BG97435A - Nаnвv диагностика: полинуклеотиди за изследване на вируса на хепатит с - Google Patents

Abstract

Установен е нов вирус, хепатит С вирус, който доказано е главният етиологичен агент на заболяванетона кръвта NANBH. Осигурени са реагенти за изолиране, амплификация и откриване на НСV (хепатит С вирус). Тези реагенти са олигомери, включени в полинуклеотидни последователности, които са в състояние да формират хибридни структури с НСV мишенни полинуклеотидни последователности. 6 претенции

Description

NANBV ДИАГНОСТИКА : ПОЛИНЖЛЕОТИЖ ЗА

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ВИРУСА НА ХЕПАТИТ С

Изобретението се отнася до материали и методи за изследване разпространението на нито-А,нцто-В хепатитната вирусна инфекция <1 / NANBV /_г По-специално, то се отнася до етиологичен агент на нито-Α,Ηπτσ-Β хепатит / NANBH /₉ хепатит С вирус / HCV / и до полинуклеотиди и техни аналози,които да се използват в изследванията за откриване на HCV в биологични проби.

Нито -А,нито-В хепатита / ΙΊΑΝΒΗ / е трансмисивно заболяване или фамилия от заболявания,които се счита че са вирус-индуцирани,и които са ясно отличими от други форми на вирус-асоциирани чернодробни заболявания,включително тези,причинени от познати вируси ,като например вируса на хепатит A / HAV /, вируса на хепатит В / BBV /, и вируса на хепатит делта / НДУ /,а така също и хепатита,причинен от цитомегаловируса / СЬТ7 / или вируса на Ер$4е1п-Вагг / BBV /,

NANBH е идентифициран за първи път в трансфугирани индивиди. Трансмисията от човек на шимпанзе и серия пасажи у шимпанзета дога ват,че заболяването ΝΑΗΒΗ се дължи на трансмисивен инфекциозен агент или агенти..

Епидемиологичните доказателства предполагат три типа на ΝΑΝΒΗ : воден епидемичен тип j кръвен или игловидно асоцииран ти: и спорагично срещан / обществено придобит / тип. Обаче, числото на причинителите на КАДЕН са неизвестни,

Известни са редица кандидати за BIANBV _>Вж. например статиит» в списъка на литературните източници под 73,22,68,69,70 и 43. Но няма доказателство,че някой от тези кандидати представя етиологичният а.гент на НАДВН.

Нного е важдо откриването на чувствителни,специфични методи за изследване и идентифициране на носители на ДАЦВУ и KAHBV контаминирана кръв или кръвни продукти, Пост-трансфузионеи хепатз се появява у приблизително 10 % от пациентите,на които е осъществе! кръвопреливане, и ДАНВН достига почти до 90 % от тези случаи,Найголемият проблем в това заболяване е честото прогресиране до хронично чернодробно увреждане / 25-55% /.

Грижата за предпазване на пациентите от трансмисия на МАТЕВ! посредством кръвта или кръвните продукти или чрез близък личен кон* средства за такт изисква надеждни изследване,диагностика и прогноза с оглед откриване нуклеинови киселини,антигени и антитела,свързани с НАД]

Кетоди за откриване на специфични полинуклеотиди посредством хибридизационни проби, са известни в областта. Вж, например лит, източници ® 49,47,50 и 112, ’•етоди за изолиране и/или откриване на специфични полинуклео^г ди посредством хибридизация не биха могли ,ца бъдат използвани за HCV до откритието на заявителя на настоящето изобретение, Изобретението на заявителя обезпечава материали и методи за получаване w<

вирусни геномни последователности,които изложени в РСТ публикация № W090/14436.

Един аспект на изобретението е метод за откриване на HCV последователност в аналитична верига,която се предполага че съдьрж HCV полинуклеотид,където HCV полинуклеотида включва мишенна област а този процес включва :

а/ осигуряване на олигомер /и/,способни на хибридизация с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига,където олигомера включва полинуклеотидна последователност,избрана от груг състояща се от олигонуклеотиди,комплементарни на следните региони от HCV генома ί както е показано на Фиг. 1 / - 16-45 ,49-78, 82-11 115-144,148-177,211-240,242-271, 275-304, 332-361,365-394,398-427 и 457-486.

б/ инкубиране на аналитичната верига с олигомера /ите/ от а/,което позво$ЙШ^^£ЕЙ8чйЙ· хибридни дуплекси между насочената и мишенната последователности; и е/ откриване на хибриди,формирани между мишенния регион и олигомера /ите/

Друг аспект на изобретението е метод за откриване на HCV последователност в аналитична верига,за която се пчита,че съдържа HCV полинуклеотид, където HCV полинуклеотида. включва подбран мишенен регион,като този процес включва ί а/ осигуряване на олигомер /и/,способни на хибридизация с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига,където олигомера е включен в полинуклеотидна верига /последователност/, подбрана от група,състояща се от олигонуклеотиди,комплементарни нг следните области от HCV генома /както е покезпно на Фиг.1 / ^: 16-45,49-78,82-111,115-144,148-177,211-240,242-271,275-304,332-36: 365-394,398-427,457-486.

б/ инкубиране на аналитичната верига . : с олигомера/ите/ от а/ което позволява образуването на специфични хибридни дуплекси между насочената и мишенната последователности, и с/ откриване на хибридите,формирани между мишенния регион, ако- има такъв, и олигомера /ите/,каго другият олигомер/и/ включва полинуклеотидна последователност,подбрана от групата,състояща се от олигонуклеотиди,комплементарни на следните области на. HCV : . генома /както е показано на Фиг. 1/ : 16-45,49-76,82-111, 115— 144,148-177,211-240,242-271,275-301,332-361,365-394,398-427, и 457-486.

Така, друг аспект на изобретението е метод за получаване н< свободна от HCV кръв,включващ :

а/ осигуряване на аналитични нуклеинови киселини от проби на кръв,за която се счита,че съ,държа HCV мишенна последователност} б/ осигуряване на олигомер/и/,способни на хибридизация с НСЯ последователност в аналитична полинуклеотидна верига,ако е налице такава,където олигомера е включен в полинуклеотидна последователно подбрана от ' група,състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на следните области от HCV генома ·/както е показан на Фигура 1 : : 16-45,49-78,82-111,115-144,148-177,211-24U,242-271 275-304,332-361,365-394,398-427, и 457-486.

в/ реакция на а/ с б/ при условия,които позволяват образуван то на полинуклеотиден дуплекс между насочената последователност и мишенната последователност,ако има такаваJ г/ откриване на дуплекс,образуван в с/,ако има j и д/ запазване на кръвта,в която комплекси не са открити в г/

По-нататъшен аспект на изобретението е метод за получаване кръв,свободна от HCV,включващ ·

а./ осигуряване на аналитични нуклеинови киселини от проба кръв,за която се счита,че съдържа HCV мишенна последователноctJ б/ осигуряване на олигомер,способен на хибридизация с HCV последователност от аналитична полинуклеотидна верига,ако има така където олигомера е включен в полинуклеотидна последователност j в/ реакция на а/ с б/ при условия,които позволяват формиран на полинуклеотиден дуплекс между насочената последователност и мишенната,ако има такава ;

г/ откриване на дуплекс,образуван във в/,ако има такъв, с друг олигомер /и/,където другият олигомер/и/ включва полинуклеотидна последователност f и д/ запазване на кръвта,в която не са установени комплекси в :

Кратко описание на чертежите :

Фигура 1 показва съставната HCV сЖК последователност,получена от клона,описан тук и от съставната HCV сЖК, представена в РСТ публЛ W090/14436.Клоновете,от които бе получена последователността, са 5^клан 32, в114а , 18^ , а^ЗОа, СА2О5а,СА290а, СА 21ба , р114а , СА 167в, СА15бе, СА59а, К9-1 / наричана също к9-1/,26j,13: 12^,.141,Ив, 7у^,,7е,8/г,33с,4ов,37в,35,3б,81,32,33в,25с,14с,^/,зу,3' ¹⁹?

зонтални черти над последователността показват позицията на предполагаемия иницииращ метионинов кодон. Така стщо показан на фигура^г е аминокиселинната последователност на предполагаемия полипротеин, кодиран в сЖС. Хетерогенетичните HCV^ в клонираните ДНКи са индикирани чрез аминокиселините,посочващи по-горе предполагаемата кодирана последователност на дългата OFF, кръглите скобки показват, че хетерогенността е установена при или близо до 5- или 3- края на HCV сДНК в клона..

Фигура 2 показва общите ДНК последователности за пет различни HCV изолата от различни географски области / ^пония и САЩ /_> където аминокиселините,кодирани от дългата OB’ от HCV^ _Са показани ,26о,15е,в5а,16}п,бк и pl31j.ii. Ьъв фигурата трите хоринад ДНК последователностите.

Фигура 3 показва последователностите от белязаните проби за откриване на HCV РНК в биологични проби,използвани в ПРИМЕР III,

Фигура 4 показва подреждането на пробите във Фигура 3 с HCV^ съобразно номерирането им на Фигура

Начини за орщестяяване_на изобретението

Терминът Хепатит С вирус / HCV / θ запазен от работещите в областта за хетерофорен неизвестен етиологичен агент на ΝΑΝΒΗ, Прототипа на изолата е идентифициран в Амер. патентно описание 122,714/ Вж. стщо НЮ публ. &*- 318,216 /. Терминът HCV стщо включва нови изолати от същия вирусен вид. Като едно разширение на този термин, болестта,причинена от Неформално наричана кръвен ΜΑΙΙΒ хепатит / ВВ- LIAKLBH /,е наричана хепатит 8.Термините ΝΑΝΒΗ _и хепатит С могат да бъдат използвани взаимозаменяемо тук.

HCV θ вирусен вид,чиито патогенни щамове причиняват ЕЕНАНВН, Тук могат да бъдат причислени също атенюирани щамове или . неизправни пречещи частици, получени от тяхЛакто е показано тук, HCV генома е включен в ИК,Известно е, че РНК^съдържащи вируси имат относително висока степен на спонтанна мутация,т.е. в рамките на от 1U~³ до 10“⁴. за инкорпориран нуклеотид /23/. Поради това, доколкото хетерогенността и флуидността на генотипа са присъщи на РНК вирусите,налице са мултиплени щамове /изолати,които могат да са вирулентни и авирулентни в рамките на HCV вида.Съставите и методите, описани тук,.цават възможност за размножаване,идентификация, откриване и изолиране на щамовете на HCV вируса или на неговите изс лати.

Идентифицирани са няколко резлични щама /изолати на HCV /_Вж.

РСТ публ. Р Ψ090/14436 /.Един такъв щам или изолат,който е прототр е наречен СДС/HCVi /също наричан HCV1Z. Информация от един щам или

-7 изолат,като напр. частична геномна последователност, е достатъчна да позволи на този,специалист в областта,използвайки стандартни те ники, да изолира нови щамове/изолати и да определи дали даден нов щам/изолат е HCV. Н_ацритлер,по-долу _са изолирани няколко различни щама/изолата. '1'ези щамове,които са получени от различни човешки се рума / и от различни географски райони /,са изолирани,оползотворяг вайки информацията от геномната последователност на HCVj,

Използвайки техниките,описани в НСТ публ. ^°90/1443б , геномната структура и нуклеотидната последователност на HCV1 гено?. FHK са изведени. Изглежда геномьт е едноверижна НЖ, съдържаща приблизително 10 ΘΘΘ нуклеотида. Геномът е позитивно-верижен, и притежава не прекъсната., транс лационна отворено читаема рамка /ОЕ? / която кодира полипротеин с около 3000 аминокиселини. И OH¹ _tструктурните протеини са кодирани в приблизително първата четвърт от N крайната облает_гс преобладаване на полипротеин,отговорен за неструктурните протеини.Е сравнение с всички познати вирусни последователности, са наблюдавани малки,но значителни ко-линеа.рни хомод гии с нестуктурни протеини от семейството на флавивирусите и с пестивирусите /които сега се счита,че са част от семейството на флавивирусите /.

Полипротеинът на флавивирусите съдържа,от амино-края до карбокси края, нуклеока.псидШ^япротеин /С/, матричния протеин /^/, затвореният протеин /Е/ и неструктурният протеин /К5/ /а+в/,

3,4/а+в/ и 5, Основано на предполагаемите аминокиселини,кодирани ι нуклеотидната последователност на НСУ^малка. област от крайния Nкрай от HCV полипротеин се явява аналогичен както по размер, така, г по високо съдържание на основни/базични/ остатъци на нуклеокапсулс ният протеин /С/ ,намерен при Н-края на флавивирусният полипротс ин. Неструктурните протеини 2,3,4 и 5 /М 2-5/ от HCV и от жълтия февер вирус / [ притежават броими части нт с аналогичен разме] и хидропатичност,макар че има различиев в аминокиселинната после дователности.Обаче, областта,която кореспондира на областите от №7 полипротеин,ввдър®ад и ·№$ 1 протеин ,не само се отличава по последователност,») е твърде различна едновременно и по размер и по' хидропатичност. 1'ака, докато основни области от HCV генома могат да бъдат отнесени към, например или BIS 2 ,може да се заключи,ч£^е95начения са спекулативни^ възможна е да има значителни различия между HCV семейството и 1йй семейството на флавивирусите, което следва вече да бъде оценено.

Различни щамове,изолати или субтипове от HCV _се очаква де съдържат различни вариации от аминокиселини и нуклеинови киселини, в сравнение с HCV1.много изолати се очаква да покажат повече / т.е над 4СР° ¹ хомоложност в аминокиселинната последователност в сравне ние с HCV1,Обаче, може да бъде установено също други по-малко хомс ложни HCV изолати.Те следва да бъдат определени като съобразно различни критерии,като ,напр. OPF от приблизително 9000 нуклеотида до приблизително 12000 нуклеотида,кодиращ полипротеин,аналогичен по размер с този на HCV1 , един кодиран полипротеин с аналогична хидрофобност и/или антигенност s тези на HCVi _>и присъствието на. ко-линеарни пептидни последователности ,съхранени с HCV1, Б допълнение,счита се,че генома следва да бъде позитивно-верижна ББК,

Всички HCV изолати кодират най-малко един епитоп,който е имунологично определяем /т.е.,може да бъде подложен на кръстосана имунна реакция / с епитоп,кодаран в НСУсДБК,описана тук.За предпочитане е епитопа да се съдържа в аминокиселинна последователност, описана тук и е уникална за HCV,когато се сравнява с известни порано патогени. Не-уникалност та на епитопа мо.же де. бъде определена чрез неговата имунологична реактивност с анти-HCV антитела и липсг та на имунологична реактивност с антитела на известни патогени,

HCV щамовете и изолатите са еволюционно свързани,Бто защо, с очаква се общата хомоложност на геномите на нуклеотидно ниво може да бъде около 4С$ или повече, вероятно може да бъде около 50/° или повече,вероятно около 60% или повече, и дори повече от 80% или над тях, В допълнение, има кореспондиращи непрекъсваеми последователности от най-малко около 13 нуклеотида. Оле,цва да се отбел< че има ваиаблни и хипервариабилни области в рамките на HCV генома Съответствието между предполагаемата геномна последователност на HCV щама и ,напр. СДС/ HCV 1сДНК последователност може да бъде определено посредством известни за нивото на техниката умения.Напр,. те могат да бъдат определени чрез директно сравнение на информацш ната последователност на полинуклеотида от предполагаемия HCV, и HCV сДНК последователността/тите/,описани тукДе също така могат да бъдат определени чрез хибридизация на полинуклеотидите при условия, които формират стабилни дуплекси между хомологните региони /напр. онези,които биха били използвани по-рано за S^разграждане > следвано от разграждане с едноверижна специфична нуклеаза'и/,следвано от определяне размера на получените отрязъци.

Поради еволюционните отношения между щамовете или изолатите на HCV,предполагаемите HCV щамове или изолати могат да бъдат идена фицирани чрез тяхната хомоложност на полипептидно нивоДчаква се HCV щамовете или изолатите да притежават най-малко 4Cd° хомоложносп повече от 50% хомоложност,вероятно повече от около 70% хомоложноса и дори повече от 80% хомоложност, и някои могат да бъдат повече οί 90% хомоложни на полипептидно ниво,Техниките за определяне хомо логията на амино киселинните последователности са известни за работещите в областта.Например, аминокиселинната последователност може да бъде' определена директна и да бъде сравнена с осигурените по изобретението последователности«Обратно,нуклеотидната после,дова телност на геномният материал от предполагаемият HCV може _па бъде определена /обикновено чрез сДНК посредничеството ^предполагаемата кодирана аминокиселинна последователност може да. бъде кодирана, и кореспондиращите области - сравнени.

- 10 Както е използвано тук,полинуклеотид “получен от определена последователност се отнася до полинуклеотидна последователност, която е включена в последователност с приблизително около 5 нуклев отида,за предпочитане около 8 нуклеотида,по-за предпочитане около 10-12 нуклеотида, и дори повече за предпочитане е да бъдат около 15-20 нуклеотида ,кореспондиращи с област от определената нуклеотщ последователност.· Кореспондиращ означава хомоложност към или комплементарност към определената последователността предпочитане е последователността от областта от която е получен полипептида, да е хомоложен или комплементарен към последователност,която е уникална за HCV геном. Ко-предпочитано е , получената последовател· ност да е хомоложна или комплементарна за последователност,която да е уникална за всички или за повечето от HCV изолатите. Независимо дали или не последователността е уникална за HCV. генома,тя може да бъде определена по известни техники.Например,поеледовател*ността може да бъде сравнена с последователността в базата данни, като напр. Вепевапя,за да се определи дали присъства в незаразен организъм или друг организъм.Последователността може също така да бъде сравнена с известни последователности от друти вирусни агенти, включително онези,които индуцират хепатит ,напр. HAV_tHBV _и ЦЦУ _и членовете от семейство Флавивиридае. Кореспондирането или не на получената последователност с други последователности може също да бъде определена чрез хибридизация при подходящи строго определени условия Абридизационни техники за определяне комплементарността. на последователностите на нуклеиновите киселини са известни в областта, и са дискутирани по-долу.Цк С1що например /48/ от списъка литературните източници. В допълнение,несъответствието на полинуклеотидните дуплекси,формирани при хибридизацията,може да бъде определено чрез известни техники,включително,например,разграждане с нуклеази като S1,която специфично разгражда едноверижни области в полинуклеотидните дуплекси.Области,от които могат да бъдат '‘получени” типични да последователности,включват,но не са ограничени до, напр. области,кодиращи специфични епитопи ,а така също и нетранскрибирани и/или нетранскрибирани области.

Полученият полинуклеотид не е задължително да е получен по физически път от показаната нуклеотидна последователност,но може да бъде генерирана по който и да е начин,включително например ,химичен синтез или ДОК репликация или ревертинна транскрибция или у транскрибция.В допълнение,комбинации от области,кореспондиращи на тази set посочена последователност може да бъцат модифицирани по познат начин с оглед използване по желания начин.

Терминът * рекомбинантен полинуклеотид ’* се използва за полинуклеотид от геномен, сдНК,семисинтетичен,или синтетичен вид, който благодарение на неговия произход или въздействие ^: /1/ не е асоцииран с всички или с част от полинуклеотида,с който е асоциира! в природата. 2/ е свързан с полинуклеотид,различен от този към който е свързан в природата , или 3/ не се среща в природата .

Терминът полинуклеотид ” както е използван тук се отнася д( полимерна форма на нуклеотиди е.· която и да е дължина независимо дали е рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид. Т_03И термин се отнася само до първичната структура на полимера . Така,тази термин включв? двойно- или едно-верижна ДНК или РНК.Той включва също известни тип( ве модификации,напр. свързвания,които са известни за нивото на техниката, метилации, капсулации”,замествания на един или повече от срещаните в природата нуклеотиди с аналог,интернуклеотидни модификации, като напр. незаредени свързвания / като метилфосфонати,фосфотриестери,фосфоамидати,карбамати и т.н. / и със заредени свързвали / като фосфоротиоати,фосфородитиоати и т.н. /,онези съдържащи висящи групи,като напр. протеини /включително нуклеази,токсини,антитеЛс

- 12 сигнални пептиди,поли- Ь - лизин и др. /,онези с интеркалации /като акридин,псорален и др./,онези,съдържащи хелатори / като метали,радиоактивни метали,бор,окислители-метали /,такива,съдържащи алкилатори,такива с модифицирани свързвания / като алфа аномерични нуклеинови киселини и др. /, а така също и немодифицирани форми на полинуклеотида.

Както тук се употребява, смисловата верига на нуклеинова киселина съдържа последователността, която игла последователност,хотло ложна на тази на м?НК. ’’ ^нти-смисловата верига съдържа последователност, която е комплементарна на тази от смисловата верига .

Както се използва тук, позитивно верижен геном ^п на вируса, е геномен полинуклеотид,независимо дали е ЬНК или ДНК* който кодира най-малко един вирусен полипептид.Примерите за позитивно верижните ИЖ вируси включват To^ccvK'clctc _tCoton&vivdae , X е, VvotHt icicle •Hlcor'n&.vKl и Cafe» tlckat, Включени са също -pCcwi'/Kctci * които формално се класифицират като TojaVKlcLctc .Тези вируси са типично едноверижни. /Вн. 23 /.

Терминът праймер както е използван тук,се отнася до олигомер,който е способен да действа като точка на инициация на синте зата на полинуклеотидната верига,когато е поставен при подходящи условия.Праймерът може да бъде изцяло или частично комплементарен на област от полинуклеотидната верига,за да може да бъде копиран. Така,при условията на хибридизация,праймерът ще се ренатурира до комплементарна област от аналитичната верига. 0 допълнителни подходящи реагенти/ като полимерази,нуклеотид трифосфати и .цр./,праймерът е изтеглен от полимеризиращия агент да формира копие от аналитичната верига.Праймерът може да бъде едноверижен, или обратно,може да бъде частично или напълно двойно-верижен.

Термините аналитичен полинуклеотид'^г и аналитична верига се отнася до едноверижна или дву-верижна молекула на нуклеиновата.

- 13 киселина,·която предполага съ,държание на ’.ъппенна последователност и която може да присъства в биологична проба.

Терминът олигомер,както е употребен тук, се отнася до праймери и до проби. Терминът не означава размера на молекулата.^баче, типичните олигомери не са по-големи от 1000 нуклеотида, по-типично - не са по-големи от 500 нуклеотида,дори по-типично - не-по-големи от 250 нуклеотида у те могат да бъдат и не по-големи от 75 нуклеотида и стщо така могат да бъдат не по-големи от 50 нуклеотида в дължина.

^акто тук е употребено,терминът проба” се отнася до струк ра,включваща полинуклеотид,който формира хибридна структура с мишенна последователност,благодарение на комплементарността на наймалко една последователност в пробата с последователност в мишенна¹ област.Полинуклеотидните региони на пробите могат да бъдат съставе· ни от ДНК и/или БНК и/или синтетични нуклеотидни аналози.Включени в рамките на пробите са уловени проби и ” белязани проби.За предпочитане,пробата не съдържа последователност,комплементарна на последователността/тите/,използвана за полимеразна верижна реакция /Р С £ /_г w··

По смисъла на текста,терминът мишенна област” се отнася до регион от нуклеиновата киселина,който подлежи на амплификация и/илр откриване .Терминът мишенна последователност” се отнася до последователност, с която пробата или праймера би формирала стабилен хибри; при желани условия.

Терминът уловена проба по смисъла на текста,се отнася до полинуклеотид,включен в едноверижен полинуклеотид, равини свързан ^с присъединителен праймер.Пдноверижният полинуклеотид съдържа мишенна полинуклеотидна последователност,която е комплементарна на мишенната последователност в мишенната област за откриване в анализирания полинуклеотид.Този комплементарен регион е със задоволителн

- 14 дължина и комплементарност спрямо мишенната последователност,таке че да позволи образуването на .дуплекс със задоволителна стабилнос да иммобилизира анализирания полинуклеотид към твърда повърхност /чрез свързване на партньорите/Овързващият партньор е специфичен за втория свързващ партньор^ вторият свързващ партньор може да бъде свързан към повърхността на твърда повърхност или може да 6ί слепен индиректно чрез други структури или свързващи партньори κί твърда повърхност.

Терминът насочващи полинуклеотидни последователности”по с^т съла на текста,се отнася до полинуклеотидна последователност,κοηί включва нуклеотиди, комплементарни на мишенната нуклеотидна последователност> последователността е със задоволителна дължина. и ко? плементарност с мишенната последователност,така че да формира ,uyi леке, който ш задоволителна стабилност за желаните цели.

Терминътсвързващи партньори както се използва тук,се отне до молекула,способна да хяжрхлаий присъедини свързваща молекула с висока специфичност,като напр. антиген и антитяло,специфично за т Най-общо,специфичните свързавщи партньори следва да се свързват < задоволителни афинитет за имобилизиране на аналитичното копие / ι плементарният дуплекс , / в случай на уловени проби / при ,услон^; на изолация.Специфичните свързващи партньори са известни в облас^г и включват,например,биотин и авидин или стрептавидин, и прот< А,голям брой известни рецептор-свързани двойки, и комплементарни полинуклеотидни верИги.Б случая на комплементарни полинуклеотида двойки,партньорите са нормално най-малко около lb бази в дължина, и могат да бъдат най-малко 40 бази в ,дължина j в допълнение,те съдържат С и С най-малко около 4($ и повече от би%.Полинуклеот: дите могат да бъдат съставени от или синтетични нуклеот.

ни аналози.

- 15 Терминът удвоен както се използва по смисъла на и306001 нието се отнася до ковалентно или силно не-ковалентно присъединително взаимодействие./напр. хидрофобни взаимодействия,водороден връзки и др./. Ковалентните връзки могат да бъдат,напр. естерни, етерни, фосфоестерни,амидаи, пептидни, имидни, карбо-сулфатни, карбофосфорни и др. подобни връзки.

Терминът опора” се отнася до която и да е твърда или полу ι твърда повърхност,към която може да бъде прикрепен желаният свързван партньор.Подходящите опорни повърхности включват стъкло,плас маса,метал,полимерен гел и др. подобни и може да има форма на ле1 ло,стена,мембрана и др.

Терминът смисъла на текста се отнася до който и да е атом или странична група,който може да бъде използван за обе печаване подходящ за откриване сигнал, и който може да бъде ата ду ван от полинуклеотида или полипептида^

По смисъла на текста,терминът белязана проба се отнася ; олигомер,който включва насочваща полинуклеотидна последователноci която е комплементарна на мишенна последователност,която да бъде открита в анализираната проба.от полинуклеотида.Тази комплемент^г на област е със задоволителна дължина и комплементарност на мишеь ната за да позволи на дуплекса,включен в белязаната проба '* и не мишенната последователност да бъде открита чрез белязане.Олигог ра е удаивк присъединен кам белязаната проба както директно,така индиректно чрез комплекс от свързващи молекули с висока специфичност за всеки друг.комплекса от свързващи молекули с висока спецп фика са описани по-горе,и снцо така включват мултимери.

Терминът мултимер”,както е използван тук, се отнася до линеарни или разклонени полимери от една и съща повтаряща се полинуклеотидна единица или от различни едноверижни полинуклеотидни

- 16 единици.. Поне една от тези единици притежава последователност,дължина и състав,който позволява хибридизирането й по специфичен начин към първата едноверижна нуклеотидна последователност,която ни интересува,по-специално анализиран или олигомер /т.е. белязана щ ба / ,свързан към първия,подлежащ на анализ.В оглед постигане на такава специфичност и стабилност,тази единица може да. бъде наймалко 15 нуклеотида в дължина,по-типично- повече от 50 нуклеотида в дължина и за предпочитане около 30 нуклеотида в дължина J нещо повече,съдържанието на Gin Се нормално би било около 40% най-малкс и най-много около 60 %. В допълнение към такива единици, мултимеръ·] включва, умножено количество единици,които са способни на специфич на хибридизация на

втори едноверижен нуклеотид,по-специ-

ално белязан /маркиран / полинуклеотид ил1

ДРУГ мултимер. Тези единици са предимно с почти същият размер и състав,както мултимерите,за които стана дума по-горе. Когато мули мерът е конструиран така,че да бъде хибридизиран към друг мултиме; първата и втора олигонуклеотидни единици са хетерогенни / различи] и не се хибридизират една с друга при условията на избраната проб? Така ,мултимерите могат да бъдат белязани проби, или могат да бъщ връзки,които присъединяват белязяния обект към пробата.

По смисъла на текста,терминът вирусна РНК , който включва HCV РНК ,се отнася до ТПК от вирусен геном,негови фрагменти,негов! транскрибти и метантни последователности,получени от него.

Терминът биологична проба се отнася до проба от тъканни или течни изолати от индивид,включен,но не ограничен от,напр. пла: ма,серум,гръбначна течност, лимфатична течност,външни сектори на кожата,респираторната,интестиналната и гениталните трактове,сълзи, слюнка,мляко,кръвни клетки,тумори,органи и също проби от ин витро клетъчни културни конституенти / включващи,но не ограничени от коь диционирана среда,получена от растежа на клетките в клетъчна културална среда,предполагаеми инфектирани с вирус клетки,рекомбинанп ни клетки и клетъчни компоненти /.

Практиката на настоящето изобретение ще използва,доколкото е указано, конвенционални техники от химията,молекулярната биолог! микробиология,рекомбинантна ДНК и имунология,които са познати за нивото на техникатаДакива техники са описани напълно в литератур? та / вж. 48 /, Всички патенти,патентни описания и публикаци^отбелязани както по-горе,така и по-долу,са включени в референцията,

Използваемите материали и процеси от настоящето изобретение с< направени възможни чрез идентификация на HCV като етиологичен arei на BB-PIAKBV ,и чрез обезпечаването на семейство от нуклеотидаи последователности,изолирани от сДНК библиотеки,които съдържат НС? сДНК последователности, Тези сДНК иийжхджхкхкнехи: библиотеки са. получени от последователности на аминокиселини ,представени в пла: мата на HCV-инфектирани шимпанзета,Конструирането на една от тези библиотеки, с библиотека / ATCC I™ 4U394 / е описано в РСТ публ. F W0 90/14436,

Използвайки по-горе описаните HCV сДНК последователности,катези,описани тук, могат да бъдат конструирани олигомери,които са използваеми за откриване на вирусни полинуклеотиди в биологични и проби. Например,от последователностите е възможно да се синтезира.¹ ДНК олигомери от около 8-19 нуклеотида, или по-дълги, които могат да бъдат използвани като хибридизационни проби за откриване на присъствието на HCV РНК в,напр., дарителска кръв,кръвни фракции, серум от субекти,които се подозират,че са вирусоносители,или клетъчно културнпни системи,в които вируса се реплицира.В допълнение

Wii новите олигомери,описани тук,дават възможност за по-нататъшно охарактеризиране на HCV генома. Полинуклеотидните проби и праймеги, получени от тези последователности,могат да бъдут използвани за амплификация на последователностите,представени в сДНК библиотеките и/или за скрининг на сДНК библиотеките за допълнително съвпадащи сДНК последователности,които,на свой ред,могат да бъдат използвани за получаване на повече съвпадащи вЖй последователности. Както е показано в РСТ публ. № 1/V090 / 14436 , геномът на HCV изглежда да е РНК,включваща първично голяма отворено читаема рамка /OJ’P /,която кодира голям полипротеин.

В допълнение към горното,информацията,обезпечена по-дору , позволява идентификация на допълнителни HCV щамове или изолати.Изолирането и охарактеризирането на допълнителния HCV щам или изолат/и/ може да бъде съпътствано от,например, изолиране на нуклеинови киселр ни от телесни компоненти,които съдържа» вирусни частици и/или вирусна ДНК,създавайки сДНК библиотеки с помощта на олигомери,основани на HCVj. последователността скрининг на библиотеките за клонове, съдържащи HCV сДНК последователности,описани по-долу, и за сравнява не на HCV сДНК от новите изолати с сДНК,описани в РСТ публ. № W0/ 14436 и по-долу. Щамове или изолати,които пасват на размерите иж /параметрите / на HCV,както е описано в Раздела Дефиниции,по-горе, са идентифицируеми.Други методи за идентификация на HCV щамове ще бъдат задължително необходими за специалиста, в областта,на базат? на информацията дадена в настоящето изобретение.

Изолиране на HCV сДНК последователноститеОлигомерите от изобретението съдържат региони,които формират хибридни дуплексни структури с '-тппенни структури в HCV полинуклеотидите.НСУ полинуклеотид хибридизационните региони могат да бъдат установени от HCV сДНК последователностите,осигурени по изобретени- 19 ето,и описани в РСТ публ. I- W090/14436. Композиция на HCV сДДК от HCV1,прототип на HCV, θ показана на Фиг. 1.Композираната последователност е основана на информационната последователност от изве тен брой HCV сДНК библиотеки,включително с” библиотека в ламбда gill Л g+11 / / АТСС № 4Θ394 Й и от човешки серум. HCV сДНК клоновете са изолирани по методитеуописани в РСТ публ. «-ИГО_фО/ 14436 Накратко,повечето от клоновете,които бяха изолирани,съдържат последователности от HCV сДНК _с библиотеки, която е конструирана с помощта на серум,получен от шимпанзе с хронична HCV инфекция и съдържаща висок титър на вируса,най-малко 10° инфекциозни дози /мл / С1Д /мл/. Полученият серум бе използван за получаване на вирусни частици*. изолатите от нуклеинови киселини от тези частици са изпол звани като матрица за конструиране на сДНК библиотеки за вирусния геном. Иницииращия клон, 5-1-1 , е болучен чрез скрининг на с'^т библиотеката със серум от инфектирани индивиди.След изолиране на иницииращия клон,остатъка от последователността е получена чрез скрининг със синтетични полинуклеотидни проби,чиито последователно ти са получени от 5 - региона и 3- региона на известната HCV сДНК последователност /ти/.

Описанието на методите за възстановяване на сДНК последователностите е повече от историческа гледна точка. Резултантните последователности / и техните комплементи / са осигурени тук , и последователностите, или която и да е част от тях, могат да бъдат зз синтез изготвени с помощта на екееюини методи,или чрез комбиниране на такива методи за синтез с възстановяване на частичните последовате ности,с помощта на метода,аналогични на описаните в РСТ публ. W090 / 14436.

Олигомерни. проби и.. пдайм£РИ

Използвайки като база HCV генома,/както е илюстрирано на

- 20 фиг.1 / и/или съхранени области от HCV генома,олигомери с приблизително 8 нуклеотида или повече могат да бъдат изготвени,които се хибридизират с позитивни вериги от HCV РНК или нейни комплементи така каято и с такива от HCV е ДНК. Тези олигомери могат да служат като проби за откриване /включително изолиране И/или маркиране / на полинуклеотиди,които съдържат HCV нуклеотидни последователност: и/или като праймери за транскрибция и /или репликация на мишенни HCV последователности.Олигомерите съдържат насочени полинуклеотид последователности,които са включени в нуклеотидити,комплементарни на мишенната HCV последователности! последователността е със задоволителна дължина и комплементарност с HCV последователността за формиране на дуплекси със задоволителна стабилност за преследван] те цели. Например, ако целта е изолиране,посредством имиобилизаци: на анализиран образец,съдържащ мишенна HCV последователност,олигомерите биха съдържали полинуклеотидна област със задоволителна дължина и комплементарност с мишенната последователност на HCV, з? осигуряване на задоволителна дуплексна стабилност за иммобилизира! на анализирания образец върху твърда повърхност,благодарение на свързването му към олигомерите,при условията на изолиране, Напримс ако олигомерите служат като праймери за транскрибция и/или репликг ция за мишенни последователности в един полинуклеотид,подлежащ на анализ,олигомерите биха съдържали полинуклеотидна област със задо! лителна дължина и номплементарност спрямо ияевиеиихи последовг телност _с оглед да даде възможност на полимеризиращият агент да завърши репликацията от праймерите,които са в стабилен .дуплексен вид,при условия на полимеризация» Например,също така олигомерите могат да бъдат използвани като маркирани проби,или да бъдат свъгз? ни към мултимери, насочения® полинуклеотиден регион би бил (ц достатъчна. дължина и ко'-Т1лементарност за формиране на стабилни -дуплексни структури с белязаните проби и/или мултимери с оглед откриване на дуплексите.

Олигомерите могат да съдържат четири съприкасаващи се нуклеотида, които са комплементарни на мишенната HCV последователност j Обикновено олигомерите съдържат минимум от около 8 такива нуклеотида, които са комплементарни на мишенната HCV последователност и за предпочитане - минит.ум от около 14 съприкасяващи се нуклеотида, които са комплементарни на мишенната HCV последователност.

Подходящи HCV нуклеотидни последователности,използваеми като мишена могат да бъдат включени от нуклеотиди,които са комплементарни на нуклеотидите,избрани от HCV сДНК нуклеотидите,показани на Фиг. 1.

Олигомерът,обаче се нуждае не само от последователност,която да е комплементарна на мишенната HCV последователност Дой може да съ,държа в допълнение нуклеотидни последователности или други стра нични групи,които са подходящи за нуждите,за които се използват олигомерите. ^папример, ако олигомерите се използват като праймери за амплификация на HCV последователности чрез РСР,те могат да съдъжат последователности,които,когато са в дуплекс,да формират ензимни рестрикционни сайтове,които улесняват клонирането на ампли цираните сайтове.Например също,ако олигомерите бъдат използвани като ’’уловени проби в хибридизационни изпитания /описани по-долу/ те ще съдържат допълнителен свърващ партньор,който се свързва към олигомер,съдьржащ нуклеотидна последователност,която е комплементарна на мишенната HCV последователност.Други типове от странични групи или последователности,които са полезни като елементи за включване или присъединяване,са онези,известни за нивото на техник та,които са подходящи за много цели,включително маркиране на нук леотидни проби.

хдиихтфхйя: олигомери е по известни

Получаването на йххжйзз начини,включително,напр.,методите,включващи изрязване,транскрибцив или химичен синтез.Нишенните последователности и/или региони от генома_гкоито са подбрани и към които мишенните последователности στ олигомерите са комплементарни, са в зависимост от необходимост? Например, ако целта е скрининг за присъствие на HCV _в биологични проби,/като кръв /.предпочитаните олигомери биха били използвани като проби и/или праймери, и биха се хибридизирали със съхранени региони от HCV генома. Някои от съхранените региони на HCV генома към които олигомерите могат да се свържат, са описани тук,напр., регионите, които включват нуклеотиди от 5-края до около 200 на бро: или от около 4000 до около 5000, или от около 8000 до около 9040 както е показано на Фиг. 1 , или за предпочитане нуклеотиди около -318 до около 174 , около 4056 до 4448, и около 4378 до около 4902 Специално предпочитани праймери и проби са получени от около нуклеотидите -313 до около -173, и от около нуклеотид 1 до около нуклеотид 540,както е показано на Фиг. 1.

Други области от генома са установени чрез сравняване на нуклеотидните последователности от различни изолати на НСУ^ключителш прототипа HCV,HCV1. Методите за провеждане на сравнения между генотиповете за определяне съхранени е · или не-съхранени региони са известни на специалистите, и примери за тези методи са разкрити в РСТ публ. *7- W090/14436.

В основните изпитвания за хибридизация на нуклеиновите кисел! ни,едноверижна нуклеинова киселина /независимо ДНК или РНК / се хибридизира кил проба нуклеинова киселина, и получените в резултат дуплекси се откриват лесно .Пробите от HCV нуклеотиди /натурални и.ш получени / са отрязъци,които позволяват откриването на уникалната вирусна секвенция чрез хибридизация. Докато 6-8 нуклеотида може да представлява работоспособен отрязък,последователности от 10-12 нуклеотида са предпочитани,а около 20 нуклеотида са повече от оптимални.За предпочитане е тези последователности да са получени от реги- 23 они,които не са хетерогенниДези проби могат да бъдат изготвени с помощта на рутинни мето,пи,включително автоматизирани олигонуклеотидни синтетични методи.Измежду полезните проби,например,са такива получени от новоизолирани клонове,разкрити тук,като напр. различни олигомери ,необходими при сондаж на сДНК библиотеките,описано порано.Би бил задоволителен всеки комплемент на която и да е част на HCV генома Да да бъдат използвани като проби,пълната комплементарност е желателна,макар че това може да не е необходимо ако отрязъка от фрагмента е увеличен.

За използването на такива проби като агенти за откриване прие съствието на HCV полинуклеотиди /напр. за скрининг на контаминирана кръв /,за анализ на биологични проби,такива като кръв или серум, третирането може да се осъществи,по желание, чрез екстракция на съдържащите се нуклеинови киселини.Последните могат да бъдат подложени на гел електрофореза или друга разделителна техникаj обратно пробите от нуклеинови киселини могат да бъдат подложени на точково оцветяване без разделителна процедура,основана на разликата в размерите на молекулитеД оглед формиране на хибридни дуплекси с ми шенните последователности от пробата,мишенним*? отрязък от анализираната нуклеинова киселина трябва да бъде едноверижна. ^ъде-ι последователността по своята природа е в едноверижна форма,денатурация не е необходима .Обаче,където последователността е представена в двойно-верижна форма,последователността ще бъде денатурирана. Денатурацията може да бъде осъществена чрез различни техники,извесо ни на специалистите, След денатурацията,анализираната нуклеинова, к киселина и проба се инкубират при условия,които дават възможност зг получаване на стабилна хибридна формация от мишенна последователнос в пробата с предполагаема мишенне последователност в анализираната проба и получените в резултат дуплекси се подлагат на изследване з< наличност.

- 24 Установяването на резултантните дуплекси,ако има, обикновен се съпътства от използването на белязани проби. Обратно,пробата м> же да не е белязана,но може да бъде откриваема чрез предварително' й свързване по специфичен начин с лиганд,който е белязан,независи директно или недиректно. Подходящи маркери и метода за белязане на пробите и лигандите са известни на специалистите, и включват напр радиоактивно йзжгажии маркери,които могат да бъдат инкорпорирани по известни методи,чрез биотин,флуоресцентни групи,- хемилуминисце тни групи /като диоксиетани,частично активирани даоксетани /ензим антитела и др.

Региона от проби,които са използвани за свързване към анали зирания обект може да бъде направен напълно комплементарен на генома. Поради тоЕа са желателни много строги условия за да се из бегнат грешки.Обаче,тези много строги условия могат да бъдат използвани само ако пробите са ковзглементарни на регионите от вирус геном които не са хетерогенни.Строгостта на хибридизацията е опре лена от редица фактори по време н? хибридизацията и по време на проце,пурата на промиване,включително температурата,йонната сила,п дължителността на времето и концентрацията не. формамид . 1'ези фактори са подчертани в публикациите на ^аниатис /48/.

могат да бъдат използвани различни варианти на тази основи схема,които са известни не специалистите,включително такива,ши улесняващи отделянето на дуплексите за да бъдат открити от други нови материали и/или които амплифицират сигнала от странич^^^³?·? пи.Преглед на тези варианти са направени напр. в 47,48 и 50«. Подходящи за откриване на HCV в тези изследвания са пробите,включенк в последователности,които се хибридизират с мишенни HCV полинукле отидни последователности за формиране на дуплекси с анализираната верига,където дуплексите са със задоволителна стабилност за открр ване в специфичната система за анализ.

Бдин специфичен вариант е,например, описаният в Амер. патент

4,868,105, издаден на 09.IX. 1989 г и ПК) публ. 225807 / публ.

юни 16.,1987/. Тези публикации описват хибридизационна проба от нуклеинови киселини в разтворима фаза,в която анализираните нуклеинови киселини са хибридизирани към от бележещи проби и .Флпмя _от проби.Комплексът за анализиране на пробата е

- 25 свързан чрез хибридизация с хяхрд проба за улавяне с твърда повърхност, която е комплементарна на •^^смат??· _за улавяне на пробата.

Това позволява анализираната нуклеинова киселина да бъде отстранена от разтвора като твърдофазен комплекс .Анализирането в твърда фа: улеснява последващата стъпка на отделяне. Формата за маркиране е комплементарна на белязаната проба,която е свързана чрез хибриди· зация към твърдофазният комплекс.·

Най-общо казано,очаква се,че HCV геномните последователности биха присъствали в серума на инфектирани индивиди в релативно ниск нива,приблизително от 10~ - 10° инфекциозни дози за шимпанзе /СХД/ за мл.Такова ниво може да изисква използването на амплификационни техники в хибридизационните изпитвания. '1'акива техники са известни н а специалистите в областта. Например, ΗπΖο Е>1ос&ем1са{ Corporaii ^,’Bio-Bridc|e^,‘ системата използва терминална дезоксинуклеотидна тран фераза за добавяне на 3- поли-dT -опашки към ДНК проба. Поли с)Топашатата проба се хибридизира към мишена нуклеотидна последовател ност и след това към биотин-модифициран поли -A, FCT публ. Ь-’ 84 / 03520 и ЙРО публ.. 124221 описват ДНК хибридизационно изпитване,! което ί 1/ анализираният обект се делинеаризира до едноверижна ДО която е комплементарна на ензимно-маркиран олигонуклеотид j 2/ полученият в резултат опашат дуплекс се хибридизира към ензимно-маркиран олигонуклеотид.КЮ публ. 204510 описва ДНК хибридизационнс изпитване,в което анализираната ЖК влиза в контакт с проба,която има опашка, като напр. поли-ψ¹ опашна, амплифи^ионнаверига,която има последователност,която се хибридизира към опашката от пробата като поли-А последователност, и която е способна да свърже множеси белязани периш. Тип хибридизационно изпитване,което е описано в ЕЮ публ.. 317077 /публ. 24.май 1989 /,което трябва да открие поеледователности на ниво приблизително 10°/мл, оползотворява мултимери от нуклеинови киселини,които се свързват към едноверижна аналитична нуклеинова киселина,и които също така се свързват към множество едноверижни белязани олигонуклеотиди. Специално желана техника можи дд г.и/плнрл лмплификл.п,игг ил тлплииитя HCV ттлелллпплтлпипети

Z?

в приблизително 10 000 усуквания / т.е. приблизително 10° последователности на мл /,като част от хибридизационната ситема. Ашлификацията може да бъде съпътствана,например,от полимеразни верижни р акции /РСК/ , описани от/80,110 и 112 /. Амплификацията може да бъд проведена преди или непосредствено след пречистването на HCV _?дишейната последователност.Например, амплификацията може да бъде използвана при присъединяването в опитите,описани в Α^θρ, патент 486 105. или ако е желана по-нататъшна амплификация,при присъединяване е хибридизационна система,описана в ИГО публ. 317077.

Предпочитаните методи за откриване на HCV последователности в анализиран полинуклеотид се основават на методите на хибридизационно откриване,описани в Амер. патент 317077.Тези методи са разтворимо-фазни сандвичеви хибридизационни изпитвания,които изпол зват както уловената,така, и белязаната проби,които се хибридизират към мишенните последователности в анализирана нуклеинова киселина. Използването на тези изпитвания за скрининг на биологични проби за HCV,използваните проби биха се свързали с консирвираяи региони от HCV генома.Уловената и белязаната проби могат да бъдат разпръснати прит тяхното свързване към мишенната последователност.Обратно, в предпочитания вариант уловената и белязаната проби са в един ком- 27 плекс, и пробите от един комплекс не се разпръсват с пробите от друг комплекс.В последният варият,за предпочитане е комплекси/ите/ от мултиплените уловени проби се хибридизират към най-запазените региони от генома,докато комплекса/ите/ от мултиплените белязани проби могат да се хибридизират към регионите,които демонстрират малки дивергенции.Например, използвайки прототипа на НСУ^сДНК после дователност,показана на Фигура 1,1фийяткххихатхж биха могли да бт дат използвани проби,които се хибридизират към последователности ят в региона от нуклеотиди от около 318 до около 174, и/или нуклеотиди в региона от около 4378 до около 4902 и/или нуклеотида в per она от около 4056 до около 4448.Предпочитаните проби биха се хибридизирали към последователности в 5-края от HCV рккииих геном^ доколкот_Яакто е показано по-долу,този регион се оказва много добре съхранен. Така,предпочитани проби могат да се хибридизират към, например,нуклеотиди от около -318 до около 174 както е показано на Фиг.1.Пробите биха били използвани за хибридизация към който и да е от позитивните вериги в съхранените региони, и/или неговите комплементи,в зависимост от намеренията,напр. за откриване на вирусни геномни последователности, или за откриване на HCV сДНК последователности, получени в резултат от ВСЕ амплификацията, или за открива на репликативни междинни продукти на позитивната HCV РНК верига..

Установяване на HCV РНК и полинуклеотиди,получени от неа с-лоисто н?;;етод? HCV Z.gPCR—--------------------Частично използваем метод за установяване на НС? РНК или полинуклеотиди, получени от тази HCV РНК е HCV/ cHCR , който е обект на настоящето описание, и който използва техниката на полимс разната верижна реакция /PCR/ и който е описан от /80,110 и 112 > Този метод използва праймери и проби,получени от информацията,осигурена. тук относно природата на HCV генома.

- 28 Най-общо,в ΡΟξ техниката,се изготвят къси олигонуклеотидни праймери,които- съответстват на противоположните краища на желаните последователност. Последователността между праймерите не е необходимо да бъде позната.Проба от полинуклеотида се екстрахира и денату рира,за предпочитане по топлинен път,и се хибридизира с олигонуклес тидни праймери,които присъстват в моларни излишъци,Полимеризацият? се катализира от матрично- и праймер-зависима полимераза в присъствието на дезоксинуклеотид трифосфати или нуклеотидни аналози / dHTi Това /тя/ резултира в два ?дълги продукта,които съдържат респектш ните праймери при техните 5 -крайща,ковалентно свързани към новост тезираните комплементи на оригиналните вериги.Непликираннта ДНК отново се денатурира,хибридизира се с олигонуклеотидни праймери, връща се при полимеризационни условия и се инициира втори цикъл на репликация.Ьторият цикъл обезпечава двете оригинални вериги,,двата дълги продукта от цикъл 1 и двата къси продукта,репликиранз от дългите продукти.Пъсите продукти съдържат последователности Iсмиел ви или безсмислови /,получени от мишенните последователности,фланкирани към 5- и 3*-краищата с праймерни последователности. При всеки допълнителен цикъл, броят на късите продукти се репликира. екс поненциално Дака, този процес причинява амплификацията на. специфичн мишенна последователност.

В метода, обезпечава се проба,която да съдържа HCV РНЙ или нейн фрагмент , Пробата се взима обикновено от индивид,който се счита,че съдържа NANBH ;обаче,могат да бъдат включени и други из точници,като напр. кондиционирана среда или клетки от ин... „нитро ... системи,в които вирусът е бил репликиран. Пробата,обаче,трябва да съдържа мишенната нуклеотиди?. последователност/ти/.

След това,пробата се подлага на условия,които позволяват реве тивна транскрибция на HCV РНК в HCV сДНК_г Условията за обратно/pei тивно/ транскрибционната РНК са известни на специалистите в област и са описани,например,в /48/. Предпочитаният метод за обратна транскрибция използва обратна транскрибтаза от различни източници,вклю- 29 чително рекомбинантни молекули, и изолирани от,например,ретровируси за предпочитане от птичи миелобластозен вирус / AmV / _fn при подходящи условия за транскрибция. KCV сЖК продукта на обратната трая скрибция е в РНКхДнК хибрида,който се получава от първата обратна транскрибция*съответно,ДНКхДНК хибрид се получава от два или повече кръга на транскрибция.

HCV сДНК,получена от обратната транскрибция след това се подлага на НСР за амплификация на мишенната последователност.С оглед на това ,HCV сДНК се денатурира,

азделените вериги се хибридизират с праймери,които фланкират мишенната последователност.

Разделянето на веригите може да бъде съпътствано откойто и да е денатурационен метод,включително физичен,химичен или ензимен начин,известни на специалистите в областта.Предпочитаният метод, който е физичен,включва нагряване на нуклеиновата киселина до нейното пълно / 99% / денатуриране.Типичното температурно денатуриране включва температури,граничещи от около 80°С до около 105°С, за време от около 1 до 10 мин.

След хибридизация на нСУ сЖК е праймери,мишенните HUV последователности се репликират чрез полимеризация,която усвоява праймерния олигонуклеотид за иницииране синтеза на рапликационната вери] га.. Праймертте са подбрани,така че теса комплементарни на последователностите от HCV генома.Олиготлерните праймери,които са комплемеи тарни на областите със смислени и безсмислени вериги от KCV сД8К, могат да бъдат конструирани от HCV сДНК последователностите от сДНК последователността,обезпечена, на Фиг. Ί,

- 30 Праймерите са подбрани така,че техните релативни позиции по продължение на дуплексните последователности са подобни на продукта,синтезиран : ат един праймер,когато е отделен от неговия комплемент /матрица/, като матрица за другия праймер за получаване на репликационна верига с определена дължина.

Праймерът е обикновено идноверижен за максимум ефективност при амплификация,но може да бъде и двойноверижен.Ако е двойноиепи³ жен,праймерът най-напред се третира за отделяне на неговите вериги преди използването им за изготвяне на екстензионнипродукти. За предпочитане е праймера да бъде олигодезоксирибонуклеотид.^раймерът трябва да бъде задоволително дълъг за да даде началото на синтезата на екстензионен продукт в присъствието на агент за полин меризация, Точната дължина на праймерите зависи от много фактори, включително температурата и източника на праймерите и използвания метод.Например,в зависимост от комплексността на мишенната последователност, олигонуклеотидният праймер типично съдържа около 15-45 нуклеотида,макар че може да съдържа повече иж по-малко нуклеотида Праймер с къси молекули обикновено изисква по-хладни температури за формиране на задоволително стабилен хибриден комплекс с матрицата ,

Използваните тук праймери са подбрани да бъдат съществено комплементарни на различни вериги от всяка специфична последователност за амплификация.Поради това,праймерите не е необходимо да рефлектират на точната последователност от матрицата,но трябва да са задоволитално комплементарни за селективна хибридизация с техните респективни вериги.Например, не-комплементарен нуклеотид ден фрагмент може да бъде присъединен към 5-края на праймера, с остатъка от праймерната последователност,комплементарна на веригата. Обратно,не-комплементарни бази или по-дълги последователности могат да бъдат пресипани към праймера,осигурявайки това,ч& праймера^притежава задоволителна комплементарност с последовател- 31 ността на една от веригите за да бъде амплифицирана към хибридизирания, и поради това да формира дуплексна структура,която може да бъде разширена чрез полимеризация.Не-комплементарната нуклеотидна последователност на праймера /ите ! може да включва рестрикционн ензимни сайтове«Добавянето на рестрикционен ензимен сайт към края /краищата/ на мишенната последователност би подпомогнала клониранет на мишенната последователност.

Следва да се отбележи,че праймер'*,както е използвано тук, може да се отнася до повече от един праймер,по-специално в случая известна когато има двусмисленост на информацията отнасяща се до терминалните последователности в мишенния регион за агшлифициране.Докато, тт Т» праймера включва сбор от праймерни олигонуклеотиди,съдържащи последователности ,представящи възможните варианти в последователността или включва нуклеотиди,които позволяват типично удхих чифтосване на базите.Дцин от праймерните олигонуклеотиди в този сбор ще бъде хомолог с края на мишенната последователност. Специфичен случай е този,когато олигомерните комплекси се използват за. да дадат наи?лото на амплификация на потенциален вариант на регион от HCV генома. Съхранените региони могат да бъдат определени чрез сравняване на нуклеотида или на аминокиселинната последователност на няколко HCV щама /изолата/. Изглежда да са налице най-малко три региона от съхранени аминокиселини в HCV генома,описани по-горе,отккоито могат да бъдат получени праймерите.Праймерите,описани по-долу в Примерите,са получени от региони на НС¥,за които се счита.,че са съхранени и които са основани на хомоложността на последователностите с тази от Флавивирусите,

Олигонуклеотидните праймери могат да бъпат изготвени по който и да е от известните подходящи методи.Методите за получаване на олигонуклеотиди със специфична последователности са известни в

- 32 областта, и включват,например, клониране и рестрикция на. подходящи последователности и χκρ насочен хи?личен синтез.Методите на химичен синтез могат да включват,напр.,фосфотриестерният метод,0' описан от Еаранг /65/,фосфодиестерният метод на /7/,диетилфосфорамидатният метод на Ьюкадк /2/ и метода,описан в Амер, патент й- 4 458 U66t 111/.

Праймерите могат да бъдат белязани,по желание,с маркери така че да йогат да бъдат открити по методите на спектроскопията

по биохимични,имунохимични или химични методи.

Матрично-зависими екстензии на нуклеотидните праймери се катализират чрез полимеризационен ^гент в присъствието на съответно количество от четирите дезоксирибонуклеотид трифосфати ί ₀АТФ,.д1ТФ,аиТФ _и да / или аналози ,в реакционна среда,която е съставена от подходящи соли,метални катиони и pH буферни систе ми.По,дходящи полимеризационни агенти са ензими,известни да катализират матрично-зависим ДНК синтез, Известните ДНК полидеризаци включват,например, &’,coli полимераза I или нейният Кленоф фрагме

ДНК полимераза и Taj ДНК полимераза. Реакционните условия за катализиране на ДНК синтезата с тези ДНК полимерази са известни в областта.

Продуктите на синтезиса са дуплексни молекули,състоящи се от матрични вериги и прай’:ерни екстензионни вериги, които включва мишенната последователност.Продуктите,обратно,служат като матриг за друг кръг на репликация.Във втория кръг на репликация,праймерната екстензионна верига от първият цикъл е линеализиран с нейният комплементарен праймер^ синтезата води до къс продукт който е свързан откъм двата 5- и 3 края с праииерни последоватед ности или техни комплементи. Повторните цикли на денатургция, праймерното линеализиране и екстензия резултират в експоненциал- 33 но акумулиране на мишенния регион,дефиниран от праймерите.Провеждат се толкова на брой цикли,колкото са необходими,за да се достигне желаното количество полинуклеотид,съдържащ мишенния регион на нуклеиновата киселина Аланото количество може да варира и се определя от функцията^която трябва да служи нуклеотида.

PCR методът може да бъде хркдахаввн осъществен от различни временни последователности .Например,той може да бъде осъществен последователно,където след всеки етап се добавят нови реагенти, или по начин,според който всички реагенти се добавят ихннхяхх едновременно или по частично последователен начин,където пресните реагенти се добавят след даден определен брой стъпки.

В предпочитания метод,BCR реакцията се провежда като а.втома· тизиран процес с помощта на термостабилни ензими.Според този метод, реакционната смес циркулира през денатурационният регион праймерния линеализиран регион и реакционният регион. ^може да бъ^п използвана машина,която е частично адаптирана за използване с термостабилен ензим,осъществяващ температурно циклиране без течна жу управляваща система,доколкото не е необходимо ензима да с добавя на всеки цикъл .’Гази машина може да се достави от ^егк!п

След амплификация чрез RCR,мишенните нуклеотиди се отттиват чрез хибридизация с нуклеотидна. проба,която формира стабилен хибрид с онзи от мишенната последователност при умерено строга хибридизация и условия на омокрянеДко се очаква.,че пробите са напълно комплементарни / напр. около 99% или повече / на мишен ната последователност,ще се използват строги условия. ко се очакват някои несъответствия,например, ако се очакват различни варианти на веригите да не са комплементарни напълно ,строгостта на хибридизацията може да бъде намалена.Както и да е,избират се условия,които постановяват неспецифично/случайно свързване.

- .34 Условията,които предизвикват хибридизация,и които се подбрани срещу неспецифично свързване,са известни в областта.Описани са,например ,в /42/.Най-общо казано,ниска концентрация на соли и висока температура повишават строгостта на свързването. И_аПример, счита се, че строги условия са инкубация ярихукхивията в разтвор съдържащ приблизително 0,1 х SSC,O,1% ,при около 65°С и умерено строги условия са инкубацията в разтвор,съдържащ приблизително 1-2 xS$C,O,i%SDS и около 50-б5°С. С_лабо строги условия са 2x6Sc и около 30-50°С.

Пробите за HCV мишенните последователности могат да бъдат получени от HCV сДНК последователност,показана на Фиг.1, или от нови HCV изолати.HCV пробите могат да бъдат с каквато и да е подходяща дължина,която покрива мишенният регион,но който изключва праймерите и позволява специфичното хибридизиране към мишенния регион.Адо е налице пълна комплементарност,т.е.,ако щама съдържа последователност,идентична на тази на пробата,доколкото дуплекса е релативно стабилен дори при строгите условия,пробата може да йех бъде къса,в размер около 10-30 бази двойки.Ако се очаква известна степен на несъвпадение с пробата, т.е. ако се очаква пробата да се ш»* хибридизира с различни области,пробата може да бъде с по-голяма дължина,доколкото дължината изглежда уравновесява н известна степен несъвпаденията.

Пробата от нуклеинова киселина с последователност,комплементарна на мишенната последователност ,може да бъде синтезирана с помощта на аналогични технологии на описаните по-горе, за синтез на праймерни последователности.При желание,пробите могат ла бъдат белязани.Подходящите маркери са описани по-горе.

В някои случаи би било желателно да се определи дължината нз НСБ? продукта, определен чрез пробата Лова може да. бъде частично вярно,ако се очаква,че вариантните HCV щамове могат да съдържат

- 35 делеции в рамките на мишенния регион, или някой има желание да потвърди дължината на РСР продукта.^ такива случаи,за предпочитане е продуктите да бъдат подложени на анализ за размера,като например хибридизация с пробата.Методите за определяне размера на нуклеиновите киселини са известни в областта и включват,например, гел електрофорезис,седиментация в градиенти и гелна хроматография.

Присъствието на мишенна последователност в биологична проба се установява чрез определяне дали е формиран хибрид между HCV полинуклеотидната проба и нуклеиновата киселина,подложена на ббработка с амплификационна техника. М_етОдите за откриване на хибридите,формирани между пробата и последователността на нуклеиновата киселина,са известни в областта.Например,за удобство, небелязана проба може да бъде прехвърлена върху хехкдин твърда повърхност/матрикс/,към който се свързва., и свързаната проба се подлага на условия,които позволяват специфична хибридизация с маркираната Дроба* след това твърдата повърхност се изпитва за присъствие на белязана проба.Обратно,ако пробата е белязана,небелязаната проба се присъединява към матрикса и след поставянето й на подходящи хибридизационни условия,матрикса се изпитва за присъствие на маркиращия блемент. Други подходящи хибри,цизационни изпитвания са описани по-горе.

Определяне на вариантни HCV последователности с помощта на КЩ -----------------------С оглед идентификация на вариантните tiCV щамове и поради това -конструиране на проби за такива варианти,описаният по-горе

- 36 HCV/cPCP метод се използва за амплификация на вариантни региони от HCV генома, така че нуклеотидните последователности от тези вариантни мишенни региони могат да бъдат определени,Най-общо, може да се очаква появяването на вариантни типове HCV _в различни географски локализации от тези,в които HCV1 щама е преобладаващ, например в Япония,Африка и др. j или в различни гръбначни видове които също се инфектират от вируса.Варианти на HCV могат да възникнат също и по време на пасирането в тъканно-културни системи, или да бъдат резултат от спонтанни или индуцирани мутации.

С оглед амплификация на вариантите на мишенни я регион, праймерите се конструират така,че да бъдат разположени странично на региона и да са комплементарни на съхранените региони.Праймерите за два региона от HCV,които вероятно са съхранени,са основани на модела, sshsesl за Флавивируса. Праймерите и пробите могат да бъдат конструирани,усвоявайки секвенционната информация ва НСГи щама,осигурена на Фиг.1.

Анализът на нуклеотидната последователност от мишенните последователности моявт да бъде осаществен чрез директен анализ н на амплифицираните продукти.йроцес за .директен секвенционен анализ на ЕСР амплифицирани продукти е описан от /81/.

Обратно, амплифицирани мишенни последователности могат да бъдат клонирани преди ееквенционният анализЛетод за директно то клониране и секвенционен анализ на ензимно амплифицирани геномни сегменти са описани от/83/. Съгласно този метод,праймерите, използвани в РСР техниката са модифицирани близо до техния 5^ край за получаване на удобни рестрикционни сайтове за директно клониране в,например, ^м13 секвенционен вектор.След амплификацията, яСР продуктите се слепват с подходящи рестрикционни ензими.Рестрикционните фрагменти са лигатирани в ^м13 вектора и се трансформират в,например, N 103 гостоприемника,посява се,и полу⁵* чените в резултат плаки се скринират чрез хибридизация с белязана олигонуклеотидна проба.Други методи за клониране и секвенционен анализ са известни в областта.

ДЬаймеш, универсални за Флавивируси и за HCV

Изследванията за природата на ЯСУ генома,използвайки пробите получени от HCV сДНК , като информацията за последователността, съдържаща се в HCV сДНК стигат до заключението,че HCV вирус,подобен на Флавивируса Дези изследвания са описани в ИЗТ публикацията W090/14436.- В сравнение с HCV

последователността,получена от HCV сДНК клоновете с известни последователности за поветето от Флавивирусите показва,че HCV включват последователности,които са хомоложни на съхранените последователности във Флавивирусите ,'1'ези съхранени последов^телное ности могат да позволят създаване на праймери,които да са универсални в тяхното прилажение за амплификация на мишенните региони от Флавивирусите и от HCV. Идентификацията, на видовете след това се съпътства от усвояване на проба, специфична за видаДеномите повечето Флавивируси са известни в областта и включват, например,Японския вирус на енцефалита,/91/,вируса на жълтата треска /74/,Денгу ‘1‘ип 2 вирус/3.2/,Денгу Тип 4 вирус /54/ и Западно нилски вирус /9/.Идентификацията на HCV вирусната. НЖ е последвана от усвояване на проба,специфична за HCV,последователността от която може да бъде определена с HCV сДНК последователността, обезпечена в описанието.

Обратно, използването на комплекс от проби,конструирани _зада обяснят _кодониата дегенерация и за това съдържамебщи

ПИП.ФАМЯ последователности с Флавивирусите и с HCV_t както сфпределени при сравняване на HCV амино киселинните последователности с известни последователности от Флавивируси,позволява детекционна

- 38 Конструиране на. желани. ДрК_послеповате.лносди_

Синтетични олигонуклеотиди могат да бъдат изготвени с помощта на автоматизиран олигонуклеотиден синтезатор,както е описан отУ^агпег / 98/. По желание синтетичните вериги могат 3? да бъдат белязани с ? чрез третиране с полинуклеотид кина за в присъствието на - АТФ_>С помощта на. стандартни условия за провеждане на реакцията.

ДНК последователностите,включително тези,изолирани от ДНК библиотеките, могат да. бъдат модифицирани по известни те— ники,включително,например сайт насочена мутагенеза, както е описано от toiler /101/.Накратко,за да бъде модифицирана ДНК, тя се въвежда във фаг като едноверижна последователност, и се превръща в двойноверижна ДНК с ДНК полимераза,с помощта на праймер,който по своята същност е синтетичен олигонуклеотид, комплементарен на тази част от ДНК,която подлежи на модификация и притежаващ желаната модификация,включена в нейната собствена последователност.Гезултантната двойно верижна ДНК _Се трансформира във фаг,^{сги1ьшан о}?актерията-гостоприемник. Културите от трансфор мираната бактерия,които съ,държат репликации от всяка верига на фага се посяват в агар за получаване на плаки.Теоретично,50^ от новите плаки съдържат фаг,съдържащ мутантна последователност, и останалите 50$ имат оригиналната последователност.^епликатите от плаките се хибридизират с белязаната синтетична проба при температура и условия,които позволяват хибридизация с правилната верига,но не и с немодифицираната последователност.последователностите, които са идентифицирани чрез хибридизация се възстановяват и клонират.

- .39 Китове за скрининг на полинуклеотиди. получени. ОТ-.НСУ

Олигомерите,които са проби и/или праймери за амплификация и/или скрининг на проби от HCV,могат да бъдат опаковани в китове. Китовете за скрининг на HCV последователности включват олигомерни проби ДНК, Китовете за амплификация на HCV последователностимогат да включват олигомерните праймери,използвани за амплификацията.Китовете обикновено съдържат пробите или праймерите в предварително измерени или предварително определено количество,а така също и други опаковани по подходящ начин реагенти и материали,в отделни подходящи контейнери,необходими за специална хибридизация и/или амплификация .Например, китът може да съдържа стандарти,буфери,ензими,субстрати,белязани проби,свързващи партньори и/или индтрукции за осъществяване на теста,

НЖЕЯТ

Описаните по-долу примери на настоящето изобретение само илюстрират,но не ограничават обхвата му,

-L Ртшване-^? дозитиш? ,и,,негативна, .верига в серум

ЕНК в mCV2? ,изолирана от серум , бе анализирана за присъствие на позитивни и негативни вериги с помощта на метода, ЕСЕ метода бе проведен по описания по-горе начин,с изключение на следното.

Екстрахираната ΗυΥρφ fHK бе подложена на ревертивна транскрибция в едноверижна сДНК с помощта на праймер както ^{ех 90, така и ЕН52_r Afех 90 е получен от нуклеотидите - 312 до-283 от HCV1 яенома,притежава последователността ί

- 40 5'ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'

Ί H52 е получен от HCV нуклеотидите -93 до -117 у нуклеотидните номера са означени в кръгли скобки под последователностите. В IH52 подчертаният динуклеотид е подложен н? мутация за създаване на Moi I сайта. Последователността ПН52 е както следва ί / Праймер / Пълнител Moil HCV последователност / JH52 ί 5 AGTCTT GCGGC£GC ACGCCCAAATC 3 (-93) (-117)

Последователността на Αχθχ 90 съответства на тази в нуклеотидите -312 до -283 от позитивната верига на HCV РнК, докато HCV РНК съответства на тази от нуклеотидите -117 до -93 от негативната верига.Получените в резултат едноверижни HUV сДНК бяха всяка поотделно амплифицирана чрез с помощта на Α^θχ 90 и ПН52. Откриването на амплифицираните продукти бе последвано от Соутерн блотинг с помощта на Α{θχ 89 като проба. Alex 89 съответства на нуклеотидните номера -203 до -175 от HCV РНК. Последователността на Αίθχ 89 е ^: '5' CCA TAG TGG ТСТ GCG CAA CCG GTG AGT АСА з'

Анализът показва че , по този метод, сигналите от амплифицираните продукти от двете РНК вериги са с еднаква интензивност. Резултатите навеждат нз мисълта,че НС\ нНК _в 5 _ региона може да съществува като двойно-верижна РНК.

- 41 II, Откриване на HCV ГНК в плазма,с помощта на HCV/(»PCP_> с участието на Йраймери и проби,получени от 5*региона на HCV РНК

Екстракция на HCV РнК _от плаз.ма_

Камино

Замразена плазма се разтопява в РЗу . Количества от 0,2 мл от сместа, състояща се от 100 милимола /м^/ Ipnc-HCl^ м^ ЕДГА , 200 ьД H_ac/_t2u микрограма/милилитър /|л^^2 РНК, и,5% $Д9 и 2 j^/мл протеиназа К,при pH 8 , се добавя към 2 мл микрофужна епруветка и се затопля до 37°0.Плазмата /и, 2 мл/ след това се добавя и сместа се оставя за инкубация при би°С зе 1 час.-След това се добавя фенол /0,4 мл/ и сместа се разбърква.

енергично 3 х 30 сек ,с промеждутък от 30 секунди за всяко разбъркване.След това сместа се центрофугира за 5 мин и водната фаза се възстановява.Органичната фаза се екстрахира обратно с 0,1 мл ТЕ$и отлетите водни фази се екстрахират 2 х с 1 обем фенол/хлороформ/ ΙΑΑ ,след това с един обем хлороформ.Към екстракта се добавят 1 jii /1 ^/ гликоген /Beorlnjen ManniielM С_0Гр / и 25 jil МаОАс / 3 bi,pti 5,4 / и 1,25 мл студен ЬтОН _и продукта се замразява в сух лед и се завърта за 10 мин/ се разтварят в 100 м1 дистилирана вода и 5 / NaO-Ac / pH 5,4 / се добавят с 250 м1 студен ЕфОн, Разтвора се замразява и се завърта отново и получените в резуртат утайки се разтварят в |л£ d Η₂°·

- 42 е ДНК синтеза

За синтезиране sa сДНК от екстрахираната ННК,иницииращи 5 от разтворената РНК се инкубират с 4 γιΐ вода и 1 /1^ или 166 рмола от 18-мер / от -РГ праймера. Инкубацията се пров вежда при 7и°С за 3 мин,последвано от охлаждане в лед.Последователност та на ЯС праймера е ^;

5* GCC AAC ACT ACT CGG СГА з'

След началната инкубация,към инкубационната смес се добавят ϊ 10 от 5х първия буфер / 250 ьДО Трие HCi_tpH 8,3 , 375 мМ КС1ф15 *5θ дитиотреитол / J 2,5 дезоксинуклеози.цтрифосфати /10 от всеки / J 2,5 jd/ обратна транскрибтаза / ШШГ от ВРЬ. _f 200 единици за yd / и дестилирана. вода за получаване на обем 50 jil. Сместа се инкубира на 37°С за 1 час,нагрява се при 90°С за 3 мин и се охлажда с лед.

PCR а:д!лифидациа,

РОК амплификацията на HCV сДНК,получена по-горе се осъществява с помощта на тест реагенти,изброени по-долу на Таблицата.

В нея РНК” означава контролната проба,в която РНК θ екстрахирана от индивид,който не е инфектиран с HCVi j тази опит се провежда преминавайки през етапите на сДНК синтезата и PCR, амплификацията$.обаче,в този случай количеството РНК по време на сДНК синтезата е заместено с^с вода. ” Матрица е контрола за ЯЖ реакцията,от която матрицата е пропусната.Опит/проба/ показва серума,който се изпитва за присъствие на HCV РНК,

ТАБЛИЦА

	РНК / и { /	<да/Щ /	Матрица. -	Проба /
вода до	100,0 до	100,0 до	100,0 до	100,0
10 х буфер	10	10,0	10,0	10,0
d НТФ	16,0	16,0	16,с	16,0
праймер 1	0,5	0,5	0,5	0,5
праймер 2	0,5	0,5	0,5	0,5
матрица	2,5	2,5	/	2,5
Tag Pol	0,5	0,5	0,5	0,5

0,42

,респективно

Праймер 1 и Праймер 2 са 0,5 jMg/jd. и и притежават следната последователност.

Праймер 1 : 5* ACCATG ААТ CAC TCC ССТ GTG AGG ААС ТАС з'

Праймер 2 : 5 AGT СТТ GCG GGG GCA CGC ОСА ААТ С 3

Тези праймери се хибридизират към съхранения регион в 51 края на HCV генома. Пробите съдържат 12,5 jd серумни еквиваленти ат HCV сДНК, Амплификационният цикъл на условията е както следва^ цикъла Топене 94° за 1,5 мин

Линеализиране - 60°С за 2 мин «У дължаване - 72°С за 3 мин

Финално удължаване ^: 72°С за 30 мин

Омокряне при 4°0 до отстраняване.

Амплифицираният продукт се изпитва с помощта на белязана ДНК,Последователността на пробата б както следва ^: Проба : 5'ТТТ СТТ GGA TCA ACC CGC TCA ATG ССТ ССА з'

Над 200 серопозитивни проби бяха изпитани по горната про- 44 цеДУра«Иод внимание са взети са?ло резултатите,в коита контролите бяха негативни . В този случай,всички серо позитивни проби са позитивни също така и в РСР изпитванията.

iii* Образни.получени от нредполагаемия регион на HCV РНЕС. напечен съппевинен ^п

Анализ на нуклеотидните последователности от сЖК от различни HCV изолати показва,че висока степен на запазване на последователността съществува в региона от около нуклеотид 1 до 570,използвайки номеризационната система за нуклеотидите от Фиг. 1» Този регион се предполага,че кодира съдевинният’* полипептид на HCV. Последователности от пет различни изолати от различни географски локализации /Нпония и САЩ / _Са показани на Фиг.2, където HCV1 θ прототип на HCV j аминокиселините,кодирани в големия ОРГ на HCV1 са показани жхеирв над нуклеотидните последователности. Ь последователностите,показани на Фиг.2, HCiIH е от личните контакти на др. Tetsu MiyamuiQ /Национален Здравен институт в Япония / и IC-14 са. от М.044w. 1 /1990/.

Ssxs Може да се види на Фиг.2, че между последователностите в предполагаемия сърцевинен регион, им? най-малко 90% хомологии съответни на последователностите от HCV1,Съобразно тази висока степен на хомоложност в региона между нуклеотидите +1 до +571, пробите от тази област биха били от полза за скрининг на НСЛ бозитивни биологични образци..

Комплект от белязани проби,които могат да бъдат използвани за определяне на HCV ΗίΚ _От областта и предполагаемо кодираща KCV сърцевинният полипептид, са показани на. Фиг. 3. Нд тази фигура номера на пробата ” от комплекта. включва серия от полинуклеотиди с хетерогенност,означена от i В Групов код,показан на Фиг. 3Детерогенността съгласува различията в нуклеотидните

- 45 последователности,намерени в различните изолати. А⁾егиони^т§т последователността,към които пробите от целия комплекс проби от Фигура 3 са комплементарни,са показани на ФигЛ, и чиито нуклеотидни ί номера кореспондират на номерирането във Фиг, 1.

'1’ози комплекс от проби са използвани за откриване на 5CV последователности.Нормата на изпитанията е описан в РСТ публ, ’WOgo/14436 в раздела за примерните изпълнения ,озаглавен

Проби за сандвичева хибридизация за HCV ”,

Индустриална приложимост

Описаните тук методи,а така, също и олигомерите, както проби,така и праймери,получени от HCV сЖК,и китовете, които ги съдържат,са използваеми за бързо,относително просто и икономично определяне на присъствието на HCV в биологични проби,по-специално в кръв,необходима за преливане и у индивидите, които се подозира,че са HCV инфектираниЛещо повече,тези методи и олигомери могат да се използват за откриване на ранен етап от flCV инфекция,отколкото имунологичните проби,основани на използването на рекомбинантните ^HCV полипептиди.С-що така,един амплифициран полинуклеотиден хибризизиран образец открива ННК в случайни проби,които са анти -HCV антитяло негативни.'^ака, пробите и праймерите,описани тук могат да бъдат използвани за амплифициране на хибридизационните проби,в конюгация е имунопроби,основани на HCV полипептиди за по-пълно идентифициране на инфекцията благодарение на HCV_t и ftCV-инфектирани биологични образци,включително кръв.

Обезпечената тук информация позволява да се конструират праймери и/зили проби,иоито са получени от съхранени региони от

- 46 HCV ренома,Осигуряването на тези праймери и проби прави възможно генерален метод,който би открил вариантни HCV щамове, и който би бил използваем за скрининг на кръв и кръвни продукти.

Ако праймерите,използвани в метода са получени от съхран нени региони на HCV генома,метода ще помогне в откриването и/ или идентификацията на вариантни щамове на НС¥,'Гака,на свой ред, ще доведе до развитието на допълнителни имунологични реагенти за откриването иадиагностиката на HCV, така както и развитието на допълнителни полинуклеотидни реагенти за откриване или третиране на HCV,.

Е допълнение,комплекса от праймери и проби,конструирани от съхранените амино киселинни последователности от Флавивирусите и HCV,позволява универсален метод за откриване на тези агенти на инфекцията.

•‘Материалите,включени :	в списъка по-долу	•,са депозирани при
условията на будапещенският	договор в АТСС ,	12301 ?агк!ан/п Дг,
^ocKVii/e,Kaiyfand 20852, и	са регистрирани	под следните
номера ί
ламбття - от11	АТСС №	Дата, иа ле позира не
HCV сДНК библиотека	40394	1,дек,. 1987
клон 81	40388	17.ноември 87
клон 91	40389	17. ноем, 1987
клон 1-2	40390	17 ноем.1987
клон 5-1-1	40391	18 ноем, 1987
клон	40514	10 ноем,1988
клон 35^	40511	10 ноем.1988
клон 15е	40513	10 ноем. 1988
клон Й9-1	40512	10 ноем.1988
3SC 308	20879	5 мз.й 1988
pS356	67683	29 април 1988

- 47 Допълнително бяха направени следните депозити на 11.

Май 1989 г Щам	Динкери	АТСС 1
Д1210 / С/1 /5-1-1 /	KF	67967
Д1210 / С/1/81 /	KF	67968
Д1210 ί С/1/СА74а /	ΚΙ*	67969
Д121и / Cyi/357	AB	67970
Д121О / yi/279a /	EF	67971
Д1210 / Cyi/СЗб /	СД	67972
Д1210 / C/1/131 /	AB	67973
Д1210 / C/I/СЗЗВ /	ET	6*7974
Д121и / yi/CA29U а/	AB	67975
НВЮ1 / AB24/C1U0 /ЗХ	/	6*7976

Следните производни на щам Д1210 бяха депозирани на З.май

1989.

АТСС №

Производни на щама

pCFiC / 0^/	6*7956
pCFiAB l С12/	67952
pCFiEF / 14c	67949
pCFiEF /15е	67954
pCFiAB / C25c	67958
pCFiEr /C33c	67953
pCFlEF /Сзу	67050
рСР1СД / 33g	67951
pCFiC Д /Сз9с	67955
pCFlEF / C4Ub	67957
pCFiEF I CA167B	6'7959

- 48 Следните щамове бяха депозирани през м.май / 12.05.1989 /

Щям

АТСС № ламбда 2^11 /θ35 / 40603 ламбда g*tlO / бета -5а / 40602 Д1210 / С40в / 67980

Д12Ю / ΡΛ 16 /

67981 н_а датата 23,май 1990 г бяха депозирани следните биологични материали :

-Материал. .. АТСС № δ' - клон32 / в рИ С18 S / 68276

При допускане . и издаване на това описание като американски патент, всички ограничения върху наличието на тези депозити ще бъдат неизменно отстранени j и достъпа до депозити биха били допустими по време на периода за чакане на решението за по-горе означеното описание,определен от Комисаря,за да бъде озаглавен под номера 37 ΟΓξ 1Д4 _и 35 Г1$С 1,22. Вещо повече, означените депозити ще бъдат съхранявани за период от 30 години от датата на депозиране или за 5 години след последния отказ за депозирането, или за периода на живот на американския патент, независимо колко е дълъг. Депозираните материали,отбелязани тук, са предназначени само за удобство и не се изискват за практикуване на изобретението по смисъла на описанието и в допълнение,тези материали са вложени тук чрез референция.

Claims (5)

1. ПРЕТЕНЦИИ

   1. ^етод за откриване на HCV последователност в аналитична верига,която се предполега,че съдържа HCV полинуклеотид,където HCV полинуклеотида включва подбрана мишенна област,като метода включва · а/ обезпечаване на олигомер,способен да се хибридизира към HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига,кълето олигомера включва полинуклеотидна последователност,подбрана от групата,състояща се от олигонуклеотиди,комплементарни на следните региони от HCV генома / както е описано на Фигура 1 / · 16-45 ,49-78, 82-111,115-144,148-177,211-240,242-271,275-304, 332-351,355-394,398-427 и 457-485 i в/ инкубиране на аналитичната верига с олигомера от а/ , което позволява да се формират специфични хибридни дуплекси между насочената и мишенната последователности j и с/ откриване на хибриди,формирани между мишенната област, ако има, и олигомера.
2. 2. ^етод,съгласно претенция 1,който по-нататък съдържал а/ осигуряване на комплекс от олигомери,като олигомерите .метода,основан на, са праймериза* полимеразната верижна реакция и който фланкира мишенната област > и в/ амплифициране на мишенната област посредством метода основан на полимеразната верижна реакция.
3. 3. Кит за откриване на HCV ?лишенна последователност в аналитична верига,включващ олигомерите от претенция 1,опаковани в подходящ контейнер.
4. 4. датод за изготвяне на свободна от HCV кръв,включващ !

   а/ обезпечаване на аналитични нуклеинови киселини от кръвни

   - 50 проби,които се предполага че съдържат HCV мишенна последователност в/ обезпечаване на олигомер,способен да се хибридизира с mCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига,ако има, където олигомера съдържа полинуклеотидна последователност,подбрана от групата,състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на следните региони от HCV _ генома /както е описано на

   Фигура 1 ί : 15-45,49-78,62-111,115-144,148-177,211 -240,242-271,

   275-304,332-361,355-394,398-427 и 4S7-486 j с/ взаимодействие на а/ с в/ при условията,които позволяват *- формиране на полинуклеотидни дуплекси между насочената последователност и мишенната последователност,ако има j d / откриване на дуплекс,формиран в /с/,ако има $ и е/ съхраняване на кръв,в тоято не са открити комплексите от d/
5. 5» Реагент,приложим за откриване на ECV ,като този реагент съдържа :

   олигонуклеотид,притежаващ последователност,комплементарна на региона от ^CV генома,подбран от групата,съдържаща базите 16-45,49-78,82-111,115-144,148-177,211-240,242-271,275-304,332-361, 365-394,398-427 и 457-485 /както е показано на Фигура. 1 /,

   5. Реагент от претенция 5,който съдържа маркер за откриването не. олигонуклеотида.