PL169035B1 - Sposób wykrywania sekwencji HCV PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wykrywania sekwencji HCV w badanej n ic i podejrzanej o zawieranie p o l i - nukleotydu HCV, który to polinukleotyd HCV zawiera wybrany region docelowy, zna­ mienny tym, ze dostarcza s ie oligom er zdolny do hybrydyzowania z sekwencja HCV w ba­ danej n ic i polinukleotydowej, zawierajacy sekwencje polinukleotydowa wybrana z grupy obejm ujacej oligonukleotydy komplementarne do nastepujacych regionów genomu HCV (jak przedstawiono na figurze 1) 16- 45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 i 457-486; inkubuje s ie badana nic z tym oligomerem az do wytworzenia specyficznych hybrydowych dupleksów pomiedzy sekwen­ c ja wyszukujaca a sekwencja docelowa po czym wykrywa s i e hybrydy ewentualnie utwo­ rzone pomiedzy regionem docelowym, je z e li t a k i wystepuje, i oligomerem. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania sekwencji HCV w badanej nici podejrzanej o zawieranie polinukleotydu HCV, który to polinukleotyd HCV zawiera wybrany region docelowy, polegający na tym, że dostarcza się oligomer zdolny do hybtydyzowania z sekwencją HCV w badanej nici polinukleotyd owej, zawierający sekwencję polmukleotydową wybraną z grupy obejmującej oligonukleotydy komplementarne do następujących regionów genomu HCV (jak pokazano na figurze 1) 16-15, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 i 457-486; inkubuje się badaną nić z tym oligomerem z punktu (a) aż do wytworzenia specyficznych hybrydowych dupleksów pomiędzy sekwencją wyszukującą i sekwencją docelową po czym wykrywa się hybrydy ewentualnie utworzone pomiędzy regionem docelowym a oligomerem.

W innej postaci wynalazku sposób wykrywania sekwencji HCV w badanej nici podejrzanej o zawieranie polinukleotydu HCV, który to polinukleotyd HCV zawiera wybrany region docelowy, polega na tym, że dostarcza się oligomem/ów/ zdolnego/ych/ do hybrydyzowama z sekwencją HCV w badanej nici polii^ukl^ol?/c^OΛwes, zawierający sekwencję polinukleotydową

169 035 wybraną z grupy obejmującej oligonukleotydy komplementarne do następujących regionów genomu HCV (jak pokazano na figurze 1) 16-45, 49-78, 82-111, 115-14-4, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 i 457-486; inkubuje się badane nici z tyn/miź oligomerem/ami/, aż do wytworzenia specyficznych hybrydowych dupleksów pomiędzy sekwencją wyszukującą a sekwencją docelową; przy czym wykrywa się hybrydy utworzone pomiędzy regionem docelowym, jeśli jest obecny; oraz oligomerem lub innym oligomerem/ami/, przy czym inny oligomer/y/ składa się z sekwencji polinukleotydowej wybranej z grupy obejmującej oligonukleotydy komplementarne do następujących regionów genomu HCV (jak pokazano na figurze 1) 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 i 457-486.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się zestaw oligomerów, w którym oligomery stanowią startery reakcji szczepienia łańcuchów za pomocą polimerazy i f ankują region docelowy i następnie amplifikuje się region docelowy na drodze reakcji szczepienia łańcuchów za pomocą polimerazy. W oparciu o stosowane w sposobie według wynalazku oligomery zdolne do hybrydyzowania z sekwencją HCV można wytworzyć zestaw do wykrywania sekwencji docelowej HCv. Oligomery te obejmują oligonukleotydy komplementarne do następujących regionów genomu HCV (jak przedstawiono na figurze 1) 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211--240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-127 i 457-486.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie krwi pozbawionej HCV. Metoda ta polega na:

(a) dostarczeniu badanych kwasów nukleinowych z próbki krwi podejrzanej o zawieranie sekwencji docelowej HCV;

(b) dostarczeniu oligomeiri/ów/ zdolnego do hybrydyzowania z sekwencją HCV w badanej nici polinukleotydowej, o iie taka sekwencja jest obecna, przy czym przy czym oligomer składa się z sekwencji polinukleotydowej wybranej z grupy obejmującej oligonukleotydy komplementarne do następujących regionów genomu HCV (jak pokazano na figurze 1) 16-4-5, 49-78, 82-11, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 i 457-486;

(c) przeprowadzeniu reakcji pomiędzy (a) i (b) w warunkach pozwalających na powstawanie pollnukleotydowego dupleksu pomiędzy sekwencją wyszukującą i sekwencją docelową, o ile taka jest obecna;

(d) wykrywaniu dupleksu powstałego w punkcie (c), o iie taki powstaje oraz (e) zebraniu krwi, w której nie wykryto kompleksów według punktu (d).

Inna metoda polega natomiast na:

(a) dostarczeniu badanych kwasów nukleinowych z próbki krwi podejrzanej o zawieranie sekwencji docelowej HCV;

(b) dostarczeniu oligomerr/ów/ zdolnego do hybiydyzowania z sekwencją HCV w badanej nici polinukleooydowej, o iie taka sekwencja jest obecna, przy czym przy czym oligomer składa się z sekwencji polinukleotydowej;

c) przeprowadzeniu reakcji pomiędzy (a) i (b) w warunkach pozwalających na powstanie polinukleolydowego dupleksu pomiędzy sekwencją wyszukującą i sekwencją docelową o ile taka jest obecna;

(d) wykrywaniu dupleksu powstałego w punkcie (a), o iie taki powstaje; za pomocą innego oligomeiu/ów/, przy czym inny oligomer/y/ zawierają sekwencję polmukleotydową oraz (e) zebraniu krwi, w której nie wykryto kompleksów według punktu (d).

Wynalazek zilustrowano na następujących rysunkach.

Figura 1 przedstawia zestawioną sekwencję cDNA HCV pochodzącego z klonu tu opisanego i z zestawionej sekwencji cDNA HCV ujawnionej w międzynarodowej publikacji nr WO 90/14436. Sekwencje pochodziły z następujących k^or^<óAw: 5’-kon 32, b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216ą pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (zwany też k9-1), 26j, 13i, 12f, 14a, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 87, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k oraz pl31jh. Trzy poziome kreski znajdujące się nad sekwencją wskazują miejsce przypuszczalnego kodonu inicjatora metioniny. Na rysun169 035 ku tym przedstawiono również sekwencję ammokwasową przypuszczalnej poliproteiny kodowanej przez cDNA HCV. Różnice w klonach kwasów DNA HCV1 zaznaczono przez wyżej umieszczone aminokwasy przypuszczalnie kodowane przez sekwencję dużej ORF (otwartej fazy odczytu) nawiasy wskazują, że w klonie, w końcu 5' lub 3' cDNA HCV lub w pobliżu, wykryto różnice.

Figura 2 przedstawia zgodność sekwencji DNA pięciu różnych izolatorów HCV pochodzących z różnych miejsc (Japonia i Stany Zjednoczone Ameryki), przy czym aminokwasy kodowane przez dużą ORF HCVl umieszczono nad sekwencjami DNA.

Figura 3 przedstawia sekwencję znakujących sond do wykrywania RNA HCV w próbkach biologicznych z Przykładu III.

Figura 4 przedstawia przyporządkowanie sond z Figury 3 w stosunku do HCV1, według numeracji z Figury 1.

Terminem wirus zapalenia wątroby typu C fachowcy określali dotychczas nieznany etiororgc2ny czynnik NANBH. Prototyp izolatu HCV ujawniono w opisie patentowym Staiów Zjednoczonych Ameryki nr 122 714 (patrz również publikacja Europejskiego Urzędu Patentowego nr 318 216). Określenie HCV obejmuje również nowe izolaty wirusa tego samego rodzaju. Rozszerzając tę terminologię, chorobę powodowaną przez HCV, zwaną przedtem zapaleniem wątroby NANB, rozprzestrzeniającym się przez krew (BB-NANBH), określa się jako zapalenie wątroby typu C. Określenia NANBH i zapalenie wątroby typu C stosuje się w niniejszym opisie wymiennie.

HCV jest rodzajem wirusa, którego patogenne szczepy wywołują NANBH. Mogą to być także szczepy atenuowane lub uszkadzające cząstki z nich pochodzące. Jak wykazano w niniejszym opisie, genom HCV składa się z RNA. Wiadomo, że wirusy RNA charakteryzują st<osunkowo wysokie częstości spontanicznych mutacji, to jest rzędu od 10— do 10— na włączany nukleotyd (Fields i Knipe /1986/). W związku z tym, ponieważ różnorodność i zmienność genotypu jest w przypadku wirusów RNA dziedziczna, wśród wirusów HCV istnieje duża liczba szczepów/izolatów, które mogą być zjadliwe lub niezjadliwe. Kompozycje i sposoby ujawnione w niniejszym opisie umożliwiają namnażanie, identyfikację, wykrywanie i izolowanie różnych szczepów lub izolatorów HCV.

Zidentyfikowano niektóre szczepy/izolaty HCV (patrz - międzynarodowa publikacja nr WO90/14436). Jeden z takich szczepów lub izolatów, stanowiący prototyp, nazwano CDC/HCV1 (zwany też HCV1). Informacja odnośnie jednego szczepu hub izolatu, taka jak informacja o częściowej sekwencji genomu, umożliwia fachowcom wyizolowanie nowych szczepów/izolatów z zastosowaniem znanych technik oraz określanie, czy take nowe szczepy/izolaty są HCV. Przykładowo, w niniejszTym opisie zdefiniowano killca różnych szczepów/izolatów. Te szczepy, które otrrymano z różnych ludzkich surowic (i z różnych miejsc) wyizolowano przy zastosowaniu informacji o sekwencji genomu HCV1. Budowę genomu i sekwencję nukleotydową genomowego RNA HCV1 wyprowadzono metodami ujawnionymi w międzynarodowej publikacji nr WO90114436. Okazuje się, że genom stanowi jednoniciowy RNA zawierający ~ 10000 nukleotydów. Genom stanowi nić dodatnią (o polarności mRNA) i posiada ciągłą, ulegającą translacji otwartą fazę odczytu (ORF), która koduje poliproteinę o długości około 3000 aminokwasów. W ORF, białka strukturalne najprawdopodobniej koduje w przybliżeniu pierwsza ćwiartka regionu N-końcowego, przy czym główna część poliproteiny jest odpowiedzialna za białka niestirikturalne. W porównaniu ze wszystkimi znanymi sekwencjami wirusów, obserwuje się niewielkie, lecz znaczące współliniowe homologie z niestrukturalnymi białkami rodziny Fla-^iwi^^iów i wirusów dżumy (które obecnie uważa się za należące do rodziny Flavi wirusów).

Poliproteina flaviwirusa zawiera, od N-końca do C—końca, białko nukleokapsydu (C), białko rdzenia (M), białko otoczki (E) i białka niestnukturane (NS) 1,2/a+b/, 3,4/a+b/ i 5. Biorąc pod uwagę przypuszczalne aminokwasy kodowane przez sekwencję nukleotydową HCV1, mały obszar na końcu N-końca prlipnoreiny HCV okazuje się być podobny, zarówno pod względem wielkości, jak i wysokiej zawartości reszt zasadowych, do białka nukleokapsydu (C) znalezionego na N-końcu poliprotein flayiwirnusa. Niesmukturalne białka 2, 3, 4 i 5 (NS^S^-5) wi8

169 035 rusa HCV i wirusa żółtej gorączki (YFV) mają swoje odpowiedniki o podobnej wielkości i powinowactwie do wody, chociaż występuje różnica w sekwencjach aminokwasowych. Jednakże, region HCV, który mógłby odpowiadać regionom poliproteiny YFV zawierającym białko M, E i NS1 różni się nie tylko w sekwencji, lecz także jest całkiem odmienny jeśli chodzi o wielkość i powinowactwo do wody. Tak więc, o ile niektóre obszary genomu HCV można nazywać tu, na przykład, NS1 lub NS2, o tyle należy zdawać sobie sprawę z tego, że te oznaczenia mają charakter spekulatywny; należy spodziewać się istnienia znaczących różnic pomiędzy rodziną wirusów HCV a rodziną flawwirnsów.

Prawdopodobnie występują różnice w aminokwasach i w kwasach nukleinowych różnych szczepów, izolatów i podtypów HCV w porównaniu z HCV1. Należy oczekiwać, że szereg izolatów będzie wykazywać znaczną (to jest większą niż 40%) homologię w pełnej sekwencji aminokwasowej z HCV1. Jednakże, może się również okazać, że istnieją inne, w mniejszym stopniu homologiczne izolaty HCV. Można je zaszeregować jako HCV według różnych kryteriów, takich jak na przykład ORF o długości od około 9000 nukleotydów do około 12000, kodująca poliproteinę podobną do poliproteiny HCV1 pod względem wielkości, o podobnej hydrofobowości i/lub podobnej antygenowości i posiadającą współliniowe sekwencje peptydowe, zachowane w poliproteinie HCV1. Ponadto uważa się, że genom jest dodatnią nicią RNA.

Wszystkie izolaty HCV kodują co najmniej jeden epitop, który można zidentyfkować metodą immunologiczną (to znaczy epitop biorący udział w immunologicznej reakcji krzyżowej) jako epitop kodowany przez kwasy cDNA HCV tu opisane. Korzystnie, epitop zawiera się w opisanej tu sekwencji aminokwasowej i jest swoisty dla HCV w porównaniu z patogenami znanymi do tej pory. Swoistość epitopu można określić jako immunologiczną reaktywnością z przeciwciałami anty-HCV i brakiem immunologicznej reaktywności z przeciwciałami przeciwko znanym patogenom.

Szczepy i izolaty HCV są ewolucyjnie spokrewnione. Dlatego należy się spodziewać, że całkowita homologia genomów na poziomie nukleotydowym może osiągać poziom około 40% lub więcej, prawdopodobnie około 50% lub więcej, prawdopodobnie 60% lub więcej, a najprawdopodobniej około 80% lub więcej, a ponadto, że mogą występować odpowiadające sobie zgodne sekwencje o długości co najmniej około 13 nukleotydów. Należy zauważyć, że w obrębie genomu HCV występują zmienne i superzmienne regiony, w tych regionach przewiduje się występowanie znacznie mniejszego stopnia homolo^gii niż w całym genomie. Podobieństwa pomiędzy sekwencją genomu przypuszczalnego szczepu HCV a selcwencją przykładowo cDNA CDC/HCV1 można określić znanymi sposobami. Na przykład, można je określić porównując bezpośrednio dane odnośnie sekwencji polinukleotydowej z przypuszczalnego HCV z danymi dotyczącymi sekwencji kwasu/ów/ cDNA HCV tu opisanego. Podobieństwa można również określić przez hybrydyzację polinukleotydów w warunkach, w których powstają trwałe dupleksy pomiędzy homologicznymi regionami (na przykład tymi regionami, które byłyby użyte przed trawieniem Si), a następnie przez trawienie specyficzną nukleazą/ami/ przecinającą pojedyncze nici i oznaczenie wielkości fragmentów powstałych na skutek trawienia.

Z uwagi na ewolucyjne pokrewieństwo szczepów lub izolatów HCV, przypuszczalne szczepy lub izolaty HCV można zidentyfikować na podstawie ich homologii na poziomie poiipeptydowym. Uważa się, że szczepy lub izolaty są zwykle homologiczne co najmniej w 40%, w więcej niż około 50% , przypuszczalnie w więcej niż około 70%, prawdopodobnie nawet w więcej niż około 80%, przy czym niektóre mogą być nawet bardziej homologiczne niż w około 90% na poziomie polipeptyyowym. Techniki oznaczania homologii seecwencji aminokwasowej są znane. Przykładowo, sekwencję ammokwasową można określić bezpośrednio i porównać ją z ujawnionymi tu sekwencjami. Alternatywnie, można określić sekwencję nukleotydową genomu przypuszczalnego HCV (zwykle poprzez przejściowy ^NA), określić kodowaną przez nią przypuszczalną sekwencję ammokwasową i porównać odpowiadające sobie regiony.

Stosowane tu określenie - polinukleotyd pochodzący od oznaczanej sekwencji odnosi się do sekwencji polinukleotydowej składającej się z sekwencji w przybliżeniu co najmniej oko169 035 ło 6 nukleotydów, korzystnie co najmniej około 8 nukleotydów, korzystniej co najmniej około 10-12 nukleotydów, a najkorzystniej, z sekwencji nawet co najmniej około 15-20 nukleotydowej, odpowiadającej regionowi oznaczanej sekwencji nukleotydowej. Odpowiadający oznacza homologiczny lub komplementarny do oznaczanej sekwencji. Korzystnie, sekwencja regionu, od której pochodzi polinukleotyd jest homologiczna lub komplementarna do sekwencji charakterystycznej dla genomu HCV. Korzystniej, taka sekwencja pochodząca jest homologiczna lub komplementarna do sekwencji charakterystycznej dla wszystkich lub dla większości izolatów HCV. Niezależnie od tego, czy sekwencja jest charakterystyczna dla genomu HCV czy też nie, można ją oznaczyć znanymi metodami. Na przykład, sekwencję można porównać z danymi z banku genów, przykładowo z Genebank, w celu określenia czy jest ona obecna w niezakażonym gospodarzu lub w innych organizmach. Sekwencję można również porównać ze znanymi sekwencjami innych czynników wirusowych, włącznie z tymi, o których wiadomo, że wywołują zapalenie wątroby, na przykład HAV, HBV i HDV oraz z czynnikami należącymi do rodziny Flaviwirusów. To, czy sekwencja pochodząca odpowiada, czy też nie odpowiada innym sekwencjom, można również sprawdzić przez hybrydyzację w odpowiednim reżimie warunków. Techniki hybrydyzacji stosowane do określania komplementarności sekwencji kwasów nukleinowych są znane fachowcom i omówiono je w niniejszym opisie. Patrz również, przykładowo, MLaniatis i wsp. (1982). Ponadto, znanymi technikami można określić niekomplementarności dupleksowych polmukleotydów powstających podczas hybrydyzacji; techniki te obejmują na przykład trawienie nukleazą taką jak S1, która specyficznie trawi jednoniciowe obszary w dupleksowych polinukleotydach. Regiony, z których można wyprowadzić typowe sekwencje DNA, obejmują na przykład regiony kodujące charakterystyczne epitopy, jak również regiony, które nie uległy transkrypcji i/lub translacji.

Polinukleotyd pochodzący nie musi pochodzić fizycznie z przedstawionej sekwencji nukleotydowej; można go wytworzyć w inny sposób, na przykład na drodze syntezy chemicznej, replikacji DNA albo odwrotnej transkrypcji lub transkrypcji. Ponadto, kombinacje regionów odpowiadających regionom z danej sekwencji można modyfikować znanymi sposobami w celu zastosowania ich tak, jak zamierzono.

Stosowany tu termin rekombinowany polinukleotyd odnosi się do polinukleotydu pochodzenia genomowego, cDNA, półsyntetycznego lub syntetyccnego, który z uwagi na swoje pochodzenie lub na skutek manipulacji: (1) nie jest połączony z całym ani z częścią polinukleotydu, z któiym jest połączony naturalnie, (2) jest połączony z polinukleoiydem innym niż ten, z którym jest połączony naturalnie, (3) nie występuje naturalnie.

Termin polinukleotyd stosowany w niniejszym opisie oznacza polimer nukleotydowy, rybonukleotydowy albo dezoksyrybonukleotydowy o dowolnej długości. Określenie to odnosi się jedynie do pierwszorzędowej struktury cząsteczki. Zatem obejmuje ono dwuniciowy i jednoniciowy DNA i RNA. Określenie to obejmuje także znane modyfikacje, na przykład znane znaczniki, metylację, czapeczki, podstawienie jednego lub większej liczby nukleotydów występujących naturalnie ich analogiem, modyfikacje wewnątrznukleotydowe, takie jak na przykład modyfikacje z wiązaniami bez ładunku (metylofosfoniany, trójestry kwasu fosforowego, fosfoamidy, karbaminiany, itd.) oraz wiązaniami z ładunkiem (tiofosforany i dwutiofosforany), modyfikacje zawierające dołączone substancje, takie jak na przykład białka (obejmujące przykładowo nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnałowe, poli-L-lizynę i podobne), modyfikacje z wstawkami (przykładowo akrydyna, psoralen i podobne), modyfikacje zawierające czynniki chelatujące (przykładowo metale, metale radioaktywne, bor, metale utleniające i podobne), modyfikacje zawierające czynniki alkilujące oraz modyfikacje ze zmodyfikowanymi wiązaniami (przykładowo kwasy nukleinowe alfa anomeryczne i podobne), jak również niezmodyfikowane postacie polinukleotydu.

Określenie sensowna nić kwasu nukleinowego oznacza sekwencję homologiczną do sekwencji mRNA. Antysensowna nić oznacza sekwencję komplementarną do nici sensownej. Stosowane tu określenie genom wirusa o dodatniej nici oznacza genomowy polinukleotyd RNA lub DNA kodujący co najmniej jeden polipeptyd wirusowy. Przykłady wirusów z dodatnią nicią RNA obejmują Togaviridae, Coronawidae, Retroviridae, Picornaviridae i Caiicivi10

169 035 ridae. Flaviviridae również są takimi wirusami, lecz przedtem były one nazywane Togaviridae. Są to typowe wirusy jednoniciowe. Patrz Fields i Knipe (1986).

Stosowane tu określenie starter oznacza oligomer zdolny do funkcjonowania jako punkt inicjacji syntezy nici polinukleotydowej w odpowiednich warunkach. Starter jest w pełni lub zasadniczo komplementarny do regionu nici polinukleotydowej, która ma być kopiowana. Tak więc, w warunkach odpowiednich do hybrydyzacji, starter będzie hybrydyzował z komplementarnym regionem badanej nici. Po dodaniu odpowiednich reagentów (przykładowo, polimerazy, trójfosforanów nukleotydowych i podobnych), starter ulega przedłużaniu przy udziale czynnika powodującego polimeryzację, a więc w wyniku tego przedłużenia powstaje kopia badanej nici. Starter może mieć postać jednoniciową lub, alternatywnie, częściowo lub w pełni dwuniciową.

Terminy badany polinukleotyd i badana nić odnoszą się do jedno- lub dwumciowej cząsteczki kwasu nukleinowego, która jest podejrzana o zawieranie w sobie sekwencji docelowej i która może być obecna w próbce biologicznej.

Określenie oligomer oznacza starter i sondy. Określenie to nie odnosi się do wielkości cząsteczki. Jednakże, długość oligomerów na ogół nie przewyższa 1000 nukleotydów, częściej nie przekracza 500 nukleotydów, a najczęściej długość nie przewyższa 250 nukleotydów; mogą one być nie dłuższe niż 100-nukleotydowe, nie dłuższe niż 75-nukleotydowe, ale również nie dłuższe niż 50-nukleotydowe.

Używane tu określenie sonda oznacza strukturę stanowiącą polinukleotyd, który tworzy strukturę hybrydową z sekwencją docelową dzięki komplementamości co najmniej jednej sekwencji sondy z sekwencją w regionie docelowym. Regiony polinukleotydowe sond zbudowane są z DNA i/lub z RNA i/lub z syntetycznych analogów nukleotydów. Jako sondy rozumie się sondy wychwytujące i sondy znakujące. Korzystnie, sonda nie zawiera sekwencji komplementarnej do sekwencji stosowanej/ych/ do inicjacji reakcji szczepienia łańcuchów przy udziale polimerazy (PCR). Określenie region docelowy oznacza region kwasu nukleinowego, który ma być amplifikowany i/lub wykrywany. Sekwencja docelowa oznacza sekwencję, która tworzy w pożądanych warunkach trwałą hybrydę z sondą lub ze starterem.

Określenie sonda wychwytująca odnosi się do polinukleotydu stanowiącego polinukleotyd jednoniciowy sprzężony z partnerem wiążącym. Jednoniciowy polinukleotyd zawiera wyszukującą sekwencję polinukleotydową która jest komplementarna do sekwencji docelowej w regionie docelowym, który ma zostać wykryty w badanym polinukleotydzie. Ten komplementarny region posiada wystarczającą długość i jest dostatecznie komplementarny z sekwencją docelową aby tworzyć a nią dupleks o trwałości wystarczającej na to, by nastąpiło unieruchomienie badanego polinukleotydu na stałej powierzchni (poprzez partnerów wiążących). Wiążący partner jest swoisty w stosunku do drugiego wiążącego partnerą a drugi wiążący partner może związać się z powierzchnią stałego podłoża, lub też może zostać związany ze stajen podłożem pośrednio poprzez inne struktur lub innych partnerów wiążących.

Określenie wyszukująca sekwencja polinuł<l^c^ty^dtssva^,, oznacza sekwencję polinukleotydową zawierającą nukleotydy komplementarne do docelowej sekwencji nukleotydowej, sekwencja ta posiada dostateczną długość i jest wystarczająco komplementarna z sekwencją docelową aby tworzyć z nią dupleks o trwałości wystarczającej do osiągnięcia zamierzonego celu.

Używane w niniejssyTn opisie wyrażenie partner wiążący oznacza cząsteczkę zdolną do wysoce wybiórczego wiązania cząsteczki ligandu; wiązania t^l<iieigo, jak na przykład wiązanie się antygenu i przeciwciała swoistego dla tego antygenu. Na ogół, swoiści partnerzy wiążący muszą wiązać siię z powinowactwem wystarczaj ącym na to, aby unieruchomić badaną kopię/komplementarną nić dupleksu (w przypadku sond wychwwytujących) w procesie izolowania. Znani są swoiści partnerzy wiążący i obejmują przykładowo biotynę i awidynę lub streptawidynę, IgG i białko A, szereg znanych par receptor-llgand oraz komplementarne nici polinukleotydowe. W przypadku komplementarnych polinukleotydowych partnerów wiążących, nici mają zwykle długość wynoszącą co najmniej około 15 zasad, ewentualnie około 40 zasad, przy czym zawartość zasad G i C wynosi co najmniej około 40% i do około 60%. Polinukleotydy mogą składać się z DNA, RNA lub z syntetycznych analogów nukleotydów.

169 035

Określenie sprzężony oznacza połączenie przez wiązania kowalencyjne lub przez siine oddziaływania niekowalencyjne (na przykład oddziaływania hydrofobowe, wiązania wodorowe i podobne). Wiązania kowalencyjne mogą przykładowo obeemować wiązania estrowe, eterowe, fosfoestrowe, amidowe, peptydowe, imidowe, wiązania wzę^gleil-si^I^I<a, węgiel-fosfor i podobne.

Stosowany w mnielszym opisie termin podłoże odnosi się do jakiejkolwiek stałej lub półstałej powierzchni, z którą pożądany partner wiążący może się związać. Odpowiednie podłoża obejmują szkło, tworzywa sztuczne, metale, żele polimerowe i podobne, stosuje się je w postaci kulek, studzienek, zanurzonych prętów, błon i podobnych.

Używane tu określenie znacznik oznacza jakikolwiek atom lub substancję, którą można stosować w celu uzyskania wykrywalnego (korzystnie, możliwego do iioścćowego oznaczenia) sygnału, który to atom lub substancję można dołączyć do polinukleotydu lub polipeptydu.

Stosowane t określenie znakowana sonda oznacza oligomer zawierający wyszukującą sekwencję pol^l^^^ł<l^<^ty^c^(S'^ą, komplementarną do sekwencji docelowej, która ma być wykryta w badanym polmukleotydzie. Ten komplementarny region ma wystarczającą długość i stopień komplementarności do sekwencji docelowej, aby mógł wytworzyć się dupleks znakowanej sondy i sekwencji docelowej, który to dupleks można wykryć za pomocą znacznika. Oligomer jest sprzężony ze znacznikiem albo bezpośrednio, albo pośrednio poprzez układ cząsteczek ligandu o wysokiej swoistości względem siebie. Układy cząsteczek ligandu o wysokiej swoistości ujawniono w niniejszym opisie, obejmują one również multimery.

Używane tu określenie multimer oznacza liniowe lub rozgałęzione polimery posiadające powtarzające się takie same jednoniciowe jednostki pollnukleoSydowe lub różne jednoniciowe jednostki polinukleotydowe. Co najmniej jedna z jednostek ma sekwencję, długość i skład pozwalający na swoiste hybrydyzowanie z pierwszą jednoniciową sekwencją nukleotydową będącą przedmiotem zainteresowania, zwykle z sekwencją badaną lub z oligomerem (na przykład ze znakowaną sondą), które są związane z badaną sekwencją. W celu osiągnięcia takiej swoistości i trwałości jednostka taka zwykle ma długość co najmniej około 15 nukleotydów, zwykle nie większą niż około 50 nukleotydów, korzystnie około 30 nukleotydów, przy czym zawartość zasad G i C zwykle wynosi co najmniej około 40%, a najwięcej około 60%. Poza taką jednostką/ami/, multimer zawiera szereg jednostek zdolnych do swoistego i trwałego hybiydyzowania z drugim jednoniciowym nukleotydem będącym przedmiotem zaintereeowania, na ogół ze znakowany pslinukleotydem lub z innym multimerem. Jednostki te mają na ogół taką samą wielkość i skład, jak multimery omówione wyżej. W przypadku, gdy multimer przeznaczony jest do hybrydyzowania z innym multimerem, jednostki polinukleotydowe pierwsza i druga - są heterogeniczne (różne) i nie hybrydyzują ze sobą w warunkach prowadzenia danej próby. Tak więc, multimery mogą stanowić znakowane sondy lub ligandy wiążące znacznik z sondą.

Stosowane tu określenie wirusowy RNA, obejmujące RNA HCV, oznacza RNA pochodzący z genomu wirusa, z jego fragmentów, transkryptów i z sekwencji zmutowanych.

Używane tu określenie próbka blstoglczna oznacza próbkę tkanki lub płynu wyizolowanej/ego/ od osobnika, którą to próbkę stanowi przykładowo: osocze, surowica, płyn rdzeniowy, lmfa, zewnętrzne wycinki skóry, wycinki z dróg oddechowych, z przewodu pokarmowego i z dróg moczowo-płciowych, łzy, ślina, mleko, krwinki, guzy, organy, jak również próbki składników hodowli komórkowych in (obejmujące, lecz nie ograniczone jedynie do niżej podanych, a mianowicie: kondycjonowane środowisko hodowli komórek z pożywek dla hodowli komórkowych, komórki przypuszczalnie zakażone wirusem, rekombinowane komórki i składniki komórek), przy czym próbki te nie ograniczają się jedynie do wyżej wymienionych.

W sposobie według wynalazku stosuje się znane fachowcom konwencjonalne techniki chemiczne, techniki biologii molekularnej, mikrobiologiczne oraz techniki rekombinacji DNA i immunologiczne. Są one w pełni opisane w liiteaatuze. Patrz na przykład - Mnuatis, Fitsch i Sambaosk, Molecular cloning; A Laboaatoay Manual (1982); dNa Cloning, tom I i II (wyd. D.N. Głowa, 1985); OOgonuclestide Synthesis (wyd. M.J. Gait, 1984); Nucleid Acid Hy12

169 035 bridization (wyd. B.D. Hames i S.J. Higgins, 1984); periodyki Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), zwłaszcza tom 154 i 155 (wyd. Wu and Grossman). Ws^stkie wymienione tu powyżej i poniżej opisy patentowe, zgłoszenia patentowe i publikacje włączono do niniejszego opisu jako odnośniki.

Opracowanie materiałów i sposobów według wynalazku stało się możliwe dzięki zidentyfikowaniu HCV jako etiotogicznego czynnika BB-N/ANBV i dzięki uzyskaniu rodziny sekwencji nukleotydowych wyizolowanych z bibliotek cDNA zawierających sekwencje cDNA HCV. Te biblioteki cDNA pochodziły z sekwencji kwasów nukleinowych obecnych w osoczu szympansów zakażonych HCV. Konstrukcję jednej z tych 5101ϊ<^1^^1<, biblioteki c (ATCC nr 40394) ujawniono w międzynarodowej publikacji nr WO/14436.

Przy zastosowaniu wcześniej opisanych sekwencji cDNA HCV, jak również sekwencji ujawnionych w niniejstym opisie można zbudować oligomery użyteczne jako reagenty do wykrywania wirusowych polinukleotydów w próbkach biologicznych. Przykładowo, na podstawie tych sekwencji można zsyntetyyować oligomery DNA o długości 8-0 nukleotydów lub dłuższe, które stosuje się jako sondy hybrydyzacyjne do wykrywania obecności RNA HCV, przykładowo we krwi pochodzącej od dawców krwi, we frakcjach krwi i surowicy, pochodzących od osobników podejrzanych o posiadanie wirusa lub w hodowlach komórkowych, w których wirus ulega replikacji. Ponadto, ujawnione tu nowe oligomery umożliwiają dalsze scharakteiyzowanie genomu HCV. Sondy polinukleotydowe i startery pochodzące od tych sekwencji można stosować do amplifkowania sekwencji znajdujących się w bibliotekach cDNA i/lub do skriningu bibliotek cDNA pod kątem dodatkowych nakładających się na siebie sekwencji cDNA, które z kolei stosuje się do uzyskiwania sekwencji nakładających się na siebie w jeszcze większym stopniu. Jak podano w międzynarodowej publikacji nr WO90/14436, wydaje się, że genom HCV stanowi RNA zawierający głównie dużą otwartą fazę odczytu (ORF) kodującą dużą poliproteinę.

Ponadto, powyższe infoπnazje pozwalają na identyfikację dodatkowych szczepów lub izolatów HCV. Izolowanie lub charakteryzowanie dodatkowych szczepów lub izolatów HCV można przeprowadzić, przykkadowo, przez wyodrębnienie kwasów nukleinowych z części ciała zawierających cząstki wirusa i/lub wirusowy RNA, wytworzenie bibliotek cDNA przy użyciu oligomerów utrzymaryzh w oparciu o sekwencję HCV1 w celu przeprowadzenia skriningu tych bibliotek pod kątem klonów zawierających sekwencję cDNA HCV opisane poniżej i porównanie kwasów cDNA HCV z nowych izolatów z kwasami cDNA opisanymi w międzynarodowej publikacji nr WO90/14436 oraz poniżej w niniejszym opiz<e. szczepy lub izolaty, których cechy zgadzają się z cechami HCV, jak opisano powyżej w części Dffinicje, są łatwe do zidentyfikowania. Inne sposoby identyfkowania szczepów HCV staną się oczywiste dla fachowców dzięki informacjom ujawnionym w niniejs^tym opisie.

Izolowanie sekwencji cDNA HCV

Oligomery stosowane w sposobie według wynalazku, zawierają regiony, które tworzą struktury hybrydowego dupleksu z docelowymi sekwencjami polinukłeotyyiów HCV. Regiony oligomerów hybrydyzujące z polinukleotydem HCV zaprojektowano wykorzystując sekwencje cDNA HCV ujawnione w niniejszym opisie i opisane w międzynarodowej publikacji nr WO90114436. cDNA HCV z HCV1, prototypowego HCV, jak przedstawiono na fgurze 1. Budowę sekwencji wyprowadzono z informacji sekwencyjnych pochodzących z szeregu klonów cDNA HCV, które wyizolowano z szeregu bibliotek cDNA HCV, włącznie z b<bl^<t^^l<ą c obecną w lambda gt 11 (λ g1 1 1( (ATCC nr 40394) i z dukzkiej rurowicy. Ktonc cDAA HCV wyizolowano metodami ujawnionymi w międzynarodowej publikacji nr W(^'^(/^^^ł^z136. W skrócie, większość wyizolowanych klonów zawierała sekwencje z biblioteki c cDNA HCV, którą skorstryowano przy zastosowaniu surowicy pobranej od szympansa z chroniczną infekcją HCV o wysokim mianie wirusa, to jest co najmniej 10⁶ dawek infekcyjnych szympansa/1 ml (dD/ml). Zebraną surowicę zastosowano do wyizolowania cząstek wirusa, kwasy nukleinowe wyizolowane z tych cząstek używano jako matrycę do konstriowania bibliotek cDNA genomu wirusa. Klon wyjściowy, 5-1-1, ut^^ynaru na drodze skriningu biblioteki c za pomocą surowicy z zakażonych osobników·'. Po wyizolowaniu klonu wyjściowego, resztę sek169 035 wencji otrzymano przez przeprowadzenie skriningu za pomocą syntetycznych sond polinukleotydowych, których sekwencje pochodziły z regionów 5' i 3' znanych sekwencji cDNA HCV.

Opis sposobów uzyskania sekwencji cDNA jest interesujący głównie z historycznego punktu widzenia. Otrzymane sekwencje (i sekwencje komplementarne) ujawniono w niniejszym opisie; sekwencje lub jakąkolwiek ich część można wytworzyć syntetycznie lub przez połączenie metody syntezy i metody otrzymywania częściowych sekwencji sposobami podobnymi do ujawnionych w międzynarodowej publikacji nr WO90/14436.

Oligomerowe sondy i startery

Oligomery o długości około 8 nukleotydów lub dłuższe, które hybrydyzują z dodatnią nicią /nićmi/ rNa HCV lub z nićmi komplementarnymi oraz z kwasami cDNA HCV, można wytworzyć biorąc za podstawę genom HCV (jak zilusttrwany na figurze 1) i/lub, korzystnie, konserwatywne regiony genomu HCV. Takie oligomery mogą służyć jako sondy do wykrywania (włącznie z izolowaniem i/lub znakowaniem) polinukleotydów zawierających sekwencje nukleotydowe HCV i/lub jako startery do transkrypcji i/lub replikacji docelowych sekwencji HCV. Oligomery zawierają polll^ul<l^<rru^dc^rvą sekwencję wyszukującą, która składa się z nukleotydów komplementarnych do docelowej sekwencji nukleotydowej HCV; sekwencja ta jest wystarczająco długa i komplementarna do sekwencji HCV, aby mógł powstać dupleks o trwałości dostatecznej dla osiągnięcia zamierzonego celu. Na przykład, jeśli celem takim jest izolacja poprzez unieruchomienie badanej sekwencji zawierającej docelową sekwencję HCV, oligomery powinny zawierać region polinukleotydu, którego długość i stopień komplemettarności do docelowej sekwencji HCV jest wystarczający na to, aby uzyskać dostateczną trwałość dupleksu, by badany odcinek został unieruchomiony na stałej powierzchni poprzez jego związanie z oligomerami w warunkach prowadzonej izolacji. Przykładowo, jeśli oligomery mają służyć jako startery transkrypcji i/lub replikacji docelowych sekwencji HCV w badanym poiinukleotydzie, oligomery takie powinny zawierać region polinukleotydu, którego długość i stopień komplementa-ności do docelowej sekwencji HCV pozwoli czynnikowi polimeryzującemu na kontynuowanie replikacji od startrów, które tworzą trwały dupleks z sekwencją docelową w warunkach prowadzenia polimeryzacji. Przykładowo, jeśli oligomery mają być stosowane jako sondy znakowane lub mają wiązać się z multimerami, wyszukujący region polinukleotydu powinien posiadać długość i stopień komplementarności wystarczający na to, aby utworzyć na tyle trwałe struktury hybrydowego dupleksu ze znakowanymi sondami i/lub multimerami, by możliwe było wykrycie dupleksu. Oligomery mogą zawierać minimum około 4 przylegających do siebie nukleotydów komplementarnych do docelowej sekwencji HCV, na ogół oligomery zawierają minimum około 8 przylegających do siebie nukleotydów komplementarnych do docelowej sekwencji HCV, korzystnie minimum około 14 przylegających do siebie nukleotydów komplementarnych do docelowej sekwencji HCV. Odpowiednie nukleotydowe sekwencje wyszukujące HCV mogą składać się z nukleotydów, które są komplementarnymi nukleotydami wybranymi spośród nukleotydów cDNA HCV przedstawionych na figurze 1.

Jednakże, ollgomer nie musi składać się jedynie z sekwencji komplementarnej do poszukiwanej sekwencji HCV. Może on dodatkowo zawierać sekwencje nukleotydowe lub inne, odpowiednie dla celów, do których stosuje się oligomery. Przykładowo, jeśli oligomery stosuje się jako startery do amplifikacji sekwencji hCv metodą PCR, mogą one zawierać takie sekwencje, które jeśli są w postaci dupleksu, tworzą miejsca restrykcyjne ułatwiające klonowanie zamplifikowanych sekwencji. Również przykładowo, jeśli oligomery mają być używane jako sondy wychwytujące w próbach hybrydyzacyjnych (opisanych poniżej), powinny one dodatkowo zawierać partnera wiążącego sprzężonego z oligomerem zawierającym sekwencję nukleotydową komplementarną do poszukiwanej sekwencji HCV. Inne rodzaje użytecznych substancji lub sekwencji, które mogą być z nimi sprzężone lub wchodzić w skład oligomerów to takie, o których wiadomo, że nadają się do różnych celów, włącznie ze znakowaniem sond nukleotydowych.

Oligomery wytwarza się znanymi sposobami, obejmującymi przykładowo wycinanie, transkrypcję lub syntezę chemiczną. Wybór docelowych sekwencji i/lub regionów genomu, do których wyszukujące polinukleotydy oligomerów są komplementarne, zależy od celu. Przykła14

169 035 dowo, jeśli celem jest skrining próbek biologicznych (na przykład krwi) pod kątem obecności HCV, korzystnie oligomery stosuje się jako sondy i/lub startery, przy czym oligomery te hybrydyzują z konserwatywnymi regionami genomu HCV. W niniejssym opisie ujawniono niektóre z konserwatywnych regionów genomu HCV, z którymi mogą wiązać się oligomery, przykładowo, regiony obejmujące nukleotydy od około 5'-końca do nukleotydu około 200, lub od nukleotydu około 4000 do około 5000, lub od około 8000 do około 9040, jak przedstawiono na figurze 1, lub korzystnie nukleotydy od około -18 do około 174, od około 4056 do około 4448 i od około 4378 do około 4902. Szczególnie korzystne startery i sondy pochodzą od nukleotydu około -13 do około -73 i od około 1 do około 540, jak przedstawiono na figurze 1.

Inne regiony genomu, które są konserwatywne, łatwo wyprowadzić przez porównanie sekwencji nukleotydowych różnych izolatów HCV, włącznie z prototypem HCV, HCV1. Sposoby porównywania ze sobą genotypów w celu określenia regionów konserwatywnych i niekonserwatywnych są znane; przykłady takich sposobów ujawniono w międzynarodowej publikacji nr WO90114436.

W podstawowej próbie hybrydyzacji kwasów nukleinowych, badany jednoniciowy kwas nukleinowy (DNA albo RNA) poddaje się hybrydyzacji z sondą kwasu nukleinowego i wykrywa się wytworzone dupleksy. Sondy dla polinukleotydów HCV (naturalne lub wyprowadzone) mają taką długość, jaka pozwala na wykrycie drogą hybrydyzacji charakterystycznych sekwencji wirusowych. Podczas gdy długość wystarczająca do stosowania wynosi 6-8 nukleotydów, preferuje się sekwencje o długości 10-112 nukleotydów; optymalne wydają się być sekwencje o długości wynoszącej około 20 nukleotydów lub dłuższe. Korzystnie, takie sekwencje pochodzą od regionów meheterogenicznych. Sondy takie wytwarza się znanymi metodami, obejmującymi zautomatyzowane metody syntezy oligonukleotydów. Użytecznymi sondami są przykładowo te sondy, które pochodzą od nowych, wyizolowanych kloi^t^pw ujawnionych w niniejssym opisie, jak również różne oligomery stosowane do sondowania bibliotek cDNA, opisane poniżej. Wystarczająca jest komplementarność do dowolnej charakterystycznej części genomu HCV. Pełna komplementarność sond jest pożądana, niemniej jednak może okazać się zbędna z uwagi na zwiększenie długości fragmentu.

W przypadku stosowania takich sond jako czynników wykrywających obecność polinukleotydów HCV (na przykład podczas skrimngu zakażonej krwi), badaną próbkę biologiczną, taką jak krew lub surowicę można, jeśli jest to pożądane, poddać obróbce w celu wyodrębnienia zawartych w niej kwasów nukleinowych. Kwas nukleinowy otrzymany z próbki można poddać elektroforezie w żelu lub innym technikom rozdziału pod względem wielkości; alternatywnie, próbkę kwasu nukleinowego można poddać punktowemu blottmgowi bez stosowania rozdziału pod względem wielkości. Aby utworzyły się hybrydowe dupleksy z wyszukującą sekwencją sondy, docelowy region badanego kwasu nukleinowego musi występować w postaci jednomciowej. W przypadku gdy sekwencja występuje naturalnie w postaci jednorazowej, denaturacja nie jest potrzebna. Jednakże, jeśli sekwencja występuje w postaci dwuniciowej, należy ją zdenaturować. Denaturację przeprowadza się różnymi znanymi metodami. Po zdenaturowaniu, badany kwas nukleinowy i sondę inkubuje się w takich warunkach, w których tworzy się trwała hybryda wyszukującej sekwencji sondy z przypuszczalną badaną sekwencją docelową a powstające dupleksy zawierające sondę/y/ wykrywa się.

Do wykrywania powstającego dupleksu, o ile taki powstaje, zwykle stosuje się znakowane sondy, alternatywnie, można stosować sondę rneznakowaną lecz wykrywalną poprzez swoiste wiązanie się ze znakowanym ligandem bezpośrednio lub pośrednio. Znane są odpowiednie sondy i sposoby znakowania sond i ligandów; sposoby takie obejmują przykładowo sto^oowanie radioaktywnych znaczników włączanych znanymi metodami (na przykład metodą przemieszczania pęknięć lub z za^t^t^^oo^^an^^m kina:), s^t^^oo^^arae biotyny, grup Ouoroscencyjnych, grup uhemiluminesuercyjnych (na przykład dioksoetanów), enzymów, przeciwciał i podobnych.

Region sond stosowanyuh do wiązania badanej próbki można uczynić w pełni komplementarnym do genomu HCV. Dlatego też, w celu uniknięcia uzyskania fałszywie dodatnich wyników, pożądane jest surowe przestrzeganie reżimu warunków. Jednakże, surowy reżim

169 035 warunków można stosować tylko w przypadku, gdy sondy są komplementarne do regionów wirusowego genomu, które nie są heterogeniczne. Warunki hybrydyzacji determinuje szereg czynników występujących podczas hybrydyzacji i podczas etapu przemywania, takich jak temperatura, siła jonowa, czas trwania oraz stężenie formamidu. Czynnik te omówiono, na przykład, w publikacji T. Maniafis’a (1982).

Można również stosować różne odmiany znanego, podstawowego sposobu, obejmujące takie odmiany, które ułatwiają oddzielenie wykrywanych dupleksów od substancji obcych i/lub takie odmiany, w których sygnał pochodzący od substancji znakowanej ulega amplifikacji. Szereg takich odmian omówiono przykładowo w: Matthews i Kricka (1988), Anal. Biochem. 169:1; Landegren i wsp. (1988), Science 242:229; oraz Mmin (1989), Clin. Chem. 35:1819. Sondy nadające się do wykrywania HCV w takich próbach zbudowane są z sekwencji, które hybrydyzują z docelowymi sekwencjami polinukleolyyowymi HCV, tworząc z badaną nicią dupleksy, przy czym dupleksy te są wystarczająco trwałe, aby można je było wykryć w określonych próbach.

Jedną z odpowiednich odmian jest przykładowo odmiana ujawniona w opisie patentowym Starów Zjednoczonych Ameryki nr 4 868 105, wydanym 9 września 1988 r. oraz w publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego nr 225 807 (opublikowanej 16 czerwca 1987 r.). W tych publikacjach opisano próbę hybrydyzacji kwasu nukleinowego w roztworze, w której badany kwas nukleinowy hybrydyzuje z kompletem znakowanych sond i z kompletem sond wychwytujących. Kompleks sonda-próbka badana sprzęga przez hybrydyzację z sondą wychwytującą na staPym nośniku, która jest komplementarna do kompletu sond wychwytujących. Dzięki t^mu badany kwas nukleinowy zostaje usunięty z roztworu jako kompleks z fazą stałą. Uzyskanie badanej próbki w postaci kompleksu z fazą stał^ ułatwia kolejne etapy rozdzielania w takiej próbie. Komplet znakowanych sond jest komplementarny do znakowanej sondy związanej przez hybrydyzację z kompleksem faza statatbadana próbka.

Zwykle należy się spodziewać występowania w surowicy zakażonych osobników sekwencji genomu HCV w stoounkowo niskich stężeniach, to jest wynoszących w przybliżeniu 10'²-10‘³ dawek infekcyjnych szympansa (CID/1 ml). Z uwagi na taki poziom stężeń może zaistnieć potrzeba stosowania technik amplifikacji w próbach hybrydyzacyjnych. Takie techniki są znane. Przykładowo, w sposobie fiimy Enzo Bróchemical Corporation Bio-Bridge stosuje się terminalną transferazę dezoksynukleotydową w celu dołączenia do sondy DNA niezmodyiikowanych ogonów 3'-poli-dT. Sonda z takimi ogonami hybrydyzuje z docelową sekwencją nukleotydową, a następnie z łańcuchem poli-A zmodyfikowanym biotyną. W międzynarodowej publikacji nrWO84/03520 i w publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego nr 124 221 opisano próbę wykorzystującą hybrydyzację DNA, w której: (1) badaną próbkę hybrydyzuje się z jednoniciową sondą DNA komplementarną do oligonukleotydu znakowanego enzymem; i (2) tak otrzymany dupleks zawierający jednoniciowy ogon hybrydyzuje się z oligonukleotydem znakowanym enzymem. W publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego nr 204 510 opisano próbę z zastosowaniem hybrydyzacji DNA, w której badany DNA kontaktuje się z sondą zaopatrzoną w ogon, taki jak poli-dT, z nicią amplifikującą o sekwencji, która hybrydyzuje z ogonem sondy, taką jak sekwencja poli-A i która jest zdolna do wiązania kilku znakowanych nici. W próbie hybrydyzacyjnej opisanej w publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego nr 317 077 (z dnia 24 maja 1989 r.) wykrywającej sekwencje o stężeniu wynoszącym w przybliżeniu 10⁶/ml stosuje się multimery kwasu nukleinowego, które wiążą się z badanym jednoniciowym kwasem nukleinowym i jednocześnie z szeregiem jednoniciowych znakowanych oligonukleotydów. W szczególnie pożądanej technice można stosować około 10000-knorną amplifikację docelowych sekwencji HCV w surowicy (to jest do około 10⁶ sekwetcji/ml), jako etap próby hybrydyzacyjnej. Ampiifikację można uzyskać przykładowo przy zastosowaniu metody reakcji szczepiania łańcuchów przy udziale polimerazy (PCR) opisanej przez Souki’ego i wsp. (1986); Mullis’a i wsp. w opisie patentowym Starów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i przez Mullis’a w opisie patentowym Starów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202. Ampiifikacji można dokonać przed lub korzystnie po oczyszczeniu docelowej sekwencji HCV. Przykładowo, można stosować amplifikację w połączeniu z próbami ujaw16

169 035 nionymi w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki na 4 868 105 lub w przypadku, gdy pożądana byłaby dalsza amplifikacjai w połączeniu z paóbą hybaydyzacyjną opisaną w publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego na 317 077.

W preferowanych sposobach wykrywania sekwencji HCV badanej nici polinukleotydowej wykorzystuje się hybaydyzacyjne metody wykrywania ujawnione w opisie patentowym Stoów Zjednoczonych Ameryki nr 4 868 105 i w publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego nr 317 077. Są to próby hybaydyzacyjne typu sandwich, prowadzone w roztworze, w których stosuje się zarówno sondy wychwytujące, jak i sondy znakowane, hybrydyzujące z sekwencjami docelowymi badanego kwasu nukleinowego. W tych próbach biologicznego skaningu próbek pod kątem HCV stosuje się sondy, któae wiążą się z konserwatywnymi regionami genomu HCV. Sondy wychwytujące i znakowane mogą wiązać się na przemian z sekwencją docelową. Alternatywnie, w korzystnym wykonaniu, sondy wychwytujące i znakowane występują w kompletach, przy czym sondy jednego kompletu nie przeplatają się z sondami drugiego. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu komplety kilku sond wychwytujących hybrydyzują z większością konserwatywnych regionów genomu, podczas gdy komplet/y/ kilku sond znakowanych mogą hybiydyzować z regionami wykazującymi niewielkie rozbieżności. Przykładowo, przy zastosowaniu paototyytoweJ sekwencji cDNA HCV1 przedstawionej na figurze 1 można stosować sondy, które hybrydyzują z sekwencjami w regionie nukleotydów od około -18 do około 174 i/lub nukleotydów od około 4378 do około 4902 i/lub nukleotydów od około 4056 do około 4448. Preferowane sondy hybrydyzują z sekwencjami z regionu 5' genomu HCV, ponieważ, jak podano poniżej, ten region wydaje się być wysoce konserwatywny. Tak więc, preferowane sondy będą hybrydyzować, przykładowo, z nukleotydami od około -318 do około 174 przedstawionymi na figurze 1. Można stosować sondy, które hybrydyzują albo z dodatnią nicią regionów konserwatywnych i/lub z nicią do niej komplementarną, w zależności od celu, jakim może być przykładowo: wykrycie sekwencji genomowych wirusa lub wykrycie sekwencji cDNA HCV otrzymanych w wyniku amplifikacji PCR, bądź też wykrycie form pośrednich, aktywnych w czasie aeplikacji, prowadzących do powstawania dodatniej nici RNAHCV.

Wykrywanie RNA HC V i pochodzących od niego polίi^lulk^l^ty^d<ó^w metodą HCV/cPCR

Szczególnie użytecznym sposobem wykrywania RNA HCV lub polinukleoSyyów pochodzących od RNA HCV jest sposób HCV/cPCR stoowiący przedmiot ninieeszego zgłoszenia, w któaym to sposobie stosuje się technikę reakcji szczepiania łańcuchów za pomocą polimerazy (PCR), podaną przez Saiki’ego i wsp. (1986); Mullis’a w opisie patenloswym Stoów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 oraz pazez Mullis’a i wsp. w opisie patentosvym Stoów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202. W sposobie HCV/cPCR stosuje się startery i sondy wyprowadzone na podstawie ujawnionych w nlniejs2zyn opisie informacji o charakterze genomu HCV.

Zwykle w technice PCR wytwarza się krótkie startery oligonukleotydowe, które odpowiadają przeciwnym końcom pożądanej sekwencji. Sekwencja pomiędzy starterami nie musi być znana. Próbkę polinukleotydu wyodrębnia się i denaturuje, korzystnie przez ogrzewanie, po czym poddaje się hybrydyzacji ze starterami oligonukleotydowymi obecnymi w nadmiarze molowym. Polimeryzację katalizuje się przy udziale polimerazy zależnej od matrycy i startera, w obecności trójSosfosanów dezoksynukleotydowych lub analogów nukleotydów (dNTP). W wyniku powstają dwa długie produkty zawierające odpowiednie startery na swoich

5-końcach, związane kowalentnie z nowo-zsyntetyzowanymi nićmi komplementarnymi do nici początkowych. Zreplikowany DNA poddaje się znowu denaturacji, hybrydyzuje się ze starterami oligonukleotydowymi i ponownie poddaje się działaniu warunków polimeryzacji, rozpoczynając drugi cykl replikacji. Po drugim cyklu otrzymuje się dwie nici początkowe, dwa długie produkty z cyklu 1 i dwa krótkie produkty powstałe w wyniku replikacji z długich produktów. Krótkie produkty zawierają sekwencje (sensowne lub antysensowne) pochodzące od sekwencji docelowej, otoczone na końcach 5' i 3' sekwencjami startera. W każdym dodatkowym cyklu liczba krótkich produktów wzrasta wykładniczo. Zatem, w sposobie tym ulega amplifikacji swoista sekwencja docelowa.

169 035

Tej procedurze poddaje się próbkę podejrzaną o zawieranie RNA HCV lub jego fragmentu. Próbkę na ogół pobiera się od osobnika podejrzanego o NANBH; jednakże próbki mogą pochodzić również z innych źródeł, przykładowo z kondycjonowanego podłoża lub z komórek hodowanych in vitro, w których namnażano wirusa. Jednakże, próbka musi zawierać docelową/e/ sekwencję/e/ kwasu nukleinowego.

Próbkę poddaje się działaniu warunków, w których zachodzi odwrotna trrmskrypcja RNA HCV na cDNA HCV. Warunki takie są znane, opisali je przykładowo Maniatis i wsp. (1982), można je również znaleźć w Methods m Enzymo^g/'. Korzystnie, przeprowadzając odwrotną transkrypcję stosuje się odwrotną transkryptazę pochodzącą z różnych źródeł, obejmujących rekombinowane cząsteczki, jak również odwrotną trimskryptazę wyizolowaną przykładowo z retrowirusa, korzystnie z wirusa ptasiej białaczki mieloblastycznej (AMV) oraz odpowiednie warunki transkrypcji. cDNA HCV wytworzony w wyniku odwrotnej transkrypcji ma postać hybrydy RNA:DNA powstającej w pierwszym etapie odwrotnej transkrypcji, następnie w drugim lub w następnych etapach transkrypcji powstają hybrydy DNA:DNA.

cDNA HCV powstający w wyniku odwrotnej transkrypcji poddaje się reakcji PCR w celu zamplifkowania sekwencji docelowej. W tym celu cDNA HCV poddaje się denaturacji, a rozdzielone nici poddaje się hybrydyzacji ze starterami otaczającymi sekwencję docelową.

Rozdzielenia nici można dokonać jakąkolwiek odpowiednią metodą denaturacji, przy użyciu znanych środków fizycznych, chemicznych lub enzymatycznych. W przypadku stosowania środków fizycznych, kwas nukleinowy korzystnie ogrzewa się aż do całkowitej (>^<^‘9^t%) denaturacji. E^^n^t^eirację termiczną prowadzi się w zakresie temperatur od około 80°C do około 105°C, w ciągu okresu czasu od około 1 minuty do około 10 minut.

Po przeprowadzeniu hybrydyzacji cDNA HCV ze starterami, dokonuje się replikacji docelowych sekwencji HCV za pomocą czynników polimeryzujących z zastosowaniem startera oligonukleotydowego ^^i<ciu^^c^go syntezę replikowanego łańcucha. Startery dobiera się tak, aby byty komplementarne do sekwencji genomu HCV. Oligomeryczne startery komplementarne do regionów sensownych i antysensownych nici cDNA HCV można zaprojektować na podstawie sekwencji cDNA HCV przedstawionej na figurze 1.

Startery dobiera się tak, aby ich wzajemne położenia wzdłuż sekwencji dupleksu były takie, żeby produkt przedłużenia zsyntetyzowany do jednego startera służył, po jego oddzieleniu od matrycy (nici do niego komplementarnej), jako matryca do przedłużenia innego startera, w wyniku czego powstaje zreplikowany łańcuch o określonej długości.

W celu osiągnięcia maksymalnej wydajności amplifikacji, korzystnie stosuje się starter jednoniciowy, lecz alt^ema^ttywnie można stosować starter dwuniciowy. W przypadku startera dwuniciowego, przed zastosowaniem go do wytwarzania produktów przedłużenia poddaje się go obróbce prowadzącej do rozdzielenia nici. Korzystnie stosuje się starter oligodezoksyrcbonukleotydowy. Długość startera musi być wystarczająca do zainicjowania syntezy produktu przedłużenia w obecności czynnika polimeryzującego. Długości starterów uzależnione są od wielu czynników, takich jak temperatura i źródło pochodzenia startera oraz od stosowanej metody. Przykładowo, w zależności od złożoności sekwencji docelowej, starter oligonukleotydowy na ogół zawiera około 15-45 nukleotydów, może jednak zawierać ich więcej lub mniej. W przypadku krótkich starterów, do wytworzenia dostatecznie trwałych kompleksów hybrydowych z matrycą należy stosować niższe temperatury.

Do stosowania wybiera się startery zasadniczo komplementarne do różnych nici każdej specyficznej amplifikowanej sekwencji. Tak więc, startery nie muszą odzwierciedlać dokładnie sekwencji matrycy, lecz muszą być komplementarne w stopniu wystarczającym na to, aby hybrydyzowały w sposób seleikecvny z odpowiadającymi im nićmi. Przykładowo, do końca 5' startera może być przyłączony niekompiemeatarac fragment nukleotydowy, lecz pozostała część sekwencji startera musi być komplementarna do nici. Alternatywnie, starter może zawierać wplecione w nim niekomplementarne zasady bądź dłuższe sekwencje pod warunkiem, że starter jest komplementarny do sekwencji jednej z tInpiliikowaaych nici w stopniu wystarczającym na to, aby z nią hybrydyzował, tworząc w ten sposób seI·ukeurę dupleksu, którą można przedłużyć za pomocą środków wywołujących polimeryzację. Niekomplementarne sekwencje

169 035 nukleotydowe starterów mogą zawierać miejsca restrykcyjne. Dołączenie miejsca restrykcyjnego do końcaów/ sekwencji docelowej byłoby szczególnie pomocne przy klonowaniu sekwencji docelowej.

Należy rozumieć, że storowane w nini^ji^izyn upisie pojęcie starer może obejmować więcej niż jeden starter, zwłaszcza w przypadku, gdy występuje pewna niejasność informacji odnośnie teminalenej/ych/ sekwencji regionu docelowego, który ma być amplifikowany. Zatem pojęcie starter obejmuje zbiór ulil^onL^^^olt^li<5^r pełniących funkcję stoterów, zawierających sekwencje reprezentujące możliwe odmiany sekwencji, alternatywnie, pojęcie to obejmuje nukieotydy umożliwiające zwykłe sparowanie zasad. Jeden z ollgonukleotyyów należących do tego zbioru, działający jako starter będzie homologiczny z końcem sekwencji docelowej. W szczególnym przypadku, do inieżowania amplifikacji ewentualnej odmiany regionu genomu HCV stosuje się zestawy oligomerów.

Przewiduje się, że istnieje szereg szczepów lub izolatów HCV o sekwencjach różniących się od sekwencji szczepu prototypowego, HCV1. Dlatego też, w celu wykrycia odmiennych szczepów, korzystnie konzttuuje się startery, które hybrydyzują z konserwatywnymi regionami genomu HCV. Konserwatywne regiony określa się przez porównanie sekwencji nukleotydowych lub aminokwazuwych kilku szczepów/izolatów HCV. Okazuje się, że w genomie HCV istnieją co najmniej trzy regiony kodujące kunzrnrae₎ywne aminiokwazy opisane powyżej, od których mogą pochodzić startery. Uważa się, że takie regiony występują. Starery opisane po niżej w przykładach pochodzą od tych regionów, które na podstawie homotagii ich sekwencji z sekwencją Flaviwirisów uważane są za konserwatywne regiony HCV.

Startery ullgonukleotyyowe wytwarza się dowolną odpowiednią metodą. Znane są sposoby wytwarzania ullgonukleotedów o określonej sekwencji, obejmują one przykładowo klonowanie i cięcie enzymami ι^^υ^ιι^ι™ odpowiednich sekwencji oraz bezpośrednią syntezę chemiczną. Sposoby polegające na chemicznej syntezie obejmują przy^udowo sposób z zastosowaniem t^<5j^^Srt)^r kwasu fosforowego opisany przez Narang’a i wsp. (1979), sposób z zastosowaniem dwuestrów kwasu fosforowego opisany przez Brown’a i wsp. (1979), metodę z użyciem dwuetylofosforoamidanu z ujawnioną przez Beucage’a i wsp. (1981) oraz sposób z użyciem statogo nośnika według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 458 066.

Jeśli jest to pożądane, stosuje się startery znakowane za pomocą włączonych do nich czynników wykrywalnych metodami spektrouZopowymi, fotochemicznymi, biochemicznymi, lmmunuchemlcznym< lub chemicznymi.

Reakcję przedłużenia startera./ów/ ullgonukleotydowego/ych/ na matrycy katalizuje się za pomocą czynnika polimeryzującego w obecności odpowiednich ilości czterech rrójfusforanów dezoksynukleotydowych (dATP, dGTP, dCTP i dTTP) oraz ich analogów, w środowisku reakcji składającym się z odpowiednich soli, kationów metali i układu buforującego pH. Odpowiednimi czynnikami polimeryzującymi są enzymy, o których wiadomo, że katalizują syntezę DNA przy użyciu startera i matrycy. Znane pullmerazy DNA obejmują przykładowo poiimerazę DNA I E. coli lub jej fragment KZenowa, polimerazę DNA T4 oraz po^merazę DNA Taq. warunki reakcji syntezy DNA katalizowanej tymi pulinerazami DNA są znane.

Produktami syntezy są cząsteczki dupleksów składające się z nici matrycy oraz z nici przedłużenia startera, które to cząsteczki zawierają sekwencję docelową. Produkty te pełnią z kolei rolę matrycy w następnym etapie replikacji. W drugim etapie replikacji nić przedłużenia startera z pierwszego cyklu poddaje się hybrydyzacji z komplementarnym do niej starterem, a w wyniku syntezy otrrymuje się krótki produkt, który jest związany na obu końcach -5' i 3' przez sekwencje startera lub przez sekwencje komplementarne. W wyniku powtarzających się cykli denaturacji, hybrydyzacji ze starterem i przedłużania osiąga się wykładniczy wzrost ilości regionu docelowego określonego przez starter. Prowadzi się taką Zic^zię cykli, aby osiągnąć pożądaną dość polinukleotydu zawierającego region docelowy kwasu nukleinowego. Pożądana ilość pulinukleotydu zależy od celu, jakiemu ma skużyć wytworzony pol<nuklruryd.

Reakcję PCR prowadzi się w kilku cyklach. Przykładowo, można prowadzić ją etapowo, czyli dodając nowe reagenty po zakończeniu każdego etapu lub w taki sposób, że wszystkie

169 035 reagenty dodaje się jednocześnie, albo metodą częściowo-ettpową w której nowe reagenty dodaje się po zakończeniu kilku etapów.

Korzystnie, reakcję PCR prowadzi się jako proces zautomatyzowany, w którym stosuje się enzymy tenmostabilne. W takim procesie mieszaninę reakcyjną poddaje się obiegowi poprzez strefę, w której odbywa się denaturacja, strefę, w której następuje hybrydyzacja ze starterem i strefę, w której zachodzi reakcja. Można stosować urządzenie specjalnie dostosowane do pracy z enzymami teimostabilnymi, w którym to urządzeniu wykorzystuje się cykliczne zmiany temperatury bez układu podawania cieczy, ponieważ nie ma potrzeby dodawania enzymów w każdym cyklu. Taki typ urządzenia można nabyć w finmie Perkin Elmer Cetus Corp.

Po przeprowadzeniu amplifikacji metodą PCR, docelowe polmukleotydy wykrywa się przez hybrydyzację z sondą polmukleotydową która tworzy trwałe hybrydy z tą sekwencją docelową w wyniku ścisłej bądź umiarkowanie ścisłej hybrydyzacji w warunkach przemywania. Jeżeli przewiduje się, że sondy będą w pełni komplementarne do sekwencji docelowej (to jest w 99% lub więcej), stosuje się ostry reżim warunków. Jeżeli przewiduje się pewną mekompiementarność, przykładowo, gdy podejrzewa się odmienne szczepy, do których sonda nie jest komplementarna w pełni, można zrezygnować z hybrydyzacji ścisłej. Jednakże, dobiera się takie warunki, które wykluczają niespecyfkcne/prryyadkowe wiązanie. Warunki, które wpływają na hybrydyzację i działają przeciwko niespecfccnemu wiązaniu są znane, opisali je przykładowo Mnuatis i wsp. (1982). Na ogół niższe stężenie soli i wyższa temperatura zwiększają specyficzność wiązania. Przykładowo, zwykle uważa się, że dla specyficznej hybrydyzacji stosuje się inkubację w roztworach zawierających w przybliżeniu 0,1 x SSC, 0,1% SDS i temperaturę inkubacjlkprzemcwama wynoszącą około 65°C a dla umiarkowanie specyficznej hybrydyzacji stosuje się inkubację w roztworach zawierających w przybliżeniu 1-2 x SSC, 0,1% SDS i temperaturę inkubacjkprzemywania wynoszącą około 50°C-65°C. Dla hybrydyzacji o niskim stopniu specyficzności stosuje się 2 x SSC i temperaturę wynoszącą około 30°C-50°C.

Sondy dla sekwencji docelowych HCV mogą pochodzić od sekwencji cDNA HCV przedstawionej na figurze 1 albo od sekwencji nowych izolatów HCV. Sondy HCV mogą mieć dowolną dogodną dłagość obejmującą region docelowy, lecz bez starterów, która to długość umożliwi wybiórczą hybrydyzację z regionem docelowym. W przypadku, gdy będzie występować pełna komplementarność, to jest, jeśli szczep zawiera sekwencję identyczną z sekwencją sondy, można stosować krótkie sondy, to znaczy o długości w zakresie około 10-30 par zasad, ponieważ dupleks będzie stoounkowo trwały nawet przy zastosowaniu ostrego reżimu warunków. W przypadku, gdy należy się spodziewać pewnego stopnia rnekomplementarności z sondą, to jest, jeśli podejrzewa się, że sonda będzie hy'bnydyzować z odmiennym regionem, można stooować sondy dłuższe, ponieważ wydaje się, że większa długość zniesie efekt niekomplementarności. Kwas nukleinowy sondy o sekwencji komplementarnej do sekwencji docelowej można zsyneetyzować przy zastosowaniu technik opisanych wyżej dla syntezy sekwencji startera. Jeśli jest to pożądane, można stosować sondę znakowaną. Odpowiednie znaczniki opisano powyżej.

W pewnych przypadkach może być pożądane określenie długości produktu reakcji PCR wykrytego za pomocą sondy. Może być to szczególnie isto^tne, jeśli zachodzi obawa, że w regionie docelowych odmiennych szczepów HCV występują delecje lub w przypadku, gdy istnieje potrzeba potwierdzenia długości produktu reakcji PCR. W takich przypadkach produkty korzystnie poddaje się analizie pod kątem wielkości, jak również hybrydyzacji z sondą. Sposoby określania wielkości kwasów nukleinowych są znane i obejmują przykładowo elektroforezę w żelu, sedymentację w gradientach stężeń oraz ekskl^^j^ą chromatografię żelową.

Obecność sekwencji docelowej w próbce biologicznej wykrywa się przez stwierdzenie, czy powstała hybryda sondy polinukleotydowej HCV z kwasem nukleinowym poddanym technice amplifikacji PCR. Znane są sposoby wykrywania hybryd powstałych z sondy i z sekwencji kwasu nukleinowego. Przykładowo, nieznakowaną próbkę można przenieść na stałe podłoże, z którym próbka wiąże się i tak związaną próbkę poddać działaniu warunków umożliwiających wybiórczą hybrydyzację ze znakowaną sondą, po czym zbadać stałe podłoże pod kątem obecności znakowanej sondy. Alternatywnie, w przypadku stosowania znakowanej próbki, niezna20

169 035 kowaną sondę wiąże się z podłożem, a po poddaniu jej działaniu odpowiednich warunków hybrydyzacji, bada się podłoże pod kątem obecności znacznika. Inne odpowiednie próby hybrydyzacyjne opisano przedtem.

Oznaczenie różnych sekwencji HCV metodą PCR

W celu zidentyfikowania różnych szczepów HCV i zaprojektowania dla nich sond, do amplifikacji różnych regionów genomu HCV zastioi^s^wano wyżej opisaną metodę HCV/PCR umożliwiającą określenie sekwencji nukleotydowych takich różnych regionów docelowych. Na ogół przypuszcza się, że odmienne typy HCV występują w innych miejscach geograficznych niż te, w których dominuje szczep HCV1, na przykład w Japonii, Afryce i podobnych lub u innych gatunków kręgowców, ulegających zakażeniu wirusem. Odmiana HCV może również powstać podczas pasażowania w hodowlach tkankowych, albo w wyniku spontanicznych lub indukowanych mutacji.

W celu zidentyfikowania odmiany regionu docelowego zaprojektowano startery fankujące podejrzany region i korzystnie, komplementarne do regionów konserwatywnych. Startery dla dwóch regionów HCV prawdopodobnie konserwatywnych oparte są na modelu Flaviwirusa. Te startery i sondy można zaprojektować przy zastosowaniu sekwencji szczepu HCV1 przedstawionej na figurze 1.

Analizy sekwencji nukleotydowej regionu/ów/ docelowego/ych/ można dokonać poprzez bezpośrednią analizę produktów amplifikowanych metodą PCR. Sposób bezpośredniej analizy sekwencji produktów amplifikowanych metodą PCR opisali Saiki i wsp. (1988).

Alternatywnie, amplifikowaną/e/ sekwencję/e/ docelową/e/ można klonować przed dokonaniem analizy sekwencji. Sposób bezpośredniego klonowania i analizowania enzymatycznie amplifikowanych fragmentów genomu opisał Scharf (1986). W tyn sposobie, startery stosowane w technice PCR modyfikuje się w pobliżu ich końców 5' uzyskując dogodne miejsca restiykcyjne do bezpośredniego klonowania w wektorze do sekwencjonowania -M13. Po amplifikacji, produkty PCR rozszczepia się przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Dokonuje się ligacji fragmentów restrykcyjnych do wektora M13 i trransformuje się, przykładowo gospodarza JM103, którego wysiewa się, a powstałe łysinki poddaje się skriningowi poprzez hybrydyzację ze znakowaną sondą oligonukleotydową. Inne sposoby klonowania i sekwencjonowania są znane.

Uniwersalne startery dla Flayiwiirisów i dla HCV

Badania charakteru genomu HCV prowadzone przy zastosowaniu sond pochodzących od cDNA HCV, jak również informacja sekwencyjna zawarta w cDNA HCV sugerują że HCV jest wirusem podobnym do Flawwirusów. Badania te ujawniono w międzynarodowej publikacji nr WO90/14436. Porównanie sekwencji cDNA HCV wyprowadzonej z klonów cDNA HCV ze znanymi sekwencjami szeregu Flaviwiirisów wykazuje, że HCV zawiera sekwencje homologiczne do konserwatywnych sekwencji Flaviwimsów. Te konserwatywne sekwencje mogą umożliwić wytworzenie starttrów, które mogą stanowić uniwersalne starter służące do amplifikacji regionów docelowych Flawwiruuów i HCV. Identyfikacji gatunku można wówczas dokonać przy użyciu sondy swoistej dla gatunku. Genomy szeregu Flaviwirusów są znane, przykładowo, wirusa japońskiego zapalenia mózgu - Encephaiitis Virus (Sumtyoshi i wsp. /1987/), wirusa żółtej gorączki - Yellow Fever Virus (Rice i wsp. /1985/), typu 2 wirusa dengi (Hahn i wsp. /1988/), typu 4 wirusa gorączki zachodniego Nilu (C^tle i wsp. /1986/). Identyfikacji RNA HCV dokonuje się przy zastosowaniu sondy swoistej dla HCV, którego sekwencja może być określona sekwencjami cDNA HCV ujawnionymi w nmietssym opisie.

Alternatywnie, zastosowanie zestawu sond z uwzględnieniem degeneracji kodonu, a więc zestawu zawierającego sekwencje wspólne dla Flaviwiπ/sów i HCV, co wynika z porównania sekwencji aminokwasowych HCV ze znanymi sekwencjami Flaviwimsów, umożliwia znalezienie uniwersalnego sposobu wykrywania tych wirusów.

Konstrukcja pożądanych sekwencji DNA

Syntetyczne oligonukleotydy można wytworzyć w automatycznym syntetyzatorze nukleotydów opisanym przez Warner© (1984). Jeśli jest to pożądane, syntetyczne nici można zna169 035 kować za pomocą ³²P poprzez działanie kinazą polinukleotydową w obecności ³²p-ATP w standEaaiowych warunkach.

Sekwencje DNA, włącznie z sekwencjami wyizolowanymi z bibliotek cDNA można modyfikować znanymi sposobami, przykładowo, metodą ukierunkowanej mutagenezy, opisaną pazez Zoller’a (1982). W skrócie, DNA, który ^ma zostać zmodyfikowany, upakowuje się do faga w postaci sekwencji jednoniciowej i przekształca się w dwuniciowy DnA za pomocą polimerazy DNA przy użyciu jako startera syntetycznego oligonukleotydu komplementarnego do części DNA, który ma ulec modyfikacji, przy czym ten oligonukleotyd zawiera w swojej sekwencji pożądaną modyfikację. Powstały dwuniciowy DNA przenosi się do gospodarza bakteryjnego utrzymującego faga. Hodowle trrfflsfosmowanych bakterii, które zawierają replikacje każdej nici faga wysiewa się na agarze otrzymując łysinki. Teoretycznie, 50% nowych łysinek zawiera faga o zmutowanej sekwencji, a pozostałe 50% zawiera sekwencję pierwotną. Replikacje łysinek poddaje się hybrydyzacji ze znakowaną syntetyczną sondą w temperaturze i warunkach, w których następuje hybrydyzacja ze skorygowaną nicią, a z sekwencją niezmodyfikowaną nie następuje. Sekwencje, które zidentyfϊOowano pazez hybrydyzację odzyskuje się i klonuje.

Zestawy do skainmgu pod kątem polinukleotydów pochodzących od HCV

Oligomery stoowiące sondy i/lub startery do amplifikacji i/lub sknningu próbek pod kątem HCV można kompletować w postaci zestawów. Zestawy do sknmngu sekwencji HCV zawierają sondy w postaci oligomerów kwasów DNA. Zestawy do amplifikacji sekwencji HCV mogą zawierać oligomerowe startery stosowane do amplifikacji. Zestawy zwykle zawierają sondy lub startery w z góry określonej i odmierzonej iiości, jak również inne, odpowiednio zapakowane w oddzielnych, odpowiednich pojemnikach reagenty i materiały potrzebne do szczególnego określonego sposobu/ów/ hybrydyzacji i/lub amplifikacji. Przykładowo, zestaw może zawierać wzorce, bufory, nośniki, enzymy, substraty, znakowane sondy, partnerów wiążących i/lub instinikcję prowadzenia testu.

Niżej przedstawiono przykłady wykonania niniejszego wynalazku ilustrujące wynalazek, lecz nie ograniczające jego zakresu.

Przykład I. Wykrywanie dodatniej i ujemnej nici końca 5' RNA HCV w surowicy.

RNA wirusa HCV27 wyizolowanego z surowicy badano pod kątem obecności dodatnich i ujemnych nici przy użyciu metody PCR. Stosowano metodę PCR, zasadniczo jak opisano wyżej, z następującymi wyjątkami.

Wyekstrahowany RNA HCV27 poddano odwrotnej transkrypcji do jednoniciowego cDNA przy użyciu jako startera Alex90 lub JH52. Alex90 pochodzi od genomu HCV1, od nukleotydu -12 do -283 i ma następującą sekwencję:

5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'.

JH52 pochodzi od HCV, od nukleotydu -93 do -117; numery nukleotydów podano w nawiasach pod sekwencjami. W JH52 zmutowano podkreślony dwunukleotyd w celu ukorzenia miejsca NotI. Sekwencja pf JiH52 jest następująca:

/Starter/ Sekwencja do zastąpienia NotI Sekwencja HCV

JH52 5' AGTCTT GCGGCCGC ACGCCCAAATC 3' (-93) (-17)

Sekwencja Alex90 odpowiada nukleotydom od -112 do -283 dodatniej nici RNA HCV, a JH52 odpowiada nukleotydom od -17 do -93 ujemnej nici. Uzyskane jednoniciowe kwasy cDNA HCV amplifikowano oddzielnie metodą PCR przy użyciu Alex90 i JH52. Zampil0kowane produkty wykrywano metodą Southern blotting, pazy użyciu jako sondy Alex89. Alex89 odpowiada nukleotydom od -203 do -75 RNAHCV. Sekwencja Alex89 jest następująca:

5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.

Analiza wykazała, że w tej metodzie sygnały zamplifikowanych produktów obu nici RNA miały taką samą intensywność. Wyniki te sugerują, że region 5' RNA HCV może występować w postaci dwuniciowego RNA.

169 035

Przykład II. Wykrywanie RNA HCV w osoczu metodą HCV/cPCR przy zastosowaniu startrów i sond pochodzących od regionu 5' RNA HCV.

Ekstrahowanie RNS HCV z osocza

Zamrożone osocze rozmrożono pod przykryciem P3. Próbkę mieszaniny trawiącej o objętości 0,2 ml (100 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, 20 gg/ml RNA MS2, 0,5% SDS i 2 mg/ml Proteinaza K, pH 8) dodano do probówki do mikrowirowania o pojemności 2 ml i ogrzano wstępnie do temperatury 37°C. Następnie dodano osocze (0,2 ml) i mieszaninę inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 60°C. Następnie dodano fenolu (0,4 ml), a mieszaninę poddano 3-kornemu wirowaniu, trwającemu każde po 30 sekund, z 30-sekundowymi przerwami pomiędzy wirowaniami. Następnie mieszaninę odwirowano w ciągu 5 minut i odzyskano fazę wodną. Fazę organiczną ponownie eksuahhwano za pomocą 0,1 ml TES, a połączone fazy wodne ekstrahowano dwukrotnie za pomocą 1 objętości fenolu/chloroformu/IAA, a następnie za pomocą 1 objętości chloroformu. Do ekstraktu dodano 1 gl (2 gg) glikogenu (Boehringer Mannheim Corp.), 25 gl NaOAc (3 M, pH 5,4), 1,25 ml zimnego EtOH, następnie produkt zamrożono na suchym lodzie i wirowano w ciągu 10 minut. Osad rozpuszczono w 100 gl wody destylowanej i dodano 5 gl NaOAc (pH 5,4) wraz z 250 gl EtOH. Roztwór zamrożono i znowu wirowano, a otrzymany osad rozpuszczono w 10 gl wody destylowanej (dH₂O).

W celu zsyntetyzowanih z wyekstrahowanego RNA cDNA, 5 gl rozpuszczonego RNA inkubowano wstępnie z 4 gl wody l 1 gl (1 gg lub 166 pikomoh, ^-merowy) startera RT , Inkubację prowadzono w temperaturze 70°C w ciągu 3 minut, a następnie ochłodzono na lodzie. Starter RT miał następującą sekwencję:

5' CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3'.

Po wstępnej inkubacji do mieszaniny dodano: 10 gl buforu x 5 dla pierwszej nici (250 mM Tris-HCl; pH 8,3; 3,75 mM KCl; 15 mM MgCl₂; 50 mM dwuιtiotzeitol); 2,5 gl trójfosforanów dezoksynukleotydowych (10 mM każdego); 2,5 ml odwrotnej transkryptazy (MMLV z BRL, 200 jednostek/gl) oraz dopełniono wodą dest/cwaną do objętości 50 gl. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, ogrzewano w temperaturze 90°C w ciągu 3 minut i ochłodzono na lodzie.

Ampiifikacja metodą PCR

Ampiifikację metodą PCR cDNA HCV otrzymanego jak opisano wyżej przeprowadzono przy użyciu próbki kontrolnej i reagentów testowych wymienionych w tabeli poniżej. W tabeli RNA oznacza próbkę kontrolną, w której RNA wyekstrahowano od osobnika mezakażonego HCV1, tę próbkę poddano etapom syntezy cDNA i amplifikacji metodą PCR. cDNA oznacza próbkę kontrolną, którą poddano etapom syntezy cDNA i amplifikacji metodą PCR; jednakże, w tym przypadku próbkę RNA zastąpiono podczas syntezy cDNA wodą. Matzych stanowiła kontrolę dla reakcji PCR, z której wykluczono matrycę. Próbka oznacza surowicę, którą badano pod kątem obecności RNA HCV.

Tabela

	RNA (gl)	cDNA (gl)	Matryca (gl)	Próbka (gl)
woda	do 100,0	do 100,0	do 100,0	do 100,0
bufor x 10	10,0	10,0	10,0	10,0
dNTP	16,0	16,0	16,0	16,0
starter 1	0,5	0,5	0,5	0,5
starter 2	0,5	0,5	0,5	0,5
matryca	2,5	2,5	-	2,5
Taq Pol	0,5	0,5	0,5	0,2

169 035

Startera 1 i startera 2 użyto w stężeniach 0,5 pg/pl i 0,42 μg/μl, odpowiednio, startery miały następujące sekwencje:

Starter 1: 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAG 3'

Starter 2: 5' AGT CTT GCG GGG GCA CGC CCA AAT C 3'.

Te startery hybrydyzowały z konserwatywnym regionem końca 5' genomu HCV. Próbki zawierały 12,5 pl równoważników surowicy dla cDNA HCV. Stosowano następujące warunki amplifikacji:

cykli:

Denaturacja:	94°C	w ciągu 1,5 minuty
Hybrydyzacja:	60°C	w ciągu 2 minut
Elogancja:	72°C	w ciągu 3 mimtt
Końcowa elongacja:	72°C	w ciągu 30 minut

Kąpiel w temperaturze 4°C aż do usunięcia. ZampliOkowane produkty sondowano przy użyciu znakowanego DNA. Sekwencja sondy była następująca:

Sonda: 5' TTT CTT GGA TCA ACC CGC TCA ATG CCT GGA 3'.

Wyżej opisanym sposobem zbadano ponad 200 próbek surowicy zawierającej HCV. Rozpatrywano tylko te wyniki, w których kontrole były ujemne. W tym przypadku, wszystkie dodatnie próbki surowicy były także dodatnie w próbie PCR.

Przykład III. Sondy pochodzące od przypuszczalnego rdzeniowego regionu RNA

HCV.

Analiza sekwencji nukleotydowych kwasów cDNA różnych izolatów HCV wykazuje, że występuje wysoki poziom konserwatywności sekwencji w regionie od nukleotydu około 1 do nukleotydu około 570, przy numeracji nukleotydów przedstawionej na figurze 1. Ten region prawdopodobnie koduje polipeptyd rdzeniowy HCV. Zgodność sekwencji pięciu różnych izolatów z różnych miejsc geograficznych (Japonia i Stany Zjednoczone Ameryki) przedstawiono na figurze 2; HCV1 stanowi prototyp HCV, aminokwasy kodowane przez dużą otwartą Oazę odczytu ORF HCV1 przedstawiono nad sekwencjami nukleolydowymi, które są zgodne. W sekwencjach przedstawionych na figurze 2, HCV-TH uzyskano od Dr Testu Miyamura (National Institute of Health of Japan), a JC-J1 i JC-J4 od Magumi i wsp. (1990). Z figury 2 wynika, że w zgodnych sekwencjach przypuszczalnego regionu rdzeniowego występuje co najmniej 90% homologia z sekwencją HCV1. Z uwagi na wysoki stopień homologii w regionie pomiędzy nukleotydami od +1 do +571, do skriningu biologicznych próbek dodatnich pod względem HCV użyteczne są sondy tego regionu.

Komplet znakowanych sond, które można stosować do wykrywania regionu RNA HCV, który przypuszczalnie koduje polipeptyd rdzeniowy przedstawiono na figurze 3. Na figurze 3, numer sondy w komplecie obejmuje serie pollnukleotydów wraz z różnicami (heterogeniczności) przedstawionymi za pomocą kodu grupowego IUB. Te ewentualne różnice mają na celu dostosowanie do różnic w sekwencjach rukleotydow'yuh występujących w zgodnych sekwencjach różnych izolatów. Regiony sekwencji HCV, do których sondy z kompletu sond z figury 3 są komplementarne przedstawiono na figurze 4, na której numeracja nukleotydów odpowiada numeracji na figurze 1.

Ten komplet sond zastosowano w próbie wykrywania sekwencji HCV. Próbę tę opisano w międzynarodowej publikacji nr WO90114436, w części dotyczącej przykładów, zatytułowanej Sondy do hybrydyzacji typu sandwich dla HCV.

Zastosowanie przemysłowe

Sposoby ujawnione w niniejszym opisie, jak również oligomery - zarówno sondy jak i startery pochodzące od cDNA HCV - oraz zawierające je zestawy znajdują zastosowanie do dokładnego, stosunkowo prostego i ekonomicznego wykrywania obecności HCV w próbkach biologicznych, zwłaszcza we krwi przeznaczonej do transfuzji lub we krwi osobników podejrzanych o infekcję HCV. Ponadto, te sposoby i oligomery mogą znaleźć zastosowanie do wykrywania wcześniejszych stadiów infekcji HCV od tych wykrywalnych za pomocą prób immunologicznych z zastosowaniem r^e^i^mb^nowanych polipeptydów HCV. Ponadto, próba oparta na amplifikacji i hybrydyzacji polinukleotydów umożliwia wykrywanie RNA hCv w sporadycznie występujących próbkach, które wykazują wynik ujemny w próbach pod kątem prze24

169 035 ciwciał przeciwko HCV. Tak więc, ujawnione w ninieissyyn opisie sondy i startery mogą być stonowane w próbach wykorzystujących amplifikację i hybrydyzację w połączeniu z próbami immunologicznymi z użyciem polipeptydów HCV, w celu pełniejszego ^^entyfi^k^wania infekcji spowodowanych HCV oraz do badania próbek biologicznych zakażonych HCV, włącznie z krwią.

Ujawnione w opisie informacje umożliwiają projektowanie stertetnw i/lub sond wyprowadzanych z konserwatywnych regionów genomu HCV. Budowa tych statrów i sond umożliwia uzyskanie ogólnego sposobu pozwalającego na wykrywanie odmian szczepów HCV, który to sposób znajduje zastosowanie do skrmmagj krwi i jej produktów.

Jeśli startery stooowane w tym sposobie wyprowadzono z konserwatywnych regionów genomu HCV, sposób ten będzie użyteczny do wykrywania i/lub identyikowania odmian szczepów HCV. To prowadzi z kolei do opracowywania dalszych reagentów immunologicznych służących do wykrywania i diagnozowania HCV, jak również do opracowywania dalszych poimalkleotydowych służących do wykrywania i/lub leczenia HCV.

Ponadto, zestawy startrów i sond wyprowadzonych z konserwatywnych sekwencji amnokwasowych Flaviwirusów oraz HCV uczynią możliwym uniwersalne wykrywanie tych czynników zakażających.

Niżej wymienione materiały zdeponowano zgodnie z Porozumieniem Budapesztańskim w Amencan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Mayland 20852 pod następującymi numerami akcesyjnymi ATCC.

lambda-gtł 1	Nr ATCC	Data zdeponowania
biblioteka cDNA HCV	40393	1 grudnia 1987
klon 81	40388	17 liitopada 1987
klon 91	40389	17 ii!itepada 1987
klon 1-22	40390	17 liktepada 1987
klon 5-1-1	40391	18 liitopada 1987
klon 12f	40514	10 liitopada 1988
klon 35f	40511	10 liitopada 1988
klon 15e	40513	10 liitopada 1988
klon K9-1	40512	10 listopada 1988
JSC 308	20879	5 maja 1988
pS356	67683	29 kwietnia 1988

Ponadto, następujące depozyty zdeponowano w dniu 11 maja 1989 r.

Szczep	Łączniki	Nr ATCC
D1210 (Cfl/5-1-1)	EF	67967
D1210 (Cfl/81)	EF	67968
D1210 (Cfl/CA74a)	EF	67969
D1210 (Cfl/35f)	AB	67970
D1210 (Cfl/279a)	EF	67971
D1210 (Cfl/C36)	CD	67972
D1210 (Cfl/13i)	AB	67973
D1210 (Cfl/C33b)	EF	67974
D1210 (Cfl/CA290a)	AB	67975
HB101 (AB24/C100 3R)		67976

169 035

Następujące szczepy pochodzące od szczepu D1210 zdeponowano w dniu 3 maja 1988 r.

Szczep pochodny	Nr ATCC
pCF1CS/C8f	67956
pCF1AB/C12f	67952
pCF1EF/14c	67949
pCF1EF/15e	67954
pCF1AB/C25c	67958
pCF1EF/C33c	67953
pCF1EF/33f	67050
pCF1CD/33g	67951
pCF1CD/C39c	67955
pCF1EF/C40b	67957
pCF1EF/CA167b	67959

Następujące szczepy zdeponowano w dniu 12 maja 1989 a.

Szczep	Nr ATCC
Lambda gt 11 (C35)	40603
Lambda gt10 (beta-5a)	40602
D1210 (C40b)	67980
D1210 (M16)	67981

Następujące materiały biologiczne zdeponowano w dniu 23 marca 1990 r.

Materiał	Nr ATCC
5'-klon 32 (w pUC18S)	68276

Po zaakceptowaniu i opublikowaniu niniejszego zgłoszenia w postaci Patentu Stoów Zjednoczonych Ameryki, wszystkie ograniczenia dostępności tych depozytów zostaną nieodwołalnie zniesione; a w trakcie trwania postępowania w sprawie niniejszego zgłoszenia dostęp do wyszczególnionych depozytów będzie umożliwiony osobie uznanej przez Komisarza za osobę upoważnioną zgodnie z 37 CFR 1.14 i 35 USC 1.22. Ponadto, wyszczególnione depozyty będą przechowywane trzydzieści (30) lat od daty zdeponowania lub pięć (5) lat od ostatniego żądania depozytu; albo przez cały okres ważności patentu Stoów Zjednoczonych Ameryki, w zależności od tego, który z tych okresów będzie dłuższy. Wymienione tu materiały zdeponowano jedynie dla udogodnienia, dzięki powyższym opisom nie są one niezbędne dla wykonania niniejszego wynalazku; ponadto materiały te włączono do niniejszego opisu jako odnośnik.

169 035

-341 GCCAGCCCCCTGATGGGGGCGA CGGTCGGGGGACTACCCCCGCT

-319 CACTCCACCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAG GTGAGGTGGTACTTAGTGAGGGGACACTCCTTGATGACAGAAGTGCGTCTTTCGCAGATC

-259 CCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATA GGTACCGCAATCATACTCACAGCACGTCGGAGGTCCTGGGGGGGAGGGCCCTCTCGGTAT

-199 GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGA CACCAGACGCCTTGGCCACTCATGTGGCCTTAACGGTCCTGCTGGCCCAGGAAAGAACCT

-139 TCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGT AGTTGGGCGAGTTACGGACCTCTAAACCCGCACGGGGGCGTTCTGACGATCGGCTCATCA

-79 GTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAG CAACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATCCCACGAACGCTCACGGGGCCCTC

- 19 GTCTCGTAGACCGTGCACC CAGAGCATCTGGCACGTGG

Arg Thr

MetSerThrAsnProLysProGlnLysLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArgProGln 1 ATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAAAAAAAACAAACGTAACACCAACCGTCGCCCACAG

TACTCGTGCTTAGGATTTGGAGTTTTTTTTTTGTTTGCATTGTGGTTGGCAGCGGGTGTC

AspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyGlyValTyrLeuLeuProArgArg 61 GACGTCAAGTTCCCGGGTGGCGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACTTGTTGCCGCGCAGG

CTGCAGTTCAAGGGCCCACCGCCAGTCTAGCAACCACCTCAAATGAACAACGGCGCGTCC

GlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGly 121 GGCCCTAGATTGGGTGTGCGCGCGACGAGAAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAGGT

CCGGGATCTAACCCACACGCGCGCTGCTCTTTCTGAAGGCTCGCCAGCGTTGGAGCTCCA

ArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGly 181 AGACGTCAGCCTATCCCCAAGGCTCGTCGGCCCGAGGGCAGGACCTGGGCTCAGCCCGGG

TCTGCAGTCGGATAGGGGTTCCGAGCAGCCGGGCTCCCGTCCTGGACCCGAGTCGGGCCC

TyrProTrpProLeuTyrGlyAsnGluGlyCysGlyTrpAlaGlyTrpLeuLeuSerPro 241 TACCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCTGCGGGTGGGCGGGATGGCTCCTGTCTCCC

ATGGGAACCGGGGAGATACCGTTACTCCCGACGCCCACCCGCCCTACCGAGGACAGAGGG

ArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArgArgSerArgAśnLeuGly 301 CGTGGCTCTCGGCCTAGCTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGCAATTTGGGT

GCACCGAGAGCCGGATCGACCCCGGGGTGTCTGGGGGCCGCATCCAGCGCGTTAAACCCA

LysValIleAspThrLeuThrCysGlyPheAlaAspLeuMetGlyTyrIleProLeuVal 3 61 AAGGTCATCGATACCCTTACGTGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATACCGCTCGTC

TTCCAGTAGCTATGGGAATGCACGCCGAAGCGGCTGGAGTACCCCATGTATGGCGAGCAG

GlyAlaProLeuGlyGlyAlaAlaArgAlaLeuAlaHisGlyValArgValLeuGluAsp 421 GGCGCCCCTCTTGGAGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCGCATGGCGTCCGGGTTCTGGAAGAC

CCGCGGGGAGAACCTCCGCGACGGTCCCGGGACCGCGTACCGCAGGCCCAAGACCTTCTG

Fig.1 (arkusz 1 z 13)

169 035

Thr

GlyValAsnTyrAlaThrGlyAsnLeuProGlyCysSerPheSerIlePheLeuLeuAla

GGCGTGAACTATGCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTATCTTCCTTCTGGCC

CCGCACTTGATACGTTGTCCCTTGGAAGGACCAACGAGAAAGAGATAGAAGGAAGACCGG

LeuLeuSerCysLeuThrValProAlaSerAlaTyrGlnValArgAsnSerThrGlyLeu

CTGCTCTCTTGCTTGACTGTGCCCGCTTCGGCCTACCAAGTGCGCAACTCCACGGGGCTT

GACGAGAGAACGAACTGACACGGGCGAAGCCGGATGGTTCACGCGTTGAGGTGCCCCGAA

TyrHisValThrAsnAspCysProAsnSerSerIleValTyrGluAlaAlaAspAlaIle

TACCACGTCACCAATGATTGCCCTAACTCGAGTATTGTGTACGAGGCGGCCGATGCCATC

ATGGTGCAGTGGTTACTAACGGGATTGAGCTCATAACACATGCTCCGCCGGCTACGGTAG

LeuHisThrProGlyCysValProCysValArgGluGlyAsnAlaSerArgCysTrpVal

CTGCACACTCCGGGGTGCGTCCCTTGCGTTCGTGAGGGCAACGCCTCGAGGTGTTGGGTG

GACGTGTGAGGCCCCACGCAGGGAACGCAAGCACTCCCGTTGCGGAGCTCCACAACCCAC

AlaMetThrProThrValAlaThrArgAspGlyLysLeuProAlaThrGlnLeuArgArg

GCGATGACCCCTACGGTGGCCACCAGGGATGGCAAACTCCCCGCGACGCAGCTTCGACGT

CGCTACTGGGGATGCCACCGGTGGTCCCTACCGTTTGAGGGGCGCTGCGTCGAAGCTGCA

HisIleAspLeuLeuValGlySerAlaThrLeuCysSerAlaLeuTyrValGlyAspLeu

CACATCGATCTGCTTGTCGGGAGCGCCACCCTCTGTTCGGCCCTCTACGTGGGGGACCTA

GTGTAGCTAGACGAACAGCCCTCGCGGTGGGAGACAAGCCGGGAGATGCACCCCCTGGAT

CysGlySerValPheLeuValGlyGlnLeuPheThrPheSerProArgArgHisTrpThr

TGCGGGTCTGTCTTTCTTGTCGGCCAACTGTTCACCTTCTCTCCCAGGCGCCACTGGACG

ACGCCCAGACAGAAAGAACAGCCGGTTGACAAGTGGAAGAGAGGGTCCGCGGTGACCTGC

ThrGlnGlyCysAsnCysSerlleTyrProGlyHisIleThrGlyHisArgMetAlaTrp

ACGCAAGGTTGCAATTGCTCTATCTATCCCGGCCATATAACGGGTCACCGCATGGCATGG

TGCGTTCCAACGTTAACGAGATAGATAGGGCCGGTATATTGCCCAGTGGCGTACCGTACC

Val

AspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValMetAlaGlnLeuLeuArgIle

GATATGATGATGAACTGGTCCCCTACGACGGCGTTGGTAATGGCTCAGCTGCTCCGGATC

CTATACTACTACTTGACCAGGGGATGCTGCCGCAACCATTACCGAGTCGACGAGGCCTAG

ProGlnAlaIleLeuAspMetIleAlaGlyAlaHisTrpGlyValLeuAlaGlyIleAla

CCACAAGCCATCTTGGACATGATCGCTGGTGCTCACTGGGGAGTCCTGGCGGGCATAGCG

GGTGTTCGGTAGAACCTGTACTAGCGACCACGAGTGACCCCTCAGGACCGCCCGTATCGC

TyrPheSerMetValGlyAsnTrpAlaLysValLeuValValLeuLeuLeuPheAlaGly

TATTTCTCCATGGTGGGGAACTGGGCGAAGGTCCTGGTAGTGCTGCTGCTATTTGCCGGC

ATAAAGAGGTACCACCCCTTGACCCGCTTCCAGGACCATCACGACGACGATAAACGGCCG

ValAspAlaGluThrHisValThrGlyGlySerAlaGlyHisThrValSerGlyPheVal

GTCGACGCGGAAACCCACGTCACCGGGGGAAGTGCCGGCCACACTGTGTCTGGATTTGTT

CAGCTGCGCCTTTGGGTGCAGTGGCCCCCTTCACGGCCGGTGTGACACAGACCTAAACAA

SerLeuLeuAlaProGlyAlaLysGlnAsnValGlnLeuIleAsnThrAsnGlySerTrp

AGCCTCCTCGCACCAGGCGCCAAGCAGAACGTCCAGCTGATCAACACCAACGGCAGTTGG

TCGGAGGAGCGTGGTCCGCGGTTCGTCTTGCAGGTCGACTAGTTGTGGTTGCCGTCAACC

Fig. 1 (ankusz 2 z 13)

169 035

HisLeuAsnSerThrAlaLeuAsnCysAsnAspSerLeuAsnThrGlyTrpLeuAlaGly

CACCTCAATAGCACGGCCCTGAACTGCAATGATAGCCTCAACACCGGCTGGTTGGCAGGG

GTGGAGTTATCGTGCCGGGACTTGACGTTACTATCGGAGTTGTGGCCGACCAACCGTCCC

LeuPheTyrHisHisLysPheAsnSerSerGlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArg

CTTTTCTATCACCACAAGTTCAACTCTTCAGGCTGTCCTGAGAGGCTAGCCAGCTGCCGA

GAAAAGATAGTGGTGTTCAAGTTGAGAAGTCCGACAGGACTCTCCGATCGGTCGACGGCT

ProLeuThrAspPheAspGlnGlyTrpGlyProIleSerTyrAlaAsnGlySerGlyPro

CCCCTTACCGATTTTGACCAGGGCTGGGGCCCTATCAGTTATGCCAACGGAAGCGGCCCG

GGGGAATGGCTAAAACTGGTCCCGACCCCGGGATAGTCAATACGGTTGCCTTCGCCGGGG

AspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrProProLysProCysGlyIleValProAlaLys

GACCAGCGCCCCTACTGCTGGCACTACCCCCCAAAACCTTGCGGTATTGTGCCCGCGAAG

CTGGTCGCGGGGATGACGACCGTGATGGGGGGTTTTGGAACGCCATAACACGGGCGCTTC

SerValCysGlyProValTyrCysPheThrProSerProValValValGlyThrThrAsp

AGTGTGTGTGGTCCGGTATATTGCTTCACTCCCAGCCCCGTGGTGGTGGGAACGACCGAC

TCACACACACCAGGCCATATAACGAAGTGAGGGTCGGGGCACCACCACCCTTGCTGGCTG

ArgSerGlyAlaProThrTyrSerTrpGlyGluAsnAspThrAspValPheValLeuAsn

AGGTCGGGCGCGCCCACCTACAGCTGGGGTGAAAATGATACGGACGTCTTCGTCCTTAAC

TCCAGCCCGCGCGGGTGGATGTCGACCCCACTTTTACTATGCCTGCAGAAGCAGGAATTG

AsnThrArgProProLeuGlyAsnTrpPheGlyCysThrTrpMetAsnSerThrGlyPhe

AATACCAGGCCACCGCTGGGCAATTGGTTCGGTTGTACCTGGATGAACTCAACTGGATTC

TTATGGTCCGGTGGCGACCCGTTAACCAAGCCAACATGGACCTACTTGAGTTGACCTAAG

ThrLysValCysGlyAlaProProCysValIleGlyGlyAlaGlyAsnAsnThrLeuHis

ACCAAAGTGTGCGGAGCGCCTCCTTGTGTCATCGGAGGGGCGGGCAACAACACCCTGCAC

TGGTTTCACACGCCTCGCGGAGGAACACAGTAGCCTCCCCGCCCGTTGTTGTGGGACGTG

CysProThrAspCysPheArgLysHisProAspAlaThrTyrSerArgCysGlySerGly

TGCCCCACTGATTGCTTCCGCAAGCATCCGGACGCCACATACTCTCGGTGCGGCTCCGGT

ACGGGGTGACTAACGAAGGCGTTCGTAGGCCTGCGGTGTATGAGAGCCACGCCGAGGCCA

Ile

ProTrpLeuThrProArgCysLeuValAspTyrProTyrArgLeuTrpHisTyrProCys

CCCTGGATCACACCCAGGTGCCTGGTCGACTACCCGTATAGGCTTTGGCATTATCCTTGT

GGGACCTAGTGTGGGTCCACGGACCAGCTGATGGGCATATCCGAAACCGTAATAGGAACA

ThrIleAsnTyrThrIlePheLysIleArgMetTyrValGlyGlyValGluHisArgLeu

ACCATCAACTACACCATATTTAAAATCAGGATGTACGTGGGAGGGGTCGAACACAGGCTG

TGGTAGTTGATGTGGTATAAATTTTAGTCCTACATGCACCCTCCCCAGCTTGTGTCCGAC

GluAlaAlaCysAsnTrpThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSer

GAAGCTGCCTGCAACTGGACGCGGGGCGAACGTTGCGATCTGGAAGACAGGGACAGGTCC

CTTCGACGGACGTTGACCTGCGCCCCGCTTGCAACGCTAGACCTTCTGTCCCTGTCCAGG

GluLeuSerProLeuLeuLeuThrThrThrGlnTrpGlnValLeuProCysSerPheThr

GAGCTCAGCCCGTTACTGCTGACCACTACACAGTGGCAGGTCCTCCCGTGTTCCTTCACA

CTCGAGTCGGGCAATGACGACTGGTGATGTGTCACCGTCCAGGAGGGCACAAGGAAGTGT

Fig. 1 (arkusz 3 z 13)

169 035

ThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnIleValAspValGln

ACCCTACCAGCCTTGTCCACCGGCCTCATCCACCTCCACCAGAACATTGTGGACGTGCAG

TGGGATGGTCGGAACAGGTGGCCGGAGTAGGTGGAGGTGGTCTTGTAACACCTGCACGTC

TyrLeuTyrGlyValGlySerSerIleAlaSerTrpAlaIleLysTrpGluTyrValVal

TACTTGTACGGGGTGGGGTCAAGCATCGCGTCCTGGGCCATTAAGTGGGAGTACGTCGTT

ATGAACATGCCCCACCCCAGTTCGTAGCGCAGGACCCGGTAATTCACCCTCATGCAGCAA

LeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAlaArgValCysSerCysLeuTrpMetMetLeuLeu

CTCCTGTTCCTTCTGCTTGCAGACGCGCGCGTCTGCTCCTGCTTGTGGATGATGCTACTC

GAGGACAAGGAAGACGAACGTCTGCGCGCGCAGACGAGGACGAACACCTACTACGATGAG

IleSerGlnAlaGluAlaAlaLeuGluAsnLeuValIleLeuAsnAlaAlaSerLeuAla

ATATCCCAAGCGGAGGCGGCTTTGGAGAACCTCGTAATACTTAATGCAGCATCCCTGGCC

TATAGGGTTCGCCTCCGCCGAAACCTCTTGGAGCATTATGAATTACGTCGTAGGGACCGG

GlyThrHisGlyLeuValSerPheLeuValPhePheCysPheAlaTrpTyrLeuLysGly

GGGACGCACGGTCTTGTATCCTTCCTCGTGTTCTTCTGCTTTGCATGGTATTTGAAGGGT

CCCTGCGTGCCAGAACATAGGAAGGAGCACAAGAAGACGAAACGTACCATAAACTTCCCA

LysTrpValProGlyAlaValTyrThrPheTyrGlyMetTrpProLeuLeuLeuLeuLeu

AAGTGGGTGCCCGGAGCGGTCTACACCTTCTACGGGATGTGGCCTCTCCTCCTGCTCCTG

TTCACCCACGGGCCTCGCCAGATGTGGAAGATGCCCTACACCGGAGAGGAGGACGAGGAC

LeuAlaLeuProGlnArgAlaTyrAlaLeuAspThrGluValAlaAlaSerCysGlyGly

TTGGCGTTGCCCCAGCGGGCGTACGCGCTGGACACGGAGGTGGCCGCGTCGTGTGGCGGT

AACCGCAACGGGGTCGCCCGCATGCGCGACCTGTGCCTCCACCGGCGCAGCACACCGCCA

ValValLeuValGlyLeuMetAlaLeuThrLeuSerProTyrTyrLysArgTyrIleSer GTTGTTCTCGTCGGGTTGATGGCGCTGACTCTGTCACCATATTACAAGCGCTATATCAGC CAACAAGAGCAGCCCAACTACCGCGACTGAGACAGTGGTATAATGTTCGCGATATAGTCG (Asn)

TrpCysLeuTrpTrpLeuGlnTyrPheLeuThrArgValGluAlaGlnLeuHisValTrp

TGGTGCTTGTGGTGGCTTCAGTATTTTCTGACCAGAGTGGAAGCGCAACTGCACGTGTGG

ACCACGAACACCACCGAAGTCATAAAAGACTGGTCTCACCTTCGCGTTGACGTGCACACC

IleProProLeuAsnValArgGlyGlyArgAspAlaValIleLeuLeuMetCysAlaVal

ATTCCCCCCCTCAACGTCCGAGGGGGGCGCGACGCCGTCATCTTACTCATGTGTGCTGTA

TAAGGGGGGGAGTTGCAGGCTCCCCCCGCGCTGCGGCAGTAGAATGAGTACACACGACAT

HisProThrLeuValPheAspIleThrLysLeuLeuLeuAlaValPheGlyProLeuTrp

CACCCGACTCTGGTATTTGACATCACCAAATTGCTGCTGGCCGTCTTCGGACCCCTTTGG

GTGGGCTGAGACCATAAACTGTAGTGGTTTAACGACGACCGGCAGAAGCCTGGGGAAACC

IleLeuGlnAlaSerLeuLeuLysValProTyrPheValArgValGlnGlyLeuLeuArg

ATTCTTCAAGCCAGTTTGCTTAAAGTACCCTACTTTGTGCGCGTCCAAGGCCTTCTCCGG

TAAGAAGTTCGGTCAAACGAATTTCATGGGATGAAACACGCGCAGGTTCCGGAAGAGGCC

PheCysAlaLeuAlaArgLysMetIleGlyGlyHisTyrValGlnMetValIleIleLys

TTCTGCGCGTTAGCGCGGAAGATGATCGGAGGCCATTACGTGCAAATGGTCATCATTAAG

AAGACGCGCAATCGCGCCTTCTACTAGCCTCCGGTAATGCACGTTTACCAGTAGTAATTC

Fig. 1 (arkusz 4 z 13)

169 035

LeuGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValTyrAsnHisLeuThrProLeuArgAspTrpAla

TTAGGGGCGCTTACTGGCACCTATGTTTATAACCATCTCACTCCTCTTCGGGACTGGGCG

AATCCCCGCGAATGACCGTGGATACAAATATTGGTAGAGTGAGGAGAAGCCCTGACCCGC

HisAsnGlyLeuArgAspLeuAlaValAlaValGluProValValPheSerGlnMetGlu

CACAACGGCTTGCGAGATCTGGCCGTGGCTGTAGAGCCAGTCGTCTTCTCCCAAATGGAG

GTGTTGCCGAACGCTCTAGACCGGCACCGACATCTCGGTCAGCAGAAGAGGGTTTACCTC

ThrLysLeuIleThrTrpGlyAlaAspThrAlaAlaCysGlyAspIlelleAsnGlyLeu

ACCAAGCTCATCACGTGGGGGGCAGATACCGCCGCGTGCGGTGACATCATCAACGGCTTG

TGGTTCGAGTAGTGCACCCCCCGTCTATGGCGGCGCACGCCACTGTAGTAGTTGCCGAAC

ProValSerAlaArgArgGlyArgGluIleLeuLeuGlyProAlaAspGlyMetValSer

CCTGTTTCCGCCCGCAGGGGCCGGGAGATACTGCTCGGGCCAGCCGATGGAATGGTCTCC

GGACAAAGGCGGGCGTCCCCGGCCCTCTATGACGAGCCCGGTCGGCTACCTTACCAGAGG

LysGlyTrpArgLeuLeuAlaProIleThrAlaTyrAlaGlnGlnThrArgGlyLeuLeu

AAGGGGTGGAGGTTGCTGGCGCCCATCACGGCGTACGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCCTA

TTCCCCACCTCCAACGACCGCGGGTAGTGCCGCATGCGGGTCGTCTGTTCCCCGGAGGAT

GlyCysIleileThrSerLeuThrGlyArgAspLysAsnGlnValGluGlyGluValGln GGGTGCATAATCACCAGCCTAACTGGCCGGGACAAAAACCAAGTGGAGGGTGAGGTCCAG CCCACGTATTAGTGGTCGGATTGACCGGCCCTGTTTTTGGTTCACCTCCCACTCCAGGTC

IleValSerThrAlaAlaGlnThrPheLeuAlaThrCysIleAsnGlyValCysTrpThr

ATTGTGTCAACTGCTGCCCAAACCTTCCTGGCAACGTGCATCAATGGGGTGTGCTGGACT

TAACACAGTTGACGACGGGTTTGGAAGGACCGTTGCACGTAGTTACCCCACACGACCTGA

ValTyrHisGlyAlaGlyThrArgThrIleAlaSerProLysGlyProValIleGlnMet

GTCTACCACGGGGCCGGAACGAGGACCATCGCGTCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATG

CAGATGGTGCCCCGGCCTTGCTCCTGGTAGCGCAGTGGGTTCCCAGGACAGTAGGTCTAC

Ser Thr

TyrThrAsnValAspGlnAspLeuValGlyTrpProAlaProGlnGlySerArgSerLeu

TATACCAATGTAGACCAAGACCTTGTGGGCTGGCCCGCTCCGCAAGGTAGCCGCTCATTG

ATATGGTTACATCTGGTTCTGGAACACCCGACCGGGCGAGGCGTTCCATCGGCGAGTAAC

ThrProCysThrCysGlySerSerAspLeuTyrLeuValThrArgHisAlaAspValIle

ACACCCTGCACTTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATT

TGTGGGACGTGAACGCCGAGGAGCCTGGAAATGGACCAGTGCTCCGTGCGGCTACAGTAA

ProValArgArgArgGlyAspSerArgGlySerLeuLeuSerProArgProIleSerTyr

CCCGTGCGCCGGCGGGGTGATAGCAGGGGCAGCCTGCTGTCGCCCCGGCCCATTTCCTAC

GGGCACGCGGCCGCCCCACTATCGTCCCCGTCGGACGACAGCGGGGCCGGGTAAAGGATG

LeuLysGlySerSerGlyGlyProLeuLeuCysProAlaGlyHisAlaValGlyIlePhe

TTGAAAGGCTCCTCGGGGGGTCCGCTGTTGTGCCCCGCGGGGCACGCCGTGGGCATATTT

AACTTTCCGAGGAGCCCCCCAGGCGACAACACGGGGCGCCCCGTGCGGCACCCGTATAAA

ArgAlaAlaValCysThrArgGlyValAlaLysAlaValAspPheIleProValGluAsn

AGGGCCGCGGTGTGCACCCGTGGAGTGGCTAAGGCGGTGGACTTTATCCCTGTGGAGAAC

TCCCGGCGCCACACGTGGGCACCTCACCGATTCCGCCACCTGAAATAGGGACACCTCTTG

Fig. 1 (arkusz 5 z 13)

169 035

LeuGluThrThrMetArgSerProValPheThrAspAsnSerSerProProValValPro

CTAGAGACAACCATGAGGTCCCCGGTGTTCACGGATAACTCCTCTCCACCAGTAGTGCCC

GATCTCTGTTGGTACTCCAGGGGCCACAAGTGCCTATTGAGGAGAGGTGGTCATCACGGG

GlnSerPheGlnValAlaHisLeuHisAlaProThrGlySerGlyLysSerThrLysVal

CAGAGCTTCCAGGTGGCTCACCTCCATGCTCCCACAGGCAGCGGCAAAAGCACCAAGGTC

GTCTCGAAGGTCCACCGAGTGGAGGTACGAGGGTGTCCGTCGCCGTTTTCGTGGTTCCAG

ProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLysValLeuValLeuAsnProSerValAlaAla

CCGGCTGCATATGCAGCTCAGGGCTATAAGGTGCTAGTACTCAACCCCTCTGTTGCTGCA

GGCCGACGTATACGTCGAGTCCCGATATTCCACGATCATGAGTTGGGGAGACAACGACGT

Leu

ThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLysAlaHisGlylleAspProAsnlleArgThr

ACACTGGGCTTTGGTGCTTACATGTCCAAGGCTCATGGGATCGATCCTAACATCAGGACC

TGTGACCCGAAACCACGAATGTACAGGTTCCGAGTACCCTAGCTAGGATTGTAGTCCTGG

GlyValArgThrIleThrThrGlySerProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeu

GGGGTGAGAACAATTACCACTGGCAGCCCCATCACGTACTCCACCTACGGCAAGTTCCTT

CCCCACTCTTGTTAATGGTGACCGTCGGGGTAGTGCATGAGGTGGATGCCGTTCAAGGAA

AlaAspGlyGlyCysSerGlyGlyAlaTyrAspIlellelleCysAspGluCysHisSer

GCCGACGGCGGGTGCTCGGGGGGCGCTTATGACATAATAATTTGTGACGAGTGCCACTCC

CGGCTGCCGCCCACGAGCCCCCCGCGAATACTGTATTATTAAACACTGCTCACGGTGAGG (Val)

ThrAspAlaThrSerIleLeuGlyIleGlyThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGly

ACGGATGCCACATCCATCTTGGGCATCGGCACTGTCCTTGACCAAGCAGAGACTGCGGGG

TGCCTACGGTGTAGGTAGAACCCGTAGCCGTGACĄGGAACTGGTTCGTCTCTGACGCCCC

AlaArgLeuValValLeuAlaThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisPro

GCGAGACTGGTTGTGCTCGCCACCGCCACCCCTCCGGGCTCCGTCACTGTGCCCCATCCC

CGCTCTGACCAACACGAGCGGTGGCGGTGGGGAGGCCCGAGGCAGTGACACGGGGTAGGG

AsnIleGluGluValAlaLeuSerThrThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIle

AACATCGAGGAGGTTGCTCTGTCCACCACCGGAGAGATCCCTTTTTACGGCAAGGCTATC

TTGTAGCTCCTCCAACGAGACAGGTGGTGGCCTCTCTAGGGAAAAATGCCGTTCCGATAG

ProLeuGluValIleLysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCys

CCCCTCGAAGTAATCAAGGGGGGGAGACATCTCATCTTCTGTCATTCAAAGAAGAAGTGC

GGGGAGCTTCATTAGTTCCCCCCCTCTGTAGAGTAGAAGACAGTAAGTTTCTTCTTCACG

AspGluLeuAlaAlaLysLeuValAlaLeuGlyIleAsnAlaValAlaTyrTyrArgGly

GACGAACTCGCCGCAAAGCTGGTCGCATTGGGCATCAATGCCGTGGCCTACTACCGCGGT

CTGCTTGAGCGGCGTTTCGACCAGCGTAACCCGTAGTTACGGCACCGGATGATGGCGCCA

LeuAspValSerValIleProThrSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeu CTTGACGTGTCCGTCATCCCGACCAGCGGCGATGTTGTCGTCGTGGCAACCGATGCCCTC GAACTGCACAGGCAGTAGGGCTGGTCGCCGCTACAACAGCAGCACCGTTGGCTACGGGAG

Tyr

MetThrGlyTyrThrGlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThrCysValThrGln

ATGACCGGCTATACCGGCGACTTCGACTCGGTGATAGACTGCAATACGTGTGTCACCCAG

TACTGGCCGATATGGCCGCTGAAGCTGAGCCACTATCTGACGTTATGCACACAGTGGGTC

Fig. 1 (arkusz 6 z 13)

169 035 (Ser)

ThrValAspPheSerLeuAspProThrPheThrIleGluThrIleThrLeuProGlnAsp

ACAGTCGATTTCAGCCTTGACCCTACCTTCACCATTGAGACAATCACGCTCCCCCAGGAT

TGTCAGCTAAAGTCGGAACTGGGATGGAAGTGGTAACTCTGTTAGTGCGAGGGGGTCCTA

AlaValSerArgThrGlnArgArgGlyArgThrGlyArgGlyLysProGlyIleTyrArg

GCTGTCTCCCGCACTCAACGTCGGGGCAGGACTGGCAGGGGGAAGCCAGGCATCTACAGA

CGACAGAGGGCGTGAGTTGCAGCCCCGTCCTGACCGTCCCCCTTCGGTCCGTAGATGTCT

PheValAlaProGlyGluArgProSerGlyMetPheAspSerSerValLeuCysGluCys

TTTGTGGCACCGGGGGAGCGCCCCTCCGGCATGTTCGACTCGTCCGTCCTCTGTGAGTGC

AAACACCGTGGCCCCCTCGCGGGGAGGCCGTACAAGCTGAGCAGGCAGGAGACACTCACG

TyrAspAlaGlyCysA1aTrpTyrGluLeuThrProAlaGluThrThrValArgLeuAr g TATGACGCAGGCTGTGCTTGGTATGAGCTCACGCCCGCCGAGACTACAGTTAGGCTACGA ATACTGCGTCCGACACGAACCATACTCGAGTGCGGGCGGCTCTGATGTCAATCCGATGCT

AlaTyrMetAsnThrProGlyLeuProValCysGlnAspHisLeuGluPheTrpGluGly

GCGTACATGAACACCCCGGGGCTTCCCGTGTGCCAGGACCATCTTGAATTTTGGGAGGGC

CGCATGTACTTGTGGGGCCCCGAAGGGCACACGGTCCTGGTAGAACTTAAAACCCTCCCG

ValPheThrGlyLeuThrHisIleAspAlaHisPheLeuSerGlnThrLysGlnSerGly

GTCTTTACAGGCCTCACTCATATAGATGCCCACTTTCTATCCCAGACAAAGCAGAGTGGG

CAGAAATGTCCGGAGTGAGTATATCTACGGGTGAAAGATAGGGTCTGTTTCGTCTCACCC

GluAsnLeuProTyrLeuValAlaTyrGlnAlaThrValCysAlaArgAlaGlnAlaPro

GAGAACCTTCCTTACCTGGTAGCGTACCAAGCCACCGTGTGCGCTAGGGCTCAAGCCCCT

CTCTTGGAAGGAATGGACCATCGCATGGTTCGGTGGCACACGCGATCCCGAGTTCGGGGA

ProProSerTrpAspGlnMetTrpLysCysLeuIleArgLeuLysProThrLeuHisGly

CCCCCATCGTGGGACCAGATGTGGAAGTGTTTGATTCGCCTCAAGCCCACCCTCCATGGG

GGGGGTAGCACCCTGGTCTACACCTTCACAAACTAAGCGGAGTTCGGGTGGGAGGTACCC

ProThrProLeuLeuTyrArgLeuGlyAlaValGlnAsnGluIleThrLeuThrHisPro

CCAACACCCCTGCTATACAGACTGGGCGCTGTTCAGAATGAAATCACCCTGACGCACCCA

GGTTGTGGGGACGATATGTCTGACCCGCGACAAGTCTTACTTTAGTGGGACTGCGTGGGT

ValThrLysTyrIleMetThrCysMetSerAlaAspLeuGluValValThrSerThrTrp

GTCACCAAATACATCATGACATGCATGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGAGCACCTGG

CAGTGGTTTATGTAGTACTGTACGTACAGCCGGCTGGACCTCCAGCAGTGCTCGTGGACC

ValLeuValGlyGlyValLeuAlaAlaLeuAlaAlaTyrCysLeuSerThrGlyCysVal

GTGCTCGTTGGCGGCGTCCTGGCTGCTTTGGCCGCGTATTGCCTGTCAACAGGCTGCGTG

CACGAGCAACCGCCGCAGGACCGACGAAACCGGCGCATAACGGACAGTTGTCCGACGCAC

ValIleValGlyArgValValLeuSerGlyLysProAlaIleIleProAspArgGluVal

GTCATAGTGGGCAGGGTCGTCTTGTCCGGGAAGCCGGCAATCATACCTGACAGGGAAGTC

CAGTATCACCCGTCCCAGCAGAACAGGCCCTTCGGCCGTTAGTATGGACTGTCCCTTCAG

LeuTyrArgGluPheAspGluMetGluGluCysSerGlnHisLeuProTyrlleGluGln

CTCTACCGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTCTCAGCACTTACCGTACATCGAGCAA

GAGATGGCTCTCAAGCTACTCTACCTTCTCACGAGAGTCGTGAATGGCATGTAGCTCGTT

Fig. 1 (arkusz 7 z 13)

169 035

GlyMetMetLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeuLeuGlnThrAlaSer

GGGATGATGCTCGCCGAGCAGTTCAAGCAGAAGGCCCTCGGCCTCCTGCAGACCGCGTCC

CCCTACTACGAGCGGCTCGTCAAGTTCGTCTTCCGGGAGCCGGAGGACGTCTGGCGCAGG

ArgGlnAlaGluValIleAlaProAlaValGlnThrAsnTrpGlnLysLeuGluThrPhe

CGTCAGGCAGAGGTTATCGCCCCTGCTGTCCAGACCAACTGGCAAAAACTCGAGACCTTC

GCAGTCCGTCTCCAATAGCGGGGACGACAGGTCTGGTTGACCGTTTTTGAGCTCTGGAAG

TrpAlaLysHisMetTrpAsnPhelleSerGlylleGlnTyrLeuAlaGlyLeuSerThr·

TGGGCGAAGCATATGTGGAACTTCATCAGTGGGATACAATACTTGGCGGGCTTGTCAACG

ACCCGCTTCGTATACACCTTGAAGTAGTCACCCTATGTTATGAACCGCCCGAACAGTTGC

LeuProGlyAsnProAlaIleAlaSerLeuMetAlaPheThrAlaAlaValThrSerPro

CTGCCTGGTAACCCCGCCATTGCTTCATTGATGGCTTTTACAGCTGCTGTCACCAGCCCA

GACGGACCATTGGGGCGGTAACGAAGTAACTACCGAAAATGTCGACGACAGTGGTCGGGT

LeuThrThrS erG InThr LeuLeuPheAsnI 1 eLeuGlyG lyTrpVa lAlaAlaGlnLeu CTAACCACTAGCCAAACCCTCCTCTTCAACATATTGGGGGGGTGGGTGGCTGCCCAGCTC GATTGGTGATCGGTTTGGGAGGAGAAGTTGTATAACCCCCCCACCCACCGACGGGTCGAG

AlaAlaProGlyAlaAlaThrAlaPheValGlyAlaGlyLeuAlaGlyAlaAlaIleGly

GCCGCCCCCGGTGCCGCTACTGCCTTTGTGGGCGCTGGCTTAGCTGGCGCCGCCATCGGC

CGGCGGGGGCCACGGCGATGACGGAAACACCCGCGACCGAATCGACCGCGGCGGTAGCCG

SerValGlyLeuGlyLysValLeuIleAspIleLeuAlaGlyTyrGlyAlaGlyValAla

AGTGTTGGACTGGGGAAGGTCCTCATAGACATCCTTGCAGGGTATGGCGCGGGCGTGGCG

TCACAACCTGACCCCTTCCAGGAGTATCTGTAGGAACGTCCCATACCGCGCCCGCACCGC (Gly)

GlyAlaLeuValAlaPheLysIleMetSerGlyGluValProSerThrGluAspLeuVal

GGAGCTCTTGTGGCATTCAAGATCATGAGCGGTGAGGTCCCCTCCACGGAGGACCTGGTC

CCTCGAGAACACCGTAAGTTCTAGTACTCGCCACTCCAGGGGAGGTGCCTCCTGGACCAG

AsnLeuLeuProAlaIleLeuSerProGlyAlaLeuValValGlyValValCysAlaAla

AATCTACTGCCCGCCATCCTCTCGCCCGGAGCCCTCGTAGTCGGCGTGGTCTGTGCAGCA

TTAGATGACGGGCGGTAGGAGAGCGGGCCTCGGGAGCATCAGCCGCACCAGACACGTCGT

IleLeuArgArgHisValGlyProGlyGluGlyAlaValGlnTrpMetAsnArgLeuIle

ATACTGCGCCGGCACGTTGGCCCGGGCGAGGGGGCAGTGCAGTGGATGAACCGGCTGATA

TATGACGCGGCCGTGCAACCGGGCCCGCTCCCCCGTCACGTCACCTACTTGGCCGACTAT

AlaPheAlaSerArgGlyAsnHisValSerProThrHisTyrValProGluSerAspAla

GCCTTCGCCTCCCGGGGGAACCATGTTTCCCCCACGCACTACGTGCCGGAGAGCGATGCA

CGGAAGCGGAGGGCCCCCTTGGTACAAAGGGGGTGCGTGATGCACGGCCTCTCGCTACGT (HisCys)

AlaAlaArgValThrAlaIleLeuSerSerLeuThrValThrGlnLeuLeuArgArgLeu

GCTGCCCGCGTCACTGCCATACTCAGCAGCCTCACTGTAACCCAGCTCCTGAGGCGACTG

CGACGGGCGCAGTGACGGTATGAGTCGTCGGAGTGACATTGGGTCGAGGACTCCGCTGAC

HisGlnTrpIleSerSerGluCysThrThrProCysSerGlySerTrpLeuArgAspIle

CACCAGTGGATAAGCTCGGAGTGTACCACTCCATGCTCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATC

GTGGTCACCTATTCGAGCCTCACATGGTGAGGTACGAGGCCAAGGACCGATTCCCTGTAG

Fig. 1 (ankusz 8 z 13)

169 035

TrpAspTrpIleCysGluValLeuSerAspPheLysThrTrpLeuLysAlaLysLeuMefc

TGGGACTGGATATGCGAGGTGTTGAGCGACTTTAAGACCTGGCTAAAAGCTAAGCTCATG

ACCCTGACCTATACGCTCCACAACTCGCTGAAATTCTGGACCGATTTTCGATTCGAGTAC

ProGlnLeuProGlyIleProPheValSerCysGlnArgGlyTyrLysGlyValTrpArg

CCACAGCTGCCTGGGATCCCCTTTGTGTCCTGCCAGCGCGGGTATAAGGGGGTCTGGCGA

GGTGTCGACGGACCCTAGGGGAAACACAGGACGGTCGCGCCCATATTCCCCCAGACCGCT (Val)

GlyAspGlyIleMetHisThrArgCysHisCysGlyAlaGluIleThrGlyHisValLys

GTGGACGGCATCATGCACACTCGCTGCCACTGTGGAGCTGAGATCACTGGACATGTCAAA

CACCTGCCGTAGTACGTGTGAGCGACGGTGACACCTCGACTCTAGTGACCTGTACAGTTT

AsnGlyThrMetArgIleValGlyProArgThrCysArgAsnMetTrpSerGlyThrPhe

AACGGGACGATGAGGATCGTCGGTCCTAGGACCTGCAGGAACATGTGGAGTGGGACCTTC

TTGCCCTGCTACTCCTAGCAGCCAGGATCCTGGACGTCCTTGTACACCTCACCCTGGAAG

ProIleAsnAlaTyrThrThrGlyProCysThrProLeuProAlaProAsnTyrThrPhe

CCCATTAATGCCTACACCACGGGCCCCTGTACCCCCCTTCCTGCGCCGAACTACACGTTC

GGGTAATTACGGATGTGGTGCCCGGGGACATGGGGGGAAGGACGCGGCTTGATGTGCAAG

AlaLeuTrpArgValSerAlaGluGluTyrValGluIleArgGlnValGlyAspPheHis

GCGCTATGGAGGGTGTCTGCAGAGGAATATGTGGAGATAAGGCAGGTGGGGGACTTCCAC

CGCGATACCTCCCACAGACGTCTCCTTATACACCTCTATTCCGTCCACCCCCTGAAGGTG

TyrValThrGlyMetThrThrAspAsnLeuLysCysProCysGlnValProSerProGlu

TACGTGACGGGTATGACTACTGACAATCTCAAATGCCCGTGCCAGGTCCCATCGCCCGAA

ATGCACTGCCCATACTGATGACTGTTAGAGTTTACGGGCACGGTCCAGGGTAGCGGGCTT

PhePheThrGluLeuAspGlyValArgLeuHisArgPheAlaProProCysLysProLeu

TTTTTCACAGAATTGGACGGGGTGCGCCTAĆATAGGTTTGCGCCCCCCTGCAAGCCCTTG

AAAAAGTGTCTTAACCTGCCCCACGCGGATGTATCCAAACGCGGGGGGACGTTCGGGAAC

LeuArgGluGluValSerPheArgValGlyLeuHisGluTyrProValGlySerGlnLeu

CTGCGGGAGGAGGTATCATTCAGAGTAGGACTCCACGAATACCCGGTAGGGTCGCAATTA

GACGCCCTCCTCCATAGTAAGTCTCATCCTGAGGTGCTTATGGGCCATCCCAGCGTTAAT

ProCysGluProGluProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThrAspProSerHis

CCTTGCGAGCCCGAACCGGACGTGGCCGTGTTGACGTCCATGCTCACTGATCCCTCCCAT

GGAACGCTCGGGCTTGGCCTGCACCGGCACAACTGCAGGTACGAGTGACTAGGGAGGGTA

IleThrAlaGluAlaAlaGlyArgArgLeuAlaArgGlySerProProSerValAlaSer

ATAACAGCAGAGGCGGCCGGGCGAAGGTTGGCGAGGGGATCACCCCCCTCTGTGGCCAGC

TATTGTCGTCTCCGCCGGCCCGCTTCCAACCGCTCCCCTAGTGGGGGGAGACACCGGTCG

SerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrAlaAsnHisAsp

TCCTCGGCTAGCCAGCTATCCGCTCCATCTCTCAAGGCAACTTGCACCGCTAACCATGAC

AGGAGCCGATCGGTCGATAGGCGAGGTAGAGAGTTCCGTTGAACGTGGCGATTGGTACTG

SerProAspAlaGluLeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsn

TCCCCTGATGCTGAGCTCATAGAGGCCAACCTCCTATGGAGGCAGGAGATGGGCGGCAAC

AGGGGACTACGACTCGAGTATCTCCGGTTGGAGGATACCTCCGTCCTCTACCCGCCGTTG

Fig. 1 (arkusz 9 z 13)

169 035

IleThrArgValGluSerGluAsnLysValValIleLeuAspSerPheAspProLeuVal

ATCACCAGGGTTGAGTCAGAAAACAAAGTGGTGATTCTGGACTCCTTCGATCCGCTTGTG

TAGTGGTCCCAACTCAGTCTTTTGTTTCACCACTAAGACCTGAGGAAGCTAGGCGAACAC

AlaGluGluAspGluArgGluIleSerValProAlaGluIleLeuArgLysSerArgArg

GCGGAGGAGGACGAGCGGGAGATCTCCGTACCCGCAGAAATCCTGCGGAAGTCTCGGAGA

CGCCTCCTCCTGCTCGCCCTCTAGAGGCATGGGCGTCTTTAGGACGCCTTCAGAGCCTCT

PheAlaGlnAlaLeuProValTrpAlaArgProAspTyrAsnProProLeuValGluThr

TTCGCCCAGGCCCTGCCCGTTTGGGCGCGGCCGGACTATAACCCCCCGCTAGTGGAGACG

AAGCGGGTCCGGGACGGGCAAACCCGCGCCGGCCTGATATTGGGGGGCGATCACCTCTGC

TrpLysLysProAspTyrGluProProValValHisGlyCysProLeuProProProLys

TGGAAAAAGCCCGACTACGAACCACCTGTGGTCCATGGCTGTCCGCTTCCACCTCCAAAG

ACCTTTTTCGGGCTGATGCTTGGTGGACACCAGGTACCGACAGGCGAAGGTGGAGGTTTC

SerProProValProProProArgLysLysArgThrValValLeuThrGluSerThrLeu

TCCCCTCCTGTGCCTCCGCCTCGGAAGAAGCGGACGGTGGTCCTCACTGAATCAACCCTA

AGGGGAGGACACGGAGGCGGAGCCTTCTTCGCCTGCCACCAGGAGTGACTTAGTTGGGAT (Ser)

SerThrAlaLeuAlaGluLeuAlaThrArgSerPheGlySerSerSerThrSerGlylle

TCTACTGCCTTGGCCGAGCTCGCCACCAGAAGCTTTGGCAGCTCCTCAACTTCCGGCATT

AGATGACGGAACCGGCTCGAGCGGTGGTCTTCGAAACCGTCGAGGAGTTGAAGGCCGTAA

ThrGlyAspAsnThrThrThrSerSerGluProAlaProSerGlyCysProProAspSer

ACGGGCGACAATACGACAACATCCTCTGAGCCCGCCCCTTCTGGCTGCCCCCCCGACTCC

TGCCCGCTGTTATGCTGTTGTAGGAGACTCGGGCGGGGAAGACCGACGGGGGGGCTGAGG (PheAla)

AspAlaGluSerTyrSerSerMetProProLeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeu

GACGCTGAGTCCTATTCCTCCATGCCCCCCCTGGAGGGGGAGCCTGGGGATCCGGATCTT

CTGCGACTCAGGATAAGGAGGTACGGGGGGGACCTCCCCCTCGGACCCCTAGGCCTAGAA

SerAspGlySerTrpSerThrValSerSerGluAlaAsnAlaGluAspValValCysCys

AGCGACGGGTCATGGTCAACGGTCAGTAGTGAGGCCAACGCGGAGGATGTCGTGTGCTGC

TCGCTGCCCAGTACCAGTTGCCAGTCATCACTCCGGTTGCGCCTCCTACAGCACACGACG

SerMetSerTyrSerTrpThrGlyAlaLeuValThrProCysAlaAlaGluGluGlnLys

TCAATGTCTTACTCTTGGACAGGCGCACTCGTCACCCCGTGCGCCGCGGAAGAACAGAAA

AGTTACAGAATGAGAACCTGTCCGCGTGAGCAGTGGGGCACGCGGCGCCTTCTTGTCTTT

LeuProIleAsnAlaLeuSerAsnSerLeuLeuArgHisHisAsnLeuValTyrSerThr

CTGCCCATCAATGCACTAAGCAACTCGTTGCTACGTCACCACAATTTGGTGTATTCCACC

GACGGGTAGTTACGTGATTCGTTGAGCAACGATGCAGTGGTGTTAAACCACATAAGGTGG

ThrSerArgSerAlaCysGlnArgGlnLysLysValThrPheAspArgLeuGlnValLeu

ACCTCACGCAGTGCTTGCCAAAGGCAGAAGAAAGTCACATTTGACAGACTGCAAGTTCTG

TGGAGTGCGTCACGAACGGTTTCCGTCTTCTTTCAGTGTAAACTGTCTGACGTTCAAGAC

AspSerHisTyrGlnAspValLeuLysGluValLysAlaAlaAlaSerLysValLysAla

GACAGCCATTACCAGGACGTACTCAAGGAGGTTAAAGCAGCGGCGTCAAAAGTGAAGGCT

CTGTCGGTAATGGTCCTGCATGAGTTCCTCCAATTTCGTCGCCGCAGTTTTCACTTCCGA

Fig. 1 (arkusz 10 z 13)

169 035 (Phe)

AsnLeuLeuSerValGluGluAlaCysSerŁeuThrProProHisSerAlaLysSerLys

AACTTGCTATCCGTAGAGGAAGCTTGCAGCCTGACGCCCCCACACTCAGCCAAATCCAAG

TTGAACGATAGGCATCTCCTTCGAACGTCGGACTGCGGGGGTGTGAGTCGGTTTAGGTTC

PheGlyTyrGlyAlaLysAspValArgCysHisAlaArgLysAlaValThrHisIleAsn

TTTGGTTATGGGGCAAAAGACGTCCGTTGCCATGCCAGAAAGGCCGTAACCCACATCAAC

AAACCAATACCCCGTTTTCTGCAGGCAACGGTACGGTCTTTCCGGCATTGGGTGTAGTTG

SerValTrpLysAspLeuLeuGluAspAsnValThrProIleAspThrThrIleMetAla

TCCGTGTGGAAAGACCTTCTGGAAGACAATGTAACACCAATAGACACTACCATCATGGCT

AGGCACACCTTTCTGGAAGACCTTCTGTTACATTGTGGTTATCTGTGATGGTAGTACCGA

LysAsnGluValPheCysValGlnProGluLysGlyGlyArgLysProAlaArgLeuIle

AAGAACGAGGTTTTCTGCGTTCAGCCTGAGAAGGGGGGTCGTAAGCCAGCTCGTCTCATC

TTCTTGCTCCAAAAGACGCAAGTCGGACTCTTCCCCCCAGCATTCGGTCGAGCAGAGTAG

ValPheProAspLeuGlyValArgValCysGluLysMetAlaLeuTyrAspValValThr

GTGTTCCCCGATCTGGGCGTGCGCGTGTGCGAAAAGATGGCTTTGTACGACGTGGTTACA

CACAAGGGGCTAGACCCGCACGCGCACACGCTTTTCTACCGAAACATGCTGCACCAATGT

LysLeuProLeuAlaValMetGlySerSerTyrGlyPheGlnTyrSerProGlyGlnArg

AAGCTCCCCTTGGCCGTGATGGGAAGCTCCTACGGATTCCAATACTCACCAGGACAGCGG

TTCGAGGGGAACCGGCACTACCCTTCGAGGATGCCTAAGGTTATGAGTGGTCCTGTCGCC

ValGluPheLeuValGlnAlaTrpLysSerLysLysThrProMetGlyPheSerTyrAsp

GTTGAATTCCTCGTGCAAGCGTGGAAGTCCAAGAAAACCCCAATGGGGTTCTCGTATGAT

CAACTTAAGGAGCACGTTCGCACCTTCAGGTTCTTTTGGGGTTACCCCAAGAGCATACTA

ThrArgCysPheAspSerThrValThrGluSerAspIleArgThrGluGluAlaIleTyr

ACCCGCTGCTTTGACTCCACAGTCACTGAGAGCGACATCCGTACGGAGGAGGCAATCTAC

TGGGCGACGAAACTGAGGTGTCAGTGACTCTCGCTGTAGGCATGCCTCCTCCGTTAGATG

GlnCysCysAspLeuAspProGlnAlaArgValAlaIleLysSerLeuThrGluArgLeu

CAATGTTGTGACCTCGACCCCCAAGCCCGCGTGGCCATCAAGTCCCTCACCGAGAGGCTT

GTTACAACACTGGAGCTGGGGGTTCGGGCGCACCGGTAGTTCAGGGAGTGGCTCTCCGAA (Giy)

TyrValGlyGlyProLeuThrAsnSerArgGlyGluAsnCysGlyTyrArgArgCysArg

TATGTTGGGGGCCCTCTTACCAATTCAAGGGGGGAGAACTGCGGCTATCGCAGGTGCCGC

ATACAACCCCCGGGAGAATGGTTAAGTTCCCCCCTCTTGACGCCGATAGCGTCCACGGCG

AlaSerGlyValLeuThrThrSerCysGlyAsnThrLeuThrCysTyrIleLysAlaArg

GCGAGCGGCGTACTGACAACTAGCTGTGGTAACACCCTCACTTGCTACATCAAGGCCCGG

CGCTCGCCGCATGACTGTTGATCGACACCATTGTGGGAGTGAACGATGTAGTTCCGGGCC

AlaAlaCysArgAlaAlaGlyLeuGlnAspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeu

GCAGCCTGTCGAGCCGCAGGGCTCCAGGACTGCACCATGCTCGTGTGTGGCGACGACTTA

CGTCGGACAGCTCGGCGTCCCGAGGTCCTGACGTGGTACGAGCACACACCGCTGCTGAAT

ValValIleCysGluSerAlaGlyValGlnGluAspAlaAlaSerLeuArgAlaPheThr

GTCGTTATCTGTGAAAGCGCGGGGGTCCAGGAGGACGCGGCGAGCCTGAGAGCCTTCACG

CAGCAATAGACACTTTCGCGCCCCCAGGTCCTCCTGCGCCGCTCGGACTCTCGGAAGTGC

Fig. 1 (arkusz 11 z 13)

169 035

GluAlaMetThrArgTyrSerAlaProProGlyAspProProGlnProGluTyrAspLeu

GAGGCTATGACCAGGTACTCCGCCCCCCCTGGGGACCCCCCACAACCAGAATACGACTTG

CTCCGATACTGGTCCATGAGGCGGGGGGGACCCCTGGGGGGTGTTGGTCTTATGCTGAAC

GluLeuIleThrSerCysSerSerAsnValSerValAlaHisAspGlyAlaGlyLysArg

GAGCTCATAACATCATGCTCCTCCAACGTGTCAGTCGCCCACGACGGCGCTGGAAAGAGG

CTCGAGTATTGTAGTACGAGGAGGTTGCACAGTCAGCGGGTGCTGCCGCGACCTTTCTCC

ValTyrTyrLeuThrArgAspProThrThrProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAla

GTCTACTACCTCACCCGTGACCCTACAACCCCCCTCGCGAGAGCTGCGTGGGAGACAGCA

CAGATGATGGAGTGGGCACTGGGATGTTGGGGGGAGCGCTCTCGACGCACCCTCTGTCGT

ArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGlyAsnllel1eMetPheAlaProThrLeuTrp AGACACACTCCAGTCAATTCCTGGCTAGGCAACATAATCATGTTTGCCCCCACACTGTGG TCTGTGTGAGGTCAGTTAAGGACCGATCCGTTGTATTAGTACAAACGGGGGTGTGACACC

AlaArgMetIleLeuMetThrHisPhePheSerValLeuIleAlaArgAspGlnLeuGlu

GCGAGGATGATACTGATGACCCATTTCTTTAGCGTCCTTATAGCCAGGGACCAGCTTGAA

CGCTCCTACTATGACTACTGGGTAAAGAAATCGCAGGAATATCGGTCCCTGGTCGAACTT

GlnAlaLeuAspCysGluIleTyrGlyAlaCysTyrSerlleGluProLeuAspLeuPro

CAGGCCCTCGATTGCGAGATCTACGGGGCCTGCTACTCCATAGAACCACTTGATCTACCT

GTCCGGGAGCTAACGCTCTAGATGCCCCGGACGATGAGGTATCTTGGTGAACTAGATGGA

ProIlelleGlnArgLeuHisGlyLeuSerAlaPheSerLeuHisSerTyrSerProGly

CCAATCATTCAAAGACTCCATGGCCTCAGCGCATTTTCACTCCACAGTTACTCTCCAGGT

GGTTAGTAAGTTTCTGAGGTACCGGAGTCGCGTAAAAGTGAGGTGTCAATGAGAGGTCCA

GluIleAsnArgValAlaAlaCysLeuArgLysLeuGlyValProProLeuArgAlaTrp

GAAATTAATAGGGTGGCCGCATGCCTCAGAAAACTTGGGGTACCGCCCTTGCGAGCTTGG

CTTTAATTATCCCACCGGCGTACGGAGTCTTTTGAACCCCATGGCGGGAACGCTCGAACC

Gly

ArgHisArgAlaArgSerValArgAlaArgLeuLeuAlaArgGlyGlyArgAlaAlaIle

AGACACCGGGCCCGGAGCGTCCGCGCTAGGCTTCTGGCCAGAGGAGGCAGGGCTGCCATA

TCTGTGGCCCGGGCCTCGCAGGCGCGATCCGAAGACCGGTCTCCTCCGTCCCGACGGTAT

CysGlyLysTyrLeuPheAsnTrpAlaValArgThrLysLeuLysLeuThrProIleAla

TGTGGCAAGTACCTCTTCAACTGGGCAGTAAGAACAAAGCTCAAACTCACTCCAATAGCG

ACACCGTTCATGGAGAAGTTGACCCGTCATTCTTGTTTCGAGTTTGAGTGAGGTTATCGC

AlaAlaGlyGlnLeuAspLeuSerGlyTrpPheThrAlaGlyTyrSerGlyGlyAspIle

GCCGCTGGCCAGCTGGACTTGTCCGGCTGGTTCACGGCTGGCTACAGCGGGGGAGACATT

CGGCGACCGGTCGACCTGAACAGGCCGACCAAGTGCCGACCGATGTCGCCCCCTCTGTAA (Pro)

TyrH i s SerVa 1S er H i s AlaAr gPr oArgTrp IleTrpPheCysLeuLeuLeuLeuAla TATCACAGCGTGTCTCATGCCCGGCCCCGCTGGATCTGGTTTTGCCTACTCCTGCTTGCT ATAGTGTCGCACAGAGTACGGGCCGGGGCGACCTAGACCAAAACGGATGAGGACGAACGA

Fig. 1 (ankusz 12 z 13)

169 035

AlaGlyValGlyIleTyrLeuLeuProAsnArgOP 9001 GCAGGGGTAGGCATCTACCTCCTCCCCAACCGATGAAGGTTGGGGTAAACACTCCGGCCT

CGTCCCCATCCGTAGATGGAGGAGGGGTTGGCTACTTCCAACCCCATTTGTGAGGCCGGA ( ) = różnice spowodowane prawdopodobnie 5' lub 3' końcową strukturą klonującą

Fig. 1 (arkusz 13 z 13)

169 035

MetSerThrAsnProLysProGlnLysLysAsnLysArgAsnThrAsnArgArgProGln HCV-1 1 ATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAAAAAAAACAAACGTAACACCAACCGTCGCCCACAG HCT18 -------------------------G-----C----------------------------

i i i cno	lilii >1 Eh U 1		1 <	lilii
1 1 1	Jh U	I	1 1 1 1	rH U	1	1	1	1 1	rH O	lilii
1 1 1		1	1 1 1 1	U U	1	1	1	1 1	u u	lilii
1 1 1	CPU	1	1 1 1 1	CP<	1	1	Eh	1 eh	0 u	1 1 Eh 1 1
1 1 1	Jh u	1	1 1 1 1	Jh U	1	1	I	1 1	Jh u	lilii
1 1 1	< u	1	1 1 1 1	< u	I	1	1	1 1	CU u	1 1 1 I 1
1 1 1	0 u	1	1 1 1 1	0 EH	1	1	1	1 1	c u	lilii
1 1 1	jh u	1	1 1 1 1	Jh U	1	1	1	1 1	t—I >4!	lilii
1 1 1	CU u	1	1 1 1 1	CU u	1	1	1	1 1	u u	lilii
1 1 u	3 u	1	1 1 1 1	c *5	1	1	1	1 1	(0 Eh	lilii
1 1 1	0) Eh	1	1 1 1 1	rH 2	1	1	1	1 1	rH O	lilii
1 1 1	- fH	1	1 1 1 1	u u	1	1	1	1 1	< u	lilii
1 1 1	3 u	1	1 1 1 1	Jh u	1	1	1	1 1	CU u	lilii
1 1 1	0) Eh	1	1 1 1 1	0) u	1	1	1	1 1	Jh o	lilii
1 1 1	- Eh	1	1 1 1 u	W EH	1	1	1	1 1	Eh Eh	lilii
1 1 1	Jh u	1	1 1 1 1	tPU	1	1	1	1 1	Jh U	lilii
1 1 1	>,<	1	1 1 1 1	Jh U	1	1	1	1 1	X U	lilii
1 1 1	Eh Eh	1	1 1 1 1	< u	1	1	1	1 1	Eh <	11110 11111
1 1 1	ι-H Eh	1	1 1 1 1	3 U	1	1	1	1 1	CPU
1 1 1	<0 Eh	1	1 1 1 1	rH <	1	1	1	1 1	Jh U	lilii
1 1 1	> u	1	1 1 1 1	U u	1	1	1	1 1		1 1 I 1 1
1 1 1	X	1	1 1 1 1	Jh u	1	1	1	1 1	>iU	lilii
1 1 1	< u	1	1 1 1 1	Q) U	1	1	1	1 1	rH U	lilii
1 1 1	u u	1	1 1 1 1	W EH	1	1	1	1 1	o o	lilii
1 1 1	>EH	1	1 1 1 1	Jh eh	1	1	1	1 1	3 O	1 1 I 1 1
1 1 1	rH o	1	1 1 1 1	X U	1	1	1	1 1	rH rij	lilii
1 1 1	u u	1	1 1 1 1	eh <	1	1	1	1 1	u u	lilii
1 1 1	i—1 £h	1	1 U 1 1	ui u	1	1	1	1 1	0 u	lilii
u u u	(0 £h	1	1 1 1 1	X	1	1	1	1 1	Jh O	lilii
1 1 1	> o	1	1 1 1 1	- 2	1	1	I	1 1	CU o	Eh 1 1 1 1
1 1 1	0) u	1	1 1 1 1	tr2	U	U	u	u u	CPO	1 i 1 1 <
1 1 1	i—l Eh	1	1 1 1 1	Jh O	1	1	1	1 1	Jh u	lilii
1 1 1	K <	1	1 1 1 1	< <	1	1	1	1 1	< u	lilii
1 1 1	c u	1	1 1 1 1	Jh U	1	1	Eh	1 Eh	CPEH	1 1 U 1 u
o u u	rH «C	1	1 1 1 1	SZ U	1	1	I	1 1	Jh u	lilii
1 1 1	u u	1	1 1 1 1	Eh <	1	1	1	I 1	< u	lilii
1 1 1	>.EH	1	1 1 1 1	<0 u	1	1	1	1 1	(0 EH	< < 1 O 1
1 1 1	rH O	1	1 1 1 1	rH U	1	1	1	1 1	rH U	1 1 1 EH 1
1 1 1	u u	1	1 1 1 1	< U	1	1	1	1 1	< u	lilii
U 1 1	>lU	1	1 Eh 1 Eh	cpu	1	1	Eh	1 1	ui u	lilii
1 1 1	rH U	1	1 1 1 I	u u	1	1	I	1 1	:x	lilii
1 1 1	U u	1	1 1 1 1	*C u	1	1	|	1 1	- 2	lilii
1 1 1	>EH	1	1 U 1 u	rH U	1	1	1	1 1	0 u	lilii
1 1 1	rH U	1	1 1 1 1	(0 Eh	1	1	1	1 1	Jh u	lilii
ł 1 1	u u	1	1 1 1 1	> u	1	1	1	1 1	CU u	lilii
1 U 1	0 o	1	1 1 1 1	>. EH	1	1	1	1 1	0) u	lilii
t 1 1	Jh U	1	1 1 1 1	rH U	1	1	1	1 1	rH Eh	lilii
1 1 1	CU u	1	1 1 1 1	u u	1	1	1	1 1	H <	lilii
1 1 1	OJ u	1	1 1 1 1	3 u	1	1	1	1 1	0 Eh	lilii
1 E-ι l	Λ Eh	1	1 1 1 1	0) EH	1	1	1	1 1	Jh u	lilii
1 1 1	CU EH	1	1 1 1 1	- Eh	1	1	1	1 1	CU u	lilii
< 1 1	ω u	1	1 1 1 1	tP<	1	u	u	1 u	c u	1 1 < 1 <
t 1 1		1	1 1 1 1	Jh U	1	1	1	1 1	rH <	lilii
1 1 1	.J <	1	1 1 1 1	< <	1	1	1	1 1	u u	lilii
1 1 1	rH u	1	1 Eh 1 1	0 Eh	1	u	u	1 u	CPtH	1 1 < 1 <
1 1 1	(0 Eh	1	1 1 1 1	Jh U	l	1	1	1 1	Jh u	1 I 1 1 1
1 1 1	> u	1	1 1 1 1	CU U	1	1	1	1 1	< o	lilii
1 1 1	au	1	1 1 1 1	>,O	1	1	1	1 1	tP<	U 1 u 1 u
1 1 1	Ul <	1	1 1 1 1	rH U	1	1	1	1 1	Jh U	lilii
1 1 1	< o	1	1 1 1 1	U U	1	1	1	1 1	< <	1 1 1 1 Eh

CM VO

T CM

VO CO

X

X

X

X

1-3

rH

e

rH

co

1-3

rH

M·

rH

co

io

rH

rH

co

1-3

rH

M

I-)

l3

1

rH

1-3

13

1

rH

1-3

1-3

1

rH

1-3

13

>

1

1

>

eh

>

1

1

>

Eh

>

1

1

>

Eh

>

1

1

u

u

u

u

u

X

u

u

u

u

u

X

u

u

u

u

U

X

U

u

u

X

X

X

X

X

eh

X

X

X

X

X

Eh

X

X

X

X

X

Eh

X

X

X

F.

N rH

Fig. 2 (arkusz

169 035

ο υ	lilii	>Eh	1 1 1 1	1	rH U	lilii	cuu	1	1 1 1 1
kt υ	lilii	rH 0	1 1 1 1	1	η EH	lilii	Ul <	1	1 1 1 1
CU υ	lilii	0 0	1 1 1 1	1	> 0	lilii	<C 0	1	1 1 1 1
Sh Εη	1 1 *4 1 <	3 0	1 1 1 1	1	3 U	lilii	3 5	1	10 10
Φ υ	lilii	Φ EH	1 1 1 1	1	Φ EH	lilii	rH <	1	1 1 1 1
W Eh	lilii	J Eh	1 1 1 1	1	0	lilii	0 0	1	1 1 1 1
3 0	lilii	C Eh	1 1 1 1	u	O 0	lilii	3 0	1	1 1 1 1
V Eh	lilii	w <	1 1 1 1	1	Sh u	lilii	0) EH	1	1 1 1 1
J U	lilii	< 3	1 1 1 1	1	CU u	lilii	k4 U	1	1 1 1 1
3 U	lilii	CPU	1 1 Eh 1	Eh	<u <	1 1 EH 1 Eh	rH Eh	1	1 1 1 1
Φ Eh	lilii	Ul 0	1 1 1 1	I	ι-l Eh	lilii	Λ Eh	1	1 1 1 1
►4 U	lilii	< u	1 1 1 1	1	UH <	lilii	> 0	1	1 1 1 1
CU0	lilii	Su 0	1 1 1 1	|	Sh u	Eh 1 1 1 Eh	o>0	1	1 1 1 1
U o	lilii	Φ u	1 1 1 1	1	>1*C	lilii	Sh 0	1	1 1 1 1
Eh Eh	lilii	W Eh	1 1 1 1	1	Eh Eh	lilii	< u	1	1 1 1 1
X	lilii	σ>0	1 1 1 1	1	>0	lilii	rH U	1	1 1 1 1
rH 0	lilii	Sh 0	1 1 1 1	1	rH 0	lilii	Λ Eh	1	liii
0 o	lilii	< <	1 1 1 1	1	0 0	lilii	> 0	1	1 1 1 1
(0 o	1 1 < 1 <	σ' Eh	1 U 1 1	1	4J 0	lilii	>iU	1	1 eh 1 Eh
rH O	lilii	U 0	1 1 1 1	1	CU EH	lilii	rH 0	1	1 1 1 I
< O	lilii	< u	1 1 1 1	1	S <	lilii	0 0	1	1 1 1 1
au	1 I 1 1 1	tP0	tlił	1	3 O	lilii	(U EH	1	1 1 1 u
u u	lilii	Ul 0	1 1 1 1	1	CU Eh	lilii	•rH	1	1 1 1 1
Eh Eh	lilii	< u	1 1 1 1	1	k4 U	lilii	£ U	1	1 1 1 1
>10	lilii	0 u	1 1 1 1	1	CU U	1 1 1 1 EH	« 0	1	1 < 1 <
rH 0	lilii	Sh u	1 1 1 1	1	ω <	lilii	rH O	1	1 1 1 1
O 0	lilii	CU u	1 1 1 1	|	< 0	lilii	*C 0	1	1 1 1 1
ui u	Eh 1 0 1 0	CU u	1 1 1 1	1	(0 U	lilii	3 0	1	1 1 1 1
>,0	1 1 EH 1 Eh	Ul <	1 1 1 1	1	rH U	lilii	Φ Eh	1	1 1 1 1
U Eh		< 0	1 1 1 1	1	< 0	lilii	kJ u	1	1 1 1 EH
>1 O	Eh 1 1 1 1	Ul <	1 1 Eh 0	0	φ u	lilii	10 u	1	1 1 1 I
r-t 0	lilii	43 U	lici	1	JC eh	lilii	rH O	1	1 1 1 1
0 0	lilii	Eh <	1111	1	CU Eh	lilii	< 0	1	1 1 1 1
3 0	lilii	0 u	1 1 1 1	1	>,U	lilii	CPU	1	1 1 1 1
rH *£	lilii	Sh U	1 1 1 1	1	rH 0	lilii	Sh 0	1	1 1 1 1
0 0	lilii	CU u	1 1 1 1	1	0 0	lilii		1	1 1 1 1
C Eh	lilii	>lU	1 1 1 1	1	Ul U	lilii	<0 u	1	1 1 1 1
W x£		rH 0	1 1 1 1	1	>10	lilii	rH U	1	1 1 1 1
< 2	lilii	0 0	1 1 1 1	1	U Eh	lilii	< 0	1	1 1 1 1
>iU	lilii	CU0	1 1 1 1	|	Ui 0	1 1 < 1 <	(0 Eh	1	1 1 1 1
rH 0	lilii	Ul 0	1 1 1 1	1	£ U	lilii	rH U	1	1 1 1 1
0 0	lilii	eh Eh	1 1 1 1	1	Eh <	lilii	< 0	1	1 1 1 1
Sh Eh	lilii	Ul U	Eh 1 Eh Eh	Eh	3 Eh	1 1 1 U 1	>iU	1	1 1 1 1
>.<	1 1 1 I 1	Φ 0	1 1 1 I	I	Φ Eh	lilii	rH 0	1	1 1 1 t
Eh Eh	lilii	ω <	1 1 1 1	|	►4 0	lilii	0 0	1	1 1 1 1
3 U	lilii	0 Eh	1 1 1 1	1	Sh U	lilii	X	1	0 0 10
V Eh	lilii	Sh U	1 1 1 1	1	43 U	lilii	rH 0	1	I 1 1 1
►J O	lilii	cu u	1 1 1 1	1	Eh	lilii	0 0	1	1 1 1 1
0 U	lilii	cno	1 1 1 1	1	CU Eh	1 · 1 1 1	3 Eh	1	ι < i <
Sh U	lilii	Sh 0	1 1 1 1	1	Ul <	lilii	Φ Eh	1	1 1 1 1
CU U	lilii	< u	1 1 1 1	1	< 0	lilii	k4 U	1	1 Eh 1 1
CU 0	lilii	Ui EH	1 1 1 1	u	(U U	lilii	0 Eh	1	1 U 1 u
Sh 0	lilii	φ u	1 1 1 I	1	rH Eh	lilii	Sh U	1	1 1 1 1
Eh Eh	lilii	W Eh	1 1 1 1	1	H <	lilii	CU U	1	1 1 1 I
0 Eh	lilii	>lU	1 1 1 I	1	rH U	lilii	AJ U	1	1 1 1 1
Sh O	lilii	rH 0	1 1 1 1	|	(0 Eh	lilii	rH U	1	1 1 1 1
CU U	lilii	0 0	1 1 1 1	1	> 0	lilii	< 0	1	1 1 1 1
U O	1 Eh EH 1 1	θ'eh	1 1 U 1	u	U1 0	lilii	>iU	1	1 1 1 1
X	lilii	Sh 0	1 1 1 1	|	X	lilii	rH 0	1	1 1 1 1
Eh Eh	lilii	< U	1 1 1 1	1	»4 2	lilii	0 0	1	1 ł 1 ł
rH rH		rH rH			rH rH		rH rH
CO Hf		O o			CM 0		M· CM
CM		rH Π			rH Π		rH if

η

Ν

CM

Fig. 2 (arkusz

£

£

£

£

rH

co

1-3

rH

Hf

rH

co

1-3

rH

Hf

rH

co

1-3

rH Hf

rH CO

P3

rH

Hf

1

rH

•3

P3

1

rH

•3

Po

1

rH

•o Id

1 rH

•3

•-3

>

Eh

>

1

1

>

Eh

>

1

1

>

Eh

>

1 1

> Eh

>

1

1

u

u

43

u

u

u

u

u

43

U

U

u

U

U

JC

U

u u

U U

Λ

U

U

U

33

£

Eh

£

£

£

£

£

Η

£

£

£

£

£

Eh

£

£ £

£ £

Eh

£

£

£

169 035

«3 U	1	1	P	1	P
rH U	1	1	1	1	1
< U	1	1	1	1	1
3 U	1	1	1	1	1
0) Eh	1	1	1	1	1
X U	1	1	P	1	P
3 Eh	1	1	u	1	u
OJ Eh	1	1	1	1	1
J U	1	1	1	1	1
OJ U	1	1	1	1	1
X Eh	1	1	1	1	1
CX. Pi	1	1	1	1	1
0) U	1	1	1	1	1
rH £-1	1	1	1	1	1
H <	1	u	1	1	1
U EH	1	1	1	1	1
OJ U	1	1	1	1	1
W Eh	1	1	1	1	1
0) U	1	1	1	1	1
X P	1	1	1	1	1
CU P	1	1	1	1	1
L P	1	1	I	1	I
OJ 0	1	1	1	1	1
tn p	1	1	I	1	1
U) u	1	1	1	1	1
	1	1	1	1	1
U P	1	1	I	1	1	0	0
>ΐΡ	1	1	1	1	1	σι	f'·
rH U	1	1	1	1	1	rH	tn
o 0	1	1	1	1	1
0 P	1	1	u	1	a	u	O		<	U < O
Jh u	1	1	1	1	1	0)	u	1	1	1 1 1
CU u	1	1	1	1	1	w	P	1	1	1 1 1
3 P	1	1	o	1	0	(0	P	1	1	1 1 1
0) P	1	1	1	1	1	rH	u	1	1	1 1 1
J u	1	1	P	1	P		u	1	1	1 1 1
c 0	1	1	P	1	1	0	u	1	1	< 1 <
(0 t£	1	1	1	1	1	ki	u	1	1	1 1 1
< 2	1	1	1	1	1	CU	u	1	1	1 1 1
>0	1	1	1	1	1	rH	0	1	1	u 1 u
rH U	1	1	1	1	1	(0	P	1	1	1 1 1
U O	1	1	1	1	1	>	0	1	1	< 1 <
	1	1	1	1	1	Jh	P	1	u	u 1 u
X u	1	1	1	1	1	X	u	1	1	1 1 1
P <	1	1	I	1	1	P	<	1	1	1 1 1
Λ 2	1	1	1	1	1	3	o	1	1	1 1 1
rH U	1	1	1	1	1	ω	P	1	1	1 1 1
< 0	1	1	1	1	1	X	P	u	u	1 u 1
kt P	1	1	1	1	1	cn	u	1	P	P 1 P
X	1	1	1	1	1	>.0	1	1	1 1 1
P P	1	1	1	1	1	u	P	1	1	1 1 1
c u	1	1	1	1	1	Μ	P	1	1	O 1 u
tn fi.	1	1	1	1	1	0J	u	1	1	1 1 1
2 2	1	1	I	1	1	w	P	1	1	1 1 1
I-I O	1	1	1	1	1	3	0	1	1	O 1 O
3 P	1	1	1	1	1	0)	P	1	1	1 1 1
> 0	1	1	1	1	I	X	a	1	1	1 1 1
	1	1	I	1	1	3	0	1	1	1 1 1
rH O	1	1	1	1	1	OJ	P	1	1	1 1 t
u u	1	1	1	1		U	u	1	1	1 1 P
rH rH						rH	rH
to a						CO
rH u·						rH	in

Fg

N a>

Fig. 2 (arkusz

X rH CO 1-3 1-1 xf lr-1 1-3 1-3 > P >11

O U X U O U

X X P X X X pr;

rH CO 4 H if I Η H) h3 > Eh >11

U U X U U U

X X Eh X X X

169 035

Sondy dla wirusa zapalenia wątroby typu C.

:42„LLA2C.44

GGTGTTACGTTTGKTTTTTYTTTGRGGTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTC

I42.LLA2C.45

RCCCGGGAACTTRACGTCCTGTGGGCGRCGTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.46

CAACARGTAAACTCCACCRACGATCTGACCTTAGGCATAGGACCCGTGTC .-42.LLA2C.47

CGCRCGCACACCCAAYCTRGGGCCCCTGCGTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.48

WCGAGGTTGCGACCGCTCGGAAGTCTTYCTTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.49

CCCGGGCTGAGCCCAGGYCCYGCCCTCGGRTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.5O

MARCCCTCATTGCCATAGAGGGGCCAAGGRTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.51

CCRCGGGGWGACAGGAGCCATCCYGCCCACTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.52

ACCCAARTTRCGCGACCTRCGCCGGGGGTCTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.53

GGCGAAGCCGCAYGTRAGGGTATCGATGACTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.54

GGCGCCGACGAGCGGWATRTACCCCATGAGTTAGGCATAGGACCCGTGTC :42.LLA2C.55

CACGCCGTCYTCCAGAACCCGGACMCCRTGTTAGGCATAGGACCCGTGTC

Kod grupowy IUG

B = G,T,C D = G,A,T H = A,T,C K == G,T

R = A, G S = G, C

V = G,A,C

M = A, C N = G,A,T,C

W = A, T Y = C,T

Fig. 3

169 035 nukleotydami

Typ sondy Numer Sondy Komplementarność

Label	42.LLA2C.44	16	to	45
Label	42.LLA2C.45	49	to	78
Label	42.LLA2C.46	82	to	111
Label	42.LLA2C.47	115	to	144
Label	42.LLA2C.48	148	to	177
Label	42.LLA2C.49	211	to	240
Label	42.LLA2C.50	242	to	271
Label	42.LLA2C.51	275	to	304
Label	42.LLA2C.52	332	to	361
Label	42.LLA2C.53	365	to	394
Label	42.LLA2C.54	398	to	427
Label	42.LLA2C.55	457	to	486

Fig. 4

169 035

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 1,50 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania sekwencji HCV w badanej nici podejrzanej o zawieranie polinukleotydu HCV, który to polinukleotyd HCV zawiera wybrany region docelowy, znamienny tym, że dostarcza się oligomer zdolny do hybrydyzowania z sekwencją HCV w badanej nici polinukleotydowej, zawierający sekwencję polinukleotydową wybraną z grupy obejmującej oligonukleotydy komplementarne do następujących regionów genomu HCV (jak przedstawiono na figurze 1) 16-45, 49-78, 82-111, 115-^^, 148-77, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 i 457-486; inkubuje się badaną nić z tym olgomerem aż do wytworzenia specyficznych hybrydowych dupleksów pomiędzy sekwencją wyszukującą a sekwencją docelową po czym wykrywa się hybrydy ewentualnie utworzone pomiędzy regionem docelowym, jeżeli taki występuje, i oligomerem.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto dostarcza się zestaw oligomerów, w którym oligomery stanowią startery w reakcji szczepiania łańcuchów za pomocą poimerazy i flankują region docelowy; i amplifikuje się region docelowy na drodze reakcji szczepiania łańcuchów za pomocą polimerazy.

   Wynalazek dotyczy sposobu wykrywania sekwencji HCV. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu wykrywania etic^los5^ic^^;z^r^^^o czynnika wirusowego zapalenia wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH), jakim jest wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) oraz polinukleotyd ów i ich analogów, które znajdują zastosowanie w próbach wykrywająych HCV w próbkach biologicznych.

   Odnośniki literaturowe cytowane w zgłoszeniu:

   Barr i wsp. (1986), Biotechniques 4 : 428.

   Beaucage i wsp. (1981), Tetrahedron Letters 22 : 1859.

   Botstein (1979), Gene 8:17.

   Brinton, M.A. (1986) THE WIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIREDAE (Seria pod redakcją Fraenkel-Conrat i Wagner, tom pod redakcją Schlesinger i Schlesinger, Plenum Press), str. 327-374.

   Broach (1981), Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, tom 1, str. 445, Cold Spring Harbor Press.

   Broach i wsp. (1983), Meth. Enz. 101 : 307.

   Brown i wsp. (1979), Methods in Enzymology 68 : 109.

   Byrne i wsp. (1988), Nucleic Acids Res. 16 : 4165.

   Castle i wsp. (1986), Yirology 119 : 10.

   Chang i wsp. (1977), Nature 198 : 1056.

   Chirgwin i wsp. (1979), Biochemistry 18 : 5294.

   Choo i wsp. (1989), Science 244 : 359.

   Chomczynski i Sacchi (1987), Analytical Biochemistoy 162 : 156.

   Clewell i wsp. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 : 1159.

   Clewell (1972), J. Bacteriol. 110 : 667.

   Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 : 2110.

   Cousens i wsp. (1987), Gene 61 : 265.

   De Bo er i wsp. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292 : 128.

   Dreesman i wsp. (1985), J. Infect. Disease 151 :761.

   Feinstone i wsp. (1981), J. Inf. Dis. 144 : 588.

   Feinstone i wsp. (1983), Infection and Immunology 41 : 816.

   169 035

   Feinstone, S.M. i Hoofiiagle, J.H. (1984), NewEngl. J. Med. 311 : 185.

   Fields i Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.).

   Fiers i wsp. (1978), Nature 273 : 113.

   Gerety, R.J. i wsp. VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag,

   J.L. i Hoofnagle, J.H. , wyd. Grune and Stratton, Inc., 1984) str. 23-47.

   Goeddel i wsp. (1980), Nucleic Acids Res. 8 : 4057.

   Graham i Van der Eb (1978), Virology 52 : 546.

   Grunstein i Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 : 3961.

   Grych i wsp. (1985), Nature 316 : 74.

   Gubler i Hoffman (1983), Gene 25 : 263.

   Hahn i wsp. (1988), Virology 162 : 167.

   Han (1987), Biochemistry 26 : 1617.

   Hammerling i wsp. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRRIDOMA.S.

   Hess i wsp. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 7 : 149.

   Hinnen i wsp. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 75 : 1929.

   Hitzeman i wsp. (1980), J. Biol. Chem. 255 : 2073.

   Holland i wsp. (1978), Biochemistry 17 : 4900.

   Holland (1981), J. Biol. Chem. 256 : 1385.

   Houghton i wsp. (1981),Nudeis Acids Res. 9 : 247.

   Huynh, T.V. i wsp. (1985) DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTICAL APPROACH (D. Glover, Wyd., IRL Press, Oford U.K.), str. 49-78.

   Immun. Rev. (1982) 62 : 185.

   Iwarson (1987), British Medical J. 295 : 946.

   Kennett i wsp. (1980), MONOCLONAL ANTIBODIES.

   Kuo i wsp. (1989), Science 244 : 362.

   Kyte i Dooiittle (1982), J. Mol. Biol. 157 : 105-132.

   Landegren i wsp. (1988), Science 242 : 229.

   Mamatis, T. i wsp. (1982), MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

   Matthews i Kricka (1988), Anaiitical Biochemistry 169 : 1.

   METHODS IN ENZYmOlOGY (Academic Press).

   Mtttlin (1989), Clinical Chem. 35 : 1819.

   Laemmli (1970), Nature 227, 680.

   Lee i wsp. (1988), Science 239 ; 1288.

   Loch i wsp. (1989), Science 243 : 217.

   Mackow i wsp. (1987), Virology 159 : 217.

   Mayer i Walker, wyd. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOlOgY (Academic Press, London).

   Mayumi i wsp. (1990), Japanese J. Exp. Med. 60 : 167.

   Maxam i wsp. (1980), Methods in Enzymology 65 : 499.

   MacNamara i wsp. (1984), Science 226 : 1325.

   Messing i wsp. (1981), Nucleis Acids Res. 9 : 309.

   Messing (1983), Methods in Enzymology 101 : 20-37.

   METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

   Michelle i wsp., Int. Symposium on Viral H^jatiitis.

   Monath (1986), THE VIRUSES: THE TOGAVIRADAE AND FLAVIVDRDEA (Seria pod redakcją Fraenkel-Conrat i Wagner, tom pod redakcją Schlesinger i Schlesinger, Plenum Press), str. 375-440.

   Murakawa i wsp. (1988), DNA 7 : 287.

   Nagahuma i wsp. (1984), Anal. Biochem. 141 : 74.

   Narang i wsp. (1979), Methods i n Enzymology 68 : 90.

   Neurath i wsp. (1984), Science 224 : 392.

   169 035

   Nisonoff i wsp. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21 : 397-406.

   Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5 : 49.

   Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6 : 65.

   Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7 : 35.

   Peleg (1969), Nature 221 : 193.

   Pfefferkom i Shapiro (1974), COMPREHENSIVE VIROLOGY, tom 2 (Fraenkel-Conrat i Wagner, wyd., Plenum, N.Y.) str. 171-230.

   Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37 : 217.

   Rice i wsp. (1985), Science 229 : 726.

   Rice i wsp. (1986), THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVTVDRDDAE (Seria pod redakcją Fraenkel-Conrat i Wagner, tom pod redakcją Schlesinger i Schlesinger, Plenum Press), str. 279-328.

   Roehrig (1986), THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVTRIDAE (Seria pod redakcją Fraenkel-Conrat i Wagner, tom pod redakcją Schlesinger i Schlesinger, Plenum Press).

   Rosenberg i wsp. (1984), Nature 312 ; 7.

   Sadler i wsp. (1980), Gene 8 : 279.

   Saiki i wsp. (1985), Science 230 : 1350.

   Saiki i wsp. (1986), Nature 324 : 163.

   Saiki i wsp. (1988), Science 239 : 487.

   Sanger i wsp. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463.

   Scharfi wsp. (1986), Science 233 : 1076.

   Schlesinger i wsp. (1986), J. Virol. 60 : 1153.

   Schreier, M. i wsp. (1980), HYBRIDOMA TECHNIQUES.

   Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE, SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).

   Shimatake i wsp. (1981), Nature 292 : 128.

   Shigekawa i Dower (1988), BioTechniques 6 : 742.

   Steimer i wsp. (1986), J. Virol. 58 : 9.

   Stollar (1980), THE TOGAVIRUSES (R.W. Schkesinger, wyd. Academic Press, N.Y.), str. 584-622.

   Sumiyoshi i wsp. (1987), Virology 161 : 497.

   Taylor i wsp. (1976), Biochem. Bipphys. Acta 442 : 324.

   Towbin i wsp. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350.

   Tsu i Herzenberg (1980), SELECTED METHODS IN CELLULAR EMMUNOLOGY (W.H. Freeman i spółka), str. 373-391.V}tdehaag i wsp. (1985), J. Immunol. 134 : 1225.

   Valenzuela, P. i wsp. (1982), Nature 298 : 344.

   VaJenzuela, P. i wsp. (1984), HEPATITIS B (Millman, I. i wsp., wyd. Plenum Press) str. 225-236.

   Warner (1984), DNA 3 : 401.

   Wu i Grossman (1987), Methods in Enzymology tom 154, RECOMBINANT DNA, Część E.

   Wu (1987), Methods in Enzymology tom 155, RECOMBINANT DNA, Część F.

   Zoller (1982), Nucleic Asids Res. 10 : 6487.

   Cytowane opisy patentowe.

   Opis patentowy St^r^c^Aw Zjednoczonych Ameryki nr4 341 761.

   Opis patentowy Sternów Zjednoczonych Ameryki nr 4 399 121.

   Opis patentowy Steinów Zjednoczonych Ameryki nr 4 427 783.

   Opis patentowy Sternów Zjednoczonych Ameryki nr 4 444 887.

   Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 466 917.

   Opis patentowy Steinów Zjednoczonych Ameryki nr 4 472 500.

   Opis patentowy Steinów Zjednoczonych Ameryki nr 4 491 632,

   Opis patentowy Stanów¹ Zjednoczonych Ameryki nr 4 493 890.

   169 035

   Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202.

   Opis patentowy Stenów Zjednoczonych Ameryki nr 4 458 066.

   Opis patentowy Stenów Zjednoczonych Ameryki nr 4 868 105.

   Wirusowe zapalenie wątroby typu nie-A i nie-B (NANBH) stenowi chorobę zakaźną lub grupę chorób, o których wiadomo, że wywoływane są przez wirusy i że można je odróżnić od innych wirusowych chorób wątroby obejmujących choroby spowodowane przez znane wirusy zapalenia wątroby, takie jak wirus zapalenia wątroby typu A (HAV), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu delta (HDV), a tekże od zapalenia wątroby wywołanego przez cytomegalowirusa (CMV) lub przez wirusa Epsteina-Barra (EBV). Po raz pierwszy NANBH stwierdzono u osobników poddanych transfuzji. Zakażenie szympansa od człowieka i kolejne pasaże w szympansach wykazały, że NANBH spowodowane jest jednym lub kilkoma zakaźnymi czynnikami infekcyjnymi.

   Dane epidemiologiczne wskazują, że mogą ^^'tniieć trzy typy NANBH: typ epidemiczny rozprzestrzeniający się drogą wodną, typ rozprzestrzeniający się przez krew lub igłę i rzadko występujący typ (nabyty w grupie). Jednakże liczba czynników, które mogą powodować NANBH jest nieznana.

   Szereg wirusów uważano za wirusa NANBV. Patrz, na przykład przeglądy Pnnce’a (1983), Feinstone’a i Hoofnagle’a (1984), Oberby’a (1985, 1986, 1987) oraz artykuł Iwarson’a (1987). Jednakże brak jest dowodów na to, że którykolwiek z nich jest etiologicznym czynnikiem NANBH..

   Istnieje poważne zapotrzebowanie na czułe, specyficzne sposoby skriningu i identyfikacji nośników NaNBV i krwi zakażonej NANBV lub produktów z takiej krwi. Potransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) występuje u około 10% pacf^i^n^tów poddanych transfuzji, a NANBV st^no^wi do 90% tych przypadków. Głównym problemem tej choroby jest często występujący rozwój chronicznego uszkodzenia wątroby (25-55%).

   Leczenie jak również zapobieganie zakażeniom NANBV przez krew i jej produkty lub przez bliski kontakt osobisty wymaga możliwości wykrywania kwasów nukleinowych, antygenów i przeciwciał związanych z NANBV, które to wykrywanie stanowiłoby środek niezawodnego sk^nii^ngu, diagnozowania i prognozowania.

   Znane są sposoby wykrywania specyficznych polmukleotydów, polegające na próbach hybrydyzacyjnych jak opisano w publikacjach: Matthews i Kricka (1988), Analytical Biochemistry, 169 : 1; Landegran i wsp. (1988), Science, 242 : 229; oraz Mittlin (1989), Clinizal Chem. 35 : 1819; oraz opisie patentowym Stenów Zjednoczonych Ameryki nr 4 868 105 wydanym 9 września 1989 r.; oraz publikacji Europejskiego Urzędu Patentowego nr 225 807 (opublikowana 16 czerwca 1987 r.).

   Do momentu odkrycia przez zgłaszających wirusa HCV niemożliwe było stosowanie sposobów izolowania i/lub wykrywania przez hybrydyzację swoistych polinukleotydów w celu wyszukiwania HCV. Wynalazek dostarcza sposobu do wykrywania sekwencji genomów wirusowych opisanych w międzynarodowej publikacji PCT nr Wo 90/14436 oraz w nniejsz;yn opisie.