BG61615B1 - Nanbv диагностика: полинуклеотиди за изследване на вируса нахепатит с - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до материали 5 и методи за изследване разпространението на нито-А, нито-В хепатитната вирусна инфекция (NANBV). По-специално, то се отнася до етиологичен агент на нито-А, нито-В хепатит (NANBH), хепатит С вирус (HCV) и до полинуклеотиди и техни аналози, които могат да се използват в изследванията за откриване на HCV в биологични проби.

Нито-А, нито-В хепатитът (NANBH) е трансмисивно заболяване или фамилия от заболявания, които се счита, че са вирус-индуцирани и които са ясно отличими от други форми на вирус-асоциирани чернодробни заболявания, включително тези, причинени от познати вируси, като например вируса на хепатит А (HAV), вируса на хепатит В (HBV) и вируса на хепатит делта (HD V), а така също и хепатита, причинен от цитомегаловируса (CMV) или вируса на Epstein-Barr (EBV). NANBH е идентифициран за първи път в трансфугирани индивиди. Трансмисията от човек на шимпанзе и серия пасажи у шимпанзета доказват, че заболяването NANBH се дължи на трансмисивен инфекциозен агент или агенти.

Епидемиологичните доказателства предполагат три типа на NANBH: воден епидемичен тип, кръвен или игловидно асоцииран тип и спорагично срещан (обществено придобит) тип. Обаче, числото на причинителите на NANBH е неизвестно.

Известни са редица кандидати за NANBV, вж. например литературни източници №№ 73, 22, 68, 69, 70 и 43. Но няма доказателство, че някой от тези кандидати представя етиологичният агент на NANBH.

Много е важно откриването на чувствителни, специфични методи за изследване и идентифициране на носители на NANBV и NANBV - контаминирана кръв или кръвни продукти. Посттрансфузионен хепатит се появява приблизително при 10% от пациентите, на които е осъществено кръвопреливане, и NANBH достига почти до 90% от тези случаи. Найголемият проблем в това заболяване е честото прогресиране до хронично чернодробно увреждане (25-55%).

Грижата за предпазване на пациентите от трансмисия на NANBH чрез кръвта или кръвните продукти или чрез близък личен контакт изисква надеждни средства за изследване, диагностика и прогноза с оглед откриване нуклеинови киселини, антигени и антитела, свързани с NANBV.

Методи за откриване на специфични полинуклеотиди чрез хибридизационни проби са известни в областта. Вж. например литературни източници №№ 49, 47, 50 и 112.

Методи за изолиране и/или откриване на специфични полинуклеотиди чрез хибридизация не могат да се използват за HCV до откритието на заявителя на изобретението. Изобретението на заявителя осигурява материали и методи за получаване на вирусни геномни последователности, които са изложени в РСТ публикация WO90/14436.

Един аспект на изобретението е метод за откриване на HCV последователност в аналитична верига, която се предполага, че съдържа HCV полинуклеотид, където HCV полинуклеотидът включва мишенна област, а този процес включва:

а/ осигуряване на олигомер/и, способни на хибридизация с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, където олигомерът включва полинуклеотидна последователност, избрана от група, състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на следните региони от HCV генома (фиг.1): 16-45, 4978, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457486.

Ь/ инкубиране на аналитичната верига с олигомера/ите от а/, което позволява образуването на специфични хибридни дуплекси между насочената и мишенната последователности; и с/ откриване на хибриди, формирани между мишенния регион и олигомера/ите.

Друг аспект на изобретението е метод за откриване на HCV последователност в аналитична верига, за която се счита, че съдържа HCV полинуклеотид, където HCV полинуклеотидът включва подбран мишенен регион, като този процес включва:

а/ осигуряване на олигомер/и, способни на хибридизация с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, където олигомерът е включен в полинуклеотидна верига (последователност), подбрана от група, състояща се от олигонуклеотиди, комплсментарни на следните области от HCV генома (фиг.1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361,365394, 398-427, 457-486.

Ь/ инкубиране на аналитичната верига с олигомера/ите от а/, което позволява образуването на специфични хибридни дуплекси между насочената и мишенната последователности; и с/ откриване на хибридите, формирани между мишенния регион, ако има такъв, и олигомера/ите, като другият олигомер/и включва полинуклеотидна последователност, подбрана от групата, състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на следните области на HCV генома (фиг.1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486.

Друг аспект на изобретението е метод за получаване на свободна от HCV кръв, включващ:

а/ осигуряване на аналитични нуклеинови киселини от проби на кръв, за която се счита, че съдържа HCV мишенна последователност;

б/ осигуряване на олигомер/и, способни на хибридизация с HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, ако е налице такава, където олигомерът е включен в полинуклеотидна последователност, подбрана от група, състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на следните области от HCV генома: (фиг.1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486.

в/ реакция на а/ с б/ при условия, които позволяват образуването на полинуклеотиден дуплекс между насочената последователност и мишенната последователност, ако има такава;

г/ откриване на дуплекс, образуван в с/, ако има; и д/ запазване на кръвта, в която не са открити комплекси в г/.

Друг аспект на изобретението е метод за получаване на кръв, свободна от HCV, включващ:

а/ осигуряване на аналитични нуклеинови киселини от проба кръв, за която се счита, че съдържа HCV мишенна последователност;

б/ осигуряване на олигомер, способен на хибридизация с HCV последователност от аналитична полинуклеотидна верига, ако има такава, където олигомерът е включен в полинуклеотидна последователност;

в/ реакция на а/ с б/ при условия, които позволяват формиране на полинуклеотиден дуплекс между насочената последователност и мишенната, ако има такава;

г/ откриване на дуплекс, образуван във в/, ако има такъв, с друг олигомер/и, където другият олигомер/и включва полинуклеотидна последователност; и д/ запазване на кръвта, в която не са установени комплекси в г/.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 показва съставната HCV сДНК последователност, получена от клона, описан тук, и от съставната HCV сДНК, представена в РСТ WO90/14436. Клоновете, от които е получена последователността, са 5'-клон 32, bl 14а, 18g, ag30a, СА205а, СА290а, СА 216а, pil4a, СА 167Ь, СА 156е, СА84а, СА59а, К9-1 (наричана също к9-1), 26j, 13i, 12f, 14i, lib, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k и pl31jh. Във фигурата трите хоризонтални черти над последователността показват позицията на предполагаемия иницииращ метионинов кодон. Така също е показана аминокиселинната последователност на предполагаемия полипротеин, кодиран в HCV сДНС. Хетерогенетичните HCV] и клонираните ДНКи са индикирани чрез аминокиселините, посочващи по-горе предполагаемата кодирана последователност на дългата ORF; кръглите скобки показват, че хетерогенността е установена при или близо до 5'- или 3'-края на HCV сДНК в клона.

Фигура 2 показва общите ДНК последователности за пет различни HCV изолата от различни географски области (Япония и САЩ), където аминокиселините, кодирани от дългата ORF от HCV], са показани над ДНК последователностите.

Фигура 3 - последователностите от белязаните проби за откриване на HCV РНК в биологични проби, използвани в пример 3.

Фигура 4 - подреждането на пробите във фиг.З с HCV съобразно номерирането им на фиг. 1.

Начини за осъществяване на изобретението

Терминът “Хепатит С вирус” (HCV) е запазен от работещите в областта за хетерофорен неизвестен етиологичен агент на NANBH. Прототипът на изолата е идентифициран в US 122714 (Вж. също ЕР 318216). Терминът HCV също включва нови изолати от същия вирусен вид. Като едно разширение на този термин, болестта, причинена от HCV, формално наричана кръвен NANB хепатит (BB-NANBH), е наричана хепатит С. Термините NANBH и хепатит С могат да бъдат използвани взаимозаменяемо тук.

HCV е вирусен вид, чиито патогенни щамове причиняват BB-NANBH. Тук могат да бъдат причислени също атенюирани щамове или неизправни пречещи частици, получени от тях. Както е показано тук, HCV генома е включен в РНК. Известно е, че РНК съдържащи вируси имат относително висока степен на спонтанна мутация, т.е. в рамките на от 10‘³ до 10“* за инкорпориран нуклеотид /23/. Поради това, доколкото хетерогенността и флуидността на генотипа са присъщи на РНК вирусите, налице са мултиплени щамове / изолати, които могат да са вирулентни и авирулентни в рамките на HCV вида. Съставите и методите, описани тук, дават възможност за размножаване, идентификация, откриване и изолиране на щамовете на HCV вируса или на неговите изолати.

Идентифицирани са няколко различни щама (изолати на HCV), РСТ WO90/14436. Един такъв щам или изолат, който е прототип, е наречен СДС/НСУ[ (също наричан HCV^. Информация от един щам или изолат, като напр. частична геномна последователност, е достатъчна да позволи на специалиста в областта, използвайки стандартни техники, да изолира нови щамове/изолати и да определи дали даден нов щам/изолат е HCV. Например, по-долу са изолирани няколко различни щама/изолата. Тези щамове, които са получени от различни човешки серуми и от различни географски райони, са изолирани, оползотворявайки информацията от геномната последователност на HCV_r

Използвайки техниките, описани в РСТ WO90/14436, геномната структура и нуклеотидната последователност на HCV, геномна РНК са изведени. Изглежда геномът е еднове рижна РНК, съдържаща приблизително 10 000 нуклеотида. Геномът е позитивно-верижен и има непрекъсната, транслационна отворено читаема рамка (ORF), която кодира полипротеин с около 3000 аминокиселини. В ORF структурните протеини са кодирани в приблизително първата четвърт от N-крайната област, с преобладаване на полипротеин, отговорен за неструктурните протеини. В сравнение с всички познати вирусни последователности се наблюдават малки, но значителни ко-линеарни хомологии с неструктурни протеини от семейството на флавивирусите и с пестивирусите (които сега се счита, че са част от семейството на флавивирусите).

Полипротеинът на флавивирусите съдържа от аминокрая до карбоксикрая нуклеокапсидният протеин (С), матричният протеин (М), затвореният протеин (Е) и неструктурният протеин (NS) 1,2 (а+в), 3,4 (а+в) и 5. Основано на предполагаемите аминокиселини, кодирани в нуклеотидната последователност на HCV_p малка област от крайния N-край от HCV полипротеин се явява аналогичен както по размер, така и по високо съдържание на основни (базични) остатъци на нуклеокапсуларния протеин (С), намерен при N-края на флавивирусният полипротеин. Неструктурните протеини 2, 3, 4 и 5 (NS 2-5) от HCV и от вируса на жълтата треска (YFV) имат броими части с аналогичен размер и хидропатичност, макар че има различие в аминокиселинната последователност. Обаче, областта, която кореспондира на областите от YFV полипротеин, съдържащ М, Е и NS, протеин, не само се отличава по последователност, но е твърде различна едновременно и по размер и по хидропатичност. Така, докато основни области :от HCV генома могат да бъдат отнесени към, например NS] или NS₂, може да се заключи, че тези означения са спекулативни. Възможно е да има значителни различия между HCV семейството и семейството на флавивирусите, което трябва вече да се оцени.

Различни щамове, изолати или субтипове от HCV се очаква да съдържат различни вариации от аминокиселини и нуклеинови киселини в сравнение с HCV_r Много изолати се очаква да покажат повече (т.е. над 40%) хомоложност в аминокиселинната последователност в сравнение с HCV,. Обаче, може да се установят също други, по-малко хомоложни

HCV изолати. Те трябва да се определят като HCV съобразно различни критерии, като например ORF от приблизително 9000 нуклеотида до приблизително 12000 нуклеотида, кодиращ полипротеин, аналогичен по размер с този на HCV_p един кодиран полипротеин с аналогична хидрофобност и/или антигенност с тези на HCV] и присъствието на колинеарни пептидни последователности, съхранени с HCV_r В допълнение се счита, че геномът следва да бъде позитивно-верижна РНК.

Всички HCV изолати кодират най-малко един епитоп, който е имунологично определяем (т.е. може да бъде подложен на кръстосана имунна реакция) с епитоп, кодиран в НСУсДНК, описана тук. За предпочитане е епитопът да се съдържа в аминокиселинна последователност, описана тук и е уникална за HCV, когато се сравнява с известни патогени. Неуникалността на епитопа може да се определи чрез неговата имунологична реактивност с анти-HCV антитела и липсата на имунологична реактивност с антитела на известни патогени.

HCV щамовете и изолатите са еволюционно свързани. Затова се очаква общата хомоложност на геномите на нуклеотидно ниво да бъде около 40% или повече, вероятно може да бъде около 50% или повече, вероятно около 60% или повече, и дори повече от 80% или над тях. В допълнение, има кореспондиращи непрекъсваеми последователности от най-малко около 13 нуклеотида. Следва да се отбележи, че има вариабилни и хипервариабилни области в рамките на HCV генома. Съответствието между предполагаемата геномна последователност на HCV щама и, напр. СДС/НСУ^ДНК последователност, може да се определи чрез известни от нивото на техниката умения. Например, те могат да се определят чрез директно сравнение на информационната последователност на полинуклеотида от предполагаемия HCV и HCV сДНК последователността/ тите/, описани тук. Също така могат да се определят чрез хибридизация на полинуклеотидите при условия, които формират стабилни дуплекси между хомоложните региони, напр. онези, които биха били използвани порано за S, разграждане, следвано от разграждане с едноверижна специфична нуклеаза/и, следвано от определяне размера на получените отрязъци.

Поради еволюционните отношения меж ду щамовете или изолатите на HCV предполагаемите HCV щамове или изолати могат да се идентифицират чрез тяхната хомоложност на полипептидно ниво. Очаква се HCV щамовете или изолатите да имат най-малко 40% хомоложност, повече от 50% хомоложност, вероятно повече от около 70% хомоложност и дори повече от 80% хомоложност и някои могат да бъдат повече от 90% хомоложни на полипептидно ниво. Техниките за определяне хомологията на аминокиселинните последователности са известни за работещите в областта. Например, аминокиселинната последователност може да се определи директно и да се сравни с осигурените по изобретението последователности. Обратно, нуклеотидната последователност на геномния материал от предполагаемия HCV може да се определи (обикновено чрез сДНК посредничеството), предполагаемата кодирана аминокиселинна последователност може да се кодира и кореспондиращите области да се сравнят.

Както е използвано тук, полинуклеотид “получен от” определена последователност се отнася до полинуклеотидна последователност, която е включена в последователност с приблизително около 6 нуклеотида, за предпочитане около 8 нуклеотида, по за предпочитане около 10-12 нуклеотида и дори повече за предпочитане е да бъдат около 15-20 нуклеотида, кореспондиращи с област от определената нуклеотидна последователност. “Кореспондиращ” означава хомоложност към или комплементарност към определената последователност. За предпочитане е последователността, от областта от която е получен полипептидът, да е хомоложна или комплементарна към последователност, която е уникална за HCV геном. По-предпочитано е получената последователност да е хомоложна или комплементарна за последователност, която да е уникална за всички или за повечето от HCV изолатите. Независимо дали последователността е уникална или не за HCV генома, тя може да се определи по известни техники. Например, последователността може да се сравни с последователността в базата данни, като например Genebank, за да се определи дали присъства в незаразен или друг организъм. Последователността може също така да се сравни с известни последователности от други вирусни агенти, включително онези, които индуцират хепатит, напр.

HAV, HBV и HDV и членовете от семейство Флавивириде. Кореспондирането или не на получената последователност с други последователности може също да се определи чрез хибридизация при подходящи строго определени условия. Хибридизационни техники за определяне комплементарността на последователностите на нуклеиновите киселини са известни в областта и са дискутирани по-долу. (Вж. също например 48 от литературните източници). В допълнение, несъответствието на полинуклеотидните дуплекси, формирани при хибридизацията, може да се определи чрез известни техники, включително например, разграждане с нуклеази като S1, която специфично разгражда едноверижни области в полинуклеотидните дуплекси. Области, от които могат да бъдат “получени” типични ДНК последователности, включват, но не са ограничени до, например области, кодиращи специфични епитопи, а така също и нетранскрибирани и/или нетрансформирани области.

Полученият полинуклеотид не е задължително да е получен по физически път от показаната нуклеотидна последователност, но може да бъде генериран по който и да е начин, включително например, химичен синтез или ДНК репликация или ревертивна транскрибция или транскрибция. В допълнение, комбинации от области, кореспондиращи на посочената последователност, може да бъдат модифицирани по познат начин с оглед използване по желания начин.

Терминът “рекомбинантен полинуклеотид” се използва за полинуклеотид от геномен, сДНК, семисинтетичен или синтетичен вид, който благодарение на неговия произход или въздействие: /1 / не е асоцииран с всички или с част от полинуклеотида, с който е асоцииран в природата; 2/ свързан е с полинуклеотид, различен от този към който е свързан в природата; или 3/ не се среща в природата.

Терминът “полинуклеотид”, както е използван тук, се отнася до полимерна форма на нуклеотиди с която и да е дължина независимо дали е рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид. Този термин се отнася само до първичната структура на полимера. Така този термин включва двойно- или едноверижна ДНК или РНК. Той включва също известни типове модификации, например свързвания, които са известни от нивото на техниката, метилации, “капсулации, замествания на един или повече от срещаните в природата нуклеотиди с ана.тог, интернуклеотидни модификации, като например незаредени свързвания (като метилфосфонати, фосфотриестери, фосфоамидати, карбамати и т.н.) и със заредени свързвания (като фосфоротиоати, фосфородитиоати и т.н.), онези, съдържащи висящи групи, като например протеини (вкл. нуклеази, токсини, антитела, сигнални пептиди, поли-Ь-лизин и др.), онези с интеркалации (като акридин, псорален и др.), онези, съдържащи хелатори (като метали, радиоактивни метали, бор, окислители-метали), такива, съдържащи алкилатори, такива с модифицирани свързвания (като алфа аномерични нуклеинови киселини и др.), а така също и немодифицирани форми на полинуклеотида.

Както се използва тук, “смисловата верига” на нуклеинова киселина съдържа последователността, която има последователност, хомоложна на тази на мРНК. “Аятисмисловата верига” съдържа последователност, която е комплементарна на тази от “смисловата верига”.

Както се използва тук, “позитивно верижен геном” на вируса е геномен полинуклеотид, независимо дали е РНК или ДНК, който кодира най-малко един вирусен полипептид. Примерите за позитивно верижните РНК вируси включват Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae и Calciviridae. Включени са също Flaviviridae, които формално се класифицират като Togaviridae. Тези вируси са типично едноверижни /23/.

Терминът “праймер”, както е използван тук, се отнася до олигомер, който е способен да действа като точка на инициация на синтезата на полинуклеотидната верига, когато е поставен при подходящи условия. Праймерът може да бъде изцяло или частично комплементарен на област от полинуклеотидната верига, за да може да бъде копиран. Така, при условията на хибридизация праймерът ще се ренатурира до комплементарна област от аналитичната верига. С допълнителни подходящи реагенти (като полимерази, нуклеотид трифосфати и др.), праймерът е изтеглен от полимеризиращия агент да формира копие от аналитичната верига. Праймерът може да бъде едноверижен или обратно, може да бъде частично или напълно двойноверижен.

Термините “аналитичен полинуклеотид и “аналитична верига” се отнася до едноверижна или двувсрижна молекула на нуклеиновата киселина, която предполага съдържание на мишенна последователност и която може да присъства в биологична проба.

Терминът “олигомер”, както е използван тук, се отнася до праймери и проби. Терминът не означава размера на молекулата. Обаче, типичните олигомери не са по-големи от 1000 нуклеотида, по-типично не са по-големи от 500 нуклеотида, дори по-типично - не по-големи от 250 нуклеотида. Те могат да бъдат и не по-големи от 75 нуклеотида и също така не по-големи от 50 нуклеотида в дължина.

Както тук е използвано, терминът “проба” се отнася до структура, включваща полинуклеотид, който формира хибридна структура с мишенна последователност, в резултат на комплементарността на най-малко една последователност в пробата с последователност в мишенната област. Полинуклеотидните региони на пробите могат да бъдат съставени от ДНК и/или РНК, и/или синтетични нуклеотидни аналози. Включени в рамките на пробите са “уловени проби” и “белязани проби”. За предпочитане, пробата не съдържа последователност, комплементарна на последователността/тите, използвана за полимеразна верижна реакция (PCR).

В смисъла на текста терминът “мишенна област” се отнася до регион от нуклеиновата киселина, който подлежи на амплификация и/или откриване. Терминът “мишенна последователност” се отнася до последователност, с която пробата или праймерът би формирал стабилен хибрид при желани условия.

Терминът “уловена проба” в смисъла на текста се отнася до полинуклеотид, включен в едноверижен полинуклеотид, свързан с присъединителен праймер. Едноверижният полинуклеотид съдържа мишенна полинуклеотидна последователност, която е комплементарна на мишенната последователност в мишенната област за откриване в анализирания полинуклеотид. Този комплементарен регион е със задоволителна дължина и комплементарност спрямо мишенната последователност, така че да позволи образуването на дуплекс със задоволителна стабилност да имобилизира анализирания полинуклеотид към твърда повърхност (чрез свързване на партньорите). Свързващият партньор е специфичен за втория свързващ партньор, който може да бъде свързан към повърхността на твърда повърхност или може да бъде слепен индиректно чрез други структури или свързващи партньори към твърда повърхност.

Терминът “насочващи полинуклеотидни последователности” се отнася до полинуклеотидна последователност, която включва нуклеотиди, комплементарни на мишенната нуклеотидна последователност; последователността е със задоволителна дължина и комплементарност с мишенната последователност, така че да формира дуплекс, който има задоволителна стабилност за желаните цели.

Терминът “свързващи партньори”, както се използва тук, се отнася до молекула, способна да присъедини свързваща молекула с висока специфичност, като например антиген и антитяло, специфично за него. Най-общо, специфичните свързващи партньори трябва да се свързват със задоволителен афинитет за имобилизиране на аналитичното копие / комплементарния дуплекс, (в случай на уловени проби) при условията на изолация. Специфичните свързващи партньори са известни в областта и включват например, биотин и авидин или стрептавидин, JgC и протеин А, голям брой известни рецептор-свързани двойки и комплементарни полинуклеотидни вериги. В случая на комплементарни полинуклеотидни двойки партньорите са нормално най-малко около 15 бази в дължина и могат да бъдат най-малко 40 бази в дължина. В допълнение, те съдържат С и С най-малко около 40% и повече от 60%. Полинуклеотидите могат да бъдат съставени от ДНК, РНК или синтетични нуклеотидни аналози.

Терминът “удвоен”, както се използва в изобретението, се отнася до ковалентно или силно нековалентно присъединително взаимодействие (например хидрофобни взаимодействия, водородни връзки и др.). Ковалентните връзки могат да бъдат например естерни, етерни, фосфоестерни, амидни, пептидни, имидни, карбосулфатни, карбофосфорни и други подобни връзки.

Терминът “опора” се отнася до която и да с твърда или полутвърда повърхност, към която може да бъде прикрепен желаният свързван партньор. Подходящите опорни повърхности включват стъкло, пластмаса, метал, по- лимерсн гел и друг» подобни и може дат има форма на легло, стена, мембрана и други.

Терминът “маркиране се отнася до който и да е атом или странична група, който може да се използва за осигуряване на подходящ за откриване сигнал и който може да бъде атакуван от полинуклеотида или полипептида.

Терминът “белязана проба” се отнася до олигомер, който включва насочваща полинуклеотидна последователност, която е комплементарна на мишенна последователност, която да бъде открита в анализираната проба от полинуклеотиди. Тази комплементарна област е със задоволителна дължина и комплементарност на мишенната, за да позволи на дуплекса, включен в “белязаната проба”, и на “мишенната последователност” да бъде открита чрез белязане. Олигомерът е присъединен към белязаната проба както директно, така и индиректно чрез комплекс от свързващи молекули с висока специфичност за всеки друг. Комплексът от свързващи молекули с висока специфика е описан по-горе и също така включва мултимери.

Терминът “мултимер”, както е използван тук, се отнася до линеарни или разклонени полимери от една и съща повтаряща се полинуклеотидна единица или от различни едноверижни полинуклеотидни единици. Поне една от тези единици има последователност, дължина и състав, който позволява хибридизирането й по специфичен начин към първата едноверижна нуклеотидна последователност, която ни интересува, по-специално анализиран или олигомер (т.е. белязана проба), свързан към първия, подлежащ на анализ. За постигане на такава специфичност и стабилност тази единица може да бъде най-малко 15 нуклеотида в дължина, по-типично - повече от 50 нуклеотида в дължина и за предпочитане около 30 нуклеотида в дължина. Съдържанието на Csu Cs нормално е около 40% най-малко и най-много около 60%. В допълнение към такива единици мултимерът включва умножено количество единици, които са способни на специфична хибридизация на втори едноверижен нуклеотид, по-специално белязан (маркиран) полинуклеотид или друг мултимер. Тези единици са предимно с почти същия размер и състав както мултимерите, посочени по-горе. Когато мултимерът е конструиран така, че да бъде хибридизиран към друг мултимер, първата и втората олигонуклеотидна единица са хетерогенни (различни) и нс се хибридизират една с друга при условията на избраната проба. Така мултимерите могат да бъдат белязани проби или връзки, които присъединяват белязания обект към пробата.

Терминът “вирусна РНК”, който включва HCV РНК, се отнася до РНК от вирусен геном, негови фрагменти, негови транскрибти и мутантни последователности, получени от него.

Терминът “биологична проба” се отнася до проба от тъканни или течни изолати от индивид, включен, но не ограничен от, например плазма, серум, гръбначна течност, лимфатична течност, външни сектори на кожата, респираторната, интестиналната и гениталните трактове, сълзи, слюнка, мляко, кръвни клетки, тумори, органи и също проби от ин витро клетъчни културни конституенти (включващи, но не ограничени от кондиционирана среда, получена от растежа на клетките в клетъчна културална среда, предполагаеми инфектирани с вирус клетки, рекомбинантни клетки и клетъчни компоненти).

Описание на изобретението

В изобретението се използват конвенционални техники от химията, молекулярната биология, микробиология, рекомбинантна ДНК и имунология, които са познати от нивото на техниката /48/. Всички патенти, патентни описания и публикации, отбелязани в описанието, са включени в референцията.

Използваните материали и процеси съгласно изобретението са възможни чрез идентификация на HCV като етиологичен агент на BB-NANBV и чрез осигуряване на семейство от нуклеотидни последователности, изолирани от сДНК библиотеки, които съдържат HCV сДНК последователности. Тези сДНК библиотеки са получени от последователности на аминокиселини, представени в плазмата на HCV-инфектирани шимпанзета. Конструирането на една от тези библиотеки - “с” библиотека (АТСС № 40394), е описано в РСТ WO90/14436.

Използвайки по-горе описаните HCV сДНК последователности като тези, описани тук, могат да бъдат конструирани олигомери, които са използваеми за откриване на вирусни полинуклеотиди в биологични проби.

Например, от последователностите е възможно да се синтезират ДНК олигомери от около 8-10 нуклеотида или по-дълги, които могат да се използват като хибридизационни проби за откриване на присъствието на HCV РНК в например, дарителска кръв, кръвни фракции, серум от субекти, които се подозира, че са вирусоносители, или клетъчно културални системи, в които вирусът се реплицира. В допълнение, новите олигомери, описани тук, дават възможност за по-нататъшно охарактеризиране на HCV генома. Полинуклеотидните проби и праймери, получени от тези последователности, могат да се използват за амплификация на последователностите, представени в сДНК библиотеките и/или за скрининг на сДНК библиотеките за допълнително съвпадащи сДНК последователности, които могат да се използват за получаване на повече съвпадащи последователности. Съгласно РСТ WO 90/14436 геномът на HCV изглежда, че е РНК, включваща първично голяма отворено читаема рамка (ORF), която кодира голям полипротеин.

В допълнение, информацията, посочена по-долу, позволява идентификация на допълнителни HCV щамове или изолати. Изолирането и охарактеризирането на допълнителни HCV щам или изолат/и може да се съпътства от например, изолиране на нуклеинови киселини от телесни компоненти, които съдържат вирусни частици и/или вирусна РНК, създавайки сДНК библиотеки с олигомери, основани на HCV] последователност, за скрининг на библиотеките за клонове, съдържащи HCV сДНК последователности, описани по-долу, и за сравняване на HCV сДНК от новите изолати с сДНК, описани в РСТ WO/14436 и подолу. Щамове или изолати, които съответстват на размерите (параметрите) на HCV, както е описано по-горе, са идентифицируеми. Други методи за идентификация на HCV щамове ще бъдат задължително необходими за специалиста в областта на базата на информацията съгласно изобретението.

Изолиране на HCV сДНК последователностите

Олигомерите от изобретението съдържат региони, които формират хибридни дуплексни структури с мишенни структури в HCV полинуклеотидите. HCV полинуклеотид хибридизационните региони могат да се установят от HCV сДНК последователностите съгласно изобретението и описани в РСТ WO90/14436. Композиция на HCV сДНК от HCV прототип на HCV, е показана на фиг. 1. Композираната последователност е основана на информационната последователност от известен брой HCV сДНК библиотеки, включително “с” библиотека в ламбда gtll /Xgtl 1/ (ATCC № 40394) и от човешки серум. HCV сДНК клоновете са изолирани по методите, описани в РСТ WO90/ 14436. Накратко, повечето от клоновете, които са изолирани, съдържат последователности от HCV сДНК “с” библиотека, която е конструирана със серум, получен от шимпанзе с хронична HCV инфекция и съдържаща висок титър на вируса, най-малко 10⁶ инфекциозни дози /тп1/ CID /ml/. Полученият серум е използван за получаване на вирусни частици, а изолатите от нуклеинови киселини от тези частици са използвани като матрица за конструиране на сДНК библиотеки за вирусния геном. Иницииращият клон, 5-1-1, е получен чрез скрининг на “с” библиотеката със серум от инфектирани индивиди. След изолиране на иницииращия клон остатъкът от последователността е получена чрез скрининг със синтетични полинуклеотидни проби, чиито последователности са получени от 5 - региона и 3 региона на известната HCV сДНК последователност/ ти.

Описанието на методите за възстановяване на сДНК последователностите е повече от историческа гледна точка. Резултантните последователности (и техните комплементи) са осигурени тук и последователностите или която и да е част от тях могат да се изготвят с методи за синтез или чрез комбиниране на такива методи за синтез с възстановяване на частичните последователности с методи, аналогични на описаните в РСТ WO90/14436.

Олигомерни проби и праймери Използвайки като база HCV генома (фиг.1) и/или съхранени области от HCV генома, олигомери с приблизително 8 нуклеотида или повече могат да бъдат изготвени, които се хибридизират с позитивни вериги от HCV РНК или нейни комплементи, така както и с такива от HCV сДНК. Тези олигомери могат да служат като проби за откриване (включително изолиране и/или маркиране) на полинуклеотиди, които съдържат HCV нуклеотидни последователности, и/или като праймери за транскрибция и/или репликация на ми9 шевни HCV последователности. Олигомерите съдържат насочени полинуклеотидни последователности, които са включени в нуклеотидите, комплементарни на мишенната HCV последователности. Последователността е със задоволителна дължина и комплементарност с HCV последователността за формиране на дуплекси със задоволителна стабилност за поставените цели. Например, ако целта е изолиране чрез имобилизация на анализиран образец, съдържащ мишенна HCV последователност, олигомерите ще съдържат полинуклеотидна област със задоволителна дължина и комплементарност с мишенната последователност на HCV за осигуряване на задоволителна дуплексна стабилност за имобилизиране на анализирания образец върху твърда повърхност, в резултат на свързването му към олигомерите, при условията на изолиране. Например, ако олигомерите служат като праймери за транскрибция и/или репликация за мишенни последователности в един полинуклеотид, подлежащ на анализ, олигомерите ще съдържат полинуклеотидна област със задоволителна дължина и комплементарност спрямо мишенната HCV последователност, за да даде възможност на полимеризиращия агент да завърши репликацията от праймерите, които са в стабилен дуплексен вид, при условия на полимеризация. Например, също така олигомерите могат да се използват като маркирани проби или да бъдат свързани към мултимери, насоченият полинуклеотиден регион ще е с достатъчна дължина и комплементарност за формиране на стабилни дуплексни структури с белязаните проби и/или мултимери за откриване на дуплексите. Олигомерите могат да съдържат четири съприкосновяващи се нуклеотида, които са комплементарни на мишенната HCV последователност. Обикновено олигомерите съдържат минимум от около 8 такива нуклеотида, които са комплементарни на мишенната HCV последователност, и за предпочитане - минимум от около 14 съприкосновяващи се нуклеотида, които са комплементарни на мишенната HCV последователност.

Подходящи HCV нуклеотидни последователности, използваеми като мишена, могат да бъдат включени от нуклеотиди, които са комплементарни на нуклеотидите, избрани от HCV сДНК нуклеотидите, показани на фиг.1.

Олигомерът, обаче се нуждае не само от последователност, която да е комплементарна на мишенната HCV последователност. Той може да съдържа в допълнение нуклеотидни последователности или други странични групи, които са подходящи за нуждите, за които се използват олигомерите. Например, ако олигомерите се използват като праймери за амплификация на HCV последователности чрез РСР, те могат да съдържат последователности, които, когато са в дуплекс, да формират ензимни рестрикционни сайтове, които улесняват клонирането на амплицираните сайтове. Също така, ако олигомерите се използват като “уловени проби” в хибридизационни изпитания (описани по-долу), те ще съдържат допълнителен свързващ партньор, който се свързва към олигомер, съдържащ нуклеотидна последователност, която е комплементарна на мишенната HCV последователност. Други типове от странични групи или последователности, които са полезни като елементи за включване или присъединяване, са онези, известни от нивото на техниката, които са подходящи за много цели, включително маркиране на нуклеотидни проби.

Получаването на олигомери се извършва по известни начини, включително например методите, включващи изрязване, транскрибция или химичен синтез. Мишенните последователности и/или региони от генома, които са подбрани и към които мишенните последователности от олигомерите са комплементарни, са в зависимост от необходимостта. Например, ако целта е скрининг за присъствие на НСV в биологични проби (като кръв), предпочитаните олигомери биха били използвани като проби и/или праймери и биха се хибридизирали със съхранени региони от HCV генома. Някои от съхранените региони на HCV генома, към които олигомерите могат да се свържат, са описани тук, например регионите, които включват нуклеотиди от 5-края до около 200 на брой или от около 4000 до около 5000, или от около 8000 до около 9040 (фиг.1), или за предпочитане нуклеотиди около -318 до около 174, около 4056 до 4448 и около 4378 до около 4902. Специално предпочитани праймери и проби са получени от около нуклеотидите -313 до около -173 и от около нуклеотид 1 до около нуклеотид 540 (фиг.1).

Други области от генома са установени чрез сравняване на нуклеотидните последователности от различни изолати на HCV, вкл.

прототипа HCV, HCV,. Методите за провеждане на сравнения между генотиповете за определяне съхранени или несъхранени региони са известни на специалистите и примери за тези методи са посочени в РСТ WO90/14436.

В основните изпитвания за хибридизация на нуклеиновите киселини едноверижна нуклеинова киселина (независимо ДНК или РНК) се хибридизира към проба нуклеинова киселина и получените в резултат дуплекси се откриват лесно. Пробите от HCV нуклеотиди (натурални или получени) са отрязъци, които позволяват откриването на уникалната вирусна секвенция чрез хибридизация. Докато

6-8 нуклеотида може да представляват работоспособен отрязък, последователности от ΙΟΙ 2 нуклеотида са предпочитани, а около 20 нуклеотида са повече от оптимални. За предпочитане е тези последователности да са получени от региони, които не са хетерогенни. Тези проби могат да се изготвят с рутинни методи, включително автоматизирани олигонуклеотидни синтетични методи. Между полезните проби например са тези, получени от новоизолирани клонове, разкрити тук, като например различни олигомери, необходими при сондаж на сДНК библиотеките, описано порано. Задоволителен ще е всеки комплемент на която и да е част на HCV генома. За да бъдат използвани като проби, пълната комплементарност е желателна, макар че това може да не е необходимо, ако отрязъкът от фрагмента е увеличен.

За използването на такива проби като агенти за откриване присъствието на HCV полинуклеотиди (напр. за скрининг на контаминирана кръв), за анализ на биологични проби, такива като кръв или серум, третирането може да се осъществи по желание чрез екстракция на съдържащите се нуклеинови киселини. Последните могат да бъдат подложени на гел електрофореза или друга разделителна техника. Обратно, пробите от нуклеинови киселини могат да се подложат на точково оцветяване без разделителна процедура, основана на разликата в размерите на молекулите. За формиране на хибридни дуплекси с мишенните последователности от пробата мишенният отрязък от анализираната нуклеинова киселина трябва да бъде едноверижен. Където последователността по своята природа е в едноверижна форма, денатурация не е необходима. Обаче, където последователността е представена в двойноверижна форма, последователността ще бъде денатурирана. Денатурацията може да се осъществи чрез различни техники, известни на специалистите. След денатурацията анализираната нуклеинова киселина и проба се инкубират при условия, които дават възможност за получаване на стабилна хибридна формация от мишенна последователност в пробата с предполагаема мишенна последователност в анализираната проба и получените в резултат дуплекси се подлагат на изследване за наличност.

Установяването на резултантните дуплекси, ако има такива, обикновено е съпроводено от използването на белязани проби. Обратно, пробата може да не е белязана, но може да бъде откриваема чрез предварителното й свързване по специфичен начин с лиганд, който е белязан, независимо директно или недиректно. Подходящи маркери и методи за белязане на пробите и лигандите са известни на специалистите и включват например радиоактивни маркери, които могат да бъдат инкорпорирани по известни методи чрез биотин, флуоресцентни групи, хемилуминисцентни групи (като диоксиетани, частично активирани диоксетани), ензими, антитела и други.

Регионът от проби, които са използвани за свързване към анализирания обект, може да бъде направен напълно комплементарен на HCV генома. Поради това са желателни много строги условия, за да се избегнат грешки. Обаче тези много строги условия могат да се използват само ако пробите са комплементарни на регионите от вирусния геном, които не са хетерогенни. Строгостта на хибридизацията е определена от редица фактори по време на хибридизацията и при процедурата на промиване, включително температурата, йонната сила, продължителността на времето и концентрацията на формамид. Тези фактори са подчертани в публикацията на Маниатис /48/.

Могат да се използват различни варианти на тази основна схема, които са известни на специалистите, включително такива, които улесняват отделянето на дуплексите, за да бъдат открити от други нови материали и/или които амплифицират сигнала от страничните белязани групи. Тези варианти са посочени например в 47, 48 и 50. Подходящи за откриване на HCV в тези изследвания са пробите, включени в последователности, които се хибридизират с мишенни HCV полинуклеотидни последователности за формиране на дуплекси с анализираната верига, където дуплексите са със задоволителна стабилност за откриване в специфичната система за анализ.

Един специфичен вариант е например описаният в US 4868105, издаден на 09.09.1989 г., и ЕР 225807, публ. 16 юни 1987. Тези публикации описват хибридизационна проба от нуклеинови киселини в разтворима фаза, в която анализираните нуклеинови киселини са хибридизирани към форма от бележещи проби и форма от улавящи проби. Комплексът за анализиране на пробата е свързан чрез хибридизация с проба за улавяне с твърда повърхност, която е комплементарна на формата за улавяне на пробата. Това позволява анализираната нуклеинова киселина да бъде отстранена от разтвора като твърдофазен комплекс. Анализирането в твърда фаза улеснява следващата стъпка на отделяне. Формата за маркиране е комплементарна на белязаната проба, която е свързана чрез хибридизация към твърдофазния комплекс.

Най-общо казано, очаква се, че HCV геномните последователности биха присъствали в серума на инфектирани индивиди в релативно ниски нива, приблизително от 10М0³ инфекциозни дози за шимпанзе <С1Д) за ml. Такова ниво може да изисква използването на амплификационни техники в хибридизационните изпитвания. Такива техники са известни на специалистите в областта. Например Enzo Biochemical Corporation “Bio-Bridge системата използва терминална дезоксинуклеотидна трансфераза за добавяне на З-поли-dT-опашки към ДНК проба. Поли dT-опашатата проба се хибридизира към мишенна нуклеотидна последователност и след това към биотин-модифициран поли-А. РСТ 84/03520 и ЕР 124221 описват ДНК хибридизационно изпитване, в което: I/ анализираният обект се делинеаризира до едноверижна ДНК, която е комплементарна на ензимно-маркиран олигонуклеотид; 2/ полученият в резултат опашат дуплекс се хибридизира към ензимно-маркиран олигонуклеотид. В ЕР 204510 се описва ДНК хибридизационно изпитване, в което анализираната ДНК влиза в контакт с проба, която има опашка, като например поли-dT опашка, амплификационна верига, която има последователност, която се хиб ридизира към опашката от пробата като поли-А последователност и която е способна да свърже множество белязани вериги. Тип хибридизационно изпитване, което е описано в ЕР 317077 (публ. 24.05.1989), което трябва да открие последователности на ниво приблизително 10⁶/ml, оползотворява мултимери от нуклеинови киселини, които се свързват към едноверижна аналитична нуклеинова киселина и които също така се свързват към множество едноверижни белязани олигонуклеотиди. Специално желана техника може да включва амплификация на мишенните HCV последователности в приблизително 10 000 усуквания (т.е. приблизително 10* последователности на ml) като част от хибридизационната система. Амплификацията може да бъде съпроводена например от полимеразни верижни реакции (PCR), описани от 80, 110 и 112. Амплификацията може да се проведе преди или непосредствено след пречистването на HCV мишенната последователност. Например амплификацията може да се използва при присъединяването в опитите, описани в US 4868105, или ако е желана по-нататъшна амплификация, при присъединяване с хибридизационна система, описана в ЕР 317077.

Предпочитаните методи за откриване на HCV последователности в анализиран полинуклеотид се основават на методите на хибридизационно откриване, описани в US 317077. Тези методи са разтворимо-фазни сандвичеви хибридизационни изпитвания, които използват както уловената, така и белязаната проби, които се хибридизират към мишенните последователности в анализирана нуклеинова киселина. Използването на тези изпитвания за скрининг на биологични проби за HCV използваните проби биха се свързали с консервирани региони от HCV генома. Уловената и белязаната проба могат да бъдат разпръснати при тяхното свързване към мишенната последователност. Обратно, в предпочитания вариант уловената и белязаната проба са в един комплекс и пробите от един комплекс не се разпръсват с пробите от друг комплекс. В последния вариант за предпочитане комплекса/ ите от мултиплените уловени проби се хибридизират към най-запазените региони от генома, докато комплекса/ите от мултиплените белязани проби могат да се хибридизират към регионите, които демонстрират малки дивер12 генции. Например, използвайки прототипа па HCV₁ сДНК последователност, показана на фиг.1, могат да се използват проби, които се хибридизират към последователности в региона от нуклеотиди от около 318 до около 174, и/или нуклеотиди в региона от около 4378 до около 4902, и/или нуклеотиди в региона от около 4056 до около 4448. Предпочитаните проби биха се хибридизирали към последователности в 5-края от HCV генома, доколкото, както е показано по-долу, този регион се оказва много добре съхранен. Така предпочитани проби могат да се хибридизират към например нуклеотиди от около -318 до около 174, както е показано на фиг.1. Пробите биха били използвани за хибридизация към който и да е от позитивните вериги в съхранените региони и/ или неговите комплементи в зависимост от намеренията, например за откриване на вирусни геномни последователности или за откриване на HCV сДНК последователности, получени в резултат от PCR амплификацията, или за откриване на репликативни междинни продукти на позитивната HCV РНК верига.

Установяване на HCV РНК и полинуклеотиди, получени от нея с метода HCV/cPCR Частично използваем метод за установяване на HCV РНК или полинуклеотиди, получени от тази HCV РНК, е HCV/cPCR, който е обект на описанието и който използва техниката на полимеразната верижна реакция (PCR) и е описан от 80, 110 и 112. Този метод използва праймери и проби, получени от информацията, осигурена тук относно природата на HCV генома.

Най-общо, в PCR техниката се изготвят къси олигонуклеотидни праймери, които съответстват на противоположните краища на желаната последователност. Последователността между праймерите не е необходимо да бъде позната. Проба от полинуклеотида се екстрахира и денатурира, за предпочитане по топлинен път, и се хибридизира с олигонуклеотидни праймери, които присъстват в моларни излишъци. Полимеризацията се катализира от матрично- и праймерзависима полимераза в Присъствието на дезоксинуклеотид трифосфати или нуклеотидни аналози (άΗΤΦ-и). Това (тя) резултира в два “дълги продукта”, които съдържат респективните праймери при техните 5-краища, ковалентно свързани към новосинтезираните комплементи на оригиналните всрши. Репликираната ДНК отново се денатурира, хибридизира се с олигонуклеотидни праймери, връща се при полимеризационни условия и се инициира втори цикъл на репликация. Вторият цикъл осигурява двете оригинални вериги, двата дълги продукта от цикъл 1 и двата “къси продукта”, репликирани от дългите продукти. Късите продукти съдържат последователности (смислови или безсмислови), получени от мишенните последователности, фланкирани към 5'- и 3'-краищата с праймерни последователности. При всеки допълнителен цикъл броят на късите продукти се репликира експоненциално. Така този процес причинява амплификацията на специфична мишенна последователност.

В метода се осигурява проба, която да съдържа HCV РНК или неин фрагмент. Пробата се взима обикновено от индивид, който се счита, че съдържа NANBH, но могат да бъдат включени и други източници, като например кондиционирана среда или клетки от ин витро системи, в които вирусът е бил репликиран. Пробата, обаче, трябва да съдържа мишенната нуклеотидна последователност/ти.

След това пробата се подлага на условия, които позволяват ревертивна транскрибция на HCV РНК в HCV сДНК. Условията за обратно (ревертивно) транскрибционната РНК са известни на специалистите в областта и са описани например в 48. Предпочитаният метод за обратна транскрибция използва обратна транскрибтаза от различни източници, включително рекомбинантни молекули, и изолирани от например ретровируси, за предпочитане от птичи миелобластозен вирус (AMV), при подходящи условия за транскрибция. HCV сДНК продуктът на обратната транскрибция е в РНКДНК хибрида, който се получава от първата обратна транскрибция; съответно, ДНК:ДНК хибрид се получава от два или повече кръга на транскрибция.

HCV сДНК, получена от обратната транскрибция, след това се подлага на РСР за амплификация на мишенната последователност. С оглед на това HCV сДНК се денатурира и разделените вериги се хибридизират с праймери, които фланкират мишенната последователност.

Разделянето на веригите може да се съпътства от който и да е денатурационен метод, включително физичен, химичен или ензимен начин, известни на специалистите в областта. Предпочитаният метод, който е физичен, включва нагряване на нуклеиновата киселина до нейното пълно (99%) денатуриране. Типичното температурно денатуриране включва температури, граничещи от около 80°С до около 105°С, за време от около 1 до 10 min.

След хибридизация на HCV сДНК с праймери мишенните HCV последователности се репликират чрез полимеризация, която усвоява праймерния олигонуклеотид за иницииране синтеза на репликационната верига. Праймерите са подбрани така, че те са комплементарни на последователностите от HCV генома. Олигомерните праймери, които са комплементарни на областите със смислени и безсмислени вериги от HCV сДНК, могат да бъдат конструирани от HCV сДНК последователностите от сДНК последователността (фиг.1).

Праймерите са подбрани така, че техните релативни позиции по продължение на дуплексните последователности са подобни на продукта, синтезиран от един праймер, когато е отделен от неговия комплемент (матрица) и служи като матрица за другия праймер за получаване на репликационна верига с определена дължина.

Праймерът е обикновено едноверижен за максимум ефективност при амплификация, но може да бъде и двойноверижен. Ако е двойноверижен, праймерът най-напред се третира за отделяне на неговите вериги преди използването им за изготвяне на екстензионни продукти. За предпочитане е праймерът да бъде олигодезоксирибонуклеотид. Праймерът трябва да бъде задоволително дълъг, за да даде началото на синтезата на екстензионен продукт в присъствието на агент за полимеризация. Точната дължина на праймерите зависи от много фактори, включително температурата и източника на праймерите и използвания метод. Например в зависимост от комплексността на мишенната последователност олигонуклеотидният праймер типично съдържа около 15-45 нуклеотида, макар че може да съдържа повече или по-малко нуклеотиди. Праймер с къси молекули обикновено изисква по-хладни температури за формиране на задоволително стабилен хибриден комплекс с матрицата.

Използваните тук праймери са подбрани да бъдат “съществено” комплементарни на различни вериги от всяка специфична после дователност за амплификация. Поради това праймерите не е необходимо да рефлектират на точната последователност от матрицата, но трябва да са задоволително комплементарни за селективна хибридизация с техните респективни вериги. Например некомплементарен нуклеотиден фрагмент може да бъде присъединен към 5'-края на праймера с остатъка от праймерната последователност, комплементарна на веригата. Обратно, некомплементарни бази или по-дълги последователности могат да бъдат пресипани към праймера, осигурявайки това, праймерът да има задоволителна комплементарност с последователността на една от веригите, за да бъде амплифицирана към хибридизирания, и поради това да формира дуплексна структура, която може да бъде разширена чрез полимеризация. Некомплементарната нуклеотидна последователност на праймера/ите може да включва рестрикционни ензимни сайтове. Добавянето на рестрикционен ензимен сайт към края (краищата) на мишенната последователност би подпомогнала клонирането на мишенната последователност.

Следва да се отбележи, че “праймер”, както е използвано тук, може да се отнася до повече от един праймер, по-специално в случая, когато има известна двусмисленост на информацията, отнасяща се до терминалните последователности в мишенния регион за амплифициране. Докато “праймерът” включва сбор от праймерни олигонуклеотиди, съдържащи последователности, представящи възможните варианти в последователността, или включва нуклеотиди, които позволяват типично чифтосване на базите. Един от праймерните олигонуклеотиди в този сбор ще бъде хомолог с края на мишенната последователност. Специфичен случай е този, когато олигомерните комплекси се използват, за да дадат началото на амплификация на потенциален вариант на регион от HCV генома. Съхранените региони могат да се определят чрез сравняване на нуклеотида или на аминокиселинната последователност на няколко HCV щама (изолата). Изглежда да са налице най-малко три региона от съхранени аминокиселини в HCV генома, описани по-горе, от които могат да бъдат получени праймерите. Праймерите, описани в примерите, са получени от региони на HCV. за които се счита, че са съхранени и които са основани ва хомоложността на последователностите с тези от Флавивирусите.

Олигонуклеотидните праймери могат да бъдат изготвени по който и да е от известните подходящи методи. Методите за получаване на олигонуклеотиди със специфична последователност са известни в областта и включват например клониране и рестрикция на подходящи последователности и насочен химичен синтез. Методите на химичен синтез могат да включват например фосфотриестерния метод, описан от Наранг /65/, фосфодиестерния метод на Браун /7/, диетилфосфорамидатния метод на Бюкадж /2/ и метода, описан в US 4458066 /111/.

Праймерите могат да бъдат белязани по желание с маркери, така че да могат да бъдат открити по методите на спектроскопията, по биохимични, имунохимични или химични методи.

Матричнозависими екстензии на нуклеотидните праймери се катализират чрез полимеризационен агент в присъствието на съответно количество от четирите дезоксирибонуклеотид трифосфати (6АТФ, бГТФ, ЙСТФ и άΤΤΦ) или аналози, в реакционна среда, която е съставена от подходящи соли, метални катиони и pH буферна система. Подходящи полимеризационни агенти са ензими, известни да катализират матричнозависим ДНК синтез. Известните ДНК полимеризации включват например E.coli полимераза I или нейния Кленоф фрагмент Т« ДНК полимераза и Tag ДНК полимераза. Реакционните условия за катализиране на ДНК синтезата с тези ДНК полимерази са известни в областта.

Продуктите на синтезиса са дуплексни молекули, състоящи се от матрични вериги и праймерни екстензионни вериги, които включват мишенната последователност. Продуктите, обратно, служат като матрица за друг кръг на репликация. Във втория кръг на репликация праймерната екстензионна верига от първия цикъл е линеализиран с нейния комплементарен праймер. Синтезата води до “къс” продукт, който е свързан откъм двата 5'- и 3'-края с праймерни последователности или техни комплементи. Повторните цикли на денатурация, праймерното линеализиране и екстензия резултират в експоненциално акумулиране на мишенния регион, дефиниран от праймерите. Провеждат се толкова на брой цикли, колкото са необходими, за да се достигне желаното ко личество полинуклеотид, съдържащ мишенния регион на нуклеиновата киселина. Желаното количество може да варира и се определя от функцията, за която трябва да служи нуклеотидът.

PCR методът може да бъде осъществен от различни временни последователности. Например той може да се осъществи последователно, където след всеки етап се добавят нови реагенти, или по начин, при който всички реагенти се добавят едновременно, или по частично последователен начин, при който пресните реагенти се добавят след даден определен брой стъпки.

В предпочитания метод PCR реакцията се провежда като автоматизиран процес с термостабилни ензими. Според този метод реакционната смес циркулира през денатурационния регион, праймерния линеализиран регион и реакционния регион. Може да се използва машина, която е частично адаптирана за използване с термостабилен ензим, осъществяващ температурно циклиране без течна управляваща система, доколкото не е необходимо ензимът да се добавя на всеки цикъл. Тази машина може да се достави от Perkin Elmer Cetus Corp.

След амплификация чрез PCR мишенните нуклеотиди се откриват чрез хибридизация с нуклеотидна проба, която формира стабилен хибрид с онзи от мишенната последователност при умерено строга хибридизация и условия на омокряне. Ако се очаква, че пробите са напълно комплементарни (напр. около 99% или повече) на мишенната последователност, ще се използват строги условия. Ако се очакват някои несъответствия, например, ако се очакват различни варианти На веригите да не са комплементарни напълно, строгостта на хибридизацията може да се намали. Избират се условия, които постановяват неспецифично/ случайно свързване.

Условията, които предизвикват хибридизация и които са подбрани срещу неспецифично свързване, са известни в областта. Описани са например в /42/. Най-общо казано, ниска концентрация на соли и висока температура повишават строгостта на свързването. Например счита се, че строги условия са инкубация в разтвор, съдържащ приблизително 0,1 х SSC. 0,1% SDS, при около 65°С, и умерено строга условия са инкубацията в разтвор, съдържаш приблизително 1-2 х SSC, 0,1 % SDS и около 50-65°С. Слабо строги условия са 2 х SSC и около 30-50°С.

Пробите за HCV мишенните последователности могат да бъдат получени от HCV сДНК последователност, показана на фиг.1, или от нови HCV изолати. HCV пробите могат да бъдат с каквато и да е подходяща дължина, която покрива мишенния регион, но който изключва праймерите и позволява специфичното хибридизиране към мишенния регион. Ако е налице пълна комплементарност, т.е. ако щамът съдържа последователност, идентична на тази на пробата, доколкото дуплексът е релативно стабилен дори при строгите условия, пробата може да бъде къса, в размер около 10-30 бази двойки. Ако се очаква известна степен на несъвпадение с пробата, т.е. ако се очаква пробата да се хибридизира с различни области, пробата може да бъде с по-голяма дължина, доколкото дължината изглежда уравновесява в известна степен несъвпаденията.

Пробата от нуклеинова киселина с последователност, комплементарна на мишенната последователност, може да се синтезира с аналогични на описаните по-горе технологии за синтез на праймерни последователности. При желание пробите могат да бъдат белязани. Подходящите маркери са описани по-горе.

В някои случаи е желателно да се определи дължината на PCR продукта, определен чрез пробата. Това може да е частично вярно, ако се очаква, че вариантните HCV щамове могат да съдържат делеции в рамките на мишенния регион или някой има желание да потвърди дължината на PCR продукта. В такива случаи, за предпочитане е продуктите да се подложат на анализ за размера, като например хибридизация с пробата. Методите за определяне размера на нуклеиновите киселини са известни в областта и включват например гел електрофорезис, седиментация в градиенти и гелна хроматография.

Присъствието на мишенна последователност в биологична проба се установява чрез определяне дали е формиран хибрид между HCV полинуклеотидната проба и нуклеиновата киселина, подложена на обработка с PCR амплификационна техника. Методите за откриване на хибридите, формирани между пробата и последователността на нуклеиновата киселина, са известни в областта. Например за удоб ство небелязана проба може да бъде прехвърлена върху твърда повърхност (матрикс), към който се свързва, и свързаната проба се подлага на условия, които позволяват специфична хибридизация с маркираната проба. След това твърдата повърхност се изпитва за присъствие на белязана проба. Обратно, ако пробата е белязана, небелязаната проба се присъединява към матрикса и след поставянето й на подходящи хибридизационни условия, матриксът се изпитва за присъствие на маркиращия елемент. Други подходящи хибридизационни изпитвания са описани по-горе.

Определяне на вариантни HCV последователности с помощта на PCR

С оглед идентификация на вариантните HCV щамове и поради това конструиране на проби за такива варианти, описаният по-горе HCV/cPCP метод се използва за амплификация на вариантни региони от HCV генома, така че нуклеотидните последователности от тези вариантни мишенни региони могат да бъдат определени. Най-общо, може да се очаква появяването на вариантни типове HCV в различни географски локализации от тези, в които НСХ⁷! щамът е преобладаващ, например в Япония, Африка и други, или в различни гръбначни видове, които също се инфектират от вируса. Варианти на HCV могат да възникнат също и по време на пасирането в тьканнокултурни системи или да са резултат от спонтанни или индуцирани мутации.

С оглед амплификация на вариантите на мишенния регион праймерите се конструират така, че да са разположени странично на региона и да са комплементарни на съхранените региони. Праймерите за два региона от HCV, които вероятно са съхранени, са основани на модела за Флавивируса. Праймерите и пробите могат да бъдат конструирани, усвоявайки секвенционната информация за HCV₍ щама (фиг.1).

Анализът на нуклеотидната последователност от мишенните последователности може да се осъществи чрез директен анализ на амплифицираните продукти. Процес за директен секвенционен анализ на РСР амплифицирани продукти е описан от /81/.

Обратно, амплифицирани мишенни последователности могат да бъдат клонирани преди секвенционния анализ. Метод за директното клониране и секвенционен анализ на ен16 зимно амплифицирани геномни сегменти са описани в /83/. Съгласно този метод праймерите, използвани в РСР техниката, са модифицирани близо до техния 5’-край за получаване на удобни рестрикционни сайтове за директно клониране в например М13 секвенционен вектор. След амплификацията РСР продуктите се слепват с подходящи рестрикционни ензими. Рестрикционните фрагменти са лигатирани в Μ13 вектора и се трансформират в например IM 103 гостоприемника, посяват се и получените в резултат плаки се скринират чрез хибридизация с белязана олигонуклеотидна проба. Други методи за клониране и секвенционен анализ са известни в областта.

Праймери, универсални за Флавивируси и за HCV

Изследванията за природата на HCV генома, използвайки пробите, получени от HCV сДНК като информация за последователността, съдържаща се в HCV сДНК, стигат до заключението, че HCV е вирус, подобен на Флавивируса. Тези изследвания са описани в PCTW090/ 14436. В сравнение с HCV сДНК последователността, получена от HCV сДНК клоновете с известни последователности за повечето от Флавивирусите показва, че HCV включват последователности, които са хомоложни на съхранените последователности във Флавивирусите. Тези съхранени последователности могат да позволят създаване на праймери, които да са универсални в тяхното приложение за амплификация на мишенните региони от Флавивирусите и от HCV. Идентификацията на видовете след това се съпътства от усвояване на проба, специфична за вида. Геномите на повечето Флавивируси са известни в областта и включват например Японския вирус на енцефалита /91/, вируса на жълтата треска /74/, Денгу Тип 2 вирус /32/, Денгу Тип 4 вирус /54/ и Западно-нилски вирус /9/. Идентификацията на HCV вирусната РНК е последвана от усвояване на проба, специфична за HCV, последователността от която може да бъде определена с HCV сДНК последователността съгласно описанието.

Обратно, използването на комплекс от проби, конструирани, за да обяснят кодонната дегенерация и за това съдържат общи последователности с Флавивирусите и с HCV, както са определени при сравняване на HCV аминокиселинните последователности с известни последователности от Флавивируси. позволява детекционна система за откриване на тези вируси.

Конструиране на желани ДНК последователности

Синтетични олигонуклеотиди могат да бъдат изготвени с автоматизиран олигонуклеотиден синтезатор, както е описан от Warner /98/. По желание синтетичните вериги могат да бъдат белязани с ³²Р чрез третиране с полинуклеотидкиназа в присъствието на³²Р - АТФ, при стандартни условия за провеждане на реакцията.

ДНК последователностите, включително тези, изолирани от ДНК библиотеките, могат да бъдат модифицирани по известни техники, включително например сайт насочена мутагенеза, както е описано от Zoller /101/. Накратко, за да бъде модифицирана ДНК, тя се въвежда във фаг като едноверижна последователност и се превръща в двойноверижна ДНК с ДНК полимераза с праймер, който по своята същност е синтетичен олигонуклеотид, комплементарен на тази част от ДНК, която подлежи на модификация, и имащ желаната модификация, включена в нейната собствена последователност. Резултантната двойноверижна ДНК се трансформира във фаг, съдържан от бактерията гостоприемник. Културите от трансформираната бактерия, които съдържат репликации от всяка верига на фага, се посяват в агар за получаване на плаки. Теоретично 50% от новите плаки съдържат фаг, съдържащ мутантна последователност, и останалите 50% имат оригиналната последователност. Репликатите от плаките се хибридизират с белязаната синтетична проба при температура и условия, които позволяват хибридизация с правилната верига, но не и с немодифицираната последователност. Последователностите, които са идентифицирани чрез хибридизация се възстановяват и клонират.

Китове за скрининг на полинуклеотиди, получени от HCV

Олигомерите, които са проби и/или праймери за амплификация и/или скрининг на проби от HCV, могат да бъдат опаковани в китове. Китовете за скрининг на HCV последователности включват олигомерни проби ДНК. Китовете за амплификация на HCV последователности могат да включват олигомерните праймери, използвани за амплификацията. Китовете обикновено съдържат пробите или праймерите в предварително измерено или предварително определено количество, а така също и други опаковани по подходящ начин реагенти и материали в отделни подходящи контейнери, необходими за специална хибридизация и/или амплификация. Например китът може да съдържа стандарти, буфери, ензими, субстрати, белязани проби, свързващи партньори и/или инструкции за осъществяване на теста.

Примери

Описаните по-долу примери само поясняват изобретението, но не ограничават обхвата му.

I. Откриване на позитивна и негативна верига 5'-HCV РНК в серум

РНК в HCV27, изолирана от серум, е анализирана за присъствие на позитивни и негативни вериги с PCR метода. PCR методът е проведен по описания по-горе начин, с изключение на следното.

Екстрахираната HCV27 РНК е подложена на ревертивна транскрибция в едноверижна сДНК с праймер както А1ех90, така и JH52. А1ех90, получен от нуклеотидите -312 до -283 от HCV1 генома, има последователността:

5' ACC ATG AAT CAC ТСС ССТ GTG AGG AAC ТАС 3'

JH52 е получен от HCV нуклеотидите 93 до -117. Нуклеотидните номера са означени в кръгли скобки под последователностите. В JH52 подчертаният динуклеотид е подложен на мутация за създаване на Not I сайта. Последователността pf JH52 е както следва:

/Праймер/ Пълнител Not I HCV последователност /JH52/ 5 AGTCTT GCGGCCGC ACGCCCAAATC 3 (-93) (-117)

Последователността на А1ех90 съответства на тази в нуклеотидите -312 до -283 от позитивната верига на HCV РНК, докато HCV РНК съответства на тази от нуклеотидите 117 до -93 от негативната верига. Получените в резултат едноверижни HCV сДНК всяка поотделно бяха амплифицирани чрез PCR с А1ех90 и JH52. Откриването на амплифицираните продукти е последвано от Соутерн блотинг с А1ех89 като проба. А1ех89 съответства на нуклеотидните номера -203 до -175 от HCV РНК. Последователността на А1ех89 е:

5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG

GTG AGT ACA 3'

Анализът показва, че по този метод сигналите от амплифицираните продукти от двете РНК вериги са с еднаква интензивност. Резултатите навеждат на мисълта, че HCV РНК в 5-региона може да съществува като двойноверижна РНК.

II. Откриване на HCV РНК в плазма с HCV/cPCR, с участието на праймери и проби, получени от 5'-региона на HCV РНК

Екстракция на HCV РНК от плазма

Замразена плазма се разтопява в Р₃ камина. Количества от 0,2 ml от сместа, състояща се от 100 mM Трис-НС1, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, 20 pg/ml MS2 РНК, 0,5% SDS и 2 mg/ml протеиназа К, при pH 8, се добавя към 2 ml микрофужна епруветка и се затопля до 37°С. Плазмата (0,2 ml) след това се добавя и сместа се оставя за инкубация при 60°С за 1 h. След това се добавя фенол (0,4 ml) и сместа се разбърква енергично 3 х 30 s, с промеждутък от 30 s за всяко разбъркване. След това сместа се центрофугира за 5 min и водната фаза се възстановява. Органичната фаза се екстрахира обратно с 0,1 ml TES и отлетите водни фази се екстрахират 2 х с 1 обем фенол /хлороформ/ IAA, след това с 1 обем хлороформ. Към екстракта се добавят 1 μΐ (1 pg) гликоген (Boehringer Mannheim Corp.), 25 μΐ NaOAc (3 M, pH 5,4) и 1,25 ml студен ΕτΟΗ. Продуктът се замразява в сух лед и се завърта за 10 min. Утайките се разтварят в 100 μΐ дестилирана вода и 5 μΐ NaOAc (pH 5,4) се добавят с 250 μΐ студен ЕтОН. Разтворът се замразява и се завърта отново. Получените в резултат утайки се разтварят в 10 μΐ dH₂0.

с ДНК синтеза

За синтезиране на сДНК от екстрахираната РНК иницииращи 5 μΐ от разтворената РНК се инкубират с 4 μΐ вода и 1 μΐ (1 g или 166 pmol от 18-мер) от РТ праймера. Инкубацията се провежда при 70°С за 3 min, последвано от охлаждане в лед. Последователността на РТ праймера е:

5' ССС AAC ACT ACT CGG СТА 3'

След началната инкубация към инкубационната смес се добавят: 10 μΐ от 5х първия буфер (250 mM Трие НС1, pH 8,3, 375 тМ КС1, 15 mM MgCl₂, 50 тМ дитиотреитол); 2,5 μΐ дезоксинуклеозидтрифосфати (10 тМ от всеки); 2,5 1 обратна транскрибтаза (MMLV от BRL, 200 единици за 1) и дестилирана во да за получаване на обем 50 μΙ. Сместа се инкубира на 37С за 1 h, нагрява се при 90°С за 3 min и се охлажда с лед.

PCR амплификация

PCR амплификацията на HCV сДНК, 5 получена по-горе, се осъществява с тест реагенти, изброени в таблицата. В нея “РНК” означава контролната проба, в която РНК е екстрахирана от индивид, който не е инфек тиран с HCV1. Този опит се провежда, преминавайки през етапите на сДНК синтезата и PCR амплификацията. Обаче, в този случай количеството РНК по време на сДНК синтезата е заместено с вода. “Матрица” е контрола за PCR реакцията, от която матрицата е пропусната. “Опит” (проба) показва серума, който се изпитва за присъствие на HCV РНК.

Таблица

Вода	РНК (μΐ) до 100,0	сДНК (μΐ) до 100,0	Матрица до 100,0	Проба до 100,0
10 х буфер	10	10,0	10,0	10,0
d НТФ	16,0	16,0	16,0	16,0
Праймер 1	0,5	0,5	0,5	0,5
Праймер 2	0,5	0,5	0,5	0,5
Матрица	2,5	2,5	-	2,5
Taq Pol	0,5	0,5	0,5	0,5

Праймер 1 и Праймер 2 са 0,5 Hg/gl и 0,42μβ/μ1, респективно, и имат следната последователност.

Праймер 1: 5' ACC ATG AAT CAC ТСС ССТ GTG AGG AAC ТАС 3'

Праймер 2: 5 AGT CTT GCG GGG GCA CGC CCA AAT С 3

Тези праймери се хибридизират към съхранения регион в 5'-края на HCV генома. Пробите съдържат 12,5 μΐ серумни еквиваленти от HCV сДНК. Амплификационният цикъл на условията е следния:

цикъла Топене 94° за 1,5 min Линеализиране - 60°С за 2 min Удължаване - 72°С за 3 min

Финално удължаване: 72®С за 30 min Омокряне при 4°С до отстраняване. Амплифицираният продукт се изпитва с белязана ДНК. Последователността на пробата е следната:

Проба: 5' TTT CTT GGA TCA ACC CGC TCA ATG ССТ GGA 3’

Над 200 серопозитивни проби са изпитани по горната процедура. Под внимание са взети само резултатите, в които контролите са негативни. В този случай всички серопозитивни проби са позитивни също така и в РСР изпитванията.

III. Образци, получени от предполагаемия регион на HCV РНК, наречен “сърцевинен”

Анализ на нуклеотидните последователности от сДНК от различни HCV изолати показва, че висока степен на запазване на последователността съществува в региона от около нуклеотид 1 до 570, използвайки номеризационната система за нуклеотидите от фиг. 1. Този регион се предполага, че кодира “сърцевинния” полипептид на HCV. Последователности от пет различни изолати от различни географски локализации (Япония и САЩ) са показани на фиг.2, където HCV1 е прототип на HCV; аминокиселините, кодирани в големия ОРГ на HCV1, са показани над нуклеотидните последователности. В последователностите, показани на фиг.2, HCV-JH е от личните контакти на д-р Tetsu Miyamura (Национален здравен институт в Япония) и JC-J1 и JC-J4 са от Mayumi (1990). На фиг.2 може да се види, че между последователностите в предполагаемия “сърцевинен” регион има най-малко 90% хомологии, съответни на последователностите от HCV1. Съобразно тази висока степен на хомоложност в региона между нуклеотидите +1 до +571 пробите от тази област могат да са от полза за скрининг за HCV по19 зитивпп биологични образци.

Комплект от белязани проби, които могат да се използват за определяне на HCV РНК от областта с предполагаемо кодираща HCV “сърцевинния полипептид, са показани на 5 фиг.З. На тази фигура “номера на пробата” от комплекта включва серия от полинуклеотиди с хетерогенност, означена от IB Групов код (фиг.З). Хетерогенността съгласува различията в нуклеотидните последователности, намерени 10 в различните изолати. Регионите от HCV последователността, към които пробите от целия комплекс проби от фиг.З са комплементарни, са показани на фиг.4, и чиито нуклеотидни номера кореспондират на номерирането във фиг. 1. 15 Този комплекс от проби са използвани за откриване на HCV последователности. Формата на изпитанията е описан в РСТ WO90/ 14436 в раздела “Проби за сандвичева хибридизация за HCV”. 20

Приложение в индустрията

Описаните тук методи, олигомерите, както проби, така и праймери, получени от HCV 25 сДНК, и китовете, които ги съдържат, могат да се използват за бързо, относително просто и икономично определяне на присъствието на HCV в биологични проби, по-специално в кръв, необходима за преливане и у индивидите, ко- 30 ито се подозира, че са HCV инфектирани. Нещо повече, тези методи и олигомери могат да се използват за откриване на ранен етап от HCV инфекция, в сравнение с имунологичните проби, основани на използването на рекомбинантни- 35 те HCV полипептиди. Също така, един амплифициран полинуклеотиден хибридизиран образец открива HCV РНК в случайни проби, които са анти-HCV антитяло негативни. Така пробите и праймерите, описани тук, могат да се изпол- 40 зват за амплифициране на хибридизационните проби в конюгация с имунопроби, основани на HCV полипептиди за по-пълно идентифициране на инфекцията благодарение на HCV и HCV-инфектирани биологични образци, вклю- 45 чително кръв.

Представената тук информация позволява да се конструират праймери и/или проби, които са получени от съхранени региони от HCV генома. Осигуряването на тези праймери 50 и проби дава възможност за генерален метод, който би открил вариантни HCV щамове, и кой то може да се използва за скрининг на кръв и кръвни продукти.

Ако праймерите, използвани в метода, са получени от съхранени региони на HCV генома, методът ще помогне в откриването и/ или идентификацията на вариантни щамове на HCV. Така ще доведе до развитието на допълнителни имунологични реагенти за откриването и диагностиката на HCV и развитието на допълнителни полинуклеотидни реагенти за откриване или третиране на HCV.

В допълнение, комплексът от праймери и проби, конструирани от съхранените аминокиселинни последователности от Флавивирусите и HCV, позволява универсален метод за откриване на тези агенти на инфекцията.

Материалите, включени в списъка подолу, са депозирани при условията на Будапещенския договор в АТСС, 12301 Parklawn Dr. Rockville, Maryland 20852, и са регистрирани под следните номера:

λ- gtll	АТСС №	Дата на депозиране
HCV сДНК
библиотека	40394	1.12.1987
клон 81	40388	17.11.1987
клон 91	40389	17.11.1987
клон 1-2	40390	17.11.1987
клон 5-1-1	40391	18.11.1987
клон 12f	40514	10.11.1988
клон 35f	40511	10.11.1988
клон 15е	40513	10.11.1988
клон К9-1	40512	10.11.1988
JSC308	20879	5.05.1988
pS 356	67683	29.04.1988

Допълнително бяха направени следните депозити на 11.05.1989 г.

Щам	Линкери	ATCC №
D1210 /Cfl/5-l-l/	EF	67967
DI210 /Cfl/81/	EF	67968
D1210 /СП/СА74а/	EF	67969
D1210 /Cf1/357/	AB	67970
D1210 /СП/279а/	EF	67971
D1210 /Cfl/СЗб/	СД	67972
DI210 /Cfl/13i/	AB	67973
D1210 /Cfl/СЗЗЬ/	EF	67974

D1210 /С11/СА290а/ AB 67975

НВ101 /АВ24/С100 #3R/ 67976

Следните производни на щам D1210 бяха депозирани на 3.05.1989 г.

Производни на щама	ATCC №
pCFICVS / C8f	67956
pCFlAB I C12f	67952
pCFlEF / 14c	67949
pCFlEF / 15e	67954
pCFlAB / C25c	67958
pCFlEF / СЗЗс	67953
pCFlEF / C33f	67050
pCFICD / 33g	67951
pCFICD / C39c	67955
pCriEF / C40b	67957
pCFlEF / CA167b	67959

Следните щамове бяха депозирани през м. май (12.05.1989)
Щам	ATCC №
Xgtll /С35/	40603
λ gtlO / -5а/	40602
DI210 /С40Ь/	67980
D1210 /М 16/	67981

На 23.05.1990 г. бяха депозирани след-

ните биологични материали:
Материал	АТСС №
5' - клон 32 /в pUC18S/	68276

При допускане и издаване на това описание като американски патент всички ограничения върху наличието на тези депозити ще бъдат неизменно отстранени и достъпът до означените депозити би бил допустим по време на периода за чакане на решението за по-горе означеното описание, определен от Комисаря, за да бъде озаглавен под номера 37 CFR 1.14 и 35 USC 1.22. Означените депозити ще бъдат съхранявани 30 г. от датата на депозиране или 5 г. след последния отказ за депозирането, или за периода на живот на американския патент, независимо колко е дълъг. Депозираните материали, отбелязани тук, са предназначени само за удобство и не се изискват за практикуване на изобретението по смисъла на описанието и в допълнение тези материали са вложени тук чрез референция.

Claims (6)

1. Патентни претенции

   1. Метод за откриване на HCV последо-

   10 вателност в аналитична верига, която се предполага, че съдържа HCV полинуклеотид, където HCV полинуклеотидът включва подбрана мишенна област, като методът включва:

   а) осигуряване на олигомер, способен да

   15 се хибридизира към HCV последователност в аналитична полинуклеотидна верига, където олигомерът включва полинуклеотидна последователност, подбрана от групата, състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на след20 ните региони от HCV генома (както е описано на фиг.1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148177,211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365394, 398-427 и 457-486;

   б) инкубиране на аналитичната верига

   25 с олигомера от а), което позволява да се формират специфични хибридни дуплекси между насочената и мишенната последователности; и

   в) откриване на хибриди, формирани

   30 между мишенната област, ако има, и олигомера.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, който по-нататък съдържа: |

   а) осигуряване на комплекс от олигоме35 ри, като олигомерите са праймери за метода, основан на полимеразната верижна реакция и който фланкира мишенната област; и

   б) амплифициране на мишенната област чрез метода, основан на полимеразната вериж40 на реакция.
3. 3. Кит за откриване на HCV мишенна последователност в аналитична верига, включващ олигомерите от претенция 1, опаковани в подходящ контейнер.

   45
4. 4. Метод за изготвяне на свободна от

   HCV кръв, включващ: '

   а) осигуряване на аналитични нуклеинови киселини от кръвни проби, които се предполага, че съдържат HCV мишенна последо50 вателност;

   б) осигуряване на олигомер, способен да ;

   се хибридизира с HCV последователност в ана- i i

   лигична полинуклеотидна верига, ако има, кълето олигомерът съдържа полинуклеотидна последователност, подбрана от групата, състояща се от олигонуклеотиди, комплементарни на следните региони от HCV генома (фиг.1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398427 и 457-486;

   в) взаимодействие на а) с б) при условията, които позволяват формиране на полинуклеотидни дуплекси между насочената последователност и мишенната последователност, ако има;

   г) откриване на дуплекс, формиран във

   в), ако има; и

   д) съхраняване на кръв, в която не са открити комплексите от г).
5. 5. Реагент, приложим за откриване на HCV, като този реагент съдържа: олигонуклеотид, имащ последователност, комплементарна на региона от HCV генома, подбран от групата, съдържаща базите 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 и 457-486 (фиг.1).
6. 6. Реагент от претенция 5, който съдържа маркер за откриването на олигонуклеотида.