ES2306648T3 - Cebadores de oligonucleotidos para la transcripcion inversa para la deteccion eficaz de vih-1 y vih-2 y procedimientos de uso de los mismos. - Google Patents

Cebadores de oligonucleotidos para la transcripcion inversa para la deteccion eficaz de vih-1 y vih-2 y procedimientos de uso de los mismos. Download PDF

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John A. Puskas
Keming Song
Jeffrey M. Linnen
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Abstract

Un procedimiento para la transcripción inversa del ARN del Virus de Inmunodeficiencia Humano (HIV) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento: (a) poner en contacto el ARN derivado de dicha muestra con (a) un oligonucleótido y (b) un cebador de hexámero aleatorio, en condiciones en las que dicho oligonucleótido ceba la síntesis de ADN complementario de al menos una parte de dicho ARN; en el que la secuencia de dicho oligonucleótido se selecciona entre el grupo constituido por: (i) SEQ ID NO 1, y (ii) SEQ ID NO 2.

Description

Cebadores de oligonucleótidos para la transcripción inversa para la detección eficaz de VIH-1 y VIH-2 y procedimientos de uso de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para detector secuencias de ácidos nucleicos en muestras biológicas, particularmente las secuencias derivadas de microorganismos infecciosos.
Antecedentes de la invención
Millones de individuos en todo el mundo están infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). Por consiguiente, la infección por VIH representa un asunto de salud pública grave. La difusión de la infección de VIH mediante productos de sangre contaminados significa que existe una necesidad para seleccionar procedimientos que puedan detectar pequeñas cantidades de ARN de VIH en muestras de pacientes. Además, la disponibilidad creciente de tratamientos de mejora para la infección por VIH significa que la detección temprana de la infección es un paciente es vital con el fin de iniciar las intervenciones terapéuticas apropiadas.
De este modo, existe una necesidad en la técnica para los procedimientos de detección altamente sensibles para VIH que se pueden usar en diagnosis y selección.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para la transcripción inversa del ARN del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) en una muestra biológica, donde el procedimiento comprende:
(a) poner en contacto del ARN derivado de dicha muestra con un oligonucleótido en condiciones en las que dicho oligonucleótido ceba la síntesis de ADN complementario de al menos una parte de dicho ARN.
donde dicho oligonucleótido se selecciona entre el grupo constituido por
(i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' <SEQ ID NO 1>, y
(ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3' <SEQ ID NO 2>. 
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detector la presencia del ARN del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) en una muestra biológica, donde el procedimiento comprende:
(a) realizar una reacción de transcripción inversa usando como molde ARN derivado de la muestra y usando, como cebador, un oligonucleótido complementario a una secuencia de nucleótidos contenida dentro del ARN para producir productos de transcripción específicos de VIH.
donde el cebador se selecciona entre el grupo constituido por:
(i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' <SEQ ID NO 1>, y
(ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3' <SEQ ID NO 2>.
(b) amplificar los productos de la reacción de transcripción inversa para producir los productos de amplificación; y
(c) detectar los productos de amplificación; y;
donde la detección de los productos de amplificación indica la presencia del ARN de VIH en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento, preferiblemente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El uso de cebadores de la transcripción inversa específicos de acuerdo con la invención proporciona un procedimiento sensible para detectar VIH-1 y VIH-2 en una muestra, preferiblemente plasma.
\newpage
En todavía otro aspecto, la invención proporciona kits para la detección de VIH-1, VIH-2, o una combinación de los mismos en una muestra biológica, donde el kit comprende un selector de transcripción inversa seleccionado entre el grupo constituido por:
(a) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' <SEQ ID NO 1>, y
(b) 5'-CCCTGTGGCGCC-3' <SEQ ID NO 2>.
Los kits pueden comprender adicionalmente reactivos e instrucciones para la transcripción inversa, amplificación, y detección de productos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración fotográfica de un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de amplificación específicos de VIH-1 obtenidos usando un cebador de transcripción inversa (a) cebadores de hexámero al azar (carriles 2-10);
o (b) una mezcla de cebadores de hexámeros al azar y LTR8RT (carriles 12-20). El carril 1 contiene marcadores, y los carriles 22, 24, y 26 son las muestras de control.
La Figura 2 es una ilustración fotográfica de un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de amplificación específicos de VIH-1 obtenidos usando un cebador de transcripción inversa (a) una mezcla de cebadores de hexámeros al azar y POL3RT (los carriles 2-10) o (b) una mezcla de LTR8RT y POL3RT (carriles 12-20). El carril 1 contiene marcadores, y los carriles 22, 24, y 26 son muestras de control.
La Figura 3 es una ilustración fotográfica de un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de amplificación específicos de VIH-1 obtenidos usando (a) cebadores de hexámeros al azar (carriles 2-13) o (b) hexámero al azar y una mezcla de POL3RT, LTR8RT, 2LTRRT y 2EnvRT (carriles 15-26). El carril 1 contiene marcadores.
La Figura 4 es una ilustración fotográfica de un gel de agarosa al 4% teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de amplificación específicos de VIH-1 obtenidos usando (a) cebadores de hexámeros al azar (carriles 2-15) o (b) hexámero al azar y una mezcla de POL3RT, LTR8RT, 2LTRRT y 2EnvRT (carriles 16-29). Los carriles 1 y 30 contienen marcadores.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han descubierto que la detección del ARN del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) en muestras biológicas es más eficaz cuando se usan oligonucleótidos que tienen secuencias complementarias con ciertas secuencias presentes en el ARN de VIH como cebadores para la transcripción inversa. Preferiblemente, las secuencias de los cebadores corresponden a secuencias próximas al extremo 3' del ARN del VIH.
Se usan muchas técnicas en biología molecular, AND recombinante, y bioquímica de proteínas en la práctica de la presente invención, tales como las explicadas en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I, II, y III, 1997 (F.M.. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I and II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription y Translation, 1984 (Hames y Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); y Protein Purification: Principles y Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.).
"Ácido nucleico" o "polinucleótido" como se usa en el presente documento se refiere a polímeros que contienen purina- y pirimidina de cualquier longitud, o bien polirribonucleótidos o polidesoxirribonucleótidos o polirribo- polidesoxirribonucleótidos mixtos. Esto incluye moléculas de una sola o doble cadena, tal, como, por ejemplo, híbridos ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN, así como "ácidos nucleicos de proteínas" (PNA) formados mediante la conjugación de de bases a una estructura central de aminoácidos. Esto también incluye ácidos nucleicos que contienen bases modificadas.
Un "complemento" de una secuencia de ácido nucleico como se usa en el presente documento se refiere a la secuencia no codificante que participa en el apareamiento de bases Watson-Crick con la secuencia original.
Un "cebador" como se usa en el presente documento es un oligonucleótido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, que forma un dúplex con una secuencia de ácido nucleico de una sola cadena de interés y permite la polimerización de una hebra complementaria usando, por ejemplo, transcriptasa inversa o ADN polimerasa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Un ácido nucleico o polipéptido "aislado" como se usa en el presente documento se refiere a un componente que se ha retirado de su ambiente original (por ejemplo, su ambiente natural si es de origen natural o una mezcla de reacción si es sintético). Un ácido nucleico o polipéptido aislado habitualmente contiene menos de aproximadamente 50%, preferiblemente menos de aproximadamente 75%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 90%, de los componentes con los que está originalmente asociado.
Una secuencia de ácido nucleico que se deriva "a partir de" una secuencia diseñada se refiere a una secuencia que corresponde a una región de la secuencia diseñada. Esto abarca secuencias que son homólogas o complementarias a la secuencia.
Un ácido nucleico diana de control positivo interno (IPC) se refiere a una secuencia de ácido nucleico sintético clonado en un vector plásmido que se linealiza posteriormente, habitualmente mediante la acción de una endonucleasa de restricción. Un IPC habitualmente tendrá múltiples secuencias de unión de cebadores que rodean a una región de unión de sonda genérica, y actúa como un control genérico contra los resultados negativo falso da como resultado reacciones de amplificación de ácido nucleico.
La secuencia de un AND diana de control positivo interno preferido es:
1
Como se usa en el presente documento, las condiciones apropiadas para la transcripción inversa, es decir, las condiciones en las que un oligonucleótido cebará la síntesis de ADNc, abarca la incubación de ARN oligonucleótidos de cebador con una enzima transcriptasa inversa y nucleótidos a una temperatura y durante un tiempo que da como resultado la síntesis de ADNc.
Los ácidos nucleicos que comprenden cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento o sus subsecuencias se pueden preparar mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente ADN usando, por ejemplo, el procedimiento de soporte sólido de fosforamidita de Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, el procedimiento de Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764: 17078, u otros procedimientos bien conocidos. Los ácidos nucleicos también se pueden modificar mediante muchos medios conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones incluyen mutilación, "remates", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, y modificaciones de internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) o enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los ácidos nucleicos pueden contener uno o más restos unidos covalentemente, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidantes, etc.), y alquilantes. PNAs también están abarcados dentro por el término "ácido nucleico". El ácido nucleico se puede derivatizar mediante la formulación de un metal o etil fosfotriéster o un enlace alquil fosforamidato. Además, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención también se pueden modificar con una etiqueta capaz de proporcionar una señal detectable, o bien directa o indirectamente. Las etiquetas ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, y similares.
Amplificación como se usa en el presente documento se refiere a un procedimiento iterativo mediante el que se copia un ácido nucleico. Los procedimientos adecuados para la amplificación incluyen sin limitación la reacción en cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de ligasa, y la amplificación mediada por transcripción.
El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) como se usa en el presente documento se refiere a especies en el género de Retroviridae, que incluye VIH- 1, VIH-2, y SIV, y cepas variantes de los mismos. Los aislamientos de VIH que se pueden detector por la presente invención incluyen, pero no se limitan a, VIH-1 y VIH-2.
La presente invención proporciona procedimientos para la transcripción inversa del ARN de VIH a partir de muestras biológicas, dichos procedimientos son útiles para la detección de VIH en muestras biológicas. La detección de los productos de amplificación específicos de VIH indica la presencia de ARN de VIH en la muestra.
De acuerdo con la invención, se obtiene una muestra biológica a partir de un paciente mediante cualesquiera procedimientos convencionales. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, sin limitación, sangre, suero, plasma, orina, leche de mama, muestras de tejidos, y fluido cefalorraquídeo. Preferiblemente, plasma se usa como una fuente de ARN de VIH.
La muestra biológica se trata de cualquier manera que proporciones acceso de los reactivos de transcripción inversa para ARN, específicamente ARN de VIH, contenidos dentro de la muestra. ARN "derivado de" una muestra biológica es cualquier ARN que estaba originalmente presente en la muestra y se había tenido acceso mediante tratamiento de la muestra. Preferiblemente, el ARN se extrae de la muestra usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, los procedimientos que emplean tiocianato de guanidinio, o usando reactivos y procedimientos comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, PureScript ó from Gentra Systems, Inc. (Minneapolis MN). Cualquier procedimiento de extracción se puede usar que dé como resultado la separación del ARN de las ARNasas, otras proteínas, y/o cualesquiera otros componentes que pudieran interferir con la transcripción inversa.
El ARN extraído de la muestra se pone en contacto después se pone en contacto con cebadores de oligonucleótidos en condiciones en las que los oligonucleótidos ceban la síntesis de ADN complementario con al menos una parte del ARN extraído. Las secuencias de los cebadores de oligonucleótido se derivan de la secuencia de VIH. Los cebadores corresponden a las regiones de ARN de VIH que pueden estar cadena abajo, es decir, 3', a las regiones en las que se desea la detección. Estas regiones pueden incluir, por ejemplo, la región de repetición de largo terminal (LTR), la región que codifica la transcriptasa inversa viral (Poi), proteína Gag, proteína Tat, glico proteína de envuelta, proteínas Vif, Vpr, y Vpu, y la región Rev, que codifica un elemento de respuesta del factor de transcripción. Preferiblemente, los cebadores corresponden a la secuencia próxima al extremo 3' del genoma de VIH. Las secuencias de cebador se pueden usar para identificar de manera específica aislamientos particulares de VIH (por ejemplo, aislamientos de VIH-1 y VIH-2). Un cebador puede identificar un aislamiento particular mediante la hibridación a ARN derivado de ese aislamiento en condiciones en las que no se hibrida a ARN de un aislamiento diferente, es decir, el propio aislamiento puede comprender una secuencia que se diferencie entre los aislamientos. Como alternativa, la secuencia de cebador se puede usar para cebar la síntesis de un fragmento de ARN de VIH que se diferencia entre los aislamientos, es decir, la secuencia que se diferencia entre los aislamientos puede estar cadena debajo de la secuencia de cebador.
Los cebadores de la transcripción inversa útiles en la práctica de la presente invención se seleccionan basándose en consideraciones teóricas de observación de secuencias, interacciones intra- e inter-moleculares, y las estructuras secundarias predichas del amplicón y secuencia que lo rodea. Además los cebadores y sistema de ensayo se diseñan para que permitan la coamplificación (y codetección) de las regiones múltiples del genoma de VIH, especies virales múltiples, y un ARN (o ADN) de control positivo interno (IPC).
Los cebadores de la transcripción inversa usados en los ejemplos se muestran en la Tabla 1.
2
La transcripción inversa se lleva a cabo usando procedimientos adicionales, tales como los descritos en Current Protocols en Molecular Biology, Volúmenes I, II, y III, 1997 (F.M.. Ausubel ed.); en la patente de estados Unidos Nº 5.322.770; en Young, et al., J. Clin. Microbiol. 31 (4): 882 (1993); Myers et al., Biochemistry 30 (3): 7661 (1991); o como se describe en el documento EP-A-1 036 847.
Después de la reacción de la transcripción inversa, el producto o productos de ADNc se pueden aislar y recuperar mediante procedimientos convencionales. Preferiblemente, el producto o productos de ADNc se amplifican. Se puede usar cualquier procedimiento de amplificación, incluyendo, sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra, amplificación mediada por la transcripción, y amplificación de una sola base de ácido nucleico. Preferiblemente, se usa PCR. De manera habitual, una mezcla de reacción que contiene todos los componentes necesarios para la PCR (incluyendo cebadores de amplificación específicos de VIH) se añade directamente a la mezcla de reacción de transcripción inversa. Después se lleva a cabo la amplificación usando las condiciones especificadas por los pares de cebadores que se usan. Los pares de cebadores de amplificación adecuados se describen, por ejemplo, en el documento EP-A-1 035 220, y en los ejemplos más adelante.
Después de la amplificación, los productos de amplificación se pueden detector usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, electroforesis en gel en azarosa o archilamida, captura de los productos de amplificación sobre un soporte sólido seguido de detección colorimétrica (véase, por ejemplo, el ejemplo 1 más adelante); detección de ECi; fluorescencia, detección radioisotópica y o quimioluminiscencia. Los reactivos para tales procedimientos de detección están comercialmente disponibles en por ejemplo Molecular Probes, Eugene, Oregon y Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY.
La detección de los productos de amplificación específicos de VIH indica la presencia de ARN de VIH en la muestra. Cuando se usa electroforesis de gel, los productos de amplificación específicos de VIH, se confirman por su tamaño, como se predice por la localización en el ARN de VIH de las secuencias que corresponden a los cebadores de amplificación usados en la reacción.
La presente invención proporciona kits para la detección de de ARn de VIH en muestras biológicas, que comprenden uno o más de los cebadoers de transcripción inversa mostrados en la Tabla 1 anterior. Los kits también pueden comprender reactivos para la transcripción inversa, así como reactivos adicionales para la detección de ADNc de VIH mediante, por ejemplo, PCR.
Descripción de las realizaciones preferidas
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin limitación
Procedimientos 1. Preparación de la muestra
Se preparo ARN a partir de muestras de plasma usando tiocianato de guanidinio o reactivos de aislamiento de ARN PureScript® (Gentra Systems, Minneapolis MN). Las modificaciones al protocolo del fabricante para los fluidos corporals incluían el uso de 40 \mug de glicógeno, en lugar de 20 \mug, como un vehículo para ayudar en la preparación de ARN viral. De manera adicional, en la mayoría de los casos, después de la precipitación con alcohol isopropílico del ARN y lavando el sedimento de ARN con etanol, el sedimento de ARN se volvió a suspender en la mezcla de tampón de RT, en lugar de la solución de hidratación de ARN proporcionada por el fabricante.
2. Transcripción inversa
La síntesis de ADNc a partir de ARN se catalizó mediante la adición de 100 U de Transcriptasa inversa (RT) del Virus de Leucemia Murina de Moloney (M-MLV) (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) en una solución de 50 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, 0,4 mM de cada dNTP (Pharmacia Biotech), 4 mM hexámeros aleatorios (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y/o cebador de la transcripción inversa específico, y 20 unidades de RNasin (Promega, Madison, Wisconsin) en agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC). Después de la incubación a 42ºC durante 30 min, la reacción de la RT se mantuvo a 100ºC durante 5 min para destruir la actividad de la RT. Cada reacción se enfrió durante 1 min seguido de microcentrifugación a 16000 x g durante 4 segundos.
3. Amplificación por la PCR
La PCR se llevó a cabo en un termociclador PE9600 (Perkin-Elmer) en una solución de 100 ml de 25 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl_{2}, 0,725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3,72 mM NaCl, 40 mM DTT, 108 mg/mL de gelatina (tipo IV), 9,5% de glicerol, 0,02% de Tween 20, 0,02% de NP40, ADN de timo de ternera (2 mg), 1,2 mM de cada dNTP, 0,4 mM de cada cebador, 10 copias de ADN de plásmido de control positivo interno linealizado, y 16 U de Taq polimerasa. Anticuerpos monoclonales a Taq, TP1-12 y TP4-9, cuya preparación se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.338.671, se añadieron a la reacción a una relación molar de 50:1 y 5:1, respectivamente, proporcionando una relación molar 55:1 de anticuerpo a Taq polimerasa. Después de la desnaturalización inicial a 96ºC durante 3 min, se realizaron 40 ciclos de amplificación a 96ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 40 segundos. Al final de la formación de ciclos, se realizó una etapa de calentamiento posterior durante 5 min a 103ºC para inactivar la Taq polimerasa. Los cebadores de amplificación usados son los mostrados en la Tabla 2 a continuación.
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TABLA 2
3
4. Detección de productos de la PCR 
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Los productos de la PCR se detectaron o bien mediante (i) electroforesis de gel, seguido de tinción por bromuro de etidio; o (ii) uso de cebadores marcados por 5'-biotina (hebra codificante) durante la amplificación. En este caso, los productos de amplificación se capturaron mediante hibridación a sondas de oligonucleótidos unidas de manera covalente a partículas de látex, que se depositaron sobre la superficie de un flujo a través de membrana (ensayos SureCell®, Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY). Las sondas de VIH-1 eran: 5'-CAACAGACGGGCACACAC
TACT-3'(JBLTRpr) <SEQ ID NO 11> y 5'- GAACAGATGGGCACACACTGCT-3' (JBLTRpr4) <SEQ ID NO 12>; y la sonda de VIH-2 era 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1) <SEQ ID NO 13>. El complejo sonda/producto se hizo reaccionar con conjugado estreptavidina (SA)-peroxidasa de rábano picante (HRP), que cataliza la conversión oxidante de un precursor de tinte a un tinte (color azul). Se puntuó la intensidad del color azul color visualmente (0-10) mediante comparación de la intensidad de color con patrones de color. Todas las puntuaciones de color visuales > 3 se consideraron que eran resultados positivos.
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Ejemplo 1 Eficacia de la Transcripción inversa usando cebadores específicos de VIH o cebadores aleatorios
Se realizó el siguiente experimento para comparar la eficacia de la transcripción inversa de ARN de VIH derivado de muestras de plasma humano usando cebadores específicos de VIH de acuerdo con la invención o cebadores de transcripción inversa de hexámeros aleatorios (N6, Pharmacia Biotech).
Se diluyó plasma humano para que contuviera 1000 copias de ARN de VIH por 100 ml, para producir aproximadamente 100 copias de ARN de VIH por reacción. Se extrajo ARN del plasma usando tiocianato de guanidinio. El sedimento de ARN se disolvió en 26 \mul de agua tratada con dietilpirocarbamato.
La reacción de transcripción inversa contenía: 13 \mul de ARN, 10 \mul de mezcla transcripción inversa (que contenía tampón de la hebra primera, 0,1 M DTT, 20 U RNasin (Promega, Madison, WI), 0,4 mM de cada dNTP, y 200 Unidades de transcriptasa inversa de Virus de Leucemia Murina de Moloney (M-MLV). 2 \mul adicionales de las siguientes mezclas de cebadores todas a 50 \muM) se añadieron de acuerdo con la condición que se está ensayando: (1) 2 \mul de cebadores aleatorios N6; (2) 1 \mul de cebadores aleatorios N6 + 1 \mul de cebador LTR8RT; (3) 1 \mul de de cebadores aleatorios N6 + 1 \mul de cebador POL3RT; (4) 1 \mul de LTR8RT + 1 \mul de POL3RT. La reacción de transcriptasa inversa se incubó a 42ºC durante 30 minutos; se calentó hasta 100ºC durante 5 minutos; y después se enfrió sobre hielo durante 1 minuto. Después se añadieron 75 \mul de mezcla maestra de PCR a la mezcla de reacción que contenía ADNc y se realizó la PCR en las condiciones siguientes: un precalentamiento de 3 minutos a 96ºC, seguido de 5 ciclos de fusión a 96ºC seguido de hibridación y amplificación a 62ºC durante 5 segundos, seguido de 35 ciclos de fusión a 96ºC e hibridación y amplificación a 68ºC durante 40 segundos. Después los productos de amplificación se volvieron a disolver en un gel de azarosa al 4% y se visualizó usando bromuro de etidio.
Resultados: Como se ilustra en las Figuras 1 y 2, el uso de cebadores de la transcripción inversa específicos de VIH, o bien solos o junto con cebadores de hexámeros aleatorios, da como resultado la detección de productos de amplificación específicos de VIH-1 de manera más significativa. Comparar la Figura 1, carriles 2-10 (cebador aleatorio solo) con la Figura 1, carriles 12-20 (LTR8RT + cebador aleatorio); Figura 2, carriles 2-10 (POL3RT + cebador aleatorio); y Figura 2, carriles 12-20 (LTR8RT + POL3RT). Este resultado también se observó cuando se usaron cebadores aleatorios 100 \muM o 200 \muM.
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Ejemplo 2 Detección de ARN de VIH en muestras de pacientes
Se realizó el siguiente estudio para comparar la detección de ARN de VIH en muestras de ensalada usando o bien cebadores de transcripción inversa de hexámeros aleatorios o cebadores aleatorios junto con cebadores de transcripción inversa específicos de VIH.
Se recogieron muestras de plasma positivos de VIH de pacientes que tienen conteos de células CD4T mayores de 500, indicando que eran asintomáticos. Y tenían una carga viral relativamente baja.
El ARN se extrajo a partir de las muestras de plasma como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior. 13 \mul de la solución de ARN se diluyeron en 15 \mul de agua. Cada muestra se dividió en dos alícuotas de 12 \mul para evaluar la transcripción inversa. Dos mezclas de reacción de transcripción inversa se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior. Cada mezcla contenía o bien 2 \mul de cebador aleatorio 100 \muM + 1 \mul de agua o 2 \mul de 100 \muM de cebador aleatorio + 1 \mul de una mezcla de cebador específico de VIH 50 \muM que contenía cantidades iguales de los siguientes cebadores: (1) POL3RT; (2) LTR8RT; (3) 2LTRRT; y (4) 2EnvRT. Las reacciones de transcripción inversa y amplificación se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior.
\newpage
Los productos de amplificación específicos de VIH se detectaron mediante electroforesis de gel sobre geles de azarosa al 4% teñidos con Bromuro de Etidio y también mediante el procedimiento colorimétrico SureCell® descrito anteriormente.
Resultados: Las Figuras 3 y 4 ilustran los productos de amplificación detectados mediante electroforesis de gel. La detección de los productos de amplificación específicos de VIH mediante el procedimiento colorimétrico se indica en valores relativos en la tabla 3. IPC indicaba cebadores de control positivo interno.
\vskip1.000000\baselineskip
4
5
En las muestras 3 y 10, la adición de cebadores de RT específicos de VIH a los cebadores de hexámeros aleatorios dio como resultado un mayor grado de de amplificación que usando cebadores aleatorios solos. La cantidad de producto detectado mediante el procedimiento era también mayor en estas muestras cuando se usaron los cebadores de RT específicos de VIH.
Las muestras 16, 20, y 22 no se detectaron usando solamente cebadores aleatorios en la reacción de la transcripción inversa, o bien mediante electroforesis de gel o mediante colorimetría. Estas muestras, sin embargo, eran positivas cuando los cebadores de RT específicos de VIH se usaron además de los cebadores aleatorios.
Estos resultados indican que los procedimientos y composiciones de la presente invención pueden reducir la incidencia de los resultados negativos falsos en la selección de pacientes o suministro de sangre para VIH.
Muchas variaciones de la presente invención sugerirán ellas mismas a los expertos en la técnica a la luz de la descripción detallada anteriormente.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> ORTHO-CLINICAL DIAGNOSTICS, INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CEBADORES DE OLIGONUCLEÓTIDOS DE LA TRANSCRIPCIÓN INVERSA PARA LA DETECCIÓN EFICAZ DE VIH-1 Y VIH-2 Y PROCEDIMIENTOS DE USO DE LOS MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P023846EP: AJF
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> 00300792.9
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 01.02.00
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/118417
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 02.02.99
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> SeqWin99
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgtattac tactg 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccctgtggcg cc 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 14
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgactagga gaga 
\hfill
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 14
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccagacggt cagt 
\hfill
14 
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<210> 5
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<211> 150
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CEBADOR
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtctgagg gatctctagt taccaga 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgttcgggcg ccactgctag aga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggttct ctccagcact agca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> CEBADOR
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgactagga gagatgggaa cacaca 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SONDA DE CAPTURA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacagacgg gcacacacta ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> SONDA DE CAPTURA
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaacagatgg gcacacactg ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SONDA DE CAPTURA
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacgcttgc ttgcttaaag acctc 
\hfill
25

Claims (8)

1. Un procedimiento para la transcripción inversa del ARN del Virus de Inmunodeficiencia Humano (HIV) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) poner en contacto el ARN derivado de dicha muestra con (a) un oligonucleótido y (b) un cebador de hexámero aleatorio, en condiciones en las que dicho oligonucleótido ceba la síntesis de ADN complementario de al menos una parte de dicho ARN;
en el que la secuencia de dicho oligonucleótido se selecciona entre el grupo constituido por:
(i) SEQ ID NO 1, y
(ii) SEQ ID NO 2.
2. Un procedimiento como se define en la reivindicación 1, en el que dicha muestra se selecciona entre el grupo constituido por sangre, suero, plasma, orina, saliva, y fluido cefalorraquídeo.
3. Un procedimiento como se define en la reivindicación 1, que comprende además (b) recuperar dicho ADNc.
4. un procedimiento para detectar la presencia de ARN de VIH en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) realizar el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para producir los productos de transcripción inversa específicos de VIH
(b) amplificar dichos productos de transcripción inversa para producir productos de amplificación; y
(c) detector dichos productos de amplificación;
en el que la detección de dichos productos de amplificación de dicha amplificación indica la presencia de ARN de VIH en dicha muestra.
5. Un procedimiento como se define en la reivindicación 4, en el que dicha amplificación se realiza mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo constituido por la reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, y amplificación por desplazamiento de hebra.
6. Un procedimiento como se define en la reivindicación 4, en el que dicha detección se realiza mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo constituido por electroforesis de gel de los productos de amplificación, captura de los productos de amplificación sobre soportes sólidos, y detección quimioluminiscente de los productos de amplificación.
7. Un cebador de oligonucleótido aislado constituido por una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
(i) SEQ ID NO 1 y
(ii) SEQ ID NO 2.
8. Un kit para la detección de VIH-1, VIH-2, o una combinación de los mismos, en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit un cebador de transcripción inversa constituido por una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:
(i) SEQ ID NO 1 y
(ii) SEQ ID NO 2.
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