’ de um iniciador de outro modo complementar. Alternativamente, bases não complementares pode ser intercaladas dentro do iniciador do oligonucleotídeo, contanto que a sequência iniciadora tenha complementaridade suficiente com a sequência da fita de molde desejada para fornecer um complexo molde-iniciador para a síntese do produto de extensão.
PCR
[035] Sequências alvo são amplificadas com técnicas conhecidas no ramo. A técnica de escolha é reação em cadeia da polimerase (PCR). A amplificação da PCR pode ser realizada por técnicas de PCR padrão, seguindo as instruções do fabricante. O sistema Abbott/772000 compreende dispositivos que automatizam a preparação da amostra e reações da PCR com base na entrada a partir do usuário.
[036] A reação de amplificação pode e, preferivelmente, compreende um ácido nucleico de controle interno (IC) e um par de iniciadores para amplificar o ácido nucleico de IC. Quando a reação de amplificação compreende um ácido nucleico de IC, as condições que promovem a amplificação também promovem a amplificação do ácido nucleico de IC. Qualquer sequência adequada pode ser usado como o IC. Exemplos de sequências alvo do IC incluem aqueles usados na seção Exemplificação, abaixo.
[037] Embora qualquer amostra adequada de um tecido ou um fluido corpóreo possa ser usada como a fonte da amostra de ácido nucleico, isto é, DNA ou RNA, na presente invenção, a amostra é eluída a partir de um DBS. Uma proteinase, tal como proteinase K, pode ser adicionada à amostra para digerir proteínas indese-jadas, se necessário ou desejado.
[038] A amostra pode ser preparada para o ensaio usando qualquer método adequado, conforme é conhecido na técnica. Desejavelmente, o método extrai e concentra ácidos nucleicos. Além disso, o método, desejavelmente, torna a sequência alvo acessível para amplificação e remove inibidores potenciais de amplificação a partir do extrato. Na presente invenção, os ácidos nucleicos são eluídos a partir do DBS com o tampão de eluição da presente invenção.
[039] Uma vez que a amostra é eluída, o RNA pode ser isolado, transcrito reverso e o cDNA resultante pode ser amplificado (por exemplo, reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT- PCR), conforme descrito nas Patentes U.S. N⍛s 5.310.652; 5.322.770; 5.561.058; 5.641.864; e 5.693.517, por exemplo). Além disso, o DNA pode ser diretamente amplificado sem o uso de uma transcriptase reversa. DNA pró-viral pode ser amplificado desta forma.
[040] O ácido nucleico alvo pode ser contatado com os iniciadores que resultam em amplificação específica de uma sequência alvo, caso a sequência alvo esteja presente na amostra. “Amplificação específica” significa que os iniciadores amplificam uma sequência alvo específica e não outras sequências. Veja, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, Editor, Freeman Press, NY (1992)); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., Editors, Academic Press, San Diego, CA (990)); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1994 a 1999, incluindo atualizações complementares até Abril de 2004); e Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3a ed., 2001), assim como os métodos descritos na Publicação de Pedido de patente N⍛ WO 93/22456 e Patentes U.S. N⍛s 4.851.331; 5.137.806; 5.595.890; e 5.639.611, todos os quais são especificamente incorporados neste relatório como referência.
[041] Um iniciador pode ser detectavelmente marcado com uma marcação que pode ser detectada por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos, por exemplo (veja, por exemplo, Sambrook, et al.). Marcações úteis incluem um corante, tal como um corante fluorescente, uma marcação radioativa, tal como 32P, um reagente eletrodenso, uma enzima, tal como peroxidase ou fosfatase alcalina, biotina ou haptenos e proteínas para as quais antisso-ros ou anticorpos monoclonais são disponíveis. Na presente invenção, corantes fluorescentes são preferidos. Neste respeito, um oligonucleotídeo detectável pode ser marcado, tal como com fluoresceína. Se o iniciador é marcado com um corante e o oligonucleotídeo detectável é marcado com fluoresceína e é designado para se ligar à fita nascente oposta a partir do corante, transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) através da hélice de DNA pode ocorrer. Outros oligonucleotí-deos detectáveis incluem uma sonda molecular, uma sonda TAQMAN®, uma sonda de DNA de fita única, uma sonda de DNA de fita dupla e semelhantes.
[042] Reagentes de amplificação de ácido nucleicos (reagentes de PCR) incluem uma enzima que apresenta atividade de polimerase (por exemplo, AmpliTaq Gold®), um ou mais cofatores de enzima (por exemplo, MgCl2) e trifosfatos de deso-xinucleotídeo (dNTPs; por exemplo, dATP, dGTP, dCTP e dUTP ou dTTP).
[043] Condições que promovem a amplificação são aquelas que promovem a anelamento de iniciadores e extensão de sequências de ácidos nucleicos. O anela-mento é dependente de vários parâmetros, tais como temperatura, concentração iônica, comprimento das sequências que serão amplificadas, complementaridade e teor de G:C das sequências que serão amplificadas. Por exemplo, a diminuição da temperatura promove o anelamento de sequências de ácidos nucleicos complementares. O teor de G:C alto e comprimento mais longo estabiliza formação de duplex. Em geral, os iniciadores e oligonucleotídeos detectáveis de cerca de 30 bp ou menos e apresentando um teor de G:C alto trabalham satisfatoriamente. Condições de amplificação, iniciadores e oligonucleotídeo detectáveis preferidos são exemplificados neste relatório.
[044] A amplificação pode ser repetida para qualquer número adequado de vezes por meio da ciclização térmica da mistura de reação entre cerca de 10 e cerca de 100 vezes, tal como entre cerca de 20 e cerca de 75 vezes, tal como entre cerca de 25 e cerca de 50 vezes.
[045] Uma vez que as reações de amplificação são concluídas, a presença de um produto amplificado pode ser detectada usando qualquer método adequado. Tais métodos incluem, sem limitação, aqueles conhecidos na técnica, tais como eletroforese em gel com ou sem um corante fluorescente (dependendo se o produto foi amplificado com um iniciador marcado com corante), um perfil de fusão com um corante intercalante (veja, por exemplo, PCR Technology, Principles, and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., W. H. Freeman e Co., Nova Iorque, 1992, Capítulo 7) e hibridização com um oligonucleotídeo detectável interno. Outros exemplos de métodos incluem ensaio imunossorvente ligado por enzimas (ELISA), eletroquimio-luminescência, dot blots reversos, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (veja, por exemplo, Lazar, Genome Res. 4: S1-S14 (1994)) e análise de polimorfismo de conformação de fita única de produtos de PCR de fita única também podem ser usados (veja, por exemplo, Orita, et al., PNAS USA 86: 2766 a 2770 (1989)). Na presente invenção, marcações fluorescentes são automaticamente detectadas com o dispositivo de reação de PCR automatizado.
[046] Ácido nucleico amplificado pode ser detectado por meio do monitoramento de um aumento na quantidade total de DNA de fita dupla (dsDNA) na mistura de reação (veja, por exemplo, a Patente U.S. N⍛ 5.994.056 e Publicação de Patentes Europeias N⍛s 487.218 e 512.334). Um corante de ligação ao DNA, tal como SYBR Green, é usado. O corante fluoresce quando ligado ao dsDNA e o aumento na fluorescência é usado para determinar o aumento no dsDNA.
[047] Alternativa e preferivelmente, a amplificação e detecção podem ser combinadas em um ensaio de PCR em tempo real. Quando a PCR em tempo real é usada, a mistura pode ainda compreender reagentes de detecção de ácidos nuclei-cos. Exemplos incluem corantes fluorescentes não específicos que se intercalam com qualquer DNA de fita dupla ou oligonucleotídeos detectáveis de DNA específicos da sequência, o que permite a detecção apenas depois que o oligonucleotídeo detectável hibridiza com seu DNA complementar alvo, desse modo, possibilitando amplificação e detecção simultâneas. Quando um oligonucleotídeo detectável está presente na mistura durante a amplificação, o oligonucleotídeo detectável deve ser estável sob as condições que promovem a amplificação, não deve interferir com a amplificação, deve ser ligar à sua sequência alvo sob condições de amplificação e emitir um sinal apenas após a ligação à sua sequência alvo. Exemplos de oligonu-cleotídeo detectável que são particularmente bem adequados neste respeito incluem oligonucleotídeos detectáveis de sinal molecular, TAQMAN® oligonucleotídeos de-tectáveis e oligonucleotídeos detectáveis lineares, tais como aqueles descritos por Abravaya, et al. (Publicação de Pedido de Patente U.S. No 2005/0227257). Os oligonucleotídeos detectáveis podem formar o arranjo de alça e tronco em combinação com um sinal molecular. Os oligonucleotídeos detectáveis também podem ser usados como oligonucleotídeos detectáveis lineares com um fluoróforo (por exemplo, FAM) em uma extremidade e um supressor de alta eficácia, tal como o Black Hole Quencher (BHQ®; BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA), na outra extremidade.
[048] Os termos e expressões que foram utilizados são usados como termos de descrição e não de limitação. Neste respeito, onde certos termos são definidos, descritos ou debatidos neste relatório, todas as tais definições, descrições e debates são intencionados a ser atribuídos a tais termos. Também não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes das mesmas.
[049] Deve ser reconhecido que várias modificações são possíveis no escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada no contexto de formas de realização preferidas e características opcionais, aqueles habilitados na técnica podem recorrer às modificações e variações dos conceitos divulgados neste relatório. Tais modificações e variações são consideradas no escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.
[050] Todas as patentes, publicações de pedido de patente, artigos de jornal, livros didáticos e outras publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativos do nível da habilidade daqueles na técnica a qual a divulgação pertence. Todos as tais publicações são incorporadas neste relatório como referência no mesmo grau como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada como referência.
[051] A invenção ilustrativamente descrita neste relatório pode ser adequadamente praticada na ausência de quaisquer elementos ou limitações que não são especificamente divulgados neste relatório. Assim, por exemplo, cada exemplo neste relatório de qualquer um entre os termos “compreendendo”, “consistindo essencialmente de” e “consistindo de” pode ser substituído com qualquer um entre os outros dois termos. Do mesmo modo, as formas no singular “um”, “uma” e “o”, “a” incluem as referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Assim, por exemplo, as referências ao “método” incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo, que são descritos neste relatório e/ou que tornar-se-ão evidentes àqueles comumente habilitados na técnica após a leitura da divulgação.
EXEMPLIFICAÇÃO Exemplo 1
[052] A presente invenção é, preferivelmente, realizada em dispositivos de PCR programáveis e automatizados, vários dos quais são conhecidos a uma pessoa de habilidade comum na técnica e são adequados para o uso com a presente invenção com quaisquer mudanças de procedimento que podem ser necessárias para o uso com um sistema específico, sem desviar dos conceitos inventivos da presente invenção. Em outros exemplos, a presente invenção pode ser manualmente realizada. Entretanto, a execução manual da presente invenção resulta em investimento de tempo aumentado e possível diminuição na precisão devido ao erro do operador.
[053] Esta exemplificação utiliza o sistema A772000 da Abbott compreendendo os instrumentos m2000sp (preparação da amostra) e m2000rt (amplificação de ácido nucleico em tempo real) e os reagentes de HIV-1 em Tempo Real da Abbott.
[054] Teste Carga Viral de HIV-1 de Amostras de Ponto de Sangue Seco para o uso em Combinação com Instrumentos m2000 da Abbott (ou similares) e Reagentes de HIV-1 em Tempo Real da Abbott (ou similares)
[055] O procedimento descrito abaixo se aplica ao teste de carga viral de HIV-1 de amostras de ponto de sangue seco (DBS). Este procedimento descrito abaixo é usado em combinação com os instrumentos m2000sp e m2000rt da Abbott e os reagentes de HIV-1 em Tempo Real da Abbott. Outros sistemas e dispositivos são disponíveis na técnica e uma pessoa de habilidade comum na técnica pode modificar o procedimento divulgado abaixo para o uso nos outros sistemas e dispositivos disponíveis com base nos ensinamentos do presente relatório descritivo e sem desviar dos conceitos inventivos do presente relatório descritivo.
PROCEDIMENTO DO INSTRUMENTO
[056] O arquivo de aplicação (isto é, software) para o teste de carga viral de HIV-1 DBS deve ser instalado nos sistemas m2000sp da Abbott e m2000rt da Abbott antes da realização do ensaio.
COLETA DA AMOSTRA E INSTRUÇÕES DE MANEJO
[057] DBS podem ser preparados em um cartão de papel Munktell TFN (Suécia) (ou cartões de papel equivalentes, conforme são conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica) seguindo estas etapas:
  • • Colocar pontos de sangue total sobre os círculos de meia polegada (12 milímetros) em um cartão de papel Munktell TFN (ou equivalente), garantindo que o círculo total foi revestido. É recomendado que pelo menos 70 μΙ de sangue (~3 a 5 gotas; não apertar ou esfolar o dedo) sejam usados para cada círculo para garantir cobertura total. Se sangue total foi coletado em um tubo de coleta de sangue, o sangue recém coletado pode ser mantido a partir de 2 a 8 °C (temperatura do refrigerador) a 15 a 30 °C (temperatura ambiente) durante até 24 horas antes da detecção. Além disso, o sangue deve ser misturado antes da detecção usando uma pipeta.
  • • Secar ao ar o cartão na temperatura ambiente.
  • • Para transportar ou armazenar, embalar cada cartão em uma bolsa ou outro recipiente vedável com embalagens dessecantes. Os cartões podem ser armazenados sob condições ambiente durante até 12 semanas. Alternativamente, os cartões podem ser armazenados entre 2 a 8 °C ou -10 °C ou temperaturas mais frias durante até 24 semanas.
  • • Enviar as amostras, se necessário ou desejado, de acordo com a temperatura e tempos de armazenagem recomendados listados acima. Para envios domésticos e internacionais, as amostras devem ser embaladas e marcadas em complacência com os regulamentos estaduais, federais e internacionais aplicáveis que cobrem o transporte de amostras clínicas, diagnósticas ou biológicas.
PROTOCOLO DE ENSAIO
1. Este protocolo exemplar usou o sistema em Tempo Real da Abbott. Uma pessoa de habilidade comum na técnica será capaz de adaptar este protocolo a outros dispositivos e sistemas similares sem experimentação indevida. Um total de 96 amostras pode ser processado em cada condução. Um controle negativo, um controle positivo baixo e um controle positivo alto são incluídos em cada condução, assim permitindo um máximo de 93 amostras de DBS que serão processadas por condução quando os calibradores não são incluídos. Estas etapas não se aplicam aos controles e calibradores Abbott, que devem ser processados como amostras líquidas diretamente. Processar as amostras de DBS seguindo estas etapas:
  • • Preparar Tubos de Transporte Abbott com 1,3 ml de tampão de eluição DS/DBS (o tampão de eluição compreende aproximadamente 3,5 M de GITC (tiocia-nato de guanidínio), aproximadamente 5% de Tween® 20, aproximadamente 50 mM de KOAc (acetato de potássio) aproximadamente ao pH 6,0). Tween® é uma marca registrada da ICI Americas, Inc., Bridgewater, Nova Jersey. Tween® 20 é um nome comercial para polissorbato 20. Outras marcas de polissorbato 20 também trabalharão nos métodos da presente invenção. [GI TC pode ser usado a partir de 1,0 a 5,5 M, 2,0 a 4,5 M, 3,0 a 4,0 M e cerca de 3,5 M; Tween20 pode ser usado em 0 a 20%, 2% a 8%, 4% a 6% e cerca de 5%; Acetato de potássio pode ser usado em 10 a 500 mM, 20 mM a 300 mM, 30 mM a 200 mM, 40 mM a 100 mM e cerca de 50 mM; e o pH pode ser de 5 a 10, 5,2 a 8, 5,6 a 7, 5,8 a 6,5 e cerca de 6,5.]
  • • Separar um (1) DBS inteiro para cada amostra a partir de um cartão de papel TFN Munktell (ou equivalente). Cada DBS deve ter aproximadamente meia polegada (12 milímetros) em diâmetro. NOTA: Se aplicável, evite contato direto da superfície de corte com amostras de DBS. Limpar o instrumento usado para cortar DBS entre as amostras, se necessário, de acordo com práticas laboratoriais satisfatórias. Colocar DBS no Tubo de Transporte Abbott contendo o tampão de eluição DS/DBS. Assegurar que o DBS seja completamente submerso no tampão de eluição DS/DBS. NOTA: Durante esta etapa de transferência de DBS, um cartão de papel TFN Munktell perfurado pode ser colocado acima do Tubo de Transporte Abbott onde DBS é empurrado para fora do cartão e ainda diretamente no tubo usando uma ponta de pipeta limpa.
  • • Incubar na temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos ou incubar durante 30 minutos a 55 °C com mistura suave intermitente antes de a amostra ser colocada no instrumento Abbott m2000sp ou outro sistema robótico (Etapa 7).
2. Descongelar controles de ensaio apropriados e controle interno (IC) entre 15 a 30 °C ou 2 a 8 °C (e entre). Descongelar calibradores entre 15 a 30 °C ou 2 a 8 °C (e entre) apenas se realizar uma condução de calibração.
  • • Uma vez descongelados, controles de ensaio, IC e calibradores podem ser armazenados entre 2 a 8 °C durante até 24 horas antes do uso.
  • • Vórtex (isto é, misturar com extremo vigor, por exemplo, com um misturador Vórtex ou equivalente) cada calibrador de ensaio e cada controle 3 vezes durante 2 a 3 segundos antes do uso. Assegurar que os conteúdos de cada frasco estão no fundo depois do vórtex batendo de leve os frascos na bancada para levar o líquido ao fundo do frasco. Assegurar que bolhas ou espumas não são geradas; e se presentes, remover as bolhas com uma ponta de pipeta estéril, usando uma nova ponta para cada frasco.
  • • Preparar controles internos (IC), de acordo com as instruções do fabricante, conforme conhecido na técnica.
3. Descongelar os reagentes de amplificação entre 15 a 30 °C ou 2 a 8 °C (e entre) e armazenar entre 2 a 8 °C até necessário para o procedimento de mistura principal de amplificação.
  • • Uma vez descongelados, os reagentes de amplificação podem ser armazenados entre 2 a 8 °C durante até 24 horas se não usados imediatamente.
  • • Preparar reagentes de amplificação (reagentes de PCR), de acordo com as instruções do fabricante, conforme conhecido na técnica.
  • • Colocar os controles positivos baixos e altos, o controle negativo, os calibradores, se aplicável, e as amostras de DBS nos Tubos de Transporte Abbott sobre as estantes de amostra m2000sp da Abbott. NOTA: Assegurar que as estantes de amostra m2000sp da Abbott foram calibradas especificamente para este procedimento de carga viral de HIV-1 DBS.
  • • Carregar as estantes de amostra cuidadosamente para evitar salpicos. Se usados, códigos de barras em etiquetas de tubo devem estar voltados para a direita para varredura. Assegurar que cada tubo é colocado seguramente na estante de amostra, de modo que o fundo do tubo atinja o interior do fundo da estante.
  • • Carregar as estantes de amostra preenchidas sobre o m2000sp da Abbott em posições de estante de amostra consecutivas, com a primeira estante mais afastada para a direita na mesa de trabalho, e qualquer estante adicional progressivamente para a esquerda da primeira estante.
[058] 5. Colocar os Vasos de Reação de 5 ml no portador de subsistema Abbott m2000sp de 1 ml.
[059] 6. Carregar os reagentes de sistema de Preparação Abbott mSample e a Placa com 96 Poços Profundos da Abbott na mesa de trabalho m2000sp da Abbott.
[060] 7. A partir da tela de Protocolo, selecionar o arquivo de aplicação de carga viral de HIV-1 DBS.
[061] Iniciar o protocolo de extração de amostra.
  • • Inserir o calibrador (necessário se uma curva de calibração não foi armazenada no m2000rt da Abbott ) e valores específicos do lote de controle na Extração de Amostra: Configuração da Mesa de Trabalho, Calibrador e Campos de Controle. Valores específicos de lote são especificados em cada Calibrador de HIV-1 em Tempo Real da Abbott e Cartão de Kit Controle.
  • • O protocolo de Adição de Mistura Principal m2000sp da Abbott (etapa 9) deve ser iniciado dentro de 1 hora depois da conclusão de Preparação da Amostra.
[062] NOTA: Mude as luvas antes de manejar os reagentes de amplificação.
[063] 8. Carregar os reagentes de amplificação e o frasco de mistura principal na mesa de trabalho m2000sp da Abbott depois que a preparação da amostra for concluída.
[064] 9. Selecionar a placa de cavidade profunda apropriada que corresponde à extração de preparação de amostra correspondente. Iniciar o protocolo de Adição de Mistura Principal m2000sp da Abbott.
  • • Depois da extração da amostra estar concluída, o m2000sp da Abbott automaticamente preenche quaisquer cavidades vazias na Placa de Reação Óptica de 96 Poços da Abbott quando existe mais do que 48 amostras processadas dentro de uma condução. Placa preenchida não é realizada por rodadas contendo 48 amostras ou menos.
[065] 10. Ligar e inicializar o instrumento m2000rt da Abbott na Área de Amplificação.
[066] 11. Vedar a Placa de Reação Ótica de 96 Poços da Abbott depois de o instrumento m2000sp da Abbott ter concluído a adição de amostras e a mistura principal, de acordo com o Manual de Operações de m2000sp da Abbott, seção de Instruções de Operações.
[067] 12. Colocar a placa de reação ótica vedada na Base de Suporte Livre de Respingo da Abbott para transferência ao instrumento m2000rt da Abbott.
[068] 13. Colocar a Placa de Reação Ótica de 96 Poços Abbott no instrumento Abbott m2000rt. A partir da tela de Protocolo, selecionar o arquivo de aplicação de carga viral de HIV-1 DBS. Iniciar o protocolo, conforme descrito no Manual de operações de m2000rt da Abbott, seção de Instruções de Operações.
[069] 14. DNase pode ser adicionada a um ou mais entre a amostra eluída, os reagentes de PCR e a reação de PCR concluída depois da adição dos reagentes de PCR à amostra eluída, se considerado necessário pelo operador. Reagen-tes/tampões de reação de DNase e reagentes/tampões de desativação não são necessários.
RESULTADOS
[070] A concentração de RNA do HIV-1 viral em uma amostra ou controle é calculada a partir da curva de calibração armazenada. O instrumento Abbott m2000rt automaticamente informa os resultados na estação de trabalho Abbott m2000rt. Os resultados do ensaio podem ser relatados em cópias/ml, log [cópias/ml], Unidades Internacionais (IU)/mL, ou log [IU/mL]. Para a interpretação dos resultados, veja a Tabela 1, abaixo.
Figure img0001
Figure img0002
a ULQ = limite superior de quantificação
*Para o Arquivo AppSpec da pesquisa (v4 ou mais alto), todas as amostras detectadas serão relatadas com um resultado VL. O LOD real será fornecido depois de estudo de verificação. Uma vez que o valor LOD de verificação é obtido, os resultados “Detectados” serão separados em duas categorias:
1). “Detectado” 2). “Detectado, < valor LOD”.
Exemplo 2
[071] A exemplificação mostra as características de projeto que permitem que o procedimento de ensaio DBS automatizado da presente invenção possa trabalhar com eficácia e sensibilidade aperfeiçoadas sobre os métodos da técnica anterior.
[072] Os procedimentos envolvem as seguintes etapas:
  • 1. DBS é separado a partir do cartão DBS.
  • 2. DBS é incubado em um tampão de tratamento.
  • 3. O vaso de reação contendo o DBS no tampão é carregado no sistema ro-bótico automatizado (por exemplo, o Abbott m2000sp).
  • 4. O sistema robótico é conduzido por um roteiro para processar a amostra de DBS através do processo de extração de ácido nucleico para manejar diretamente o tubo onde DBS foi incubado sem intervenção manual.
  • 5. Depois da extração de ácido nucleico, o sistema robótico forma a mistura principal de PCR (isto é, a reação de PCR concluída sem os ácidos nucleicos alvos). Alternativamente, esta etapa pode ser anulada se a mistura principal de PCR foi formada a priori e carregada no sistema.
  • 6. O sistema robótico forma a reação de PCR concluída combinando os ácidos nucleicos extraídos obtidos no final da Etapa 4 com a mistura principal de PCR obtida no final da Etapa 5.
  • 7. Ciclização por PCR e redução/resultado de dados relatados são realizados em um instrumento analítico (por exemplo, instrumento PCR em tempo real, tal como o Abbott m2000rt).
  • 8. Se desejado pela aplicação específica, DNase é adicionada a e incubada com os ácidos nucleicos extraídos obtidos da Etapa 4 para eliminar/reduzir teor de DNA. Em um tal caso, os ácidos nucleicos tratados com DNase serão ainda processados partindo da Etapa 6. Alternativamente, DNase pode ser adicionada aos reagentes de PCR antes de ou durante a formação da mistura principal de PCR. Além disso, alternativamente, DNase pode ser formulada nos reagente(s) PCR. Em um tal caso, a mistura principal de PCR contendo DNase será assim processada partindo da Etapa 6. Durante a Etapa 6, DNase é distribuída para cada amostra pelo sistema robótico, anulando a distribuição manual de DNase. Além disso, uma incubação de tratamento com DNase pode ser necessária depois da Etapa 6 antes da Etapa 7.
Nota: Uma aplicação específica onde o uso de DNase pode ser desejado é PCR específico do RNA do HIV onde a interferência a partir do DNA pró-viral pode ser eliminada/reduzida.
[073] As tecnologias que permitem os procedimentos de ensaio e desempenho de ensaio acima incluem:
  • 1. O tampão de tratamento que elui ácido nucleico de DS/DBS com alta eficácia. Esta divulgação inclui o uso de tampão mWash 1 de Abbott (3,5 M de GITC; Tween 20 a 5%; 50 mM de KOAc, pH 6,0) como o tampão de tratamento/eluição DBS. Nota: Abbott tem previamente fornecido um protocolo VL DBS de HIV comercial e um ensaio DBS Qualitativo de HIV de CE-IVD comercial que usa tampão mLysis de Abbott como o tampão de tratamento (4,66 M de GITC; Tween 20 a 10%; 100 mM de Trizma, pH 7,8). Uma comparação destes dois procedimentos é fornecida abaixo e mostra a superioridade inesperada do procedimento da presente invenção.
  • 2. Os parâmetros de roteiro que permitem o sistema de pipeta robótico para transferir o líquido diretamente a partir do tubo contendo material DBS sólido para ainda processar em uma maneira robusta e exata enquanto deixando para trás um volume morto de <300 μΙ no tubo depois da transferência líquida.
  • 3. O uso de DNase que eficazmente degrada DNA nos ácidos nucleicos extraídos sem incluir tampões de reação de DNase específicos.
  • 4. O uso de DNase com a propriedade como descrita no item 3 que eficazmente degrada DNA na temperatura ambiente.
  • 5. O uso de DNase com as propriedades como descritas nos itens 3 e 4 que eficazmente degradam DNA dentro do período de tempo de 30 minutos.
  • 6. O uso de DNase com as propriedades como descritas nos itens 3 - 5 que não precisam ser inativadas com introdução de reagentes ou temperaturas elevadas.
  • 7. O uso de DNase que eficazmente degrada DNA na reação de PCR quando DNase foi introduzida a reagentes de PCR antes de exposição a ácidos nucleicos extraídos ou é introduzido durante a formação da reação de PCR.
  • 8. O uso de DNase com a propriedade como descrita no item 7 sem incluir tampão de reação DNase específico.
  • 9. O uso de DNase com as propriedades como descritas nos itens 7 e 8 que eficazmente degradam DNA na temperatura ambiente ou temperaturas durante vários estágios de ciclização de PCR.
  • 10. O uso de DNase com as propriedades descritas nos itens 7 a 9 que eficazmente degradam DNA dentro do período de tempo de 10 minutos. Preferivelmente, no caso onde temperaturas durante vários estágios de ciclização de PCR podem suportar função DNase, o tratamento DNase não requer tempo ou estágio(s) de ciclização adicional(s) para além dos quais são incluídos na ciclização de PCR.
  • 11. O uso de DNase com propriedades como descritas nos itens 7 a 10 que não precisam ser inativadas com introdução de reagentes ou temperaturas elevadas antes de e durante PCR.
  • 12. O uso de DNase e associada às condições de tratamento DNase nos itens 3 a 11 que não impactam negativamente a detecção de sequências de RNA.
  • 13. O uso do ajuste de “volume de PCR” (como um parâmetro de ciclização térmica) a ser menor do que o volume de real de PCR. Este ajuste elimina o efeito de “borda” observado em uma placa de PCR completa, que impacta negativamente a sensibilidade quando comparada com uma condução em uma placa de PCR parcial. O efeito de “borda” como observado com algum estado dos ciclizadores de PCR da técnica de tempo real é causado pela ultrapassagem da temperatura pela unidade de controle térmico. O ajuste de volume de PCR menor leva ao controle térmico mais lento e mais exato, desse modo aliviando a maioria da ultrapassagem da temperatura.
  • 14. O corte da reação de PCR é determinado por um de habilidade na técnica como ao que é apropriado para a amostra alvo de DS/DBS específico.
[074] Detalhes de uma exemplificação das tecnologias da presente invenção:
1. A transferência robótica de líquido de tubos contendo DBS consiste nas seguintes etapas:
  • • O DBS é empurrado para o fundo do tubo de entrada da amostra por uma ponta descartável usando um algoritmo “Detecta o Fundo do Tubo”.
  • • A ponta descartável é lentamente retraída por uma distância pequena (por exemplo, 3 mm) a partir do fundo do tubo de entrada da amostra e uma aspiração de volume pequeno (por exemplo, 50 μΙ) é realizada para verificar que o DBS não está interferindo com a ponta descartável. Depois que a aspiração de volume pequeno é concluída, a ponta descartável é retraída a um ponto acima da superfície do líquido.
  • • Usando a mesma ponta descartável, a superfície do líquido é detectada e uma aspiração de seguimento de volume parcial (por exemplo, 450 μΙ para obter 1 mL) é realizada daquele local. Depois que a primeira aspiração de volume parcial é concluída, o líquido contido na ponta descartável é transferido a um tubo de reação para etapas de extração de ácido nucleico adicionais.
  • • Estas etapas são repetidas para obter o volume de transferência de amostra total.
2. DNases exemplares que eficazmente degradem DNA quando usadas em conjunto com os métodos e composições da presente invenção quando adicionados a ácidos nucleicos extraídos (sem impactar negativamente detecção de RNA) na ausência de tampões de reação de DNase específicos e que não necessitam ser inativadas com introdução de reagentes ou temperaturas elevadas são:
  • • Promega (Madison, Wl) Dnase livre de RNase de RQ1 (Cat # M6101); 2U/reação; Temperatura ambiente; 30 minutos.
  • • Ambion (Grand Island, NY) DNase I (Livre de RNase) (Cat # AM2222); 2U/reação; Temperatura ambiente; 30 minutos.
  • • Roche (Basel, Suiça) recombinante DNase I, Livre de RNase (Cat # 04716728001); 20U/reação; Temperatura ambiente; 30 minutos.
  • • Outras DNases adequadas podem ser conhecidas a e podem ser identificadas por uma pessoa de habilidade comum na técnica usando os métodos descritos neste relatório sem experimentação indevida. A presente invenção não é limitada a qualquer DNase específica desde que cumpra os padrões listados neste pedido. Os ensaios descritos nas figuras abaixo são exemplares apenas e não servem para limitar a invenção a qualquer DNase particular ou qualquer método particular de triagem.
[075] Referir-se à Figura 1 para uma DNase que eficazmente removeu DNA e não impactou negativamente os sinais de RNA. Figura 1 mostra ácido nucleico eluí-do extraído de pontos de sangue seco positivo para HIV tratados com DNase antes de combinar com reagentes de PCR (linhas tracejadas) em comparação com controle (nenhum tratamento de DNase, linhas cheias). Os ácidos nucleicos foram, em seguida, avaliados com uma PCR em tempo real de beta globina para o sinal de DNA de beta globina e uma RT-PCR em tempo real para HIV-1 para os sinais de RNA de HIV e IC, a) sinal de DNA de Beta globina, para demonstrar efetividade de tratamento de DNase, b) sinal de RNA de HIV, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase, c) sinal de RNA de IC, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase. Condições usado para tratamento de DNase: Ambion DNase 1 (Livre de RNase) (Cat # AM2222); 2U/reação; temperatura ambiente; 30 minutos.
[076] Referir-se à Figura 2 para uma DNase que não removeu eficazmente o DNA e não impactou negativamente os sinais de RNA. A Figura 2 mostra ácido nu-cleico eluído extraído de pontos de sangue seco positivo para HIV tratados com DNase antes de combinar com reagentes de PCR (linhas tracejadas) em comparação com controle (nenhum tratamento de DNase, linhas cheias). Os ácidos nucleicos foram, em seguida, avaliados com uma PCR em tempo real de beta globina para o sinal de DNA de beta globina e uma RT-PCR em tempo real para HIV-1 para os sinais de RNA de HIV e IC, a) sinal de DNA de Beta globina, para demonstrar efetividade de tratamento de DNase, b) sinal de RNA de HIV, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase, c) sinal de RNA de IC, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase. Condições usadas para tratamento de DNase: DNase I de New England Biolabs (Livre de RNase) (Cat # MO303S); 2U/reação; temperatura ambiente; 30 minutos.
[077] Referir-se à Figura 3 para uma DNase que eficazmente removeu DNA e negativamente impactou sinais de RNA. A Figura 3 mostra ácido nucleico eluído extraído de pontos de sangue seco positivo para HIV tratados com DNase antes de combinar com reagentes de PCR (linhas tracejadas) em comparação com controle (nenhum tratamento de DNase, linhas cheias). Os ácidos nucleicos foram, em seguida, avaliados com uma PCR em tempo real de beta globina para o sinal de DNA de beta globina e uma RT-PCR em tempo real para HIV-1 para os sinais de RNA de HIV e IC, a) sinal de DNA de Beta globina, para demonstrar efetividade de tratamento de DNase, b) sinal de RNA de HIV, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase, c) sinal de RNA de IC, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase. Condições usado para tratamento de DNase: Sigma-Aldrich DNase 1 (Grau de Amplificação) (Cat # AMPD1); 2U/reação; temperatura ambiente; 30 minutos.
3. DNases exemplares que eficazmente degradam DNA na reação de PCR (sem negativamente impactar detecção de RNA) quando DNase foi introduzida a reagentes de PCR antes de exposição a ácidos nucleicos extraídos ou é introduzida durante a formação da reação de PCR são:
  • • Promega Dnase livre de RNase de RQ1 (Cat # M6101); 2U/reação; Temperatura ambiente; 10 minutos
  • • Ambion DNase I (Livre de RNase) (Cat # AM2222); 2U/reação; Temperatura ambiente; 30 minutos
  • • Outras podem ser conhecidas a um de habilidade comum na técnica e podem ser identificadas usando os métodos descritos neste relatório sem experimentação indevida. A presente invenção não é limitada a qualquer DNase específica desde que cumpra os padrões listados neste pedido. Os ensaios descritos nas figuras abaixo são exemplares apenas e não servem para limitar a invenção a qualquer Dnase particular.
[078] Referir-se à Figura 4 para uma DNase que eficazmente removeu DNA e não impactou negativamente os sinais de RNA. Em Figura 4, DNase foi adicionada aos reagentes de PCR que foram subsequentemente combinados em mistura principal de PCR (linha tracejada). Como o controle, DNase não foi adicionada aos reagentes de PCR (linha cheia). Os ácidos nucleicos extraídos foram, em seguida, avaliados pela mistura principal de PCR onde sinal de DNA de beta globina, e HIV e sinal de RNA de ICs são detectados, a) sinal de DNA de Beta globina, para demonstrar efetividade de tratamento de DNase, b) sinal de RNA de HIV, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase, c) sinal de RNA de IC, para demonstrar o impacto de tratamento de DNase. Condições usadas para tratamento de DNase:
[079] Promega Dnase livre de RNase de RQ1 (Cat # M6101); 2U/reação; temperatura ambiente; 10 minutos.
[080] A Abbott forneceu previamente um protocolo da técnica anterior. Este protocolo foi otimizado para modo de abertura de VL de DBS para HIV-1 inicial (veja tabela abaixo). O protocolo de modo de abertura inicial foi ainda otimizado para modo de abertura atual e para desenvolvimento do produto CE. Tabela 2 abaixo mostra as diferenças entre o protocolo da técnica anterior, protocolo do modo de abertura inicial e ainda protocolo aperfeiçoado. As letras “CE” são a abreviação de frase Francesa “Conformite Europeene” que literalmente significa “Conformidade Europeia”.
Figure img0003
Figure img0004
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[081] As mudanças no ensaio, conforme detalhado na Tabela 2, resultam em um vasto, inesperado e surpreendente aperfeiçoamento sobre o método da técnica anterior. Tabela 3 mostra a sensibilidade aumentada obtida pelo método da presente invenção. O nível alvo associado com 100% de detecção diminuída de 10.000 cópias por ml no ensaio da técnica anterior a 2.000 cópias por ml quando do uso dos métodos da presente invenção.
Tabela 3 - Veja a tabela abaixo para a comparação da invenção do protocolo do modo de abertura (RT para condição de eluição de DBS de 20 minutos.) com o protocolo da técnica anterior em sensibilidade detecção.
Figure img0006
Figure img0007
Exemplo 3 ESTUDOS REALIZADOS PARA APERFEIÇOAMENTO DO ENSAIO DE SENSIBILIDADE E ROBUSTEZ
[082] Com o ensaio de modo de abertura inicial, aproximadamente 2 - 3% de amostras de estudo internas e > 5% amostras de estudo externas tiveram erros m2000rt 4450 ou 4442 e, em seguida, foram inválidas. Foi determinado que guanidi-na residual levada à frequência aumentada de inibição e os erros 4450 e 4442. O Arquivo de Especificação de Aplicação de HIV-1 DBS foi modificado para reduzir a quantidade e frequência de acúmulo de guanidina. Reduzindo a velocidade de retração durante remoção de resíduos reduz a dispersão de qualquer suspensão de gotas a partir das pontas da pipeta. Visto que a amostra de DBS está presente em tampão de Lavagem 1 (Tampão de eluição DBS) com 1 ml como entrada de amostra, o volume de tampão de lise na reação pode ser reduzida de 2400 a 1600 μΙ, reduzindo a quantidade de GITC presente em cada reação. A eficácia de lavagem foi aumentada aumentando o volume de Lavagem 2 de 700 a 750 μΙ. Implementando estas mudanças reduz a frequência de erros 4450 e 4442 a aproximadamente 0,2% (Dado não mostrado). Esta otimização significantemente melhorou a robustez do ensaio.
[083] A sensibilidade de ensaio pode ser aperfeiçoada aumentando a entrada de amostra usando dois DBS de 70 μ! (ponto de sangue seco) por paciente para teste. Os dados de avaliação (dados não mostrados) sugeriram que na eluição na temperatura ambiente, dois DBS comparados a um DBS melhoraram a taxa de detecção final baixa de HIV. À condição de eluição de 55 °C por 30 minutos, o aperfeiçoamento em baixa taxa de detecção de concentração de HIV de dois DBS comparados a um DBS não foi como distinto.
[084] O ensaio de sensibilidade também pode ser aperfeiçoado aumentando eficácia de eluição. Uma comparação direta de eluição na temperatura ambiente por 20 minutos e eluição a 55 °C por 30 minutos foi realizada. Os resultados (Figura 5) sugeriram que tanto Ct (limite de ciclo) quanto MR (razão máxima) foram aperfeiçoados significantemente aumentando a temperatura à 55 °C por 30 minutos. A temperatura a 55 °C e temporização foram guardadas em banda (Figuras 6 e 7, respectivamente). Os resultados (Figura 6) mostraram que temperaturas mais altas do que 60 °C resultaram em valores de MR menores. Em geral, o MR mais alto foi a 55 °C. Figura 7 mostrou que trinta minutos a 55 °C foi necessário para eluição de DBS mais eficiente. Depois de incubação a 55 °C por 30 minutos, incubação adicional à temperatura ambiente por até 24 horas não afetou os resultados de PCR. Além disso, uma comparação de material de RNA recuperado de DBS comparado ao sangue total diretamente reforçado ao tampão de amostra foi conduzido entre a temperatura ambiente por 20 minutos e 55 °C por 30 minutos. Os resultados mostraram que a condição de eluição a 55 °C aumentou a recuperação por aproximadamente 10% comparada à condição de eluição à temperatura ambiente (Tabela 4). Agitação contínua da amostra de DBS em tampão foi combinada com a condição de eluição à 55 °C . Os resultados mostraram ligeiro aperfeiçoamento na baixa recuperação de HIV de DBS; o aperfeiçoamento não foi estatisticamente significante (dados não mostrados).
Figure img0008
Figure img0009
[085] O aperfeiçoamento em porcentagem de recuperação como comparada ao sangue total quando o DBS foi eluído a 55 °C por 30 minutos versus temperatura ambiente por 20 minutos foi observado ser aproximadamente 10%.
[086] Uma avaliação de sensibilidade analítica preliminar foi conduzida para estimar a sensibilidade usando um Virológico de Garantia de Qualidade (VQA) painel de diluição de HIV-1 (lote painel #2) a 55 °C por 30 minutos. Também foi testado usando HIV-1 inativado de SeraCare que foi quantificado usando 3 lotes de calibradores. Os calibradores usados para quantificação foram quantificados usando um painel de diluição de HIV-1 de VQA (lote painel #1). Os resultados são mostrados na Tabela 5. A estimativa de LOD é aproximadamente 800 cópias/mL.
Figure img0010
*HIV-1 inativado de SeraCare que foi quantificado usando 3 lotes de calibrador, que foram quantificados de VQA1.
[087] Correntemente existem múltiplos cartões de papel DBS comercialmente disponíveis. É importante mostrar se os desempenhos são comparáveis. Um estudo foi conduzido para a comparação lado a lado dos cartões de papel DBS por 3 fornecedores diferentes. Múltiplos lotes de cartões de papel foram usados se disponíveis. Os resultados estão resumidos na Tabela 6. O desempenho baseado na baixa concentração de HIV Ct, MR e taxa de detecção foram similares. As diferenças não foram estatisticamente significantes.
Figure img0011

Claims (11)

  1. Método automatizado para detectar ácidos nucleicos de HIV-1 em uma amostra de sangue, o método CARACTERIZADO pelo de que compreende:
    • a) fornecer: i) uma amostra de sangue suspeita de estar infectada com HIV seca em um veículo sólido, ii) um tampão de eluição, iii) um instrumento de preparação de amostra programável e automatizado, iv) um instrumento de PCR programável e automatizado, v) DNase e vi) reagentes de PCR adequados para detectar ácidos nucleicos de HIV-1;
    • b) eluir a amostra de sangue a partir do veículo sólido com o tampão de eluição para criar uma amostra eluída;
    • c) carregar automaticamente a amostra eluída no instrumento de preparação de amostra automatizado e programável para extração e purificação adicionais de ácido nucleico para criar uma amostra processada;
    • d) carregar os reagentes de PCR no instrumento de PCR programável e automatizado;
    • e) iniciar um programa automatizado para colocar em alíquotas os reagentes de PCR na amostra processada;
    • f) realizar a PCR nos ácidos nucleicos extraídos na amostra processada com o instrumento de PCR programável e automatizado;
    • g) analisar os resultados da PCR gerados pelo instrumento de PCR programável e automatizado para determinar se quaisquer amostras compreendem ácidos nucleicos de HIV-1;
    • h) em que, o dito tampão de eluição compreende aproximadamente 3,5 M de GITC, aproximadamente 5% de polissorbato 20, aproximadamente 50 mM de KOAc em aproximadamente pH 6,0;
    • i) em que, opcionalmente, a DNase é adicionada a um ou mais entre a amostra processada, os reagentes de PCR ou a reação de PCR completa depois da adição dos reagentes de PCR à amostra processada.
  2. Método, de acordo com a reivindicação 1, o método CARACTERIZADO pelo de que compreende ainda controles negativos e positivos.
  3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que a etapa b) é de cerca de 20 minutos em temperatura ambiente.
  4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo de que a etapa b) é realizada com mistura suave intermitente.
  5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que a etapa b) é de cerca de 30 minutos a cerca de 55 °C.
  6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo de que a etapa b) é realizada com mistura suave intermitente.
  7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que o dito procedimento automatizado é programado por comandos de software.
  8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que a etapa i) é realizada e a dita DNase não exige tampões de reação de DNase específico, é eficaz em temperatura ambiente ou temperaturas usadas durante os estágios de ciclização de PCR, degrada eficazmente o DNA no período de tempo de 30 minutos, não precisa ser inativada depois de degradar eficazmente o DNA e não causa impacto negativo na detecção de sequências de RNA.
  9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que o dito veículo sólido é filtro de papel.
  10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que o dito ácido nucleico é RNA.
  11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo de que o dito ácido nucleico é DNA pró-viral.
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