KR0163964B1

KR0163964B1 - 엔에이엔비브이 진단법: c형 간염바이러스의 스크리닝에 유용한 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR0163964B1
Application number: KR1019930700383A
Authority: KR
Inventors: 혹톤 마이클; 추 퀴-림; 쿠오 조오지; 제이.웨이너 아미; 장한; 스티븐 어디어 마이클; 던칸 어빈 브루스; 에이.콜버그 자니스
Original assignee: 로버트 피.블랙버언; 카이론 코오퍼레이션
Priority date: 1990-08-10
Filing date: 1991-08-12
Publication date: 1998-11-16
Also published as: PL169035B1; HU227499B1; EP0543924A4; FI930582A; FI930582A0; HU9300323D0; ES2104720T3; NO930429L; DE69126617D1; ATE154646T1; ES2104720T4; BG97435A; EP0543924A1; JP2714255B2; CA2089080A1; WO1992002642A1; HUT69140A; NO930429D0; EP0543924B1; CZ282573B6

Abstract

혈액-매개의 NANBH의 주요한 병원체임이 증명된 새로운 바이러스인 간염C 바이러스(HCV)가 본 출원인에 의해 발견되었다. HCV폴리뉴클레오티드의 분리, 증폭, 및 검색시약이 제공되어 있다.

이들 시약은 HCV 표적 뉴클레오티드 서열과 혼성체 구조를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고머이다.

Description

[발명의 명칭]

NANBV 진단법: C형 간염바이러스의 스크리닝에 유용한 폴리뉴클레오티드

[도면의 간단한 설명]

제1도는 여기에 기술된 클론으로부터 및 PCT 공개번호 WO 90/14436 에서 제시된 편집한 HCV cDNA 서열로부터 유래된 편집한 HCV cDNA 서열을 나타낸다.

서열이 유래된 그 클론은 5'-클론 32, b114a, 18g, ag30, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (또한 k9-1), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k, 및 p131jh 이다.

도면에서 서열위에 있는 세개의 수평 대시기호는 추정되는 개시인자(initiator) 메티오닌 코돈의 위치를 나타낸다. 또한 HCV cDNA 에서 암호화된 추정되는 폴리단백질의 아미노산서열이 도면에서 보여진다.

HCV1 의 클론 DNA 에서 이종성은 큰 ORF의 추정적으로 암호화된 서열 위에 나타내진 아미노산에 의하여 표시되었다; 괄호는 이종성이 클론에서 HCV cDNA 의 5'-또는 3'-말단에서 또는 말단 가까이에서 검출되었다는 것을 나타낸다.

제2도는 다른 지리적위치(일본과 미국) 로부터의 5개의 다른 HCV 분리체에 대한 DNA 일치서열을 나타내는데, 여기서 HCV1 의 큰 ORF에 의해 암호화된 아미노산들이 DNA 서열 위쪽에서 보여진다.

제3도는 실시예III에서 사용된 생물학적 샘플에서 HCV RNA 의 검색을 위한 표지 프로브의 서열을 나타낸다.

제4도는 제1도의 번호에 따라서, 제3도의 프로브와 HCV1 의 정렬을 나타낸다.

[기술분야]

본 발명은 비-A형, 비-B형 간염바이러스(NANBV) 감염의 확산을 처리하기 위한 물질들 및 방법론에 관한 것이다.

더 특이적으로는 비-A형, 비-B형 간염(NANBH) 의 병원체인 C형 간염 바이러스(HCV), 및 생물학적 시료에서 HCV의 검출을 위한 검사에서 유용한 폴리뉴클레오티드와 그것의 유사체에 관한 것이다.

[참고문헌]

CELI AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

[인용특허]

[배경기술]

비-A형, 비-B형 간염(NANBH) 은 바이러스- 유도된다고 믿어지는 전염성 질병 또는 질병의 군이며, 시토메갈로 바이러스(CMV) 또한 엡스타인- 바르 바이러스(EBV) 에 의해 유도되는 간염뿐만아니라, 공지된 간염바이러스 즉 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 및 델타 간염 바이러스(HDV) 에 의해 야기되는 것을 포함하는 다른 형태의 바이러스- 연관된 간 질병과 구별가능한 전염성 질병 또는 질병의 군이다.

NANBH 는 먼저 수혈 받은 사람들에서 확인되었다.

인간에서 침팬지로 전염 및 침팬지들에서의 연속전염은 NANBH가 전염성 있는 감염원 또는 감염원들에 기인한다는 증거를 제공하였다.

역학적 증거는 세가지 유형의 NANBH 가 있을수 있다는 것을 제안한다: 수인성 유행형; 혈액 또는 바늘연관형; 및 산발적으로 일어나는(공중 획득) 유형, 그러나, NANBH 의 원인일수 있는 병원체의 수는 알려져 있지 않다.

많은 후보 NANBV가 있었다.

예컨대 프린스(Prince)(1983), 페인스톤(Feinstone) 및 후프니글(Hoofnagle)(1984), 및 오버비(Overby)(1985, 1986, 1987)에 의한 개설 및 이와슨(Iwarson)(1987) 에 의한 논문을 참조할 수 있다. 그러나 이 후보들중 어느것도 NANBH의 병원체를 나타낸다는 증거는 없다.

NANBV 운반체 및 NANBV 오염된 혈액 및 혈액생성물을 스크리닝 및 확인하기 위한 민감하고 특이적인 방법에 대한 요구가 중요하다.

수혈후 간염(PTH) 은 수혈 받은 환자들중 대략 10% 에서 일어나며 NANBH가 이 경우의 90%까지를 차지한다.

이 질병에서 주요문제는 만성적인 간손상으로의 빈번한 진행(25-55%)이다.

혈액 및 혈액 생성물에 의한 또는 밀접한 개인적 접촉에 의한 NANBH 의 전염방지 뿐만아니라 환자간호는 NANBV에 관련된 핵산, 항원 및 항체를 검출하기 위한 믿을만한 스크리닝, 진단 및 예후도구를 필요로 한다.

혼성화 검사에 의한 특이적인 폴리뉴클레오티드의 검출방법이 당업계에서 공지되었다. 예컨대 매듀스(Matthews)및 크릭카(Kricka)(1988), Analytical Biochemistry 169 : 1 ; 란데그렌(Landegren) 등 (1988), Science 242 : 229; 및 미틀린(Mittlin)(1989), Clinical Chem.35: 1819. 1989년 9월 9일 부여된 미국 특허 제4,868,105 및 EPO 공개번호 225807 (1987년 6월 16일 발행) 을 참조할 수 있다.

[발명의 개시]

혼성화에 의해 특이적인 폴리뉴클레오티드를 분리 및/ 또는 검출하는 방법은 출원인들의 HCV의 발견까지는 HCV에 대한 스크러닝에 이용될수 없었다.

출원인들의 발명은 바이러스 게놈 서열을 얻기위한 물질들 및 방법들을 제공하는데, 이것들은 PCT 공개번호 WO 90/14436 및 하기에서 제공되었다.

본발명의 한면은 HCV 폴리뉴클레오티드를 포함한다로 추정되는 분석물 사슬에서 HCV 서열을 검출하는 방법인데, 여기서, HCV 폴리뉴클레오티드는 선택된 표적 부위를 포함하며, 상기의 방법은 다음으로 이루어진다:

(a) 분석물 폴리뉴클레오티드 사슬에서 HCV서열에 혼성화할수 있는 올리고머( 들) 를 제공하는것, 여기서 올리고머는 HCV 게놈(제1도에서 보여짐) 의 하기의 부위들과 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리 뉴클레오티드 서열로 이루어진다: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427, 및 457-486;

(b) 타게팅(tageting) 서열과 표적서열사이에서 특이적인 혼성 이중가닥이 형성되도록 (a) 의 올리고머( 들) 와 분석물 가닥을 배양하는것; 및

(d) 올리고머( 들) 와 표적부위( 있다면) 사이에서 형성된 혼성체를 검색하는것.

본발명의 다른면은 HCV 폴리뉴클레오티드를 포함한다고 추정되는 분석물 가닥에서 HCV 서열을 검색하는 방법인데, 여기서 HCV폴리 뉴클레오티드는 선택된 표적부위를 포함하며, 상기의 방법은 다음으로 이루어진다:

(a) 분석물 폴리뉴클레오티드 가닥에서 HCV 서열에 혼성화할 수 있는 올리고머( 들) 를 제공하는것, 여기서 올리고머는 HCV 게놈( 제1도에서 보여짐) 의 하기 부위들과 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427, 및 457-486;

(b) 타게팅 서열과 표적서열사이에서 특이적인 혼성 이중가닥이 형성되도록 (a)의 올리고머( 들) 와 분석물 가닥을 배양하는것; 및

(d) 표적부위( 있다면) 및 올리고머( 들) 사이에서 형성된 혼성체를 다른 올리고머( 들) 로 검색하는것, 여기서 다른 올리고머( 들) 는 HCV게놈( 제1도에서 보여짐) 의 하기의 부위들과 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427, 및 457-486.

한편 본발명의 다른면은 다음으로 이루어지는 HCV가 없는 혈액을 제조하는 방법이다:

(a) HCV 표적서열을 포함한다고 추정되는 혈액샘플로부터 분석물 핵산을 제공하는것;

(b) 있다면, 분석물 폴리뉴클레오티드 가닥에서 HCV 서열에 혼성화할 수 있는 올리고머(들)를 제공하는것, 여기서 올리고머는 HVC 게놈(제1도에서 보여짐)의 하기 부위들과 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427, 및 457-486;

(c) 타케팅 서열과 표적서열( 있다면) 사이에서 폴리뉴클레오티드 이중가닥의 형성을 허용하는 조건하에서 (a)를 (b)와 반응시키는것;

(d) 있다면, (c)에서 형성된 이중가닥을 검색하는것; 및

(e)복합체들이 (d)에서 검색되지 않는혈액을 보관하는것.

본 발명의 또 다른면은 다음으로 이루어지는 HVC가 없는 혈액을 제조하는 방법이다:

(a) HCV 표적서열을 포함한다고 추정되는 혈액의 사료로부터 분석물 핵산을 제공하는것;

(b) 있다면, 분석물 폴리뉴클레오티드 사슬에서 HCV서열에 혼성화할수 있는 올리고머(들)를 제공하는것, 여기서 올리고머는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다;

(d) 있다면, (c)에서 형성된 이중가닥을 다른 올리고머( 들)로 검색하는것, 여기서 다른 올리고머( 들)는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다; 및

(e) 복합체들이 (d)에서 검색되지 않는 혈액을 보관하는것.

[발행을 수행하는 방식]

용어 C형 간염 바이러스(HCV)는 지금까지 알려지지 않은 HANBH의 병원체에 대하여 당업자들에 의해 명명되었다.

HCV 의 원형 분리체는 미국특허출원 제122,714 호에서 확인되었다(또한 EFO 공개번호 제318,216 호 참조). HCV 란 용어는 또한 똑같은 바이러스종의 새로운 분리체도 포함한다. 이 용어의 연장으로서 전에는 혈액성 NANB 간염(BB-HANBH)이라 불리운 HVC에 의해 야기되는 질병이 C형 간염이라고 불리운다.

용어 HANBH와 용어 C형 간염이 여기서는 교환 가능하게 사용될 수 있다.

HCV는 병원성 균주들이 BB-HANBH를 일으키는 바이러스종이다.

또한 약화된 균주 또는 그것으로부터 유래된 결함있는 간섭입자일수도 있다.

하기에서 보여지는 것처럼, HCV게놈은 RNA 로 이루어진다.

RNA포함 바이러스는 자연발생 돌연변이율이 비교적 높다고 알려져 있다.

즉 삽입되는 뉴클레오티드 당 10^-3내지 10^-4의 차수로 일어난다고 발표되었다(Fields Knipe (1986)).

따라서 유전형의 가변성 및 이종성이 RNA바이러스에서 본질적이기 때문에, HCV종내에서도 병원성 또는 비병원성일수 있는 다수의 균주들/ 분리체들이 있다.

여기에 기술된 조성물 및 방법은 다양한 HCV 균주들 또는 분리체들의 증식, 동정, 검출, 및 분리를 가능하게 한다.

HCV의 몇가지 다른 균주들/ 분리체들이 확인되었다.(PCT 공개번호 WO 90/14436참조). 원형인 한가지 그러한 균주 또는 분리체는 CDC/HCV1 (또한 HCV1이라 불리움)이라 명명되었다. 부분 게놈서열 따위의 하나의 균주 또는 분리체의 정보는 당업자들이 표준기술을 이용하여 새로운 균주/ 분리체를 분리하여 그러한 균주/ 분리체가 HCV인지 여부를 확인하도록 하는데 충분하다.

예컨데 몇가지 다른 균주들/ 분리체들이 하기에는 기술되었다.

다수의 인간 혈청으로부터( 및 다른 지리적 위치로부터) 획득된 이 균주들은 HCV1의 게놈서열의 정보를 이용하여 분리되었다.

PCT공개번호 WO 90/14436에서 기술된 기술을 이용하여, HCV1 게놈 RNA의 게놈구조 및 뉴클레오티드 서열이 추론되었다.

게놈은 10,000 뉴클레오티드를 포함하는 단일- 가닥 RNA인것 같다.

게놈은 양성-사슬이며, 약 3,000 아미노산의 폴리단백질을 암호화하는 연속적인 번역의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 갖는다.

ORF에서 구조단백질( 들)은 N-터미날 부위의 대략 1/4에서 암호화되는 것같고 폴리단백질의 대부분은 비-구조 단백질의 원인이 된다.

모든 공지된 바이러스 서열과 비교할때, 플라비 바이러스과의 비-구조 단백질과, 및 페스티 바이러스(이것은 현재 플라비 바이러스과의 부분이라고 생각된다) 와 작지만 중요한 공- 선상 상동관계가 관찰되었다.

플라비 바이러스 폴리단백질은 아미노 터미날로부터 카르복시 뉴클레오캡시드 단백질(C), 매트릭스 단백질(M), 엔벨로프 단백질(E), 및 비- 구조 단백질들(NS) 1, 2(a+b), 3,4(a+b), 및 5를 포함한다.

HCV1의 뉴클레오티드 서열에 암호화된 추정적인 아미노산에 근거하면, HCV 폴리단백질의 맨끝의 N- 말단에 있는 작은 도메인은 플라비바이러스 폴리단백질의 N- 말단에서 발견되는 뉴클레오캡시드 단백질(C) 과 크기 및 염기성 잔기의 고함량에 있어서 유사한것 같다.

HCV 의 비- 구조 단백질 2, 3, 4 및 5(NS2-5) 와 황열 바이러스(YFV) 의 비- 구조 단백질 2, 3, 4 및 5(NS2-5) 는 아미노산 서열의 발산이 있음에도 불구하고 비슷한 크기 및 수전염성(hydropathicity)의 대응부를 가지는 것 같다.

그러나 M,E 및 NSI 단백질을 포함하는 YFV 폴리단백질의 부위들에 대응하는 HCV 의 부위는 서열에서 다를뿐만 아니라 크기 및 수전염성에서도 꽤 다른것 같다. 그리하여 HCV 게놈의 어떤 도메인들이 여기서 예컨대 NSI 또는 NS2로 언급될수 있지만, 이 표시들은 사변적이라는 것이 기억되어야 한다;

HCV 과 및 플라비바이러스 사이에는 상당한 차이가 있을수 있다.

HCV 의 다른 균주들, 분리체들 또는 아류형들은 HCV1 과 비교할때 아미노산 및 핵산의 변이체들을 포함할 것이다.

많은 분리체들은 HCV1 과 비교할때 전체 아미노산 서열에 있어 많은(즉 약 40% 이상)상동관계를 나타내는 것으로 여겨진다.

그러나 예컨대 상동관계가 적은 HCV분리체들이 또한 발견될 수 있다.

이것들을 예컨대 HCV1 의 것과 크기가 비슷한 폴리단백질을 암호화하는 대략 9,000 뉴클레오티드 내지 대략 12,000 뉴클레오티드의 ORF, HCV1의 것과 유사한 소수성 및/ 또는 항원성의 암호화된 폴리단백질, 및 HCV1 과 함께 보존되는 공- 선상 펩티드 서열의 존재 따위의 다양한 기준에 따라서 HCV로 정의될 것이다.

부가적으로 게놈은 양성- 사슬 RNA일것으로 믿어진다.

모든HCV분리체는 여기에 기술된 HCV cDNA에서 암호화된 에피토프(epitope) 와 면역학적으로 확인가능한( 즉 면역학적으로 교차- 반응성이 있는) 에피토프를 적어도 하나 암호화하고 있다. 바람직하게는 에피토프가 여기에 기술된 아미노산 서열내에 포함되며 이전에 알려진 병원체와 비교할때 HCV에 특이하다.

에피토프의 특이성은 항-HCV 항체와의 면역학적 반응성 및 공지된 병원체에 대한 항체와의 면역학적 반응성의 결핍에 의하여 결정될수 있다.

HCV 균주들과 분리체들은 진화적으로 관련이 있다.

따라서, 뉴클레오티드 수준에서 게놈의 전체 상동관계는 약 40% 또는 그 이상일수 있고, 아마도 약 50% 또는 그 이상일 것이며, 아마도 약 60% 또는 그 이상, 및 훨씬 더 아마도 약 80% 또는 그 이상일것이라고 여겨진다; 부가적으로 적어도 약 13 뉴클레오티드의 대응하는 근접서열이 있을 것으로 여겨진다.

HCV 게놈내에는 가변(Variable)및 초가변(hypervariable) 부위들이 있다는 것이 주목되어야 한다; 따라서 이 부위들에서의 상동관계는 전체 게놈에서 보다 상당히 더적을 것으로 여겨진다. 추정적인 HCV 균주게놈서열 및 예컨대 CDC/HCV1 cDNA 서열 사이의 대응성은 당업계에서 공지된 기술에 의해 결정될수 있다.

예컨대, 그것은 여기에 기술된 HCV cDNA 서열( 들) 및 추정적인 HCV 폴리뉴클레오티드의 서열 정보의 직접적인 비교에 의하여 결정될수 있다.

그것은 또한 상동관계 있는 부위들 사이에서 안정한 이중체를 형성하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화시키고( 예컨대 S₁분해 전에 이용되는 것, 단일 가닥 특이적 뉴클레오티드( 들)로 분해시키고, 분해된 절편들을 크기 결정함으로써 결정될수 있다.

HCV 의 균주들 또는 분리체들의 진화적 관계때문에 추정적인 HCV 균주들 또는 분리체들은 폴리펩티드 수준에서의 상동관계에 의해 확인가능하다.

일반적으로 HCV 균주들 또는 분리체들은 적어도 40% 상동관계, 약 50% 이상 상동관계, 아마도 약 70% 이상 상동관계, 및 훨씬 더 아마도 약 80% 이상 상동관계가 있다고 여겨지며, 일부는 폴리펩티드 수준에서 약 90% 이상 상동관계가 있을수 있다.

아미노산 서열 상동관계를 결정하는 기술은 당업계에서 공지되었다.

예컨대 아미노산 서열은 직접적으로 결정될수 있으며, 여기서 제공된 서열과 비교될수 있다. 한편 추정적인 HCV의 게놈 물질의 뉴클레오티드 서열이 결정될수 있고( 대개 cDNA 중간생성물을 경유하여), 여기에 암호화된 추정적인 아미노산 서열이 결정될수 있으며, 대응하는 부위들이 비교될수 있다.

여기서 사용되는 표시된 서열로부터 유래된 폴리뉴클레오티드는 표시된 뉴클레오티드 서열의 부위에 해당하는 대략 적어도 약 6뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 약 8 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 적어도 약 10-12 뉴클레오티드, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 15-20 뉴클레오티드의 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

대응하는(Corresponding) 은 표시된 서열에 상보적이거나 또는 상동관계가 있는 것을 의미한다. 바람직하게는 폴리뉴클레오티드가 유래된 그 부위의 서열은 HCV게놈에 특이한 서열에 상보적이거나 또는 상동관계가 있다.

더 바람직하게는, 유래된 서열은 모든 또는 대부분의 HCV 분리체에 특이한 서열에 상보적이거나 또는 상동관계가 있다.

하나의 서열이 HCV 게놈에 특이한지의 여부는 당업자들에게 공지된 기술에 의해 결정될수 있다. 예컨대 그 서열은 데이타 뱅크 예컨대 진뱅크(Genebank)에 있는 서열과 비교하여, 그것이 비감염 숙주 또는 다른 생물체내에 존재하는지의 여부를 결정할수 있다. 그 서열은 또한 플라비비리대에 속하는 것들 및 간염을 유도한다고 알려진 것들, 예컨대 HAV, HBV, 및 HDV를 포함하는 다른 바이러스 병원체의 공지된 서열과 비교될 수 있다.

다른 서열과의 유래된 서열의 대응성 또는 비- 대응성은 또한 적당한 스트린젠시(stringency) 조건에서의 혼성화에 의해 결정될수 있다.

핵산서열의 상보성을 결정한는 혼성화기술은 당업계에서 공지되었으며, 하기에서 논의 되었다.

예컨대 마니아티스(Maniatis)등 (1982)를 참조할수 있다.

부가적으로 혼성화에 의해 형성된 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 미스매치(mismatch)는 예컨대 이중체 폴리뉴클레오티드에서 단일- 가닥 부위를 특이적으로 분해하는 S1 따위의 뉴클레아제로 분해시키는 것을 포함하는 공지된 기술에 의해 결정될수 있다.

전형적인 DNA 서열이 유래' 할수 있는 부위들은 예컨대 비- 전사되는 및/ 또는 비- 번역되는 부위들 뿐만아니라 특이적인 에피토프를 암호화하는 부위들을 포함하지만 이것들에 제한되지는 않는다.

유래된 폴리뉴클레오티드는 반드시 밝혀진 뉴클레오티드 서열로부터 물리적으로 유래하지는 않고, 예컨대 화학합성 또는 DNA 복제 또는 역전사 또는 전사를 포함하여 어떤 방법으로도 생성될수 있다. 부가적으로 표시된 서열부위에 대응하는 부위들의 조합이 의도되는 이용에 따라 당업계에서 공지된 방법으로 변형될수 있다.

여기서 사용되는 재조합 폴리뉴클레오티드란 용어는 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성출처를 갖는 폴리뉴클레오티드를 나타내는데, 그것의 출처 또는 조작에 의해: (1) 그것이 자연계에서 회합되는 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 일부와 회함되지 않으며, (2) 그것이 자연계에서 연결되는것 보다 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되며, 또는 (3) 자연계에 존재하지 않는다.

여기에 사용되는 폴리뉴클레오티드 라는 용어는 리보뉴클레오티드이거나 데옥시리보뉴클레오티드이거나, 임의의 길이의 중합체형의 뉴클레오티드를 말하는 것이다.

이 용어는 단지 분자의 1차 구조를 말한다.

따라서 이 용어는 이중- 및 단일- 가닥 DNA및 RNA를 포함한다.

또한 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 당해 기술분야에 알려진 수준의 변형된 형태들, 예를들면 메틸화, 캡(cap), 유사체에 의해 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 치환으로 그 예를들면 전하가 없는 결합( 예를들면 메틸인산, 인산트리에스테르, 인산아미테이트, 카르바메이트등) 및 전하가 있는 결합( 예를들면 인산티오에이트, 인산디티오에이트 등) 이 있고, 예를들면 단백질( 예를들면 뉴클레오제, 독소, 항체, 신호 단백질, 폴리-L-라이신등을 포함) 과 같은 부착부분을 포함하며, 삽입제(intercalctor)(예를들면 아크리딘, 프소랄렌(psoralen)등) 가 있고, 킬레이트제( 예를들면 금속, 방사성, 금속, 붕소, 산화성 금속등) 를 포함하고, 알킬레이터를 포함하고, 변형된 결합( 예를들면 알파 아노머성(anomeric)핵산등) 이 있다.

여기에 사용되는 핵산의 센스(sense) 가닥 은 mRNA 와 동일한 서열을 갖는 서열을 포함한다. 안티- 센스가닥 은 센스- 가닥 의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 여기에 사용되는 바이러스의 양성가닥게놈 은 RNA 또는 DNA 의 게놈성 폴리 뉴클레오티드이며, 최소한 하나의 바이러스 폴리펩티드를 암호화한다.

양성 가닥 RNA 바이러스의 예에는 토가비리대(Togaviridae), 코로나비리대(Coronaviridae), 레트로비리대(Retroviridae), 피코르나비리대(Picornaviridae)및 칼라시비리대(Caliciviridae)가 포함된다. 예전에 토가비리대로 분류되었던 플라비비리대도 또한 포함된다.

이들 바이러스들은 전형적으로 단일 가닥이다.

필드 및 크나피(Field Knipe) 를 참고(1986)하라.

여기에 사용된 프라이머 라는 용어는 적당한 조건이 되었을때 폴리뉴클레오티드 가닥이 합성의 개시점으로 작용할수 있는 올고리머를 가리킨다.

프라이머는 복제되어야 하는 폴리뉴클레오티드 가닥 부위와 완전히 또는 실제적으로 상보적인 것이다. 따라서, 혼성화를 전도하는 조건하에서 프라이머는 분석물 가닥의 상보적 부위에 어닐링될 것이다.

적당한 반응물( 예를들면, 폴리머라제, 뉴클레오티드 트리포스페이트등) 을 가하면, 프라이머는 폴리머화제에 의해 확장되어 분석물 가닥의 복제물을 생성한다. 프라이머는 단일- 가닥일수 있고, 또 달리는 부분적으로 혹은 완전히 이중- 가닥일수 있다.

분석물 폴리뉴클레오티드 및 분석물 가닥 이란 용어는 표적 서열을 포함하는 것으로 추측되는 단일- 또는 이중가닥 핵산분자를 가리키며, 이는 생물학적 샘플중에 존재할수 있다.

여기에 사용된 바와같이 올리고머 라는 용어는 프라이머 및 프로브에 관한 거이다. 올리고머 라는 용어는 분자크기까지 함축하는 것은 아니다.

그러나, 전형적으로 올리머는 1000 뉴클레오티드, 더 전형적으로 500 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로 250 뉴클레오티드 보다 크지 않으며; 그 길이가 100 뉴클레오티드보다 크지 않을수 있고, 75 뉴클레오티드보다 크지 않을수 있고, 또한 50 뉴클레오티드보다 크지 않을수 있다.

여기에 사용된 프로브(probe)라는 용어는 표적서열과 혼성구조를 형성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구조를 말하며, 이는 프로브중의 최소한 하나의 서열이 표적부위의 서열과 상보적인 것에 기인한다. 프로브의 폴리뉴클레오티드 부위는 DNA 및/ 또는 RNA, 및/ 또는 합성 뉴클레오티드 유사체로 이루어질수 있다.

프로브에는 포획(capture) 프로브 및 표지(label) 프로브 가 포함된다.

바람직하게, 프로브는 폴리머라제 사슬반응(Polymerase chain reaction; PCR)프라이머로 사용되는 서열( 들) 에 상보적인 서열을 포함하지 않는다.

여기에서 쓰인 바와같이 표적부위(target region)는 증폭 및/ 또는 검색되어야 하는 핵산 부위를 가리킨다.

표적서열 이란 용어는 프로브 또는 프라이머가 원하느 조건하에서 안정한 혼성체를 형성하는 서열을 가리킨다.

여기에 사용된 포획 프로브 라는 용어는 결합상대와 짝지어진 단일- 가닥 폴리뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드를 가리킨다.

단일- 가닥 폴리뉴클레오티드는 분석물 폴리뉴클레오티드에서 검색되는 표적부위 중의 표적 서열과 상보적인 타게팅 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어져 있다.

이 상보적인 부위는 길이가 충분하고 표적서열에 상보적인바, 분석물 폴리뉴클레오티드를 고체표면( 결합 상대를 경유) 에 고정화시키기에 충분한 안정된 이중가닥을 제공한다. 결합 상대는 2차 결합 상대에 특이적이며; 2차 결합상대는 고체지지체의 표면에 결합될수 있거나 또는 결합 상대 또는 기타 다른 구조를 경유하여 비직접적으로 고체 지지체에 결합될수 있다.

여기에 사용된 타게팅 폴리뉴클레오티드 서열 이란 용어는 표적 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 가리키며; 그 서열은 표적서열과 상보적이고 길이가 충분한바 의도하는 목적을 위해 충분한 안정성을 가진 이중가닥을 형성한다.

여기에 사용된 결합상대(binding partner) 라는 용어는 예를들면 항원과 그것의 특이 항체와 같은 높은 특이성을 가진 리간드 분자를 결합시킬 수 있는 분자를 가리킨다. 일반적으로 특이 결합상대들은 분리 조건하에서 분석물 복제물/ 상보적 이중가닥( 포획 프로브의 경우) 을 고정화하기에 충분한 친화력으로 결합해야 한다. 특이 결합상대는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를들면 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘, IgG 및 단백질A, 알려진 수많은 수용체- 리간드 커플, 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥이다. 상보적인 폴리뉴클레오티드 결합상대의 경우, 상대는 정상적으로 길이가 최소 약 15 염기이고, 최소 40 염기일수도 있으며; 아울러 최소 약 40% 및 약 60%의 Gs 및 Cs 성분을 갖는다.

폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 합성뉴클레오티드 유사체로 이루어질수 있다.

여기에 사용된 짝 지워진(coupled) 이란 용어는 공유결합 또는 강한 비- 공유 상호작용( 예를들면 소수(hydrophobic) 상호작용, 수소결합등) 에 의해 부착된 것을 가리킨다. 공유결합은 예를들면 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아미드, 펩티드, 이미드, 탄소- 황 결합, 탄소- 인 결합등일수 있다.

지지체(support) 라는 용어는 원하는 결합상대가 고정될수 있는 임의의 고체 또는 반- 고체 표면을 가리킨다.

적당한 지지체에는 유리, 플라스틱, 금속, 중합체, 겔등이 포함되며, 구슬, 웰, 딥- 스틱, 막등의 형태를 취할수 있다.

여기에서 상용된 표지(label)라는 용어는 검색 가능한 신호( 정량화 가능한 것이 바람직) 를 공급하고 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 부착할수 있는 임의의 원자 또는 부분을 가리킨다.

여기에서 사용된 표지프로브 는 분석물 폴리뉴클레오티드에서 검색되어야 하는 표적서열과 상보적인 타게팅 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고머를 가리킨다. 상보적인 부위는 길이가 충분하고 표적서열에 상보적인바 표지에 의해 검색되어야하는 표지 프로브 및 표적 프로브 로 이루어진 이중가닥을 제공한다.

올리고머는 직접 표지물에 짝지워지거나, 또는 리간드 분자 세트를 경유하여 각각의 높은 특이성으로 비직접적으로 짝지워질수 있다.

높은 특이성을 가진 리간드 분자 세트는 위에 설명되어 있으며 멀티머 또한 포함한다.

여기에서 사용된 멀티머(multimer) 라는 용어는 동일한 반복 단일가닥 폴리뉴클레오티드 단위 또는 상이한 단일가닥 폴리뉴클레오티드단위의 선상 또는 분지된 폴리머를 가리킨다. 이 단위의 최소한 하나는 관심이 되는 1차 단일 가닥 뉴클레오티드 서열, 전형적으로는 분석물 또는 분석물에 결합된 올리고머( 예, 표지프로브) 에 특이하게 혼성화되도록 허용하는 조성물 및 길이, 서열을 갖는다.

이러한 특이성 및 안정성을 얻기위해, 이 단위는 길이가 정상적으로 최소 약 15 뉴클레오티드이고 전형적으로 기껏해야 약 50 뉴클레오티드이며 바람직하게는 약 30 뉴클레오티드이며; 더구나 Gs 및 Cs 함량은 정상적으로 최소 약 40% 이고 많아도 약 60% 이다.

이러한 단위( 들) 외에 멀티머는 관심이 되는 2차 단일- 가닥 뉴클레오티드, 전형적으로는 표지된 폴리뉴클레오티드 또는 다른 멀티머에 특이적으로 그리고 안정하게 혼성화될수 있는 단위의 다중결합도를 포함한다.

이 단위들은 일반적으로 상기 논의한 멀티머와 크기 및 조성이 대략 동일하다. 멀티머가 다른 멀티머에 혼성화되도록 설계되었을때 1차 및 2차 올리고뉴클레오티드 단위들은 상이하고, 선택된 분석 조건하에서 서로 혼성화하지 않는다. 따라서 멀티머들은 표지 프로브일수 있거나 또는 프로브에 표지를 짝지우는 리간드일수 있다.

여기에서 사용된 바이러스 RNA 라는 용어는 HCV RNA를 포함하며, 바이러스게놈 및 그것의 단편, 그것의 전사물, 그들로부터 유래된 돌연변이 서열로부터 유래된 RNA 를 가리킨다.

여기에서 사용된 생물학적 샘플은, 예를들면 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부단면, 호흡기, 장 및 비뇨생식기, 눈물, 침, 우유, 혈액세포, 종양, 기관 및 시험관 세포 배양 성분의 샘플( 세포 배양 배지중 세포성장으로부터 유래된 조절된 배지, 추정상 바이러스에 감염된 세포, 재조합세포 및 세포성분들에 제한되지 않고 이들을 포함한다) 에 제한되지 않고 이들을 포함하여 개체로부터 분리한 조직 또는 액의 샘플을 가리킨다.

[발명의 설명]

달리 언급되지 않는 경우, 본발명의 실행에는 당해 기술분야의 범위내인 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술이 사용될 것이다.

이러한 기술은 문헌에 전부 설명되어 있다.

예를들면 마니아티스(Maniatis), 핏치(Fitsch)및 샘브룩(Sambrook), Molecular Cloning; A Laboratory Manual(1982); DNA Cloning, Volumes I and II(D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames S.J.Higgins eds. 1984); 연속출판물인 Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.), 특히 제154 권 및 제 155권(Wu and Grossman,eds.)를 참조하라.

상기 및 하기에서 여기에 언급된 모든 특허, 특허출원 및 출판물은 여기에서 참고 자료도 통합하여 사용되었다.

본발명에 유용한 재료 및 방법은 BB-NANBV 의 병원체인 HCV의 확인과 HCV cDNA 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리로부터 분리한 뉴크레오티드 서열군의 제공에 의해 가능하게 되었다. 이들 cDNA 라이브러리는 HCV- 감염 침팬지의 혈장중에 존재하는 핵산 서열로부터 유래한 것이다. 이들 라이브러리중 하나의 구조인 c 라이부러리(ATCC No. 40394)는 PCT 공개 No. WO 90/14436 에 설명되어 있다.

여기에 설명한 것뿐만 아니라, 상기 설명한 HCV cDNA 서열을 이용하여, 생물학적 샘플중의 바이러스 폴리뉴클레오티드를 검색하는 시약으로 유용한 올리고머를 제조할수 있다. 예를들면, 이 서열로부터 약 8-10 뉴클레오티드 또는 그보다 큰 DNA 올리고머의 합성이 가능하며, 이는 예를들면 기증받은 혈액, 혈액분획, 바이러스를 보유하고 있다고 추정되는 피험자의 혈청, 또는 바이러스가 복제를 하고 있는 세포배양 시스템중에서 HCV RNA의 존재를 검색하는 혼성화 프로브로서 유용하다.

게다가, 여기에 설명한 신규의 올리고머는 HCV게놈의 특성화를 더욱 가능하게 한다. 이들 서열로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 cDNA 라이브러리중에 존재하는 서열의 증폭 및/ 또는 추가 오버랩핑(Overlapping) cDNA 서열의 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 사용될수 있으며, 이는 다음에 오버랩핑 서열을 더 얻기 위해 사용될수 있다.

PCT 공개 No. WO 90/14436중에 언급된 바와같이, HCV 게놈은 거대한 폴리프로테인을 암호화하는 거대한 오픈 리딩 프레임(ORF) 으로 주로 이루어져 있는 것으로 보인다.

상기에 아울러, 다음에 제공된 정보는 추가의 HCV 균주 또는 분리물의 확인을 가능하게 한다. 추가의 HCV 균주 또는 분리물의 분리 및 특성규명은 예를들면 바이러스 입자 및/ 또는 바이러스 RNA를 포함하는 생체 성분으로부터 유래된 핵산의 분리, 다음에 설명된 HCV cDNA 서열을 포함하는 클론을 위한 라이브러리를 스크리닝하기 위한, HCV1 서열에 근거한 올리고머를 사용한 cDNA 라이브러리의 제조 및 PCT 공개 No. WO 90/14436 및 다음에 설명된 cDNA와 신규 분리물로 부터의 HCV cDNA를 비교하여 이루어질수 있다.

선행 정의 부분에서 설명된 바와같은 HCV 의 파라미터내에 적합한 균주 또는 분리물은 용이하게 확인 가능하다.

HCV 균주를 확인하는 다른 방법은 여기에 제공된 정보를 기본으로 하여 당해 기술분야의 숙련자에게 명확할 것이다.

[HCV cDNA 서열의 분리]

본발명의 올리고머는 HCV 폴리뉴클레오티드중의 표적서열과 혼성 이중가닥 구조를 형성하는 부위를 포함한다.

올리고머의 HCV 폴리뉴클레오티드 혼성화 부위는 여기에서 제공되고 PCT 공개 No. WO 90/14436에 기재된 HCV cDNA 서열( 들) 로부터 확인될수 있다.

원형 형태적인 HCV, HCV1 로부터의 HCV cDNA 조성물을 제1도에 나타내었다. 조성물의 서열은 람다 gt 11(λgt11)(ATCC No. 40394) 중에 존재하는c 라이브러리를 포함하는, 많은 HCV cDNA 라이브러리 및 사람 혈청으로부터 분리한 많은 HCV cDNA 클론으로부터 유래된 서열 정보를 기본으로 한다.

PCT 공개 No. WO 90/14436에 설명된 방법에 의해 HCV cDNA 클론을 분리하였다.

요약컨대, 분리된 클론의 대부분은 만성 HCV 에 감염된 침팬지로부터 유래하고 높은 역가의 바이러스, 다시 말해 최소 10⁶침프 감염량 [chimp infectious doses/㎖(CID/㎖)]을 포함하는 풀(pooled)혈청을 사용하여 제조된 HCV cDNA c 라이브러리로부터 유래한 서열을 포함하였다.

풀 혈청은 바이러스 입자를 분리하기 위해 사용되고; 이들 입자로부터 분리된 핵산은 cDNA 라이브러리 제조에 있어 바이러스 게놈에 대한 주형으로서 사용되었다.

개시클론, 5-1-1 은 감염 개체로부터 혈청에 의해 c라이브러리를 스크리닝하여 얻었다. 개시클론의 분리후, 잔존 서열은 합성 폴리뉴클레오티드 프로브에 의해 공지된 HCV cDNA 서열( 들) 의 5'-부위 및 3'-부위로부터 유래된 서열을 스크리닝하여 얻었다.

cDNA 서열을 복구하는 방법의 설명은 대부분 역사적으로 관심이 된다.

얻어진 서열( 및 그들의 상보서열) 이 여기에서 제공되고, 서열 또는 그들의 임의의 부분이 합성법을 사용하여 또는 PCT 공개 No. WO 90/14436에 설명된 것과 유사한 방법을 사용되는 부분적 서열의 회복과 합성법을 조합하여 제조될수 있다.

[올리고머 프로브 및 프라이머]

HCV 게놈( 제1도에 도시한 바와같음) 및/ 또는 HCV 게놈의 바람직한 보존 부위를 기본으로 사용하여, 대략 8- 뉴클레오티드 또는 그 이상의 올리고머를 제조할수 있으며, 이는 HCV cDNA 뿐만 아니라 HCV RNA 또는 그 상보물의 양성 가닥( 들) 과 혼성화한다.

이들 올리고머는 IICV 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 검색( 분리 및/ 또는 표지를 포함)을 위한 프로브 및/ 또는 표적이 된 HCV 서열의 전사 및/ 또는 복제를 위한 프라이머로 사용할수 있다.

올리고머는 타게팅 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이 서열은 표적 HCV 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 서열은 길이가 충분하고 HCV 서열에 상보적인 바 의도된 목적을 위해 충분한 안정성을 갖는 이중 가닥을 형성한다.

예를들면 목적이 고정화를 경유한 표적 HCV를 포함하는 분석물의 분리라면, 올리고머는 길이가 충분하고 표적이 된 HCV 서열에 상보적이어서 분리 조건하에서 올리고머에의 결합을 거쳐 고체표면상에 분석물을 고정화하기에 충분한 이중가닥의 안정성을 제공하는 폴리뉴클레오티드 부위를 포함할 것이다.

또한 예를들어 올리고머가 분석물 폴리뉴클레오티드중의 표적 HCV 서열의 전사 및/ 또는 복제를 위한 프라이머로 사용된다면, 올리고머는 길이가 충분하고 표적이 된 HCV 서열에 상보적이어서 중합제가 중합 조건하에서 안정한 이중 가닥형태의 프라이머로부터 표적서열에 의해 복제를 계속하도록 허용하는 폴리뉴클레오티드 부위를 포함할 것이다.

또한 예를들어 올리고머가 표지 프로브로 사용되거나 멀티머에 결합된다면, 타게팅 폴리뉴클레오티드 부위는 길이가 충분하고 상보적인 바, 표지 프로브 및/ 또는 멀티머와 안정한 혼성 이중가닥 구조를 형성하므로 이중가닥의 검색이 가능하다.

올리고머는 표적이 된 HCV서열에 상보적인 최소 대략 4개의 인접 뉴클레오티드를 포함할수 있으며; 보통 올리고머는 표적이 된 HCV 서열에 상보적인 최소 대략 8개의 인접 뉴클레오티드를 포함하여, 바람직하게는 표적이 된 HCV 서열에 상보적인 최소 약 14개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.

적당한 HCV 뉴클레오티드 타게팅 서열은 HCV cDNA 뉴클레오티드로부터 선택된 상보적 뉴클레오티드인 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 제1도에 도시되어 있다.

그러나, 올리고머는 표적이 된 HCV 서열에 상보적인 서열만으로 구성될 필요는 없다.

아울러 올리고머의 사용 목적에 적합한 뉴클레오티드서열 또는 다른 부분들을 포함할수 있다.

예를들면 올리고머가 PCR를 거쳐 HCV 서열을 증폭하기 위한 프라이머로 사용되는 경우, 이중 가닥일 때 증폭된 서열의 클로닝을 용이하게 하는 제한효소부위를 형성하는 서열을 포함할수 있다.

또한 예를들면 올리고머가 혼성화 분석( 하기 언급함) 중에 포휙 프로브로 사용된다면, 표적이 된 HCV 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고머와 짝지워지는 결합상대를 아울러 포함할 것이다.

올리고머가 포함되거나 짝지워진 유용한 다른 형태와 부분 또는 서열은, 뉴클레오티드프로브의 표지화를 포함하여 다양한 목적에 적합하다고 당해 기술분야에 알려져 있는 것들이다.

당해 기술분야에 공지된 방법, 예를들면 절단, 전사, 또는 화학적 합성을 포함하는 방법을 이용하여 올리고머를 제조한다.

올리고머의 타게팅 폴리뉴클레오티드와 상보적인 선택된 게놈의 부위 및/ 또는 표적서열은 목적에 좌우된다.

예를들어 목적이 생물학적 샘플( 예를들면 혈액) 중의 HCV 의 존재를 스크리닝하는 것이라면, 바람직한 올리고머는 프로브 및/ 또는 프라이머로 사용될 것이고, 보존된 IICV 게놈 부위로 혼성화할 것이다.

올리고머가 결합될수 있는 IICV 게놈의 어떤 보존 부위는 여기에 설명되어 있으며, 예를들면 그 부위는 약 5- 말단 내지 약 200개, 또는 약 4000 내지 약 5000, 또는 제1도의 도시된 바와같이 약 8000 내지 약 9040, 또는 바람직하게는 약 -318 내지 약 174, 약 4056 내지 약 4448 및 약 4378 내지 약 4902 의 뉴클레오티드를 포함한다.

약 -313 내지 약 -173 및 제1도에 도시된 바와같은 약 1내지 약 540의 뉴클레오티드로부터 유래된 프라이머 및 프로브들이 특히 바람직하다.

보존된 다른 게놈 부위는 프로트타입 HCV, HCV1을 포함하여 HCV의 다양한 분리물과 뉴클레오티드 서열을 비교하여 용이하게 확인된다.

보존부위 및 비보존부위를 결정하기 위해 유전자형(genotype)간을 비교하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고, 이 방법들의 예가 PCT 공개 No. WO 90/14436에 개시되어 있다.

기본적인 핵산 혼성화 분석에서 단일 가닥 분석물 핵산(DNA 또는 RNA) 은 핵산 프로브로 혼성화되고, 결과 이중 가닥이 검색되었다.

HCV 폴리뉴클레오티드를 위한 프로브(본질적 또는 파생적)는 혼성화에 의해 바이러스의 특유 서열을 검색할수 있는 길이이다.

6-8 뉴클레오티드가 작동가능한 길이인 반면, 10-12 뉴클레오티드의 서열이 바람직하며, 약 20 뉴클레오티드 또는 그이상이 최상으로 보인다.

바람직하게는 이 서열들은 이종성이 결핍된 부위로부터 유래될 것이다.

자동화된 올리고뉴클레티드 합성방법을 포함한 전형적인 방법을 사용하여 이 프로브들을 제조할수 있다.

cDNA 라이브러리 프로빙에 유용한 다양한 올리고머뿐 아니라, 유용한 프로브들중에서, 예를들어, 여기에 개시된 새로이 분리된 클론으로부터 유래된 것들을 하기에 언급한다.

HCV 게놈의 어느 유일한 부위에 상보적인 것이 충분할 것이다. 프로브로서 사용하기 위해서는 완전한 상보성이 바람직하지만, 절편의 길이가 증가함에 따라 그것은 불필요할 수도 있다.

HCV 폴리뉴클레이티드의 존재를 검색하기 위한 작용물로서 그러한 프로브를 사용하기 위해( 예컨대 오염된 혈액의 스크리닝시에) 혈액 또는 혈청과 같은 분석할 생물학적 샘플이 원한다면 그안에 함유된 핵산을 추출하기 위해 처리될 수 있다.

샘플에서 얻어진 핵산은 겔 전기영동 또는 다른 크기 분리기술로 분리될 수 있다; 선택적으로 핵산 샘플은 크기분리없이 도트 블로트(dot bldt)될 수도 있다.

프로브의 타게팅 서열을 지닌 혼성이중가닥을 형성시키기 위해 분석물 핵산의 표적 부위는 단일가닥형태로 되어야 한다.

서열이 자연적으로 단일가닥형태로 존재하면, 변성은 불필요하다.

그러나, 서열이 이중가닥형태로, 존재하면, 서열은 변성될 것이다. 변성은 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 수행될 수 있다. 변성후에, 분석물 핵산 및 프로브는 분석물의 추정상 표적화된 서열과 프로브의 표적서열의 안정한 혼성체 형성을 촉진하는 조건하에서 배양되고, 프로브( 들)를 지니는 얻어진 이중가닥이 검출된다.

얻어진 이중가닥( 있다면) 의 검색은 대개 표지된 프로브를 이용하여 수행된다; 선택적으로, 프로브는 표지되지 않을 수도 있으나, 직접 또는 간접적으로 표지된 리간드와의 특이적 결합에 의해 검색될 수 있다. 적합한 표지, 및 프로브 및 리간드 표지방법이 본 기술에 공지되어 있으며, 예컨대 공지된 방법(예를들어, 닉크 트란스레이션 또는 키나싱(kinasing))으로 삽입될 수 있는 방사성 표지, 비오틴, 형광군, 화학발광군 (예를들어, 디옥세탄(dioxetane) 특히 트리거(trigger) 된 디옥세탄), 효소, 항체 따위를 포함한다.

분석물에 결합하는데 사용되는 프로브 부위는 HCV 게놈에 완전히 상보적으로 만들어질수 있다. 그러므로, 대개 거짓 양성반응을 방지하기 위해 높은 스트린젠시 조건이 바람직하다.

그러나, 높은 스트린젠시 조건은 단지 프로브가 이종성이 없는 바이러스 게놈의 부위에 상보적일 때만 사용되어야 한다. 혼성화 스트린젠시는 온도, 이온강도, 시간 및 포름아미드 농도를 포함하여 혼성화 및 세척과정의 많은 요인에 의해 결정된다.

이들 인자는 예컨대 티. 마니아티스(T. Maniatis)(1982) 에 나타나 있다.

외부물질로부터 검색할 이중가닥의 분리를 촉진하고 및/ 또는 표지된 부분으로부터의 신호를 증폭하는 것을 포함하는 본 기술에 공지된 기본 기술의 변형법이 이용될 수도 있다.

많은 변형법이, 예컨대, 매듀스(Matthews) 및 크릭카(Kricks)(1988), Anal. Biochem. 169: 1; 란데그렌(Landegren) 등 (1988), Science 242: 229; 및 미틀린(Mittlin)(1989), Clin. Chem. 35: 1819에 나타나 있다.

이들 분석법에서 HCV 검색에 적합한 프로브는 표적 HCV 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하여 분석물 가닥과 함께 이중가닥을 형성하는 서열로 이루어지며, 거기에서 이중가닥은 특이한 분석 시스템에서의 검색을 위해 충분히 안정하다.

적합한 변형법은 예컨대 1989년 9월 9일에 출판된 미국특허 No. 4,868,105 및 E.P.O 공개No. 225807(1987년 6월 16일에 출판됨) 에 개시되어 있는 것이다.

이들 출판물에는 분석물 핵산이 표지 프로브 세트 및 포획 프로브 세트에 혼성화되는 액상 혼성화 분석법이 기술되어 있다.

프로브-분석물 복합체는 포획 프로브 세트에 상보적인 고체로 지지된 포획 프로브와 혼성화를 통해 짝지어진다.

이것에 의해, 분석물 핵산은 고체상 복합체로 용액에서 제거된다. 분석물이 고체상복합체의 형태이면 분석에서 후속분리단계가 용이해진다. 표지 프로브 세트는 고체상/ 분석물 복합체에 혼성화되어 결합된 표지 프로브에 상보적이다.

일반적으로, HCV 게놈서열이 상대적으로 낮은 수준, 예컨대 대략 ㎖당 10²-10³침프감염량(CID)으로 감염된 개체의 혈청에 존재할 것이 예상된다.

이 수준은 증폭 기술이 혼성화 분석법에 상용되는 것을 필요로 할 것이다.

그러한 기술이 본 기술에 공지되어 있다.

예컨대, 엔조 바이오케미칼 코오퍼레이션 바이오-브리지(Enzo Biochemical Corporation Bio-Bridge) 시스템은 말단 데옥시뉴클레오티드 트란스퍼라제를 이용하여 변형되지 않은 3'-폴리-dT-꼬리를 DNA프로브에 첨가시킨다.

폴리 dT-꼬리 프로브는 표적 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고, 이어서 비오틴-변형 폴리-A에 혼성화된다. PCT 공개 No. W084/03520 및 EPO 공개 No.124221에는 DNA혼성화 분석법 : (1) 분석물이 효소-표지의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 단일-가닥 DNA프로브에 어닐링되고 ; 및 (2) 얻어진 꼬리 이중가닥이 효소-표지의 올리고뉴클레오티드에 혼성화되는 것이 기술되어 있다.

EPO공개 No.204510에는 분석물 DNA가 꼬리, 예컨대 다수의 표지 가닥에 결합할 수 있는 프로브의 꼬리, 예컨대 폴리-A 서열에 혼성화되는 서열을 지니는 증폭 가닥인 폴리-dT 꼬리를 지니는 프로브와 접촉하는 DNA혼성화 분석법이 기술되어 있다.

대략 10⁶/㎖수준의 서열을 검색할 수 있는, EPO공개 No.317077(1989년 5월 24일에 출판됨)에 기술되어 있는 한가지 형태의 혼성화 분석법은 단일-가닥 분석물 핵산 및 다수의 단일-가닥 표지 올리고뉴클레오티드에도 결합하는 핵산 멀티머(multimer)를 사용한다. 특히 바람직한 기술은 혼성화 시스템의 일부로서, 대략 10,000배(즉, 대략 10⁶서열/㎖)로 혈청내의 표적 HCV서열을 증폭시키는 것을 포함한다.

증폭은 예컨대, 사이끼(Saiki)등(1986), 몰리스(Mullis)의 미국특허 No.4,683,195 및 몰리스(Mullis)등의 미국특허 No.4,683,202에 기술되어있는 폴리머라제 사슬반응(PCR)기술로 수행될 것이다. 증폭은 HCV 표적서열의 정제전, 또는 바람직하게 정제후에 수행될 것이다. 예컨대, 증폭은 미국특허 No.4,868,105에 기술되어 있는 분석법과 함께, 또는 더 나아가서의 증폭이 바람직한 경우에는 EPO공개 No.317077에 기술된 혼성화 시스템과 함께 이용될 것이다.

분석물 폴리뉴클레오티드 가닥의 HCV서열을 검색하는 바람직한 방법은 미국특허 No.4,868,105 및 EPO공개 No. 317077에 개시되어 있는 혼성화 검색방법에 근거한다. 이들 방법은 분석물 핵산의 표적서열에 혼성화되는 포획 및 표지 프로브 둘다를 이용하는 액상샌드위치 혼성화 분석법이다. HCV의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 이들 분석법의 용도에서, 사용되는 프로브는 HCV게놈의 보존된 부위에 결합할 것이다.

포획 및 표지 프로브는 표적서열에 결합시 점재되어 있을 것이다.

선택적으로, 바람직한 방식에서 포획 및 표지 프로브는 세트로 있고, 한 세트의 프로브는 다른 세트의 프로브와는 점재하지 않는다.

뒤의 방식에서, 바람직하게 다수의 포획 프로브 세트(들)가 게놈의 보존된 대부분의 부위에 혼성화되며, 반면에 다수의 표적 프로브 세트(들)는 적은 양의 차이를 나타내는 부위에 혼성화될 것이다.

예컨대, 제1도의 HCV1 cDNA 서열의 원형을 이용하는 경우, 약 -318내지 약 174부분의 뉴클레오티드, 및/또는 약 4378 내지 약 4902 부분의 뉴클레오티드, 및/또는 약 4056 내지 약 4448 부분의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 프로브가 이용된다.

바람직한 프로브는 HCV게놈의 5'-부위의 서열에 혼성화되는데, 왜냐하면, 하기에 나타나 있듯이, 이 부위가 고도로 보존되어 있기 때문이다.

그러므로, 바람직한 프로브는 예컨대 제1도에 나타나 있듯이 약 -318 내지 약 174의 뉴클레오티드에 혼성화될 것이다. 보존된 부위의 양성가닥 및/ 또는 보충물에 혼성화되는 프로브가 목적, 예컨대 바이러스 게놈 서열의 검색, 또는 PCR증폭에서 얻어지는 HCV cDNA 서열의 검색, 또는 양성 HCV RNA 가닥의 복제 중간체의 검색에 의존하여 사용될 것이다.

[ HCV cPCR 방법을 이요한 HCV RNA 및 그것에서 유도된 폴리뉴클레오티드의 검색]

HCV RNA 또는 HCV RNA에서 유도된 폴리뉴클레오티드를 검색하는데 특히 유용한 방법은 HCV / cPCR 방법인데, 본 출원의 주제이며, 사이끼(Saiki)등 (1986), 물리스(Mullis)의 미국특허 No. 4,683,195 및 물리스(Mullis)등의 미국특허 No. 4,683,202에 기술된 폴리머라제 사슬반응기술(PCR)을 이용한다. HCV/cPCR 방법은 HCV게놈의 특성과 관련하여 여기에 게시된 정보로부터 유도된 프라이머와 프로브를 이용한다.

일반적으로, PCR 기술에서, 원하는 서열의 반대 말단과 결합된 짧은 올리고 뉴클레오티드 프라이머가 제조된다. 프라이머간의 서열은 알려져 있지 않다.

폴리뉴클레오티드 샘플은 추출된후 바람직하게 열에 의해 변성되고, 과량의 몰로 존재하는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 혼성화된다.

중합은 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 또는 뉴클레오티드 유사체(dNTPs)의 존재하에 주형 - 및 프라이머-의존 폴리머라제에 의해 촉매되어진다.

이것은 5'-말단에 각 프라이머를 포함하고 새로 합성된 원래 가닥의 보충물에 공유결합된 두 개의 긴 생성물(long product)을 형성시킨다.

복제된 DNA는 다시 변성되고, 올리고뉴클레오티드 프라이머와 혼성화된후, 다시 중합 조건에서 복제의 제2 사이클이 시작된다.

제2 사이클은 두 개의 원래 가닥, 제1 사이클에서 얻어진 두 개의 긴 생성물, 및 긴 생성물로부터 복제된 두 개의 짧은 생성물(short product)을 제공한다.

짧은 생성물은 표적서열에서 유도되고 프라이머 서열을 지닌 5'- 및 3'-말단에 연결된 서열(센스 또는 안티센스)을 포함한다.

각 부과적인 사이클에서, 짧은 생성물이 지수적으로 복제된다.

그러므로 이 방법은 특정한 표적서열의 증폭을 야기시킨다.

본 방법에서, HCV RNA또는 그것의 절편을 포함하는 것으로 추정되는 샘플이 제공된다. 샘플은 대개 NANBH를 지니는 것으로 추정되는 사람에게서 얻어진다; 그러나, 샘플의 다른 공급원은 예컨대 바이러스가 복제되는 생체의 시스템에서 얻어진 조건화된 배지 또는 세포를 포함한다. 그러나 샘플을 표적핵산서열(들)을 포함해야 한다.

이어서 샘플은 HCV RNA를 HCV cDNA를 역전사시키는 조건에 놓인다.

RNA를 역전사시키는 조건은 본 기술에 숙련된 사람에게 알려져 있으며, 예컨대 마니아티스 등(1982), 및 메쏘드 인 엔지모로지(Methods in Enzymology)에 기술되어 있다.

바람직한 역전사 방법은 재조합 분자, 예컨대 레트로바이러스(retrovirus), 바람직하게는 조류의 미엘로블라스토시스(myeloblastosis) 바이러스(AMV)에서 분리된 것을 포함하여, 다양한 공급원에서 얻은 역전사효소, 및 역전사에 적합한 조건을 이용한다.

역전사의 HCV cDNA 생성물은 RNA:DNA 혼성체로 존재하는데, 이것은 역전사의 제 1회에서 얻어진다. 계속해서 전사의 제 2회 또는 그 이상으로부터 DNA:DNA 혼성체가 얻어진다.

역전사로 얻어진 HCV cDNA 는 이어서 PCR로 표적서열이 증폭된다.

이것을 수행하기 위해, HCV cDNA 는 변성되고, 분리된 가닥은 표적서열을 측면에 지닌 프라이머와 혼성화된다.

가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 방법을 포함하여 어떤 적합한 변성 방법으로 수행되며, 이들은 본 기술에 숙련된 사람에게 알려져 있다.

바람직한 물리적 방법은 핵산이 완전히(99%) 변성될 때까지 가열하는 것을 포함한다.

전형적인 열 변성은 약 80℃내지 약 105℃ 범위의 온도에서 약 1 내지 10분간 가열하는 것을 포함한다.

HCV cDNA와 프라이머의 혼성화 후에 표적 HCV 서열은 복제 사슬의 합성을 개시하는 프라이머 올리고뉴클레오티드를 이용하는 증폭방법으로 복제된다.

HCV게놈의 서열과 상보적이도록 프라이머가 선택된다.

HCV cDNA의 센스 또는 안티센스 가닥 부위에 상보적인 올리고머 프라이머는 제1도에 제시된 합성 cDNA서열에서 얻어진 HCV cDNA로부터 만들어질 수 있다.

이중가닥 서열을 따라 상대적인 위치가 하나의 프라이머로부터 합성된 확장 생성물이 되도록 프라이머는 선택되고, 그것이 주형(보충물)으로부터 분리된 경우, 다른 프라이머의 확장을 위한 주형으로 쓰여져서 한정된 길이의 복제 사슬이 생성된다.

프라이머는 증폭의 최대효율을 위해 바람직하게 단일가닥이 바람직하나, 선택적으로 이중가닥일 수 있다. 이중가닥인 경우, 프라이머는 확장 생성물을 제조하는데 사용하기전에 우선 가닥이 분리되도록 처리되어야 한다.

바람직하게, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다.

프라이머는 중합제의 존재시에 확장 생성물의 합성이 가능하도록 충분히 길어야 한다.

프라이머의 정확한 길이는 온도 및 프라이머 공급원 및 방법의 용도를 포함하여, 많은 요인에 의존할 것이다. 예를들면, 표적서열의 복합성에 의존하는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 약 15 내지 45 뉴클레오티드를 포함하여, 보다 많거나 적은 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 일반적으로 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형으로 충분히 안정한 혼성 복합체를 형성하기위해 보다 차가운 온도를 필요로 한다.

여기에 사용된 프라이머는 증폭될 각 특정서열의 다른 가닥에 실질적으로 상보적인 것이 선택되었다. 그러므로, 프라이머는 주형의 정확한 서열을 반영하지 않으나, 해당 가닥과 선택적으로 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 한다.

예를들어, 비-상보적인 뉴클레오티드 절편은 가닥에 상보적인 프라이머 서열의 나머지와 함께 프라이머의 5'-말단에 부착될 것이다.

선택적으로, 비-상보적인 염기 또는 보다 긴 서열은, 프라이머가 증폭되어 그것과 혼성화되는 가닥의 한가지 서열과 충분히 상보적일 때 프라이머의 사이에 위치함으로써, 중합방법으로 확장되는 이중가닥 구조를 형성한다.

프라이머의 비-상보적인 뉴클레오티드 서열은 제한효소위치를 포함할 것이다.

표적서열의 말단(들)에 제한효소위치를 첨가하는 것이 표적서열의 클로닝에 특히 도움이 될 것이다.

여기에 사용된 바와 같이 프라이며는 증폭되는 표적부위의 말단서열(들)에 대한 정보가 약간 모호한 특이한 경우에는 하나이상의 프라이머를 지칭하는 것이 이해될 것이다. 그러므로, 프라이머는 서열의 가능한 변화를 나타내는 서열을 포함하는 프라이머 올리고뉴클레오티드의 집합체를 포함하거나 또는 전형적인 염기 짝짓기를 허용하는 뉴클레오티드를 포함한다. 이 집합체 중에서 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적서열의 말단과 유사할 것이다. 특별한 경우, 올리고머 세트가 HCV게놈의 잠재적인 변이 부위의 증폭을 준비하는데 이용된다.

HCV1 원형 균주로부터 유도된 서열을 지니는 HCV의 다양한 균주 또는 분리체가 있을 것으로 예상된다. 그러므로, 변이 균주를 검색하기 위해서는 HCV게놈의 보존된 부위에 혼성화되는 프라이머를 만드는 것이 바람직하다. 보존된 부위는 여러 HCV균주/ 분리체의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하여 결정할 수 있다. 프라이머가 유래될 수 있는 상기한 HCV게놈에는 보존된 아미노산의 적어도 세가지 부분이 존재하는 것으로 보인다. 이들 부위가 존재하는 것으로 믿어진다.

다음의 실시예에 기술된 프라이머는 플라비바이러스(Flaviviruses)에 유사한 서열에 근거하여 HCV의 보존된 부위로 믿어지는 것에서 유도되었다.

올리고뉴클레오티드 프라이머는 어떤 적합한 방법으로 제조될 것이다.

특정한 서열의 올리고뉴클레오티드 제조방법이 본 기술에 공지되어 있으며, 적절한 서열의 클로닝 및 제한, 및 직접적인 화학합성 등을 포함한다.

화학합성방법은 예컨대 나랑(Narang)등 (1979)에 의해 기술된 포스포트리에스테르 방법, 브라운(Brown)등 (1979)에 의해 개시된 포스포디에스테르 방법, 뷰케지(Beaucage)등 (1981)에 의해 개시된 디에틸포스포아미데이트(diethylphosphoramidate)방법, 및 미국특허 No.4,458,066의 고체 지지물 방법일 것이다.

프라이머는 원한다면 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 방법으로 검색가능한 물질을 삽입시켜 표지할 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프라이머(들) 의 주형-의존 확장은 적당한 염, 금속 양이온 및 pH완충시스템으로 구성된 반응 매체에서 4가지 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)또는 유사체가 적당한 양으로 존재할 때 중합제에 의해 촉매 되어진다.

적합한 중합제는 프라이머- 및 주형-의존 DNA합성을 촉매하는 것으로 알려진 효소이다. 알려진 DNA 폴리머라제는 예컨대 이.콜라이(E. coli) DNA 폴리머라제 Ⅰ 또는 그것의 크레노우(Klenow) 절편, T₄DNA 폴리머라제 및 Taq DNA폴리머라제를 포함한다.

이들 DNA폴리머라제에 의한 DNA합성을 촉매하는 반응조건이 본 기술에 공지되어 있다.

합성의 생성물은 주형가닥과 프라이머 확장 가닥으로 구성된 이중가닥 분자로서 표적 서열을 포함한다. 차례대로 이들 생성물은 복제의 다른 일회의 주형으로 쓰인다.

제 2회에 복제시, 제1 사이클에 대한 프라이머 확장 가닥은 상보적인 프라이머와 어닐링된다; 합성은 프라이머 서열 또는 그것들의 보충물에 의해 5'- 및 3'-말단 둘다에 결합된 짧은생성물을 만든다.

변성, 프라이머 어닐링 및 확장의 반복된 사이클은 프라이머에 의해 한정되는 표적부위의 지수적인 축적을 야기시킨다. 핵산의 표적부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 원하는 양을 얻기위해 충분한 사이클이 진행된다. 원하는 양은 다양할 것이며, 생성물 올리고뉴클레오티드가 제공하는 기능에 의해 결정된다.

PCR방법은 다수의 일시적인 서열에서 수행될 수 있다.

예를들어, 각 단계후에 새로운 시약이 첨가되어 점차적으로, 또는 모든 시약이 동시에 첨가되는 방식으로, 또는 정해진 수의 단계후에 새로운 시약이 첨가되는 부분적으로 점차적인 방식으로 수행될 수 있다.

바람직한 방법에서, PCR반응은 열안정성 효소를 이용하는 자동화된 방법으로 수행된다.

이 방법에서, 반응혼합물은 변성부위, 프라이머 어닐링부위 및 반응부위를 통해 순환된다. 효소가 모든 사이클에서 첨가될 필요가 없으므로 열안정성 효소의 용도에 특히 적합하고, 액체 조작 시스템없이 순환하는 온도를 이용하는 기계가 사용될 것이다.

이러한 형태의 기계는 페르킨 엘머 세투스 코오퍼레이션(Perkin Elmer Cerus Corp.)에서 상업적으로 구입된다.

PCR 중폭후, 표적 폴리뉴클레오티드는 엄격 내지는 적당히 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 표적서열의 것과 안정한 혼성체를 형성하는 프로브 폴리뉴클레오티드와의 혼성화에 의해 검색된다. 프로브가 표적서열에 완전히 상보적(즉 약99%이상)인 것으로 예상될 때, 엄격한 조건이 이용될 것이다.

만약 일부분의 미스맷칭(mismatching)이 예상되는 경우, 예컨대 다양한 균주가 프로브가 완전히 상보적이 아닌 결과가 예상되는 때는 혼성화의 엄격성이 완화될 것이다.

그러나, 비특이성/우발적 결합을 통제하는 조건이 선택된다.

혼성화에 영향을 미치고 비특이성 결합을 선별하는 조건이 본 기술에 알려져 있고, 예컨대 마니아티스등 (1982)에 기술되어 있다.

일반적으로, 낮은 염농도 및 높은 온도는 결합의 엄격성을 증가시킨다.

예를들어, 대개 엄격한 조건은 약 0.1 x SSC, 0.1% SDS를 포함하는 용액에서 약 65℃의 배양/세척 온도에서 배양하는 것이고, 적당한 엄격한 조건은 약 1 내지 2 x SSC, 0.1% SDS를 포함하는 용액에서 약 50℃내지 65℃의 배양/세척온도에서 배양하는 것으로 간주된다. 낮은 엄격성 조건은 2 x SSC 및 약 30℃내지 50℃이다.

HCV표적서열에 대한 프로브는 제1도에 나타난 HCV cDNA 서열, 또는 새로은 HCV분리체로부터 유도될 것이다.

HCV프로브는 표적부위를 포함하나 프라이머는 제외되고, 표적부위에 특이적으로 혼성화되는 적합한 길이에 속할 것이다.

만약 완전히 상보적이며, 예컨대 균주가 프로브의 것과 동일한 서열을 포함하는 경우, 이중가닥은 엄격한 조건하에서 조차도 상대적으로 안정하기 때문에, 프로브는 약 10 내지 30 염기쌍 범위의 짧은 것이 될 수 있다.

만약 프로브와 어느정도의 미스맷치(mismatch)가 예상되는 경우, 즉 프로브가 여러부위에 혼성화되는 것으로 예상될 때, 프로브는 큰 길이에 속할 것인데, 왜냐하면 길이는 미스맷치(들)의 효과가 약간 균형을 이루도록 하기 때문이다.

표적서열에 상보적인 서열을 지니는 프로브 핵산은 프라이머 서열의 합성에 대해 위에 기술한 동일한 기술로 합성될 수 있다.

원한다면 프로브를 표지할 수 있다. 적절한 표지가 위에 기술되어 있다.

몇가지 경우에 있어서, 프로브로 검색된 PCR 생성물의 길이를 결정하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 만약 HCV균주가 표적부위내에 제거된 부분을 지니는 것으로 추정될 때, 또는 PCR 생성물의 길이를 확인하고 싶을 대 특히 바람직하다.

그러한 경우, 생성물의 프로브와 혼성화하거나 크기를 분석하는 것이 바람직하다.

핵산의 크기를 결정하는 방법이 본 기술에 알려져 있고, 예컨데 겔 전기영동, 구배침전, 및 겔 제외 크로마토그래피 등을 포함한다.

생물학전 샘플의 표적서열 존재는 HCV폴리뉴클레오티드 프로브 및 PCR증폭 기술을 실시한 핵산간의 혼성체 형성을 결정함으로써 검색된다.

프로브 및 핵산서열간에 형성된 혼성체 검색방법이 본 기술에 알려져 있다.

예컨대 편의를 위해, 표지되지 않은 샘플이 결합하게 되는 고체 매트릭스로 전달된 후, 결합한 샘플은 표지된 프로브와의 특이한 혼성화를 가능하게하는 조건에 놓이게 된다.

이어서 고체 매트릭스가 표지된 프로브의 존재에 대해 시험된다.

선택적으로, 만약 샘플이 표지되었다면, 표지되지 않은 프로브는 매트릭스에 결합되어 있으며, 적절한 혼성화 조건에 노출된 후, 매트릭스가 표지의 존재에 대해 시험된다. 다른 적합한 혼성화 분석법이 위에 기술되어 있다.

[PCR을 이용한 여러 HCV 서열의 결정]

여러 가지 HCV 균주를 확인하고, 그들 변이체에 대한 프로브를 만들기 위해, 상기 HCV/cPCR 방법을 이용하에 HCV 게놈의 변이부분을 증폭시켜서, 이들 변이된 표적부위의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다.

일반적으로, HCV의 변이 형태는 HCV1균주가 대부분인 지역, 예컨대 일본, 아프리카 등의 다른 지리학적 위치에서 발견되는 것으로 예상된다.

또는 바이로스로 감염된 다른 척추동물 종류에서 발견되는 것으로 예상된다.

변이된 HCV는 또한 조직배양 시스템에서의 계대배양시에도 발생되며, 자발적 또는 유발된 돌연변이의 결과이다.

변이된 표적부위를 증폭시키기 위해, 추정부위의 옆에 붙을 수 있도록 프라이머가 만들어지며, 바람직하게는 보존된 부위에 상보적이다. 아마도 보존된 HCV의 두부위에 대한 프라이머는 플라비바이러스 모델에 존재한다. 이들 프라이머 및 프로브는 제1도에 제시된 HCV1 균주에 대한 서열 정보를 이용하여 만들어질 것이다.

표적부위(들) 의 뉴클레오티드 서열의 분석은 PCR 증폭 생성물의 직접적인 분석으로 이루어진다.

PCR증폭 생성물의 직접적인 서열분석방법이 사이끼(Saiki)등 (1988)에 의해 기술되었다.

선택적으로, 증폭된 표적서열(들) 은 서열분석 이전에 클로닝될 수 있다. 효소에 의해 증폭된 게놈 절편의 직접적 클로닝 및 서열분석방법이 샤르트(Schart)(1986)에 의해 기술되었다.

본 방법의 PCR 기술에 사용한 프라이머는 예컨대 M13 시퀸싱(sequencing)벡터로 직접 클로닝되는 편리한 제한 위치를 생성하도록 5'-말단부위에서 변형된다. 증폭후, PCR 생성물은 적절한 제한 효소로 절단된다. 제한 절편은 M13 벡터에 연결되고, 예컨대 JM 103 숙주에 형질전환되어 플레이팅되며, 얻어진 플라크는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화에 의해 스크리닝된다. 클로닝 및 서열분석에 대한 다른 방법이 본 기술에 공지되어 있다.

[플라비바이러스 및 HCV에 대한 보편적 프라이머]

HCV cDNA 내에 포함된 서열 정보 및 HCV cDNA 로부터 유도된 프로브를 이용한 HCV게놈의 특성에 대한 연구는 HCV가 플라비-유사 바이러스임을 암시한다.

이들 연구는 PCT 공개 No. WO 90/14436에 기술되어 있다. HCV cDNA 클론에서 유도된 HCV cDNA 서열과 알려진 많은 플라비바이러스 서열의 비교는 HCV가 플라비바이러스의 보존된 서열에 유사한 서열을 지님을 보여준다. 이들 보존된 서열은 플라비바이러스의 표적부위에 대한 증폭 및 HCV에 대해 적용할 수 있는 보편적인 프라이머의 제조를 가능하게 할 것이다. 이어서 이들 종류의 확인이 종류에 특이한 프로브를 이용하여 달성된다. 많은 플라비바이러스의 게놈이 본 기술에 공지되어 있고, 예를들어 일본 뇌염 바이러스(Sumiyoshi 등(1987)), 황열 바이러스(Rice 등(1985)), 뎅그열타입 2 바이러스(Hahn 등(1988)), 뎅그열 타입 4 바이러스(Mackow(1987)), 및 서나일 바이러스(Castle 등(1986))를 포함한다. HCV RNA의 확인은 HCV에 특이한 프로브를 이용하여 달성되고, 서열은 여기에 제시된 HCV cDNA 서열을 통해 결정될 수 있다.

선택적으로, 플라비바이러스의 알려진 서열과 HCV 아미노산 서열의 비교에 의해 결정되듯이, 플라비바이러스 및 HCV에 대한 공통서열을 포함하고 코돈 변이들 반영하여 만들어진 프로브(들) 세트의 이용은 이들 바이러스에 대한 일반적인 검색 시스템을 가능하게 한다.

[원하는 DNA 서열의 제조]

합성 올리고뉴클레오티드는 와너(Warner)(1984)에 의해 기술된 바와같이 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기로 제조될 수 있다.

원한다면, 합성가닥을 표준반응 조건을 이용하여³²P-ATP 의 존재하에 폴리뉴클레오티드 키나제(kinase)로 처리하여³²P로 표지할 수 있다.

cDNA 라이브러리(library)에서 분리된 것을 포함하여, DNA 서열은 졸라(Zoller)(1982)에 의해 기술된 바와같이 위치 특이성 돌연변이유발을 포함하는 기술에 의해 변형될 수 있다.

요컨대, 변형되는 DNA가 단일가닥 서열로 파지(phage)에 들어가서, 프라이머로 변형되는 DNA부분에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 DNA폴리머라제에 의해 이중가닥 DNA로 전환된다.

얻어진 이중가닥 DNA 는 수주세균을 지지하는 파지에 형질전환된다.

형질전환된 세균의 배양물은 파지의 각 가닥의 복제물을 포함하며, 플라크를 얻기 위한 한천에 플레이팅된다.

이론상 50%의 새로운 플라크는 돌연변이된 서열을 갖는 파지를 포함하고, 나머지 50%는 원래서열을 포함할 것이다.

플라크의 복제물은 올바른 가닥과의 혼성화를 허용하는 조건 및 온도에서 표지된 합성 프로브에 혼성화되나, 변형된 서열과는 혼성화되지 않는다.

혼성화로 확인한 서열을 회수하여 클로닝하였다.

[HCV 유도 폴리뉴클레오티드의 스크리닝 키트(kit)]

HCV 샘플의 증폭 및/ 또는 스크리닝에 대한 프로브 및/ 또는 프라이머인 올리고머는 키트에 포장될 수 있다.

HCV 서열의 스크리닝 키트는 올리고머의 프로브 DNA를 포함한다.

HCV 서열 증폭 키트는 증폭에 사용되는 올리고머의 프라이머를 포함할 것이다.

키트는 대개 특정한 혼성화 및/또는 증폭의 실시에 필요한, 분리된 적합한 용기에 적합하게 포장된 시약 및 재료 뿐만 아니라 예비측정 또는 예비결정된 양의 프로브 또는 프라이머를 포함할 것이다.

예를들어, 키트는 표준물(standards), 완충액, 지지물(support), 효소, 기질, 표지 프로브, 결합상태, 및/또는 시험 시행 지침서를 포함할 것이다.

[실시예]

하기 본발명의 실시예는 오로지 예시 목적을 위해 제공된 것이고, 본발명의 영역을 제한하는 것이 아니다.

[1.혈청의 양성 및 음성가닥 5'-HCV RNA의 검색]

혈청에서 분리한 HCV27의 RNA를 PCR 방법을 이용하여 양성 및 음성가닥의 존재에 대해 분석하였다.

PCR방법은 하기사항을 제외하고 본질적으로 상기한 바와같이 수행하였다.

추출된 HCV27 RNA를 Alex90 또는 JH52 프라이머를 이용하여 단일가닥 cDNA로 역전사 시켰다.

HCV1 게놈의 뉴클레오티드 -312내지 -283에서 유도된 ALex90은

5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'

의 서열을 지닌다.

HCV 뉴클레오티드 -93내지 -117에서 유도된 JH52의 뉴클레오티드 수는 하기 서열의 괄호에 표시되어 있다.

JH52에서 밑줄친 디뉴클레오티드는 NotI 위치를 만들도록 돌연변이시킨 것이다.

pf JH52의 서열은 다음과 같다.

Alex90의 서열은 HCV RNA 양성가닥의 뉴클레오티드 -312 내지 -283의 것과 결합하고, 반면에 JH52는 음성가닥의 뉴클레오티드 -177 내지 -93의 것과 결합한다.

얻어진 단일가닥 HCV cDNA를 Alex90 및 JH52를 이용하여 PCR로 각각 증폭시켰다.

프로브로 Alex89를 이용하여 서던블로팅(Southern blotting)으로 증폭된 생성물을 검색하였다.

Alex89는 HCV RNA의 뉴클레오티드 번호 -203 내지 -175와 결합한다.

Alex89의 서열은 다음과 같다.

5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'

이 방법을 이용한 분석은 두 RNA 가닥의 증폭된 생성물의 신호가 동일한 강도로 나타남을 보여주었다.

이 결과는 5'-부위의 HCV RNA가 이중가닥 RNA 로 존재할 것임을 암시한다.\

[II. HCV/cPCR, 프라이머 및 HCV RNA의 5'-부위에서 유도된 프로브를 이용한 혈장의 HCV RNA검색]

[혈장으로부터 HCV RNA의 추출]

냉동된 혈장을 P3후드에서 녹였다. 소화믹스(mix) 0.2㎖ 분취량(100밀리몰(mM) Tris-HCl, 2mM EDTA, 200mM NaCl, 20 마이크로그램 / 밀리리터 (㎕/㎖) MS2 RNA, 0.5% SDS, 및 2㎎/㎖ 프로틴아제 K, pH8)을 2㎖ 마이크로푸지 튜브(microfuge tube)에 첨가하고 37℃까지 미리 가열하였다.

이어서 혈장(0.2㎖)을 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 1시간 배양하였다.

다음에 페놀(0.4㎖)을 첨가하여, 혼합물을 30초간 3회 와동시켰으며, 와동 사이는 30초였다.

이어서 혼합물을 5분간 원심분리한 후 수성층을 회수하였다.

유기상을 0.1㎖ TES로 다시 추출한 후, 모아진 수성층을 1부피의 페놀/클로로포름/IAA로 2회 추출하고, 이어서 1부피의 클로로포름으로 추출하였다.

추출물에 1㎕(2g) 클리코겐(Boehringer Mannheim Corp.) 및 25㎕의 NaOAc(3M, pH5.4) 및 1.25㎖의 냉각된 에탄올을 첨가하여 생성물을 드라이아이스에서 냉동시킨 후 10분간 회전시켰다.

펠렛을 증류수 100㎕에 녹인후 NaOAc 5㎕(pH5.4) 및 냉각된 에탄올 250㎕를 첨가하였다. 용액을 냉동시키고 회전시킨후 얻어진 펠렛을 증류수 10㎕에 녹였다.

[cDNA 합성)

추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해, 우선 녹인 RNA 5㎕를 물 4㎕ 및 RT프라이머 1㎕(1μg 또는 18-량체의 166피로몰)와 함께 배양하였다.

70℃에서 3분간 배양한 후 얼음에서 냉각시켰다.

RT 프라이머의 서열을 다음과 같다.

5' CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3'

초기 배양후, 10㎕의 5배 제1가닥 완충액(250mM Tris HCl, pH8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl_2,50mM 디티오트레이톨) 2.5㎕의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(각 10mM) 2.5㎕의 역전사 효소(BRL의 MMLV, ㎕당 200단위), 및 부피를 50㎕로 만드는 증류수를 배양 혼합물에 첨가하였다.

혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 90℃에서 3분간 가열한 후, 얼음에서 냉각시켰다.

[PCR 증폭]

위에 생성된 HCV cDNA의 PCR증폭을 하기의 표에 열거된 컨트롤(control) 및 시험 시약을 이용하여 수행하였다.

표에서, RNA는 HCV1에 감염됨 사람에게서 추출된 RNA가 있는 컨트롤 샘플을 나타낸다.

이 샘플로 cDNA 합성 및 PCR증폭의 단계를 통해 수행하였다.

cDNA는 cDNA합성 및 PCR증폭의 단계를 통해 수행된 컨트롤 샘플을 가르킨다. 그러나, 이 경우 RNA분취량을 cDNA 합성동안 물로 대치시켰다.

샘플은 HCV RNA의 존재를 시험한 혈청을 가르킨다.

프라이머 1 및 프라이머 2를 각각 0.5㎍/㎕ 및 0.42㎍/㎕씩 첨가하였으며, 이들은 하기의 서열을 지닌다.

프라이머 1 : 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'

프라이머 2 : 5' AGT CTT GCG GGG GCA CGC CCA AAT C 3'

이들 프라이머는 HCV 게놈의 보존된 5'말단 부위에 혼성화된다.

샘플은 HCV cDNA의 12.5㎕ 혈청 등가물을 포함하였다.

이용한 증폭 사이클은 하기와 같다.

35사이클 : 용해 - 94℃에서 1.5분간

어닐링 -60℃에서 2분간

연장 -72℃에서 3분간

최종연장 : 72℃에서 30분간

제거될 때까지 4℃에서 침지시킴

증폭된 생성물을 표지된 DNA로 조사하였다.

프로브의 서열은 다음과 같다.

프로브 : 5' TTT CTT GGA TCA ACC CGC TCA ATG CCT GGA 3'

200이상의 HCV혈청-양성 샘플을 상기 방법으로 조사하였다. 컨트롤이 음성인 결과에 대해서만 고찰하였다. 이 경우, 모든 혈청-양성 샘플은 PCR분석에서도 양성이었다.

[III. HCV RNA의 추정상 코어(Core) 부위에서 유도된 프로브]

다른 HCV 분리체에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열분석은 제1도에 나타낸 열거 시스템을 이용할 경우, 약 뉴클레오티드 1 내지 약 뉴클레오티드 570 부위의 서열이 고도로 보존되어 있음을 보여주었다.

이 부위는 추정상 HCV의 코어폴리펩티드를 암호화한다.

다른 지리적 위치(일본 및 미국)에서 얻어진 다섯가지의 다른 분리체에 대한 컨센서스(consensus)서열을 제2도에 나타냈는데, HCV1은 HCV원형이다.

HCV1의 큰 ORF에 암호화되어 있는 아미노산을 컨센서스 뉴클레오티드 서열위에 나타냈다. 제2도의 서열에서, HCV-JH는 테쯔 미야무라(Tetsu Miyamura)박사 (일본의 국립보건원(HIH))와의 개인적인 통신을 통해 얻었고,JC-J1 및 JC-J4는 마유미(Mayumi)등 (1990)으로부터 얻었다.

추정상 코어부위는 컨센서스 서열간에는 HCV1 서열에 비해 적어도 90%의 유사성이 있음을 제2도에서 알수 있다.

뉴클레오티드 +1 내지 +571부위의 고도의 유사성에 근거하여 볼 때, 이 부위에 대한 프로브는 HCV양성의 생물학적 표본의 스크리닝에 유용할 것이다.

HCV 코오폴리펩티드를 암호화하는 것으로 추정되는 부위에서 얻어진 HCV RNA의 검색에 유용한 표지 프로브 세트를 제3도에 나타냈다.

제3도에서 세트의 프로브 번호는 제3도에 열거된 IUB그룹 코드(Group Code)로 표시되는 일련의 이형 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이질성은 다른 분리체의 컨센서스 서열에서 발견되는 뉴클레오티드의 서열 차이를 제공하는 것이다. 제3도의 프로브 세트에 있는 프로브와 상보적인 HCV서열 부위를 제4도에 나타냈으며, 뉴클레오티드 번호는 제1도의 번호와 일치한다.

이 프로브 세트를 HCV서열을 검색하는 분석에 사용하였다.

이 분석 포맷(FORMAT)은 PCT공개 No. W090/14436에 기술되어 있는데, HCV에 대한 샌드위치 혼성화 프로브(Probes For Sandwich Hybidzation for HCV)라는 제목의 실시예 부분에 있다.

[산업적 응용]

HCV cDNA로부터 유도된 프로브 및 프라이머의 올리고머 및 그것들을 포함하는 키트 뿐만 아니라 여기에 기술된 방법은 생물학 샘플, 더욱 특이하게는 수혈에 사용될 혈액, 및 HCV에 감염된 것으로 추정되는 사람에 있어서, HCV의 존재를 정확하고, 상대적으로 간단하고, 경제적으로 결정하는 데 유용하다.

더욱이, 이들 방법 및 올리고머는 재조합 HCV폴리펩티드의 용도에 근거한 면역학적 분석보다 빠른 단계의 HCV감염을 검색하는데 유용한 것이다.

또한 증폭된 폴리뉴클레오티드 혼성화 분석은 항-HCV 항체 음성인 샘플의 경우에도 HCV RNA를 검색한다. 그러므로, 여기에 기술된 프로브 및 프라이머는 HCV, 및 혈액을 포함하여 HCV에감염된 생물학적 표본의 감염을 보다 완전하게 확인하는 HCV폴리펩티드에 근거한 면역분석과 함께 증폭된 혼성화분석에 이용될 것이다. 여기서 제공된 정보는 HCV게놈의 보존된 부위로부터 유도된 프라이머 및/또는 프로브의 디자인을 가능하게 한다.

이들 프라이머 및 프로브의 제공은 여러 HCV균주를 검색하고, 혈액 및 혈액 생성물의 스크리닝 용도에 속하는 일반적인 방법에 유용하다. 만약 본 방법에 사용된 프라이머가 HCV게놈의 보존된 부위로 부터 유도되었다면, 본 방법은 다양한 HCV균주를 검색 및/또는 확인하는데 도움을 줄 것이다. 이것은 차례로 HCV의 검색 및 진단에 대한 부가적인 면역학적 시약의 개발 및 HCV의 검색 및/또는 치료에 대한 부가적인 폴리뉴클레오티드의 개발을 선도할 것이다. 부가하여, 플라비바이러스 및 HCV의 보존된 아미노산 서열로부터 디자인된 프라이머 및 프로브 세트는 이러한 감염원에 대한 보편적인 검색 방법을 참작한다.

하기에 열거된 물질은 부다페스트 조약에 다라 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(American Type Culture Collection : ATCC), 12301파크로운 닥터(Parklawn Dr.), 록크빌리(Rockville), 메릴랜드(Maryland) 20852에 기탁되어 있고, 하기의 가탁번호가 부여되었다.

부가하여, 1989년 5월 11일에 하기 기탁이 이루어졌다.

균주 D1210의 하기유도체가 1989년 5월 3일에 기탁되었다.

하기 균주는 1989년 5월 12일에 기탁되었다.

하기 생물학적 물질이 1990년 3월 23일에 기탁되었다.

미국특허로서 본 출원의 승인 및 공표에 근거하여, 이들 기탁물의 이용에 대한 모든 제한은 변경되지 않고 제거될 것이고; 및 디자인된 기탁물의 이용허가는 상기-명명의 출원이 미정인 동안은 37CFR 1.14 및 35USC 1.22하에 거기에 권리가 부여된 국장에 의해 결정된 사람에게 유용할 것이다.

더욱이, 디자인된 기탁물은 기탁일로부터 30년 동안, 또는 최후의 기탁 요구후 5년 동안; 또는 보다 긴, 미국특허의 강제기간 동안 유지될 것이다.

여기에 언급된 기탁물은 단지 편의를 위해 의도한 것이며, 본 명세서와 관련하여 발명을 실행하는데는 필요하지 않고, 부가적으로 이들 재료가 여기에 참고로 포함된 것이다.

Claims

HCV폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 추정되는 분석물 가닥의 HCV서열 검색방법에 있어서, HCV폴리뉴클레오티드는 선택된 표적 부위를 포함하고, 상기 방법은 (a) HCV게놈(제1도에 나타나 있음)의 다음 부위 : 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 및 457-486에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 분석물 폴리뉴클레오티드 가닥의 HCV서열에 혼성화될 수 있는 올리고머를 제공하는 단계; (b)타게팅 서열 및 표적 서열간에 특이한 혼성체 이중가닥을 형성시키는 (a)의 올리고머와 분석물 가닥을 배양하는 단계; 및 (d) 만약에 존재한다면, 표적 부위 및 올리고머간에 형성된 혼성체를 검색하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, (a)폴리머라제 사슬반응방법에 대한 프라이머이고 표적 부위의 옆에 붙어 있는 올리고머 세트를 제공하는 단계; 및 (b)폴리머라제 사슬반응방법을 통해 표적 부위를 증폭하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
분석물 가닥의 HCV표적 서열을 검색하는 키트에 있어서, 적절한 용기에 포장된 제 1항의 올리고머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
HCV가 없는 혈액의 제조방법에 있어서, (a)HCV표적 서열을 포함하는 것으로 추정되는 혈액 샘플로부터 분석물 핵산을 제공하는 단계; (b)HCV게놈(제1도에 나타나 있음)의 다음 부위 : 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 및 457-486에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 만약에 존재한다면, 분석물 폴리뉴클레오티드 가닥의 HCV서열에 혼성화될 수 있는 올리고머를 제공하는 단계; (c)만약에 존재한다면, 표적서열과 타게팅 서열간에 폴리뉴클레오티드 이중가닥을 형성시키는 조건하에 (a)와(b)를 반응시키는 단계; (d)만약에 존재한다면, (c)에서 형성된 이중가닥을 검색하는 단계; 및 (e)(d)에서 복합체가 검색되지 않은 혈액을 보관하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
HCV의 검색에 유용한 시약에 있어서, 상기 시약은 염기 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 및 457-486(제1도에 나타나 있음)으로 구성된 군에서 선택되는 HCV게놈 부위에 상보적인 서열을 지니는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시약.
제 5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 검색가능한 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.