ES2218067T3 - Cebadores oligonucleotidos para la deteccion multiple eficaz del virus de la hepatitis c (vhc) y del virus de la inmunodeficienci humana (vih) y procedimiento de uso de los mismos. - Google Patents
Cebadores oligonucleotidos para la deteccion multiple eficaz del virus de la hepatitis c (vhc) y del virus de la inmunodeficienci humana (vih) y procedimiento de uso de los mismos.Info
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Abstract
Un procedimiento para codetectar el ARN del virus de la hepatitis C (VHC) y el ARN del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento: (A) realizar una reacción de transcripción inversa usando ARN procedente de dicha muestra como molde y al menos un cebador de transcripción inversa que cebará la transcripción inversa del ADN a partir del ARN del VHC, y al menos un cebador de transcripción inversa que cebará la transcripción inversa del ADN a partir del ARN del VIH, para producir productos de transcripción inversa que comprenden: (a) productos de transcripción inversa específicos del VHC, (b) productos de transcripción inversa específicos del VIH, o (c) una combinación de (a) y (b); (B) amplificar dichos productos de transcripción inversa usando uno o más pares de cebadores oligonucleótidos específicos para la región 5¿ no codificante del VHC y uno o más pares de cebadores oligonucleótidos específicos para el VIH para producir productos de amplificación que comprenden (a) productos de amplificación específicos del VHC, (b) productos de amplificación específicos del VIH, o (c) una combinación de (a) y (b) y (C) detectar dichos productos de amplificación; en el que la detección de los productos de amplificación específicos para VHC indica la presencia de ARN de VHC en dicha muestra, la detección de los productos de amplificación específicos para VIH indica la presencia ARN de VIH en la muestra, y la detección de los productos de amplificación específicos para VHC y de los productos de amplificación específicos para VIH indica la presencia de ARN de VHC y de ARN de VIH en dicha muestra.
Description
Cebadores oligonucleótidos para la detección
múltiple eficaz del virus de la hepatitis C (VHC) y del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) y procedimientos de uso de los
mismos.
La presente invención trata de procedimientos
mejorados para detectar secuencias de ácido nucleico en muestras
biológicas, particularmente secuencias procedentes de
microorganismos infecciosos.
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
infecta a millones de individuos en todo el mundo, y por lo tanto,
representa una seria preocupación sobre la salud pública. La
propagación de la infección por VIH a través de productos sanguíneos
contaminados significa que hay una necesidad de procedimientos de
filtrado que puedan detectar pequeñas cantidades de ARN de VIH en
muestras de pacientes. Adicionalmente, la creciente disponibilidad
de tratamientos paliativos para la infección por VIH significa que
la temprana detección de una infección en un paciente es vital con
objeto de iniciar las intervenciones terapéuticas adecuadas.
El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus
transmitido por vía parenteral, responsable de la mayoría de los
casos de hepatitis post-transfusional y de una parte
sustancial de los casos de hepatitis esporádicos (o adquiridos en
una comunidad) en todo el mundo. Se estima que más del 1% de la
población mundial está infectada por el VHC. La infección por el VHC
está asociada con hepatitis aguda, hepatitis crónica, cirrosis y el
subsiguiente carcinoma hepatocelular.
El VHC está clasificado actualmente como un
género aparte, Hepacivirus, en la familia
Flaviviridae. Su genoma consiste en una molécula de ARN de
hebra positiva de aproximadamente 9.500 nucleótidos con un marco
abierto de lectura (ORF) único y grande que codifica un precursor de
una poliproteína de aproximadamente 3.000 aminoácidos. El gran ORF
está precedido por una región 5' no codificante (NC) de
aproximadamente 340 nucleótidos, que es la región más altamente
conservada del genoma. La región 5' del ORF codifica (en dirección
5' hacia 3') una proteína de la cápside, dos glucoproteínas de la
cubierta (E1 y E2) y una pequeña proteína de función desconocida
(P7). La porción 3' del ORF codifica proteínas no estructurales que
incluyen una proteasa, una proteína bifuncional proteasa/helicasa,
una ARN polimerasa y péptidos reguladores.
El análisis de las secuencias codificantes del
VHC de todo el mundo ha revelado una considerable variación de la
secuencia entre virus individuales aislados. Adicionalmente, los
análisis de las secuencias del VHC de pacientes individuales ha
mostrado que el virus circula en forma de las denominadas
"cuasi-especies", que contienen secuencias
relacionadas pero no idénticas. La variación que existe entre los
aislados y entre los pacientes individuales se cree que es el
resultado de la baja fidelidad de la ARN polimerasa dependiente de
ARN codificada por el virus. El grado de variabilidad genética del
VHC tiene importantes implicaciones en la prevención, el diagnóstico
y el control de la infección.
El serodiagnóstico de la infección por VHC se
determina típicamente mediante
enzimo-inmuno-ensayos (EIE)
disponibles comercialmente que detectan anticuerpos que se unen a
proteínas o péptidos recombinantes del VHC. Un resultado positivo
del EIE puede ser confirmado mediante un ensayo de
inmunotransferencia recombinante (RIBA), pero ni los ensayos de EIE
ni de RIBA distinguen infecciones anteriores de las actuales. Debido
al título típicamente bajo de virus circulantes, no se ha
desarrollado un ensayo directo para las proteínas víricas.
Adicionalmente, los ensayos basados en anticuerpos generalmente no
logran detectar la infección por VHC durante los 2 a 3 meses
siguientes a la exposición.
McDonough y col., Infusionstherapie Und
Transfusionsmedizin, 25: 164-169 (1998), describen
un ensayo de alto rendimiento para la detección simultánea o por
separado de VIH y VHC. Giachetti y col., Transfusion 38: S261
(octubre de 1998) discuten sobre un ensayo múltiple
VIH-1/VHC. Nedjar y col., Virological Methods
35: 297-304 (1991) enseñan la coamplificación de
secuencias específicas de VHC y VIH-1 mediante PCR
como una herramienta potencial para la detección simultánea de
VIH-1 y VHC. Gonzales-Villaseñor
y col., Clinical Chemistry 51(11): 9 (1995) describen
un ensayo múltiple basado en RT-PCR para
VLTH-I/II, VIH-1, VHC y VHB.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección simultánea de la presencia del ARN del virus de la
hepatitis C (VHC) y del ARN del virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) en una muestra biológica usando un ensayo múltiple.
Así, en un aspecto, la invención está dirigida a
un procedimiento para codetectar el ARN del virus de la hepatitis C
(VHC) y el ARN del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en una
muestra biológica. El procedimiento comprende:
(A) realizar una reacción de transcripción
inversa usando ARN procedente de la muestra como molde y al menos un
cebador de transcripción inversa que cebará la transcripción inversa
del ADN a partir del ARN del VHC, y al menos un cebador de
transcripción inversa que cebará la transcripción inversa del ADN a
partir del ARN del VIH, para producir productos de transcripción
inversa que comprenden (a) productos de transcripción inversa
específicos del VHC, (b) productos de transcripción inversa
específicos del VIH, o (c) una combinación de (a) y (b);
(B) amplificar los productos de transcripción
inversa usando uno o más pares de cebadores oligonucleótidos
específicos para la región 5' no codificante del VHC y uno o más
pares de cebadores oligonucleótidos específicos para el VIH para
producir productos de amplificación que comprenden (a) productos de
amplificación específicos del VHC, (b) productos de amplificación
específicos del VIH, o (c) una combinación de (a) y (b);
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VHC consisten en:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 1>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 2>;
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH-1 consiste
en un cebador hacia delante con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo que consiste en:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>, y
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5), y en el que cada uno de los pares de
cebadores oligonucleótidos específicos para el VIH-2
consiste en un cebador hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia:
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>; y
(C) detectar los productos de amplificación, en
el que la detección de los productos de amplificación específicos
para VHC indica la presencia de ARN de VHC en la muestra, la
detección de los productos de amplificación específicos para VIH
indica la presencia de ARN de VIH en la muestra, y la detección de
los productos de amplificación específicos para VHC y de los
productos de amplificación específicos para VIH indica la presencia
de ARN de VHC y de ARN de VIH en la muestra.
En un segundo aspecto, la invención está dirigida
a un procedimiento para coamplificar el ADN del virus de la
hepatitis C (VHC) y el ADN del virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH). El procedimiento comprende:
(A) realizar una reacción en cadena de la
polimerasa sobre una muestra de ADN sospechosa de contener ADN de
VHC, ADN de VIH o una combinación de ADN de VHC y ADN de VIH, usando
uno o más pares de cebadores oligonucleótidos específicos para la
región 5' no codificante del VHC y uno o más pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH para producir productos de
amplificación que comprenden (a) productos de amplificación
específicos para VHC, (b) productos de amplificación específicos
para VIH, o (c) una combinación de (a) y (b);
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VHC consisten en:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 1>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 2>;
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH-1 consiste
en un cebador hacia delante con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo que consiste en:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>, y
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5), y en el que cada uno de los pares de
cebadores oligonucleótidos específicos para el VIH-2
consiste en un cebador hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia:
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>.
\newpage
Preferiblemente, el procedimiento anteriormente
descrito para codetectar el ARN del virus de la hepatitis C (VHC) y
el ARN del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) comprende:
(A) realizar una reacción de transcripción
inversa usando adicionalmente un ARN de control positivo interno
(CPI) como molde y al menos un cebador de transcripción inversa que
cebará la transcripción inversa del ADN a partir del ARN de CPI para
producir productos de transcripción inversa que comprenden productos
de transcripción inversa específicos para el CPI;
(B) amplificar los productos de transcripción
inversa usando adicionalmente uno o más pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el CPI para producir productos de
amplificación que comprenden productos de amplificación específicos
para el CPI;
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el CPI comprenden:
(i) un cebador hacia delante
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
(IPCF1) <SEC ID Nº 8>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
(IPCR1) <SEC ID Nº 9>;
(C) detectar los productos de amplificación, en
el que la detección de los productos de amplificación específicos
para CPI indica la presencia de ARN de CPI en la muestra.
Preferiblemente, el procedimiento anteriormente
descrito para coamplificar el ADN del virus de la hepatitis C (VHC)
y el ADN del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
comprende:
(A) realizar la reacción en cadena de la
polimerasa sobre una muestra de ADN que contiene adicionalmente ADN
de CPI y uno o más pares de cebadores oligonucleótidos específicos
para el CPI para producir productos de amplificación que comprenden
productos de amplificación para el CPI;
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el CPI comprenden:
(i) un cebador hacia delante
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
(IPCF1) <SEC ID Nº 8>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
(IPCR1) <SEC ID Nº 9>.
Los procedimientos para la detección de la
amplificación incluyen, sin limitaciones, (a) la electroforesis y
(b) la captura de los productos de la amplificación sobre un soporte
sólido al que están unidos sondas específicas para CPI, VHC o VIH,
seguida de la cuantificación de los productos unidos usando un
ensayo de colorimetría. Las sondas de captura específicas para CPI
útiles incluyen, sin limitaciones,
5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'
<SEC ID Nº 17>. Las sondas de captura específicas 5' para VHC
útiles incluyen, sin limitaciones,
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
<SEC ID Nº 12>. Las sondas de captura específicas para VIH
útiles incluyen, sin limitaciones,
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3' <SEC
ID Nº 13> y las sondas de captura específicas para
VIH-2 útiles incluyen, sin limitaciones,
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
<SEC ID Nº 14>.
En otro aspecto, la invención está dirigida a un
equipo para codetectar ARN de VHC y ARN de VIH en una muestra
biológica. El equipo comprende:
(a) un par de cebadores oligonucleótidos
específicos para la región 5' no codificante del VHC que consiste en
s en:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 1>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 2>;
(b) cebadores oligonucleótidos específicos para
el VIH-1 que consisten en un cebador hacia delante
con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo que consiste en:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>, y
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5), y (c) cebadores oligonucleótidos
específicos para el VIH-2 que consisten en un
cebador hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia:
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>.
En otro aspecto más, la invención está dirigida a
un equipo para coamplificar el ADN del VHC y el ADN del VIH en una
muestra de ADN. El equipo comprende:
(a) un par de cebadores oligonucleótidos
específicos para la región 5' no codificante del VHC que consiste en
s en:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 1>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 2>;
(b) cebadores oligonucleótidos específicos para
el VIH-1 que consisten en un cebador hacia delante
con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo que consiste en:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>,
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5), y (c) cebadores oligonucleótidos
específicos para el VIH-2 que consisten en un
cebador hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia:
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>.
Los presentes inventores han descubierto que
puede conseguirse la detección simultánea de bajos niveles de ARN
del virus de la hepatitis C (VHC) y de ARN del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) en muestras biológicas que contienen
ARN de VHC y de VIH en un ensayo múltiple mediante (i) realizar una
reacción de transcripción inversa sobre el ARN procedente de la
muestra y (ii) amplificar los productos de la transcripción inversa
usando pares de oligonucleótidos particulares con secuencias
complementarias de ciertas secuencias presentes en el ARN del VHC y
del VIH. La presente invención proporciona así ensayos múltiples de
transcripción inversa/amplificación de un solo paso mejorados que
detectan bajos niveles de copia del ARN del VHC y del VIH en las
mismas muestras.
Los cebadores oligonucleótidos se eligen
basándose en consideraciones de conservación de la secuencia, las
interacciones intra e intermoleculares y las estructuras secundarias
predichas para el amplicón y la secuencia circundante.
Adicionalmente, los cebadores y el sistema de ensayo están diseñados
para permitir la coamplificación (y la codetección) de regiones
múltiples de los genomas del VHC y del VIH, de especies víricas
múltiples y de un ARN (o ADN) de control positivo interno (CPI). La
amplificación/detección simultánea de regiones múltiples de genomas
víricos aumenta la sensibilidad del ensayo, y la coamplificación de
un CPI disminuye la probabilidad de falsos negativos por inhibición
de la PCR.
En la práctica de la presente invención se usan
muchas técnicas de biología molecular, microbiología, ADN
recombinante y bioquímica de proteínas, tales como las explicadas
en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology,
volúmenes I, II y III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook y
col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
segunda edición, Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York; DNA Cloning: A Practical Approach,
volúmenes I y II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide
Synthesis, 1984, (M. L. Gait ed.); Transcription and
Translation, 1984 (Hames y Higgins eds.); A Practical Guide
to Molecular Cloning; la serie Methods in Enzimology
(Academic Press, Inc.); y Protein Purification: Principles and
Practice, segunda edición (Springer-Verlag, N.
Y.).
"Ácido nucleico" o "polinucleótido",
según se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a
polímeros que contienen purinas y pirimidinas de cualquier longitud,
tanto polirribonucleótidos como polidesoxirribonucleótidos o
polirribo-polidesoxirribonucleótidos mezclados. Esto
incluye moléculas de ADN de hebra simple y doble, tales como, por
ejemplo, híbridos ADN-ADN, ADN-ARN y
ARN-ARN, así como "ácidos nucleicos proteicos"
(ANP) formados por bases conjugadas con un esqueleto de aminoácidos.
Esto también incluye ácidos nucleicos que contienen bases
modificadas.
Un "complemento" de una secuencia de ácido
nucleico, según se usa en la presente memoria descriptiva, se
refiere a la secuencia antisentido que participa en el apareamiento
de bases de Watson-Crick con la secuencia
original.
Un "cebador", según se usa en la presente
memoria descriptiva, es un oligonucleótido aislado de entre
aproximadamente 5 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud,
preferiblemente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 25
nucleótidos de longitud, y muy preferiblemente de entre
aproximadamente 6 y aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, que
forma una estructura doble con una secuencia monocatenaria de ácido
nucleico de interés, y permite la polimerización de una hebra
complementaria usando, por ejemplo, una transcriptasa inversa o una
ADN polimerasa.
Un ácido nucleico "aislado", según se usa en
la presente memoria descriptiva, se refiere a un componente que es
extraído de su entorno original (por ejemplo, su entorno natural, si
se encuentra de forma natural, o de una mezcla de reacción, si es
sintético). Un ácido nucleico aislado contiene típicamente menos de
aproximadamente el 50%, preferiblemente menos de aproximadamente el
75%, y muy preferiblemente menos de aproximadamente el 90% de los
componentes con los que estaba originariamente asociado.
Una secuencia de ácido nucleico que "procede
de" una secuencia específica se refiere a una secuencia que
corresponde a una región de la secuencia específica. Esto incluye
secuencias que son homólogas o complementarias de la secuencia.
Un ácido nucleico objetivo de control positivo
interno (CPI) se refiere a una secuencia sintética de ácido nucleico
clonada en un plásmido vector que es subsiguientemente linealizada,
típicamente por la acción de una endonucleasa de restricción. Un CPI
tendrá típicamente múltiples secuencias de unión del cebador
alrededor de una región genérica de unión de sonda, y actúa como un
control general frente a falsos negativos en reacciones de
amplificación de ácidos nucleicos.
La secuencia de un ADN objetivo de control
positivo interno preferible es:
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTA
TCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTG
CTCCAGGATCGTG-3' <SEC ID Nº 15>
TCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTG
CTCCAGGATCGTG-3' <SEC ID Nº 15>
Los ácidos nucleicos que comprenden cualquiera de
las secuencias descritas en la presente memoria descriptiva o
subsecuencias de las mismas pueden prepararse mediante
procedimientos convencionales. Por ejemplo, el ADN puede
sintetizarse químicamente usando, por ejemplo, el método de soporte
sólido del fosforamidito de Matteucci y col., 1981, J. Am.
Chem. Soc. 103: 3185, el procedimiento de Yoo y col.,
1989, J. Biol.. Chem. 764: 17078, u otros procedimientos bien
conocidos. Los ácidos nucleicos también pueden modificarse mediante
muchos medios conocidos en la técnica. Algunos ejemplos no
limitantes de dichas modificaciones incluyen la metilación, la
"encapsulación", la sustitución de uno o más de los nucleótidos
naturales por un análogo y modificaciones internucleotídicas tales
como, por ejemplo, con enlaces sin carga (por ejemplo,
metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.)
o enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos,
etc.). Los ácidos nucleicos pueden contener una o más fracciones
adicionales unidas covalentemente, tales como, por ejemplo,
proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de
señalización, poli-L-lisina, etc.),
agentes intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.),
quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro,
metales oxidantes, etc.) y alquilantes. El término "ácido
nucleico" también incluye a los ANP. El ácido nucleico puede
derivatizarse mediante la formación de un metil o etilfosfotriéster
o un enlace alquilfosforamidato. Adicionalmente, las secuencias de
ácido nucleico de la presente invención también pueden modificarse
con un marcaje capaz de proporcionar una señal detectable, tanto
directa como indirectamente. Algunos ejemplos de marcajes incluyen
radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.
La amplificación, según se usa en la presente
memoria descriptiva, se refiere a un proceso iterativo mediante el
cual se copia un ácido nucleico. Los procedimientos adecuados de
amplificación incluyen, sin limitaciones, la reacción en cadena de
la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa, la amplificación
por desplazamiento de hebras y la amplificación de base simple de
ácido nucleico y la amplificación mediada por transcripción.
La presente invención proporciona procedimientos
para la detección del VHC y del VIH en muestras biológicas. Los
procedimientos se llevan a cabo mediante:
(i) la realización de una reacción de
transcripción inversa usando como molde el ARN contenido en o
procedente de la muestra;
(ii) la amplificación de los productos de
transcripción inversa, si los hay, usando al menos un par de
cebadores de amplificación con las secuencias correspondientes a
secuencias dentro del genoma del VHC, según se define en las
reivindicaciones, y al menos un par de cebadores de amplificación
con las secuencias correspondientes a secuencias dentro del genoma
del VIH, según se define también en las reivindicaciones, para
producir productos de amplificación específicos para el VHC y el
VIH; y
(iii) la detección de los productos de
amplificación específicos para el VHC y el VIH. La detección de los
productos de amplificación específicos para el VHC y el VIH indica
la presencia de ARN del VHC y del VIH, respectivamente, en la
muestra.
Según la invención, se obtiene una muestra
biológica de un paciente mediante cualquier medio convencional. Las
muestras biológicas adecuadas incluyen, sin limitaciones, sangre,
suero, plasma, orina, leche materna y líquido cefalorraquídeo.
Preferiblemente, se usa plasma como fuente de ARN vírico.
La muestra biológica se trata de cualquier forma
que proporcione acceso para los reactivos de transcripción inversa
del ARN, específicamente de ARN vírico, contenidos dentro de la
muestra. El ARN "procedente de" una muestra biológica es
cualquier ARN que estuviera originalmente presente en la muestra y
cuyo acceso ha sido logrado mediante el tratamiento de la muestra.
Preferiblemente, el ARN se extrae de la muestra usando cualquier
procedimiento bien conocido en la técnica, tal como, por ejemplo,
los procedimientos que emplean tiocianato de guanidinio, o usando
reactivos disponibles comercialmente y procedimientos tales como,
por ejemplo, PureScript® de Gentra Systems, Inc. (Minneapolis MN).
Puede usarse cualquier procedimiento de extracción que dé como
resultado la separación del ARN de las ARNasas, otras proteínas y/o
cualesquiera otros componentes que pudieran interferir en la
transcripción inversa.
Entonces la muestra se somete a una transcripción
inversa usando (a) cebadores aletarios, tales como cebadores
hexámeros aleatorios obtenidos de Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ,
y/o (b) cebadores procedentes de las regiones 5' o 3' no
codificantes de la secuencia genómica del ARN del VHC. La
transcripción inversa se lleva a cabo usando procedimientos
convencionales, tales como los descritos en Current Protocols in
Molecular Biology, volúmenes I, II y II, 1997 (F. M. Ausubel
ed.); en la patente de EE.UU. 5.322.770; en Young y col., J.
Clin. Microbiol. 31(4): 882 (1993); Myers y col.,
Biochemistry 30(3): 7661 (1991); o según se describe
en la solicitud de patente en cotramitación
EP-A-1036847 (ref.
CDS-212), prioridad de reivindicación de USSN
60/118.520.
Tras la reacción de transcripción inversa, los
productos son amplificados. Puede usarse cualquier procedimiento de
amplificación, incluyendo, sin limitaciones, la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa, la
reacción por desplazamiento de hebras, la amplificación mediada por
transcripción o la amplificación de base simple de ácido nucleico.
Preferiblemente se usa la PCR. Típicamente, se añade una mezcla de
reacción que contiene todos los componentes necesarios para la PCR
directamente a la mezcla de reacción de la transcripción inversa.
Entonces se lleva a cabo la amplificación usando las condiciones
especificadas según el par de cebadores usado.
Los presentes inventores han descubierto que
ciertos pares de cebadores de amplificación específicos para VHC y
para VIH pueden usarse simultáneamente para detectar bajos niveles
de ARN tanto de VHC como de VIH en muestras de pacientes. Estos
cebadores se enumeran en la Tabla 1, a continuación.
Tras la amplificación, los productos amplificados
pueden detectarse usando cualquier procedimiento conocido en la
técnica, incluyendo, sin limitación, electroforesis en gel de
agarosa o de poliacrilamida; detección colorimétrica no isotópica,
tal como el sistema SureCell®, disponible en Ortho Clinical
Diagnostics, Rochester, NY (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 a
continuación); detección de Eci; quimioluminiscencia y
fluorescencia.
La detección de los productos de amplificación
específicos víricos indica la presencia de ARN vírico en la muestra.
Cuando se usa la electroforesis en gel, los productos de
amplificación específicos víricos se confirman por su tamaño, según
se predice mediante la localización, en el respectivo ARN vírico, de
las secuencias correspondientes a los cebadores de amplificación
usados en la reacción.
La presente invención encuentra uso en el
diagnóstico de la infección por VIH y VHC en pacientes, en el ensayo
de la eficacia de los regímenes de tratamiento antivíricos y en el
filtrado del suministro sanguíneo de muestras infectadas por VHC y
por VIH.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención sin limitaciones.
Se realizaron los siguientes experimentos para
determinar la sensibilidad de la detección múltiple de VHC y VIH
según los procedimientos de la presente invención.
Se cuantificó la carga vírica en plasma de
pacientes positivos en VIH y en plasma de pacientes positivos en VHC
usando el ensayo Amplicor de Roche según las instrucciones del
fabricante. Las muestras de plasma que contenían VIH y VHC se
diluyeron primero hasta contener 1.000 copias/ml y 10.000 copias/ml,
respectivamente. Entonces se combinaron como sigue: para
proporcionar 25 copias de ARN genómico vírico/reacción de PCR se
añadieron 25 \mul de plasma de VHC y 500 \mul de plasma de VIH a
450 \mul de plasma negativo. Para proporcionar 5 copias/reacción
de PCR se añadieron 10 \mul de plasma de VHC y 100 \mul de
plasma de VIH a 890 \mul de plasma negativo.
Se preparó ARN a partir de las muestras de plasma
usando reactivos de asilamiento de ARN PureScript® (Gentra Systems,
Minneapolis, MN). Las modificaciones del protocolo del fabricante
para fluidos corporales incluyeron el uso de 40 \mug de glucógeno,
en lugar de 20 \mug, como vehículo para ayudar en la precipitación
del ARN vírico. Adicionalmente, en la mayoría de los casos, tras la
precipitación con alcohol isopropílico del ARN y el lavado del
sedimento de ARN con etanol, el sedimento de ARN se resuspendió en
la mezcla de tampón de RT, en lugar de en la solución de hidratación
del ARN proporcionada por el fabricante.
La síntesis del ADNc a partir del ARN se catalizó
mediante la adición de 100 U de la transcriptasa inversa (RT) del
virus de la leucemia murina de Moloney recombinante (VLMM) (Gibco
BRL, Gaithesburg, Maryland) a 50 \mul de una disolución de
Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM,
DTT 10 mM, cada dNTP a 0,4 mM (Pharmacia Biotech), hexámeros
aleatorios a 4 \muM (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) o un
cebador específico de la transcripción inversa, y 20 unidades de
agua tratada con RNasin (Promega, Madison, Wisconsin) en
dietilpirocarbonato (DEPC). Tras la incubación a 42ºC durante 30
min, la reacción de la RT se mantuvo a 100ºC durante 5 min para
destruir la actividad RT. Cada reacción se enfrió durante 1 min,
seguido de una microcentrifugación a 16.000 x g durante 4
segundos.
La PCR se llevó a cabo en un termociclador PE9600
(Perkin-Elmer) en 100 \mul de una disolución de
Tris-HCl 25 mM, MgCl_{2} 3 mM, EDTA 0,725 mM, KCl
54 mM, NaCl 3,72 mM, DTT 40 \muM, 108 \mug/ml de gelatina (tipo
IV), 9,5% de glicerol, 0,02% de Tween 20, 0,02% de NP40, ADN de timo
de ternera (2 \mug), cada dNTP a 1,2 mM, cada cebador a 0,4
\muM, 10 copias de ADN de plásmido linealizado de control positivo
interno (CPI) y 16 U de polimerasa Taq. Se añadieron anticuerpos
monoclonales de Taq, TP1-12 y TP4-9,
cuya preparación se describe en la patente de EE.UU. 5.338.671, a la
reacción, en una proporción molar de 50:1 y 5:1, respectivamente,
para proporcionar una proporción molar de 55:1 entre los anticuerpos
de la polimerasa Taq. Tras la desnaturalización inicial a 96ºC
durante 3 min, se realizaron 40 ciclos de amplificación a 96ºC
durante 5 s y 68ºC durante 40 s. Al final de los ciclos se realizó
una etapa post-térmica durante 5 min a 103ºC para
inactivar la polimerasa Taq.
Los productos de la PCR se detectaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 4% seguida de una tinción con
bromuro de etidio. Alternativamente, los productos de la PCR fueron
biotinilados mediante el uso de cebadores marcados con biotina en 5'
(hebra con sentido) durante la amplificación. El producto se capturó
mediante hibridación con sondas oligonucleótidos unidas
covalentemente a partículas de látex, que se depositaron en la
superficie de una membrana de flujo. (Ensayos SureCell®). Las sondas
del VIH-1 eran:
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr) <SEC ID Nº 13> y
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; la sonda del VIH-2
era 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>; y la sonda del VHC era
5'-CCT TTC GCG ACC CAA CAC TAC TCG
GCT-3' (C252-27P) <SEC ID Nº
12>. El complejo sonda/producto se hizo reaccionar con conjugado
de peroxidasa de rábano picante (HRP)-estreptavidina
(SA), que cataliza la conversión oxidativa de un precursor de
pigmento en pigmento (de color azul). La intensidad del color azul
se evaluó visualmente (0-10) comparando la
intensidad del color con estándares de color. Todas las puntuaciones
de color visuales > 3 se consideraron resultados positivos.
La electroforesis en gel reveló los siguiente
productos de amplificación: 188 \etat (VHC), 160 \etat (CPI) y
150 \etat (VIH producto largo de LTR). El ensayo combinado de VIH
y VHC fue capaz de detectar todas las muestras combinadas de VIH y
VHC a 25 copias por ensayo de PCR (500 partículas víricas/ml
plasma). Además, entre el 50-90% de las muestras
positivas combinadas fueron detectadas a 5 copias/ensayo de PCR (100
partículas víricas/ml plasma). Los resultados se resumen en la Tabla
2, a continuación.
| n^{o} de copias de ARN vírico por | n = 8 sonda positiva de VHC | n = 8 sonda positiva de VIH |
| reacción de PCR | ||
| 0 | 0% | 0% |
| 5 | 88% | 50% |
| 25 | 100% | 100% |
Claims (40)
1. Un procedimiento para codetectar el ARN del
virus de la hepatitis C (VHC) y el ARN del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) en una muestra biológica,
comprendiendo dicho procedimiento:
(A) realizar una reacción de transcripción
inversa usando ARN procedente de dicha muestra como molde y al menos
un cebador de transcripción inversa que cebará la transcripción
inversa del ADN a partir del ARN del VHC, y al menos un cebador de
transcripción inversa que cebará la transcripción inversa del ADN a
partir del ARN del VIH, para producir productos de transcripción
inversa que comprenden (a) productos de transcripción inversa
específicos del VHC, (b) productos de transcripción inversa
específicos del VIH, o (c) una combinación de (a) y (b);
(B) amplificar dichos productos de transcripción
inversa usando uno o más pares de cebadores oligonucleótidos
específicos para la región 5' no codificante del VHC y uno o más
pares de cebadores oligonucleótidos específicos para el VIH para
producir productos de amplificación que comprenden (a) productos de
amplificación específicos del VHC, (b) productos de amplificación
específicos del VIH, o (c) una combinación de (a) y (b);
en el que cada uno de dichos pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VHC está constituido por:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 1>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 2>;
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH-1 está
constituido por un cebador hacia delante con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo constituido por:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>, y
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5>,
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH-2 está
constituido por un cebador hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>; y
(C) detectar dichos productos de
amplificación;
en el que la detección de los productos de
amplificación específicos para VHC indica la presencia de ARN de VHC
en dicha muestra, la detección de los productos de amplificación
específicos para VIH indica la presencia ARN de VIH en la muestra, y
la detección de los productos de amplificación específicos para VHC
y de los productos de amplificación específicos para VIH indica la
presencia de ARN de VHC y de ARN de VIH en dicha muestra.
2. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha reacción de transcripción inversa
se realiza usando cebadores oligonucleótidos aleatorios.
3. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha amplificación se realiza mediante
un procedimiento elegido del grupo que consiste en la reacción en
cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa, la
amplificación por desplazamiento de hebras, la amplificación de base
simple de ácido nucleico y la amplificación mediada por
transcripción.
4. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha detección comprende la
visualización de dichos productos de amplificación mediante
electroforesis en gel.
5. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha detección comprende la captura de
dichos productos de amplificación sobre un soporte sólido que
contiene (a) una o más sondas oligonucleótidos específicas para VHC,
(b) una o más sondas oligonucleótidos específicas para VIH, o (c)
una combinación de (a) y (b), y la cuantificación de dichos
productos capturados usando un ensayo de colorimetría.
6. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 5, en el que dicha sonda específica para VHC
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12> y
dicha sonda específica para VIH se elige del grupo constituido
por:
(a)
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>;
(b)
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; y
(c)
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
7. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha muestra se elige del grupo que
consiste en sangre, suero, plasma, orina, saliva y líquido
cefalorraquídeo.
8. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha codetección es simultánea.
9. Un procedimiento para coamplificar el ADN del
virus de la hepatitis C (VHC) y el ADN del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), comprendiendo dicho
procedimiento:
(A) realizar una reacción en cadena de la
polimerasa sobre una muestra de ADN sospechosa de contener ADN de
VHC, ADN de VIH o una combinación de ADN de VHC y ADN de VIH, usando
uno o más pares de cebadores oligonucleótidos específicos para la
región 5' no codificante del VHC y uno o más pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH para producir productos de
amplificación que comprenden (a) productos de amplificación
específicos para VHC, (b) productos de amplificación específicos
para VIH, o (c) una combinación de (a) y (b);
en el que cada uno de dichos pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VHC constituido por:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 1>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 2>;
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH-1 está
constituido por un cebador hacia delante con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo constituido por:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>, y
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5>, y
en el que cada uno de los pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el VIH-2 está
constituido por un cebador hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>.
10. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 9, que comprende además:
(B) detectar dichos productos de
amplificación,
en el que la detección de los productos de
amplificación específicos para VHC indica la presencia ADN de VHC en
dicha muestra, la detección de los productos de amplificación
específicos para VIH indica la presencia ADN de VIH en dicha
muestra, y la detección de los productos de amplificación
específicos para VHC y de los productos de amplificación específicos
para VIH indica la presencia ADN de VHC y de ADN de VIH en dicha
muestra.
11. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 10, en el que dicha detección comprende la
visualización de dichos productos de amplificación mediante
electroforesis en gel.
12. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 10, en el que dicha detección comprende la captura de
dichos productos de amplificación sobre un soporte sólido que
contiene (a) una o más sondas oligonucleótidos específicas para VHC,
(b) una o más sondas oligonucleótidos específicas para VIH, o (c)
una combinación de (a) y (b), y la cuantificación de dichos
productos capturados usando un ensayo de colorimetría.
13. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 12, en el que dicha sonda específica para VHC está
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12> y
dicha sonda específica para VIH se elige del grupo constituido
por:
(a)
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>;
(b)
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; y
(c)
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
14. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 9, en el que dicha coamplificación es simultánea.
15. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 1, en el que dicha reacción de transcripción inversa
se realiza usando adicionalmente un ARN de control positivo interno
(CPI) como molde y al menos un cebador de transcripción inversa que
cebará la transcripción inversa del ADN a partir del ARN de CPI,
para producir productos de transcripción inversa que comprenden
productos de transcripción inversa específicos para el CPI; y en el
que dichos productos de transcripción inversa se amplifican
adicionalmente usando uno o más pares de cebadores oligonucleótidos
específicos para el CPI, para producir productos de amplificación
que comprenden productos de amplificación específicos para el
CPI;
comprendiendo cada uno de dichos pares de
cebadores oligonucleótidos específicos para el CPI:
(1) un cebador hacia delante
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
(IPCF1) <SEC ID Nº 8>, y
(2) un cebador inverso
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
(IPCR1) <SEC ID Nº 9>;
en el que la detección de los productos de
amplificación específicos para CPI indica la presencia de ARN de CPI
en dicha muestra.
16. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 15, en el que dicha reacción de transcripción inversa
se realiza usando cebadores oligonucleótidos aleatorios.
17. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 15, en el que dicha amplificación se realiza mediante
un procedimiento elegido del grupo constituido por la reacción en
cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa, la
amplificación por desplazamiento de hebras y la amplificación
mediada por transcripción.
18. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 15, en el que dicha detección comprende la
visualización de dichos productos de amplificación mediante
electroforesis en gel.
19. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 15, en el que dicha detección comprende la captura de
dichos productos de amplificación sobre un soporte sólido que
contiene (a) una o más sondas oligonucleótidos específicas para CPI,
(b) una o más sondas oligonucleótidos específicas para VHC, (c) una
o más sondas oligonucleótidos específicas para VIH, o (d) una
combinación de cualesquiera de (a), (b) y (c), y la cuantificación
de dichos productos capturados usando un ensayo de colorimetría.
20. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 19, en el que dicha sonda específica para CPI está
constituido por
5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'
<SEC ID Nº 17>, dicha sonda específica para VHC está
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12> y
dicha sonda específica para VIH se elige del grupo que consiste
en:
(a)
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>;
(b)
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; y
(c)
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
21. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 15, en el que dicha muestra se elige del grupo
constituido por sangre, suero, plasma, orina, saliva y líquido
cefalorraquídeo.
22. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 15, en el que dicha codetección es simultánea.
23. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 9, en el que dicha reacción en cadena de la
polimerasa se realiza sobre una muestra de ADN que adicionalmente
contiene ADN de CPI y uno o más pares de cebadores oligonucleótidos
específicos para el CPI, para producir productos de amplificación
que comprenden productos de amplificación para el CPI;
en el que cada uno de dichos pares de cebadores
oligonucleótidos específicos para el CPI comprende:
(i) un cebador hacia delante
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
(IPCF1) <SEC ID Nº 8>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
(IPCR1) <SEC ID Nº 9>.
24. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 23, que comprende además:
(B) detectar dichos productos de
amplificación,
en el que la detección de los productos de
amplificación específicos para CPI indica la presencia de ADN de CPI
en dicha muestra, la detección de los productos de amplificación
específicos para VHC indica la presencia de ADN de VHC en dicha
muestra, la detección de los productos de amplificación específicos
para VIH indica la presencia de ADN de VIH en dicha muestra, y la
detección de los productos de amplificación específicos para VHC y
de los productos de amplificación específicos para VIH indica la
presencia de ADN de VHC y de ADN de VIH en dicha muestra.
25. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 24, en el que dicha detección comprende la
visualización de dichos productos de amplificación mediante
electroforesis en gel.
26. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 24, en el que dicha detección comprende la captura de
dichos productos de amplificación sobre un soporte sólido que
contiene (a) una o más sondas oligonucleótidos específicas para CPI,
(b) una o más sondas oligonucleótidos específicas para VHC, (c) una
o más sondas oligonucleótidos específicas para VIH, o (d) cualquier
combinación de cualesquiera de los anteriores, y la cuantificación
de dichos productos capturados usando un ensayo de colorimetría.
27. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 26, en el que dicha sonda específica para CPI está
constituido por
5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'
<SEC ID Nº 17>, dicha sonda específica para VHC está
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12> y
dicha sonda específica para VIH se elige del grupo constituido
por:
(a)
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>;
(b)
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; y
(c)
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
28. Un procedimiento según se define en la
reivindicación 27, en el que dicha coamplificación es
simultánea.
29. Un equipo para codetectar ARN de VHC y ARN de
VIH en una muestra biológica, comprendiendo dicho equipo:
(a) un par de cebadores oligonucleótidos
específicos para la región 5' no codificante del VHC constituido
por:
(i) un cebador hacia delante
5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3'
(C131F25) <SEC ID Nº 10>, y
(ii) un cebador inverso
5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
(C294R25) <SEC ID Nº 11>; y
(b) cebadores oligonucleótidos específicos para
el VIH-1 que están constituidos por un cebador hacia
delante con la secuencia:
5'-CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3'
(JBLTR4) <SEC ID Nº 3>, y un cebador inverso específico para
el VIH-1 elegido del grupo constituido por:
(1) 5'-GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACC
AGAGT-3' (JBLTR6) <SEC ID Nº 4>, y
(2)
5'-TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA-3'
(JBLTR8) <SEC ID Nº 5>, y un par de cebadores oligonucleótidos
específicos para el VIH-2 constituido por un cebador
hacia delante con la secuencia
5'-GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA-3'
(2LTRe) <SEC ID Nº 6>, y un cebador inverso específico para el
VIH-2 con la secuencia:
5'-GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA-3'
(2LTR-R1) <(SEC ID Nº 7>.
30. Un equipo según se define en la
reivindicación 29, que comprende además un par de cebadores
oligonucleótidos específicos para el CPI, en el que dicho par de
cebadores oligonucleótidos específicos para el CPI comprende un
cebador hacia delante
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
(IPCF1) <SEC ID Nº 8> y un cebador inverso
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
(IPCR1) <SEC ID Nº 9>.
31. Un equipo según se define en la
reivindicación 29, que comprende además una o más sondas.
32. Un equipo según se define en la
reivindicación 30, que comprende además una o más sondas.
33. Un equipo según se define en la
reivindicación 31, en el que dichas sondas se eligen del grupo
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12>,
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>,
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>, y
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
34. Un equipo según se define en la
reivindicación 32, en el que dicha sonda específica para CPI está
constituido por
5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'
(IPC1P) <SEC ID Nº 17>, dicha sonda específica para VHC está
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12> y
dicha sonda específica para VIH se elige del grupo constituido
por:
(a)
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>;
(b)
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; y
(c)
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
35. Un equipo para coamplificar ADN de VHC y ADN
de VIH en una muestra de ADN, comprendiendo dicho equipo los
cebadores oligonucleótidos definidos en la reivindicación 29.
36. Un equipo según se define en la
reivindicación 35, que comprende además un par de cebadores
oligonucleótidos específicos para el CPI, en el que dicho par de
cebadores oligonucleótidos específicos para el CPI comprende un
cebador hacia delante
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
(IPCF1) <SEC ID Nº 8> y un cebador inverso
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
(IPCR1) <SEC ID Nº 9>.
37. Un equipo según se define en la
reivindicación 35, que comprende además una o más sondas.
38. Un equipo según se define en la
reivindicación 36, que comprende además una o más sondas.
39. Un equipo según se define en la
reivindicación 37, en el que dichas sondas se eligen del grupo
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12>,
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>,
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>, y
5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
40. Un equipo según se define en la
reivindicación 38, en el que dicha sonda específica para CPI está
constituido por
5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3'
(IPC1P) <SEC ID Nº 17>, dicha sonda específica para VHC está
constituido por
5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'
(C252-27-PRB) <SEC ID Nº 12> y
dicha sonda específica para VIH se elige del grupo constituido
por:
(a)
5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr3) <SEC ID Nº 13>;
(b)
5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'
(JBLTRpr4) <SEC ID Nº 16>; y
(c)
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(2LTRpr1) <SEC ID Nº 14>.
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