HU227499B1 - Nanbv diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis c virus - Google Patents

Description

NANBV diagnosztikusok: hepatitisz C virus azkrinelésére has ználható polinukleotidok .-•C^inmyn-'-Ger-pera'tlen, EMERYVILLS» California <

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Feltalálók:

WS1NBR Amy 01 ,

KAN Jang,

URDEA Michael Steven

IRVXNE Bruce Duncan,

KOLBERO Janice A,,

BENICIA,

LAPAYSTTE,

ALAMÖ,

COMCORD,

RXCHMÖSíD,

California >

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A bejelentés napja; 1991, 08, 12,

Elsőbbsége; 1990. OS. 10.

H.£?<:WíH'vUy ¹ X-ÚÖÜ ' O 'í V? 1 ,

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US91/05728. A nemzetközi közzététel száma; WO éÁ/xO^.C₃(pt φ φ >· χ ί φ

Φχφ Φ*

A találmány ^w-S hepatitisz vírus (NANBV) fertőzés terjedésének kontrollásara használható anyagokra és :<'<:,·$·· s-\ _s..

módszerekre vonatkozik.> Részletesebben, a találmány a pon-A, >^ΛΦ;ζ··$··ϊ'·\ν peu-Ή hepatitisz (ΝΆΝΒΗ) , a hepatitisz C vírus (HCV) körokozé ágensére, poiínukleotidokra és ezek analógjaira vonatkozik, amelyek felhasználhatók _xbiológiai mintádbana HCV kimutatására A 'Atitm.Ay AvAs.fV-w. ·»· '··&··, ^-a-V / ·; í.t' Si.x.,.,. ' j''d Λ.••'X. ’-'W.X.p WXÍp'í í.

A le-xrasban az alábbi referenciákat említjük:

Barr és munkatársai, Biotechnigues, 4:428 (1988),

Beaucage és munkatársai, Tetraheáron Letters, .22:1859 (1981), Botstein, Gene, 8:17 (1978),

Szinten, Ml A, The Vírusos: The Togavíridae and. Flaviviridae (sorozat•-szerkesztő; Fraenkel-Conrat és Wagner, kötet-szerkesztő; Schiesinger és Schiesinger, Flenum Press), 327-374, oldal,

Broach, Moíecular Blology of the Yeast saccharomyces, I, kötet, 445, oldal, Colé Spring Harbor Press (1981),

Broach és munkatársai, Meth. Ena,, 101:307 (1983),

Brown és munkatársai, Methods ín Enzymology, 68:109 (1979),

Byrne és munkatársai, Muciéit Aoíds Rés., 16:4165 (1988),

Castle és munkatársai, Virology, 119:18 (1988),

Chang és munkatársai, Matúra, 198:1058 <1977),

Chirgwin és munkatársai, Bíochamistry, 18:5294 (1979),

Choo és munkatársai, Science, 244:359 (1989),

Chomozynski és Sacchi, Analytical Eiochemistry, 182:156 (1987),

Clewell és munkatársai, Proc. Natl. Acad, Sci,, HSA, 82:1159 (1969),

X 4 X 4 44 XX

X X * 4 4 4 4

4X4 v * *44

4 4 4 κ X 4

Χ444 44 4*44 4444 4 4

Glawell, 3, Seetericd ., 110: 66? (1972) ,

Céhén, Pröe.Nstl.Acad.Sei,,08Α, 69: 2110 (1972) tousens ue uoar ás munkatársai, Gene 61: 295 (198?), és munkatársai Proc,Hall, Acad.Sci. ,0SA, £28/ (19835 > öraesman és munkatársai, 3.Infest.Disaása, 151; 761 (1985), Fainstone ás munkatársai, 3»In£.Dis., 144: 388 (19815,

Fainstone és munkatársai, Infsction adn Immunology, 41; 816 (1985). Feinstons, S.M. és K'ooínagle, 3.H. New Fngl.G.Med., 511; 185 (19841 Fialds és Knips, Pundsmental Virology (Ravan Press, N.¥. '(1988), fisra és munkatársai, Natúré., 275: 115 (19/8),

Gerely, R«3, és munkatársai Virsl Hepatitis esd Liver Öisesse (Vyss, 8.N., Dxenelag, XL. és Hooínagle, 3.H, szerkesztésében

Gruna és Stratton, Inc., 23-47, oldal (1984),

Goeddel és munkatársai, Hucleic Acids Rés,., 8g 405/ (1980),

Sraham és Van dér Eb, Virolog.y, 52; 546 (1978),

Grunstein és H.ogness, Prés,Háti.Acad.Sci,, USA, 73; 3961 (1975), Srych és munkatársai, Natúré, 516; 74 (1985),

Gubler és Hoftmann, Gene, 25: 263 (19835,

Hánh és munkatársai, Virólógy, 162: 16? (19885,

Ken, Bioohemistry, 26: 1617 (19875,

Hammarling és munkatársai, Honocional Antibodies and T-Csll Kybrodomas C19815,

Hess ég munkatársai, G. Adv.Enry.ma Rag., 77 249 (1968),

Hinnan és munkatársai, Proc. Heti. Acad. Sci., ?5 : 192$^ (1978), Hitréman és munkatársai, 3·. Síel .Chem,, 255; 2073 (1980),

Holland és munkatársai, Biochemistry, l?x 4900 (1978),

Holland, 3. Biot. Chem., 256; 1585 (1981), * φ φ·

Houghton és munkatársai, Huclsic Acids Rés., 9: 24? (198*y, Huynh, T.V, és munka társai DMA Cloning Tschniquesj A Practical

Approach (Szerkesztő 8. Olover Ed,, 1RL Press, Oxford, ü.k, 49-78, oldal (1985),

Immun. Rev\, Ő2; 18$ (1982),

Iwarson, British Medical 3., 295; 946 (1987),

Z 1 ü ö ő , $

Rennett és munkatársai, Monoclonal Antibodies (1980)

Kuo és munkatársai, Science, ,244; 562 (1989),

Kyte és Ooclittls, 8. Mol.Siol., ,157; 105-152 (1982),

Landegren és munkatársai. Science, 242t 229 (1988),

Maniatis, T., ás munkatársai, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Goid Spring Harbor Press, Ccld Spring Karbor, N.Y.) (1982),

Matthsws ás Krioka, Ánalytical Siochemistry, 169: 1 (1988), Msthods. m enzymology (Academic Press)

Mittlín., Clinical Chem,, . · 55; 1819 (1982),

Laemmii, Hatura, 227; 688 (1970),

Lee és munkatársai, Science, 259; 1288 (1988),

Lch és munkatársai, Science, 245; 21? (1989), ’Maokow és munkatársai, Virology, 159; 217 (1987),

Mayer és Walker szerkesztésében, Xmmonochemicsl Methods in

Cell and Molecular Biology (Academic Press, London) (198?),

Mayymí és munkatársai, Oapanese 3. Exp.Msd,, 88: 167 <199g>, Maxam és munkatársai, Methods in Cnzymclogy, 6.5; 499 (1980), MacHamara és munkatársai,· Science, 226; 152$ (1984),

Messíng és munkatársai, Muclsic Acids Rés., 9c 509 (1981), Messing, Methods in Enzymology, 101; 28-5?

Methods in Enzymology (Academic Press) (1985) xx φφ χ Α· Φ Φ * X Φ Φ X •Φ X * * Φ Φ <

ΧΦΦ>* *Χ ΑΦ*Α ^Φ·ΦΦ ΦΦ

Michelie és munkatársai Int, Symposium on Viral Hepatitis*, Konaíh The Viruses; The Togavíradea and Plavxviridae (Sorozat szerkesztek: Fraenkei-Ccnrat és Wagner, kötet szerkesztők : Schlesinger és Schlesinger, Plenom Press), 375-440, oldal (1886),

Hurakawa és munkatársai DHA, 7; 28? (1988),

Nagahuma és munkatársai Anal♦Biochem., 141; 24 (1984),, harang és munkatársai Methods in Enzymology, 68: 90 (1979),

Neurath és munkatársai, Science, 224: 392 (1984), Nisonofí és munkatársai, Clin.Immunoi«Immunopathol.> 21; 397-406 (1981), uverby, L.K., Curr,Hepatol., 5p 49 (1985),

Co.rr*Hspatol., 8: 65 (1986),

7« 35 Π o.a 7 3 överby,L<R. , Överby, L*R,

Eeleg, hatóra, 221 ; 193 (1969),

Ptefterkorn és Shspiro, Comprehensive Virclogy, 2, kötet (Frsenkel-Conrat és Wagner szerkesztése, ©ds. , Plenom, H,,Y.) 171-230 oldal (1974),

Princa, Anno .Rév .Míerohiol. , 37; 217 (1983),

Pice és munkatársai, Science,, 229: 726 (1985),

Pice és munkatársai The Viruses; The Togavirídae and Flavivirids CSorozat.szerkesztők; Fraenksl-Conrst és Wagner, kötet szerkesztők: Schlesinger és Schlesinger, Plenom Press), 279-328* oldal (1986),

Koebrig, The Viruses; The Togavirídae and Fiáviviriőae (Sorozatszerkesztők: Fraenkel-Cnnrat és Wagner, kötet szerkesztek: Schlesinger ée Schlesinger, Plánom Press) (1986),

Φ * •ΦΦΦ

Φ χ. φ X Φ Φ X ψ « * φ X ·Φ φ φφφ X * χ

ΧΦΦΦ. φφί Φ’Φφφ -φφφφ **

ΦΦφφ

Rbsenöerg és munkatársai, Natúré, 312:- 7 (.1984),

Sadler és munkatársai, 8ane, 8g 279 (1980),

Saiki és munkatársai, Science, 210: 1150 (1985),

Saiki és munkatársai, Natúré·, 324: 161 0.986),

Saiki és munkatársai, Science., 219: 487 (1988),

Sanger és munkatársai, Proc. Natl.Acad-Sci ., USA 74; 5461 (1977)., Scharf és munkatársai, Science, 231: 1878 (1586),

Scéleelncer és munkatársai, 8.Virol., 68; 1151 0.986),

Schreier, H., és munkatársai Hybridcma Techniques (1980),

Scopes, Protein Fu.riticat.ion, Frinciples and Practice, 2, kiadás (Spr.inger-Verisc, N.Y.) 0.984),

Shimatake és munkatársai, Hatóra, 292; 128 (1981),

Shigekawa és Dower, BiöTechniques. 6: 742 (1988),

Steimer és munkatársai vice.

AesceStellát, The Togaviruses (Szerkesztő: R.U. Schlesingei míc Press, N.Y.) 584-622. oldal (1980),

Sumiyoshi és munkatársai, Viroiogy., 161; 49? (1987),

Taylor és munkatársai, Biochem. Biophys, Acta, 442: 124 (1976), Towbin és munkatársai, Proc.Háti.Acad.Sói., USA, 76: 4150 (1979), Tsu és Herzenberg, Sélected Methods in Ceiluiar Immunology (é.H.Freeman és Co.) 371-391. oldal (1588),

V ytde haag és munkatá r s a1> 8.1mmuηο1,, 114; 12 2 5 (198 5), Valenzueia, F·, Natúré, 298; 144 (1882),

Valenzuela, P., és munkatársai, Hepatitis 8 (Miliman,!,, se munka társai szerkesztése rlenum rress) 225-21&. otdel

Warner, ÖHA, O 401 (1984), (1984)

Φ * X ψ ·*·<· Φ Φ Φ X φ X X * Φ * Φ Φ φ φΧ-Φ φ Φ ΧΦΦ χ φφφ X X Φ

ΦΦ*φ Φφ Φ*ΦΦ ΦΦΦΧ -X*

Wu és Grossman, Methods ín £nzymc DNA, 8. rész (1987),

154.kötet

Recombinant

Wu,	Methods	in Pnzymoiogy	155, t	;etat, Rscomhinant 0	NA, P. r
	(17875
<, ο 1 £	er, Nucleic	A	cids Rés,	» ifi·	4487 (1782).
Olts	ItjSÁabadalm	X	...Icitácek	c
ü, S,	Patent	No,	A	,341,741	számú	amerikai	szabadalmi	leírás
! S 0 V» < V> Φ	Patent	Ne.	4	V' ,\i Xs X	számo	amerikai	szabadalmi	leírás,
é, b v	Patent	No,	A	,427,783	számú	amerikai	szabadalmi	leírás,
U,. S .	Patent	Ne.	4	,444,887	számé	amerikai	a z a h a ö s 1 m 1	leírás,
O.S,	Patent	No,	4	,444,917	számú	amer lkai	szabadalmi	leir ás,
tus.	Patent	No.	4	,472,500	számé	amerikai	szabadalmi	leírás,
b.S„	Patent	No.	4	,491,432	számú	amerikai	szabadalmi	leírás,
(j V S A	Patent	Hö,	4	,493,890	számé	amerikai	szabadalmi	leírás,
U > S V	> S5 <' Π b	Ro«	A	, 485,2U2	számú	amerikai	szabadalmi	1SÜ <3 s,
ü.S.	Patent	No,	A	,458,044	számé	amerikai	szabadalmi	leírás,
y y> .·	Paterst	Ne.	4	,848,105	számú	amerikai	szabadalmi	V

ΦΦ φΑ Α* ΦΑ *« φ A Α χ Α Φ X X χ AAA A A ΑΑ·*

Α χ Φ A A Α »

ΑΑφφ *> AAAÁ ***ΐ ΑΑ

A ροΡ-Α, ροή'-3 hepatitisz (ΝΑΜΒΗ) egy fertőző betegség vagy betegségcsalád, amely minden valószínűség szerint virus-indukált, és amely megkülönböztethető más, vírusokhoz köthető májbetegségektől, ideértve azokat, amelyeket ismert hepatitisz vírusok okoznak, azaz a hepatitisz A virus (HAVj , hepatitisz δ vírus (HBV) és delta hepatitisz virus (HDV), mint ahogy megkülönböztethető a hepatitisz indukálta citomegalovirustöl (CMV) vagy az Bpstei.n-.8arr vírustól (EBV) . A NAH8H-t először vérátömlesztést kapott egyénekben fedezték fel. Az emberről a csimpánzra történő átvihetőség és a csimpánzokban megvalósuló sorozatos passzálhatőság bizonyítékot nyújtott arra, hogy a MAHBH átvihető fertőző ágenshez vagy ágensekhez kötött.

Járványügyi evidenciák megerősítik, hogy három tipusu MAH88 lehetséges; a vízhez kötött járványtípus, a vérhez vagy az injekciöstü jelenlétéhez kapcsolható típus és az elszórtan bekövetkező (közösségben szerzett) típus, ugyanakkor, a NAHBH-t okozó ágensek száma nem ismeretes.

Több MANBV jelölt létezik. Lásd például:: Prinoe (1983), Feinstone és Hoofnagle (1984), överby (1985, 1988, 1987) összefoglaló munkáit és Iwarson (1987) dolgozatát. Ugyanakkor, nincs konkrét bizonyítéka annak, hogy ezen jelöltek bármelyike képviseli a fertőző MANSH ágenst.

Komoly igény mutatkozik érzékeny, specifikus módszerek Iránt, amelyekkel szűrhetjük és azonosíthatjuk a NANBV hordozókat és a NANSV fertőzött vért és vártöl készült termékeket. A várátΦΦφχ ΦΦ *Φ*Φ φφ őmiesztés után jelentkező hepatitisz (PTK) a transz.fuzionált ciensek körülbelül lö Vában jelentkezik, ezek 90 %-a KANBH eset. A legnagyobb probléma ebben a betegségben az, hogy gyakran (az esetek 25 - 55 Vában) krónikus májleépülés következik be,

Az egészségügy, úgyszintén a. NANBH átvitele vérrel és a vérből készült termékekkel vagy a szorosabb személyi kontaktussal használható szkrinínget igényei, diagnosztizálást és lehetőséget a prognózisra, a NANBV-vei összefüggő nukleinsavak, antigének és antitestek kimutatására.

Specifikus polinukleotidok hibridizációs méréssel történő' meghatározására az irodalomban módszereket találunk. Erre vonatkozóan lásd például Matthews és Kricka, Analytical Mo~ chemistry, 169:1. (1988), Landegren és munkatársai, Science, 242-229 (1988) és Míttlln, Clinical Chem,, 35:181.9 (1389), továbbá az 1989, szeptember 9-én kiadott 4,868.105 számú amerikai szabadalmi leírás és az 1927, junius 16~án publikált, 22.5807 sorszámú EPC oublikáció.

Mielőtt a feltalálók felfedezték volna a HCV-t, a specifikus polinukieotidők. hibridizációval történő izolálása és/vagy detektálása nem volt használható a HCV szkriningjéhez♦ A feltalálók felfedezése anyagokat és módszereket biztosit a virus genom szekvenciáinak izolálására, ezt a W030/14435 számú PCT publikáció n és lejjebb találjuk meg.

φ* φ* χ ν &

Φ «ΛΦ

Φ χ»φφ φ φ·φ * Φτ φφ» φ Φ φ φ φφχφ ΦφΦΑ

A találmány egyik tárgya eljárás HCV szekvencia kimutatására, feltehetően HCV poiinukleotidot tartalmazó, elemzendő ribonukleinsav szálban, ahol a HCV poiinukleotid egy kiválasztott cél-régiót tartalmaz, amely eljárás abban áll, hogy

a) ei az elemzendő poiinukleotid szálban levő HCV szekvenciához hibridizálddni képes oligomert (oligomereket) állítunk elő, ahol az oligomer a HCV genom (lásd az 1, ábrán, megadott szekvenciát) alábbi régióival komplementer oligonukleotidok közöl tartalmaz egy polinukleotid szekvenciát: 18-45, 49-78, 82-111, 115-144,

148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394,

398-427 és 457-486;

az elemzendő szálat az a) szerinti oiigomerrel (oligomerekkei) inkubáljuk, amikor specifikus hibrid duplexek jönnek létre a célszekvencia (target) és az ehhez kötődd (targeting) szekvencia között; és kimutatjuk az esetleg jelenlevő célrégid és az oligomer (oligomerek) között létrejött hibrideket.

frfrx* χ

A találmány egy további tárgya eljárás HCV szekvencia kimutatására, feltehetően HCV polínukleotidot tartalmazó, elemzendő szálban, ahol a HCV polinukleotid egy kiválasztott célrégiőt tartalmaz, amely abban áll, hogy

a)

b) ti az elemzendő polinukleotid szálban levő HCV szekvenciához hibridizáiődni képes olígomert (oligomereket) állítunk elő, ahol as oligomer a HCV genom (lásd az

1. ábrán, megadott szekvenciát) alábbi régiói vad komplementer oligonukleotidok közül tartalmaz egy polinukleotid szekvenciát: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144,

148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394,

398-427 és 457-486;

az elemzendő szálat az a) ezerinti oligomerrel (oligomerekkel) inkubáljuk, amikor specifikus hibrid duplexek jönnek létre a célszekvencia és az ehhez kötődő szekvencia között; ős kimutatjuk az esetleges célszekvencia és az oligomer (oligomerek) más oligomerrel (oligomerekkel) alkotott hibridjeit, ahol a másik oligomer íoligomerek) a HCV genom (lásd az 1, ábrát) alábbi régióival komplementer oligonukleotidok közül tartalmaz egy polinuk1eo11d szekvene i á t: 16-45» 48-78, 8 2-111» 115-144, * * <· Φ * * * * Φ * φφφφ

148-177, 211-240# 242-271, 275-304, 332-301, 365-324

328-427 és 457-486,

A találmány egy további tárgya módszer HCV-mentes vé előállítására, amely eljárás abból áll, hogy:

egy HCV célszekvenciát feltehetően tartalmazó vérmi tából elemzendő nukleinsavakat állítunk elő;

b)

d) az elemzendő polinukleotld szálban levő «cv szekvenciához hibridizálódni képes oligomert (oligomereket) állítunk elő, ahol az oligomer a HCV genom (lásd az

1. ábrán megadott szekvenciát) alábbi régióival komp lementer oligonukleotidok közül tartalmaz egy polinukleotid szekvenciát: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394

328-427 ás 457-486;

az a) és a b) szerinti .szekvenciákat olyan körülmények között reagáltatjuk, ahol a kapcsolódó szék vencia és a cél-szekvencia, ha jelen van, egy polínukleotid duplexet képez;

a ö) szerint esetleg képződő duplexet kimutatjuk, ás

X Φ a o) szerint végzett vizsgalatban komplexeket nem mutató vért megőrizzük.

A találmány egy következő tárgya eljárás HCV-tői mentes vér előállítására, amely abban áll, hogy:

a) ϊ-\ V c,>

ő)

HCV célszekvenciát feltehetően tartalmasé vérmintából elemzendő nukielnssvakat állítunk, elő;

az elemzendő polinukleotid szálban levő HCV szekvenciával bíbridlzálóőni képes oligomeri (olígomereket.) állítunk elő, ahol. az oligomer egy nolinukleotiö ezekven' ólát tartalmaz;

Az a) és a b) szerinti szekvenciákat olyan körülmények között reagáltatjuk, ahol a kapcsolódó szekvencia és a célszekvencia egy polinukleotid. duplexet képez;

a c) ezerinti reakcióban esetleg képződött duplexet kikutatjuk egy olyan másik oligomer,re,1 (oligomerokkal) , ahol ez a másik oligomer (oligomerek) egy polinukleotid szekvenciát tartalmaz;

a d) szerinti vizsgálatban komplexeket nem adó vért megőrizzük.

XX XX XX

X χ X X * χχχ ♦ » > χχχχ χχχ:χ χ

CA29	fi SS ’
(kS~	Ί «« χχΛζχ.
4Gb,	3?b
19g,	26g

ί\ W <>' ί -- XX >' XX χ ·$ > ο

As 1. ábrán bemutatjuk a leírásban megadott ki ónból és a WO9Q/X4436 sorszámú PCT publikációban ismertetett HCV cDNS szekvenciából összeállított HCV cDNS szekvenciát. A szekvencia a alábbi klönokból származik: 5‘-klón32, bli4a, 18g, ag30a, CA205a €A23öa, CA2X6a, píl4a, CA16?b, CAl56e, CA84a, CAS9a·, K3~l (kS-l-nek ís nevezik), 2áj, 13i, X2f, 141, Xib, 7f, 7e, 8h, 33c, 32, 33b, .25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 3Sf, íSg, ISe, bSa, X6jh, 6k és pl31jh.

Az ábrán a bárom vízszintes vonal a szekvencia fölött jelzi a feltételezett metionin iniciácíós kodon helyét. Az ábrán magadjuk a HCV cDNS által meghatározott feltételezett polipratein aminosav szekvenciáját is. A HCVi klónozott dezoxl-ribonukleinsavaiban levő heterogenitásokat az aminosavaknál jelezzük, a: aminosavakat a nagy ORF (open reading frame, nyitott leolvasási keret) kódoló szekvencia felett adjuk meg; a zárójelekkel jelezzük, hogy a HCV komplementer dezoxí-ribonukleínsavában a heterogenitásokat az 5 - vagy a 3 -végen vagy ahhoz közel találtuk.

A 2, -ábrán bemutatunk különböző földrajzi helyeken (Japán és Egyesült Államok) izolált öt különböző HCV izolátum konszenzus dezoxl-ribonukleinsav szekvenciáit<

A 3, ábrán bemutatjuk azon jelölőprőbák szekvenciáit, amelyeket a 3. példában használtunk a biológiai mintákban levő HCV ribonukleinsav detektálásáta>

φφ φ φ >·

Α 4. ábrán megadjuk a 3. ábra szerinti próbák felsorolását HCVl-gyel, mégpedig az 1, ábra szerinti sorszámozással.

A “hepatitisz C vírus” (HCV) kifejezést a területen dolgozó olyan h’ANBH kórokozó ágensekre tartják fenn, amelyeket mindezidáig nem fedeztek fel, A HCV prototípus izolátumot a 122,714 sorszámú amerikai elsőbbségi iratban azonosították, (lásd továbbá & 318,216 sorszámú EPO publikált iratot) ·. A HCV betűcsoport magába foglalja a hasonló virusfajok uj izolátornált is,

A terminológia kiterjesztését jelenti az# hogy hepatitisz C kife jezé.sss.1 jelöljük a korábban, a vérrel Összefüggő NAHB hepatitisz nek (8B-NAH8H), HCV által okozott betegséget is, A leírásban a NANBH-t és a hepatitisz C jelzést egymással felcserélve is haszA HCV egy virusfaj, amelynek patogén törzsei okozzák a BB-BANBB-t, Bzek lehetnek felerősödött törzsek vagy megjelenő defaktív részecskék# amely utóbbiak, a patogén törzsekből erednek Ahogy az az alábbiakból kiderül, a HCV genom ribonukleinsavból áll (RHS). Ismeretes# hogy a ribonukleinsavat tartalmazó vírusok spontán igen nagy mértékben mutálnak# azaz beépült nukleotidon'ként 18~·$ - ItT⁴ gyakorisággal, az Irodalom szerint (Fields és Knipe /1986/) . így,., mivel a ribonukleinsav vírusokra jellemző a genotípus heterogenitása és változékonysága, többféle tőrzs/izolátum létezik, amelyek a HCV fajokon belül lehetnek virulensek vagy avirulensek. A jelen leírásban ismertetett kompozíciók és frfrfr frfrfrfr ΦΦ fr frfriX * * fr fr fr fr· X * * * fr módszerek alapján eljárva képesek vagyunk a különböző HCV törzse: vagy izolátumok szaporítására, azonosítására, kimutatására ás izolálására.

Több különböző HCV törzset ás ízolátumot azonosítottak (lásd a W090/14436 sorszámú PCT leírást). Egy ilyen prototípusként kezelt törzset vagy Ízolátumot CDC/HCVl-nek (vagy HCVl-nek) neveztek ei, Egy törzsről vagy izoláiumről szerzett információ, például genomjának részleges szekvenciája elegendő a témában jártas szakemberek számára ahhoz, hogy uj törzseket vagy ízolátumokat izoláljanak standard technikákat alkalmazva, és el·· dönthessék azt, hogy ezek az uj törzsek vagy izolátumok .HCV-vel azonosithatók~e> Az alábbiakban például több különböző törzset/izolátumot Írunk. ie< Ezeket a törzseket a HCVI genomiális szekvenciádának ismeretében izoláltuk több humán szérumból, amelyeket különböző földrajzi területekről nyertünk.

A W0VO/1443S sorszámú PCT leírásban ismertetett techni kákát felhasználva a HCVi genomiális ribonukleinsavának struktúráját és nukleotid szekvenciáját leírtuk. A genom olyan egyszáiú ribonukleinsav, amely körülbelül 10.000 nukleotiöot tartalmaz.

A genom pozitív szálú, és tartalmaz egy folyamatos transzlációs nyitott leolvasási keretet (open readíng frame, ORP), amely egy 3.000 aminosavból állő poliproteínt határoz meg. Az öHP szekvencián belül a szerkezeti protein (proteinek) valószínűleg az terminális régió első negyedében vannak kódolva, a nem-strukturális proteinek nagy részével együtt, összehasonlítva a φφ φ* * φ φ φ φ φ > χ * φ •φφφ* φφ bt b’ φ φ φφ* φ Φ φ X φφφφ ΧΦφφ φφ.

szekvenciát az összes ismert -vírus szekvenciával, kicsi, de szignifikáns, kolinaári-z homolőgia volt megfigyelhető a Flavivirus család nem-strukturális proteinjeivel és a pestivirusokkal (ezeket mostanában a Flavivirus családba sorolják).

A flavivirus poliprotein tartalmaz - az aminoterminális végtől a karboxilterminális végig haladva - nukleokapszid proteint (C), mátrix proteint (bj , burokproteint (F) és nem-strukturális proteineket (NS) 1,2(atb),3,4(a*b) és 5. A HCV1 nukleotid szekvenciája által kódolt vélt aminosav szekvencia alapján a HCV poliprotein N-terminális végének legszélén egy kisméretű dómén mind méretben, mind nagymennyiségű bázikus aminosav-tartalmában hasonlónak, látszik a flavivirusok poiiproteinjelnek N-terminális végén talált nukleokapszid proteinhez CC) . A HCV

2,3,4 5 (NS2-5) jellel jelölt, nem-strukturális proteinjei és a sárgaláz vírus {YFV) nem-strukturális proteinje hidropátia szempontjából és nagyságuk alapján is hasonlöaknak tűnnek, bár aminosav szekvenciáikban különbségek vannak. Ugyanakkor, az YFV poliproteinnek megfelelő HCV régió, amely tartalmazza az M, F és NSi proteint, nem csupán szekvenciájában, de méretében és hidropátiás tulajdonságaiban is különbözik. Így, bár a HCV genom bizonyos doménjeit e helyen például MSI vagy NS2 jellel jelölhetjük, emlékeznünk kell arra, hogy ezek az állítások spekulatívak, ugyanis jelentős különbségek lehetnek a HCV család és a flavivírusok között, amelyeket eddig még nem fogadtak el.

-η - tv n‘ φφ ΐΐψ* ****

A HCV különböző törzsei, izoiátumai vagy szubtipusai valószínűleg tartalmaznak a BCV.l-töl különböző aminosavakat és nukleinsavakat. Sok izolátum várhatóan nagymértékű (azaz nagyobb mint 40 %-os) homológiát mutat a teljes aminosav szekvenciában a HCV1 szekvenciájával összehasonlítva, Ugyanakkor kimutathatják, hogy kisebb .homoiógiávai rendelkező HCV izolátumok is léteznek. Ezeket HCV-nek azonosíthatják, különböző kritériumok alapján, például a közelítően 9000 - Í2000 nukleotláhól állő ORF létezése alapján, amely a HCVl-hes hasonló nagyságú poliproteint kódol, továbbá, mert a kódolt poliprotein hasonló hidrofób és/vagy anti gán tulajdonsága, mint a HCV1 poiiproteinje, továbbá például azért, mert jelen van a. HCV1 vírusra jellemző kolineáris peptid szekvencia. Ezenkívül elképzelhető, hogy a genom egy pozitív szálú ribonukleinsav (RNS).

Mindegyik HCV izolátnm legalább egy olyan epitopot kódol, amely a jelen leírásban megadott HCV cDME-ek által kódolt epitoppal immunolögiaílag azonos (azaz imunológiailag keresztreaktív), Előnyösen az epltop az itt leirt aminosav szekvenciában szerepei, és egyedül jellemző a HCV-re, összehasonlítva az ismert patogénekkel. Az epltop egyedülállósága az anti.-HCV antitestekkel való immunológiai reaktivitás alapján meghatározható, és megállapítható az immunológiai reaktivitás hiánya az ismert patogének antitestjelvei szemben,

A HCV törzsek és izolátumok euoinoionárise.n rokonok.

Így várható, hogy a genom nukleotid szinten homológ, legalább

ΦΦ $

♦*« φ φφφ φ φ φ

ΦΦΦ* χχ %-osan vagy nagyobb mértékben, valószínűleg 50 %~osan vagy jobban, még valószínűbben Sö %~csan vagy nagyobb mértékben, és leginkább elvárhatóan 38 %-osan, vagy még ennél. ís nagyobb mértékben . Ezenkívül várhatóan előfordulnak legalább 13 nukleotidból álló rokon szekvenciák is. Megjegyzendő, hogy vannak variábilis és hípervaríábilis régiók a HCV genomban, ezért várhatóan ezekben a régiókban a homológ!a szignifikánsan kisebb, mint a teljes genomban, A vélt HCV törzs genomi szekvenciájának azonossága például a CDC/HCVl cDHS szekvenciával a szakemberek körében ismert technikákkal állapítható meg. Például megállapítható az azonosság a vélt HCV vírusból származó polinukleotid szekvenciájának és ss alábbiakban Isirt HCV cdms szekvencia direkt összehasonlításával. Végezhetjük az összehasonlítást a polinukleotidok hibrid!rációj ával, olyan reakciökörülmények között, amikor stabil duplexek keletkeznek a homológ régiók között (például azok között,, .amelyeket előzőleg emésztéskor használtunk), egyszálű szakaszokra specifikus nukleázos emésztést és az emésztett fragmensek méret-meghatározását követően .

Mivel a HCV törzsek vagy Ízoiátumok evolúciós szempontból egymással rokonságban vannak, a feltételezett HCV törzsek vagy ízoiátumok azonos.!thatók a polipeptidjeik homológiája alapján. Általában a HCV törzsek vagy izolátumok várhatóan legalább 40 %-os, valószínűbben 50 %-os, még valószínűbben több mint 78 %-os, és leginkább várhatóan, több mint 80 %-os homolőΦί· X Φ ψ« φφ

Φ Φ Φ

ΦΦΦΦ φφΧ *ΦΦ φφ-φ.φ piát mutatnak , egyesek pedig még 90 %-nál nagyobb homológiát is mutathatnak polipeptid szinten. Az aminosav szekvenciában mutatkozó homológía meghatározásának technikái a szakemberek körében ismertek. Az aminosav szekvencia meghatározható például közvetlenül, és az eredmény összehasonlítható a leírásban megadott szekvenciával. Eljárhatunk úgy is, hogy a feltételezett HCV genomi anyagának nukleotid szekvenciáját határozzuk meg (általában egy cbNS intermedier molekulán át), a nukleotid szekvenciában kódolt feltételezett aminosav szekvencia leírható, és a megfelelő régiók összehasonlíthatók.

A leírásban agy kiválasztott szekvenciától ”származtatott” poiinukleotid alatt egy olyan poiinukleotid szekvenciát értünk, amely legkevesebb. 6, előnyösen legalább 8, előnyösebben legalább 10 - 12, és legelőnyösebben legalább 15 - 20 nukleotídot tartalmaz, amely régió megfelel a kiválasztott nukleotid szekvencia régiójának. A megfelelő” kifejezés azt jelenti, hogy az adott szakasz homológ vagy komplementer a kiválasztott szekvenciával. Előnyös, ha a régió, amelyből a polinukleotidot származtattuk, homológ vagy komplementer ahhoz a szekvenciához, amely a HCV genomban egyedülálló, azaz csak itt szerepel, A legelőnyösebb helyzet az, amikor a származtatott szekvencia homológ vagy komplementer egy olyan szekvenciával, amely az összes vagy a legtöbb HCV ízolátumban egyedülálló. Azt, hogy a HCV genomban egy szekvencia egyedülálló-e avagy sem,- a szakemberek körében ismert technikákat alkalmazva meghatározhatjuk. A szekvencia például φ* φ φ φ χ.

φφφ φφ φφφ* φφφφ összehasonlítható az adatbankokban (például a Genebank-ban) levő szekvenciákkal, megállapíthatjuk, hogy a vizsgált régió jelen van-e nem azonosított vagy más organizmusokban. A szekvencia összehasonlítható más vírusok ismert szekvenciáival is, köztük szókéval, amelyekről ismeretes, hogy hepatitiszt indukálnak, például a BAV, HBV, HBV ás a Flaviviridae család tagjaival. A származtatott szekvencia megfelelése vagy különbözősége más szekvenciáktól megfelelő szigorú körülmények között végzett hibridizációval is meghatározható. A nukleinsav szekvenciák komplementaritásának meghatározására használt hibridizációs technikák a szakemberek körében ismertek., és az alábbiakban tárgyaljuk. Az irodaómban is megtalálhatók, a fenti módszerek.

lásd például Maniatis a hibridizációval kiés munkatársai munkáját (1982) izenkivül , alakult duplex polinukleotidok átfedését is meghatározhatjuk ismert technikákkal, ideértve például az Sl nukleázzal kivitelezett emésztést, ez a nukieáz a duplex polinukleotidok egyszálú szakaszait emészti. Azok közül a régiók közűi, amelyekből tipikus dezoxí-ribonukleinsav szekvenciák származtathatók”, megemlítjük, nem limitáló jelleggel, például az epitopokat, kódoló régiókat és a nam-átirt és/vagy nem-transzlatált régiókat.

A származtatott polinukleotiöot nem származtatjuk szükségszerűen a bemutatott nukleotid szekvenciából, bármely más utón is generálható, például kémiai szintézissel, dezoxí-ribonukleinsav replikádéval, reverz transzkripcióval vagy transzkripcióval. Ezenkívül a kiválasztott szekvenciának rnegfe22

φ.φ φ <

φ φ φ· φ φφφ φ φ φ φ' lelő régiók kombinációi & szakterületen ismert módon# tervezetten módosíthatók.

A rekombináns polinukleotld kifejezés alatt genomiális, cDNS, szemiszíntetikus vagy szintetikus eredetű polinukleotidot értünk, amely eredete vagy a vele végzett manipuláció folytán

1< nincs kapcsolatban agy olyan poiinukleotiddal, vagy annak egy részével, amivel a természetben aszociálva van,

2« olyan polinukleotidhoz kapcsolódik# amelyhez a természetben soha, vagy

Ϋλί'Λ'Γί ** aatri aIA.

O¹ < 'Os Ό.* ά.<»ίνθ· χφ φφ*«χαΦ\«. Ό.- >

A leírásban polinukleotld* kifejezés alatt bármilyen hosszúságú polimer nukleotidokat értünk, amelyek lehetnek r.ibonukleotídok és dezoxi-ribonukleotidok. 8z a kifejezés csak a molekula primer struktúrájára utal. A kifejezés két- és egyszálú dezoxi-ribonukleinsavat ás ribonukleinsavat is jelent. A kifejezés használatakor gondolhatunk ismert módosulatokra is, például a szakterületen ismert jelólt molekulákra, metilezett# hurkokkal rendelkező, egy vagy több, a természetben előforduló nukleotid-analógot tartaimaző szálat, internukleotid módosulatokat, mint például olyan szálakat, amelyek töltés nélküli (például metíl-foszfonátok, foszfo-triészterek, foszfo-aaidátok, frfr frfr frfr karbamátok, stb.) vagy töltéssel rendelkező (például foszforo-tioátok, foszforo-ditioátok, stb,} csoportokat hordoznak, olyanokat, amelyek kiegészítő csoportokat, például proteineket (ideértve nukleázokat, tozinokat, antitesteket, szignálpeptideket, poli-L-lizint, stb.), amelyek szálak közötti csoportokat hordoznak (például akridin, pszoralin, stb.), azokat, amelyek kólátokat tartaImaznak {például fémeket, radioaktív fémeket, bóratomot, oxidativ fémeket, stb.), továbbá azokat, amelyek alkilezve vannak, azokat, amelyek módosult csoportokat hordoznak (például alfa-anomsr nukleinsavakat, stb.), továbbá a polinukleotidok nem módosult alakjait is ideértjük.

Szensz szál alatt a leírásban egy olyan nukleinsavat értünk, amely hordozza a hírvivő ribonukleinsavval homológ szekvenciát. Az anti--szensz szál alatt a szensz szállal komple menter szekvenciát értjük.

A leírásban egy vírus pozitív szélű genomja alatt, legyen az ribonukleinsav, vagy dezoxi-ribonukleinsav, olyan geno miális polínukleotidot értünk, amely legalább egy vírus polipeptidet kódol. Pozitív szálú ribonukleinsav vírusok többek között Togavirídae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae és a Caliciviridae. Idetartoznak a Flaviviridae-k is, amelyeket koráb bán Togaviridae-nek határoztak meg. Ezek a vírusok tipikusan egyszálú vírusok {lásd Fields és Knipe, 1886}, ,χ „

Ο *,**»*

ΦΑΑΧ XX ΦΦίχ.. _.Γ.~ * * νν »ΑΑ> ΦΑΑφ φ'φ

A leírásban primer kifejezés alatt olyan oligomert értünk, amely megfelelő feltételek között a polinukieotid lánc szintézisének elindulásakor iniciációs pontként működik. A primer teljesen vagy részben komplementer a másolandó polinukieotid szál egy régiójával. Így, a hibridizációt megengedő körülmények között a primer kapcsolódni fog a vizsgálandó szál komplementerrégiójához. Megfelelő reagensek adagolásakor (például polimeráz, nukleotid-trifoszfátok és mások) a primer meghosszabbodik a polimerizáló enzim révén, és a vizsgálandó szál másolata képződik.

A primer lehet egyszálű vagy lehat részben vagy teljes mértékben kétszálu.

Az elemzendő polinukieotid és az “elemzendő szál” kifejezés alatt olyan egyszálű vagy kétazélu nukleínsv molekulát értünk, amely feltételezhetően tartalmaz egy célszekvenciát (target), és amely jelen lehet egy biológiai mintában.

Az “oligomer kifejezés alatt a leírásban prímeteket vagy próbákat értünk. Az oligomer kifejezés nem utal a molekula nagyságára. Ugyanakkor, a tipikus oligomerek 1000 nukleotidnál nem nagyobbak, gyakrabban kisebbek 500 nukleotidnál, még gyakrabban nem nagyobbak 250 nukleotidnál; lehetnek 10 0 és 75 nukleotidnál is kisebbek, és lőhetnek 50 nukleotidnál nem nagyobb bőszszuságuak xs.

A próba kifejezés alatt olyan szerkezetű molekulát értünk, amely tartalmaz egy polinukleotidot, amely viszont hibridet alkot egy célszekvenciával (target), mivel a próbában legalább égy szekvencia koz^plementer a célrégió (target régió) egy +Φ W.SA w.

X Φ Φ χ. * Φ*> ΦΦ ·»' ΦΦ* „ * * * Φ

Φ Φ χ. . * * Φ Φ Φ'

Φφφφ φ* ***„. *_ν * Φ φφφχ χχ szekvenciájával. A próbák polinukleotid régiói dezoxi-ribonukleinsavból és/vagy ribonukleinsavból és/vagy szintetikus nukleotíd analógokból állhatnak. A próbák lehetnek “elfogó próbák“ és “jelölő próbák”. A próbák előnyösen nem tartalmaznak olyan szekvenciát, amely komplementer a polimeráz láncreakcióban (PCR) használt primőrrel.

A “célrégió (target régió) kifejezés alatt a nukleinsav olyan szakaszát értjük, amely sokszorozandó és/vagy kimutatandó. a “célszekvencia (target szekvencia) kifejezés olyan szekvenciát jelent, amellyel egy próba vagy egy primer megfelelő körülmények között stabil hibridet képez.

Az “elfogó próba kifejezés a leírásban egy olyan polinukleotidot jelent, amely egy kötőpartnerhez kapcsolódd egyszálú polinukleotidot tartalmaz. Az egyszálú polinukleotid egy olyan kapcsolódó (targeting) polinukleotid szekvenciát tartalmaz, amely komplementer a vizsgálandó polinukleotidban kimutatandó célrégió célszekvenciájával (target). Ez a komplementer régió elég hosszú és megfelelő mértékben komplementer a célszekvenciával ahhoz, hogy stabil duplex képződjön, amely viszont képes immobilizálni a vizsgálandó polinukleotidot egy szilárd halmazállapotú felülethez (a köbőpartnere'k segítségével)« A kötőpartner specifikus egy második kötópartnerrei? a második kötőpartner kötődhet egy szilárd halmazállapotú hordozóhoz vagy más struktúrákon vagy kótőpartnereken át indirekt módon kapcsolódhat egy szilárd hordozóhoz .

Φ « »* * * φ ♦ »» δ*'*_Λ »»»* .» .g_eJS %**

A “kapcsolódó (targeting) polinukleotld szekvencia” kifejezés alatt a leírásban olyan polinukleotld szekvenciát értünk, amely tartalmaz egy célnukleotid szekvenciával komplementer .nukleotidot; a szekvencia elég hosszú és megfelelően komplementer a célszekvenciával ahhoz, hogy duplexet képezzen, amely viszont megfelelő mértékben stabil az elérendS célhoz,

A “kötőpartner” kifejezést a leírásban abban az értelemben használjuk, hogy egy molekula nagy specificitással képes kötni egy ligand molekulát, mint például egy antigént és egy erre specifikus antitestet, Általánosságban szólva, a specifikus kötőpartnereknek megfelelő affinitással kell kötniük a vizsgálandó másolatot/komplementer szál duplexet (az elfogd próbák esetén), hogy az izolálás feltételei között megtörténjen as immobilizáció. A szakemberek ismerik a specifikus kötőpartnereket, ilyen például a biotin és az avidin, vagy a sztreptavidin, az IgG és az A protein. a számtalan ismert receptor-ligand pár és a komplementer polinukleotld szálak. A komplementer polinukleotld köiöpartnerek esetén a partnerek közönséges körülmények között legalább 15 bázis hosszúságúak, lehetnek 40 bázishosszuságuak; ezenkívül guanin és citozín tartalmuk legalább 40 %» lehet 60 % is» A polínukleotidok lehetnek dezoxi-ribonukleinsavak, ribonukleinsavak vagy szintetikus nukleotid analógok» a kapcsolt kifejezés alatt kovalens vagy erős, nem-kovalens kötések vagy kapcsolatok (például hidrofób kölcsönhatások, hidrogén--kötések, stb.) értendők. A kovalens kötések

Φ Φ lehetnek például észter~, éter- , foszfö-észter- , ©mid-* peptid-> imid~, szén-kén-kötések, szén-fesz fór- kötések és más, ehhez hasonlóak*

A “hordozó” kifejezés sieti bármely olyan szilárd vagy félstilárd halmazállapotú. felületet értünk, amelyhez egy adott kötőpartner kapcsolódhat, Megfelelő hordozók például az üveg, a műanyag, a fém, a polimer gélek és más, hasonlóak; a hordozók lehetnek ágyak, üregek, membránok és más, hasonlók,

A jelzés kifejezés bármely olyan atomot vagy csoportot takar, amelyet felhasználhatunk egy kimutatható (előnyösen mennyiségileg meghatározható) jel előállításáraés amely köthető egy polinukleotldhoz vagy polipeptidhez *

A ”jelpróba” kifejezés alatt egy olyan oligomert értünk, amely tartalmaz egy kapcsolódó · (targeting) polinukleotid szekvenciát, ez egy vizsgálandó polinukleotidhan jelenlevő cél (target) szekvenciával komplementer, és ezért kapcsolódik,

A komplementer régió megfelelő hosszúságú, és megfelelő mértékben komplementer a célszekvencíával ahhoz, hogy a jelzőpróbát és a célszekvenciát tartalmazó duplex létrejöjjön, amit azután a jelzés segítségével meghatározhatunk, Az oligomert egy jelzéshez közvetlenül, vagy indirekt módon iigand molekulák segítségével kapcsoljuk, ezek egymáshoz nagy specificitással kő tődnek, Nagy spéciiicit.ásu iigand molekulákat a leírásban megadunk, ezek közé. tartoznak a múltÍmerek is.

<φφφ V Φ Φ Φ '?a

A multimer” kifejezés a leírásban olyan lineáris vagy elágazó polimereket jelent, amelyek hasonlói ismétlődő egyszálú polinukleotidokhól vagy különböző egyszálú polinukleotid egységekből állnak. Az egységek közül legalább egynek rendelkeznie kell egy olyan szekvenciával, amely elegendő hosszú és megfelelő összetételű ahhoz, hogy lehetővé tegye annak specifikus hibridizációját egy vizsgálandó első egyszálú nukleotid szekvenciához, tipikusan egy vizsgálandó vagy egy, a vizsgálandó molekulához kapcsolt ollgomerhez (például egy jeipröbához), Ezen specificitás és stabilitás elérése érdekében ez az egység legalább IS nukleotid hosszúságú, tipikusan nem. hosszabb, mint 50 nukleotid, és előnyösen 30 nukleonéból áll; ezenkívül a szekvencia guanin és citozín tartalma általában legalább 40 %, legtöbb esetben 80 %. Ezenfelül a múlfimer tartalmaz olyan többszörösen ismétlődő egységeket, amelyek specifikusan és stabilan, hibridizálödnak egy második, érdeklődésűnkre száméttartö egyszálú nukleotidboz, tipikusan egy jelzett pol inuk lentidhez vagy egy másik múl t imerhez. Ezek az egységek általában hasonló nagyságúak és összetételünk, aint a fentiekben ismertetett aultimerek. Ha egy mulfimert egy másik multimerhez szándékozunk bibríöizálni, az első és a második oligonukleotid egység heterogén (különböző), és a kiválasztott mérési körülmények között egymáshoz nem bíbridizálödnak, így a múl timerek. jelzett próbák lehetnek, vagy olyan ligandok, amelyek a próbához jelzésként kapcsolódnak.

A leírásban, “vírus ribonukleinsav kifejezés alatt ideértve a HCV ribonukleinsavat, olyan ribonukleinsavat értünk.

φφ >*ΦΦ ΦΦ-χχ XX amely vírusgénemből származik, vagy ennek egy fragmense, transzkriptuma vagy az ezekből származó mutáns szekvencia.

A leírásban biológiai minta” kifejezés alatt olyan szóvetet vagy szöveti folyadékot értünk, amelyet egy egyénből

isol&Itunk	- >	ilyen lehet pé	xdáui e '
Xyadék* a	1 ·<	mfοxö mir1gyek	bői ssán
1.0.1. φ	&	légzőrendszer,	az e.eéx:
·¥*<& «< Öv <3 \ Sí £.· \-.· ΛΦ.. %í vx.	kö	nnyek, a nyál,	a tej ,
szervek és	’s .Φ.	n vitro sejtbe.	nyészété'
táló jelle		el, ideértve a	táptala

dicionáit táptalaját, feltételezhetően vírussal fertőzött sejteket, rekombináns sejteket és sejtösszét-evőket) .

A találmány kivitelezésekor, kivéve, ba máshogy nem adjuk meg, a kémia, a molekuláris biológia, a mikrobiológia, a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technika és az immunológia ismert módszereit használjuk, ezek a témában jártas szakemberek előtt ismertek, A technikákat az irodalomban teljes mértékben megtaláljuk. Brre vonatkozóan lásd például Maniatis, Fitsoh és Sambrook, Molecular Cloning,- A Laboratory Manual (1982) ,♦ DNA Cloning, 1. és II. kötet (Glover szerkesztésében, 1335},· Oiigonucleotide Synthesis (Gált szerkesztésében, 1384); Nucleic Acid Hybriöization (Hames és Higgins Szerkesztésében, 1984}? A Methods in Bnzymology kötetei (.Academic Press, Inc.), különös tekintettel a Wu és Grossman szerkesztette 154, és 155, kötetek)

Az összes, korábban és később a leírásban említett szabadalmi leírás és publikáció referenciaként szerepel,

A leírásban megadott anyagok ás eljárások használata azzal vált lehetségessé, hogy megtörtént a HCV azonosítása, mint a SD-NANBV kórokozója, ás azzal, hogy biztosítunk egy olyan nukleotid szekvencia családot, amelyet HCV cDNS szekvenciákat tartalmazó cDNS könyvtárból izoláltunk. Sz a cDNS könyvtár olyan nukleinsav szekvenciákból származik,, amelyek egy HCV-fertőzött osisgsánz plazmájában voltak jelen. Az egyik ilyen könyvtár-konstrukció a c könyvtár, .amelyet a WD90/1443S sorszámú PCT publikációban ismertettek (ATCC 4Ö394),

A fent leirt HCV cDNS szekvenciákat, továbbá a leírásban megadottakat használva olyan oligomereket állíthatunk elő, amelyek reagensként használhatók a biológiai mintákban jelenlevő vírus polinukleotídók kimutatására. A szekvenciából kiindulva lehetséges például 8 - 10 nukleotidból álló, vagy ennél nagyobb dezoxi-ribonukleinsav olígomerek szintézise, amelyeket hibridizációs próbaként használhatunk fel a HCV ribonukleinsav jelenlétének kimutatására, például véradóktól származó vérben, vérár akciókban, feltételezhetően vírushordozó szérumokban vagy olyan sejttenyészetekben, amelyekben a vírus replikálódik. Ezenkívül a leírásban megadott újszerű oligomereket felhasználhatjuk a HCV genom további jellemzésére. Ezekből a szekvenciákból levezetett polinukleotid próbák és primerek felhasználhatók cDNS könyvtárakban jelenlevő szekvenciák sokszorosításéra és/vagy a cDNS * * * X ΛΛ < φ χ φ *φ _Λ** **

X φφφ * ^φ * X

X φ φ * + ΦΧφ **ΦΦ ΦΦ φΧΦΦ xLw * *

V»»» ΑΦΦΧ φφ könyvtárak szkfineiésére további átlátó cDNS szekvenciák megtalálása érdekében, amelyek viszont újra használhatók további átfedő szekvenciák felfedezésére. Ahogy az a ROSQ/1443S sorszámú PCT közrebocsátás! iratban olvasható, a HCV genom ribonukleinsav, amely elsődlegesen egy nagyméretű nyitott leolvasási keretet tartalmaz (ŐRE), ez a szekvencia pedig egy nagyméretű políproteint határoz meg.

A fentieken kívül az alábbiakban megadott információ lehetővé teszi további HCV törzsek vagy izolátumok azonosítását. További HCV törzsek és izolátumok izolálását és jellemzését például úgy végezzük, hogy a vírus részecskéket és/vagy vírus ribonukleinsavat tartalmazó testrészből vagy testfolyadékból izoláljuk a nukleinsavakat, a hcvi szekvencián alapuló oligomerekkel cDNS könyvtárat ál 1.1 tünk elő, megvizsgáljuk a könyvtárat, tartalmaz~e az alábbiakban megadott HCV cDNS .szekvenciát, és ezután Összehasonlítjuk az aj izolétumból származó HCV cDNS molekulákat a WO90/14436 sorszámú PCT közrebocsátás! iratban és ezen leírás további részében leírt cDNS molekulákkal. Azok a törzsek vagy izolátumok, amelyek a HCV paramétereinek megfelelnek, ahogy azt az előzőekben megadtuk, könnyen azonosíthatók. A témában jártas szakemberek előtt más módszerek is ismeretesek a HCV törzsek azonosítására, amely azonosítás a jelen leírásban megadottakon alanul, φ φφ

X Φ •φ φ

φφφφ »'♦ χ· »Χ-φ

y.>

Az alább lakban ismertetjük a HCV cDNS szekvenciák izolálását ,

A találmány szerinti oiigomerek olyan régiókat tartalmaznak, amelyek hibrid duplexeket alkotnak, a HCV polinukleotídok kiválasztott szekvenciáival. A HCV polinukleotldokkal híbridizálódó oligomer régiókat kideríthetjük a leírásban megadott HCV cDNS szekvenciákból, ahogy azt a WO90/1443Ó sorszámú PCT közrebocsátási iratban olvashatjuk. A HCVí-ből származó HCV cDNS öszszetételét (ez egy HCV prototípus) az l, ábrán adjuk meg. A szekvencia összetétele olyan szekvencia-információkból származik, amelyek néhány HCV cDNS klönból származik? ezeket jőnéhány HCV cDNS könyvtárból izoláltuk, ezek között szerepel a ^wc“ könyvtár, amely a lambda gtll (ATCC 40394) dezoxi-ribonukleinsavban van jelen, és amely humán szérumból származik. A HCV cDNS kiónokat a W090/14436 sorszámú PCT közrebocsátási iratban megadottak ezerint izoláltuk. Röviden, e kiónok nagy részét a HCV cDNS *c génbankból kapott szekvenciákból izoláltuk, amely szekvenciákat krónikus HCV fertőzött csimpánzok szérumából gyűjtöttünk, ezek a szérumok magas titerszámu vírust tartalmaztak, azaz legalább lö^$ csimpánz fertőző dőzis/ml-t (ClD/ml). Az összegyűjtött szérumot használtuk a virus részecskék izolálására; a részecskékből izolált nukleinsavat templátként használtuk a vírus genom cDNS génbankjának (könyvtár) előállítására. Az első klón, az 5-1-1 jellel jelölt, olyan *c* könyvtárból származik, amelyet fertőzött egyének szérumából vettünk. Az eredeti klón izolálása után a szék*4 * 4i * **>

*·* *Χ 4* * 4 4 X 4ί * * *44 ' . - χ '4 χ χ χ

4*4 44 *44χ 44*4 44 véneia többi részét szintetikus polinukleotid próbák segítségével kaptuk, ezek a szekvenciák az ismert HCV cDNS szekvenciák 5‘~ és 3'-régiójából származnak.

A cDNS szekvenciák elkészítésének leírása nagyréezben történeti érdekességé, A kapott szekvenciákat (és ezek komplemen térj eit) a leírásban megadjuk, a szekvenciákat, vagy ezek bármely részét szintetikus módszerekkel, előállíthatjuk, de használhatjuk a szintetikus módszerek, és a rész-szekvenciák előállítása módszereinek kombináció;) ét is,· ahogy azt a WO9Ö/14436 sorszámú pct közrebocsátás! iratban olvashatjuk.

Az alábbiakban ismertetjük az oligomer próbákat és primorekot.

A HCV genom (lásd az 1. ábrát) szekvenciájára és/vagy előnyösen, a HCV genom állandó régióira alapozva 8 vagy több nuklootidből álló oligomerok állíthatók elő, amelyek hibridizálódnak a HCV ribonukleinsav pozitív szálához (szálaihoz), vagy ennek komplementeréhez, úgyszintén a HCV cDNS molekulákhoz. Ezeket az oligomereket. próbaként használhatjuk fel a HCV nukleotid szekvenciákat tartalmazó polinukleotidok kimutatására (izolálására és/vagy jelzésére), felhasználhatjuk továbbá a kiválasztott HCV szekvenciák transzkripciójához ás/vagy replíkációjához primőrként. A kapcsolódó (targeting), polinukleotid .szekvenciát tartalmazó oligomerek egy cél (tenget) HCV nukleotid szekvenciával komplementer nukleotid régiót tartalmaznak; a szekvencia megfelelő hosszúságú és komplementaritást a HCV szekvenciához ahhoz, hogy megfelelő, a célnak eleget tevő stabilitással *♦ Αχ· * Φ X

Φ'Χ» χ * Φ Φ

ΑΧ rendelkező duplexet képezzen. Így például, ha a cél egy target HCV szekvenciát hordozó vizsgálandó minta izolálása immobilizációval, az oligomernek tartalmaznia keli egy olyan poiinukleotid szakaszt, amely megfeleld hosszúságú és komplementaritásu a kiválasztott hcv szekvenciával ahhoz, hogy megfelelő stabilitású duplex képződjön a vizsgálandó szekvencia immohilizálásához egy szilárd halmazállapotú felületen, amely bekövetkezhet úgy, hogy az adott izolálás! körülmények között ez egy oligomerhez kötődik. Továbbá, például, ha egy vizsgálandó polinukleotlóban levő cél HCV szekvencia transzkripciójához és/vagy replikációjához primőrként szolgál az oligomer {oligomerek} , úgy az öli gomer eknek tartalmazniuk kell a kiválasztott HCV szekvenciával komplementer és megfelelő hosszúságú poiinukleotid régiót, amikor lehetségessé válik a polimerizáló enzim számára a replikáció folytatására a primerekedi kezdődően, amelyek viszont stabil duplexet képeznek a pölimérizálás körülményéi között a céiszékvencíával. Továbbá, ha az oligomereket jelöldpróbaként használjuk, vagy multimerekhez akarjuk kapcsolni őket, a kapcsolódó (targeting) poiinukleotid régiónak elég hosszúnak és. a stabil hibrid duplex struktúra kialakításához megfelelő komplementeritásunak keli lennie a jelóldprdbákkal és/vagy muitimerekkel, hogy kimutathassuk a duplexet. Az oligomerek legkevesebb 4 olyan, egymást követő nukleotidot tartalmazhatnak, amelyek komplementerek a kiválasztott HCV szekvenciával? az oligomerek általában legkevesebb 8 olyan, egymást követő nukleotidot tartalmaznak, amelyek komplementerek a *·* X X frfrfr fr frfrfr * fr fr

K-frXfr «X· fr Xfr fr fr fr fr X· frXfrfr frfrfrx kiválasztott HCV szekvenciával, előnyösen azonban legkevesebb 14 egymást követő komplementer nukleotiöot hordoznak.

Az előnyös HCV nukleotid szekvenciához kapcsolódó (targeting) szekvenciák olyan, nukleotidokból állhatnak, amelyek az

1. ábrán bemutatott HCV cbNS nukleotidokra komplementer nukleotidőkből állnak.

Az oligomereknek ugyanakkor nem kell csak a cél HCV szekvenciával komplementer szekvenciát tartalmaznia. Tartalmazhatnak további, nukleotid szekvenciákat vagy más csoportokat, amelyek az oiigomerek használatával kapcsolatos céloknak megfelelnek. így például, ha az. oligomereket primőrként használjuk a polinukleotid lánc reakcióval történő HCV szekvencia sokszorosítására, úgy azok hordozhatnak olyan szekvenciákat, amelyek duplexben restrikciós enzimek által felismerhető helyeket képeznek, amelyeket viszont a sokszorosított szekvenciák klónozására használhatunk fel. Továbbá, ha az oligomereket elfogópróbákként használjuk az alábbiakban megadott hibridizációs mérésekben, úgy azok tartalmaznak egy további kötőpartnert, amely viszont a kiválasztott HCV szekvenciával komplementer nukleotid szekvenciát tartalmazó oiigomerhez kapcsolódik.. Az oligomerekben levő vagy ázásokhoz kapcsolódó csoportok vagy szekvenciák a témában jártas szakemberek előtt ismertek, ezek sokféle célra felhasznáihatók, ideértve a nukleotid próbák jelölését is.

Az oiigomerek preparálását a szakterületen ismert módszerekkel végezzük, ideértve a kihasitásos reakciót, a transzkripciót vagy a kémiai szintézist. A genom kiválasztott (target)

X X ΦΧ ♦ * ¥ χ ' * Λ, * φ Φ φ ΧΧ-φφ φ χ. φφχ célszekvenciái és/vagy régiói, amelyekhez a kapcsolódó '{targeting} öli gomer ekben levő polinukleotidok komplementaritásuk miatt kapcsolódnak, a céltól függő összetételüek. így például, ha célunk a HCV kimutatása biológiai mintákban (például vérben), úgy az előnyös oligomereket próbaként és/vagy primerekként használhatjuk, és a KCV genom konzervatív régióihoz kell, hogy hibrid!zálödjanak. A HCV genom egyes konzervatív régióit, amelyhez as oligomerek kötődhetnek, a leírásban megadjuk; például az 5‘'-terminális végtől számítva a. 200> sorszámú nukleotidíg terjedő részt, vagy a 4,000-tői az 5.000-ig terjedő szakaszt, vagy a

s> 6 ef' ~ -a 's «	9,		«X.Sjjí \í A·. tS\»ÍXvs' A^ ΑΧ AA V VA A A \v »ν· \·Λ ί*	\’rf a
előnyösen a	- 3	18	- 174, a 4056 ··	4443 és	a 4.371
nukleotidok	ár	tál	meghatározott	szakaszt.	. A kü.

primerek és próbák a -313 és a -173 sorszámú nukleotid szakaszból származnak, illetve az 1 - 540 sorszámú nukleotid szakaszból, ahogy a.z az 1. ábrán látható,

A genom más konzervatív régióit könnyen kiválaszthatjuk oly módon, Hogy összehasonlítjuk a különböző HCV izolátumok, ideértve a prototípusként szereplő HCV, HCV1 nukleotid szekvenciáit. A genotípusok közötti összehasonlítás módszerei abból állnak, hogy meghatározzuk a konzervatív és nem-konzervatív, a szakterületen ismert régiókat. Ezen módszerek példáit megtaláljuk a WO30/14438· sorszámú PCT közrebocsátás! iratban.

Az alapvető nukleinsav hibridizációs mérés során a vizsgálandó egyszálú nukleinsavat (akár öezoxi-ribonukleinsavat * Φ* φ ΧΧΦ φ φφφ * φ φ φφφφ ΦΦΦχ «φ

- 37 vagy ribonukleinsavat) egy nukleinsav próbához hibrid! zál. juk, és a kapott duplexeket kimutatjuk. A HCV polinukleotidok (természetes vagy származtatott) próbái olyan hosszúak, hogy hibridizációval ki tudjuk mutatni az egyedülálló virus szekvenciákat. A δ - δ nukleotidból álló próbák megfelelő hosszúságúak, előnyösek azonban a lö - 12 nukleotidból állók, a legoptimálisahbnak látszanak azonban a 20 nukleotidból álló szekvenciák< Ezek a szekvenciák előnyösen olyan régiókból származtathatók, amelyek homogének (nem rendelkeznek heterogenitással). Ezeket a próbákat rutin módszerekkel állíthatjuk elő, ideértve az automatikus oligonukleotid szintézist, A felhasználható próbák közé értjük azokat, amelyeket a leírásban megadott uj izolátumokből származtattunk, továbbá azokat a különböző oligomereket, amelyeket az alábbiakban mutatunk bs, a cDHS génkönyvtárak próbájaként, A HCV genom egyedülálló részeinek bármely komplementje használható.

A próbaként 'használt szekvenciákban a teljes komplementaritás az előnyős, bár ez nem szükséges akkor, ha a fragmens nagysága no.

Az analizálanóö biológiai mintában, például vérben vagy szérumban levő HCV polinukleotidok kimutatására (például a fertőzött vér vizsgálatakor) a fenti próbákat úgy használjuk, hogy először a mintában levő nukleinsavakat, szükség esetén, kivonjuk, A mintából származó nukleinsavat gél-elektroforézissel vagy más, a nukleinsavakat nagyság szerint elválasztó módszerrel vizsgáljuk; köthetjük a próbához a nukleinsav mintát nagyság szerinti elkülönítés nélkül is. A próbában levő kiválasztott

XX

Α Χ .»** ** ** * * * * * * * * ψ * -*’* * #**

ΧΧχχ χχ *Χ#χ -ΧΧΧχ %«* (targeting) szekvenciával való hibrid duplexképzéskor a célrégiő vizsgált nukleinsava egyszálú alakban kell, hogy legyen. Ka a szekvencia természetes alakja egyszálú, úgy nem szükséges denaturálnunk. Azonban, ha a szekvencia kétszálu alakban van jelen, úgy a szekvencia denaturálandó. A denaturácidt a szakterületen ismert módszerekkel végezhetjük. A denaturácidt kővetően a vizsgálandó nukleinsavat és a próbát a próbában levő célszekvencía és a vizsgálandó mintában levő feltételezett vizsgálandó szekvencia közötti stabil hibrid kialakulásának megfelelő reakciókörülmények között inkubáljuk, és a kapott, a próbát (próbákat) tartalmazó duplexeket kimutatjuk.

Az esetleg képződő duplex kimutatására általában jelzett próbákat használunk,- a próba azonban lehet nem-jelzett is, lehet olyan, amely jelzett ligandhoz való kötődéssel mutatható ki, közvetlenül vagy közvetve. A megfelelő jelzések és a jelzett próbák és ligandok előállításának módszerei ismertek a szakterületen, idetartoznak például a radioaktív jelzések, ezeket ismert módszerekkel, például nick transzlációval vagy kinéz enzimmel juttatjuk a molekulába, idetartozik a biotinos jelzés, a fluoreszcens csoportok, a kemilumineszcene csoportok (például dioxetánok, részlegesen jelölt dioxetánok), enzimek, antitestek és hasonlók.

A kiválasztott vizsgálandó mintához kapcsolódni képes régiók a próbában úgy tervezhetők, hogy azok teljesen komplementerek legyenek a HCV genommal. így általában erősen szigorított

Aa * ΦΑ

X

A A* Jí »*A * A feltételeket kell alkalmaznunk, a hibás, pozitív eredmény elkerülésére, Ugyanakkor, ezeket a szigorú feltételeket csak akkor kell használnunk, ha a heterogenitást nélkülöző vírus genommal komplementer régiókat tartalmazó próbákat használunk. A hibridizáció megszoritottaágát a hibridizáció és a mosási lépés során több tényező határozza meg, például a hőmérséklet, az ionerősség, az expozíció ideje és a formamid koncentrációja. Ezeket a tényezőket például Maníatis (1982) írja le,

Az alapmódszerek szakterületen ismert variációit ís felhasználhatjuk, ideértve azokat, amelyek során az idegen anyagokból detektálandó duplexeket elkülönítjük és/vagy amelyek során a jelzett csoportok szignáljait sokszorosítjuk. Ezen módszer-variációk nagy számát ismertetik az alábbi dolgozatokban: Matthe’W's és Kricka, Anal. Biochem. > 189:1 (1988) ; Landegren és munkatársai, Science, 242:229 (1988); továbbá Míttlín, Clin. Chem., 35:1819 (1989). A mérésekben a. HCV kimutatására alkalmas próbák olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek hibrldizálódnak a cél HCV polinukieotid szekvenciákhoz, amikor a vizsgálandó szállal duplexek képződnek, ezek a duplexek pedig- megfelelően stabilak az adott mérési rendszer detektálása során.

Egy megfelelő variációs módszert például a 4.868.105 sorszámú amerikai (1989. szeptember 9.) és a 22588? sorszámú EPö (1987. junius 16.) közrebocsátási irat ismertet. Ezek a publikációk egy folyadékfázisban végzett nukleinsav hibridizációs mérést ismertetnek, amelyben a vizsgálandó nukleinsavat egy jelölőpróba.- ?»* * frfr frfr

frfrfrfr frfr

-szetbez és egy elfogópröba-szethez hibridizál juk, A próba-vizsgálandó minta komplexét hibridizációval egy szilárd fázishoz kötött elfogópróbához kötjük, ez utóbbi komplementer az elfogópróba-szetbez. Ily módon lehetségessé válik a vizsgálandó nukleinsav eltávolítása az oldatból szilárd fázisban levő komplexként. A vizsgálandó anyag szilárd fázisú komplexként lehetővé teszi ennek izolálását a mérés során. A jelőlőpróba-szet komplementer egy jelölőpróbáboz, amely viszont hibridizációval kötődik egy szilárd fázisban levő/vizsgálandó anyag komplexhez.

Általában azt várjuk, hogy a HCV genom szekvenciái jelen legyenek a fertőzött személyek széruméban, mégpedig alacsony koncentrációban, azaz körülbelül 1Ö^Z - ICP csimpánz fertőzött dózis (CID)per ml értékben. Ez a koncentráció szükségessé teheti a hibridizációs mérésben a sokszorosítást. Ilyen technikák ismertek a szakirodalomban. Például az Snzo Biochemical Corporation “Bio-Bridge rendszerében terminális dezcxi-nukleotid transzferár enzimet használunk ahhoz, hogy a dezoxi-ribonukleinsav próbához módosítatlan 3*-polí-dT kinyúló véget kapcsoljunk.

A poii~dT végű próbát egy cél nukleotid szekvenciához hibrid!záljuk, majd egy biotin-módosított poli-A szakaszhoz.

A WO 84/Ö3520 sorszámú PCT és a 124.221 sorszámú EPO közrebocsátást iratban olyan dezoxi-ribonukleinsav hibridizációs méréssel ismerkedhetünk meg, amelyben

1} a vizsgálandó molekulát olyan egyszálú dezoxi-ribonukleinsav próbához kötjük, amely komplementer egy enzim-jelzett oligonuklectidhoz, májd «·# φ

2) a kapott végállásban meghosszabbított duplexet egy enzimmel jelzett oligonukieotiddal hibridizáljuk.

A 204,510 sorszámú EPö közrebocsátási irat egy olyan dezoxí-ribonukleinsav hibridizációs mérést ismertet, amelyben a vizsgálandó dezoxi-ribonukleinsavat olyan próbával hozzuk őszsze, amely egy farokrésszel rendelkezik, ez egy poli-dT szekvencia, továbbá egy olyan sokszorosító szállal, amely a próba iarokrészével hibridizáló szekvenciát tartalmaz, például egy poli-A szekvencia, végül, amely képes kötődni egy feleslegben jelenlevő jelzett szálhoz. Egy, a 317,077 sorszámú, 1939, május 24-én közrebocsátott SPÖ iratban ismertetett hibridizációs mérés során 10^/m.l koncentrációban jelenlevő szekvenciákat mutatunk ki, a mérésben olyan multimer nukleinsavakat használunk, amely egyszálú vizsgálandó nukleinsav mintához képes kötődni, és amely kötődik továbbá egy feleslegben jelenlevő egyszáíú jelzett oligonukleotid készlethez. Különösen előnyös az a technika, amelynek során a szérumban jelenlevő cél HCV szekvenciákat 10,000··-szeresre sokszorosítjuk (azaz, körülbelül 10^ szekvencia/ml koncentrációra) , amely lépés része a hibridizációs rendszernek. A sokszorosítást például a poiimeráz láncreakcióval (PCR) végezhetjük, amelyet áaiki és munkatársai ismertetnek (1986) , továbbá, amelyet a Mullis illetve Mullis és munkatársai által készített 4.683.195 illetve 4.683.202 sorszámú amerikai szabadalmi leírásban találunk. A sokszorosítást végezhetjük a HCV célszekvencia tisztítása előtt, előnyösen azonban ennek után sokszorosítunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a sokszorosítást a 4.868.105 sorszámú amerikai szabadalmi leírásban ismertetett módszerekkel együtt végezzük, vagy* ha további sokszorosítás szükséges, úgy a 317.877 sorszámú EPO közrebocsátási iratban megadott hibridizációs rendszer használata során.

Egy vizsgálandó polinukleotid szálban levő HCV szekvencia kimutatására előnyösen használható módszerek a 4.868.105 sorszámú amerikai szabadalmi leírásban, és a 317.07? sorszámú EP· közrebocsátási iratban ismertetett hibridizációs datekcíós módszereken alapulnak. Ezek a módszerek oldott fázisú szendvics hib ridizációs mérések, amelynek során a vizsgálandó nukleinsavban jelenlevő célsz.ekvenciákhoz hibridízálódó elfogó és jelölő próbákat használunk. A biológiai mintákban levő HCV szkrinelésére használt próbák kötődnek a HCV genom konzervatív régióihoz. Az elfogó és jelölő próbák vegyítve vannak a cél (target) szekvenciához történő kötődéskor, Eljárhatunk előnyős módon úgy is, hogy szettekben levő elfogó és jelölő próbákat használunk, ekkor az egyik szetben levő próbák nem befolyásolják, nem vegyülnek a másik szetben levő próbákkal. Sz utóbbi esetben az az előnyős, ha az elfogó próbák szetje (szetjei) a genom legkonzervatívabb régióihoz hibrid!zálődnak, ugyanakkor a jelölő próbák szetje (szetjei) olyan régiókhoz hibrid!zálödhatnak, amelyek kismértékű divergenciát mutatnak. így például, ha a prototípusként szereplő az 1. ábrán bemutatott HCV1 clW szekvenciát használjuk, úgy *< Λ'ν ΦΦ >> φ*

Φ ΦΦΦ φ φ ΦΦΦ ♦ Φ X Φ V Φ «

ΧΦΦΦ φφ φφφ* ΦΧΧΧ- φφolyan próbákat használhatunk, amelyek a -318-tői a 174,, a 43?8~tól a 4902. és/vagy a 4056···tői a 4448. nukleotid szakaszhoz hibridizálódnak. Az előnyös próbák a HCV genom S *-régiójában levő szekvenciákhoz hibridizálódnak, mivel, ahogy azt lejjebb bemutatjuk, ez a régió nagymértékben konzervatívnak látszik. Ssért az előnyös próbák azok, amelyek például a -318-föl a 174, nukleotidok által reprezentált szakaszhoz hibridizálódnak, ahogy azt az 1. ábrán megadottakból láthatjuk. Használhatunk olyan próbákat, amelyek a konzervatív régiók pozitív száljához hibridizálódnak, vagy ennek komplementeréhez, attól .függően, mi a célunk: például, a virus genom szekvenciáinak kimutatása vagy a polimeráz láncreakcióval végzett sokszorosítás során kapott HCV cDNS szekvenciák kimutatása, esetleg a pozitív HCV ribonukleinsa szál replikativ intermedierjelnek azonosítása.

Az alábbiakban ismertetjük a HCV/c polimeráz láncreakciós módszert a HCV ribonukleinsav és az ebből származó polinukleotidok kimutatására.

A HCV ribonukleinsav vagy a HCV ribonukleinsavból szár máztatbatő polinukleotidok kimutatásának különösen előnyös módszere a HCV/c polimeráz láncreakcióé módszer, a módszer a leírás ben referenciaként szerepel, kivitelezése során az alábbi közleményekben megadott polimeráz láncreakcióé (PCR) technikát használjuk: Saiki és munkatársai (1988), illetve Mullis, illetve Múl lis és munkatársai által megírt, 4,883,175 sorszámú amerikai sza badalmi leírás, illetve a 4,883,202 sorszámú, ugyancsak amerikai

*.<χ

X ν X X XX XX

XX «· X X X X

X X X X χ χ ·*· X

X X X- X X X

X XX XXvx >ΧΧφ Φχ szabadalmi leírás. A KCV/cFCR módszer során a HCV genom természetét feltáró és a jelen leírásban ismertetett információk alapján készített primsreket és próbákat használjuk.

A PCE technika alkalmazása során általában olyan rövid oligonukleotid prímereket állltunk elő, amelyek a kiválasztott szekvencia ellentétes végeivel találkoznak. A primerek közötti szekvenciákat nem kell ismernünk. Egy polinukleotid mintát extrahálunk, és ··· előnyösen hővel - denaturálunk, majd egy olyan oligonukleotid primőrrel hibrídizálunk·, amely moláris feleslegben van jelen. A polimerizációt egy templát- és egy primer dependens polimeráz katalizálja dezoxi-nukleotid-trifőszfátok vagy nukleotid-analógok (dMTPs) jelenlétében. A reakció eredménye két hosszú termék”, amelyek az 5»-végeken tartalmazzák a megfelelő prímereket, mégpedig az eredeti szál újonnan szintetizált komplement j eihez kovalensen kötve. A replikáit dezoxi-ribonukleinsavat ismét denaturáljuk, oligonukleotid. prímetekhez hibridizáljuk, ismét létrehozzuk a polimerizációs reakciókörülményeket, és egy második, replikátiós ciklust indítunk. A második ciklus során létrejön a két eredeti szál, az első ciklusból származó két hoszszu termék és két rövid termék, amely hosszú termékekből replifcálódott. A rövid termékek olyan szekvenciákat tartalmaznak (szensz vagy anti-szensz), amelyek a. célszekvenciéból származnak, és amelyek az 5^#- és 3’-végeiken primer szekvenciákkal hosszabbodtak meg. Mindegyik további ciklus során a rövid termékek száma exponenciálisan nö, Így a folyamat során egy Βροοίί íkus célszekvencia megsokszorozódik.

A X Φ χ Φ φ φφ* φφ

Φ Χ· X y ΧΦ φ φ * φ

X ΦΧΦ φ φ Φ * φ ΧΧφφ φφ φφφφ χφφφ ΦΦ

- ₄₅ „

A módszer során egy mintát használunk, amely feltétélezhetően tartalmaz HCV ribonukleinsavat vagy ennek egy fragmensét. A mintát általában NAN&H fertőzött egyénből vesszük; származhat a minta azonban más forrásból is, például olyan in vitro rendszerből szármázd kondicionált táptalajból vagy sejtekből, amelyekben a vírus replikálódott. A minta azonban kell, hogy tartalmazza a tél nukleinsav szekvenciát (szekvenciákat).

A mintát olyan körülmények közé helyezzük, amikor megtörténhet a HCV ribonukleinsav reverz transzkripciója HCV cDNS molekulává. A témában jártas szakemberek ismerik a ribonukleinsav reverz transzkripciójának körülményeit,- a reakció-feltételeket, például Maniatis ás munkatársai (1982) és a Hethoós ín Enzymology megfelelő fejezeteiben megtaláljuk. A reverz transzkripció előnyős módszere szerint különböző .forrásokból származó reverz transzkríptáz enzimet használunk, ilyen lehet rekombináns molekula és izolált enzim, például rétrovírusból, előnyösen a madár mielóblasztózis vírusból (ANV), a reakció során megfelelő reakciókörülményeket alkalmazunk. A HCV cDNS előállításakor a reverz transzkripció során egy ribonukleinsav ; dezoxi-ribonukleinsav hibrid molekula keletkezik, ez az első reverz transzkripciós lépés eredménye, amiután két vagy több transzkripciós lépés után dezoxi-ribonukleinsav ; dezoxi-ribonukleinsav hibridek jönnek létre,

A reverz transzkripciós reakció után kapott HCV cDNS ezután a célszekvencía sokszorosítására, a polimeráz láncreakció ;♦%

XX

* φ * * φ φ φ φ φ φ· *

X Φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ körülményei közé kerül. Ennek kivitelezésére a HCV cDNS molekulát denaturáljuk, és az elkülönített szálakat a célszekvencián túlnyúló primerekhez hibrídizáljuk.

A szálak szeparálását bármely megfelelő denaturáló módszerrel végezhetjük, például fizikai, kémiai vagy enzimatikus lépésekkel, ezeket a témában jártas szakemberek ismerik. Egy előnyös fizikai módszer szerint a nukleinsavat addig melegítjük, míg teljesen (99 %-nál jobban) denatúrálődik. A tipikus hődenaturáciő során 1 - 18 percen át 8Ö*C és 105°c közötti hőmérsékleten tartjuk a dezoxi-ribonukleinsavat,

A hcv cDNS molekula primerekkel való hibridizációját kővetően a cél HCV szekvenciákat polimerizációval repiikáljuk, a replikáit szál szintézisének elindításához primer oligonuklectidot használunk. A prímeteket úgy választjuk ki, hogy ezek a HCV genom szekvenciájával komplementerek legyenek. A HCV cDNS szensz és anti-szensz szálainak régióival komplementer oligomer primerek tervezésekor az 1. ábrán bemutatott HCV cDNS szekvenciákból indulunk ki,

A primereket úgy választjuk meg, hogy ezek relatív pozíciója egy duplex szekvencia mentén olyan legyen, hogy az egyik primőrről szintetizált termék - ha ezt a templátjáról (komplementjéről) elkülönítjük - egy másik primer templátjaként szolgáljon, amikor meghatározott hosszúságú replikáit szálat kapunk«

4?

Χ-φ

A sokszorosítás maximális hatékonysága érdekében a primer előnyösen egyszálú, de lehet kétszálú is. Ha kétszálú, a prímért először kiterjesztése előtt egyszálú alakká alakítjuk. A primer előnyösen egy oíigo-dezoxí-ríbonukleotid. A primőrnek elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy Irányíthassa a polimerizáciőt katalizáló enzim jelenlétében a szál meghosszabbodását. A primer pontos hosszúsága több tényezőtől függ, például a hőmérséklettől, a primer forrásától és a használt módszertől. Például, a célszekvencia komplexicitásától függően az oligonukleotid primer IS - 4S nukleotidot tartalmaz, tartalmazhat azonban többet vagy kevesebbet is. A rövid primer molekulák általában alacsonyabb hőmérsékleten képeznek megfelelően stabil hibrid komplexeket a templátt'^;:s 1

V\aJ. >

A leírásban megadott eljárás során olyan primereket használunk, amelyek “lényegében komplementerek a sokszorosítani kívánt, specifikus szekvenciák különböző szálaival. Azaz, a primerek nem- keli, hogy megfeleljenek a templát pontos szekvenciájának, a komplementáciőnak megfelelő mértékének kell lennie ahhoz, hogy a megfelelő szálakhoz való szelektív hibridizáció bekövetkezzen, Például, a primer S*-végéhez egy nem-komplementer nukleotid fragmens kapcsolható, .ha á primer szekvenciájának további rész© az adott szállal komplementer, Előfordulhat, hogy a primőrbe nem-komplementer bázisokat vagy hosszabb szekvenciákat építünk be, azzal a feltétellel, hogy a primőrnek megmarad a szükséges komplementaritása a sokszorozandó szálak egyikének ·>·χ φφ φχ Φφ χχ φ φ χ Φ φ χ· φ: Φ

Φ φφφ «ί- φ φφφ

Φ Φ Φ φ φ Φ χ·

ΧΦΦΦ Φφ Χφφφ ΦΦΦΦ ΦΦ szekvenciájával, azaz létrejön az ezzel való hibridizáció, és igy duplex moiekulaszerkezet jön létre, amely polimerizáclős technikával meghosszabbítható. A primerek nukleotid szekvenciájában levő nem-komplement-er részek lehetnek restrikciós enzimek által felismerhető helyek. Egy célszekvencia végéhez kapcsolt restrikciós felismerő hely különösen előnyösen alkalmazható a célszekvencia klónozásakor.

Érthetői hogy a leírásban a *primer* kifejezés több mint egy primerre utalhat, különösen abban az esetben, amikor a sokszorozandó célrégiő terminális szekvenciájában vagy szekvenciáiban valamiféle genetikai kétértelműség van, A leírásban ezen túl egy *primer olyan primőrként alkalmazott oligonukleotídok gyűjteményét jelenti, amelyek a szekvenciában levő lehetséges variációk szekvenciáit reprezentálja, vagy olyan nukleotidokat tartalmaz, amelyek tipikus bázíspárosodást eredményeznek. A gyűjreményben szereplő primer oligonukleotídok egyike a célszekvencía végével homológ. Specifikus esetet jelent az, amikor oligomer készleteket használunk a HCV genom potenciálisan változó régiójának sokszorosítására.

Várható, hogy a HCV különböző törzsei vagy izolátumai között több olyan lesz, amelyek szekvenciái a HCVI, azaz a prototípusként kezeit törzsből származtatható. Ezért, különböző variáns törzsek kimutatására előnyösen úgy járunk el, hogy a HCV genom konzervatív régióival híbridizáiódó prímeteket használunk. A konzervatív régiókat meghatározhatjuk oly módon, hogy több HCV

ΦΦ φφ

Φ Φ ·* Φ ·χ· * φ:·ΧΦ Φ >' *χφ

Φ χ' Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦΦχ. ΦΦΦΦ ΦΦ tőrzs/izolétum nukleotid vagy aminosav szekvenciáját meghatározzuk. Az előzőekben leírt HCV genom valószínűleg legalább három konzervatív régiót tartalmaz, ezektől származtathatók a primerek. Ezek a régiók nyilvánvalóan léteznek, A továbbiakban, a példákban leírt prímeteket a HCV konzervatívnak hitt régióiból származtattuk, a Plavivírus-ok szekvencia homológ-iájára alapozva.

Az oligonukleotid prímereket bármilyen megfelelő módszert alkalmazva előállíthatjuk. A specifikus szekvenciájú olígonukleotídok előállításának módszerei a szakemberek körében ismertek, ilyenek például a klónozás és a megfelelő szekvenciák kivágása, továbbá ilyen a közvetlen kémiai szintézis is. Kémiai szintézis alatt értjük például a foszfo-triészter módszert /Narang és munkatársai (1979)/, a foszfo-diészter módszert /Brown és munkatársai (1979)/, a díetil-foszfor·-amidét os módszert /Beaucage és munkatársai (1981)/ és a 4,458,066 sorszámú amerikai szabadalmi leírásban leírt szilárd hordozós módszert.

Szükség esetén a prímereket jelzéssel látjuk el, a spektroszkópiai, fotokémiai, biokémiai, ímmunokémíaí vagy kémiai módszerrel kimutatható jelzéseket beépítjük.

Az oligonukleotid primer (primerek) templáttól függő meghosszabbításét egy polimerizáló enzim által katalizált reakcióban végezzük, megfelelő mennyiségű négy dezoxi-ríbonukleotid-trífoszfét (dATP, dGTP, dCTP és dTTP) vagy ezek analógjainak jelenlétében, olyan reakcióelegyben, amely tartalmaz megfelelő sókat, fém kationokat és a pH-t szabályozó puffért. Meg58 »* ** Φ-Χ ** «·* * * φ » ·χ· Φ Φ φ *** φ .φ ee-* φ φ * * φ φ- φ

ΦΦΦ ΦΧ ΧΦΦφ. ΦΦΧΦ Χ-Φ függő dezoxiIsmert dezoxifelelő polimerizáló anyag a primer- és templát ribonukleinsav szintézist katalizáló enzimek,

-ribonukleinsav polimerizáló enzim például az E, coli dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz X vagy ennek. Xlenow- fragmense, a T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz és a Tag dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz. A fenti dezoxi-ribonukleinsav-polímerázok katalizálta dezoxi-ribonukleinsav szintézis reakciókörülményei a szakemberek körében ismertek.

A szintézis termékei olyan duplex molekulák, amelyek tartalmazzák a templát szálakat és a meghosszabbított primer szálakat, ezek tartalmazzák a célszekvenciát, Ugyanakkor, ezek a termékek templátként szolgálnak egy kővetkező repiikációs- ciklusban. Ebben a második körben a korábbi ciklusban létrejött meghosszabbodott primer szál hozzákőtódik a komplementer primerhez; a szintézist követően egy rövid terméket kapunk, amely kötődik mind az 5^f-, mind a 3* -végekhez, a primer-szekvenciák vagy ezek komplementereinek segítségévei. Ha a denaturácíót, a primer kapcsolást és a -meghosszabbítást eredményező ciklust megismételjük, úgy a primerek által meghatározott célrégió mennyisége exponenciálisan nő, Megfelelő számú ciklust hajtunk, végre ahhoz, hogy a nukleinsav célrégiőját tartalmazó polinukleotidból megfelelő mennyiséghez jussunk, á kívánt mennyiség változik, függ attól, hogy a termékként képződj polinukleotidot mire kivánjuk felhasználni ,

Φ Φ φ X φφ φφ φφ φφ φ φ· φ φ ·Λ φ φφφ φ φ· φφφ φφφ φ φ φ

ΦΦ ΦΦφφ φ·φφφ φφ

A PCR. módszer több egymást követő lépésben vibelezhető ki. Eljárhatunk például úgy, hogy a reakciót lépésenként végezzük, mindegyik lépés után u.j .reagenseket adagolunk; eljárhatunk úgy is, hogy az összes reagenst együtt adagoljuk, vagy használhatunk részben, megszakított eljárást, ebben az esetben megfelelő számú lépés lezajlását kővetően friss reagenst adagolunk.

Előnyősén a PCR reakciót automatizált rendszerben végezzük, amikor termestabil enzimet alkalmazunk. Ebben a folyamatban a reakcióelegyet egy denaturációs régión vezetjük át, továbbá egy primer kapcsoló régión és egy reakciótéren, Használhatunk olyan készüléket, amelyben egy termestabil enzim használatára specifikusan.kifejlesztett reakciótér van, továbbá, amelyben folyadék-cirkulációs rendszer nélkül alkalmazzuk a hőmérséklet-változtatást, mivel az enzimet nem szükséges minden ciklusban adagolnunk. Ezt· a tipu.su készüléket a Perkin Elmer Cetus Corp.-tŐl vásárolhatjuk meg.

A PCR módszerrel történt sokszorosítást követően a célpolinukleotidokat egy olyan poiinukleotid próbához való hibridizációval mutatjuk ki, amely stabil hibridet képez a célszekvenciával, .szigorú-enyhén szigorú hibridizációs és mosási körülmények között. Ha a próbák várhatóan teljesen komplementerek (azaz körülbelül 99 %-osan vagy jobban) a céiszékvencíával, úgy szigorú reakciókörülményeket használunk. Ha némi eltérést várunk, például akkor, ha egy variáns törzzsel dolgozunk, amely a próbával várba* ·φφ Φ φ φ Φφφ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ φ Φ χ Φ φ

X Φ Χ-ΦΦ φ #' ί ♦

ΦΦφφ φφχχ φφ tóan nem lesz teljesen komplementer, úgy a szigorú hibridizációs körülményeket enyhíthetjük, ugyanekkor olyan körülményeket választunk, amelyek kizárják a nem-specifikus vagy véletlen kötődést. Azokat a feltételeket, amelyek befolyásolják a hibridizációt, és amelyek kizárják a nem-specifikus kötődést, ismertek a szakemberek körében /lásd például Maníatís ás munkatársai (1982)/, Általában az alacsony sőkoncentráció és a magas hőmérséklet növeli a kötődés szigorúságát (specificitását). Például, általánosan elfogadott nézet az, hogy a szigorú körülmények között az inkubációt olyan oldatban végezzük, amely 8,1 x SSC-t, 0,1 % SDS-t tartalmaz, az inkubációs és mosási hőmérséklet pedig 8S°C> Enyhén szigorú feltételeket biztosítunk akkor, ha & re akcióé legyek 2 - 2 x SSC-t, 0,1 SPS-t -tartalmaz, és az inkubácids/mosási hőmérséklet 58°C - 65*C. Igen gyengén szigorú feltételek között 2 x SSC-t használunk, és a hőmérsékletet 30^cC és 58°C közé állítjuk be,

A HCV célszekvenciákhoz a próbákat az 1. ábrán megadott HCV cDNS szekvenciából vegy uj HCV i2olátumok szekvenciáiból származtatjuk, A HCV próbák bármilyen használható hosszúságúak lehetnek, olyanok, hogy átérjék a célrégiót, de ugyanakkor nem érintkeznek a primerekkel, és amelyek specifikus hibridizációt engednek meg a célrégióval, Abban az esetben, ha teljes komplementaritás van, azaz, ha a törzs a próbával teljesen azonos szekvenciát tartalmaz, mivel a duplex viszonylag stabil lesz még szigorú reakciókörülmények között is, a próbák rővidebbek *4 4* 4» 4 4 XX

4 4 * 4 .4 * 4

4:4 4 4 4 44 4 »444 x 4 4

44x4 44 4 444 4444 44 lehetnek, azaz

IS - 30 Oázispár hosszúságúnk. Ha a próbával szemben bizonyos mértékű eltérés várható, azaz, ha feltételezzük, hogy a próba hibrldizálni fog egy variábilis régióval, a próba hosszabb lehet, mivel ekkor a komplementaritásban mutatkozó eltérések kiegyenlithetődnek.

A célszekvenoiáva'l komplementer nukleinsav szekvenciát hordozó próbát a fentiekben a primer szekvenciák szintézise kapcsán megadott technikákat használva szintetizálhatjuk. Ha kívánatos,· á próba jelzést hordozhat. A fentiekben megadtunk bizonyos jelzési módokat.

Egyes esetekben szükség lehet a .próbával kimutatott PCR termék hosszúságának meghatározására, Sz különösen akkor igaz, ha feltété leshető, hogy a variáns HCV törzsek a célrégiőn belül deléciőkat tartalmaznak, vagy ha valaki a PCR termék hosszúságát ellenőrizni óhajtja, ilyen esetekben előnyős a termék nagyság-analízise, továbbá a próbával való hibridizációjának vizsgálata, A nukleinsavak hosszának méghatározását a szakemberek körében ismert módszerekkel végezzük, a módszerek közé tartozik például a gél-elektroforézis, koncentráció-gradiensen való ülepítés és a kizáráson alapuló gél-kromatográfia.

A célszekvencia biológiai mintában való jelenlétének meghatározása úgy történik, hogy megvizsgáljuk, hogy a HCV polinukleotid próba és a PCR sokszorosítási technikával kapott nukleinsav között képződött-e hibrid, Egy próba és egy nukleinsav szekvencia között létrejött hibrid kimutatásának módszerei a frfr fr* * frfr * frfrfr fr fr frfrfr fr * fr fr fr frfr frfr-ΦΦ frfr frfr-φφ; φ-frfrfr- frfr szakterületen ismertek. így például az egyszerűség kedvéért eljárhatunk oly módon, hogy egy nem-jelzett mintát hozzákötünk egy kö tőképes, szilárd mátrixhoz, és a kötött mintát olyan körülmények közé helyezzük, amely körülmények között az specifikusan hibridizálódik egy jelzett próbával; ezután vizsgáljuk a szilárd halmazállapotú mátrixot a jelzett próba jelenlétére, Eljárhatunk úgy is, hogy ha a minta jelzett, a nem-jelzett próbát hozzákötjük a mátrixhoz, és a megfelelő hibridizációs körülmények biztosítását kővetően vizsgáljuk a mátrixot a jelzés jelenlétére.

Az előzőekben más előnyös hibridizációs méréseket is bemutattunk.

Az alábbiakban ismertetjük a variáns HCV szekvenciák meghatározását PCR (polimeráz láncreakció) módszerrel,

A variáns HCV törzsek azonosítása és az ezen variánsokhoz szükséges próbák tervezése érdekében a fent ismertetett KCV/cPCR módszert használjuk a HCV genom variáns régióinak sokszorosítására úgy, hogy a variábilis célrégiók nukleotid szekvenciáit. meghatározhassuk. A HCV variáns típusait általában különböző földrajzi helyeken várhatjuk, olyan helyeken, ahol a HCVI törzs domináns, például Japánban, Afrikában és másutt; előfordulhatnak kü.lőnbÖ.ző gerinces fajokban, amelyek a vírussal fertőzöttek, Variáns HCV részecskék megjelenhetnek szövettenyészet rendszerek átólfásakor vagy spontán vagy indukált mutációk eredményeként .

A variáns célrégiő sokszorosítása érdekében olyan prímereket tervezünk, amelyek mintegy meghosszabbítják a feltétéAA A* •A X A A

AAA

ΑΑ A<:

φ A * .<· Ai ·Λ X

AÁAA AA ΑΦ»Α Α*ΑΑ· *A lesett régiót, ezenkívül előnyösen komplementerek a konzervatív régiókkal. A HCV valószínűleg konzervatív két régiójának primerjelt a Plavivírus modell alapján tervezzük. Ezeket a primereket és próbákat az 1. ábrán megadott HüVl törzsre vonatkozó szekvencia -informác1ó alapján tervezzűk.

A célrégió (régiók) nukleotid szekvenciájának analízise történhet a ?CR módszerrel sokszorosított termék direkt analízisével. A PCR módszerrel előállított termékek direkt szekvencia-analízisének módszerét Salkí és munkatársai írják le (1988) .

A szekvencia-analízis előtt a sokszorosított célszekvenoía (szekvenciák) klónozhatok ís. Scharf (1986) módszert közöl az enzimátikusan sokszorosított genomiális szegmensek direkt klónozására és szekvencia-analízisére> A módszer szerint a PCR technikában .használt primereket 5*-végeikhez közel módosítjuk, oly módon, hogy például egy Ml3 szekvenáló vektorba való direkt klónozáshoz megfelelő restrikciós helyek jöjjenek létre. Sokszorosítás után a PCR termékeket a megfelelő restrikciós enzimekkel hasítjuk. A restrikciós fragmensekst Ml3 vektorba építjük, és .például JM1Ö3 gazdasejtbe transzformáljuk, a transzformánsokat szélesztjük, és a kapott plakkokat hibridizációval vizsgáljuk, jelzett oligonukleotid próba felhasználásával. A klónozáshoz és szekvencia-analízishez más módszerek is ismeretesek a szakirodalomban.

Az alábbiakban ismertetjük a Plavívirus-ok ás részecskék általános primőrjeit.

α Π\Λ

ΦΦ

Φ Φ Φ φ· Φ * Φ Φ«*

Φ φ· Φ Α φτφφφ «ΦΦ* *Φ

S8

A HCV genom természetének a HCV cDNS-bői levezetett próbák használatéval történő tanulmányozása, továbbá a HCV cDNS szekvenciájából adódó információkból adódóan az következik, hogy a HCV egy Fiavi-·tipusu vírus, Ezeket az eredményeket a WO 90/14436 sorszámú PCT közrebocsátási iratban közük. A HCV cDNS klánokból származó HCV cDNS összehasonlítása nagyszámú Flavívirus ismert szekvenciájával azt eredményezte, hogy bebizonyosodott, mely szerint a HCV tóbb olyan szekvenciát tartalmaz, ©melyek a Flavívirus-ok konzervatív szekvenciáival homológok* Szakból a konzervatív szekvenciákból kiindulva előállíthatunk olyan, primereket, amelyek a Flavívirus-ok és a HCV célrégióinak sokszorosítására általános érvényűén felhasználhatók. Ezen fajokra specifikus próbákkal azután azonosíthatjuk a fajokat,

A szakirodalomban ismert több Flavívirus genomja, erre vonatkozóan lásd az alábbi közleményeket; dapanese Encephalltis vírus /Sumiyoshi és munkatársai (198?)/; Yellow Hever vírus /(Rice ós munkatársai (1985)/; Dengue Type 2 Vírus /Hahn és munkatársai (1988)/; Dengue Type 4 Virus /Mackó© (198?)/ és West Síile Vírus /Castle és munkatársai (1.988)/. A HCV ribonukleinsav azonosítására a HCV-.re specifikus próbát használunk, ennek szekvenciáját a leíráshoz mellékelt ábrán megadott HCV cDNS-bői származtatjuk.

Ezen vírusok általános érvényű kimutatási rendszerét kapjuk, ha a kodon-degener ált ságot figyelembevéve és a HCV és a. Flavívirus-ok aminosav szekvenciájának összehasonlításából adódó adatokat felhasználva olyan prőbakészleteket használunk, amelyek a Flavivirus-ok és a HCV közös szekvenciáit tartalmazzák.

ΦΧ φΦ -χχ Φφ ΦΦ φ Φ -φ· Φ. φφ χ ΦΦ φφφ φ Φ ΦΦχ

X Φ' X Φ Φ Φ *

ΧΦφΦ «X *.Φ·φΦ φίΦφφ ΦΦ

Az alábbiakban ismertetjük a kívánt dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák előállítását.

A szintetikus oligonukleotidok előállíthatők Warner (1984) által leirt automatikus oligonukleotid szintetizátorral. Szükség esetén izotóppal jelölhetjük a szálakat, ezt úgy végezzük, hogy standard reakciókörülmények között ^^P-ATP jelenlétében polinukleotid-kinázzal kezelünk,

A dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák, köztük a cDNS bankokból izoláltak ismert technikákkal módosíthatók, például hélyspecífikus mutagenezissel /Soller (1982)/. Röviden szólva, a módosítandó dezoxi-ribonukleinsavat egyszálű szekvenciaként fágrészecskékbe zárjuk, és dezoxi-ribonukleinsav polimerázzal kétszálúvá alakítjuk, eközben egy primert használunk, azaz a módosítandó dezoxi-ribonukleinsav szakaszra komplementer szintetikus oligonukleotidot, amely tartalmazza szekvenciájában a kívánt módosítást,' A kapott kétszálu dezoxi-ribonukleinsavat a fágot befogadó gazda baktériumba transzformáljuk. A transzformált baktériumok tenyészete tartalmazza a fág mindegyik DNS szálának replikádéit, ezeket plakkok képzésére agart tartalmazó táptalajra szélesztjük. Az uj plakkok 50 %-a elméletileg olyan fágokat tartalmaz, amelyek a mutált szekvenciát hordozzák, a fágok másik 50 %-a az eredeti szekvenciát hordozza, A plakkok replikátumait jelzett szintetikus próbához hibridízáljuk olyan hőmérsékleten és olyan körülmények között, amikor a korrekt szállal bekövetkezik a hibridizáció, de a nem módosított szállal nem. A hibridizációval azonosított szekvenciákat izoláljuk és klónozzuk.

χχτ χ^Χ X# <»Χ

X .χ φ * * X X χ tf.XX « X X«W

X X X X XX Χ· ¥#»χ X* Χ·ΧΧχ Χ·ΑΧΧ XX

A HCV-ből S2árma2ő polinukleotidok szkriningjére alkalmas kit előállítását az alábbiak szerint végezzük.

A HCV minták sokszorosítására és/vagy szkriningjére alkalmas, próbaként és/vagy primerkánt használható oligomereket kítbe csomagolhatjuk, A HCV szekvenciák szkrinelésére. alkalmas kitek tartalmazzák az oligomer próba dezoxl-ribonukleinsavakat.

A HCV szekvenciák sokszorosítására használható kitek tartalmazhatják a sokszorosításkor használt oligomer primereket. A kitek általában előzőleg kimért vagy meghatározott mennyiségben tartalmazzák a próbákat vagy prímeteket, továbbá más edényekben a megfelelően csomagolt reagenseket és anyagokat, amelyek szükségesek az egyes hibridizációkhoz és/vagy sokszorosításokhoz. Így például a kit tartalmazhatja a dezoxi-ribonukleinsav szálakat, puffarokat, vivőanyagokat, enzimeket, szubsztrátokát, jelzett próbákat, kótópartnereket és/vagy a teszt használatát megadó utasításokat.

Az alábbiakban példákkal ismertetjük a szabadalmi leírást, a példák szemléltető jellegűek, és nem korlátozzák a leírás érvényét,

ΦΦ <^·3Φ φφ φφ: ΦΦ * * Φί χ φ. Φφί· Φ

Φ φφφ φ. Φ· φ!φ{·φ ·$ 5> Φ á Φ * Φ

ΦΦφ,φ: φφ Φ·£φ<. χφφφ ΦΦ

S3

ί.példa

Αζ 5^f-HCV ribonukleinsav pozitív é szérumban legativ száljának kimutatása

A szérumból izolált HCV27 ribonukleinsavát analizáljuk pozitív és negatív szálak jelenlétére PCR módszerrel. A PCR módszert a fentiekben xnegadottak szerint vifelezzük ki, kivéve az alábbiakat:

Az extrahált HCV2? ribonukleinsavat reverz transzkríptázzal egyszáíú cDHG molekulákká alakítjuk, primőrként Alex90~et vagy JH52-t használva. Az Alex90 a HCV1 genom 312-tól a -283~ig terjedő nukleotidjaiból származtatott, alábbi szekvencia:

S’ ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTC AGC AAC TAC 3 .

A CHS2 a HCV -93 - -117. nukleotidjaiból származtatott szekvencia; az alábbi .szekvenciában a nukleotidok számait zárójelek között adjuk meg. A CHS2-ben az aláhúzott dinukleotidot Hotl hely előállítása érdekében mutálhattuk. A GHS2 szekvenciát az alábbiakban adjuk meg:

l.SXiTex.1 NotX . HCV tz^kvencia (JH52) 5·' ACTCTT CCGG££GC ACGCCCAAATG (-93) (1X7)

Az Alex30 szekvenciája a HCV ribonukleinsav pozitív száljának -312 - -283. nukleotidjainek felei meg, mig a JH52 megfelel a negatív szál -11? - -93. nukieotidjainak. A kapott egyszálú HCV cDNS-ek mindegyikét az Alex90 ás a JH52 felhasználásával polimeráz. láncreakcióval (PCR) sokszorosítottuk, A sokszorosított termékek -kimutatását Southern-blotting-gal mutattuk ki, próbaként az AlexSS szekvenciát használva. Az Alex89 a- HCV ribonukleinsav -203-től a -175. nükieotldjáig terjedő szakasznak felel meg. Az Alex89 szekvenciája az alábbi:

5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3.

A módszer szerint kivitelezett analízis szerint mindkét ribonukleinsav szál sokszorosított termékének szignálja azonos intenzitású. Ezen eredmények szerint a HCV ribonukleinsava az .5*-régióban kétszáíú ribonukleinsavként létezhet.

A HCV RNS kimutatása plazmában HCV/cPCR technikával, a HCV ribonukleinsavának s^!-régiójából származtatott primerekkel és próbákkal

A HCV ribonukleinsav extrakoiója plazmából

A fagyasztott plazmát P3 kupakban felolvasztjuk. 2 m'J

φ * ΦΦΦΦ φφ.

φφ . φφ φ» φ· φ * φ φ •φ φ φφφ

Φ » Φ φ

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ $φ térfogatú míkrocentrifuga csőbe 8,2 ml emésztő elegyet helyezünk, és 37^öc hőmérsékletre melegítjük. Az emésztő elegy összetétele a következő:

100 mM trisz-hidroklorid, mM etílén-diamln-tetraecetsav,

200 mM nátrium-klórlő, pg/mi MS2 ribonukleinsav,

0,5 %SDS és 2 mg/ml protelnáz k, az elegy pH-ja - 8.

Ezután 0,2 ml plazmát adagolunk az elegyhez, és 1 órán át 60°c hőmérsékleten tartjuk. Ezután 8,4 ml fenolt adagolunk, és háromszor 30 másodpercig vortexezzük az elegyet, mindegyik vortexezés közben 30 másodperc szünetet tartunk. Ezután 5 percen át centrifugálunk, és a vizes fázist elkülönítjük. A szerves fázist 0,1 ml TES oldattal extraháijuk, és az összegyűjtött vizes fázisokat kétszer 1 térfogatnyi fenol/kloroform/lAA eleggyel, ezután 1 térfogatnyi kloroformmal extraháljuk. Az extráktűmhez 1 pi (2 pg) glikogént (Boehringer Mannheim Corp.) és 25 pl nátrium-acetátot (3 mól, pH « 5,4) és 1,25 ml hideg etanolt adunk, amiután száraz jégben lefagyásztjuk a reakcióelegyet, és 10 percen át centrifugáljuk. Az üledéket 180 pl desztillált vízzel feloldjuk, és 5 pi nátríum-aoetátot (pH ~ 5,4) adagolunk 258 pl hideg etanollal. Az oldatot- ismét lefagyasztjuk és centrifugáljuk, a kapott centrifugációs üledéket 10 pl. desztillált vízben feloldj uk.

χ χ X < frfr X * * A

X fr fr ' fr * fr * .>· < frfr· <· V - * fr fr fr <· A X fr 9 * xX*x frfr *frxx yfr*A *♦

A cSNS szintézise

Az extrahált ribonukleinsavból oDNS-t szintetizálunk úgy, hogy 5 pl oldott ribonukleinsavat 4 μΐ viz és 1 μΐ RT primer jelenlétében inkubálunk; a primer mennyisége 1 pg vagy 166 .pmól (18-mer). Az inkubálést 7ö*C hőmérsékleten végezzük 3 percen át, majd jég fürdőben lehűtjük az elegyet. Az RT primer szekvenciája az alábbi;

’ CCC AAC ACT ACT CCG CTA 3 >.

Az első inkubáció után az elegyhez az alábbi anyagokat adagolj uk:

lö μΐ Sx első szál* puffer (258 mM trisz-hidroklorid, pH »» 8,3, 375 mM kálium-klorid, 15 mM magnézium-díklorid, 50· mM ditio-treitol);

2,5 μΙ dezoxi-nukleozid-trifoszfátok (mindegyikből

Ί Λ v

2,5 al reverz transzkriptáz (ΜΜΪ,-V, BRL cégtől, 200 egység/μΙ), és az elegyet desztillált vízzel 50 pl-re egészítjük ki.

Az elegyet 1 érán át 37°c hőmérsékleten inkubáljuk, majd 3 percen át 98®C .hőmérsékleten tartjuk, amiután jég*ütdőben lehűt> <AÍ\ fr.

* X φ φϊΐ .ν * ΦΦΧ φ φ Φ Φ * * *

ΦΦΦΦ «* ΦΦΦΦ Φ**Φ Μ

PCR sokSΖΟΧΟsί tás

A fentiek szerint előállított HCV oüHS-t PCR módszerrel sokszorosítjuk, kontrollként és tes2t-reagensekként az alábbi táblázatban megadottakat használva, A táblázatban az RNS olyan kontroli-mintát jelent, amelyben HCV1 részecskékkel nem fertőzött egyénből nyert ribonukleinsavat tettünk? a mintával végigcsináljuk a cDNS szintézist ós a PCR sokszorosítást. A cDNS” olyan kontrollmintát jelent, amelyet végigvittünk a cDNS szintézis és a PCR sokszorosítás lépésein; azonban ebben az esetben a ribonukleinsav alikvőt helyett vizet adagolunk a cDNS szintézis kivitelezésekor, A templát” a PCR reakció során olyan kontroll, amelyből a templátot kihagyjuk, A “minta” azt a szérumot jelenti, amelyet vizsgálunk a HCV ribonukleinsav jelenlétére .

KHB (μΐ) vi z ki eg é s z i t ve löö, ö - ra löx puffer 10,δ d»-k 18,0

CDNS

Templál (pl) >rimer 1 primer 2

0,5 ö,5 *\ -x·¹· ·**, í í } i i \ $ *· V <55

Λ* A φ \v A, \*A

Λ· Λ A. \·' j- V

18,8

A.Vvjr V *

Π

18,8

Ö, 5

0, 5

1ÖÖ,Ö-ra

1Ö,Ö

18,0

8, 5 >ΦΧΧ «*

ΧΧφφ ΧΦΦ>· φ* •X X (A táblázat .folytatása) ;empiát 'aq Föl o 4

V f s-‘

Az 1 primer és a 2 primer mennyisége sorrendben 0,5 pg/yl és 8,42 μρ/μΐ, nukleotid szekvenciájuk pedig az alábbi:

Primer 1: 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT CTG ACG AAC 'TAC 3 £· >. ?>,Λίίί >'<?TSÍT! χ'^ί'^ΖΦ Α’Ά’'·'Ά »**^ι.Λ .'^•TX X Λ m '> ί '> * Vii ww· <s<-A kv-uA ΛΛΧ J

Szak a primerek bibridizáldönak a HCV genom 5^! -végének konzervatív régiójával. A minták 12,5 ul, HCV cDNS-sel ekvivalens szérumot tartalmaznak. A sokszorosítási ciklus körülményei az alábbiak:

ciklus: bőkezelés: 9é^öC, 1,5 percig kapcsolás: 60°C, 2,0 percig hosszabbítás: 72®C, 3,0 percig.

A végső lánchosszabbitás: 72 °C, 30 percen át.

Az áztatás 4°C hőmérsékleten folyik, a teljes kimosódásig.

A sokszorosított terméket jelzett dezoxi-ribonukleinsavval vizsgáljuk. A próba szekvenciája a kővetkező:

φ XX Φ * $

X Φ ΦΧ *Φ φ φ .Φ X φ _χ X ΦΦΦ φ φ * φ χφφφ φΧ*Φ ** & < <r:r«rf* ,··χrv??*s λΛ χ mzt X ·*_?*<Α yxzx<-\ A'>_{*e φ ά αχλχ φχζχ:· <·*<ζ·» Α <

χ χ χ Vix \svsA 3áJ\ xY\s.C C\yL Aiu νΛ, χ J · <

A fenti eljárással több mint 200 HCV szérum-pozitív mintát vizsgáltunk. Csak azokkal az eredményekkel foglalkozunk, amelyekben a kontroll minták eredményei negatívak. Ebben az esetben az összes szérum-pozitív minta pozitívnak bizonyult a PCR mérés során ís,

A HCV RNS feltételezett ^f!felületi'' régiójából származtatott próbák

Különböző HCV izolátumok cDNS molekuláinak nukleotid. szekvenciája analíziséből az derül ki, hogy az 1 - 570 nukleotid régióban (lásd az i. ábrán megadott nukleotid számozást) nagymértékű szekvencia kon zervat.izmus nyilvánul meg. Hz a régió feltételezhetően egy felületi (core) HCV polipeptídet kódol. Különböző földrajzi helyeken (Japánban és Amerikában) izolált öt különböző izolátum konszenzus szekvenciáit mutatjuk be a 2. ábrán, ahol a HCVI a prototípus HCV; a HCVI nagy ORF régiója által kódolt aminosavakat a konszenzus nukleotid szekvencia felett adjuk meg. A 2. ábra szekvenciái közül a hcv-jh Dr. Tetsu Miyamura (National Institute of Health of Japan) személyes közleményéből származik, a JC-JÍ és a JC-J4 szekvencia Mayumi és munkatársaitól ered (1990). A 2. ábrán látható, hogy a feltételezett “core* régióban a konszenzus szekvenciák között legalább

ΦΧΦ φφ .Φί φ X Φ * φ φφφ φ Φ X φφ ** φ X Φ Φ

Φ φ Φ X

Φφ. ΦΧΦΦ ΦΦ*Φ ♦*' %-os homológia létezik a kcvi szekvenciával összehasonlítva.

A *i és a 4-571 nukleotidok közötti régió nagymértékű homológiája miatt azok a próbák, amelyek ezen régióhoz kapcsolódnak, a HCV pozitív biológiai anyagok szkrínelésére felhasználhatók.

A 3. ábrán mutatjuk be azokat a jelzett próbákat, amelyek felhasználhatók a HCV ribonukleinsavának azon régiója kimutatására, amelyek feltételezhetően a HCV felületi polipeptíóét kódolják. A 3. ábrán egy próba-sor szám” egy sorozat olyan polinukleotióot foglal magába, amelyek a 3. ábrán megadott IUB csoportkőd jelzései szerint heterogenitást tartalmaznak. A heterogenitások alapján alkalmazkodhatunk a különböző izolátumok konszenzus szekvenciáiban talált nukleotid. szekvencia-különbségekhez. A 3, ábrán bemutatott próbakészletben szereplő próbák a

4. ábrán megadott HCV szekvencia régiókhoz komplementerek, az ábrán a nukleotidokat az 1. ábra szerinti módon számoztuk.

A próba-készletet a HCV szekvenciák kimutatására- használtuk. A mérés módját a WO 90/14436 sorszámú PCI közrebocsátási iratban olvashatjuk, abban a példában, amelynek cime: ”A HCV szendvics hibridizáció próbái.

Iödrl--.álhálnayhatóság

A leírásban megadott módszerek, továbbá az oligomerek, mind a próbák, mind pedig a prímetek, amelyek a HCV cDNS-bői származtathatók, továbbá az ezeket tartalmazó kitek felhasználhatók a biológiai mintákban, levő HCV pontos, viszonylag egyszerű és gazdaságos meghatározására, különösen as olyan vérben levő

ΧΦ

- 67 HCV kimutatáséra, amelyeket vérátömlesztésre használunk, továbbá azon egyének vizsgálatára, amelyek feltehetően HCV-vei fertőzöttek.. A fentieken kívül a leírásban megadott módszerek és oligome rek felhasználhatók a HCV fertőzés korai kimutatására, korábbi jelzést kaphatunk, mint egy rekombináns HCV polipeptid használatán alapuló immunológiai méréssel. Egy bővített polinukieotid hibridizációs méréssel olyan alkalmi mintákból mutathatjuk, ki a HCV ribonukleinsavat, -amelyek anti-ECV antitest negatívak. így a leírásban ismertetett próbákat -és prímeteket bővített hibridizációs mérésekben használhatjuk, a HCV peptídeken alapuló immuno mérésekkel együtt, a HCV-nek tulajdonított fertőzések és a HCVvei fertőzött biológiai anyagok, ideértve a vér teljesebb azonosítására .

A leírásban ismertetett információk lehetővé teszik a primerek és/vagy próbák megtervezését, amelyeket a HCV genom kon zervativ régióiból származtatunk. Ezen. primerek és- próbák léte általános érvényű módszer kidolgozását teszi lehetővé, amellyel kimutathatjuk a variáns HCV törzseket, és amely felhasználható a vér és a vérből készült termékek zzkrinelésére.

Ha a leírásban ismertetett módszerben olyan prímért használunk, amelyet a HCV genom konzervatív régióiból származtattunk, úgy a módszer módot ad a HCV variáns törzseinek kimutatására és/vagy azonosítására. Sz ugyanakkor olyan további immuno lögiai reagensek kifejlesztéséhez vezethet, amelyek alkalmasak a HCV kimutatására és diagnosztizálására, továbbá a HCV kimutatáΦΧ φ φ * * φ φ φ φ »·♦* φ X Φ

ΦΦ<ΧΧ ΦΦ

ΦΦ ΦΦ χ Φ Φ

Φ Φ Φ ΦΦΦΦ ΦΦ

Β9

Sára és/vagy kezelésére alkalmas további poiinukleotid reagensek kifejlesztésére<

Fentieken kívül, a Flavivirus és a HCV aminosav szekvenciáinak konzervatív régiéi alapján, tervezett primer és próbakészletek lehetővé teszik ezen fertőző ágensek egyetemes érvényű kimutatási módszerének kidolgozását,

Az alábbiakban megadott anyagokat a Budapest Egyezmény alapján letétbe helyeztük az American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr.,, Bookvi'lle, Maryland 20852. A letétbe helyezett anyagok az alábbi letéti sorszámot kapták:

iambda-gtll	ATCC NO,	Letéti	. óát	:um.
HCV cDNS könyvtár	40394	1987,	* Λ ,Ό A	91,
klón 81	49388	1987,	11.	17»
klón 91	40389	1987,	11,	17 „
klón 1-2	49390	1987 ,	11,	17,
klón 5-1-1	40391	1987,	11.	18,
klón 12f	49514	1988,	X Φ»· s·	10,
klón 35f	40511	1988,	5 's	10,
klón 15e	49513	1988,	11,	19,
klón K9-1	49512	1988.	11.	19,
JSC 300	20879	1988,	05,	05,
PS356	87683	1988,	94,	29,
w -S. ss ,·.·. V. ... .. ...	.·»· ,SS SS SS .S· ,SS ,,	.. ... ...

fr

Xfrfr

1989. 05.

Törzs én az alábbi anyagokat helyeztük letétbe

ATCC No.

ni '>τ tt fr. is SS1 -Á \í	CCT1/S~1~	X)		67367
D1210	CCFi/8!)		£F	67968
B1210	/ *$i fr / .>·>· Λ >7 λ	a)		67963
DX210	CCF1/36T)		AB	67 970
DÍ210	(CF1/279S	)	EF	67971
Dl 210	(CF1/C36)		CD	67972
B12XS	(CF1/13.Í)		AB	67973
DI210	(CF1/C33Ö		Ϊ?Ρ	67974
DX210	(CF!/CA290a)	AB	67375
HB101	CAB24/C10	0 #3R}		67976

A D121-3 törzs következő utdötörzseit 1989. 05. δ3-ám .helyeztük letétbe;

Utódtőrzs

VICC NoPCF1CS/C8T pCF!AB/Cl2f

PCI /í

67356

67352

67943

67354 φφ »·-♦ φ * φ

Φ Φ φχ χ Φ *

ΦΦχφ ΦΦ

Φφ ΦΦ Α*

Φ φ Α Φ * χ Φ Φ Φ ·Φ χ φ Φ

ΧΦΦΦ φ·ΦΦΦ Φ*

PÍ1F1AB/C25C	679 SS
PCP1EF/C33C	67353
PCP1BP/C33Ó	67050
pCP!CD/33g	67951
pCP2CD/C39c	67955
PCFIEF/Cáöb	67957
pCPlBP/CAl6?b	67959

-én az alábbi törzsek letétbe helyezése történt meg:

lambda	gtll(C3S)	40603
lambda	gtlO(béta-5a)	40602
ΦΧ -Ϊ ·*> Λ .'«J .k k< 1, V	(C4öb)	67980
P1210	(M16)	67981

Az alábbi biológiai anyagokat 1990, 03« 23~án helyeztük letétbe;

Anyag

ATCC No, klón32 (pUClSS)

68274 φφ.

** *'*·

Φ Φ ·* * ^Λ φ χΦΦ X _.

. * * ί » » . ’

ΧΦΦΦ X* Φφφχ φφφ* »:*

Az amerikai egyesült államok-beli szabadalmi engedélyezési és kiadási folyamat kézben a letétek hozzáférhetőségének korlátozását megmásithatatlanui visszavonták? a nevezett letétek hozzáférhetősége a folyamodvány függőségi állapota alatt a 37 CFR 1.14 és a 35 DSC 1.22 alatt megnevezett meghatalmazottól függ. A jelzett letéteket a letétbe helyezéstől számítva 38 éven át tartják meg, vagy az utolsó igényt kővető további 5 évig vagy ez amerikai szabadalom érvényességi idejéig, akármilyen hosszan. A leírásban megadott letétek csak kényelmi okokból születtek, és nem érintik a leírásban megadottak gyakorlati kivitelezését, és ezenkívül ezek az anyagok a leírásban referen-·

Claims (12)

1. StABAtALdl IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás HCV szekvencia kimutatására egy feltehetően HCV polinukleotidot tartalmazó, elemzendő DNS szálban, ahol a HCV polinukíeotíd egy kiválasztott cél (target) régiót tartalmaz, azzal j e 1 1 e m e z ve, hogy

   a) egy elemzendő polinukíeotíd szálban esetleg létező HCV szekvenciához hibridizálö olyan oligomert állítunk elő, amely oligomer olyan polinukíeotíd szekvenciát tártálmáz, mely a HCV genom (lásd az 1. ábrát) alábbi régióival komplementer oligonukléotiöf»í|ből áll: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 146-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 396-427 ^457-486?

   h) az elemzendő szálat az a) szerinti oligomerrel inkubáljuk, amikor a kapcsolódó (targeting) ás a cél (target) szekvencia között specifikus hibrid duplexek képződnek: ás

   c) az esetleg jelenlevő célrégiő (target) és az oligomer között képződő hibrideket kimutatjuk.
2. 2>· Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal j e I 1 em e z v e, hogy

   a) olyan oligomer sorozatot állítunk elő, amelyek a polímeráz láncreakcióban (PCR) printerként szerepelnek, és amelyek meghosszabbítják a cél (target) régiót? és

   b) a cél (target) régiót a PCR-mődszerrel sokszorozzuk.

   .λ...

   »* χχ χχ

   Κ <ί χ χ * At

   Λ * > »

   -χχ
3. 3. Készlet (kit) egy elemzendő szálban levő HCV cél (target) szekvencia kimutatáséra, azzal j el lemezve, hogy az 1 \ „ts^, igénypont szerinti oligomereket X®élí?éTéIÖ~edényekbe csomagoi
4. 4. Eljárás HCV-mentes vér előállitására, azzal jellemezve, hogy

   a) egy feltehetően HCV cél (target) szekvenciát tartalmazó, vérmintából elemzendő nukleinsavakat állítunk elő;

   b) egy elemzendő polinukleotid szálban esetleg létező HCV szekvenciához hibridizáló olyan oligomert állítunk elő, amely oligomer olyan polinukleotid szekvenciát tartalmaz, amely a HCV genom (lásd az :1. ábrát) alábbi régióival komplementer oligonukleot.i<^)^3ői áll: 16-45, 49-78, 82-1X1, ÜS-144, 148-177, 211-248, 242-271, ς χ'ίζ ·*·\ >

   275-304, 332-361, 365-394, 388-42? W?457~486;

   c) az a) szerinti nukleinsavat a b) szerintivel reagáltatjuk olyan, körülmények között, amikor a kapcsolódó (targeting) szekvencia és az esetleg jelenlevő cél (target) szekvencia között polinukleotid duplex képződik ;

   d) a c) szerinti duplexet kimutatjuk; és

   e) tároljuk azt a vért, amelyből a d) szerint komplexeket nem mutattunk ki.
5. 5, HCV kimutatására alkalmazható reagens, azzal jellemezve, hogy a reagens tartalmaz:

   egy, az 1 . ábrán bemutatott, alábbi béziscsoportokból álló, a HCV genom egy régiójával komplementer oligonukleotid szekvenciát: 18-45,49-78, 82-111,115-144,148177, 211-240, 242-271,275-304, 332-351, 355-384,388-42? vagy 457-488.
6. 6, Az 45. Igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid egy kimutatható jelzést tartalmaz.

   ?, Izolált polinukleotid. amely egy HCV célzó szekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a célzó szekvencia egy legalább 10 nukleotidből álló lineáris szekvenciát tartalmaz, amely kompjementer-^áme^ez 1, ábrán bemutatott szekvenciák ktSlSSSSblakketj 15-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148 275-304, 332-381, 365-384, 388-427, 457-438 vagy komplementig

   177, 211-240, 242-271, . igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy az egy polinukleotid.
7. 9. A 7, igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, sV poHXukleotld.

   tz &
8. 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a poiínukleotidot kémiai szintetikus módszerrel állítjuk elő.
9. 11. A 7-10, igénypontok bármelyike szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a polinukleotid előállítása során a polinukleotid kialakításában résztvevő anyagok pelimenzácíójának katallzálására egy polimerázt alkalmazunk.
10. 12. A 11. igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a pollmehzáelét rekombináns gazdesejthen katalizáljuk.
11. 13. A 12. Igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt prokarióta sejt.
12. 14. Α 13, igénypont szerinti epiinukleotkl, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt eukarióta sejt.