PT94081B

PT94081B - Diagnosticos para o nambv: polinucleotidos uteis na deteccao do virus da hepatite c

Info

Publication number: PT94081B
Application number: PT94081A
Authority: PT
Inventors: Michael Houghton; Jang Han; Michael S Urdea; Qui-Lim Choo; George Kuo
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1990-05-17
Publication date: 1997-07-31
Also published as: PT94081A

Description

CAMPO TÉCNICO

A invenção está relacionada com materiais e metodologias de controle da dispersão da infecçâo, pelo virus da hepatite nâo-A e nâo-B (NANBV). Mais especificamente, relaciona-se com um agente etiológico da hepatite nâo-A e não-B (NANBV), o virus da hepatite C (HCV), e com polinucleótidos e sequências análogas a eles, que são úteis em ensaios para a detecção do HCV em amostras biológicas.

REFERENCIAS CITADAS NO PEDIDO Barr et al. (1986), Biotechniques 4:428.

Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Letters 22:1859.

Botstein (1979), Gene 8:17.

Brinton, M.A. (1986) em THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND

FLAVIRIDAE (Editores das séries : Fraenkel-Conrat e

Wagner, editores dos volumes: Schlesinger e

Schlesinger, Plenum Press), pags 327-374.

Broach (1981) em : Molecular Biology of the Yeast

Saccharomyces, Vol. 1, p.445, Cold Spring Harbor Press Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.

Brown et al. (1979), Methods in Enzymology 68:109.

Byrne et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:4165.

Castle et al. (1986), Virology 119:10.

Chang et al. (1977), Nature 198:1056.

Chirgwin et al. (1979), Biochemistry 18:5294.

Choo et al. (1989), Science 244:359.

Chomczynski e Sacchi (1987), Analytical Biochemistry

162:156.

Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sei. USA

62:1159.

Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.

Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110.

Cousens et al. (1987), Gene 61:265.

De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 292:128. Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761. Feinstone et al. (1981), J. Inf. Dis. 144:588.

Feinstone et al. (1983), Infection and Immunology 41:816. Feinstone, S.M. e Hoofnagle, J. H. (1984), New Engl. J. Med

311:185.

Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press

N.Y.) .

Fiers et al. (1978), Nature 273:113.

Gerety, R.J. et al., em VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag, J.L., e Hoofnagale, J.H., eds, Grune e Stratton, Inc., 1984) pp 23-47.

Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. í):4057.

Graham e Van der Eb (1978), Virology 52:546.

Grunstein e Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73:3961.

Grych et al. (1985), Nature 316:74.

Gubler e Hoffman (1983), Gene 25:263.

Hahn et al. (1988), Virology 162:167 .

Han (1987), Biochemistry 26:1617.

Hammerling et al. (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS.

Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 2*149.

Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sei. 75:1929. Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.

Holland et al. (1978), Biochemistry 17:4900.

Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.

Houghton et al. (1981), Nucleic acids Res. 2^:247·

Hunyh, T.V. et al. (1985) em DNA CLONING TECHNIQUES; A

PRACTICAL APPROACH (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, U.K.) pp. 49-78.

Immun. Rev. (1982) 62:185.

Iwarson (1987), British Medicai J. 295:946 .

Kennett et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES.

Kuo et al. (1989), Science 244:362.

Kyte e Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157:105-132.

Landegren et al. (1988), Science 242:229.

Maniatis, T., et al. (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press,

Cold Spring Harbor, N.Y.).

Matthews e Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169:1.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

Mittlin (1989), Clinicai chem. 35;1819.

Laemmli (1970), Nature 227, 680.

Lee et al. (1988), Science 239:1288.

Loh et al. (1989), Science 243:217.

Mackow et al. (1987), Virology 159:217.

Mayer e Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN

CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499.

MacNamara et al. (1984), Science 226:1325.

Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9j309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

Michelle et al., Int. Symposium on Virai Hepatitis.

Monath (1986) em THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND

FLAVIVIRIDAE (Editores das séries Fraenkel-Conrat e Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p. 375-440.

Murakawa et al. (1988), DNA 2^:287.

Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74.

Narang et al. (1979), Methods in Enzymology 68:90.

Neurath et al. (1984), Science 224:392.

Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406.

Overby,	L.R.	(1985),	Curr. Hepatol.	5:49.
Overby,	L.R.	(1986),	Curr. Hepatol.	6:65.
Overby,	L.R.	(1987),	Curr. Hepatol.	7:35.

Peleg (1969), Nature 221:193.

Pfefferkorn e Shapiro (1974), em COMPREHENSIVE VIROLOGY,

Vol. 2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, eds., Plenum, N.Y.) pp. 171-230.

Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37;217.

Rice et al. (1985), Science 229;726.

Rice et al. (1986), em THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Editores das séries Fraenkel-Conrat e Wagner, vol. eds. Schlesinger e Schlesinger, Plenum Press), p. 279-328.

Roehrig (1986) em THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND

FLAVIVIRIDAE (Editores das séries Fraenkel-Conrat e Wagner, vol. eds. Schlesinger e Schlesinger, Plenum Press)

Rosenberg et al. (1984), Nature 312:7.

Sadler et al. (1980), Gene £3:279.

Saiki	et	al.	(1985),	Science	230	:1350.
Saiki	et	al.	(1986),	Nature	324:	163.
Saiki	et	al.	(1988),	Science	239	:487.

Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463. Scharf et al. (1986), Science 233:1076.

Schlesinger et al. (1986), J. Virol. 60:1153.

Schreier, M., et al. (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES. Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND

PRACTICE, SECOND EDITION (Springler-Verlag, N.Y.). Shimatake et al. (1981), Nature 292:128.

Shigekawa e Downer (1988), Biotechniques ¢5:742.

Steimer et al. (1986), J. Virol. 58:9.

Stollar (1980), em THE TOGAVIRUSES (R.W. Schlesinger, ed.,

Academic Press, N.Y.), pp. 584-622

Sumiyoshi et al. (1987), Virology 161:497.

Taylor et al. (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:324.

Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:4350.

Tsu e Herzenberg (1980), em SELECTED METHODS IN CELULAR

IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) pp. 373-391.

Vytdehaag et al. (1985), J. Immunol. 134;1225.

Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344.

Valenzuela, P., et al. (1984), em HEPATITIS B (Millman, I., et al., ed. Plenum Press) pp. 225-236 .

Warner (1984), DNA 3:401.

Wu e Grossman (1987), Methods in Enzymology Vol. 154,

RECOMBINANT DNA, Parte E.

Wu (1987), Methods in Enzymology Vol. 155, RECOMBINANT DNA,

Parte F.

Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

PATENTES CITADAS

Patente	dos	E.U.	No.	4.341.761
Patente	dos	E.U.	No.	4,399,121
Patente	dos	E.U.	No.	4,427,783
Patente	dos	E.U.	No.	4,444,887
Patente	dos	E.U.	No.	4,466,917
Patente	dos	E.U.	No.	4,472,500
Patente	dos	E.U.	No.	4,491,632
Patente	dos	E.U.	NO.	4,493,890
Patente	dos	E.U.	NO.	4,683,202
Patente	dos	E.U.	No.	4,458,066

Patente dos E.U. No. 4,868,105

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A hepatite não-A e nâo-B (NANBH) é uma doença, ou familia de doenças transmissíveis, que se pensa serem induzidas por virus, e que são distintas de outras formas de doenças hepáticas de associação virai, incluindo as causadas pelas viroses hepáticas conhecidas, i.e., virus da hepatite A (HAV), virus da hepatite B (HBV) e virus da hepatite delta (HDV), assim como da hepatite induzida pelo citomegalovirus (CMV), ou pelo virus de Epstein-Barr. A NANBH foi primeiro identificada em individuos que sofreram transfusões. A transmissão do homem para o chimpanzé e passagems seriadas em chimpanzés, forneceram provas de que a NANBH é devida a um agente, ou a agentes infecciosos transmissíveis.

índices epidemiológicos sugerem a existência de três tipos de NANBH : o tipo epidémico com origem na água; o tipo associado ao sangue ou agulhas; e o tipo de ocorrência esporádica (adquirido na comunidade). No entanto, o número de agentes que podem ser causadores de NANBH é desconhecido.

Tem havido um certo número de candidatos a causadores da NANBH. Ver, por exemplo as revisões de Prince (1983), Feinstone e Hoofnagle (1984), Overby (1985, 1986, 1987) e o artigo de Iwarson (1987). No entanto, não existem provas de que algum destes candidatos represente o agente etiológico da NANBH.

A exigência de métodos sensiveis e específicos para o despiste e identificação de portadores de NANBV, e de sangue ou produtos sanguíneos contaminados pelo NANBV, é significativa.

♦assa».

Hepatites post-transfusionais (PTH), ocorrem em aproximadamente 10% dos pacientes após transfusão, e a NANBH concorre para mais de 90% destes casos. O maior problema nestas doenças é a frequente progressão para uma lesão hepática crónica (25-55%).

O tratamento do doente, assim como a prevenção da transmissão da NANBH pelo sangue e produtos sanguíneos, ou por contacto pessoal, requer uma detecção de confiança, métodos de diagnóstico e prognóstico para detecção dos ácidos nucleicos, antigénios e anticorpos relacionados com o NANBV.

Métodos para a detecção de polinucleótidos específicos por ensaios de hibridaçâo, são técnicas conhecidas dos peritos. Ver, por exemplo, Matthews e Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169:1; Landegren et al. (1988), Science 242:229; e Mittlin (1989), Clinicai Chem. 35:1819. Patente dos E.U. No. 4,868,105, emitida a 9 de Setembro de 1989, e na publicação

E.P.O. No. 225,807 (publicada a 16 de Junho de 1987).

A requerente descobriu um novo virus, o virus da hepatite C (HCV), que demonstrou ser o maior agente etiológico da NANBH de origem sanguinea (BB-NANBH). 0 trabalho inicial da requerente, incluindo uma sequência genómica parcial do protótipo do HCV isolado, CDC/HCV1 (também chamado HCV1), é descrito na publicação E.P.O. No. 318,216 (publicada a 31 de Maio de 1989), e na publicação PCT No. WO 89/04669 (publicada a 1 de Junho de 1989). As divulgações destes Pedidos de Patentes, assim como quaisquer Pedidos de Patentes Nacionais correspondentes, estão incorporadas no presente texto por referência. Estes Pedidos expõem, entre si, os métodos de DNA recombinante de sequências de HCV Clonais, técnicas de diagnóstico utilizando sondas de HCV, anticorpos anti-HCV e métodos de isolamento de novas sequências de HCV.

EXPOSIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção baseia-se em sequências de HCV descritas na publicação E.P.O. No. 318.216 e na publicação PCT No. Wo 89/04669, assim como outras sequências de HCV descritas no presente texto. Métodos para isolamento e/ou detecção de polinucleótidos específicos por hibridação, não puderam ser utilizados no despiste do HCV até ã descoberta do HCV pela requerente. Assim, um aspecto da invenção consiste num oligómero capaz de sofrer hibridação com uma sequência do HCV de uma cadeia polinucleotidica de análise, em que o oligómero é constituído por uma sequência dirigida contra o HCV complementar de, pelo menos, 4 nucleótidos contíguos do cDNA do HCV como se pode ver na fig. 18.

Outro aspecto da invenção consiste num processo para detecção de uma sequência de HCV numa cadeia de análise que se suspeita conter polinucleótidos de HCV, em que estes polinucleótidos possuem uma região alvo seleccionada, compreendendo o dito processo:

(a) proporcionar um oligómero capaz de se hibridar com uma sequência de HCV numa cadeia polinucleotidica de análise, em que o oligómero possui uma sequência dirigida contra uma região alvo do HCV, e é complementar de, pelo menos, 4 nucleótidos contíguos do cDNA do HCV como se pode ver na fig. 18.

(b) a incubação da cadeia de análise com o oligómero de (a), permitindo a formação de duplexes hibridos específicos entre as regiões alvo e as regiões dirigidas contra essas sequências alvo; e (d) Deteçcão dos híbridos formados entre a região alvo, se ela existir, e o oligómero.

Ainda outro aspecto da invenção consiste num método de preparação de sangue isento de HCV, compreendendo:

(a) proporcionar ácidos nucleicos de análise a partir de uma amostra de sangue que se suspeita conter uma sequência alvo de HCV;

(b) proporcionar um oligómero capaz de se hibridar com uma sequência de HCV numa cadeia de polinucleótidos de análise, se existir alguma, em que o oligómero é constituído por uma sequência dirigida contra a região alvo do HCV, e é complementar a uma região de, pelo menos, 8 nucleótidos presentes numa sequência de nucleótidos de HCV conservada, no RNA do HCV.

(c) Reaçcâo de (a) com (b), sob condições que permitem a formação de um duplex de polinucleótidos entre a sequência alvo, se ela estiver presente, e a sequência contra ela dirigida.

(d) Detecção do duplex formado em (c), se ele estiver presente; e (e) Recolha do sangue em que não foi detectada a presença de complexos em (d).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1 - Mostra a sequência do cDNA do HCV no clone

12f, e os aminoácidos ai codificados.

Fig. 2 - Mostra a sequência do cDNA do HCV no clone K91, e os aminoácidos ai codificados.

Fig. 3 - Mostra a sequência do clone 15e, e os aminoácidos ai codificados.

Fig. 4 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone 13i, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com o clone 12f.

Fig. 5 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone 26j, a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências coincidentes com o clone 13i.

Fig. 6 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone CA59a, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com os clones 26j e K9-1.

Fig. 7 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone CA84a, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com o clone CA59a.

Fig. 8 - Mostra a sequência de nucleótidos do cDNA do HCV no clone CA156e, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com o CA84a.

Fig. 9 - Mostra a sequência de nucleótidos do cDNA do HCV no clone CAI67b, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com o CA156e.

Fig. 10 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone CA216a, os aminoácidos ai codificados e as sequências coincidentes com o clone CA167b.

Fig. 11 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone CA290a, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com o clone CA216a.

Fig. 12 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone ag30a e as sequências coincidentes com o clone *=^ss=-^^CA290a.

Fig. 13 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone CA205a, e as sequências coincidentes com o cDNA do

HCV no clone CA290a.

Fig. 14 - Mostra as sequências nucleotidicas do cDNA do HCV no clone 18g, e as sequências coincidentes com o cDNA do HCV no clone ag30a.

Fig. 15 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone 16jh, os aminoãcidos ai codificados, e os nucleótidos coincidentes com a sequência do cDNA do HCV no clone

15e.

Fig. 16 - Mostra a sequência nucleotidica do cDNA do HCV no clone 6K, os aminoãcidos ai codificados, e os nucleótidos coincidentes com as sequências do cDNA do HCV no clone 16jh.

Fig. 17 - Mostra as sequências nucleotidicas do cDNA do HCV no clone pl31jh, os aminoácidos ai codificados, e os nucleótidos coincidentes com a sequência do cDNA do HCV no clone

6K,

	Fig.	18 - Mostra a sequência	compilada do cDNA do HCV
derivado	dos	clones descritos neste	texto e da sequência
compilada	de	cDNA do HCV apresentado na publicação E.P.O. No.
318.216.	Os clones de onde a sequência	é derivada são o 5'-clone

32, bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CAl67b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (também chamado k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k, e pl31jh. Na figura, as três marcas horizontais acima da sequência, indicam a posição geralmente considerada do codâo de iniciação metionina. Também é apresentada na figura a sequência de aminoácidos da poliproteina, geralmente considerada, codificada no cDNA do HCV. Heterogeneidades em DNAs clonais do HCV1, são indicadas pelos aminoácidos representados acima da sequência codificada, geralmente considerada, da ORF maior; os parênteses indicam que a heterogeneidade foi detectada na, ou perto da extremidade 5' ou 3' do cDNA do HCV, no clone.

Fig. 19 - Mostra a sequência das sondas de captura e marcação, para detecção do RNA do HCV em amostras biológicas.

Fig. 20 - Mostra o alinhamento esquemático de uma poliproteina flaviviral e de uma poliproteina geralmente considerada do HCV, codificada na ORF maior do genoma do HCV. Também estão indicadas na figura as possíveis funções dos polipéptidos flavivirais, resultantes da clivagem da poliproteina flaviviral. Por último, são indicados os locais relativos dos polipétidos do HCV, NANB5_i_i e C100, no que respeita à poliproteina do HCV geralmente considerada.

Fig. 22 - Mostra a sequência de nucleótidos em dupla cadeia do cDNA do HCV inserida no clone 81, e a sequência de ) aminoácidos, geralmente aceite, do polipéptido ai codificado.

Fig. 23 - Mostra a sequência do cDNA do HCV no clone 36, 0 segmento coincidente com o cDNA NANBV do clone 81, e a sequência de polipéptidos codificados no clone 36.

Fig. 24 - Mostra a sequência do cDNA do HCV no clone 37b, o segmento coincidente com o clone 35, e o polipéptido ai codificado.

Fig. 25 - Mostra autoradiografias do ensaio cPCR para o HCV, no RNA obtido a partir de amostras de figado de chimpanzés com NANBH (Fig. 25A), e em pacientes italianos com NANBH (Fig. 25B) .

Figs. 26A e 26B - São gráficos mostrando a relação temporal entre o aparecimento de danos no fígado, a presença de RNA do HCV, e a presença de anticorpos anti-HCV em dois chimpanzés com NANBH.

Fig. 27 - Mostra a sequência de nucleótidos do cDNA do HCV no clone CA84a, os aminoácidos ai codificados, e as sequências coincidentes com o clone CA59a.

Fig. 28 - Mostra a sequência cDNA do HCV no clone 40b, o segmento coincidente com o clone 37b, e o polipéptido ai codificado.

Fig. 29 - Esta figura é uma autoradiografia mostrando produtos de amplificação, marcados de aproximadamente 300, 30 e 3 CID do genoma do HCV.

Fig. 32 - Mostra a sequência de nucleótidos do cDNA do HCV no clone 40a.

Fig. 33 - Esta figura é uma auto-radiografia mostrando produtos de amplificação a partir de primers, derivados de regiões conservadas do genoma do HCV.

Fig. 34 - Mostra a sequência do cDNA do HCV no clone 35, o segmento coincidente com o clone 36, e o polipéptido ai codificado.

Fig. 37 - Esta figura é um diagrama mostrando a relação das sondas e primers derivados da região 5' do RNA do HCV, donde derivam o cDNA do HCV nos clones ag30a e K9-1.

Fig. 38 - Esta figura é uma auto-radiografia de produtos de amplificações a partir de conjuntos de primers do isolado representadas derivados do ag30a e K9-1.

Fig. 39 - Mostra as sequências alinhadas de nucleótidos de isolados humanos 23 e 27 e de HCV1. Sequências homólogas estão indicadas pelo simbolo (*). Sequências não homólogas estão representadas por minúsculas.

Fig. 40 - Mostra as sequências alinhadas de aminoácidos de isolados humanos 23 e 27 de HCV1. Sequências homólogas estão indicadas pelo simbolo (*). Sequências não homólogas estão representadas por minúsculas.

Fig. 41 - Mostra uma reprodução com metade da intensidade da cor, de uma autoradiografia de uma técnica de Northern blot do RNA isolado do figado de um chimpanzé infectado por NANBV de origem sanguínea (BB-NANBV), utilizando como sonda o cDNA do BB-NANBV do clone 81.

Fig. 43 - Mostra uma reprodução com metade da intensidade da cor, de uma auto-radiografia de ácidos nucleicos extraídos de partículas de NANBV, obtidas a partir de plasma infectado, com anti-NANB5_i_i, e utilizando como sonda o cDNA do 32

NANBV do clone 81 marcado com p.

Fig. 44 - Mostra reproduções de auto-radiografias, de filtros contendo os ácidos nucleicos isolados do NANBV, utilizando como sondas cadeias de DNA positivas e negativas, 32 marcadas com P, derivadas do cDNA do NANBV do clone 81.

Fig. 46 - Mostra a sequência de consenso de nucleótidos humano 23, estando as sequências variantes abaixo da linha de sequência. São também representados os aminoácidos codificados nesta sequência de consenso.

Fig do isolado representadas representados consenso.

- Mostra a sequência de consenso de nucleótidos humano 27, estando as sequências variantes abaixo da linha de sequência. São também os aminoácidos codificados na sequência de

Fig. 48 - Esta figura é um gráfico mostrando a relação entre os primers do EnvL e do EnvR para a poliproteina modelo do flavivirus, e a poliproteina geralmente aceite do HCV.

Fig. 49 - Mostra uma comparação da composição das sequências alinhadas de nucleótidos de isolados Thorn, EC1, HCT #18, e HCV1.

Fig. 50 - Mostra a comparação da sequência de nucleótidos do EC10, e a composição da sequência do HCV1; a sequência do EC10 encontra-se na linha acima do ponteado, e a sequência de HCV1 fica na linha abaixo do ponteado.

Fig. 51 - Mostra a comparação das sequências de aminoácidos 117-308 (relativas ao HCV1) codificadas nas regiões EnvL das sequências de consenso dos isolados humanos HCT #18, JH23, JH27, Thorne, EC1 e de HCV1.

Fig. 52 - Mostra uma comparação das sequências de aminoácidos 330-360 (relativas ao HCV1), codificadas nas regiões EnvR das sequências de consenso dos isolados humanos HCT #18, JH23, JH27, Thorne, EC1 e de HCV1.

Fig. 53 - Mostra as sequências de nucleótidos de primers individuais na mistura de primers 5'-3.

MODOS DE REALIZAÇAO DA INVENÇÃO

O termo virus da hepatite C (HCV), tem sido reservado pelos cientistas que trabalham neste campo, para referir um agente etiológico da NANBH desconhecido até à data. 0 protótipo isolado do HCV foi identificado na U.S.S.N. 122.714 (ver também publicação E.P.O. No. 318.216). 0 termo HCV também inclui novos isolados da mesma espécie virai. Como extensão desta terminologia, a doença causada pelo HCV, anteriormente chamada de hepatite NANB de origem sanguínea (BB-NANBH), é chamada hepatite C. Os termos NANBH e hepatite C podem ser usados como sinónimos no presente texto.

HCV é uma espécie virai cujas estirpes patogénicas causam a BB-NANBH. Também pode haver estirpes atenuadas ou partículas defectivas interferentes derivadas delas. Como se mostra abaixo, o genoma do HCV é constituído por RNA. Sabe-se que as viroses provocadas por virus RNA, têm Índices relativamente elevados de mutações espontâneas, i.e., estão descritas na ordem -3 -4 de 10 a 10 por nucleótido incorporado (Fields & Knipe (1986)). Assim, uma vez que a heterogeneidade e a fluidez do genótipo são inerentes às viroses RNA, existem múltiplas estirpes/isolados, que podem ser virulentas ou avirulentas, dentro da espécie do HCV. As composições e métodos descritos no presente texto, possibilitam a propagação, identificação, detecção, e isolamento das estirpes de vários HCV ou isolados.

Têm sido identificados várias estirpes/isolados diferentes do HCV (ver abaixo). Uma dessas estirpes ou isolado, que constitui um protótipo, é chamada CDC/HCVl (também chamada HCVl). A informação de uma estirpe ou isolado, tal como uma sequência genómica parcial, é suficiente para permitir aos peritos na técnica, a utilização de técnicas Standard para isolar

novas estirpes/isolados, e para identificar se estes novos estirpes/isolados são de HCV. Por exemplo, vários estirpes/isolados diferentes são descritos abaixo. Estas estirpes, que foram obtidas a partir de um certo número de soros humanos (de diferentes áreas geográficas), foram isolados utilizando a informação da sequência genómica do HCV1.

Usando as técnicas descritas na publicação E.P.O. No. 318.216 e abaixo, tem sido deduzida a estrutura genómica e a sequência nucleotidica do RNA genómico do HCV1. 0 genoma parece ser uma cadeia simples de RNA contendo -10.000 nucleótidos. O genoma é uma cadeia positiva, e possui uma estrutura de leitura aberta translacional continua, (ORF), que codifica para uma poliproteina de cerca de 3.000 aminoácidos. Na ORF, as proteínas estruturais parecem ser codificadas aproximadamente, no primeiro quarto da região N-terminal, junto com a maioria das poliproteinas responsáveis por proteínas não estruturais. Quando comparadas com todas as sequências virais conhecidas, são observadas pequenas mas significativas homologias co-lineares com as proteínas não estruturais da família dos flavivirus, e com as pestiviroses (que actualmente são consideradas como pertencentes à familia dos flavivirus).

Na figura 20 é apresentado um alinhamento esquemático de possíveis regiões de uma poliproteina flaviviral (utilizando como exemplo o Virus da Febre Amarela), e de uma poliproteina geralmente aceite, codificada na ORF principal do genoma do HCV. Na figura, são indicados os possíveis domínios da poliproteina do HCV. A poliproteina do flavivirus contém, desde o terminal amino até ao terminal carboxi, a proteína da nucleocápside (C), a

β proteína da matriz (M), a proteina do envelope (E), e proteínas não estruturais (NS) 1, 2 (a+b), 3, 4 (a+b), e 5. Baseados nos supostos aminoácidos codificados na sequência nucleotidica do HCV1, um pequeno dominio na extremidade N-terminal da poliproteina do HCV, parece similar, tanto em tamanho como no elevado teor de resíduos básicos, à proteina da nucleocápside (C) encontrada na porção N-terminal das poliproteinas flavivirais. As proteínas não estruturais 2, 3, 4 e 5 (NS2-5) do HCV e do Virus da Febre Amarela (YFV) parecem possuir regiões correspondentes, de tamanho similar e comportamento semelhante em presença da água, embora haja divergências nas sequências de aminoácidos. No entanto, a região do HCV que poderia corresponder às regiões da poliproteina do YFV, que contêm as proteínas Μ, E e NS1, não só diferem em sequência, mas também parecem ser bastante diferentes tanto em tamanho, como no comportamento em relação á água. Assim, enquanto alguns domínios do genoma do HCV podem ser referidos no presente texto como, por exemplo, NS1, ou NS2, deve ter-se em conta que estas designações são especulativas; pode haver diferenças consideráveis entre a familia do HCV e flaviviroses que têm ainda de ser apreciadas.

Espera-se que diferentes estirpes, isolados ou subtipos do HCV, contenham variações nos aminoácidos e ácidos nucleicos, quando comparados com o HCV1. Em muitos isolados, espera encontrar-se mais homologia na sequência total de aminoácidos (i.e., mais do que cerca de 40 %), quando comparado com o HCV1. No entanto, podem também encontrar-se outros isolados de HCV menos homólogos. Estes seriam definidos como HCV, atendendo a vários critérios como, por exemplo, uma ORF de aproximadamente

9.000 nucleótidos, a 12.000 nucleótidos, codificando para uma poliproteina semelhante em tamanho à do HCV1, uma poliproteina codificada, de carácter hidrofóbico e/ou antigénico, semelhante à do HCV1, e a presença de sequências de péptidos co-lineares que são conservadas com o HCV1. Por fim, pensa-se que o genoma seja uma cadeia positiva de RNA.

Todos os isolados de HCV codificam, pelo menos, um epitopo que é imunologicamente identificável (i.e., imunológicamente contra-reactivo) com um epitopo codificado nos cDNAs do HCV descrito no presente texto. 0 epitopo é preferencialmente contido numa sequência de aminoáeidos descrita no presente texto, que é exclusiva do HCV, quando comparado com agentes patogénicos previamente conhecidos. A exclusividade do epitopo pode ser determinada pela sua reactividade imunológica com anticorpos anti-HCV, e ausência dessa reactividade imunológica com anticorpos para agentes patogénicos conhecidos.

As estirpes e isolados de HCV estão relacionados do ponto de vista evolutivo. Assim, é de esperar que a homologia dos genomas, a nivel dos nucleótidos, possa ser de cerca de 40 %, ou mais elevada, provavelmente será de 50 % ou mais elevada, provavelmente cerca de 60 % ou mais, e é muito mais possível que seja de cerca de 80 % ou mais, e ainda que haverá sequências correspondentes contíguas de, pelo menos, cerca de 13 nucleótidos. Deve notar-se, como se mostra abaixo, que existem regiões variáveis e hipervariáveis no genoma do HCV; por esta razão é de esperar que a homologia nestas regiões esteja significativamente diminuída em relação ao genoma total. A correspondência entre a sequência geralmente aceite, da cadeia

I genómica do HCV e, por exemplo, a sequência do cDNA do CDC/HCV1, pode ser determinada por técnicas utilizadas nestas áreas. Por exemplo, pode ser determinada por comparação directa da informação da sequência do polinucleótido do HCV putativo, e da sequência(s) do cDNA do HCV descrita no presente texto. Também podem ser determinadas por hibridação dos polinucleótidos sob t

condições que permitem a formação de duplexes estáveis entre regiões homólogas (por exemplo, aquelas que seriam utilizadas antes da digestão com a Sq) , seguidas por uma digestão com nuclease(s) especifica(s) para cadeias simples, seguida da determinação do tamanho dos fragmentos digeridos.

Devido á relação evolutiva das estirpes ou isolados de HCV, supostas estirpes ou isolados de HCV são identificáveis pela sua homologia ao nivel dos polipéptidos. Geralmente, espera-se que estirpes ou isolados de HCV apresentem uma homologia de, pelo menos 40 %, mais do que cerca de 50 % de homologia, provávelmente mais do que cerca de 70 % de homologia, e ainda mais provavelmente mais do que cerca de 80 % de homologia, alguns podem mesmo ser mais do que cerca de 90 % homólogos ao nivel dos polipétidos. As técnicas para determinação da homologia da sequência de aminoácidos são conhecidas dos peritos. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser determinada directamente e comparada com as sequências aqui apresentadas. Alternativamente, a sequência de nucleótidos do material genómico do suposto HCV pode ser determinada (usualmente via o intermediário do cDNA), pode ser determinada a suposta sequência de aminoácidos ai codificados, e as regiões correspondentes comparadas.

Um polinucleótido derivado de uma sequência

designada, como é referido no presente texto, refere-se a uma sequência de polinucleótidos que é composta de uma sequência de, aproximadamente, pelo menos cerca de 6 nucleótidos, preferencialmente, pelo menos, cerca de 8 nucleótidos, sendo preferível, pelo menos, cerca de 10-12 nucleótidos e preferindose entre 15-20 nucleótidos correspondentes a uma região da designada sequência nucleotidica. Correspondentes significa homólogos ou complementares à sequência designada. Preferencialmente, a sequência da região de onde o polinucleótido é derivado, é homóloga ou complementar de uma sequência que é exclusiva de um genoma de HCV. Preferencialmente, a sequência derivada é homóloga ou complementar de uma sequência exclusiva de todos, ou pelo menos da maioria dos isolados de HCV. Se a sequência é ou não exclusiva do genoma do HCV, pode determinar-se por técnicas conhecidas dos peritos neste ramo. Por exemplo, a sequência pode ser comparada com sequências em bancos de dados e.g., bancos de genes, para determinar se ela está presente no hospedeiro não infectado, ou em outros organismos. A sequência pode também ser comparada com as sequências conhecidas de outros agentes virais, incluindo aqueles que se sabe serem indutores da hepatite, e.g·, HAV, HBV e HDV, e membros da família Flaviviridae. A correspondência ou não correspondência da sequência derivada com outras sequências pode também ser determinada por hibridação, sob condições apropriadas ao emparelhamento. Técnicas de hibridação, para determinar a complementaridade das sequências de ácidos nucleicos, são conhecidas nestes campos, e são discutidas abaixo. Ver também, por exemplo, Maniatis et al. (1982). Além disso, falhas nos

Ρ,

duplexes de polínucleótidos formados por hibridaçâo podem ser determinadas por técnicas conhecidas, incluindo por exemplo, digestão com nuclease como a Sq que digere especificamente áreas de cadeias simples, em conjuntos de duplexes de polínucleótidos. Regiões das quais as tipicas sequências do DNA podem ser derivadas incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, regiões que codificam epitopos específicos, assim como regiões não transcritas e/ou não traduzidas.

polinucleótido derivado não é necessariamente derivado fisicamente da sequência de nucleótidos apresentada, mas pode ser gerado por qualquer processo, incluindo por exemplo, sintese quimica, ou replicação do DNA, ou transcrição reversa, ou transcrição. Por fim, combinações de regiões correspondentes à da sequência designada, podem ser modificadas por processos conhecidos dos peritos, consistentes com o uso pretendido.

termo polinucleótido recombinante, como é utilizado no presente texto, pressupõe um polinucleótido de cDNA genómico semi-sintético, ou de origem sintética, que, em virtude da sua origem ou manipulação : (1) não está associado com a totalidade, ou uma porção, de um polinucleótido com o qual está associado na natureza, (2) está ligado a um polinucleótido diferente daquele a que aparece ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza.

termo polinucleótido, como utilizado no presente texto, refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento, quer ribonucleótidos ou desoxiribonucleótidos. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim, este termo inclui cadeias simples e duplas de DNA e RNA. Inclui também tipos conhecidos de modificações, por exemplo, marcações que estão descritas nas técnicas, metilações caps, substituição de um ou mais nucleótidos, que ocorrem naturalmente, por outros análogos, modificações internucleótidos como, por exemplo, aqueles que possuem ligações não carregadas (e.g., metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carboamatos, etc.), e com ligações carregadas (e.g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles que contêm porções pendentes, como por exemplo, proteinas (incluindo por e.g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, poli-L-Lisina, etc.), aqueles que possuem susbstâncias intercalantes (e.g., acridina, psoralen, etc.), aqueles que contêm quelantes (e.g., metais, metais radioactivos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles que contêm alquilantes, aqueles que possuem ligações modificadas (e.g., ácidos nucleicos α anuméricos, etc.), assim como formas não modificadas do polinucleótido.

A cadeia de sentido de um ácido nucleico, como é utilizado no presente texto, contém a sequência que é homóloga da sequência do mRNA. A anti-cadeia de sentido contém a sequência complementar à da cadeia de sentido.

Uma cadeia genómica positiva de um virus, como é utilizado no presente texto, é um genoma, seja RNA, seja DNA, constituído por uma cadeia simples que codifica um(s) polipétido(s) viral(s). Exemplos de viroses RNA de cadeia positiva incluem os Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae, e Caliciviridae. Incluídos também estão os Flaviridae, que foram inicialmente classificados como Togaviridae. Ver Fields & Knipe (1986).

termo primer, como é utilizado neste texto, refere-se a um oligómero que é capaz de actuar como ponto de iniciação da sintese de uma cadeia de polinucleótidos, quando colocados sob condições apropriadas. 0 primer será completa ou substancialmente complementar a uma região da cadeia de polinucleótidos a ser copiada. Assim, sob condições que conduzam à hibridação, o primer vai emparelhar com a região complementar de uma cadeia de análise. Mediante a adição dos reagentes adequados (e.g., uma polimerase, nucleótidos trifosfato, e outros semelhantes), o primer é continuado através do agente polimerizador para formar uma cópia da cadeia de análise. 0 primer pode ser uma cadeia única, ou alternativamente, pode ser uma cadeia dupla parcial ou total.

Os termos polinucleótido de análise e cadeia de análise, referem-se a uma cadeia simples ou dupla de uma molécula de ácidos nucleicos que se suspeita conter a sequência alvo, e que pode estar presente numa amostra biológica.

termo oligómero, como se utiliza neste texto, refere-se a primers e a sondas. 0 termo oligómero não implica o tamanho da molécula. No entanto, oligómeros típicos não ultrapassam os 1.000 nucleótidos, tipicamente não possuem mais de 500 nucleótidos, sendo ainda mais tipica a situação em que eles não ultrapassam os 250 nucleótidos, podem não possuir mais do que 100 nucleótidos, por vezes não ultrapassam os 75 nucleótidos, e também podem ser constituídos por não mais de 50 nucleótidos de comprimento.

termo sonda, como é utilizado no presente texto, refere-se a uma estrutura constituída por um polinucleótido, que

forma uma estrutura hibrida com uma sequência alvo, devido à complementaridade de, pelo menos, uma sequência da sonda com uma sequência da região alvo. As sondas de regiões de polinucleótidos podem ser formadas de DNA, e/ou RNA, e/ou nucleótidos sintéticos análogos. Incluídas nas sondas estão as sondas de captura e sondas de marcação. Preferencialmente, a sonda não contém uma sequência complementar à(s) sequência(s) utilizadas como primer e a partir das quais se inicia a reacção em cadeia da polimerase (PCR).

termo região alvo, como é utilizado no presente texto, refere-se a uma região do ácido nucleico que vai ser amplificada e/ou detectada. 0 termo sequência alvo, refere-se a uma sequência com a qual uma sonda ou primer vai formar um hibrido estável sob condições apropriadas.

termo sonda de captura, como é utilizado no presente texto, refere-se a um polinucleótido, constituído por uma cadeia simples de polinucleótidos, acoplados a um parceiro de e ligação. 0 polinucleótido de cadeia simples, é constituído por uma sequência polinucleotidica dirigida contra, e que é

_) complementar de uma sequência alvo, numa região alvo a ser detectada no polinucleótido de análise. Esta região complementar tem comprimento e complementaridade suficientes para permitir a formação de um duplexe estável, que é suficiente para fixar o polinucleótido de análise a uma superfície sólida (através da ligação a um parceiro). O parceiro de ligação é especifico para uma segunda ligação a um novo parceiro. 0 segundo parceiro de ligação pode ligar-se à superfície de um suporte sólido, ou pode estar indirectamente ligado, através de outras estruturas, ou parceiros de ligação, a um suporte sólido.

termo sequência polinucleotidica dirigida contra, tal como é utilizado no presente texto, refere-se a uma sequência polinucleotidica que é constituída por nucleótidos que são complementares a uma sequência nucleotidica alvo; a sequência tem comprimento e complementaridade suficientes com a sequência alvo para formar um duplex que tem estabilidade suficiente para o objectivo pretendido. 0 termo parceiro de ligação, tal como é referido no texto, refere-se a uma molécula capaz de ligar uma molécula liganda de elevada especificidade, como, por exemplo, um antigénio ou um anticorpo especifico. Em geral, os parceiros específicos de ligação devem ligar-se com afinidade suficiente para imobilizar a cópia de análise/duplex de cadeia complementar (no caso de sondas de captura), sob condições de isolamento. Parceiros específicos de ligação são conhecidos nesta técnica e incluem, por exemplo, biotina e avidina ou streptavidina, Ig G e proteína A, os vários pares receptor-ligando conhecidos e cadeias polinucleotidicas complementares. No caso de parceiros de ligação a polinucleótidos complementares, os parceiros são, normalmente, pelo menos de cerca de 15 bases de comprimento e podem ser de pelo menos 40 bases de comprimento; além disso têm um conteúdo de Gs e Cs de, pelo menos, cerca de 40 % e tanto como cerca de 60 %. Os polinucleótidos podem ser compostos por DNA, RNA, ou nucleótidos análogos sintéticos.

termo acoplado, como é referido no presente texto, refere-se à junção por ligações covalentes ou por interacções não covalentes fortes (e.g. interacções hidrofóbicas, ligações de pontes de hidrogénio, etc. ). As ligações covalentes podem ser, por exemplo, éster, éter, fosfoéster, amida, peptidica, imida, ligações carbono-enxofre, ligações carbono-fósforo e outras semelhantes.

termo suporte refere-se a qualquer superfície sólida ou semi-sólida, à qual pode estar ligado o parceiro de ligação desejado. Suportes apropriados incluem o vidro, plástico, metal, geles poliméricos e outros semelhantes, que podem tomar a forma de esferas, cúpulas, placas graduadas, membranas e outros semelhantes.

termo marcação, tal como ê usado no presente texto, refere-se a qualquer átomo ou meio, que possa ser utilizado para fornecer um sinal detectável (preferencialmente quantificável), e que possa ligar-se a um polinucleótido ou polipéptido.

Tal como é aqui usado, o termo sonda de marcação, refere-se a um oligómero que é constituído por uma sequência polinucleotidica dirigida contra a região alvo, que é complementar de uma sequência alvo a detectar no polinucleótido de análise. Esta região complementar é de comprimento e complementariedade, em relação á sequência alvo, suficientes para permitir a formação de um duplex constituído pela sonda de marcação e a sequência alvo a detectar pela marcação. O oligómero é acoplado directamente ao marcador, ou indirectamente através de uma série de moléculas ligandas com elevada especificidade umas para as outras. Conjuntos de moléculas ligandas, com elevada especificidade, são descritas acima, e também incluem multimeros.

termo multimero, como é aqui utilizado, refere-se a polímeros lineares ou ramificados da mesma unidade repetitiva de polinucleótidos em cadeia simples, ou diferentes unidades de polinucleótidos de cadeia simples. Pelo menos uma das unidades, tem uma sequência, comprimento e composição que lhe permite a hibridaçâo especifica com a primeira sequência nucleotidica em cadeia simples, de interesse, geralmente uma cadeia de análise, ou um oligómero (e.g., uma sonda de marcação) ligado a uma cadeia de análise. Com vista a atingir esta elevada especificidade e estabilidade, esta unidade terá normalmente cerca de 15 nucleótidos de comprimento, tipicamente não mais do que cerca de 50 nucleótidos em comprimento, e o conteúdo de Gs e Cs será normalmente e pelo menos de cerca de 40 % e no máximo de 60 %. A acrescentar a estas unidades, o multimero inclui uma multiplicidade de unidades que são capazes de se hibridar especifica e estavelmente com um segundo nucleótido de cadeia simples, de interesse, tipicamente um polinucleótido marcado ou um outro multimero. Estas unidades têm geralmente o mesmo tamanho e composição que os multimeros referidos acima. Quando um multimero se destina a hibridar-se com outro multimero, a primeira e segunda unidades de oligonucleótidos são heterogéneas (diferentes), e não se hibridam uma com a outra, sob condições do ensaio seleccionado. Assim, os multimeros podem ser sondas de marcação ou podem ser ligandos que acopulam o agente de marcação à sonda.

Como é utilizado no presente texto, o termo RNA virai, que inclui o RNA do HCV, refere-se ao RNA do genoma virai, fragmentos dele, transcrições dele e sequências mutantes dele derivadas.

Como é aqui referido, uma amostra biológica, refere29

se a uma amostra de tecidos ou fluidos isolados de um indivíduo, incluindo mas não limitados a, por exemplo, plasma, soro, liquido espinal, fluido linfático, secções externas da pele e tracto respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, orgãos, e também amostras de constituintes de culturas celulares in vitro (incluindo, mas não limitadas por meios condicionados, resultantes do crescimento das células em meios de cultura celular, supostamente células infectadas por virus, células recombinantes, e componentes celulares).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A prática da presente invenção vai empregar, excepto quando indicado de outro modo, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, DNA Recombinante e imunologia, que são sobejamente conhecidas dos peritos nestes campos. Estas técnicas, são extensivamente referidas na literatura, ver e.g., Maniatis, Fitch & Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I e II (edições D.N. Glover, 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (edições M.J. Gait, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (edições B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); as séries, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.), particularmente os Vol. 154 e 155 (edições Wu e Grossman, e edições Wu). Todas as patentes, Pedidos de Patentes e publicações aqui mencionadas, tanto acima como abaixo, são aqui incorporadas por referência.

Os materiais e processos utilizados na presente invenção, tornaram-se possiveis pela identificação do HCV como agente etiológico do BB-NANBV, e pela provisão de uma família de sequências nucleotidicas isoladas de um património de cDNA, que contém sequências do cDNA do HCV. Estes patrimónios de cDNA, derivaram de sequências de ácidos nucleicos presentes no plasma de um chimpanzé, infectado pelo HCV. A construção de um destes patrimónios, o património c (ATCC No. 40394), está descrita na publicação E.P.O. No.318.216.

Utilizando a sequência acima descrita, do cDNA do HCV, assim como as descritas no presente texto, podem ser construídos oligómeros úteis como reagentes para detecçâo de polinucleótidos virais em amostras biológicas. Por exemplo, a partir das sequências, é possivel sintetizar oligómeros de DNA de cerca de 8-10 nucleótidos, ou maiores, que são úteis como sondas de hibridação para detecçâo da presença do RNA do HCV em, por exemplo, sangue doado, fracções sanguíneas, soro de indivíduos suspeitos de serem portadores do virus, ou sistemas de cultura celular, nos quais o virus está a replicar-se. Por último, os novos oligómeros aqui descritos, possibilitam uma caracterização mais profunda do genoma do HCV. Sondas polinucleotidicas e primers derivados destas sequências, podem ser utilizados para amplificar sequências que fazem parte dos patrimónios de cDNA e/ou detectar, nesses patrimónios, outras sequências de cDNA coincidentes, que por sua vez, podem ser usadas para obter mais sequências coincidentes. Como se indica abaixo, e na publicação E.P.O. No. 318.216, o genoma do HCV parece ser um RNA constituído primeiramente por uma grande estrutura de leitura aberta (ORF) que codifica para uma grande poliproteina.

Em consequência do exposto acima, a informação

fornecida abaixo permite a identificação de estirpes ou isolados adicionais de HCV. 0 isolamento e caracterização das estirpes ou isolados de HCV adicionais, pode ser levado a cabo utilizando técnicas conhecidas pelos peritos nestes assuntos, como por exemplo, isolando os ácidos nucleicos de componentes do corpo que contêm partículas virais e/ou RNA virai, criando patrimónios de cDNA, usando os oligómeros descritos abaixo, para pesquisa nos patrimónios de clones contendo as sequências de cDNA do HCV descritas abaixo, e comparando os cDNAs do HCV dos novos isolados com os cDNAs descritos na Publicação E.P.O. No. 318.216, e abaixo. Estirpes ou isolados que se encaixem dentro dos parâmetros do HCV, como é descrito na Secção de definições, acima, são identificados sem dificuldade. Outros métodos para identificação de estirpes de HCV serão óbvias para os peritos nestas técnicas, baseados nas informações aqui referidas.

ISOLAMENTO DE SEQUÊNCIAS DO CDNA do HCV

Os oligómeros da invenção contêm regiões que formam duplexes de estruturas híbridas com as regiões alvo dos polinucleótidos do HCV. A região de hibridaçâo do oligómero com os polinucleótidos do HCV podem passar a conhecer-se a partir da sequência(s) do cDNA do HCV fornecidas no presente texto, e descritas na Publicação E.P.O. No. 318.216. Na fig.18 pode observar-se uma composição do cDNA do HCV, proveniente do HCV1, protótipo do HCV. A sequência composta é baseada na informação das sequências derivadas de um certo número de cDNA de clones de HCV, que foram isolados de um certo número de patrimónios de cDNA do HCV, incluindo o património c, presente no lambda gtll (ATCC

No. 40394), e de soro humano. Os clones de cDNA do HCV foram isolados por métodos descritos na Publicação E.P.O. No. 318.216. Resumidamente, a maioria dos clones que foram isolados continham sequências do cDNA do HCV do património c, que foi construido usando uma pool de soros de um chimpanzé com uma infecçâo crónica pelo HCV e contendo um titulo elevado do virus, i.e., g

pelo menos 10 doses infectadas do chimpanzé/ml (CID/ml). A pool de soros foi usada para isolar partículas virais; ácidos nucleicos isolados destas partículas foram usados como molde na construção dos patrimónios de cDNA do genoma virai. 0 clone inicial, 5-1-1, foi obtido por pesquisa do património c em soros de indivíduos infectados. Após o isolamento do clone inicial, o resto da sequência foi obtido por detecção com sondas de polinucleótidos sintéticas, das sequências derivadas da região 5' e da região 3' das sequências já conhecidas do cDNA do HCV.

A descrição dos métodos de obtenção das sequências de cDNA é principalmente de interesse histórico. As sequências resultantes ( e seus complementares) são fornecidas no presente texto, e as sequências, ou qualquer porção delas podem ser preparadas utilizando métodos de sintese, ou por uma combinação de métodos sintéticos com obtenção de sequências parciais usando métodos similares aos descritos na Publicação E.P.O. No. 318.216.

SONDAS DE OLIGOMEROS E PRIMERS

Usando como base o genoma do HCV (como se ilustra na fig. 18), e/ou preferencialmente regiões conservadas do genoma de HCV, podem ser preparados oligómeros de aproximadamente 8 nucleótidos ou mais, que se hibridam com a(s) cadeia(s) positivas do RNA do HCV ou seus complementares, assim como com os cDNAs do

HCV. Estes oligómeros podem servir como sondas para detecção (incluindo isolamento e/ou marcação) de polinucleótidos que contêm sequências nucleotidicas do HCV, e/ou como primers para a transcrição e/ou replicação de sequências alvo de HCV. Os oligómeros contêm uma sequência polinucleotidica dirigida contra a região alvo, que é constituida por nucleótidos, que são complementares a uma sequência nucleotidica alvo de HCV, a sequência é de comprimento e complementaridade com a sequência de HCV, suficientes para formar um duplex que tem estabilidade suficiente para os fins pretendidos. Por exemplo, se a finalidade é o isolamento, por imobilização, de uma cadeia de análise contendo a sequência alvo de HCV, os oligómeros conterão uma região polinucleotidica de comprimento e complementariedade suficientes para a sequência alvo de HCV, para permitir suficiente estabilidade do duplex para fixar a cadeia de análise a uma superfície sólida, através da sua ligação a oligómeros, sob condições de isolamento. Por exemplo, também se os oligómeros são para utilizar como primers, para transcrição e/ou replicação de sequências alvo de HCV numa cadeia polinucleotidica de análise, os oligómeros conteriam uma região polinucleotidica de comprimento e complementariedade suficientes para a sequência alvo do HCV, para permitir ao agente polimerizador a continuação da replicação a partir dos primers que se encontram em duplexes estáveis formados com a sequência alvo, sob condições de polimerizaçâo. Por exemplo, também, se os oligómeros são para utilizar como sondas de marcação, ou são para ligar a multimeros, a região polinucleotidica alvo seria de comprimento e complementariedade suficientes para formar duplexes de estruturas complementariedade suficientes para formar duplexes de estruturas hibridas estáveis com as sondas de marcação e/ou multimeros, para permitir a detecção de duplexes. Os oligómeros podem conter um minimo de cerca de 4 nucleótidos contíguos que são complementares de sequências alvo de HCV; usualmente os oligómeros conterão um minimo de cerca de 8 nucleótidos contíguos que são complementares da sequência de HCV alvo, e preferencialmente conterão um minimo de 14 nucleótidos contíguos que são complementares à sequência alvo de HCV.

Sequências apropriadas de nucleótidos de HCV dirigidas contra a região alvo, podem ser constituídas por nucleótidos que são complementares, seleccionados dos nucleótidos de cDNA do HCV que se seguem, e que podem ser observados na Fig. 18, (nn_x - nny representam a sequência desde o nucleótido número x até ao nucleótido número y):

nn nn nn nn nn

-340

-310

-280

-250

-220

-190 nn nn nn nn nn nn nn

-160

-130

-100

- nn

- nn nn

110

- nn.

- nn

- nn nn nn nn

140

-330'	ⁿⁿ-330	ⁿⁿ-320'	ⁿⁿ-320'	ⁿⁿ-310'
-300⁷	ⁿⁿ-300	ⁿⁿ-290'	ⁿⁿ-290	ⁿⁿ-280'
-2 70^;	nn_27₀	ⁿⁿ-260^;	ⁿⁿ-260	ⁿⁿ—250'
-240'	ⁿⁿ-240	ⁿⁿ-230'	ⁿⁿ-230	ⁿⁿ-22O⁷
— 210'	nn_2io	ⁿⁿ-200'	ⁿⁿ-200	ⁿⁿ-190'
-180⁷	ⁿⁿ_180	nn_₁₇₀;	ⁿⁿ-170	ⁿⁿ—160'
-150'	ⁿⁿ-150	ⁿⁿ-140'	ⁿⁿ-140	ⁿⁿ-130'
-120'	ⁿⁿ-120	ⁿⁿ-110'	ⁿⁿ-no	ⁿⁿ-100^?
-90' ^:	ⁿⁿ-90 ’	nn_θq; nn_	-80 ’ ⁿⁿ	-70'

80' nn

- nn

170 ⁿⁿ200 - nn nn nn

120' 150' 180'

ⁿⁿ-60	ⁿⁿ-50'	ⁿⁿ-50 ”	ⁿⁿ-40'
ⁿⁿ-30	ⁿⁿ-20'	ⁿⁿ-20 -	ⁿⁿ-10^;
^ll “ ⁿⁿl0^{; nn}10	ⁿⁿ2 0'	ⁿⁿ20	ηη_3θ;
^l40	ⁿⁿ50^{; nn}50	ⁿⁿ6 0	^{; nn}60	ⁿⁿ70'
^l80	ⁿⁿ9 0^{; nn}90	ⁿⁿioo^{7 nn}ioo	ⁿⁿ110^;
ⁿⁿ120	ⁿⁿ130^;	ⁿⁿ1.30	ⁿⁿ140^;
ⁿⁿ150	ⁿⁿ160^;	ⁿⁿ160	ⁿⁿ170'
ⁿⁿ180	ⁿⁿ190'	ⁿⁿ190 ~	ⁿⁿ200'
ⁿⁿ210	- ⁿⁿ220'	nn220 ’	ⁿⁿ230'

^ηη230	-	^ηη240^Ζ	^ηη240	-	^ηη250'	^ηη250	-	^ηη260^;
^ηη260	-	^ηη270'	^ηη270	-	^ηη280⁷	^ηη2 80	—	^ηΓΪ2 9 0⁷
ηη₂₉₀	-	^ηη300⁷	^ηη300	-*	^ηη310 ⁷	^ηη310	·*·	^ηη320'
^ηη320	-	^ηη330^;	^ηη330		^ηη340'	^ηη340	—	^ηη350'
^ηη350	-	^ηη360^?	^ηη360	—	^ηη37 0⁷	^ηη37ο		^ηη380^?
^ηη380	-	^ηη390⁷	^ηη390	—	^ηη400⁷	^ηη400		^Πη410⁷
^ηη410	-	^ηη420^;	^ηη420	—	^ηη430'	^ηη430		^ηη440⁷
^ηη4 40	-	^ηη450⁷	^ηη450	-	^ηη4 60⁷	^ηη460	*·	^ηη470⁷
^ηη470	-	^ηη4 80⁷	^ηη480	-	^ηη490^;	^ηη490		^ηη500⁷
^ηη500	-	^ηη510⁷	^ηη510	—	ηη₅₂θ;	^ηη520		^ηη530'
^ηη530	-	^ηη540'	^ηη540	-	^ηη550^?	^ηη550	·	^ηη560'
^ηη560	—	^ηη57 0⁷	^ηη570	—	^ηη5 8 0⁷	^ηη580	·	^ηη590'
^ηη590	-	^ηη600⁷	^ηη600	—	^ηη610^?	^ηη610	—	^ηη620⁷
^ηη620	-	^ηη6 30⁷	^ηη630	—	^ηη6 40⁷	^ηη640		^ηη650^?
^ηη650	-	^πη660^;	^ηη660		^ηη6 7 0⁷	^ηη670		^ηη680^ζ
^ηη680	-	^ηη6 9 0⁷	^ηη690	-	^ηη700^;	^ηη700	—	^ηη710⁷
^ηη710	-	^ηη720'	^ηη720		^ηη730'	^ηη730		^ηη740⁷
^ηη7 4 0	-	^ηη750^?	^ηη750	—	^ηη7 6 0 ⁷	^ηη760	·*·	^ηη7 7 0⁷
^ηη770	-	^ηη780'	^ηη780	—	^ηη7 9 0⁷	^ηη790		^ηη800^;
^πη800	-	πηθιθ;	^ηη810	-	^ηη820'	^ηη82 0		^ηη830^?
^ηη830	-	^ηη84 0^;	^ηη840	—	^ηη850⁷	^ηη850		^ηη860^Ζ
^ηη860	-	^ηη87 0⁷	^ηη870	-»	^ηη880^;	^ηη880		^ηη8 9 0⁷
^ηη890	-	^ηη9 00⁷	^ηη900	—	^ηη910⁷	^ηη910		^ηη920^;
^ηη920	-	^ηη930^;	^ηη930	-	^ηη940^;	^ηη940		^ηη95 0⁷
^ηη950	-	^ηη960'	^ηη960	—	^ηη970⁷	^ηη970		^ηη980^;
^ηη980	-	^ηη99Ο⁷	^ηη9 9 0	—	^ηη1000	^{? ηη}1000	- ^ηη10

^ηηΧ010 ^ηη1020^{? ηη}1020 ’ ^ηη1030^{; ηη}1030 ^ηη1040^{? ηη}1040 “ ^ηη1050^{; ηη}1050 ^ηη1060' ^ηη1060 ” ^ηη1Ο7Ο^{7 ηη}1Ο7Ο ^ηη1080^{; ηη}1080 ^ηη1090^{; ηη}1090 ^πη1100^{; ηη}1100 ^ηηιιιο^{7 ηη}1110 ^ηη1120^{; ηη}1120 ~ ^ηη1ΐ30^{; ηη}1130 ~ ^ηη1140^{; ηη}1140 ^ηη1150^{; πη}1150 ^ηη1160^{; ηη}11βΟ ^ηη1170^{; ηη}1170 ’ ^ηη1180^{; ηη}1180 ’ ^ηη1190^{7 ηη}1190 ” ^ηη1200^{; ηη}ΐ200 ' ^ηη1210^{; ηη}1210 ^ηη1220^{? ηη}1220 ^ηη1230^{? ηη}1230 ^ηη1240^{? ηη}1240 ^ηη1250^; ^ηη1250 ^ηη1260^{; ηη}1260 “ ^ηη1270^{; ηη}1270 ^ηη1280^{? ηη}1280 ^ηη1290' ^ηη1290 ^ηη1300'* ^ηη1300 ” ⁿⁿ1310?

^ηη1310	-	^ηη1320⁷	^ηη1320	**	^ηη133Ο⁷	^ηη1330		^ηη1340⁷
^ηη1340	-	^ηη1350 ⁷	^ηη1350	-	^ηη136Ο⁷	^ηη1360	—	^ηη1370⁷
^ηη1370	—	^ηη1380⁷	^ηη1380	-	^ηη139Ο⁷	^ηη1390	·	^ηη1400⁷
^ηη1400	-	^ηη141Ο⁷	^ηη14ΐ0	-	^ηη142 0⁷	^ηη1420	—	^ηη1430'
^ηη1430	-	^ηη1440⁷	^ηη1440	—	^ηη1450^;	^ηη1450	—	^ηη1460^;
^ηη1460	-	^ηη1470⁷	^ηη1470	-	^ηη1480^;	^ηη1480	—	^ηη1490^?
^ηη1490	-	^ηη1500'	^ηη1500	··	^ηη151Ο⁷	^ηη1510	—	^ηη1520'
^ηηΐ520	-	^ηη1530⁷	^ηη1530	—	^ηη1540^;	^ηη1540	·	^ηη1550⁷
^ηη1550	-	^ηη156Ο⁷	^ηη1560	*	^ηη1570^;	^ηη1570	·	^ηη1580⁷
^ηη1580	-	^ηη1590'	^ηη1590	-	^ηη1600'	^ηη1600		^ηη161Ο⁷
^ηη1610	-	^ηη162Ο⁷	^ηη1620	-	^ηη1630^;	^ηη1630	—	^ηη1640⁷
^ηη1640	-	^ηηΐ650^;	^ηη1650	-	^ηη166Ο⁷	^ηη1660	—	^ηη1670^;
^ηη!670	-	^ηη1680⁷	^ηη1680	*	^ηη169Ο⁷	^ηη1690		^ηη1700^;
^ηη1700	-	^ηη1710^;	^ηη1710	-	^ηη1720⁷	^ηη1720	—	^ηη1730⁷
^ηη1730	-	^ηη1740⁷	^ηη1740	— _r	^ηη1750⁷	^ηη1750		^ηη1760⁷
^ηη1760	-	^ηη1770^;	^ηη17 7 0	-	^ηη1780⁷	^ηη1780	—	^ηη1790^;
^ηη1790	-	^ηη1800'	^ηη1800	—	^ηη1810 ⁷	^ηη1810		^ηη182Ο⁷
^ηη1820	-	^ηη1830^?	^ηη1830	—	^ηη1840^?	^ηη1840		^ηη1850⁷
^ηη1850	-	^ηη18βΟ⁷	^ηη1860	·“	^ηη1870⁷	^ηη1870		^ηη188Ο⁷
^ηη1880	-	^ηη1890^;	^ηη1890	—	^ηη1900^;	^ηη1900		^ηη1910^;
^ηη1910	-	^ηη192Ο⁷	^ηη1920	*	^ηη1930^;	^ηη1930		^ηη1940⁷
^ηηΐ940	-	^ηη1950⁷	^ηη1950	-	^ηη1960^;	^ηη1960	-	^ηη1970⁷
^ηη1970	-	^ηη198Ο⁷	^ηη1980	-	^ηη199Ο⁷	^ηη1990		^ηη2000⁷
^ηη2000	-	^ηη2010'	^ηη2010	-	^ηη2020'	^ηη2020	—	^ηη2030'
^ηη2030	-	^ηη2040⁷	^ηη2040	—	^ηη2050^;	^ηη2050		^ηη2060⁷
^ηη2060	-	^ηη207 0'	^ηη2070	-	^ηη2080'	^ηη2080	—	^ηη2090⁷
^ηη2090	-	^ηη2100⁷	^ηη2100	-	^ηη2110⁷	^ηη2110	—	^ηη2120⁷
^ηη2120	-	^ηη2130⁷	^ηη2130	—	^ηη2140^?	^ηη2140	—	^ηη2150'
^ηη2150	-	^ηη2160⁷	^ηη2160	—	^ηη217 0 ⁷	^ηη2170		^ηη2180⁷
^ηη2180	-	^ηη2190⁷	^ηη2190	-	^ηΓι2 2 00 '	^ηη2200		^ηη2210⁷
^ηη2210	-	^ηη2220'	^ηη2220	*	^ηη2 2 3 0 ^;	^ηη2230		^ηη2240⁷
^ηη2240	-	^ηη2250^;	^ηη2250	-	^ηη2260'	^Πη2260		^ηη22Ί0⁷
^ηη2 2 7 0	-	^ηη2280'	^ηη2280	-	^ηη2290'	^ηη2290	—	^ηη2300⁷
^ηη2300	-	^ηη2310⁷	^ηη2 310	-	^ηη2320 ⁷	^ΠΠ2320	·	^ηη2330⁷
^ηη2330	-	^ηη.234Ο⁷	^ηη2340	—	^ηη2350⁷	^ηη2350		^ηη2 360⁷
^ηη2360	-	^ηη2370r	^ηη2370	-	ηη2380'	^ηη2380		^ηη2390>

^ηη2390	-	^ηη24 00⁷	^ηη2400	-	^ηη2410⁷	^ηη2410		^ηη2420⁷
^ηη2420	-	^ηη24 30⁷	^ηη2430	-	^ηη2 4 4 0⁷	^ηη2440	·“	^ηη2450⁷
^ηη2450	-	^ηη2460'	^ηη2460	-	^ηη2470 ⁷	^ηη2470		^ηη2480^;
^ηη2480	—	^ηη2490^?	^ηη2490	—	^ηη2500'	^ηη2500		^ηη2510⁷
^ηη2510	*	^ηη2520⁷	^ηη2520	-	^ηη2530⁷	^ηη2530	Μ	^ηη2540⁷
^ηη2540	-	^ηη2550⁷	^ηη2550	—	^ηη2560⁷	^ηη2560		^ηη2570⁷
^ηη2570	-	^ηη2580⁷	^ηη2580	—	^ηη2590⁷	^ηη2590		^ηη2600'
^ηη2600	-	^ηη2610'	^ηη2610	—	^ηη2620'	^ηη2620		^ηη2630^;
^ηη2630	-	^ηη2640⁷	^ηη2640		^ηη2650 ⁷	^ηη2650	“·	^ηη2660⁷
^ηη2660	-	^ηη2670⁷	^ηη2670	—	^ηη2680'	^ηη2680		^ηη2690'
^ηη2690	-	^ηη2700⁷	^ηη2700	—	^ηη2710⁷	^ηη2710		^ηη2 7 2 0⁷
^ηη2720	- .	^ηη2730'	^ηη2730		^ηη2740 ⁷	^ηη2740		^ηη2750⁷
^ηη2750	-*	^ηη2760⁷	^ηη2760	—	^ηη2770⁷	^ηη2770		^ηη2780'
^ηη2780	-	^ηη2 7 9 0⁷	^ηη2 79 0	—	^ηη2800⁷	^ηη2800		^ηη2810^;
^ηη2810	*	^ηη2820⁷	^ηη2820	—	^ηη2830⁷	^ηη2830		^ηη2840^?
^ηη2840	-	^ηη2850'	^ηη2850	—	^ηη2860⁷	^ηη2860		^ηη2870⁷
^ηη2870	-	^ηη2 880⁷	^ηη2880	—	^ηη2890'	^ηη2890	·	^ηη2900⁷
^ηη2900	-	^ηη2910⁷	^ηη2910	—	^ηη2 92 0⁷	^ηη2920		^ηη29 30⁷
^ηη2930	-	^ηη2940⁷	^ηη2940	—	^ηη2950^;	^ηη2950		^ηη296Ο⁷
^ηη2960	-	^ηη2970⁷	^πη2 9 70	—	^ηη2 9 80⁷	^ηη2980		^ηη2 990⁷
^ηη2990	-	^ηη3 000'	^ηη3000	—	^ηη3010⁷	^ηη3010		^ηη3020⁷
^ηη3020	-	^ηη3030 ⁷	^ηη3030	—	^ηπ3040^;	^ηη3040	*	^ηη3050⁷
^ηη3050	-	^ηη3060^?	^ηη3060	—	^ηη3070^;	^ηη3070		^ηη3080⁷
^ηη3080	-	^ηη3090⁷	^ηη3090	—	^ηη3100’	^ηη3100		^ηη311Ο⁷
^ηη3110	-	^ηη3120⁷	^ηη3120	—	^ηη3130⁷	^ηη3130		^ηη3140^;
^ηη3140	-	^ηη3150^;	^ηη3150	—	^ηη3160⁷	^ηη3160		^ηη3170^;
^ηη317 0	-	^ηη3180^;	^ηη3180	—	^ηη3190^?	^ηη3190		^ηη32 00⁷
^ηη3200	-	^ηη3210⁷	^ηη3210	—	^ηη3220⁷	^ηη3220		^ηη3230⁷
^ηη32 30	-	^ηη3240^;	^ηη3240	-	^ηη3250^;	^ηη3250		^ηη3260⁷
^ηη3260	-	^ηη3270'	^ηη3270	-	^ηη3280 ⁷	^ηη3280	—	^ηη3290'
^ηη3290	-	^ηη3300⁷	^ηη3300	—	^ηη3310^;	^ηη3310		^ηη3320^?
^ηη3320	-	^ηη3330'	^ηη3330	—	^πη3340^;	^ηη3340		^πη3350⁷
^ηη3350	-	^ηη3360^;	^ηη3360	—	^ηη3370^;	^ηη3370	***	^ηη3380⁷
^ηη3380	-	^ηη3390'	^ηη3390	—	^ηη3400^;	^ηη3400		^ηη3410⁷
^ηη3410	-	^ηη3420^;	^ηη3420	-	^ηη3430^;	^ηη3430		^ηη3440⁷
^ηη3440	-	^ηη3450<	^ηη3450	-	^ηη3460^?	^ηη3460		^ηη3470'

^ηη3470	-	^ηη3480⁷	^ηη3480	-	^ηη34 90⁷	^ηη3490	*“	^ηη3500⁷
^ηη3500	-	^ηη3510⁷	^ηη3510	—	^ηη3520⁷	^ηη3520		^ηη353Ο⁷
^ηη3530	—	^ηη3540⁷	^ηη3540	—	^ηη3550⁷	^ηη3550	*	^ηη3560^;
^ηη3560	-	^ηη3570'	^ηη3570	—	^ηη3580⁷	^ηη3580		^ηη3590⁷
^ηη3590	-	^ηη36ΟΟ⁷	^ηη3600	“	^ηη3610'	^ηη3610	**	^ηη362Ο⁷
^ηη3620	-	^ηη3630'	^ηη3630	—	^ηη3640^;	^ηη3640	“	^ηη3650⁷
^ηη3650	-	^ηη3660⁷	^ηη3660	—	^ηη3670⁷	^ηη3670		^ηη3680⁷
^ηη3680	-	^ηη3690⁷	^ηη3690	—	^ηη3700'	^ηη3700		^ηη3710⁷
^ηη3710	-	^ηπ3 7 2 0⁷	^ηη3720	—	^ηη3730^;	^ηη37 30	«Μ	^ηη3740^;
^ηη3740	-	^ηη3750⁷	^ηη3750	-	^ηη37 60⁷	^ηη3760	Η*	^ηη3770⁷
^ηη3770	-	^ηη3780'	^ηη3780	—	^ηη3790⁷	^ηη37 90	**	^ηη3800^;
^ηη3800	-	^ηη381Ο⁷	^ηη3810	-	^ηη3820^;	^ηη3820	**	^ηη3830’
^ηη3830	-	^ηη384Ο⁷	^ηη3840	—	^ηη3850⁷	^ηη3850		^ηη386Ο⁷
^ηη3860	-	^ηη3870⁷	^ηη3870	·	^ηη3880⁷	^ηη3880	*	^ηη3890'
^ηη3890	-	^ηη3900^;	^ηη3900		^ηη391Ο⁷	^ηη3910		^ηη3920⁷
^ηη3920	-	^ηη3930⁷	^ηη3930	—	^ηη3 940⁷	^ηη3940		^ηη3950⁷
^ηη3950	-	^ηη3960^;	^ηη3960	—	^ηη3970⁷	^ηη3970	Μ	^ηη39 8 0⁷
^ηη3980	—	^ηη3990^;	^ηη3990		^ηη4000^;	^ηη4000		^ηη4Ο1Ο⁷
^ηη4010	-	^ηη4020'	^ηη4020		^ηη4 030⁷	^ηη4030	**	^ηη4Ο4Ο⁷
^ηη4040	-	^ηη4050^;	^ηη4050	—	^ηη4060'	^ηη4060		^ηη4Ο7Ο⁷
^ηη4070	-	^ηη4080⁷	^ηη4080	—	^ηη4090^?	^ηη4090		^ηη4100'
^ηη4100	-	^ηη4110⁷	^ηη4110	—	^ηη412Ο⁷	^ηη4120		^ηη4130⁷
^ηη4130	-	^ηη4140⁷	^ηη4140	. —	^ηη4150⁷	^ηη4150		^ηη4160⁷
^ηη4ΐ60	-	^ηη4170⁷	^ηη4170	—	^ηη4180⁷	^ηη4180	Μ	^ηη4190⁷
^ηη4190	-	^ηη42οο;	^ηη4200	—	^ηη4210⁷	^ηη4210		^ηη4220⁷
^ηη4220	-	^ηη4230^?	^ηη4230	—	^ηη4240⁷	^ηη4240	**	^ηη4250⁷
^ηη4250	-	^ηη4260^;	^ηη4260	—	^ηη4 2 7 0 ⁷	^ηη4270		^ηη4280⁷
^ηη4280	-	^ηη4 2 90^;	^ηη4 29 0	-	^ηη4300^?	^ηη4 300		^ηη4310^;
^ηη4 310	-	^ηπ4320’	^ηη4320	—	^ηη4330'	^ηη4330		^ηη4 34 0⁷
^ηη4340	-	^ηη4350⁷	^ηη4350	-	^ηη4 360 ⁷	^ηη4 36 0	**	^ηη4 37 0⁷
^ηη4370	-	^ηη4380^;	^ηη4380	—	^ηη4390'	^ηη4390		^ηη4 4 00⁷
^ηη4400	-	^ηη4410⁷	^ηη4410	—	^ηη4420'	^ηη4420		^ηη4430⁷
^ηη4430	-	^ηη4440^;	^ηη4440	—	^ηη4450^;	^ηη4450		^ηη4460^?
^ηη446 0	-	^ηη4470^;	^ηη4470	-	^ηη4480⁷	^ηη4 4 80		^ηη4490⁷
^ηη4490	-	^ηη4500'	^ηη4500	—	^ηη4510⁷	^ηη4510		^ηη4520⁷
^ηη4520	-	^ηη45307	^ηη45 30	-	^ηη4540'	ηη₄₅40		πη₄550<

^ηη4550	—	^ηη4560^;	^ηη4560	-	^ηη4570'	^ηη4 570	··	^ηη4580'
^ηη4580	-	^ηη4590^;	^ηη4590	-	^ηη4600^;	^ηη4600	—	^ηη4610^;
^ηη4610	-	^ηη4620'	^ηη4620	-	^ηη4630^;	^ηη4630		^ηη4640^?
^ηη4640	-	^ηη4650^;	^ηη4650	-	^ηη4660^;	^ηη4660	*·	^Πη4670^?
^ηη4670	-	^ηη4680^;	^ηη4680	-	^ηη4690^;	^ηη4690	““	^ηη4700⁷
^ηη4700	-	^ηη4710'	^ηη4710	—	^ηη4 7 20⁷	^ηη4720	—	^ηη4730^;
^ηη47 30		^ηη47 40^;	^ηη4 7 40	-	^ηη4 7 50⁷	^ηη4750	—	^ηη4760^;
^ηη4760	-	^ηη4770'	^ηη47 7 0	-	^ηη47 80⁷	^ηη4780	—	^ηη4790^;
^ηη4790	-	^ηη4800^;	^ηη4800	-	^ηη4810^;	^ηη4810	·*	^ηη4820'
^ηη4820	-	^ηη4830^;	^ηη4830	-	^ηη4840^;	^ηη4840		^ηη4850^;
^ηη4850	-	^ηη4860^;	^ηη4860	—	^ηη4870⁷	^ηη4870		^ηη4880^?
^ηη4880	-	^ηη4890^;	^ηη4890	—	^ηη4900⁷	^ηη4900	“·	^ηη491Ο⁷
^ηη4910	-	^ηη4920^;	^ηη4920	—	^ηη4930^;	^ηη4930		^ηη4940^?
^ηη4940	*	^ηη4 9 50'	^ηη4950	—	^ηη4960⁷	^ηη4960		^ηη4970^;
^ηη4970	-	^ηη4980^;	^ηη4980	—	^ηη4990^;	^ηη4990		^ηη5000^;
^ηη5000	-	^ηη5010^;	^ηη5010		^ηη5020'	^ηη5020		^ηη5030^?
^ηη5030	-	^ηη5040^;	^ηη5040	—	^ηη5050^?	^ηη5050		^ηη5060⁷
^ηη5060	-	^ηη507 0'	^ηη5070	—	^ηη5080^;	^ηη5080		^ηη5090'
^ηη5090	-	^ηη5100^;	^ηη5100	—	^ηη5110^?	^ηη5110		^ηη5120⁷
^ηη5120	-	^ηη5130^;	^ηη5130	-	^ηη5140^;	^ηη5140	—	^ηη5150⁷
^ηη5150	-	^ηη5160^;	^ηη5160		^ηη5170^;	^ηη5170	—	^ηη5180⁷
^ηη5180		^ηη5190^?	^ηη5190	—	^ηη52Ό0^;	^ηη5200		^ηη5210^;
^ηη5210	-	^ηη5220^;	^ηη5220	-	^ηη5230^;	^ηη5230	—	^ηη5240⁷
^ηη5240	-	^ηη5250^;	^ηη5250	—	^ηη5260^;	^ηη5260	. Μ	^ηη5270⁷
^ηη5270	-	^ηη5280^;	^ηη5280	-	^ηη5290^;	^ηη5290	-	^ηη5300^;
^ηη5300	-	^ηη5310^;	^ηη5310	—	^ηη5320'	^ηη5320	—	^ηη533Ο⁷
^ηη5330	-	^ηη5340 ^;	^ηη5340	-	^ηη5350^;	^ηη5350	—	^ηη5360^;
^ηη5360		^ηη5370'	^ηη5370	**	^ηη5380⁷	^ηη5380		^ηη5390^;
^ηη5390	-	^ηη5400^;	^ηη5400	-	^ηη5410^;	^ηη5410	—	^ηη5420'
^ηη5420	-	^ηη5430'	^ηη5430		^ηη 5 4 4 0'	^ππ54 40	—	^ηη5450^;
^ηη5450	-	^ηη5460^;	^ηη5460	-	^ηη5470^;	^ηη5470	—	^ηη5480^;
^ηη5480		^ηη54 9 0'	^ηη5490	-	^ηη5500'	^ηη5 5 00		^ηη5510^?
^ηη5510	-	^ηη5520^;	^ηη5520	-	^ηη5530^;	^ηη5530	—	^ηη5540^;
^ηη5540	-	^ηη5550^;	^ηη5550	—	^ηη5560^;	^ηη5560		^ηη5570'
^ηη5570	-	^ηη5580^?	^ηη5580	-	^ηη5590'	^ηη5590	-	^ηη5600'
^ηη5600	-	^ηη5610r	^ηη5610	*	^ηη5620;	^ηη5620	*	ⁿⁿ5630f

^ηη5630	^ηη5640'	^ΠΠ5640	^ηη5650^?	^ηη5650	' ^ηη5660
^ηη5660	-	^ηη5670^;	^ηη5670	-	^ηη5680'	^ηη5680		^ηη5690
^ηη5690	—	^ηΠ5700^;	^ηη5700	-	^ηη5710^;	^ηη5710	—	^ηη5720
^ηη5720	-	^ηη5730^;	^ηη5730	-	^ηη5740^;	^ηη5 74 0	—	^ηη5750
^ηη5750	-	^ηη5760^;	^ηη5760	—	^ηΠ5770^;	^ηη5770	··	^ηη5780
^ηη5780	-	^ηη5790^?	^ηη5790	-	^ηη5800^;	^ηη5800	—	^ηη58ΐ0
^ηη5810	-	^ηη5820'	^ηη5820	-	^ηη5830^;	^ηη5830	—	^ηη5840
^ηη5840	-	^ηη5850^;	^ηη5850	-	^ηη5860'	^ηη5860	—	^ηη5870
^ηη5870		^ηΠ5880^;	^ηη5880	-	^ηη5890^;	^ηη5890		^ηη5900
^ηη5900	-	^ηη5910^;	^ηη5910	-	^ηη5920⁷	^ηη5920	—	^ηη5930
^ηη5930	-	^ηη5940^;	^ηη5940	-	^ηη5950⁷	^ηη5950	—	^ηη5960
^ηη5960	-	^ηη5970'	^ηη5970	—	^ηη5980⁷	^ηπ5980		^πη5990
^ηη5990	-	^ηη6000'	^ηη6000	—	^ηη6010'	^ηη6010		^ηη6020
^ηη6020	-	^ηη6 030^;	^ηη6030	-	^ηη6040⁷	^ηη6040		^ηη6050
^ηη6050	-	^ηη6060^;	^ηη6060	-	^ηη6070⁷	^ηη6070		^ηη6080
^ηη6080	-	^ηη6090'	^ηη6090	-	^ηη6100⁷	^ηη6100	—	^ηη6110
^ηηβ110	-	^ηη6ΐ20^;	^ηη612 0	-	^ηη6130⁷	^ηη6130		^ηη6140
^ηη6140	*	^ηη6150'	^ηη6150	-	^ηη6160⁷	^ηη6160	—	^ηη6170
^ηηβ170	-	^ηηβ180’	^ηηβ180	—	^ηη6190⁷	^ηη6190	*·	^ηη6200
^ηη6200	-	^ηη6210'	^ηη6210	-	^ηη6220^;	^ηη6220		^ηη6230
^ηη6230	-	^ηη6240'	^ηη6240	—	^ηη6250⁷	^ηηβ250		^ηη6260
^ηη6260	*	^ηη6270^;	^ηη6270	*	^ηη6280'	^ηη6280	—	^ηη6290
^ηη6290		^ηη6300^;	^ηη6300		^ηη631Ο⁷	^ηη6310		^ηη6320
^ηη6320		^ηη6330'	^ηη6330		^ηη6340'	^ηη6340	—	^ηη6350
^ηη6350	*	^ηη6 360⁷	^ηη6360	-	^ηη6370^;	^ηηβ370		^ηη6380
^ηη6380	-	^ηη6390'	^ηη6390		^ηη6400⁷	^ηη6400		^ηη6410
^ηη6410	-	^ηη6420^;	^ηη6420	-	^ηη64 30 ⁷	^ηη6430		^ηη64 4 0
^ηη6440	-	^ηη6450'	^ηη6450	-	^ηη6460⁷	^ηη6460	—	^ηη6470
^ηη6470	-	^ηη6480'	^ηη6480	—	^ηη6 4 9 0 ⁷	^ηη6490	—	^ηηβ500
^ηη6500	-	^ηη6510⁷	^ηη6510	-	^ηη6520'	^ηη6520		^ηη6530
^ηη6530	*	^ηη6 54 0⁷	^ηη6540	-	^ηη6550⁷	^ηη6550		^ηη6560
^ηη6560	-	^ηη6 5 7 0'	^ηη6570	-	^ηη6580^;	^ηη6580		^πη6590
^ηη6590	-	^ηη66.00^;	^ηη6600		^ηη6610'	^ηη6610	—	^ηη6620
^ηη6620	-	^ηη6630^;	^ηη6β30	-	^ηη6 6 4 0 ⁷	^ηη6640		^ηη6650
^ηη6650	-	^ηη6660^;	^ηη6660	-	^ηη6670⁷	^ηη6670	—	^ηη6680
^ηη6680	-	^ηη6690'	^ηη6690	-	^ηη6700^;	^ηη6700		^ηη6710

ⁿⁿ6710	*“	ⁿⁿ6720
ⁿⁿ6740	—	ⁿⁿ6750
ⁿⁿ6770	—	ⁿⁿ6780
ⁿⁿ6800	-	ⁿⁿ6810
ⁿⁿ6830	—	ⁿⁿ6840
ⁿⁿ6860	—	ⁿⁿ6870
ⁿⁿ6890	-	ⁿⁿ6900
ⁿⁿ6920	-	ⁿⁿ6930
ⁿⁿ6950	-	ⁿⁿ6960
ⁿⁿ6980	-	ⁿⁿ6990
ⁿⁿ7010	-	ⁿⁿ7020
ⁿⁿ7040	-	ⁿⁿ7050
ⁿⁿ7070		ⁿⁿ7080
ⁿⁿ7100		ⁿⁿ7110
ⁿⁿ7130	-	ⁿⁿ7140
ⁿⁿ716 0	-	ⁿⁿ7170
ⁿⁿ7190	—	ⁿⁿ7200
ⁿⁿ7220		ⁿⁿ7230
ⁿⁿ7250	-	ⁿⁿ7260
ⁿⁿ7280	-	ⁿⁿ7290
ⁿⁿ7310	-	ⁿⁿ7320
ⁿⁿ7340	-	ⁿⁿ7350
ⁿⁿ7 370		ⁿⁿ7380
ⁿⁿ7400	-	ⁿⁿ7410
ⁿⁿ7430	-	ⁿⁿ7440
ⁿⁿ7460	-	ⁿⁿ7470
ⁿⁿ7490	-	ⁿⁿ7500
ⁿⁿ7520	-	ⁿⁿ7530
ⁿⁿ7 550	—	ⁿⁿ7560
ⁿⁿ7580	—	ⁿⁿ7590
ⁿⁿ7 610	-	ⁿⁿ7620
ⁿⁿ7640	-	ⁿⁿ7650
ⁿⁿ7670	-	ⁿⁿ7680
ⁿⁿ7700	-	ⁿⁿ7 710
ⁿⁿ7730	-	ⁿⁿ7740
ⁿⁿ7760	-	ⁿⁿ77 70

ⁿⁿ6720	—	ⁿⁿ6730 ⁷
ⁿⁿ6750		ⁿⁿ6 7 6 0'
ⁿⁿ6780	-	ⁿⁿ679O⁷
ⁿⁿ6810		ⁿⁿ6820^?
ⁿⁿ6840	—	ⁿⁿ6850^;
ⁿⁿ6870	-	ⁿⁿ6880^;
ⁿⁿ6900	-	ⁿⁿ69l0'
ⁿⁿ6930	-	ⁿⁿ6 9 40⁷
ⁿⁿ6960	-	ⁿⁿ6970^;
ⁿⁿ6990	-	ⁿⁿ7000'
ⁿⁿ7020	-	ⁿⁿ7030^?
ⁿⁿ7050	—	ⁿⁿ7060^;
ⁿⁿ7080	-	ⁿⁿ7090 ⁷
ⁿⁿ7110	-	ⁿⁿ7120^;
ⁿⁿ7140	-	ⁿⁿ7150 ⁷
ⁿⁿ7170	-	ⁿⁿ7180 ⁷
ⁿⁿ7 200	-	ⁿⁿ7210^;
ⁿⁿ7230	-	ⁿⁿ7 24 0⁷
ⁿⁿ7260	-	ⁿⁿ7270'
ⁿⁿ7290	-	ⁿⁿ7300^;
ⁿⁿ7320	-	ⁿⁿ7330^?
ⁿⁿ7 350	—	ⁿⁿ7 36 0⁷
ⁿⁿ7380	-	ⁿⁿ7 390⁷
ⁿⁿ7410	-	ⁿⁿ7 4 2 0⁷
ⁿⁿ7440	-	ⁿⁿ7450⁷
ⁿⁿ7470	-	ⁿⁿ7 4 8 0 ⁷
ⁿⁿ7500	-	ⁿⁿ7510^;
ⁿⁿ7530	%	ⁿⁿ7 540 ⁷
ⁿⁿ7560	-	ⁿⁿ7570^;
ⁿⁿ7590	-	ⁿⁿ76,00'
ⁿⁿ7620		ⁿⁿ7630^;
ⁿⁿ7650	-	ⁿⁿ7660^;
ⁿⁿ7680	-	ⁿⁿ7690^;
ⁿⁿ7710	-	ⁿⁿ7720'
ⁿⁿ7740	-	ⁿⁿ7 750 ^?
nn₇77o	-	ηη₇₇θο;

ⁿⁿ6730	—	ⁿⁿ6 74 0
ⁿⁿ6760		ⁿⁿ6770
ⁿⁿ6790		ⁿⁿ6800
ⁿⁿ6820	—	ⁿⁿ6830
ⁿⁿ6850		ⁿⁿ6860
ⁿⁿ6880	—	ⁿⁿ6890
ⁿⁿ6910	—	ⁿⁿ6920
ⁿⁿ6940	-	ⁿⁿ6950
ⁿⁿ6970	—	ⁿⁿ6980
ⁿⁿ7000		ⁿⁿ7010
ⁿⁿ7030	—	ⁿⁿ7040
ⁿⁿ7060	—	ⁿⁿ7070
ⁿⁿ7030	—	ⁿⁿ7100
ⁿⁿ712 0	-	ⁿⁿ7130
ⁿⁿ7150		ⁿⁿ7160
ⁿⁿ7180	—	ⁿⁿ7190
ⁿⁿ7210	—	ⁿⁿ7220
ⁿⁿ7240	—	ⁿⁿ7250
ⁿⁿ7 2 7 0	—	ⁿⁿ7280
ⁿⁿ7300	—	ⁿⁿ7310
ⁿⁿ7330		ⁿⁿ7340
ⁿⁿ7360	—	ⁿⁿ7370
ⁿⁿ7390	-	ⁿⁿ7400
ⁿⁿ7420		ⁿⁿ7430
ⁿⁿ7450	-	ⁿⁿ7460
ⁿⁿ7480	—	ⁿⁿ7490
ⁿⁿ7510		ⁿⁿ7520
ⁿⁿ7540	—	ⁿⁿ7550
ⁿⁿ7570	-	ⁿⁿ7580
ⁿⁿ7 6 00	-	ⁿⁿ7610
ⁿⁿ7630	-	ⁿⁿ7640
ⁿⁿ7660	—	ⁿⁿ7670
ⁿⁿ7690	-	ⁿⁿ7700
ⁿⁿ7 7 2 0		ⁿⁿ7730
ⁿⁿ7 7 50		ⁿⁿ7760
nn₇₇₈o	-	nn₇₇₉o

^ηη7790	-	^ηη7800'	^ηη7800	*	^ηη7 810^;	^ηη7 810	··	^ηη7820^;
^ηη7820	-	^ηη7 8 3 0⁷	^ηη7830	-	^ηη7840^;	^ηη7840		^ηη7850^;
^ηη7 850	-	^ηη7860'	^ηη7 860	—	^ηη7 8 7 0⁷	^ηη7870		^ηη7 880⁷
^ηη7880	-	^ηη7 890⁷	^ηη7890	-	^ηη7900^;	^ηη7900		^ηη7 910⁷
^ηη791Ο	-	^ηη7920'	^ηη7920	-	^ηη793Ο⁷	^ηη7930		^ηη7940^?
^ηη7940	-	^ηη7950^?	^ηη7950	*	^ηη7960⁷	^ηη7960		^ηη7 970⁷
^ηη7970	-	^ηη7 980⁷	^ηη7 9 80	··	^ηη799Ό^;	^ηη7990		^ηη8000'
^ηη8000	-	^ηη8010'	^ηη8010	-	^ηη8020'	^ηη8020		^ηη8030⁷
^ηη8030	-	^ηη8040'	^ηη8040		^ηη8050⁷	^ηη8050		^ηη8060'
^ηη8060	-	^ηη8070'	^ηη8070	—	^ηη8080⁷	^ηη8080	*	^ηη8090'
^ηη8090	-	^ηη8100'	^ηη8100		^ηη8110⁷	^ηη8110	“·	^ηη8ΐ20⁷
^ηη8120	-	^ηη8130⁷	^ηη8130	—-	^ηη814Ο⁷	^ηη8140	•	^ηη8150'
^ηη8150	-	^ηη8160⁷	^ηη8160	—	^ηη817 0⁷	^ηη8170		^ηη8180⁷
^ηη8180	-	^ηη8190⁷	^ηη8190	—	^ηη8200 ⁷	^ηη8200		^ηη8210'
^ηη8210	-	^ηη8220^?	^ηη8220	—	^ηη8230^;	^ηη8230	·	^ηη8240^;
^ηη8240	-	^ΠΓΪ8250^;	^ηη8250	—	^ηη8260'	^ηη8260		^ηη8270⁷
^ηη8270	-	^ηη8280'	^ηη8280	—	^ηη8290^;	^ηη8290		^ηη8300'
^ηη8300	-	^πη8310^;	^ηη8310	—	^ηη8320'	^ηη8350	•	^ηη8330'
^ηη8330	-	^ηη8340⁷	^ηη8340		^ηη8350'	^ηη8350	**	^ηη8360'
^ηη8360	-	^ηη8370'	^ηη8370	—	^ηη8380^;	^ηη8380		^ηη8390⁷
^ηη8390	-	^ηη84 00⁷	^ηη8400	—	^ηη8410⁷	^ηη8410		^ηη8420⁷
^ηη8420	-	^ηη8430^;	^ηη8430	—	^ηη8440^;	^ηη8440		^ηη8450⁷
^ηη8450	-	^ηη8460^;	^ηη8460	—	^ηη8470^;	^ηη8470	*·	^ηη8480⁷
^ηη8480	-	^ηη8490^;	^ηη84 90	—	^ηη8500'	^ηη8500		^ηη8510⁷
^ηη8510	-	^ηη8520’	^ηη8520	^—	^ηη8530^?	^ηη8530		^ηη8540⁷
^ηπ8540	-	^ηη8550^?	^ηη8550	—	^ηη8560'	^ηη8 56 0		^ηη8570^;
^ηη8570	-	^ηη8580^;	^ηη8580	—	^ηη8590'	^ηη8590	··	^ηη8600^;
^ηη8600	-	^ηη8610⁷	^ηη8610	·*	^ηη8620^;	^ηη8620	*	^ηη8630'
^ηη8630	-	^ηη8640^;	^ηη8640	—	^ηη86 50 ⁷	^ηη8650		^ηη8660⁷
^ηη8660	-	^ηη8670'	^ηη8670	—	^ηηΩς₈₀ ^;	^ηη8680	“	^ηη8690⁷
^ηη8690	-	^ηη8700 ⁷	^ηη8700	—	^ηη8710^;	^ηπ8710		^ηη87 2 0⁷
^ηη8720	-	^ηη87 30 ⁷	^ηη8730		^ηη8 7 4 0'	^ηη8 7 4 0		^ηη8750'
^πη8750	-	^ηη8760^;	^ηη8760	-	^ηη8 7 7 0'	^ηη8 7 7 0		^πη8780^?
^ηη8780	-	^ηη8 7 9 0 ⁷	^ηη8 7 9 0	-	^ηη8800 ⁷	^ηη8800		^ηη881Ο^;
^ηη8810	-	^ηη8820'	^ηη8820	—	^ηη8830'	^ηη8830		^ηη8840⁷
^ηη8840	-	nng850?	^ηη8850	-	nngggo;	^ηη8860	*	^ηη8870'

ⁿⁿ8870	ⁿⁿ8880^?
ⁿⁿ8900	“ ⁿⁿ8910^;
ⁿⁿ8930	“ ⁿⁿ8940^;
ⁿⁿ8960	- nn_gg70;
ⁿⁿ8990	- ⁿⁿ9QQ0^;
ⁿⁿ9020	~ ⁿⁿ9030'
ⁿⁿ9050	ⁿⁿ9060’

ⁿⁿ8880	’ ⁿⁿ8890^;
ⁿⁿ8910	’ ⁿⁿ8920^;
ⁿⁿ8940	ⁿⁿ8950^?
ⁿⁿ8970	~ ⁿⁿ8980^;
ⁿⁿ9000	- ⁿⁿ9₀₁₀ ^;
ⁿⁿ9030	- ⁿⁿ9Q40^;

ⁿⁿ8890	” ⁿⁿ8900^?
ⁿⁿ8920	ⁿⁿ8930^;
ⁿⁿ8950	” ⁿⁿ8960^;
ⁿⁿ8980	ⁿⁿ8990^;
ⁿⁿ9010	~ ⁿⁿ9020^?
ⁿⁿ9040	ⁿⁿ9050^;

No entanto, o oligómero não necessita de consistir apenas na sequência que é complementar da sequência alvo do HCV. Pode ainda conter sequências nucleotidicas ou outros meios adequadas às finalidades para as quais os oligómeros são utilizados. Por exemplo, se os oligómeros sào utilizados como primers para a amplificação das sequências de HCV através do PCR, podem conter sequências que, quando em duplexes, formam sites para enzimas de restrição que facilitam a clonagem das sequências amplificadas. Por exemplo, também, se os oligómeros são para usar como sondas de captura em ensaios de hibridação (descritos abaixo), conteriam também um parceiro de ligação que está acoplado ao oligómero contendo a sequência nucleotidica que é complementar da sequência alvo do HCV. Outros tipos de meios ou sequências úteis, das quais os oligómeros podem ser constituídas ou aos quais podem estar acopladas, são aquelas que são conhecidas pelos especialistas no ramo e que são apropriadas para uma variedade de propósitos, incluindo a marcação de sondas de nucleótidos.

A preparação dos oligómeros faz-se por meios conhecidos

c dos especialistas, incluindo, por exemplo, métodos que utilizam a excisão, transcrição, ou sintese quimica. As sequências alvo e/ou regiões do genoma que são seleccionadas, das quais os polinucleótidos do oligómero dirigidos contra a região alvo são complementares, dependem da finalidade. Por exemplo, se o objectivo é detectar a presença do HCV em amostras biológicas (e.g. sangue), os oligómeros preferidos seriam utilizados como sondas e/ou primers, e hibridariam com regiões conservadas do genoma de HCV. Algumas das regiões conservadas do genoma do HCV, às quais o oligómero se pode ligar, são descritas no presente texto, por exemplo, as regiões que incluem nucleótidos numerados a partir da extremidade 5'-terminal até cerca de 200, ou desde cerca de 4000 até cerca de 5000, ou cerca de 8000 até 9040, como se mostra na fig. 18, ou preferencialmente nucleótidos do -318 até 174, 4056 até 4448, e 4378 até 4902. Outras regiões do genoma, que estão conservadas, são rapidamente conhecidas por comparação da sequência de nucleótidos de vários isolados de HCV, incluindo o protótipo do HCV, HCV1. Métodos para estabelecer comparações entre os genótipos para determinar regiões conservadas e não conservadas, são conhecidos dos especialistas no ramo, e exemplos destes métodos são revelados no presente texto.

No ensaio básico da hibridaçâo dos ácidos nucleicos, cadeias simples de ácidos nucleicos de análise (DNA ou RNA) são hibridadas com um ácido nucleico sonda, e os duplexes resultantes são detectados. As sondas para os polinucleótidos de HCV (naturais ou derivados) têm um comprimento que permite a detecção de sequências virais únicas, por hibridaçâo. Enquanto 6-8 nucleótidos podem constituir um comprimento com que se pode trabalhar fácilmente, sequências de 10-12 nucleótidos são preferidas, e cerca de 20 nucleótidos ou mais de comprimento, são óptimos. Preferencialmente, estas sequências derivam de regiões onde a heterogeneidade está ausente. Estas sondas podem ser preparadas utilizando métodos de rotina, incluindo métodos automatizados de síntese de oligonucleótidos. Entre as sondas úteis , por exemplo, encontram-se as que são derivadas dos clones recentemente isolados, reveladas no presente texto, assim como os vários oligómeros úteis na sondagem de patrimónios de cDNA, apresentadas abaixo. Um complemento de qualquer porção única do genoma de HCV será satisfatório. Para utilizar como sondas, é desejável uma complementaridade completa, embora possa ser desnecessária conforme aumenta o comprimento do fragmento.

Para utilização destas sondas como agentes para detecção da presença de polinucleótidos de HCV (por exemplo no despiste de sangue contaminado), a amostra biológica a analizar, assim como o sangue ou o soro, pode ser tratada, se tal for desejado, para extrair os ácidos nucleicos nela contidos. O ácido nucleico resultante da amostra pode ser sujeito a uma electroforese em gel ou a outras técnicas de separação baseadas no tamanho da molécula; alternativamente, a amostra de ácido nucleico pode ser submetida a uma técnica de transferência sem separação por tamanho. Com vista à formação de duplexes híbridos com a sequência da sonda dirigida contra , a região alvo do ácido nucleico para análise tem que estar na forma de cadeia simples. Se a sequência está naturalmente presente na forma de cadeia simples, é desnecessária a desnaturação. No entanto se a

sequência está presente na forma de dupla cadeia, terá de ser desnaturada. A desnaturação pode ser levada a cabo por várias técnicas conhecidas dos especialistas nestes assuntos. Subsequentemente à desnaturação o ácido nucleico de análise e a sonda são incubados sob condições que promovem a formação de hibridos estáveis da sequência dirigida região alvo, na sonda, com a suposta sequência alvo na cadeia de análise, e os duplexes resultantes contendo a(s) sonda(s) são detectados.

A detecçâo do duplex resultante, se houver algum, é usualmente conseguida pela utilização de sondas marcadas; alternativamente, a sonda pode ser não marcada, mas pode ser detectável por ligação especifica com um ligando marcado, directa ou indirectamente. Marcadores adequados e métodos para marcação de sondas e ligandos são conhecidos pelos especialistas nestas técnicas e incluem, por exemplo, marcadores radioactivos, que podem ser incorporados por métodos conhecidos (e.g· corte e translacção ou tratamento com quinases), biotina, grupos fluorescentes, grupos quemiluminescentes (e.g., dioxetanos, particularmente dioxetanos activados), enzimas, anticorpos, e outros semelhantes.

A região das sondas que são utilizadas para se ligarem à cadeia de análise, podem ser feitas completamente complementares ao genoma do HCV. Assim, geralmente são desejáveis condições que conduzem a uma elevada especificidade de emparelhamento para evitar os falsos positivos. Contudo, condições de elevada especificidade de emparelhamento, devem apenas utilizar-se se as sondas são complementares a regiões do genoma virai onde não existe heterogeneidade. A severidade do

emparelhamento na hibridação é determinada por um certo número de factores durante a hibridação e durante o processo de lavagem, incluindo a temperatura, força iónica, intervalo de tempo e concentração de formamida. Estes factores são referidos em linhas gerais em, por exemplo, Maniatis, T.(1982).

Variações deste esquema básico, que são conhecidas dos especialistas nestas técnicas, incluindo aquelas que facilitam a separação dos duplexes a detectar a partir de materiais estranhos e/ou que amplificam o sinal da metade marcada, podem também ser utilizados. Um certo número destas variações são revistas em, por exemplo: Mathews e Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169:1; Landergren et al. (1988), Science 242:229; e Mittlin (1989), Clinicai Chem. 35:1819. Estas e as seguintes publicações descrevendo os procedimentos de ensaios são assim incorporadas no presente texto, por referência. Sondas adequadas à detecção do HCV nestes ensaios são constituídas por sequências que sofrem hibridação com sequências nucleotidicas alvo de HCV, para formar duplexes com a cadeia de análise, em que os duplexes são de estabilidade suficiente para a detecção pelo sistema de ensaio especificado.

Uma variação adequada é, por exemplo, a que está descrita na Patente Norte Americana No. 4.868.105, emitida a 9 de Setembro de 1989, e na Publicação E.P.O. No 225.807 (publicada a 16 de Junho, 1987). Estas publicações descrevem um ensaio de hibridação do ácido nucleico em fase de solução, no qual o ácido nucleico de análise é hibridado com um conjunto de sondas de marcação e um conjunto de sondas de captura. Este complexo sondacadeia de análise, é acoplado por hibridação com uma sonda de

captura fixa a uma estrutura sólida, que é complementar ao conjunto das sondas de captura. Isto permite ao ácido nucleico de análise ser removido da solução como um complexo em fase sólida. Tendo a cadeia de análise na forma de um complexo na fase sólida, facilitam-se os subsequentes passos de separação do ensaio. 0 conjunto das sondas de marcação é complementar de uma sonda marcada que está ligada por hibridação ao complexo fase sólida/cadeia de análise.

Geralmente espera-se que as sequências do genoma de HCV estejam presentes em niveis relativamente baixos, no soro de 2 3 indivíduos infectados, i.e., a aproximadamente 10 -10 doses infecciosas de chimpanzé (CID) por ml. Este nível pode requerer a utilização de técnicas de amplificação em ensaios de hibridação. Estas técnicas são conhecidas dos peritos que trabalham neste campo. Por exemplo, o sistema Bio-Bridge da Enzo Biochemical Corporation utiliza uma desoxinucleótido transferase terminal para acrescentar caudas-3'-poli-dT não modificadas a uma sonda de DNA. A sonda a que foi acrescentada a cauda de poli-dT é hibridada à sequência nucleotidica alvo, e depois a uma poli-A biotina modificada. A Publicação PCT 84/03520 e Publicação EP No.124.221 descrevem um ensaio de hibridação do DNA no qual: (1) a cadeia de análise é emparelhada com uma sonda de DNA em cadeia simples que é complementar de um oligonucleótido marcado com uma enzima; e (2) o duplex com cauda resultante é hibridado com um oligonucleótido marcado com uma enzima. A EPA 204.510 descreve um ensaio de hibridação do DNA, no qual a cadeia de DNA de análise contacta com uma sonda que possui uma cauda, como a cauda de poli-dT, uma cadeia amplificadora que possui uma sequência que se hibrida com a cauda da sonda, como a sequência poli-A e que é capaz de se ligar a uma pluralidade de cadeias marcadas. Um tipo de ensaio de hibridação que é descrito na Publicação E.P.O. No. 317.077 (publicada em 24 de Maio, 1989), que deve detectar sequências a um nivel de aproximadamente 10 /ml, utiliza multimeros de ácidos nucleicos, que se ligam a ácidos nucleicos de análise em cadeia simples, e que também se ligam a uma multiplicidade de oligonucleótidos marcados de cadeia simples. Uma técnica particularmente desejável pode envolver a amplificação das sequências alvo de HCV no soro, aproximadamente 10.000 vezes (i.e., até aproximadamente 10 sequências/ml), como parte do sistema de hibridação. A amplificação pode ser levada a cabo, por exemplo, pela reacção em cadeia da polimerase (PCR), técnica descrita por Saiki et al. (1986), por Mullis, Patente Norte Americana No. 4.683.195, e por Mullis et al. Patente Norte Americana No. 4.683.202. A amplificação pode anteceder ou, preferencialmente, ser subsequente à purificação da sequência de HCV alvo. Por exemplo, a amplificação pode ser utilizada em conjunto com os métodos de ensaio descritos na Patente Norte Americana No. 4.868.105, ou, se se desejar efectuar mais amplificações, em conjunto com o sistema de hibridação descrito na Publicação E.P.O. No. 317.077.

Métodos preferíveis para detecção das sequências de HCV, numa cadeia de polinucleótidos de análise, são baseados nos métodos de detecção de hibridação descritos na Patente Norte Americana No. 4.868.105, e na Publicação E.P.O. No. 317.077. Estes métodos são ensaios de hibridação de sandwich em fase de solução, que utilizam tanto sondas de captura como de marcação, que se hibridam com sequências alvo num ácido nucleico de análise. Na utilização destes ensaios para detecção do HCV em amostras biológicas, as sondas usadas ligar-se-iam às regiões conservadas do genoma de HCV. As sondas de captura e marcação podem ser intercaladas na sua ligação à sequência alvo. Alternativamente, de modo preferível, as sondas de captura e marcação encontram-se em conjuntos, e as sondas de um conjunto não se intercalam com as sondas de outro conjunto. Neste último processo, o(s) conjunto(s) de múltiplas sondas de captura, hibridam-se preferencialmente com as regiões mais conservadas do genoma, enquanto o(s) conjunto(s) de múltiplas sondas de marcação podem hibridar-se com regiões que exibem pequenas divergências. Por exemplo, usando o protótipo da sequência do cDNA do HCV1, apresentado na Fig.18, podem ser usadas sondas que se hibridam com sequências na região de nucleótidos desde cerca de -318 até cerca de 174, e/ou nucleótidos da região de cerca de 4.378 até cerca de 4.902, e/ou nucleótidos da região desde cerca de 4.056 até cerca de 4.448. As sondas preferidas hibridar-se-iam com sequências na região 5' do genoma de HCV, uma vez que, como se mostra abaixo, esta região parece ser altamente conservada. Assim, sondas preferidas podem hibridar-se com, por exemplo, nucleótidos desde cerca de -318 até cerca de 174 como se mostra na Fig.18. Podem usar-se sondas que se hibridam com a cadeia positiva nas regiões conservadas, e/ou o seu complemento, dependendo da finalidade, por exemplo, para detectar sequências genómicas virais, ou para detectar sequências de cDNA do HCV resultantes da amplificação pelo PCR, ou para detectar intermediários replicativos da cadeia positiva do RNA do HCV.

DETECÇÃO do RNA do HCV e POLINUCLEÓTIDOS DERIVADOS DELE

USANDO O MÉTODO do cFCR/HCV

Um método particularmente útil para detectar o RNA do HCV, ou polinucleótidos derivados do RNA do HCV, é o método do cPCR/HCV, que é um objecto do presente Pedido e que utiliza a técnica da reacção em cadeia da polimerase (PCR) descrita por Saiki et al. (1986), por Mullis na Patente Norte Americana No. 4.683.195 e por Mullis et al. na Patente Norte Americana No. 4.683.202. O método cPCR/HCV utiliza primers e sondas derivadas da informação fornecida no presente texto no que respeita à natureza do genoma de HCV.

Geralmente, na técnica do PCR, são preparados pequenos primers de oligonucleótidos, que correspondem a extremos opostos de uma sequência desejada. A sequência entre os primers não precisa ser conhecida. Uma amostra de polinucleótidos é extraida e desnaturada, preferencialmente pelo calor, e hibridada com primers de oligonucleótidos que estão presentes em excesso molar. A polimerização é catalizada por uma polimerase dependente de um molde e de um primer, na presença de desoxinucleótidos trifosfato ou nucleótidos análogos (dNTPs). Isto resulta em dois produtos longos, que contêm os primers respectivos nas extremidades 5’, ligados covalentemente aos complementos recentemente sintetizados das cadeias originais. O DNA replicado é de novo desnaturado, hibridado com primers de oligonucleótidos, reconduzido a condições de polimerização, sendo iniciado um segundo ciclo de replicação. 0 segundo ciclo fornece as duas cadeias originais, os dois produtos longos do ciclo 1, e dois produtos curtos replicados dos produtos longos. Os produtos curtos contêm sequências de sentido ou anti-sentido, derivadas da sequência alvo, possuindo como flancos, nas extremidades 5' e 3', sequências de primers. Em cada ciclo adicional, o número de produtos curtos é replicado expontaneamente. Assim, este processo provoca a amplificação de uma sequência alvo especifica.

Neste método é fornecida uma amostra suspeita de conter RNA do HCV, ou um seu fragmento. A amostra é geralmente obtida a partir de um indivíduo que se suspeita conter NANBH; no entanto, outras fontes de amostra são incluídas, e.g., meios condicionados ou células provenientes de sistemas in vitro no qual o virus sofreu replicação. A amostra, no entanto, tem que conter, no ácido nucleico, a(s) sequência(s) alvo.

A amostra é então sujeita a condições que permitem a transcrição reversa do RNA do HCV em cDNA do HCV. As condições para a transcrição reversa do RNA são conhecidas dos peritos nestas técnicas e são descritas, por exemplo, em Maniatis et al. (1982) e em Methods in Enzymology. Um método preferível de transcrição reversa utiliza a transcriptase reversa de uma variedade de fontes, incluindo moléculas recombinantes e isoladas de, por exemplo, um retrovirus, preferencialmente o virus da mieloblastose das aves (AMV), e condições apropriadas à transcrição. 0 cDNA do HCV, produto de transcrição reversa, está sob a forma de um hibrido RNA:DNA que resulta do primeiro ciclo de transcrição reversa; subsequentemente, os híbridos DNA:DNA resultam de dois ou mais ciclos de transcrição.

cDNA do HCV resultante da transcrição reversa é então sujeito ao PCR, para amplificação da sequência alvo. Com vista a atingir esta finalidade, o cDNA do HCV é desnaturado e as cadeias separadas são hibridadas com primers, que se dispõem nos flancos da região alvo.

A separação das cadeias pode ser conseguida através de qualquer método de desnaturação apropriado, incluindo meios físicos, quimicos ou enzimáticos, que são conhecidos dos peritos nestas técnicas. Um método físico preferível envolve o aquecimento dos ácidos nucleicos, até estarem completamente desnaturados (>99%). A temperatura tipica de desnaturação envolve temperaturas que vão desde cerca de 80°C até cerca de 105°C, durante intervalos de tempo que vão desde 1 a 10 min..

Após a hibridação do cDNA do HCV com os primers, as sequências alvo de HCV são replicadas por processos de polimerização que incluem um primer de oligonucleótidos, para iniciar a sintese da cadeia de replicação. Os primers são seleccionados de modo a serem complementares a sequências do genoma do HCV. Primers oligoméricos complementares a regiões de cadeias de sentido e anti-sentido do cDNA do HCV podem ser estabelecidos a partir das sequências de cDNA do HCV da sequência composta do cDNA, fornecida na Fig.18.

Os primers são seleccionados de modo que as suas posições relativas, ao longo de uma sequência de duplexes, sejam tais que um produto extenso, sintetizado a partir de um primer, quando ê separado do seu molde (complemento), serve de molde para a extensão do outro primer, fornecendo-se uma cadeia de replicação de comprimento definido.

primer é preferencialmente de cadeia simples para que haja uma eficiência máxima na amplificação, mas pode, alternativamente, ser de dupla cadeia. Se fôr de dupla cadeia, o primer tem que ser primeiro tratado, para separar as suas cadeias antes de ser usado para preparar produtos de extensão. Preferencialmente, o primer é um oligodesoxiribonucleótido. 0 primer deve ser suficientemente comprido para iniciar a sintese de produtos de extensão na presença do agente de polimerização. Os comprimentos exactos dos primers vão depender de muitos factores, incluindo temperatura, fonte do primer e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência alvo, o primer oligonucleotidico contém, tipicamente, cerca de 15-45 nucleótidos, embora possa conter mais ou menos nucleótidos. Pequenas moléculas de primers, geralmente, requerem temperaturas mais baixas para formar complexos híbridos, suficientemente estáveis com o molde.

Os primers utilizados neste trabalho são seleccionados para ser substancialmente complementares às diferentes cadeias de cada sequência especifica a ser amplificada. Assim , os primers não necessitam de reflectir a sequência exacta do molde, mas têm que ser suficientemente complementares, para hibridarem, selectivamente, com as suas respectivas cadeias. Por exemplo, um fragmento nucleotidico, não complementar, pode ser ligado à extremidade 5' do primer, com o resto da sequência do primer sendo complementar à cadeia. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais longas podem ser intercaladas no primer, desde que o primer tenha complementaridade suficiente com a sequência de uma das cadeias a amplificar, para se hibridar com ela e assim formar uma estrutura em duplex, que pode ser aumentada em extensão por meio

Vi

da polimerizaçâo. As sequências nucleotidicas não complementares dos primers podem incluir sites para enzimas de restrição. Juntar um site para a enzima de restrição à(s) extremidade(s) da sequência alvo, seria particularmente útil para a clonagem da sequência alvo.

Será compreendido que primer, como é usado no presente texto, pode referir-se a mais do que umprimer, particularmente no caso em que existe alguma ambiguidade na informação que respeita à(s) sequencia(s) terminal da região alvo a amplificar. Por este motivo, um primer inclui uma colecção de primers oligonucleotidicos, contendo sequências representando as possíveis variações na sequência, ou inclui nucleótidos que permitem uma tipica formação de pares de bases. Um dos oligonucleótidos do primer nesta colecção será homólogo com a extremidade da sequência alvo. Um caso especifico é apresentado nos Exemplos, nos quais os conjuntos de oligómeros de 44-mers e 45-mers foram utilizados para iniciar a amplificação de uma região potencialmente variável do genoma do HCV.

Prevê-se que haverá uma variedade de cadeias ou isolados de HCV, com sequências que se desviam das do HCV1, a estirpe protótipo. Assim, com vista à detecção de estirpes variantes, é preferível construir primers que se hibridam com regiões conservadas do genoma do HCV. As regiões conservadas podem ser determinadas, comparando as sequências de nucleótidos ou aminoácidos de várias estirpes/isolados de HCV. Parece haver, pelo menos, três regiões de aminoácidos conservados no genoma do HCV, descritas acima, das quais podem derivar os primers. Acredita-se que estas regiões existem. Os primers descritos abaixo, nos Exemplos, são derivados do que se crê serem regiões conservadas do HCV, baseados na homologia de sequências, com os das Flaviviroses.

Os primers oligonucleotidicos podem preparar-se por qualquer método apropriado. Métodos para preparação de oligonucleótidos, de sequência especifica, são conhecidos dos peritos nestas técnicas e incluem, por exemplo, clonagem e restrição das sequências apropriadas e sintese quimica directa. Métodos de sintese quimica podem incluir, por exemplo, o método do fosfotriéster, descrito por Narang et al. (1979), o método do fosfodiéster, revelado por Brown et al. (1979), o método do dietilfosforamidato, revelado em Beaucage et al. (1981) e o método do suporte sólido, na Patente Norte Americana No.

4.458.066.

Os primers podem ser marcados, se tal fôr desejado, por meio de incorporações, detectáveis por métodos espectroscópicos, fotoquimicos, bioquímicos, imunoquimicos ou químicos.

Extensões de primers oligonucleotidicos, dependentes de moldes, são catalizadas por um agente polimerizador, na presença de quantidades adequadas dos quatro desoxiribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), ou análogos, num meio reaccional que é constituído pelos sais, catiões metálicos e sistema tampão de pH apropriados. Agentes polimerizadores adequados são enzimas, que se sabe catalizarem a sintese do DNA, dependente do primer e do molde. Polimerases conhecidas do DNA incluem, por exemplo, a DNA polimerase I da E. coli ou o seu fragmento Klenow, a T4 DNA polimerase e a Taq DNA

polimerase. As condições de reacção para catalizar a síntese do DNA com estas DNA polimerases são conhecidas dos peritos nestas técnicas.

Os produtos da sintese são moléculas em duplex, consistindo nas cadeias molde e nas cadeias de extensão do primer, que incluem a sequência alvo. Estes produtos, por outro lado, servem de molde para um novo ciclo de replicações. No segundo ciclo de replicações, a cadeia de extensão do primer do primeiro ciclo é emparelhada com o seu primer complementar; a sintese dá origem à formação de um produto curto, gue é ligado em ambas as extremidades 5' e 3' por sequências de primers ou seus complementos. Ciclos repetitivos de desnaturação, emparelhamento do primer e extensão resultam na acumulação exponencial da região alvo, definida pelos primers. São efectuados ciclos suficientes para atingir a quantidade desejada de polinucleótidos, contendo a região alvo do ácido nucleico. A quantidade desejada pode variar e é determinada pela função à qual se destina o produto polinucleotidico.

método do PCR pode ser realizado num certo número de sequências temporais. Pode, por exemplo, ser realizado passo a passo onde, após cada passo, novos reagentes são adicionados, ou de um modo em que todos os reagentes são adicionados simultaneamente, ou ainda de um modo de passo a passo parcial, onde reagentes frescos são adicionados, após um certo número de passos.

Num método preferido, a reacção do PCR é levada a cabo como um processo automatizado que utiliza uma enzima termoestável. Neste processo, a mistura de reacção é conduzida

através de uma zona de desnaturação, uma zona de emparelhamento do primer e uma zona de reacção. Pode ser empregue um aparelho que é especificamente adaptado para utilização de uma enzima termoestável, que utiliza temperaturas cíclicas, na ausência de um sistema liquido, uma vez que a enzima não necessita de ser adicionada em todos os ciclos. Este tipo de aparelho é comercializado pela Perkin Elmer Cetus Corp..

Após amplificação pelo PCR, os polinucleótidos alvo são detectados por hibridaçâo com uma sonda polinucleotidica, que forma um hibrido estável com a sequência alvo, sob condições de muito elevada especificidade, a condições de moderada especificidade de hibridaçâo e lavagem. Se se espera que as sondas sejam completamente complementares (i.e., cerca de 90% ou mais) à sequência alvo, serão usadas condições de elevada especificidade de hibridaçâo. Se se espera alguma falta de complementaridade, por exemplo, se são esperadas estirpes variantes, tendo como resultado o facto de a sonda não ser completamente complementar, a especificidade de hibridaçâo pode diminuir. No entanto, são escolhidas condições que excluem ligações não especificas/acidentais. Condições que afectam a hibridaçâo e que são selectivas contra ligações não especificas são conhecidas dos peritos neste assunto e são descritas em , por exemplo, Maniatis et al. (1982). Geralmente, concentrações salinas mais baixas e temperaturas mais elevadas, aumentam a especificidade das ligações no emparelhamento. Por exemplo, é usualmente considerado que condições especificas de emparelhamento, são a incubação em soluções que contêm, aproximadamente, 0,1 x SSC, 0,1% SDS, temperatura de incubação/lavagem a cerca de 65°C, e condições moderadamente especificas de emparelhamento são a incubação em soluções que contêm aproximadamente 1-2 x SSC, 0,1% SDS e temperatura de incubação/lavagem de cerca de 50°C-65°C. Condições de baixa especificidade de emparelhamento são 2 x SSC e cerca de 30-50°C.

Sondas para sequências alvo de HCV podem ser derivadas da sequência do cDNA do HCV, presente na Fig.18, ou de novos isolados de HCV. As sondas de HCV podem ser de qualquer comprimento adequado, que vá de um extremo ao outro da região alvo, mas que exclua os primers e que permita uma hibridação especifica com a região alvo. Se deve existir complementaridade completa, i.e., se a estirpe contém uma sequência idêntica à da sonda, uma vez que o duplex vai ser relativamente estável, mesmo sob condições de elevada especificidade de emparelhamento, as sondas podem ser curtas, i.e., de um comprimento de cerca de 1030 pares de bases. Se se espera algum grau de falta de complementaridade com a sonda, i.e., se se suspeita que a sonda vai hibridar com uma região variável, esta pode ser de comprimento maior, uma vez que o contrabalançar alguns dos efeitos comprimento parece da falta de complementaridade(s). Um exemplo disto é encontrado nos Exemplos, em que a sonda foi concebida para se ligar a potenciais variantes do HCV1. Neste caso, os primers foram concebidos para se ligarem ao cDNA do HCV, derivado de uma região conservada hipotética do genoma de HCV, e a região alvo era potencialmente possuidora de variações (baseada no modelo dos Flavivirus). A sonda usada para detectar as sequências alvo do HCV continha, aproximadamente, 268 pares de bases.

s

ácido nucleico sonda, contendo uma sequência complementar à sequência alvo, pode ser sintetizado usando técnicas similares às descritas acima, usadas para a sintese de sequências de primers. Se for desejável, a sonda pode ser marcada. Marcadores apropriados são descritos acima.

Em alguns casos, pode ser desejável determinar o comprimento do produto do PCR detectado pela sonda. Isto pode ser particularmente desejado se se suspeitar que estirpes de HCV variantes podem conter delecções dentro da região alvo ou, se se desejar, para confirmar o comprimento do produto do PCR. Nestes casos, é preferível submeter os produtos a uma análise de tamanho, assim como hibridaçâo com a sonda. Métodos’ para determinar o tamanho dos ácidos nucleicos são conhecidos dos peritos nestas técnicas e incluem, por exemplo, electroforese em gel, gradientes de sedimentação e cromatografia de exclusão em gel.

A presença da sequência alvo numa amostra biológica é detectada através da presença de híbridos formados entre a sonda polinucleotidica do HCV e o ácido nucleico sujeito à amplificação pela técnica do PCR. Métodos para detectar híbridos formados entre a sonda e a sequência de ácidos nucleicos, são conhecidos pelos peritos nestas técnicas. Por exemplo, por conveniência, uma amostra não marcada pode ser transferida para uma matriz sólida, à qual se liga, e a amostra ligada, sujeita a condições que permitem hibridações especificas com uma sonda marcada; a matriz sólida é então examinada, pesquisando-se a presença da sonda marcada. Alternativamente, se a amostra é marcada, a sonda não marcada é ligada à matriz e, após exposição às condições apropriadas de hibridação, a matriz é examinada, pesquisando-se a presença do marcador. Outros ensaios de hibridação adequados estão descritos acima.

DETERMINAÇÃO de SEQUÊNCIAS VARIANTES de HCV, UTILIZANDO o PCR

Com vista à identificação de estirpes variantes de HCV e assim estabelecer sondas para estas variantes, o método do cPCR/HCV, descrito acima, é utilizado para amplificar regiões variantes do genoma do HCV, de modo que as sequências de nucleótidos destas regiões alvo variantes possam ser determinadas. Geralmente, pode-se esperar que ocorram tipos variantes de HCV, em localizações geográficas diferentes daquelas nas quais a estirpe do HCV1 é predominante, por exemplo, Japão, África etc; ou em diferentes espécies de vertebrados, que também são infectados pelo virus. Variantes de HCV podem também surgir, durante passagens em sistemas de culturas de tecidos, ou ser o resultado de mutações espontâneas ou induzidas.

Com vista à amplificação da região alvo variante, são estabelecidos primers que se dispõem nos flancos da região suspeita e, preferencialmente, são complementares a regiões conservadas. Primers para duas regiões do HCV, que são provávelmente conservadas, baseadas num modelo do Flavivirus, são descritas nos Exemplos. Estes primers e sondas podem ser estabelecidos, utilizando a informação da sequência para a estirpe do HCVl fornecida na Fig. 18.

Análises da sequência nucleotidica da região alvo podem efectuar-se por análise directa dos produtos amplificados pelo

PCR. Um processo para análise directa da sequência dos produtos amplificados pelo PCR é descrita no Saiki et al. (1988).

Alternativamente, a(s) sequência(s) alvo amplificada(s) podem ser clonadas antes da análise da sequência. Um método para a clonagem directa e análise das sequências de segmentos genómicos, amplificados enzimaticamente, tem sido descrito por Scharf (1986). Neste método, os primers utilizados na técnica do PCR são modificados perto da sua extremidade 5', para produzir sites de restrição, convenientes para a clonagem directa, por exemplo, num vector sequencial M13. Após a amplificação, os produtos do PCR são clivados com as enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos da restrição são ligados ao vector M13 e transformados em, por exemplo, um hospedeiro JM 103, revestido exteriormente por uma fina camada de um metal, e nas placas resultantes faz-se uma pesquisa por hibridação com uma sonda oligonucleotidica marcada. Outros métodos para clonagem e análise de sequências são conhecidos dos especialistas nestas técnicas.

PRIMERS UNIVERSAIS PARA FLAVIVIRQSES e PARA O HCV

Estudos da natureza do genoma do HCV, utilizando sondas derivadas do cDNA do HCV, assim como informação em sequências contidas no cDNA do HCV, sugerem que o HCV é semelhante a um Flavivirus. Estes estudos estão descritos na Publicação E.P.O. No

318.216, pertença da presente cessíonária, e que está incorporada aqui na sua integridade. Uma comparação da sequência do cDNA do HCV, derivada dos clones do cDNA do HCV, com sequências conhecidas de um certo número de Flaviviroses, mostram que o HCV contém sequências que são homólogas de sequências conservadas nas

Flaviviroses. Estas sequências conservadas podem permitir a criação de Primers, que podem ser universais na sua aplicação por amplificação de regiões alvo das Flaviviroses, e do HCV. Estas sequências são as de 16-mer ou sequências menores da extremidade 3' dos primers descritos nos Exemplos. A identificação das espécies é então conseguida, utilizando uma sonda especifica para as espécies. Os genomas de um certo número de flaviviroses são conhecidos dos especialistas nestes assuntos e incluem, por exemplo, o virus da Encefalite Japonesa (Sumiyoshi et al. (1987)), o virus da Febre Amarela (Rice et ai. (1985)), o virus Dengue Tipo 2 (Hahn et al. (1988)), o virus Dengue Tipo 4 (Mackow (1987)), e o virus do Oeste Nilo (Castle et al. (1986)). A identificção do RNA do HCV é conseguida utilizando uma sonda especifica para o HCV, a sequência do qual pode ser determinada através da sequência do cDNA do HCV, aqui fornecida.

Alternativamente, a utilização de conjuntos de sondas, concebidas para terem em conta a degeneração do codâo e que contêm assim sequências comuns com as Flaviviroses e com o HCV, como é determinado por uma comparação das sequências de aminoáeidos do HCV, com as sequências conhecidas das Flaviviroses, permite a criação de um sistema de detecção geral para estas viroses.

CONSTRUÇÃO das SEQUÊNCIAS de DNA DESEJADAS

Podem ser preparados oligonucleótidos sintéticos utilizando um sintetizador oligonucleotidico automático, como é descrito por Warner (1984). Se se desejar, as cadeias sintéticas 32 podem ser marcadas com P, por tratamento com um polinucleótido qumase, na presença do P-ATP, utilizando condições Standard para a reacção.

As sequências de DNA, incluindo as isoladas dos patrimónios de cDNA, podem ser modificadas por técnicas conhecidas, incluindo, por exemplo, mutagénese dirigida para um site, como é descrito por Zoller (1982). Abreviadamente, o DNA a modificar é incluido num fago, sob a forma de uma sequência em cadeia simples e convertida em cadeia dupla de DNA, com uma DNA polimerase, utilizando como primer um oligonucleótido sintético complementar à porção do DNA a ser modificada, e tendo a modificação desejada incluida na sua própria sequência. A cadeia dupla de DNA resultante é transformada numa bactéria hospedeira suporte do fago. Culturas da bactéria transformada, que contêm replicações de cada cadeia do fago, são revestidas em agar, de uma fina camada de um metal, para obter placas. Teoricamente, 50% das novas placas contêm fagos, possuindo a sequência mutada, e as restantes 50% têm a sequência original. Replicações das placas são hibridadas com sondas sintéticas marcadas, a temperaturas e sob condições que permitem a hibridação com a cadeia correcta, mas não com a sequência não modificada. As sequências que têm sido identificadas por hibridação são recuperadas e clonadas.

KITS para DETECÇÃO de POLINUCLEÓTIDOS DERIVADOS do HCV

Oligómeros que são sondas e/ou primers para amplificação e/ou despiste do HCV em amostras, podem ser incluídos em kits. Os kits para despiste de sequências de HCV incluem as sondas de DNAs oligoméricas. kits para amplificação de sequências do HCV, podem incluir os primers oligoméricos usados na amplificação. Os kits usualmente contêm as sondas ou primers, numa quantidade pré-medida ou pre-determinada, assim como outros reagentes adequados armazenáveis, e materiais em contentores adequados e separados, necessários para a hibridação particular e/ou protocolo(s) de amplificação. Por exemplo, o kit pode conter padrões, tampões, suportes, enzimas, substratos, sondas de marcação, parceiros de ligação, e/ou instruções para a realização do ensaio.

Exemplos

Abaixo estão descritos exemplos da presente invenção, que são fornecidos apenas com o propósito ilustrativo e não para limitar o alcance da presente invenção.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA das PORÇOES COINCIDENTES do cDNA do HCV dos CLONES I3i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e e

CAI67b

Os clones 13i, 26 j, CA59a, CA84a, CAl56e e CAl67b foram isolados do património lambda-gtll que contém cDNA do HCV (ATCC No. 40.394), cuja preparação está descrita na Publicação E.P.O. No. 318.216 (publicada em 31 de Maio de 1989), e WO 89/04669 (publicada a 1 de Junho de 1989). A pesquisado património foi efectuada com as sondas descritas abaixo, usando o método descrito em Huynh (1985). A frequência com que apareceram clones positivos com as respectivas sondas foi cerca de 1 em 50.000.

O isolamento do clone 13i foi realizado utilizando uma sonda sintética derivada da sequência do clone 12f. A sequência da sonda era:

5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3' isolamento do clone 26j foi realizado usando uma sonda derivada da região 5' do clone K9-1. A sequência da sonda era:

’ TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3' .

Os procedimentos de isolamento para o clone 12f e para o clone k9-l (também chamado K9-1) estão descritos na Publicação E.P.O. No. 318.216 e as suas sequências são apresentadas nas Figs. 1 e 2, respectivamente. As sequências do cDNA do HCV dos clones 13i e 26j estão presentes nas Figs.4 e 5, respectivamente. Também estão ai representados os aminoáeidos para os quais essas sequências codificam, assim como as porções coincidentes do clone 13i com o clone 12f, e a porção coincidente do clone 26j com o clone 13i. As sequências para estes clones confirmaram a sequência do clone k9-l. 0 clone k9-l foi isolado a partir de um património diferente de cDNA do HCV (ver Publicação E.P.O. No. 318.216). 0 clone CA59a foi isolado utilizando uma sonda baseada na sequência da região 5' do clone 26j. A sequência desta sonda era:

’ CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3' .

Uma sonda derivada da sequência do clone CA59a foi usada para isolar o clone CA84a. A sequência da sonda usada para este isolamento foi:

5’ AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.

clone CA156e foi isolado usando uma sonda derivada da sequência do clone CA84a. A sequência da sonda foi:

5’ ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.

clone CA167b foi isolado usando uma sonda derivada da sequência do clone CA156e. A sequência da sonda foi:

5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.

As sequências nucleotidicas dos cDNAs do HCV nos clones CA59a, CA84a, CAl56e e CA167b são representadas nas Figs.6, Ί, 8 e 9 respectivamente. Os aminoácidos ai codificados, assim como os fragmentos coincidentes com as sequências dos clones relevantes, são também mostrados nas figuras.

CRIAÇAO do PATRIMÓNIO pi do cDNA do HCV Um património do cDNA do HCV, o património pi, foi construído a partir da mesma porção do plasma do chimpanzé infectado, usado para construir o património lambda-gtll do cDNA do HCV (ATCC No. 40.394) descrito na Publicação E.P.O. No.

318.216, e utilizando, essencialmente, as mesmas técnicas. No entanto, a construção do património pi utilizou um método de extensão do primer, no qual o primer pela transcriptase reversa se baseava na sequência do clone CA59a. A sequência do primer foi:

5' GGT GAC GTG GGT TTC 3'.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA do CLONE pi 14a

A pesquisa do património pi de cDNA do HCV descrito acima, com a sonda usada para isolar o clone CA167b (ver acima) revelou o clone pi 14a. 0 clone contém cerca de 800 pares de bases de cDNA que coincide com os clones CA167b, CA156e, CA84a e CA59a, que foram isolados a partir do património lambda-gtll do cDNA do HCV (ATCC No. 40.394). Por último, o pi 14a também contém cerca de 250 pares de bases de DNA, que estão a montante do cDNA do HCV no clone CAI67b.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA dos CLONES CA216a, CA290a e ag30a

Baseada na sequência do clone CA167b, foi construída uma sonda sintética, tendo a seguinte sequência:

5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'.

A sonda acima apresentada foi utilizada em pesquisas que revelaram o clone CA216a, cuja sequência de HCV é apresentada na Fig.10.

Foi construída outra sonda baseada na sequência do clone CA216a tendo a seguinte sequência:

5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'

Pesquisando o património lambda-gtll (ATCC No. 40.394), com esta sonda surgiu o clone CA290a, sendo as sequências de HCV, ai presentes, apresentadas na Fig.11.

Numa tentativa semelhante, um património de cDNA de extensão de um primer foi feito, utilizando ácidos nucleicos extraidos do mesmo plasma infeccioso, usado no património original lambda-gtll de cDNA, descrito acima. O primer usado baseou-se nas sequências dos clones CA216a e CA290a:

5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'

O património de cDNA foi construido usando métodos similares aos previamente descritos para patrimónios usados no isolamento dos clones pil4a e k9-l. A sonda usada para pesquisar este património baseava-se na sequência do clone CA290a:

5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3' clone ag30a foi isolado do novo património com a sonda acima descrita e continha cerca de 670 pares de bases da sequência de HCV (ver Fig.12), Parte desta sequência coincide com a sequência de HCV dos clones CA216a e CA290a. No entanto, cerca de 300 pares de bases da sequência ag30a estão a montante da sequência do clone CA290a. A sequência não coincidente mostra um codão de iniciação (*) e um codão de paragem, que pode indicar o inicio da ORF do HCV. Também indicados na Fig.12 estão pequenos péptidos, geralmente aceites como ai codificados (#), que podem desempenhar um papel na regulação da tradução, assim como o suposto primeiro aminoãcido do polipéptido, geralmente considerado (/) e, a jusante, os aminoácidos ai codificados.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA do CLONE CA205a

O clone CA205a foi isolado a partir do património original lambda gt-11 (ATCC No. 40394), utilizando uma sonda sintética derivada da sequência de HCV no clone CA290a (Fig.ll). A sequência da sonda era :

5'TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'

A sequência do cDNA do HCV no CA205a, apresentada na Fig. 13, coincide com as sequências do cDNA em ambos os clones ag30a e CA290a. A coincidência da sequência com a do CA290a é representada pela linha ponteada acima da sequência (A figura também mostra os aminoácidos, geralmente aceites como codificados neste fragmento).

Como foi observado, das sequências de cDNA do HCV nos clones CA205a e ag30a, a poliproteina do HCV, geralmente aceite, parece começar no codão de iniciação ATG; as sequências de HCV, em ambos os clones, contêm uma estrutura interna, um duplo codão de paragem contiguo (TGATAG), 42 nucleótidos a montante deste ATG. A ORF do HCV, parece ter inicio após estes codões de paragem e estender-se por, pelo menos, 8907 nucleótidos (ver o cDNA composto do HCV, como é apresentado na Fig. 18).

ISOLAMENTO e SEQUENCIA do CLONE 18g

Baseado na sequência do clone ag30a (ver Fig. 12), e na sequência coincidente de um clone proveniente do património original lambda gt-11 (ATCC No. 40394), CA230a, foi construída uma sonda sintética, tendo a seguinte sequência :

5'CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'

Pesquisando com a sonda o património original lambda gt-11 do cDNA do HCV, surgiu o clone 18g, cuja sequência do cDNA do HCV é apresentada na Fig. 14. Também está apresentada na Figura a porção coincidente com o clone ag30a, e polipétidos, geralmente aceites como codificados no cDNA do HCV.

cDNA, no clone 18g (cl8g ou 18g), coincide com o dos clones ag30a e CA205a, descritos acima. A sequência do C18g também contém a região do duplo codão de paragem, observada no clone ag30a. A região polinucleotidica, a montante destes codões de paragem, presumivelmente, representa parte da região-5' do genoma do HCV, que pode conter ORFs curtas, e que pode ser confirmada por sequenciação directa do genoma de HCV purificado.

Estes pequenos péptidos, supostamente ai codificados, podem desempenhar um papel regulador na tradução. A região do genoma de HCV, a montante da representada pelo C18g, pode ser isolada para análises de sequências, utilizando, essencialmente, a técnica descrita na Publicação E.P.O. No. 318.216, para isolar sequências de cDNA a montante da sequência do cDNA do HCV no clone 12f. Essencialmente, pequenos primers oligonucleotidicos sintéticos da transcriptase reversa, que estão baseados na sequência do C18g, são sintetizados e utilizados para se ligarem à sequência correspondente do RNA genómico do HCV. As sequências do primer estão próximas da extremidade 5' terminal conhecida do clone C18g, mas suficientemente a jusante para permitir o criação de sequências de sondas que se situariam acima da sequência do primer. São utilizados métodos Standard conhecidos de introdução dos primers e clonagem. 0 património de cDNA resultante é pesquisado com sequências dirigidas para porções situadas acima dos locais onde se encaixam os primers (como se deduz da sequência elucidativa do C18g). 0 RNA genómico do HCV é obtido de amostras de plasma ou figado de individuos com NANBH. Uma vez que o HCV parece ser semelhante aos Flavivirus, a extremidade 5'do genoma pode ser modificada por uma estrutura cap. Sabe-se que os genomas dos Flavivirus contêm na sua extremidade 5', estruturas em cap (Virus da Febre Amarela, Rice et al. (1988); Virus Dengue, Hahn et al. (1988); Virus da Encefalite Japonesa (1987)).

ISOLAMENTO e SEQUENCIA de CLONES do PATRIMÓNIO do cDNA do Beta-HCV

Clones, contendo cDNA representativo da região terminal 3' do genoma de HCV, foram isolados de um património de cDNA, construído a partir da pool de plasma infeccioso original do chimpanzé, que foi usado para a criação do património lambda gt11 do cDNA do HCV (ATCC No. 40394), descrito na publicação E.P.O. No 318.216. Com vista à criação do património de DNA foi acrescentada, ao RNA extraído do plasma, uma cauda de poli rA, utilizando uma poli (rA) polimerase e o cDNA foi sintetizado usando como primer para a transcriptase reversa o oligo (dT)q218· 0 híbrido RNA:cDNA resultante foi digerido com a RNAase H, e convertido em cadeia dupla de cDNA do HCV. O cDNA do HCV resultante foi clonado no lambda gtlO, utilizando essencialmente as técnicas descritas em Huynh (1985), revelando o património Beta (ou b) do cDNA do HCV. Os procedimentos seguidos foram os seguintes:

Uma aliquota (12ml) do plasma foi tratada com proteinase K, e extraída com um volume igual de fenol saturado com Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, beta-mercaptoetanol 0,05 % (v/v), hidroxiquinolona 0,1 % (p/v), EDTA lmM. A fase aquosa resultante foi re-extraida com a mistura do fenol, seguida de 3 extracções com uma mistura de fenol e clorofórmio (1:1) : álcool isoamilico (24:1), seguida de 2 extracções com uma mistura de clorofórmio e álcool isoamilico (1:1). Subsequentemente ao ajuste da fase aquosa a 200 mM, no que respeita ao NaCl, os ácidos nucleicos na fase aquosa foram precipitados durante a noite a -20°C com 2,5 volumes de etanol absoluto frio. Os precipitados foram recuperados por centrifugação a 10.000 RPM durante 40 min., ,«55 lavados com etanol a 70% contendo 20 mM de NaCl, e com etanol frio a 100%, secos durante 5 min. num excicador, e dissolvidos na água.

Aos ácidos nucleicos, isolados da pool de plasma do chimpanzé infectado, foi acrescentada uma cauda poli rA utilizando uma polimerase poli-A na presença de um inibidor da ribonuclease da placenta humana (HPRI) (adquirida da Amersham

Corp.), utilizando como transportador o RNA MS2. Ácidos nucleicos isolados, equivalentes aos contidos em 2 ml de plasma, foram incubados numa solução contendo TMN (Tris HC1 50mM, pH 7,9, MgCl2 mM, NaCl 250 mM, MnCl2 2,5 mM, ditiotreitol 2 mM (DTT)), alfa32 [ P]ATP 40 micromolar, 20 unidades de HPRI (Amersham Corp.), e cerca de 9 a 10 unidades de RNAase livre de poli-A polimerase (BRL). A incubação ocorreu durante 10 min. a 37°C e as reacções paradas com EDTA (concentração final cerca de 250 mM). A solução foi extraida com um volume igual de fenol-clorofórmio, e com um volume igual de clorofórmio, e os ácidos nucleicos foram precipitados durante a noite a -20°C com 2,5 volumes de etanol na presença de 200 mM de NaCl.

ISOLAMENTO do CLONE b5a património beta de cDNA do HCV foi pesquisado, por hibridaçâo, usando uma sonda sintética que tinha uma sequência baseada na sequência do cDNA do HCV no clone 15e. O isolamento do clone 15e é descrito na Publicação E.P.O. No. 318.216 e a sua sequência é apresentada na Fig.3. A sequência da sonda sintética era:

5' ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'

A pesquisa do património revelou o clone beta-5a (b5a) que contém uma região do cDNA do HCV de, aproximadamente, 1.000 pares de bases. A região-5' deste cDNA coincide com a dos clones 35f, 19g, 26g, e 15e (estes clones estão descritos acima). A região entre a sequência poli-A da extremidade 3' , e a sequência 3' que coincide com o clone 15e, contém, aproximadamente, 200 pares de bases. Este clone permite a identificação de uma região da sequência 3' terminal do genoma de HCV.

A sequência do b5a está contida na sequência do cDNA do HCV no clone 16 jh (descrito abaixo). Além disso, a sequência está também presente no CC34a, isolado do património original lambdagtll (ATCC No. 40394).(Referimo-nos aqui ao património original lambda-gtll como património C).

ISOLAMENTO e SEQUENCIA de CLONES GERADOS por

AMPLIFICAÇAO pelo PCR da REGIÃO 3' do GENOMA do HCV

Múltiplos clones de cDNA que têm sido gerados contêm sequências nucleotidicas derivadas da região 3' do genoma de HCV. Isto foi conseguido por amplificação de uma região alvo do genoma por uma técnica de reacção em cadeia da polimerase, descrita em Saiki et al. (1986), e em Saiki et al. (1988), que foi modificada como se descreve abaixo. 0 RNA do HCV, que foi amplificado, foi obtido a partir da pool de plasma original do chimpanzé infectado que foi usado para a criação do património lambda-gtll do cDNA do HCV (ATCC No. 40394) descrito na Publicação E.P.O. No.

318.216. 0· isolamento do RNA do HCV realizou-se como está descrito acima. Ao RNA isolado foi acrescentada uma cauda na extremidade 3', pela poli-A polimerase da E. coli, em presença de

ATP, como se descreve em Sippel (1973), excepto no que se refere ao facto de os ácidos nucleicos isolados do soro de chimpanzés terem sido substituídos pelo substrato do ácido nucleico. 0 RNA a que foi acrescentada a cauda foi então sujeito a transcrição reversa em cDNA pela transcriptase reversa, usando um adaptador oligo dT-primer, essencialmente como é descrito por Han (1987), excepto no que se refere aos componentes e sequência do adaptador-primer que era:

Stuffer Not I promotor SP6 Primer

AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T15 cDNA resultante foi sujeito a amplificação pelo PCR usando dois primers:

Primer Sequência

JH32 (30 mer) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC

JH11 (20 mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA primer JH32 continha 20 sequências nucleotidicas hibridáveis com a extermidade 5' da região alvo no cDNA, com uma ^m estimada de 66°C. 0 JH11 era derivado de uma porção do adaptador oligo dT-primer; assim é especifica da extremidade 3' do cDNA com a T_m de 64°C. Ambos os primers foram delineados para possuirem um site de reconhecimento para a enzima de restrição, Not I, na extremidade 5', para utilização na subsequente clonagem do cDNA do HCV amplificado.

A reacção do PCR foi levada a cabo pondo em suspensão o cDNA e os primers em 100 microlitros de mistura reaccional contendo os quatro desoxinucleósidos trifosfato, tampões salinos

I e iões metálicos, e uma polimerase do DNA termo-estável isolada do Thermus aquaticus (Taq polimerase), que constam de um kit para PCR da Perkin Elmer Cetus (N801-0043 ou N801-0055). A reacção do

PCR foi efectuada em 35 ciclos num ciclizador térmico de DNA da Perkin Elmer Cetus. Cada ciclo consistia num passo de desnaturação a 94°C durante 1,5 min., um passo de emparelhamento a 60°C durante 2 min., e um passo de extensão do primer a 72°C durante 3 min.. Os produtos do PCR foram sujeitos a uma análise por Southern blot utilizando uma sonda de 30 nucleótidos, JH34, cuja sequência era baseada na da região 3' terminal do clone 15e. A sequência do JH34 é:

’ CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3' .

Os produtos do PCR detectados pela sonda do cDNA do HCV varia desde um tamanho de 50 pares de base até cerca de 400 pares de base.

Com vista à clonagem do cDNA do HCV amplificado, os produtos do PCR eram clivados com a Not I e seleccionados por tamanho por electroforese em gel de poliacrilamida. DNA com dimensões superiores a 300 pares de bases foi clonado no site da Notl do pUC 18S. 0 vector pUC 18S é construído por inclusão de um poliligando para a Notl, clonado entre os sites para a EcoRI e Sall do pUC 18. Os clones foram pesquisados em busca de cDNA do HCV usando a sonda JH34. Um certo número de clones positivos foi obtido e sequenciado. A sequência nucleotidica do cDNA do HCV inserida num destes clones, 16jh, e os aminoáeidos ai codificados, são apresentados na Fig.15. Uma heterogeneidade nucleotidica, detectada na sequência do cDNA do HCV no clone 16jh

Í!

quando comparada com a mesma região de outro clone, está indicada na figura.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA do CLONE 6k

Baseado na sequência do clone 16jh e clone b5a (ver acima), foi construída, uma sonda sintética, tendo a seguinte sequência:

5' TCT TCA ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC TCA 3'.

A pesquisa do património original lambda-gtll do cDNA do HCV (descrito na Publicação E.P.O. No. 318.216), com a sonda, revelou a presença de clones com uma frequência de, g

aproximadamente, 1 em 10 ; um destes clones foi chamado clone 6k (também chamado C6k), cuja sequência de cDNA do HCV está representada na Fig.16. Também estão representados na Figura a sobreposição com o clone 16jh e os polipéptidos geralmente aceites como codificados no cDNA do HCV. A informação das sequências do cDNA do HCV no clone 6k foi obtida de apenas uma cadeia. Informações sobre o depósito deste clone são fornecidas abaixo, nas quais o clone aparece mencionado como lambda-gtll C6k. A confirmação da sequência do C6K, como parte de uma ORF que codifica para os polipéptidos do HCV1, tem sido obtida por sequenciaçâo de outros clones coincidentes.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA do CLONE p!31jh

A sequência da região 3' do genoma de HCV contida num clone e que inclui uma estrutura interna do codão de paragem, foi isolada essencialmente como se descreve acima para o isolamento dos clones gerados por amplificação da região 3' do genoma pelo

PCR, exceptuando o facto de o RNA do HCV1 ser convertido em cDNA, usando o oligonucleótido:

5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA GAA

T₁₅ 3'.

cDNA foi então amplificado pela reacção do PCR usando os primers:

5' TTC GCG GCC GCT ACA GCG GGG GAG ACA T 3' e

5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3'

Após a amplificação, os produtos do PCR foram precipitados com espermine, digeridos com a Notl e extraídos com fenol. Os produtos purificados foram clonados no site da Notl do pUC18S, e os clones HCV positivos foram seleccionados usando o oligonucleótido:

5' CGA TGA AGG TTG GGG TAA ACA CTC CGG CCT 3' cDNA do HCV num clone, designado pl31jh, é apresentado na Fig.17. Este clone contém na estrutura interna um codão de paragem, para a ORF maior, contida no genoma do HCV.

ISOLAMENTO e SEQUENCIA do CLONE 5'-clone32

Um clone contendo a sequência da região 5' do genoma de HCV, situado a montante da sequência no clone bll4a, foi isolado, e a sequência nucleotidica determinada por uma modificação do método para o isolamento e sequenciação de clones gerados por amplificação pelo PCR da região 3' do genoma, descrito na Patente Norte Americana No. 456.637, que é incorporada por referência. Geralmente, uma região alvo do genoma era amplificada pela técnica do PCR descrita em Saiki et al. (1986) e em Saiki et al (1988). 0 RNA do HCV que foi amplificado foi obtido por extração do soro humano (isolado clinico E.U., HCV27), usando o método do tiocianato de guanidina frio descrito por Han et al. (1987). 0 RNA extraído foi convertido em cadeias simples de DNA com a transcriptase reversa, usando um primer, JH94, que é complementar aos nucleótidos -250 a -223 do genoma do HCV ( ver Fig.18). A sequência do JH94 é:

5' CCT GCG GCC GCA CGA CAC TCA TAC TAA 3'.

A conversão de cadeia simples em cadeia dupla de cDNA do HCV foi conseguida através da ligação de uma cauda, ao DNA com aproximadamente 20 a 50 resíduos de dA, usando a desoxinucleotidil transferase terminal (Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING), e replicando as moléculas às quais foi adicionada a cauda usando o seguinte adaptador oligo-dT-primer, que contém um site para a Not I, e um promotor sp6:

Stuffer Not I promotor sp6 Primer

AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T15 cDNA resultante foi sujeito a amplificação pelo PCR utilizando dois primers, JH94 (descrito acima) e o JH11, que tem a seguinte sequência:

Primer Sequência JH11 (20 mer) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA

A reacção do PCR foi realizada suspendendo o cDNA e os primers em 100 microlitros da mistura reaccional, contendo os quatro desoxinucleósidos trifosfato, tampões salinos, iões metálicos e uma DNA polimerase termo-estável isolada do Thermus aquaticus (Taq polimerase), que estão contidos no kit para o PCR da Perkin Elmer Cetus (N801-0043 ou N801-0055). A reacção do PCR foi efectuada em 35 ciclos num ciclizador térmico de DNA da Perkin Elmer Cetus. Cada ciclo consistia num passo de desnaturação a 94°C durante 1,5 min., um passo de emparelhamento a 60°C durante 2 min., e um passo de extensão do primer a 72°C durante 3 min..

Os produtos do PCR foram digeridos com Not I, e clonados no pUC18S. Clones contendo sequências nucleotidicas de HCV foram obtidos por despiste com uma sonda, Alex90, que é derivada dos nucleótidos -312 a -283 do genoma do HCV1, e que tem a sequência:

5'ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'

Os cDNAs do HCV nos clones isolados foram sequenciados pelo método dideoxi de terminação da cadeia (Sanger et al. (1977)). A sequência do cDNA do HCV num dos clones isolados, 5'clone 32, abrange toda a região dos nucleótidos -224 até -341 na Fig.18.

Uma análise da sequência nucleotidica do cDNA do HCV mostrou que a réplica da cadeia de RNA do HCV contém um fragmento rico em CG que pode ser capaz de formar uma estrutura estável em hairpin:

A /\

C-C-C’C-C«G C-C-GG-T I l I I f

A i I I

5'

I ) I < <

I t i I I I |

T-G-G-G-G-G-C-G-A-CNa estrutura, as linhas a tracejado indicam possíveis

ligações de hidrogénio entre nucleótidos complementares.

Uma pesquisa na base de dados do computador, banco de genes, revelou que sequências homólogas estavam isentas de sequências virais conhecidas. Assim, esta sequência pode ser exclusiva da extremidade 5' do genoma de HCV.

Uma estrutura em hairpin pode servir de sinal de reconhecimento para uma transcriptase, e/ou pode contribuir para a estabilidade do RNA na extremidade 5’.

SEQUÊNCIAS COMPILADAS de cDNA do HCV

Uma sequência de cDNA do HCV tem sido compilada a partir de uma série de clones coincidentes derivados de vários patrimónios de cDNA do HCV aqui descritos, e na publicação E.P.O. No. 318.216. Os clones dos quais a Fig.18 é derivada são os clones 5'-32, bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (também chamado k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, C6k e pl31jh. Os métodos para isolamento destes clones, assim como as suas sequências, são aqui discutidos, assim como na publicação E.P.O. No.318.216, que está incorporada no presente texto por referência. Na Fig.18, os três traços acima da sequência indicam a posição do codâo de iniciação metionina, geralmente aceite.

O clone bll4a coincide com os clones 18g, ag30a e CA205a, excepto no aspecto de o clone bll4a conter dois nucleótidos extra, situados a montante da sequência no clone 18g (i.e., 5'-CA). Estes dois nucleótidos extra têm sido incluídos na

Τ’* sequência genómica do HCV representada na Fig.18.

Deve notar-se que embora vários dos clones descritos acima tenham sido obtidos a partir de outros patrimónios que não o património C original lambda-gtll do cDNA do HCV (ATCC No.40394), estes clones contêm sequências de cDNA do HCV que coincidem com sequências do cDNA do HCV no património original. Assim, essencialmente, toda a sequência de HCV é derivável do património C original lambda-gtll (ATCC No. 40394), que foi usado para isolar o primeiro clone de cDNA do HCV (5-1-1) . O isolamento do clone 5-1-1 está descrito na Publicação E.P.O. No.

318.216, que está incorporada no presente texto por referência.

A sequência geralmente aceite da maior poliproteina do HCV, codificada na composição do cDNA do HCVl, é também apresentada. 0 primeiro aminoàcido da sequência é o suposto iniciador metionina, da ORF maior. Os aminoácidos variantes, devidos às heterogeneidades clonais, estão indicados acima da sequência. Uma vez que o património lambda-gtll foi criado a partir de soro obtido de um indivíduo (ver Publicação E.P.O. No. 318.216), o resultado sugere que sequências virais variantes (tanto nucleótidos como aminoácidos) estão presentes nesse indivíduo.

Um exame da sequência composta do cDNA do HCV mostra que, para além da ORF maior, existe um certo número de ORFs situadas a montante daquela que codifica para a poliproteina, e na sequência que codifica a poliproteina existe um grande número de ORFs menores nas outras duas estruturas translacionais. As

ORFs situadas a montante da poliproteina do HCV estão representadas na tabela imediactamente abaixo.

Tabela

ORFs a Montante da que Codifica a Grande

Poliproteina do HCV

Nucl.#

-310

-329

-246

-127

Estrutura de Translação

Sequência de Aminoáeidos

MNHSPVRNYCLHAE SV

MGATLHHESLPCEELL

SSRRKRLAMALV

MSWQPPGPPLPGEP

MPGDLGVPPQDC

A estrutura de leitura, posição e tamanho das ORFs a jusante da sequência que codifica para o iniciador MET, da poliproteina geralmente aceite, são apresentados na tabela abaixo. A poliproteina maior é a traduzida da estrutura de leitura 2.

Tabela

ORFs a Jusante da Suposta Sequência de Iniciação

Codificada MET

Estrutura de Leitura_Dimensões (aa)_Posição (pb)

1	168	696
1	105	2343
1	119	5616
2	3025	-42
3	160	5

í «SE».

111 1667

148 6893

A acrescentar ao exposto acima, um exame da sequência que é complementar à cadeia genômica do RNA do HCV, também contém várias ORFs pequenas. Uma destas ORFs que é complementar aos nucleótidos de -341 a +837 na sequência do RNA do HCV, codifica um polipéptido de 385 aminoãcidos.

COMPARAÇAO das SEQUÊNCIAS da REGIÃO 5' OBTIDAS de

ISOLADOS de HCV de DIFERENTES LOCALIZAÇÕES GEOGRÁFICAS

Foram comparadas sequências nucleotidicas da região 5' dos isolados do HCV dos E.U.A. (HCV18, HCV27), da Itália (HCVI1, HCVI24) e da Coreia (HCVK1).

isolamento das sequências de cDNA do HCV foi, essencialmente, como se descreve acima para o isolamento do 5'clone32, excepto no que se segue: 0 RNA extraido sofreu uma transcrição reversa em cDNA, usando como primer o JH51 ou o rl6, que são complementares aos nucleótidos do HCV de -90 a -73 e de 366 a 383, respectivamente. As sequências destes primers são as que se seguem:

Primer Sequência

JH51 5' CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3'

Π6 5' CAC GTA AGG GTA TCG ATG 3'

A amplificação do dsDNA do HCV efectuou-se pelo método do PCR, utilizando o JH93 e o JH52 como 5' e 3primers,

?.

respectivamente. A sequência de HCV no JH93 é derivada dos nucleótidos de HCV, desde o -317 ao -296, a qual, no JH52, vai dos nucleótidos do HCV -93 até ao -117, estando os números dos nucleótidos indicados entre parênteses abaixo da sequência. No

JH52	o dinucleótido sublinhado sofreu uma mutação para	criar o
site	para a NotI. As sequências destes primers são as	que	se
seguem;
(	Primer) Stuffer	Not I	Sequência do	HCV
	(JH93) 5' TTC	GCGGCCGC (-317)	ACTCCATGAATCACTCCCC 3' (-296)
	(JH52) 5' AGTCTT (-93)	GCGGCCGC ACGCCCAAATC (	-117)	3'
	Após a amplificação,	os produtos	do PCR foram	clivados
pela	Not I, e clonados no	pUC18S. Os	cDNAs do HCV foram

sequenciados quer pela sequenciação directa, após amplificação pelo PCR, ou, alternativamente, os cDNAs do HCV clonados foram sequenciados pela extensão do primer e pelo método dideoxi. A extensão do primer e o método de sequenciação de dideoxi foram executados como se descreve acima para a sequência do 5'-clone32.

método do PCR para sequenciação directa usou o Alex90 (ver a sua sequência acima) como 5'-primer e o r25 como 3'primer. 0 Alex90 é derivado dos nucleótidos de HCV de -312 a 283, e o r25 é derivado dos nucleótidos de 365 a 342 (ver Fig.18). A sequência do r25 é:

5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3'.

Uma comparação das sequências da região 5' do HCV27, HCVK1, HCVI1, HCVI24 e HCV18, com a sequência do protótipo do

HCV, HCV1, mostrou o seguinte: a região 5' examinada é altamente conservada, · entre os 5 isolados do HCV. A sequência parecia ser idêntica, excepto num nucleótido, que foi delectado na posição 171 no HCVI24, e pela ambiguidade em quatro nucleótidos nas posições -222 a -219 no isolado HCVK1.

Os elevados niveis de conservação da sequência nesta região podem reflectir o papel destas regiões na replicação virai, e/ou transcrição, e/ou tradução.

VARIAÇÕES nas SEQUÊNCIAS nos ISOLADOS de HCV de

DIFERENTES INDIVÍDUOS

Isolados de HCV que contêm sequências que se afastam da CDC/HCV1 foram identificados em seres humanos, alguns dos quais eram sero-positivos para os anticorpos anti-C100-3 (o EC10 era negativo para os anticorpos). A identificação destes novos isolados foi conseguida por clonagem e sequenciação de segmentos do genoma de HCV que havia sido amplificado pela técnica do PCR, usando sequências do CDC/HCV1. A amplificação foi conseguida essencialmente, baseada num método de cPCR/HCV. 0 método utiliza primers e sondas baseadas nas sequências do cDNA do HCV aqui descritas. 0 primeiro passo do método é a sintese de um cDNA para o genoma de HCV, ou para o seu intermediário replicativo, utilizando a transcriptase reversa. Após as sínteses do cDNA do HCV, e antes da amplificação, o RNA na amostra é degradado por técnicas conhecidas dos peritos nestes assuntos. Um determinado segmento do cDNA do HCV é então amplificado pelo uso dos primers apropriados. As sequências amplificadas são clonadas, e clones contendo as sequências amplificadas são detectados por uma sonda que é complementar a uma sequência que se situa entre os primers, mas que não coincide com eles.

ISOLADOS de HCV OBTIDOS de SERES HUMANOS nos E.U.

Amostras de sangue que foram usadas como fonte de viriões de HCV foram obtidas na Cruz Vermelha Americana em Charlotte, Carolina do Norte, e da Community Blood Center do Kansas, Kansas City, Missouri. Pesquisaram-se as amostras em busca de anticorpos para o antigénio do HCV C100-3, usando um ensaio de ELISA como está descrito na Publicação E.P.O. No.

318.216, e sujeitas a uma análise suplementar de Western blot, utilizando um HRP anti-humano policlonal de cabra, para medir anticorpos anti-HCV. Duas amostras, #23 e #27, da Cruz Vermelha Americana e da Community Blood Center do Kansas, respectivamente, foram classificadas como sendo HCV positivas por estes ensaios.

Partículas virais, presentes no soro destas amostras, foram isoladas por ultracentrifugação, sob as condições descritas por Bradley et al.(1985). 0 RNA foi extraido das partículas por digestão com proteinase k e SDS, nas concentrações finais de 10 microgramas/ml para a proteinase k, e 0,1% de SDS; a digestão durou lh a 37°C. 0 RNA virai foi ainda purificado por extracçâo com clorofórmio-fenol, como se descreve na Publicação E.P.O. No.

318.216.

RNA do HCV, na preparação do RNA, foi sujeito à transcrição reversa em cDNA, essencialmente como se descreve na Publicação E.P.O. No. 318.216, excepto no que se refere ao facto de o oligonucleótido JHC 7, que corresponde à sequência do cDNA

1958-1939 e que tem a sequência que se segue, ter sido usado como primer para a reacção da transcriptase reversa:

JHC 7: CCA GCG GTG GCC TGG TAT TG.

Após ambas as cadeias de cDNA terem sido sintetizadas, o cDNA resultante foi então amplificado pelo método do PCR, essencialmente como se descreve acima, para o isolamento dos clones gerados por amplificação pelo PCR, excepto no que se refere aos primers oligonucleotidicos usados, i.e., JHC 6 e ALX 80, terem sido delineados para amplificar um fragmento do genoma de HCV de 1080 nucleótidos, dos nucleótidos 673 a 1751 do genoma de HCV do CDC/HCV1. Por último os primers são delineados para incorporar um site de restrição para a Not I na extremidade 3' do produto do PCR e um extremidade cega na extremidade 5'. As sequências dos primers são:

ALX 80: TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG;

e

JHC 6: ATA TGC GGC CGC CTT CCG TTG GCA TAA.

O ALX 80 corresponde aos nucleótidos 673-702 da sequência do CDC/HCV1; o JHC 6 corresponde aos nucleótidos 17521738 do HCV1 (além disto, há 12 nucleótidos extra que codificam para o site da Notl). A designação dos nucleótidos em JHC 6, i.e., em número descendente, indica a colocação na cadeia de anti-sentido.

Após a amplificação pelo PCR com os primers descritos acima, a extremidade cega foi convertida num site para a Not I como se segue: uma cauda homopolimérica de 15 dGs foi acrescentada ao produto do PCR, usando a desoxinucleótido transferase terminal, e os produtos foram de novo sujeitos a

amplificação pelo PCR, usando como primers o JHC 6 e o JHC 13. 0 último primer, o JHC 13, cuja sequência é apresentada em seguida, é delineado para conter um site para a Not I, para além de um fago SP6 promotor (o promotor SP6 é descrito em GENETIC ENGINEERING, J. Setlow Ed.(1988)).

JHC13: AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC

ACT ATA GAA CCC CCC CCC CCC CCC.

Com vista à clonagem do cDNA do HCV amplificado, os produtos do PCR foram clivados com a Notl, precipitados com espermine para remover oligonucleótidos livres (Hoopes et al.(1981)), e clonados no site da Notl do pUC18S (ver secção IV.A.34.). Os cDNAs do HCV em três clones derivados de cada isolado de HCV, foram submetidos a análises de sequências. A análise foi, essencialmente, pelo método descrito em Chen e Seeburg (1985).

Sequências de consenso dos clones derivados do HCV nas amostras 23 e 27 são apresentadas na Fig. 46 e Fig. 47, respectivamente. As sequências variáveis são também apresentadas nestas figuras, assim como os aminoáeidos codificados nas sequências de consenso.

A Fig. 39 e a Fig. 40 mostram comparações das sequências alinhadas das cadeias nucleotidicas positivas (Fig. 39) e sequências de aminoáeidos geralmente aceites (Fig. 40) das amostras 23, 27 e HCVl. A sequência de aminoáeidos do HCVl na Fig. 39 representa os aminoáeidos numerados de 129-467 da poliproteina do HCV, codificada pela ORF maior, no RNA genómico

do HCV. Um exame das Fig. 46 e Fig. 47 mostra que existem variações nas sequências dos três clones isolados. As variações das sequências, a nivel nucleotidico e a nivel de aminoáeidos, estão sumarizadas na tabela imediatamente abaixo. Na tabela, os polipéptidos designados por Se NS1 representam números de aminoáeidos desde 130 até ~ 380, e de 380 até ~ 470, respectivamente. A numeração tem inicio no suposto iniciador metionina. A terminologia S e NS1 baseia-se no posicionamento das sequências que codificam para os polipéptidos, usando o modelo do Flavivirus. Como está descrito acima, no entanto, recentes evidências sugerem que não existe uma correlação total entre o HCV e as Flaviviroses no que respeita aos dominios polipeptidicos virais, particularmente nos dominios geralmente aceites E/NS1. De facto, os polipéptidos do HCV e os seus dominios codificados podem exibir substanciais desvios do modelo do Flavivirus.

Tabela

Homologia de Sequências

Código nucleotidico Aminoáeidos codificados

Global	S	NS I	Global	S	NS	I
	%	%	%	%	%		%
HCV1/HCV23	93	95	91	92	95		87
HCV1/HCV27	89	93	84	89	95		82
HCV23/HCV27	89	93	85	90	93		84
Embora	haja	variações	nas sequências	de	HCV,
recentemente	isoladas,	as sequências	elonadas	das amostras	23 e
2 7 (chamadas	HCV23	e HCV27), contêm,	cada uma,	1019 :	nucleótidos,
indicando a	ausência	de delecções e	adição de mutantes	nesta

região, nos clones seleccionados. As sequências nas Fig. 39 e 40 mostram também que as sequências isoladas não sofreram rearranjos nesta região.

Uma comparação das sequências de consenso do HCVl e para os outros isolados de HCV está sumarizada na tabela acima. As variações das sequências entre o isolado HCVl do chimpanzé e os HCVs isolados dos seres humanos são quase as mesmas que se encontram entre os HCVs de origem humana.

E interessante notar que as variações da sequência em dois dos supostos dominios não são uniformes. A sequência numa suposta região S parece ser relativamente constante e disposta ao acaso por toda a região. Em contraste, uma suposta região NS1 tem um grau mais elevado de variabilidade que a sequência global, e a variação parece ser numa bolsa de hipervariabilidade de 28 aminoácidos, que se localiza a cerca de 70 aminoácidos a jusante da porção N-terminal, geralmente aceite da suposta poliproteina.

Embora seja discutível se as variações detectadas foram introduzidas durante o processo de amplificação, é pouco provável que todas as variações sejam dai resultantes. Estimativas feitas levam a crer que a Taq polimerase introduz erros numa sequência de, aproximadamente, 1 base por 10 kilobases do modelo de DNA por ciclo (Saiki et al.(1989)). Baseados nestas estimativas, cerca de 7 erros podem ter sido introduzidos durante a amplificação pelo PCR dos 1019 pb do fragmento de DNA. No entanto, os tês subclones do HCV-23 e HCV-27 revelaram 29 e 14 variações de bases, respectivamente. 0 que se segue sugere que estas variações ocorrem naturalmente. Cerca de 60% das alterações das bases são mutações silenciosas que não alteram a sequência dos aminoácidos.

Variações introduzidas pela Taq polimerase, durante a amplificação peio PCR, seria de esperar que aparecessem ao acaso; no entanto, os resultados mostram que as sequências variantes estão agrupadas em, pelo menos, uma região especifica. Além disso, uma sequência de consenso era derivada por sequenciação de mútiplos clones diferentes, derivados dos produtos de amplificação do PCR.

ISOLADOS de HCV de SERES HUMANOS em ITALIA e nos E.U.

Segmentos do RNA do HCV, presentes em diferentes isolados, foram amplificados pelo método do cPCR/HCV. Estes segmentos estendem-se por uma região de ~0,6 Kb a ~1,6 Kb a jusante do codâo de iniciação metionina, da suposta poliproteina do HCV. Os isolados são de espécimes biológicos, obtidos a partir de indivíduos injectados pelo HCV. Mais especificamente, o isolado HCT#18 é de plasma humano de um indivíduo nos E.U.A., EC1 e EC10 são de uma biópsia de fígado de um paciente italiano, e o Th é de tuna fracção dos mononucleócitos do sangue periférico de um paciente americano. Segmentos comparáveis de RNA do HCV têm sido isolados a partir de um chimpanzé.

RNA foi extraido dos espécimes de plasma humano, usando, no processo de extracçâo, fenol:CHC13:álcool isoamilico. 0,1 ml ou 0,01 ml do plasma foi diluido para um volume final de 1,0 ml, com uma solução de TENB/proteinase K/SDS (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, EDTA 0,001 M, NaCl 0,1 M, proteinase K lmg/ml e o,5% SDS), contendo 10 a 40 microgramas/ml de ácido poliadenilico e incubado a 37 C, durante 60 min. . Após a digestão com a proteinase K, as fracções de plasma resultantes foram

Λ) desproteinizadas por extração com TE (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) fenol saturado, pH 6,5. A fase fenólica foi separada por centrifugação e foi re-extraida com TENB, contendo 0,1% de SDS. Das fases aquosas resultantes de cada extração fez-se uma pool, e esta foi extraída duas vezes com um volume igual de fenol/clorofórmio/álcool isoamilico [1:1(99:1)], e depois duas vezes com igual volume de uma mistura de clorofórmio/álcool isoamilico, 99:1. Após a fase de separação por centrifugação, fez-se um acerto final de concentração da fase aquosa a 0,2 M, em acetato de Na, e os ácidos nucleicos foram precipitados por adição de dois volumes de etanol. Os ácidos nucleicos precipitados foram recuperados por ultracentrifugação num rotor SW 41 a 38 K, durante 60 min., a 4°C, ou numa microcentrifuga, durante 10 min. a 10K e a 4°C.

RNA extraido da biópsia do figado foi fornecido pelo Dr. F. Bonino, Ospedale Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino,

Itália.

A fracção mononucleocitica foi obtida por sedimentação da aliquota individual de sangue, através de Ficoll-Paquí^ (Pharmacia Corp.), usando as instruções dos fabricantes. 0 RNA total foi extraido da fracção, usando tiocianato de guanidina, processo descrito na Publicação E.P.O. No. 318.216 (ver também Choo et al. (1989)).

A sintese do cDNA do HCV das amostras foi conseguida usando a transcriptase reversa e primers derivados do clone 156e e do clone K91. Estes primers, que são de anti-sentido relativamente ao RNA genómico, têm as seguintes sequências:

156el6B: 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3',

K91/16B: 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'.

Após a precipitação pelo etanol, o RNA precipitado ou fracção do ácido nucleico, foi seco e de novo suspenso em água destilada tratada em DEPC. Estruturas secundárias dos ácidos nucleicos foram destruídas por aquecimento a 65 °C, durante 10 min., e as amostras foram imediatamente arrefecidas em gelo. O cDNA foi sintetizado usando de 1 a 3 microgramas do RNA total do figado ou dos ácidos nucleicos (ou RNA) extraídos de 10 a 100 microlitros de plasma. As sinteses utilizaram a transcriptase reversa num volume de reacção de 25 microlitros, usando o protocolo especificado pelo fabricante, BRL. Todas as misturas reaccionais para a sintese do cDNA continham 23 unidades do TM inibidor da RNAase RNASIN (Fisher/Promega). após a sintese do cDNA, as misturas reaccionais foram diluidas com água, fervidas durante 10 min. e rapidamente arrefecidas no gelo.

Cada conjunto de amostras foi duas vezes sujeito à técnica de amplificação pelo PCR. Os primers para a reacção foram escolhidos para amplificar regiões designadas EnvL e EnvR. A região EnvL contém os nucleótidos desde 669 - 1243, e os aminoácidos geralmente aceites de 117 - 308; a região EnvR contém os nucleótidos desde 1215 - 1629 e codifica para os supostos aminoácidos 300 - 408 (os supostos aminoácidos são numerados tendo inicio no suposto codão de iniciação metionina). A relação destas regiões, relativamente à suposta poliproteina codificada no cDNA do HCV e aos polipéptidos codificados no modelo do Flavivirus, é mostrada na Fig. 48.

Os primers, para a primeira reacção do PCR eram derivados das sequências do cDNA do HCV no clone ag30a, clone 156e ou clone k9-l. Os primers, usados para a amplificação da região EnvL, foram o 156el6B (apresentados acima) e ag30al6A para a cadeia de sentido; a amplificação da região EnvR utilizou o primer K91/16B (apresentado acima) e 156el6a para a cadeia de sentido. As sequências dos primers da cadeia de sentido são as seguintes:

Para EnvL, ag30al6A: 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3' e

Para EnvR, 156el6A: 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'.

As reacções do PCR foram efectuadas, essencialmente, de acordo com as indicações do fabricante (Cetus-Perkin-Elmer), excepto no que se refere à adição de 1 micrograma de RNase A. As reacções foram efectuadas num volume final de 100 microlitros. A reacção do PCR foi efectuada em 30 ciclos, utilizando um regime de 94°C (1 min.), 37°C (2 min.) e 72°C (3 min.), com uma extensão de 7 min. a 72°C no último ciclo. As amostras foram então extraídas com fenol:CHCl3, precipitadas duas vezes pelo etanol, de novo suspensas em Tris HC1 10 mM, pH 8,0, e concentradas, usando a filtração Centricon-30 (Amicon). Este procedimento remove com eficácia os oligonucleótidos com menos de 30 nucleótidos de comprimento; assim, são removidos os primers da primeira amplificação pelo PCR.

As amostras concentradas pelo Centricon-30 foram então submetidas a uma segunda amplificação pelo PCR, usando sondas estabelecidas a partir dos clones 202a e 156e para a região do EnvL, e dos clones 156e e 59a para a região EnvR. Os primers

ΐββ5552»·Β· para a amplificação da região EnvL têm as sequências seguintes:

202aEnv41a: 5' CTT GAA TTC GCA ATT TGG GTA AGG TCA

TCG ATA CCC TTA CG 3' e

156E38B': 5' CTT GAA TTC GAT AGA GCA ATT GCA ACC

TTG CGT CGT CC 3'.

Os primers para amplificação da região EnvR em RNAs derivados de seres humanos têm as sequências seguintes:

156e38A': 5' CTT GAA TTC GGA CGA CGC AAG

GTT	GCA	ATT e	GCT	CTA	TC 3'
59aEnv39C: 5'	CTT	GAA	TTC	CAG	CCG GTG TTG
	AGG	CTA	TCA	TTG	CAG TTC 3'.

A amplificação pelo PCR realizou-se em 35 ciclos, utilizando um regime de 94°C (1 min.), 60°C (1 min.) e 72°C (2 min), com uma extensão de 7 min., a 72°C, para o último ciclo. As amostras foram então extraidas com fenol:CHCl3, precipitadas duas vezes e digeridas com a EcoRI. Os produtos da reacção do PCR foram analisados por separação dos produtos por electroforese em gel de poliacrilamida a 6%. DNAs com, aproximadamente, as dimensões calculadas para os produtos do PCR esperados, foram electroeluidas dos geles e subclonadas, ou num vector plasmidico pGEM-4, ou no lambda-gtll. As dimensões esperadas para os produtos da EnvL e EnvR, após a primeira aplicação, são 615 pb e 683 pb, respectivamente; após a segunda amplificação pelo PCR, as dimensões esperadas dos produtos para a EnvL e EnvR são 414 pb e 575 pb, respectivamente. Os plasmideos contendo os produtos amplificados foram usados para transformar células hospedeiras; o plasmideo pGEM-4 foi usado para transformar a DH5-alfa, e o lambda-gtll foi usado para transformar a C600 delta-HFL. Clones das células transformadas que, ou se hibridavam com as sondas do

HCV apropriadas (descritas abaixo) ou que tinham inserções de tamanho correcto, foram seleccionados. As inserções eram então clonadas no M13 e sequenciadas.

As sondas para todos os produtos do cPCR/HCV consistiam 32 em secções do cDNA do HCV, marcadas com P, que tinham sido preparadas por amplificação pelo PCR de uma região do clone 216 (usando como primers o CA216al6A e o 216al6B), e do clone 84 (usando como primers o CA84al6A e o CA84al6B, ou o CA84al6C); o 32

P foi introduzido nos produtos do PCR, por corte e translação. As sondas da primeira e segunda etape de amplificação EnvL eram provenientes do clone 216. As utilizadas na primeira amplificação da EnvR eram do 84 (i.e. CA84al6A e CA84al6B), para a segunda amplificação da EnvL pelo PCR, foram usadas a CA84al6A e CA84al6C. Estas sondas não coincidiam com os primers usados nas reacções do cPCR/HCV. A sequência dos primers para a amplificação das sondas pelo PCR encontra-se na tabela seguinte:

Tabela

Primerclone_Sequência

CA216al6A	216	5'	TGA	ACT	ATG	CAA	CAG	G	3'
CA216al6B	216	5'	GGA	GTG	TGC	AGG	ATG	G	3'
CA84al6A	84	5'	AAG	GTT	GCA	ATT	GCT	C	3'
CA84al6B	84	5'	ACT	AAC	AGG	ACC	TTC	G	3'
CA84al6C	84	5'	TAA	CGG	GTC	ACC	GCA	T	3'

ή»

A informação das sequências, em variantes na região EnvL, foi obtida a partir de 3 clones do HCT#18, 2 clones do TH, 3 clones do EC1 e de clones de HCVl, descritos na Publicação E.P.O. No. 318.216 e supra. Uma comparação da sequência nucleotidica composta, de cada isolado derivado destes clones, é apresentada na Fig. 49. Na figura, cada sequência é apresentada de 5' para 3', para a cadeia de sentido para a região EnvL, e as sequências foram alinhadas. As linhas verticais e letras maiúsculas indicam homologia de sequências, a ausência de uma linha e de letras maiúsculas indicam uma falta de homologia. As sequências apresentadas em linhas são como se segue: Linha 1, Thorn; linha 2, EC1; linha 3, HCT#18; linha 4, HCVl.

A informação das sequências, em variações da região EnvR, foi obtida a partir de dois clones do EC10, e dos clones do HCVl, descritos na Publicação E.P.O. No. 318.216 e supra. Os dois clones do EC10 diferiam apenas por um nucleótido. A comparação das sequências nucleotidicas do EC10 (clone 2) e uma composição das sequências de HCVl é apresentada na Fig. 50; cada sequência é apresentada de 5' para 3', para a cadeia de sentido da região EnvR, e as sequências foram alinhadas. Os dois pontos entre as sequências indicam homologia de sequências.

Uma comparação das sequências de aminoáeidos codificados nas regiões EnvL (aminoáeidos #117-308) e EnvR (aminoáeidos #300-438), para cada um dos isolados, é mostrada nas Figs. 51 e 52, respectivamente. Incluídas nas figuras encontramse as sequências para os isolados JH23 e JH27, descritas acima. Também estão indicadas sequências de isolados Japoneses; estas sequências foram fornecidas pelo Dr. T. Miyamura, Japão. Nas figuras, a sequência de aminoácidos para a região é dada na sua integridade para o HCV1, e os aminoácidos não homólogos nos vários isolados estão indicados.

Como se pode ver na Fig. 51, na região EnvL, existe ao todo cerca de 93% de homologia entre o HCV1 e os outros isolados. 0 HCT18, o Th, e o EC1 têm cerca de 97% de homologia com o HCV1; o JH23 e o JH27 têm cerca de 96% e cerca de 95% de homologia, respectivamente, com o HCV1. A Fig.52 mostra que as homologias na região EnvR são significativamente menores do que na região EnvL; além disso, uma sub-regiâo parece ser hipervariável (i.e., do aminoácido 383-405). Estes dados estão sumarizados na tabela imediatamente abaixo.

Tabela

Homologia da Região EnvR

Isolado Percentagem de Homologia com o HCV1

AA330-AA438 AA383-AA405

JH23 (E.U.)	83	57
JH27 (E.U.)	80	39
Japonês	73	48
EC10 (Itália)	84	48

DETECÇAO de CADEIAS 5' RNA do HCV POSITIVAS e NEGATIVAS no SORO

O RNA no HCV27, isolado do soro, foi analisado em busca da presença de cadeias positivas e negativas, utilizando o método do PCR. Este método foi realizado, essencialmente, como se descreve acima, excepto no que se segue: 0 RNA extraido do HCV27

100 foi sujeito a transcrição reversa, dando origem a um cDNA em cadeia simples, usando como primer o Alex90 ou o JH52 (ver acima as suas sequências). A sequência do Alex90 corresponde à dos nucleótidos -312 a -283 da cadeia positiva do RNA do HCV, enquanto o JH52 corresponde à dos nucleótidos -117 a -93 da cadeia negativa. Cada um dos cDNAs do HCV em cadeia simples, resultante, foi, separadamente amplificado pelo PCR, usando o Alex90 e o JH52. A detecção dos produtos amplificados foi conseguida por Southern blot, usando o Alex89 como sonda. 0 Alex89 corresponde aos nucleótidos números -203 a -175 do RNA do HCV. A sequência do Alex89 é:

5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.

As análises indicaram que, por este método, os sinais dos produtos amplificados de ambas as cadeias de RNA eram de intensidade igual. Estes resultados sugerem que o RNA do HCV, na região 5', pode existir em dupla cadeia de RNA.

SONDAS para HIBRIDAÇÃO em SANDWICH para o HCV

Este exemplo mostra os conjuntos de sondas de marcação e captura, úteis na detecção do RNA do HCV em amostras biológicas, usando, essencialmente, o ensaio descrito na Patente

Norte Americana No. 4.868.105. 0 método consiste num ensaio de hibridação em sandwich em fase de solução, que utiliza tanto as sondas de captura como as sondas de marcação, que se hibridam com sequências alvo num ácido nucleico de análise. Na pesquisa de HCV em amostras biológicas, as sondas usadas ligam-se a regiões conservadas do genoma do HCV, e as regiões de ligação do HCV são

101 seleccionadas pela sua exclusividade ao genoma de HCV. As regiões que se ligam ao parceiro de ligação da sonda de captura, ou a porção da sonda de marcação que se liga ao agente de marcação (ou a um multimero) amplificado, se for usado o método descrito na Publicação E.P.O. No. 317.077), são seleccionadas de tal forma que não se ligam a nenhuma das sequências conhecidas no banco de dados ou no HCV e que têm o conteúdo apropriado de Gs e Cs, para permitir a formação de duplexes estáveis com os seus complementos, sob condições de selecção. As sondas de captura e marcação encontram-se sob a forma de conjuntos e as sondas de um conjunto não se intercalam com as sondas de outro conjunto. Estas sondas são constituídas por sequências complementares às sequências nucleotidicas que se seguem na cadeia codificante da sequência protótipo do cDNA do HCV apresentada na Fig.18.

Conjunto I

Tipo de Sonda Número da Sonda Números dos

Nucleótidos

Complementares

Captura	42.XT1.1	-318	a	-289
Captura	42.XT1.2	-285	a	-256
Captura	42.XT1.3	-252	a	-223
Captura	42.XT1.4	-219	a	-190
Marcação	42.LLA2C.5	-186	a	-157
Marcação	42.LLA2C.6	-153	a	-124
Marcação	42.LLA2C.7	-120	a	-91
Marcação	42.LLA2C.8	-87	a	-58
Marcação	42.LLA2C.9	-54	a	-25
Marcação	42.LLA2C.10	-21	a	9

102

		Ή-:
Marcação	42.LLA2C.il	13	a	42
Marcação	42.LLA2C.12	46	a	75
Marcação	42.LLA2C.13	79	a	108
Marcação	42.LLA2C.14	112	a	141
Marcação	42.LLA2C.15	145	a	174

Conjunto 2

Tipo de sonda	Número de sonda	Números	dos
		Nucleótidos
		Complementares
Captura	42.16.XT1	4378 a	4407
Captura	42.17.XT1	4411 a	4440
Captura	42.18.XT1	4444 a	4473
Captura	42.19.XT1	4477 a	4506
Captura	42.20.XT1	4510 a	4539
Marcação	42.21.LLA2C	4543 a	4572
Marcação	42.22.LLA2C	4576 a	4605
Marcação	42.23.LLA2C	4609 a	4638
Marcação	42.24.LLA2C	4642 a	4671
Marcação	42.25.LLA2C	4675 a	4704
Marcação	42.26.LLA2C	4708 a	4737
Marcação	42.27.LLA2C	4771 a	4770
Marcação	42.28.LLA2C	4774 a	4803
Marcação	42.29.LLA2C	4807 a	4836
Marcação	42.30.LLA2C	4840 a	4869
Marcação	42.31.LLA2C	4873 a	4902

103

Conjunto 3

Tipo de sonda Número de sonda Números de

Nucleótidos

Complementares

Captura	42.32.XT1	4056	a	4085
Captura	42.33.XT1	4089	a	4085
Captura	42.34.XT1	4122	a	4151
Captura	42.35.XT1	4155	a	4184
Marcação	42.36.LLA2C	4188	a	4217
Marcação	42.37.LLA2C	4221	a	4250
Marcação	42.38.LLA2C	4254	a	4283
Marcação	42.39.LLA2C	4287	a	4316
Marcação	42.40.LLA2C	4230	a	4349
Marcação	42.41.LLA2C	4353	a	4382
Marcação	42.42.LLA2C	4386	a	4415
Marcação	42.43.LLA2C	4419	a	4448

Nos conjuntos acima, cada sonda de captura contém, para além das sequências complementares às sequências do HCV, as seguintes sequências a jusante da sequência do HCV (i.e., na extremidade 3'):

5' CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG 3'

A sequência comum a cada sonda de captura é complementar a uma sequência no(s) parceiro(s) de ligação, de modo a que, após a hibridação, o duplex possa ser capturado através da fixação à fase sólida.

Também, em cada conjunto, cada sonda de marcação contém, para além das sequências complementares às sequências do HCV, a seguinte sequência a jusante da sequência do HCV:

5' TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC 3'

Se é usado o método descrito na Publicação E.P.O. No.

104

317.077, a sequência comum a cada sonda de marcação é complementar a uma sequência num multimero, para permitir a formação de duplexes híbridos com esse multimero.

As sequências das sondas nos conjuntos acima referidos são apresentadas na Fig.19.

DETECÇÃO das SEQUÊNCIAS POLINUCLEOTIDICAS do HCV USANDO a AMPLIFICAÇAO pelo PCR

No método generalizado de amplificação do RNA do HCV pelo cPCR, considera-se que a cadeia de RNA é um viriâo ou uma cadeia de mRNA, que é a cadeia de sentido. No entanto, é também possivel que formas replicativas intermédias possam ser detectadas. Estas seriam cadeias de anti-sentido; neste caso, o primer seria uma cadeia de sentido. Uma cadeia de sentido do RNA, contendo a região alvo, é hibridada com um primer antisentido, que serve de primer para a sintese da cadeia de replicação, contendo o alvo. O cDNA correspondente ao molde de RNA é sintetizado por uma transcriptase reversa, dependente do primer e do molde. O cDNA do hibrido resultante RNA:cDNA é liberto pela desnaturaqçâo e tratamento com RNAse. Os primers são emparelhados com o cDNA e aumentados em extensão, por DNA polimerase, dependente do primer e do molde. Os produtos são desnaturados, re-emparelhados com os primers e é conduzida uma segunda fase de sintese. Decorrem um certo número de ciclos até que o produto amplificado, contendo a região alvo, esteja numa quantidade desejável que é, pelo menos, um nivel detectãvel.

DETECÇÃO de SEQUÊNCIAS de ÁCIDOS NUCLEICOS do HCV

105

AMPLIFICADAS, DERIVADAS de SEQUÊNCIAS de ÁCIDOS

NUCLEICOS de HCV do FÍGADO e ESPECIMES PLASMATICOS de

CHIMPANZÉS com NANBH

Os ácidos nucleicos de HCV presentes no figado e plasma dos chimpanzés com NANBH e não em chimpanzés controle, foram amplificados, usando, essencialmente, a técnica da reacção em cadeia da polimerase (PCR), descrita por Saiki et al. (1986). Os oligonucleótidos dos primers eram derivados das sequências do cDNA do HCV, no clone 81 (Fig. 22), ou clones 36 (Fig. 23) e 37b (Fig. 24). As sequências amplificadas foram detectadas por electroforese em gel e pelo método de Southern blot modificado, usando como sondas o oligómero do cDNA apropriado ou uma sequência de cDNA, sujeita a corte e translação, com uma sequência da região entre os dois primers, mas não incluindo os mesmos.

Amostras de RNA, contendo sequências de HCV a examinar pelo sistema de amplificação, foram isoladas de biópsias de figado de 3 chimpanzés com NANBH e de 2 chimpanzés de controle. 0 isolamento da fraeção poli A⁺ RNA foi efectuado pelo método do tiocianato de guanidina, descrito em Maniatis et al. (1982).

Amostras de RNA, que eram para examinar pelo sistema de amplificação, foram também isoladas a partir do plasma de dois chimpanzés com NANBH e de um chimpanzé de controle, assim como de uma pool de plasma de chimpanzés de controle. Um chimpanzé fi infectado tinha um titulo igual ou superior a 10 CID/ml e o outro chimpanzé infectado tinha um titulo igual ou superior a 10 CID/ml.

Os ácidos nucleicos foram extraídos do plasma pelo

106

processo que se segue: 0,1 ml ou 0,01 ml do plasma foram diluídos para um volume final de 1,0 ml, com uma solução de TENB/proteinase K/SDS (Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, EDTA 0,001 M, NaCl 0,1 M, proteinase K 1 mg/ml, SDS 0,5%), contendo 10 microgramas/ml de ácido poliadenilico e incubado a 37°C, durante 60 min.. Após a digestão com a proteinase K, as fracções de plasma resultantes foram desproteinizadas por extracção com TE (Tris-HCl 10,0 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) fenol saturado. A fase fenólica foi separada por centrifugação e foi de novo extraida com TENB, contendo SDS 0,1%. Com as fases aquosas, resultantes de cada extracção, fez-se uma pool, que se extraiu duas vezes, com um volume igual de fenol/clorofórmio/álcool isoamilico [1:1(99:1)], e depois duas vezes com um volume igual de uma mistura de clorofórmio/álcool isoamilico 99:1. Seguindo-se separação de fases por centrifugação, a fase aquosa foi trazida a uma concentração final de 0,2 M em Acetato de Na e os ácidos nucleicos foram precipitados por adição de dois volumes de etanol. Os ácidos nucleicos precipitados foram recuperados por ultracentrifugação, num rotor SW 41 a 38 K, durante 60 min. a

4°C.

Em adição ao referido acima, o plasma de chimpanzé de elevado titulo e a pool de plasma de controle, alternativamente, foram extraídos com 50 microgramas de transportador poli A, pela técnica de Chomcyzski e Sacchi (1987). Esta técnica utiliza extracção com tiocianato ácido de guanidina. 0 RNA foi recuperado por centrifugação a 10.000 RPM, durante 10 min., a 4°C, numa microcentrifuga para Eppendorf.

Em duas ocasiões, antecedendo a sintese do cDNA, na

107 reacção do PCR, os ácidos nucleicos extraidos do plasma pelo método da proteinase K/SDS/fenol, foram ainda purificados por ligação e eluição em colunas S e S Elutip-R. A técnica seguida estava de acordo com as instruções do fabricante.

cDNA, usado como molde para a reacção do PCR, era derivado dos ácidos nucleicos (ou do ácido nucleico total ou do RNA) e preparado como se descreve acima. Após a precipitação pelo etanol, os ácidos nucleicos precipitados foram secos e resuspensos em água destilada tratada em DEPC. As estruturas secundárias dos ácidos nucleicos foram destruídas por aquecimento a 65°C, durante 10 min. e as amostras foram imediatamente arrefecidas em gelo. 0 cDNA foi sintetizado, usando 1 a 3 microgramas do RNA total do figado do chimpanzé ou dos ácidos nucleicos (ou RNA), extraidos de 10 a 100 microlitros de plasma. Na sintese foi usada a transcriptase reversa, e a reacção efectuou-se num volume de 25 microlitro, usando o protocolo especificado pelos fabricante, BRL. Os primers para a sintese do cDNA foram aqueles que também foram utilizados na reacção do PCR, descrita abaixo. Todas as misturas reaccionais para a sintese do cDNA continham 23 unidades de inibidor da RNAase, RNASIN (Fisher/Promega). Após a sintese do cDNA, as misturas reaccionais foram diluidas com água, fervidas durante 10 min. e rapidamente arrefecidas em gelo.

As reacções do PCR foram efectuadas, essencialmente, de acordo com as instruções do fabricante (Cetus-Perkin-Elmer), excepto no que respeita à adição de 1 micrograma de RNase A . As reacções foram realizadas num volume final de 100 microlitros. O PCR foi efectuado em 35 ciclos, utilizando um regime de 37°C (2

108 min.), 72°C (3 min.) e 94°C (1 min.).

Os primers para sintese do cDNA e para as reacções do PCR eram derivados das sequências de cDNA do HCV num dos clones 81, 36 ou clone 37b. (As sequências de cDNA do HCV dos clones 81, 36 e 37b são apresentadas nas Figs. 22, 23 e 24, respectivamente). As sequências dos dois primers de 16-mer, derivadas do clone 81, eram :

5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3' e

5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3'

A sequência do primer do clone 36 era :

5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.

A sequência do primer do clone 37b era:

^r ACA ATA CGT GTG TCA C 3'.

Nas reacções do PCR, os pares de primers derivam, alternativamente, do clone 81, tendo ambos 16-mer, do clone 36, tendo ambos 16-mer ou do clone 37b, tendo ambos 16-mer.

Os produtos da reacção do PCR foram analisados por separação dos produtos por electroforese, em gel alcalino, seguida de Southern blot, e detecçâo das sequências de cDNA do

HCV, amplificadas com uma sonda oligonucleotidica interna, 32 marcada com P, derivada de uma região do cDNA do HCV, que não coincide com os primers. As misturas reaccionais do PCR foram extraídas com fenol/clorofórmio e os ácidos nucleicos precipitados da fase aquosa com sal e etanol. Os ácidos nucleicos

109

J precipitados foram recolhidos por centrifugação e dissolvidos em água destilada. Aliquotas das amostras foram sujeitas a electroforese, em gel de agarose alcalino, 1,8%. Cadeias simples de DNA de 60, 108 e 161 nucleótidos de comprimento foram, simultaneamente, sujeitas a electroforese em gel, como marcadores de peso molecular. Após a electroforese, os DNAs do gel foram TM transferidos para o papel Sonda Zeta Biorad . A pré-hibridaçâo, a hibridação e as condições de lavagem foram as especificadas pelo fabricante (Biorad).

As sondas usadas para a hibridação-deteccção de sequências de cDNA do HCV amplificadas foram as seguintes: Quando o par de primers do PCR era derivado do clone 81, a sonda era de 108-mer, com uma sequência correspondente àquela que se localiza na região entre as sequências dos dois primers. Quando o par de primers do PCR era derivado dos clones 36 e 37b, a sonda era a inserção de cDNA do HCV, sujeita a corte e translação, derivada do clone 35, cuja sequência nucleotidica é a apresentada na Fig. 34. Os primers são derivados dos nucleótidos 155-170 da inserção do clone 37b e 206-268 da inserção do clone 36. A extremidade 3' da inserção do cDNA do HCV no clone 35 coincide com os nucleótidos 1-186 da inserção no clone 36; e a extremidade 5' da inserção do clone 35 coincide com os nucleótidos 207-269 da inserção no clone 37b (comparar Figs. 23, 34 e 24). Assim, a inserção do cDNA no clone 35 abrange parte da região entre as sequências dos primers derivadas dos clones 36 e 37b e é útil como sonda para sequências amplificadas, que incluem estes primers.

As análises do RNA dos espécimes de figado foram feitas

110 de acordo com o procedimento descrito acima, utilizando ambos os conjuntos de primers e sondas. 0 RNA do figado de 3 chimpanzés com NANBH apresentou resultados positivos de hibridação para sequências de amplificação do tamanho esperado (161 e 586 nucleótidos para 81, 36 e 37b, respectivamente), enquanto os chimpanzés de controle apresentaram resultados negativos de hibridação. Os mesmos resultados foram conseguidos quando a experiência foi repetida três vezes. Análises dos ácidos nucleicos e RNA do plasma estavam também de acordo com o procedimento acima descrito, utilizando primers e sondas do clone 81. Os plasmas eram de dois chimpanzés com NANBH, de um chimpanzé de controle, e de uma pool de plasmas de chimpanzés de controle. Ambos os plasmas da NANBH continham ácidos nucleicos/RNA, que apresentavam resultados positivos no ensaio amplificado do PCR, enquanto ambos os plasmas de controle apresentavam resultados negativos. Estes resultados têm sido, repetidamente, obtidos várias vezes.

Tem-se verificado que ocorrem viroses defectivas em viroses de RNA. Usando a tecnologia do PCR, é possível delinear primers para amplificar sequências do genoma do HCV. Através de análises dos produtos amplificados, espera-se ser-se capaz de identificar ambas as versões defectivas do genoma virai, assim como espécies virais de tipo selvagem. De acordo com o que foi referido, usando dois primers baseados em sequências conhecidas de HCV, pode prever-se, com bastante precisão, o tamanho esperado do produto do PCR. Qualquer espécie maior, observada por electroforese em gel e análises de hibridação, pode representar um potencial genoma variante. Alternativamente, qualquer espécie

111 menor, observada deste modo, pode representar agentes defectivos. Análises destes tipos seriam úteis na confirmação da origem exacta da sequência de HCV conhecida, se se trata, de facto, de uma sequência virai selvagem ou de um genoma defectivo. Técnicas e métodos para estas análises são bem conhecidos dos especialistas que trabalham nestes asuntos e foram previamente descritas. Esta metodologia vai permitir a um especialista na técnica obter formas relacionadas (tipo selvagem ou defectivos) do genoma virai.

DETECÇÃO de SEQUÊNCIAS em PARTÍCULAS CAPTURADAS que,

QUANDO AMPLIFICADAS pelo PCR, HIBRIDAM com o cDNA do

HCV DERIVADO do CLONE 81

RNA, em partículas capturadas, foi obtido como se descreve abaixo. As análises para sequências que se hibridam com o cDNA do HCV, derivado do clone 81, foram efectuadas utilizando a técnica da amplificação pelo PCR, como se descreve acima, exceptuando o facto de a sonda de hibridação ser uma sequência oligonucleotidica tratada com quinases, derivada da sequência do cDNA do clone 81. Os resultados mostraram que as sequências amplificadas se hibridavam com a sonda do cDNA do HCV.

Foram capturadas partículas de plasmas de chimpanzés infectados pelo HCV, usando esferas de poliestireno revestidas com um anticorpo imunopurificado, dirigido contra o polipéptido codificado no clone 5-1-1. A técnica para a produção do anticorpo imunopurifiçado está descrita na Publicação E.P.O. No. 318.216, que é comumente pertença do cessionário, e que está aqui incorporada por referência. Resumidamente, o polipétido do HCV,

112

codificado no clone 5-1-1, foi expresso como um polipêtido de fusão com a superóxido dismutase (SOD). Isto foi conseguido por subclonagem da inserção de cDNA do clone 5-1-1, no vector de expressão pSODcfl (Steimer et al. (1986)). 0 DNA isolado do pSODcfl foi tratado com BamHI e EcoRI, e o seguinte ligando foi ligado ao DNA linear criado pelas enzimas de restrição:

5'GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA

CCT TAA GAC TAT TTT AA 3'

Após a clonagem, o plasmídeo contendo a inserção foi isolado, e restringido com a EcoRI. A inserção do cDNA do HCV, no clone 5-1-1, foi retirada com a EcoRI e ligada ao plasmideo DNA linearizado EcoRI. A mistura do DNA foi utilizada para transformar a estirpe D1210 da E. Coli (Sadler et al. (1980)). Recombinantes com o cDNA do 5-1-1 na orientação correcta para expressão da ORF, foram identificadas por mapas de restrição e sequenciaçâo de nucleótidos. Bactérias recombinantes de um clone foram induzidas a expressar o polipéptido SOD - ΝΑΝΒ5_ι_χ, por cultura de bactérias na presença de IPTG. 0 polipéptido de fusão foi purificado da E. coli recombinante, por extracção diferencial dos extractos celulares com ureia, seguida de cromatografia em colunas trocadoras de aniões e catiões. O polipéptido S0D-NANB5_ purificado foi preso a uma membrana de nitrocelulose. O anticorpo, em amostras de soro infectado pelo HCV, foi absorvido à matriz de ligação do polipéptido. Após lavagem para remover materiais não especificamente ligados e materiais não ligados, o anticorpo ligado era libertado do polipéptido ligado.

MÉTODO do cPCR para DETECTAR RNA do HCV no FÍGADO

113

Q· no SORO de INDIVÍDUOS com NANBH

A confiança e utilidade de uma forma modificada do ensaio do PCR, i.e., um ensaio cPCR, para detecçâo de infecções pelo HCV, foi determinado efectuando o ensaio no RNA total do figado e no soro de indivíduos infectados. No ensaio do cPCR, o suposto RNA virai da amostra é sujeito a transcrição reversa em cDNA com a transcriptase reversa; um segmento do cDNA resultante é então amplificado utilizando uma versão modificada da técnica do PCR descrita por Saiki et al.(1986). Os primers para a técnica do cPCR são derivados do RNA do HCV, que pode ser identificado pela familia dos cDNAs do HCV aqui fornecidos. 0 produto amplificado que corresponde ao HCV-RNA é detectado utilizando uma sonda derivada da familia de cDNAs do HCV aqui fornecida.

	0 ensaio do cPCR/HCV, utilizado nestes estudos,	foi
realizado	utilizando os seguintes métodos para a preparação	do
RNA, a	transcrição reversa do RNA em cDNA, a amplificação	dos
segmentos	específicos do cDNA pelo PCR, e as análises	dos

produtos do PCR.

RNA foi extraido do figado utilizando o método do isotiocianato de guanidina, para preparação do RNA total, descrito em Maniatis et al. (1982).

Com vista ao isolamento do RNA total do plasma, o plasma foi diluido 5 a 10 vezes com TENB (NaCl 0,1 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, e EDTA 1 mM), e incubado nesta solução de proteinase K/SDS (SDS 0,5%, 1 mg/ml de proteinase K, transportador de poli A 20 microgramas/ml), durante 60 a 90 min, a 37°C. A amostra foi extraida uma vez com fenol (pH 6,5), a fase orgânica resultante

114

foi re-extraida uma vez com TENB, contendo 0,1% SDS, e das fases aquosas, de ambas as extracções, fez-se uma pool que se extraiu duas vezes com um volume igual de fenol/CHCl3/álcool isoamilico [1:1(99:1)]. As fases aquosas resultantes foram extraídas duas vezes com um volume igual de CHCl3/álcool isoamilico (99:1), e precipitadas pelo etanol usando acetato de sódio 0,2 M, pH 6,5, e 2,5 volumes de etanol a 100%; a precipitação ocorreu durante a noite, a -20°C.

O cDNA, usado como molde para a reacção do PCR, foi preparado utilizando as amostras designadas para preparação dos correspondentes cDNAs. Cada amostra de RNA (contendo 2 microgramas do RNA total de figado de chimpanzé, desnaturado pelo calor, ou RNA de 2 microlitros de plasma ou 10% do RNA extraido de uma biópsia cilíndrica de figado humano, de 10 mm x 4 mm) foi incubada num volume reaccional de 25 microlitros contendo cada primer, numa concentração de um micromolar, cada desoxiribonucleótido trifosfato (dNTP) numa concentração de 1 milimolar, Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, MgCl2 5 milimolar, ditiotreitol (DTT) 5 milimolar, KC1 73 mM, inibidor RNase (RNASIN) 40 unidades, transcriptase reversa AMV 5 unidades. A incubação fez-se durante 60 min., a 37°C. Após a sintese do cDNA, as reacções foram diluidas com 50 microlitros de água desionizada (DIW), fervida durante 10 min. e arrefecida em gelo.

A amplificação de um segmento do cDNA do HCV foi realizada utilizando como primers dois oligómeros sintéticos de 16-mer, cujas sequências eram derivadas dos clones do cDNA do HCV 36 (anti-sentido) e 37b (sentido). A sequência do primer do clone 36 era:

115

5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'.

A sequência do primer do clone 37b era:

5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'

Os primers foram usados na concentração final de 1 micromolar cada. Com vista à amplificação do segmento do cDNA do HCV, que é flanqueado pelos primers, as amostras de cDNA foram incubadas com 0,1 microgramas de RNAase A e os reagentes do PCR eram do kit da Perkin Elmer Cetus (N801-0043 ou N801-0055), de acordo com as instruções do fabricante. A reacção do PCR foi efectuada em 30 ciclos ou 60 ciclos, num ciclizador térmico de DNA da Perkin Elmer Cetus. Cada ciclo consistia num passo de desnaturação de 1 min., a 94°C, um passo de emparelhamento de 2 min., a 37°C e um passo de extensão de 3 min., a 72°C. No entanto, o passo de extensão no ciclo final (30 ou 60) foi de 7 min. em vez de 3 min. . Após a amplificação, as amostras foram extraídas com um volume igual de fenol: clorofórmio (1:1), seguida de extracção com um volume igual de clorofórmio, após o que as amostras foram precipitadas com etanol, contendo acetato de sódio 0,2 M.

Os produtos do cPCR foram analizados como se segue. Os produtos foram sujeitos a electroforese em gel de agarose alcalino 1,8%, de acordo com Muracawa et al. (1988), e tranferidos para papel Sonda Zeta (BioRad Corp.), por transferência dos geles durante a noite em NaOH 0,4 M. As transferências foram neutralizadas em 2 x SSC (1 x SSC, contendo NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M), pré-hibridadas em NaCl 0,3 M, tampão de fosfato de sódio 15 mM,pH 6,8, EDTA 15 mM, SDS 1,0%, leite magro 0,5% (Carnation Co.), DNA de esperma de salmão

116

desnaturado e sonicado 0,5 mg/ml. As transferências a analizar para os fragmentos de cDNA do HCV foram hibridadas com uma sonda 32 marcada com P, gerada por corte e translação da sequência de inserção de cDNA do HCV, no clone 35, descrita na Publicação E.P.O. No. 318.216. Após hibridaçâo, as transferências foram lavadas em 0,1 x SSC (1 x SSC contém NaCl 0,15 M, citrato de Na

0,01 M), a 65°C, secas e auto-radiografadas. A dimensão esperada dos produtos é de 586 nucleótidos de comprimento; produtos que se hibridaram com a sonda e migraram nos geles, na zona correspondente a estas dimensões, foram tomados como positivos para o RNA virai.

Como controle, foi efectuado o ensaio do cPCR com os primers estabelecidos para amplificar o mRNA para a alfa-1 antitripsina, para verificar a presença de RNA em cada amostra analizada. A região do gene, que codifica para a alfa-1 antitripsina, está descrita em Rosenberg et al. (1984). Primers oligoméricos sintéticos de 16-mer, concebidos para amplificar um fragmento de 365 nucleótidos, da região do gene que codifica para a alfa-1 antitripsina, derivaram dos nucleótidos 22-37 (sentido) e nucleótidos 372-387 (anti-sentido). Os produtos do PCR foram detectados, usando uma sonda sujeita a corte e translação e 32 marcada com P, que se situa no meio, e não incluindo as sequências do primer do cDNA/PCR.

Devido à extrema sensibilidade da reacção do PCR, todas as amostras foram sujeitas a ela um minimo de três vezes. Todos os sinais de falsos positivos foram eliminados quando se tomaram as seguintes precauções: 1) Eliminação dos aerossois através da utilização de tubos de atarrachar tapados, com selos de borracha

117

TM na forma de aneis em O; 2) Pipetagem com pipetas Ranin Microman de lançamento positivo com pontas/capilares disponíveis; e 3) Seleccionar a sequência oligonucleotidica para o cDNA e para os primers PCR a partir de dois clones não contíguos de cDNA.

DETECÇÂO do RNA do HCV em AMOSTRAS de FÍGADO por um

MÉTODO de cPCR ensaio do cPCR foi realizado no RNA total isolado do figado de três chimpanzés, experimentalmente infectados com um agente da NANBH e de biópsias de figado de doentes italianos cujo diagnóstico era de uma NANBH crónica.

A Fig.25 A mostra os resultados do ensaio do cPCR usando 1 micrograma de cada preparação do RNA total do figado. 0 RNA foi isolado de amostras de figado de um chimpanzé na fase crónica da NANBH (910) (coluna 1), dois chimpanzés na fase aguda da infecçâo (1028 e 508) (colunas 2 e 3, respectivamente). 0 PCR foi efectuado nas amostras das colunas 1-3 em 30 ciclos, e o auto-radiograma da transferência contendo essas colunas foi exposto por 5 horas. O cDNA de 1 micrograma do RNA total do animal 1028, com uma infecçâo aguda (coluna 4), e os três chimpanzés não infectados (colunas 5-7), foram amplificados em 60 ciclos, e os auto-radiogramas contendo essas colunas foram expostos durante 7 dias. O DNA do pBR322 digerido pela MspI

32, marcado com serviu como marcador em todos os autoradiogramas. Pode observar-se pelos resultados que o cDNA correspondente ao RNA do HCV foi visto apenas nas amostras de chimpanzés com NANBH, fosse ela aguda ou crónica (colunas 1, 3 e 4). Os produtos do cPCR nestas colunas, migraram entre os

118

fragmentos marcadores de 527 e 622 nucleótidos (não apresentados).

A Fig. 25B mostra os resultados do ensaio do cPCR utilizando 10% do RNA , extraido de uma biópsia de figado cilindrica de 10 mm x 4 mm, de 15 pacientes com NANBH crónica (colunas 1-15), de um paciente com uma doença de figado criptogénica (coluna 16), e de uma amostra controle de um paciente com hepatite B crónica (coluna 17). A amplificação pelo PCR fez-se em 30 ciclos e os auto-radiogramas das transferências foram expostos durante 4 dias, excepto no que se refere à coluna 1, para a qual a exposição foi de 15 horas. Como se pode ver pelos resultados, 9/15 (60%) das amostras humanas foram positivas para o RNA do HCV (colunas 1, 2, 4, 6, 7, 10-13). Um paciente diagnosticado com uma doença de figado criptogénica (coluna 16), e um paciente com infecçâo crónica pelo HBV (coluna 17) foram repetidamente negativos no ensaio do cPCR.

COMPARAÇAO do ENSAIO cPCR/HCV em BIOPSIAS de FIGADO

HUMANO e RIA do SORO, USANDO o POLIPEPTIDO C100-3 do

HCV polipéptido SOD/HCV C100-3 (também chamado C100) é um polipéptido recombinante de fusão que contém 363 aminoácidos virais. 0 polipéptido é útil na detecção de anticorpos do HCV (ver Kuo et al. (1989)). o método para preparação do C100 está descrito na Publicação E.P.O. No. 318.216.

Um ensaio radioimune, usando o C100, foi efectuado no soro recolhido dos mesmos 17 pacientes humanos cujas amostras de figado foram submetidas ao ensaio do cPCR/HCV, como se

119 fcc descreve acima. A colheita do soro efectuou-se no mesmo dia em que se colheu as biópsias de figado. 0 ensaio foi efectuado, essencialmente, como se descreve na Publicação E.P.O. No.

318.216, que é comumemente propriedade da cessionària e está incorporada no presente texto para referência. Resumidamente, placas de Microtitulaçâo (Immulon 2, tiras de cúpulas destacáveis) foram revestidas com 0,1 microgramas do C100 purificado. As placas revestidas furam incubadas durante 1 hora a

37°C com a amostra do soro (100 microlitros de uma diluição de

1:100) ou controles apropriados. Após a incubação, o material não ligado foi removido, as placas foram lavadas, e complexos de anticorpo humano-ClOO foram detectados por incubação com anti125 imunoglobulina humana de carneiro marcada com I. O anticorpo marcado, não ligado, foi removido por aspiração e as placas foram lavadas. Foi determinada a radioactividade em cúpulas individuais.

Os resultados do RIA mostram que 67% destas amostras foram positivas para os anticorpos anti-ClOO. O soro do paciente, diagnosticado com uma doença de figado criptogénica, foi positivo para os anticorpos anti-ClOO, embora os niveis de RNA virai fossem indetectáveis no figado do paciente nesta amostra. O nivel de correlação entre a presença de anticorpos anti-ClOO e o RNA do HCV foi de 70%; dois pacientes, que foram negativos para os anticorpos por RIA, tinham niveis significativos de RNA do HCV nos seus figados (dados não apresentados).

Os resultados indicam que o virus está frequentemente presente no figado de pacientes com anticorpos anti-ClOO circulantes, confirma a pretençâo de que a presença de anticorpos

120 anti-ClOO reflecte com precisão a exposição ao HCV. Além disso, no conjunto, estes resultados indicam que o HCV deste tipo concorre em pelo menos 75% para a NANBH dos pacientes deste estudo, a estirpe predominante do HCV na Itália parece estar bastante relacionada com a estirpe de HCV prevalente nos Estados Unidos.

ENSAIO do cPCR/HCV no SORO: DETECÇAO do RNA VIRAL na

FASE AGUDA da INFECÇÂO em CHIMPANZÉS

A relação temporal entre o aparecimento de danos hepáticos, a presença do RNA do HCV, e a presença de anticorpos anti-HCV, foi monitorizada no soro de dois chimpanzés, experimentalmente infectados com NANBH (nos 771 e 910). Os danos hepáticos foram determinados pelos niveis de alanina amino transferase (ALT); a presença de RNA do HCV foi determinada pelo ensaio do cPCR para o HCV descrito acima; anticorpos anti-HCV foram detectados, utilizando o método de RIA C100.

A análise do cPCR/HCV foi realizada no RNA extraido de 1 microlitro de plasma de chimpanzé. 0 soro foi colhido do chimpanzé 771, aos dias 25, 32, 70 e 88 post-infecçâo; o cPCR foi efectuado em 30 ciclos e o auto-radiograma foi exposto durante 18 dias. O soro foi colhido do chimpanzé 910 aos dias 11, 28 e 67 post-infecção; o cPCR foi efectuado em 60 ciclos, e o autoradiograma foi exposto durante 5 dias.

Os resultados dos ensaios são apresentados na Fig. 26A para o chimpanzé 771, e na Fig. 26B para o chimpanzé 910. Fazendo uma comparação das Figs. 26A e 26B, parece surgir, bastante cedo, durante a hepatite aguda, um pico bem definido de valores de ALT,

121 que se relacionam com a presença de RNA virai, no individuo infectado.

Os dados também indicam que a presença do RNA do HCV, que é indicativa de um estado de virémia, precede a presença de anticorpos anti-HCV. 0 chimpanzé 771 (Fig. 26A) apresentou um episódio agudo, claramente definido, de NANBH post-transfusão, aos 28 dias, também caracterizado por um pico inicial dos niveis de ALT. 0 RNA do HCV foi detectado no soro colhido ao 25o e 32o dias. No entanto, durante esta fase aguda, anticorpos anti-HCV estavam ausentes. Em contraste, ao 70o dia, o RNA do HCV estava abaixo do nivel experimental de detecção e os anticorpos anti-HCV estavam a aumentar. Ao 88o dia, o RNA do HCV permanecia indetectável, enquanto os anticorpos anti-HCV estavam, significativamente, aumentados, acima do nivel verificado no 70o dia.

Os resultados obtidos a partir do soro do chimpanzé 910 eram de padrão algo semelhante, embora o tempo de indução dos anticorpos do HCV, pela infecçâo, não tivesse sido detectado durante a fase aguda da doença que se prolongou até, pelo menos, ao 67o dia; os anticorpos anti-HCV, detectados por RIA ao 11o dia, eram devidos a imunização passiva do animal 910, com anticorpos do plasma usado para inocular o animal. Os anticorpos anti-HCV foram encontrados no soro do chimpanzé 910, durante a fase crónica da infecçâo posterior (dados não apresentados).

Deve notar-se que, valores baixos de ALT no plasma de individuos com NANBH crónica, não se relacionam, necessariamente, com uma fraca produção de virus. Uma pool de 17 amostras diferentes de plasma do chimpanzé 910, após um periodo de dois

122

β anos e meio a três anos e meio post-inoculaçâo, foi monitorizado no que respeita aos níveis de ALT e à pesquisa de RNA do HCV. Os valores de ALT das amostras não excederam 45 mU/ml; no entanto, titulações efectuadas indicaram a presença de elevados titulos de HCV (3 x 10θ CID/ml). 0 cPCR foi efectuado em 30 ciclos e o auto-radiograma foi exposto durante 15 horas; as análises do cPCR mostraram, claramente, a presença de RNA virai (dados não apresentados).

ENSAIO do cPCR/HCV no SORO: DETECÇÃO do RNA VIRAL no

HOMEM, na FASE AGUDA da INFECÇAO

O plasma de um paciente humano submetido a cirurgia, colhido durante a fase inicial de NANBH aguda, foi examinado em busca de RNA do HCV e de anticorpos anti-HCV, utilizando o ensaio cPCR/HCV e RIA-C100, respectivamente. O ensaio cPCR/HCV foi conduzido utilizando 1 microlitro de plasma do paciente e de quatro controles humanos de genealogia conhecida; o cPCR foi efectuado em 30 ciclos e, após hibridação e lavagem, o auto radiograma foi exposto durante 8 horas.

Os resultados mostraram que o soro colhido do paciente submetido a cirurgia, durante a fase aguda da infecçâo, continha um nivel elevado de RNA virai e que os anticorpos anti-HCV não foram detectáveis pelo RIA-C100 (dados agora apresentados). (Sabia-se que o plasma da fase aguda do doente submetido a cirurgia tinha um titulo elevado do agente infeccioso de NANBH [10θ'5 CID/ml, como foi determinado por Feinstone et al. (1981); Feinstone et al. (1983)]. Deve notar-se, no entanto, que estes pacientes sofreram uma sero-conversâo para os anticorpos anti· 123

HCV, pelo método RIA-C100, aproximadamente 9 meses após a infecção. O soro do controle genealógico humano, do qual anteriormente se havia retirado plasma, deu resultados negativos, tanto para o ensaio do cPCR/HCV, como para o RIA-C100.

SENSIBILIDADE do ENSAIO cPCR/HCV

A sensibilidade do ensaio do cPCR/HCV foi determinada analizando dez diluições seriadas de uma pool de plasmas de titulo conhecido. 0 plasma de chimpanzé tinha um titulo de ~3 x 5

CID/ml, e o RNA foi extraído de dez diluições de 1 microlitro de plasma. O cPCR foi efectuado em 30 ciclos e, após hibridaçâo e lavagem, o auto-radiograma foi exposto durante 15 horas. Os produtos do cPCR, resultantes da amplificação de ~300, ~30 e ~3 CID dos genomas do HCV são apresentados nas colunas 1-3, respectivamente, da Fig. 29. As amostras nas colunas 1 e 2 foram detectáveis em auto-radiogramas expostos durante 2 horas.

Uma vez que se pensa que o titulo médio do HCV em indivíduos infectados se encontra aproximadamente entre 100 e 10.000 CID/ml de plasma, este dado sugere que o ensaio do cPCR/HCV pode ser clinicamente útil.

ENSAIOS do cPCR/HCV para ESTIRPES VARIANTES de HCV

Primers, consistindo num conjunto de oligómeros de 44-mers e um conjunto de oligómeros de 45-mers, foram concebidos para amplificar estirpes de HCV que são semelhantes ou idênticas ao HCV isolado, do qual a sequência de cDNA da Fig.18 é derivada. A premissa subordinada à concepção destes primers é a descoberta da requerente de que o HCV é um virus semelhante aos

124

Flavivirus. Menbros da família dos Flaviviridae, quando comparados ao HCV, têm dois conjuntos de sequências maiores de aminoácidos conservadas, TATPPG e QRRGR, na suposta região NS3 destas viroses. Vários outros conjuntos menores podem ser observados, por exemplo, GDD na região geralmente aceite NS5. Outros conjuntos são determináveis por comparação das sequências de aminoácidos conhecidas com as do HCV. Esta informação foi deduzida a partir de sequências de vários membros da familia Flaviviridae, que têm sido descritos, incluindo o virus da Encefalite Japonesa (Sumiyoshi et al. (1987)), Virus da Febre Amarela (Rice et al. (1985)), Virus Dengue Tipo 2 (Hahn et al. (1988)), Virus Dengue Tipo 4 (Mackow (1987)), e Virus do Oeste do Nilo (Castle et al. (1986)). As sequências conservadas de aminoácidos e utilização de codões estão na tabela que se segue.

Sequências Conservadas de Aminoácidos (AA) Entre Flaviviroses e o HCV

Virus	# do Primeiro A.A.	T	A	A.A. T	P	P	G
HCV	1348 5	' ACC	GCC	ACC	CCT	CCG	GCC	3'
Febre Amarela	1805	ACA	GCC	ACA	CCG	CCT	GGG
Oeste Nilo	1818	ACG	GCA	ACG	CCA	CCC	GGG
Dengue-4	1788	ACC	GCA	ACC	CCT	CCC	GGA
JEV	1957	ACA	GCG	ACC	CCG	CCT	GGA
Primer	de sentido do	HCV	(44 mer)=
			5'	ACC	GCC	ACC	CCX	CC

(X=A,T,C ou G)

125 ί

Virus	# do Primeiro A.A.	Q	A. R	A. R	G	R
HCV	1486 5'	CAA	CGT	CGG	GGC	AGG
Febre Amarela	1946	CAA	AGG	AGG	GGG	CGC
Oeste Nilo	1959	CAG	CGG	AGA	GGA	CGC
Dengue-	4 1929	CAG	AGA	AGA	GGG	CGA
JEV	1820	CAA	CGG	AGG	GGC	AGA

Primer anti-sentido do HCV (45 mer)=

3'GTX GCA GCC CCG TCC 5' (X=T ou C)

Nota: A sequência do primer foi escolhida para minimizar o número de degenerescências nucleotidicas na extremidade 3'da sequência do primer e para maximizar o número de nucleótidos na extremidade 3'de cada primer, que corresponde, exactamente, a qualquer das sequências nucleotidicas possíveis ou aos seus complementos, codificando para os aminoácidos conservados acima indicados.

Os primers oligoméricos de 44-mer e 45-mer foram estabelecidos de modo a que as sequências, codificando para estes aminoácidos, foram incorporadas no primer. Além disso, eles contêm degenerescências na extremidade 3' de cada primer e são derivados de duas regiões diferentes do genoma de HCV, que estão presentes no clone 40b (ver Fig. 28), e que são derivados da região que codifica o suposto NS3 do HCV. As fórmulas para os primers oligonucleotidicos nos conjuntos são:

5' GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC ACC GCC ACC

CCX CC 3' em que ο X pode ser: A, T, G ou C; e

5'TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC CCT GCC AGT CCT GCC CCG

ACT YTG 3' em que o Y pode ser: T ou C.

126

ensaio cPCR/HCV foi efectuado utilizando estes primers para amplificar o RNA do HCV no plasma do chimpanzé 910. O método do ensaio foi, essencialmente, como se descreve na Secção acima, excepto no que se refere aos conjuntos de primers oligoméricos de 44-mer e 45-mer terem sido substituídos pelos primers derivados dos clones 36 e 37b. Acrescenta-se ainda que a detecçâo do cDNA do HCV amplificado foi por hibridação com uma sonda derivada do clone 40a, cuja sequência estã representada na Fig. 32.

A sonda foi preparada por amplificação de um segmento do clone 40a, utilizando o método do PCR, descrito acima, e primers de 18-mer, contendo as sequências que se seguem:

5'GAG ACA TCT CAT CTT CTG 3' e

5'GAA CGT GAT TGT CTC AAT 3'

Após a amplificação, a preparação da sonda foi marcada 32 com P, por corte e translação.

A Fig. 33 mostra uma auto-radiografia de Southern blot, sondada com a sequência derivada do clone 40a. Fragmentos de DNA 32 do pBR322, digeridos pela MspI e marcados pelo P serviram de marcadores (coluna 1). As dimenções previstas dos produtos do PCR, resultantes da amplificação, usando estes primers, são de 490 nucleótidos (nt). Reacções em duplicado são apresentadas nas colunas 2 e 3.

ANALISES para VARIANTES da REGIÃO 5' do HCV

Baseados no modelo do Flavivirus, o cDNA do HCV da região 5', que é flanqueado pelas regiões representadas nos

127 clones ag30a e k9-l, codifica um segmento proteico, que é geralmente considerado como pertencente ao envelope e/ou matriz (E/M). 0 soro obtido do chimpanzé, a partir do qual foi construído o património C do cDNA do HCV, foi analizado pelo cPCR/HCV, para determinar se estavam presentes variantes dentro desta região alvo.

ensaio do cPCR/HCV foi efectuado, essencialmente, como está descrito acima, para o isolamento do clone 5'-32, excepto no que se refere aos primers e sondas usados. A Fig. 37 apresenta a relação dos primers e sondas (e os clones dos quais eles são derivados), com a região alvo do cDNA do HCV. Um conjunto de primers para o PCR, ag30al6A e K91Envl6B, era derivado dos clones ag30a e k9-l, que estão a montante e a jusante, respectivamente, da sequência alvo. A dimensão esperada para os produtos do cPCR, cujos primers são a ag30al6A e k91Envl6B, é de 1,145 kb, baseados na sequência confirmada do cDNA do HCV. Dois outros conjuntos de primers para o PCR, cobrindo a região amplificada e usando ag30al6A e k91Envl6B, e coincidentes um com o outro, foram também usados para amplificação pelo PCR do RNA do HCV no soro. Assim, neste caso, as reacções do PCR foram efectuadas usando como um conjunto de primers, o ag30al6A e o CA156el6B e, como um segundo conjunto de primers, o CA156el6A e o k91Envl6B. As dimensões esperadas dos produtos do PCR para estes pares eram 615 nucleótidos (NT) e 683 NT, respectivamente. A tabela, abaixo apresenta uma lista dos primers, o clone de onde derivam e a sequência do primer.

128

Tabela

Primer

Clone

Sequência

ag30al6A	ag30a	5'	CTC	TAT	GGC	AAT	GAG	g :
K91Envl6B	k9-l	5'	CGT	TGG	CAT	AAC	TGA	τ ;
CA156el6B	156	5'	CGA	CAA	GAA	AGA	CAG	a :
CA156el6A	156	5'	AGC	TTC	GAC	GTC	ACA	τ :
CA216al6A	216	5'	TGA	ACT	ATG	CAA	CAG	g :
CA216al6B	216	5'	GGA	GTG	TGC	AGG	ATG	g :
CA84al6A	84	5'	AAG	GTT	GCA	ATT	GCT	c .
CA84al6B	84	5'	ACT	AAC	AGG	ACC	TTC	G .
sondas para	todos os produtos	do cPCR/HCV	consistiam	em
:ções do cDNA	32 do HCV, marcadas com P,	que	foram	preparadas

por amplificação pelo PCR, de uma região do clone 216 (usando como primers o CA216al6A e o 216al6B), e do clone 84 (usando 32 como primers o CA84al6A e o CA84al6B); o P foi introduzido nos produtos do PCR, por corte e translação. Estas sondas não coincidiam com os primers usados nas reacções do cPCR/HCV.

A Fig. 38 apresenta uma auto-radiografia de uma Southern blot, na qual os produtos do cPCR/HCV foram hibridados com as sondas marcadas com P. 0 produto do cPCR/HCV de extensão dos primers ag30al6A e k91Envl6B (coluna 1) era, aproximadamente, de 1,1 kb; nenhum outro produto do PCR foi observado, num periodo de exposição de 15 horas. Os produtos do HCV de extensão dos conjuntos de primers ag30al5A/CA156el6B

3) eram.

(coluna 2) e CAl56el6A/K9lEnvl6B (Coluna aproximadamente, de 625 NT e, aproximadamente, de 700 NT, respectivamente. As dimensões dos produtos do PCR foram determinadas por comparação com a migração relativa dos

129 fragmentos resultantes da digestão do pBR322 com MspI e do PhiX 174, digeridos com HaelII (coluna 5).

estudo referido acima vai detectar inserções ou

delecções	tão pequenas, como aproximadamente, 20 NT a 50 NT,	e
rearranjos	de DNA, alterando as dimensões do DNA alvo.	Os
resultados	na Fig. 38 confirmam que existe apenas uma espécie
principal	de cDNA, derivada da região E/M do HCV no soro	do
chimpanzé.	AMPLIFICAÇAO para CLONAGEM de SEQUÊNCIAS do cDNA	do

HCV, UTILIZANDO o PCR e PRIMERS DERIVADOS de REGIÕES

CONSERVADAS de SEQUÊNCIAS GENOMICAS do FLAVIVIRUS A descoberta de que o HCV é um virus semelhante aos flavivirus, permite uma estratégia para clonar sequências de cDNA do HCV não caracteristicas, utilizando a técnica do PCR e primers derivados das regiões que codificam para sequências conservadas de aminoáeidos nas flaviviroses. Geralmente, um dos primers é derivado de uma sequência genómica definida do HCV, e outro primer, que se situa no flanco de uma região de um polinucleótido não sequenciado do HCV, é derivado de uma região conservada do genoma flavivirus. Sabe-se que os genomas do flavivirus contêm sequências conservadas dentro dos polipéptidos NS1 e E, que estão codificados na região 5'do genoma do flavivirus. Assim, para isolar sequências do cDNA, derivadas de regiões comparáveis do genoma de HCV, geralmente aceites, são estabelecidos primers situados a montante, que derivam das sequências conservadas destes polipéptidos dos flavivirus. Os primers, situados a jusante, são derivados de uma extremidade

130 situada a montante da porção conhecida do cDNA do HCV.

Devido à degenerescência do código, é provável que haja falta de correspondência entre as sondas de flavivirus e a sequência genómica do HCV correspondente. Deste modo, é usada uma estratégia similar à descrita por Lee (1988). A técnica de Lee utiliza primers oligonucleotidicos mistos, complementares aos produtos de tradução reversa de uma sequência de aminoácidos; as sequências nos primers mistos têm em conta todos os codões de degenerescência para a sequência conservada de aminoácidos.

Três conjuntos de primers mistos são gerados, baseados nas homologias de aminoácidos encontradas em várias flaviviroses, incluindo Dengue-2, 4 (D-2,4), virus da Encefalite Japonesa (JEV), Febre Amarela (YF) e virus Oeste do Nilo (WN) . A mistura de primers, derivada da sequência conservada mais a montante (5'-l), é baseada na sequência de aminoácidos gly-trpgly, que é parte da sequência conservada asp-arg-gly-trp-glyaspN, encontrada na proteína E do D-2, JEV, YF e WN. A seguinte mistura de primers (5'-2) é baseada numa sequência conservada a jusante na proteína E, phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-aspser-tyr-ileu, e é derivada da phe-gly-asp; a sequência conservada está presente no D-2, JEV, YF e WN. A terceira mistura de primers (5'-3) baseia-se na sequência de aminoácidos arg-sercys, que é parte da sequência conservada Cys-Cys-arg-ser-cys na proteína NS1 do D-2, D-4, JEV, YF e WN. Os primers individuais que formam a mistura em 5'-3 são apresentados na Fig. 53. Para além das variadas sequências, derivadas de regiões conservadas, cada primer, em cada mistura, também contém uma região constante na extremidade 5', que conntém uma sequência que

131

codifica para sites de enzimas de restrição, HindIII, Mbol e

EcoRI.

primer a jusante, ssc5h20A, é derivado de uma sequência nucleotidica no clone 5h que contém o cDNA do HCV, com sequências coincidentes com as dos clones 14i e 11b. A sequência do ssc5h20A é:

5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3’.

Um primer alternativo, ssc5h34A, pode também ser usado. Este primer é derivado de uma sequência, no clone 5h e, em adição, contém nucleótidos na extremidade 5', que criam um site para uma enzima de restrição, facilitando assim a clonagem. A sequência do ssc5h34A é:

5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3'

A reacção do PCR, que foi inicialmente descrita por Saiki et al. (1986), é levada a cabo, essencialmente, como está descrito em Lee et al. (1988), exceptuando o facto de o molde para o cDNA ser o RNA isolado do figado de chimpanzés infectados pelo HCV, ou de partículas virais isoladas do soro de chimpanzés infectados pelo HCV. Além disso as condições de emparelhamento são menos severas no primeiro conjunto de amplificações (NaCl 0,6 M e 25°C), uma vez que a parte do primer que vai emparelhar com a sequência do HCV é de apenas 9 nucleótidos, e pode haver falta de correspondência. Além disso, se se usar o ssc5h34A, as sequências adicionais, não derivadas do genoma de HCV, tendem a destabilizar o hibrido primer-molde. Após o primeiro conjunto de amplificações, as condições de emparelhamento podem ser mais severas (NaCl 0,066 M e 32°C - 37°C), uma vez que a sequência amplificada contém agora regiões que são complementares a, ou

132

duplicados dos primers. Além disso, os primeiros 10 ciclos de amplificação são efectuados com a enzima Klenow I sob condições apropriadas ao PCR, para essa enzima. Após estes ciclos estarem completos, as amostras são extraídas, segue-se um tratamento com a Taq polimerase, de acordo com as instruções do kit, como são fornecidas pela Cetus/Perkin-Elmer.

Após a amplificação, as sequências do cDNA do HCV amplificadas são detectadas por hibridação, usando uma sonda derivada do clone 5h. Esta sonda é derivada de sequências a montante daquelas das quais o primer é derivado, e não coincide com as sequências dos primers derivados do clone 5h. A sequência desta sonda é:

5' CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC

GTC GTG TGG CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3'.

APLICAÇAO INDUSTRIAL

Os métodos aqui descritos, assim como os oligómeros, tanto as sondas como os primers, derivados do cDNA do HCV, e os kits que os contêm, são úteis pela precisão, relativa simplicidade e determinação económica da presença do HCV em amostras biológicas, mais particularmente no sangue, que pode ser usado para transfusões, e em indivíduos suspeitos de terem uma infecçâo pelo HCV. Além disso, estes métodos e oligómeros, podem ser mais úteis para detectar um estádio inicial da infecçâo pelo HCV, do que os ensaios imunológicos baseados na utilização de polipéptidos recombinantes do HCV. Também, um ensaio de hibridação de polinucleótidos amplificados, detecta o RNA do HCV em amostras ocasionais, que são anticorpos anti-HCV negativos.

133 *<<Assim, as sondas e primers aqui descritas podem ser usados em ensaios de hibridaçâo de amplificações, em conjunto com um imunoensaio baseado nos polipéptidos de HCV, para identificação mais completa de infecções devidas ao HCV e espécimes biológicos, infectados pelo HCV, incluindo o sangue.

A informação fornecida no presente texto permite o criação de primers e/ou sondas que são derivados de regiões conservadas do genoma do HCV. 0 fornecimento destes primers e sondas torna disponível um método geral que vai detectar estirpes variantes do HCV, e que vai poder ser usado no despiste do sangue e dos produtos sanguíneos.

Se os primers usados no método são derivados de regiões conservadas do genoma de HCV, o método deve ajudar na detecção e/ou identificação de estirpes variantes do HCV. Isto, por outro lado, deve conduzir ao desenvolvimento de reagentes imunológicos adicionais, para a detecção e diagnóstico do HCV, assim como ao desenvolvimento de reagentes polinucleotidicos adicionais para detecção e/ou tratamento do HCV.

Para além disto, conjuntos de primers e sondas, criados a partir da sequência conservada de aminoáeidos de Flaviviroses e HCV, permite um método de detecção universal, para estes agentes infecciosos.

A lista de materiais que se segue está depositada sob os termos do Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection (ATCC), 12.301, Dr. Parklawn, Rockville, Maryland 20.852 e foram-lhes atribuídos os seguintes Números de Acesso.

134 «ίΓ-

Lambda-gtll	ATCC No	Data do Depósito
património do cDNA do HCV	40.394	01 Dez. 1987
clone 81	40.388	17 Nov. 1987
clone 91	40.389	17 Nov. 1987
clone 1-2	40.390	17 Nov. 1987
clone 5-1-1	40.391	18 Nov. 1987
clone 12f	40.514	10 Nov. 1988
clone 35f	40.511	10 Nov. 1988
clone 15e	40.513	10 Nov. 1988
clone K9-1	40.512	10 Nov. 1988
JSC 308	20.879	05 Maio 1988
pS356	67.683	29 Abr. 1988

Além destes, os depósitos seguintes foram efectuados a 11 de Maio de 1989.

Estirpe ________Ligandos_ATCC No

D1210 (Cfl/5-1-1)	EF	67.967
D1210 (Cfl/81)	EF	67.968
D1210 (Cfl/CA74a)	EF	67.969
D1210 (Cfl/35f)	AB	67.970
D1210 (Cfl/279a)	EF	67.971
D1210 (CÍ1/C36)	CD	67.972
D1210 (Cfl/13i)	AB	67.973
D1210 (Cfl/C33b)	EF	67.974
D1210 (Cfl/CA290a)	AB	67.975
HB101 (AB24/C100 #3R)		67.976

As seguintes derivativas da estirpe D1210 foram depositadas em 03 de Maio de 1989.

135

Derivativas das Estirpes	ATCC No
pCFlCS/C8f	67.956
pCFlAB/Cl2f	67.952
pCFlEF/14c	67.949
pCFlEF/15e	67.954
pCFlAB/C25c	67.958
pCFlEF/C33c	67.953
pCFlEF/C33f	67.950
pCflCD/33g	67.951
pCFlCD/C39c	67.955
pCFlEF/C40b	67.957
pCFlEF/CA167b	67.959

As seguintes estirpes form depositadas em 12 de Maio de 1989.

Estirpe	ATCC No
Lambda gtll(C35)	40.603
Lambda gtlO(beta-5a)	40.602
D1210 (C40b)	67.980
D1210 (M16)	67.981

Os materiais biológicos seguintes foram depositados em 23 de Março de 1990.

Material	ATCC No
5' -clone32 (em pUC18S)	68.276

136

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- Um método de preparação de um oligómero capaz de hibridar com uma sequência de HCV, numa cadeia polinucleotidica de análise, caracterizado pelo facto de compreender a preparação do oligómero constituído por uma sequência de direccionamento para o HCV, complementar de, pelo menos, 4 nucleótidos contíguos do cDNA de HCV, representados na figura I, sendo a preparação feita através de métodos conhecidos no ramo.

2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o oligómero preparado ser constituído por nucleótidos que são complementares a nucleótidos escolhidos a partir dos seguintes nucleótidos do cDNA de HCV, representados na Figura 1 (nn_x - nn-y indica do número de nucleótido x ao número de

137

Figura 1 (nn_x - nn_y indica do número de nucleótido x ao número de nucleótido y):

ⁿⁿ-340 ** ⁿⁿ-330 ⁿⁿ-310 — ⁿⁿ-300 ⁿⁿ-280 - ⁿⁿ-270 ⁿⁿ-250 - ⁿⁿ-240 ⁿⁿ-220 — ⁿⁿ-210 ⁿⁿ-190 -* ⁿⁿ-180 ⁿⁿ-160 — ⁿⁿ-150 ⁿⁿ-130 * ⁿⁿ-120 ⁿⁿ-ioo - ⁿⁿ-90'

ⁿⁿ-330 ^nri-320' ⁿⁿ-300 - ⁿⁿ-290^? ⁿⁿ-270 - ⁿⁿ-260' ⁿⁿ-240 ⁿⁿ-230^? ⁿⁿ-210 - ⁿⁿ-200^; ⁿⁿ-180 - ⁿⁿ-170^; ⁿⁿ-150 - ⁿⁿ-140^; ⁿⁿ-120 ⁿⁿ-l10^; ⁿ-90 nn ^l-80' ⁿⁿ

ⁿⁿ-320 w ⁿⁿ-310 ⁿⁿ-290 — ⁿⁿ-28Q ⁿⁿ-260 - ⁿⁿ-250 ⁿⁿ-230 ⁿⁿ-220 ⁿⁿ-2 00 ⁿⁿ-190 ⁿⁿ-170 — ⁿⁿ~160 ⁿⁿ-140 - ⁿⁿ-130 ⁿⁿ-l10 — ⁿⁿ-ioo 80 ⁿⁿ 70^!

ⁿⁿ-70 - ⁿⁿ-60^; ⁿⁿ-60 “ ⁿⁿ-50^; ⁿⁿ-50 ⁿⁿ-40' ⁿⁿ-40 ⁿⁿ-30' ⁿⁿ-30 “ ⁿⁿ-20' ⁿⁿ-20 ~ ⁿⁿ-10^; ⁿⁿ-10 - nn^; nn 1 ⁿⁿ10^{; nn}10 - nn₂₀; ηη_2θ - ηη_3θ? ⁿⁿ30 ‘ ηη_4θ; nn '40 ’ nn_5Q; nn_5Q - ⁿⁿ60^; ⁿⁿ60 ⁿⁿ70^? nn_7Q - ηηθθ; nn '80 ⁿⁿ90' nn_9Q ⁿⁿlQ0 ; ηη_10θ - nn_11Q; ⁿⁿ110 ⁿⁿ120^; ⁿⁿ120 - nn₁₃₀; ⁿⁿ130 ⁿⁿ140^? ⁿⁿ140 nn₁₅₀? ⁿⁿ150 ⁿⁿ160^? ⁿⁿ160 ⁿⁿ170^? ⁿⁿ170 ⁿⁿ180^; ⁿⁿ18Q ⁿⁿL90^? ⁿⁿ190 ⁿⁿ200^; ⁿⁿ200 ’ ⁿⁿ2l0^; ⁿⁿ210 ⁿⁿ220^; ⁿⁿ220 ⁿⁿ230' ⁿⁿ230 - nn_24Q; ⁿⁿ240 ^n,1250^; ⁿⁿ250 ⁿⁿ260^; ⁿⁿ260 - ηη_27θ; ⁿⁿ270 ⁿⁿ280^; ⁿⁿ280 ⁿⁿ290^; nn29o - nn3O0; nn3oo - ⁿⁿ310? ⁿⁿ310 ~ nn320?

138

^ηη320 ·* ^ηη33Ο⁷ ^ηη330 — ^ηη340^; ^ηη340 ^ηη350^; ^ηη35Ο - ^ηη360' ^ηη360 — ^ηη3 7 0⁷ ^ηη370 — ^ηη380⁷ ^ηη380 - ^ηη390^? ^ηη390 — ^ηη400^? ^ηη400 — ^ηη410^; ^ηη410 - ηη₄₂₀; ^ηη420 - ^ηη4 30⁷ ^ηη430 — ^ηη440' ^ηη44Ο πη_45θ; ^ηη450 - ^ηη4 60⁷ ^ηη460 ^ηη4 7 0⁷ ^ηη470 - ^ηη4 80⁷ ^ηη48Ο *· ηη_49θ; ^ηη490 ·· ^ηη500⁷ ^ηη500 - ^ηη5ΐο'· ^ηη510 — ^ηη5 2 0⁷ ^ηη520 — ^ηη530⁷ ^ηη530 - ^ηη540^? ^Πη540 - ^ηη550^; ^ηη550 — ^ηη56Ο⁷ ^ηη560 - ^ηη57Ο⁷ ^ηη570 - ^ηη5 8 0 ⁷ ^ηη580 — ^ηη59Ο⁷ ^ηη590 - ^ηη6ΟΟ⁷ ^ηη6ΟΟ - ^ηη61Ο⁷ ^ηη610 ^ηη620⁷ ^ηη620 - ^ηη6 30⁷ ^ηη630 * πη_θ4θ; ^ηη640 — ^ηη650^; ^ηη650 * ^ηη66Ο' ^ηη660 - ^ηη670⁷ ^ηη670 — ^ηη68Ο⁷ ^ηη680 - ^ηη69 0^; ^ηη6^,90 * ^ηη700 ⁷ ηη?οο - ^ηη71Ο⁷ ^ηη?ιο - ^ηη72Ο^; ^ηη720 ^ηη730^? ^ηη730 — ^ηη74 0⁷ ^ηη740 - ^ηη75Ο⁷ ^ηη750 ^ηη7 6 0 ⁷ ⁿⁿ76Q - ^ηη77Ο⁷ ^ηη7 7 0 * ^ηη780^; ^ηη780 - ^ηη790^; ^ηη790 — ^ηη800⁷ ^ηη800 - ^ηη810^; ^ηη810 — ^ηη82Ο⁷ ^ηη820 — ^ηη8 30⁷ ^ηη830 - ^ηη84Ο⁷ ^ηη840 — ^ηη850^; ^ηη850 — ^ηη860⁷ ^ηη860 ^ηη87 0⁷ ^ηη870 * ^ηη88Ο⁷ ^ηη880 — ^ηη89Ο⁷ ^ηη890 - ^ηη900' ^ηη900 ^ηη9ΐο^; ^ηη910 — ^ηη92Ο⁷ ^ηη92Ο - ^ηη9 30⁷ ^ηη93Ο - ^ηη9 4 0⁷ ^ηη940 — ^ηη950⁷ ^ηη950 - ^ηη96Ο⁷ ^ηη960 — ^ηη9 7 0⁷ ^ηη970 — ^ηη98Ο⁷ ^ηη980 - ^ηη9 9 0⁷ ^ηη9 9 0 ^ηηιοοο ^{7 ηη}1000 “ ^ηηιο

^ηη1010 ’ ^ηη1020^{7 ηη}1020 ^ηη1030^{; ηη}1030 ^ηη1Ο4Ο^{7 ηη}1040 ^ηη1Ο5Ο^{7 ηη}1050 ” ^ηη1Ο6Ο^{7 ηη}1060 ” ^ηη1Ο7Ο^{7 ηη}1070 ^ηη1080^{; ηη}1080 ^ηη1Ο9Ο^{7 ηη}1090 ^ηη1100^{7 ηη}1100 - ^ηη1110^{; ηη}1110 ^ηη1120^{; ηη}1120 “ ^ηη1130' ^ηη1130 ^ηη114Ο^{7 ηη}1140 ^ηη1150^{? ηη}1150 ^ηη116Ο^{7 ηη}1160 ^ηη1170^{; ηη}1170 ~ ^ηη11θΟ^{; Πη}1180 ~ ^ηη1190^{1 ηη}1190 ^ηη12ΟΟ^{7 ηη}1200 ~ ^ηη1210^{? ηη}1210 ^ηη1220^{? ηη}1220 ~ ^ηη123Ο' ^ηη123Ο ~ ^ηη1240^{; ηη}1240 ” ^ηηΐ25Ο^{? ηη}1250 ^ηη1260^{? ηη}1260 ~ ^ηη1270^{; πη}1270 ^ηη1280^{; ηη}1280 ^ηη1290^{; Πη}129Ο ” ^ηη1300^{; ηΠ}1300 ’ ^ηΠΐ310' ^ηη1310 ^ηη1320^{; ηη}1320 ~ ^ηη133Ο^{; ηη}133Ο ” ^ηη134Ο^{7 ηη}1340 “ ^ηη135Ο^{; ηη}1350 ^ηη136Ο^{; ηη}136Ο ’ ^ηη137Ο^;ηη₁₃70 ^ηη1380' ^ηη1380 ~ ⁿⁿ139(U ^ηη1390 - ^ηη1400'’

139

ⁿⁿl400 *· ^ηΠ1410^; ^ηΠ1410 - ^ηΠ14 2 0' ^ηη1420 ^ηη1430' ^ηη1430 - ^ηη1440^; ^ηΠ1440 ^ηη1450⁷ ^ηη1450 - ^ηη1460⁷ ^ηη1460 - ^ηη147 0⁷ ^ηΠΐ470 - ^ηη1480 ⁷ ^ηη14 80 - ^ηη149Ο⁷ ^ηη1490 - ^ηη1500^; ^ηηΐ500 - ^ηη1510^; ^ηη1510 - ^ηη1520^; ^ηη1520 - ^ηη1530⁷ ^ηη1530 - ^ηη1540^; ^ηη1540 - ^ηη1550⁷ ^ηη1550 - ^ηη1560' ^ηη1560 - ^ηη1570^; ^ηη1570 — ^ηη1580⁷ ^ηη1580 - ^ηη159Ο⁷ ^ηη1590 — ^ηη1600' ^ηηΐ600 — ^ηη1610⁷ ^ηη1610 - ^ηη1620' ^ηΠ1620 - ^ηηΐ63Ο⁷ ^ηη1630 — ^ηη1640⁷ ^ηη1640 - ^ηη1650^? ^ηη1650 ^ηη1660^? ^ηη1660 — ^ηη1670⁷ ^ηη1670 - ^ηη1680^? ^ηη1680 - ^ηη1690^? ^ηηΐ690 - ^ηη1700' ^ηη1700 - ^ηη1710^; ^ηη1710 — ^ηη1720⁷ ^ηη1720 — ^ηη1730^; ^ηη1730 - ^ηη174Ο⁷ ^ηη1740 - ^ηη17 50⁷ ^ηη1750 — ^ηη176Ο⁷ ^ηη1760 — ^ηη17 70⁷ ^ηπ1770 ^ηη17 80' ^ηΠ1780 · ^ηη17 90⁷ ^ηη17 90 - ^ηη1800' ^ηη1800 ^ηη181Ο⁷ ^ηη1810 — ^ηη182Ο⁷ ^ηη1820 — ^ηη1830^; ^ηη1830 ^ηη184Ο⁷ ^ηη1840 ^ηη1850⁷ ^ηη1850 - ^ηη1860 ⁷ ^πη1860 - ^ηη1870⁷ ^ηη1870 — ^ηη188Ο⁷ ^ηη1880 - ^ηη18 9 0 ⁷ ^ηη1890 “· ^ηη1900^? ^ηη1900 * ^ηη191Ο⁷ ^ηηΐ910 - ^ηη192Ο⁷ ^ηη1920 ^ηη1930^; ^ηη19 30 * ^ηη1940⁷ ^ηη1940 — ^ηΠ1950^; ^ηη1950 ^ηη1960^; ^ηη1960 ^ηη1970^; ^ηΠ1970 - ^ηη1980 ⁷ ^ηηΐ980 - ^ηη1990^; ^ηηΐ990 — ^ηη2000⁷ ^ηη2000 - ^ηη2010^; ^ηη2010 — ^ηη2020' ^ηη2020 — ^ηη2030⁷ ^ηη2030 - ^ηη2Ο4Ο⁷ ^ηη2040 - ^ηη2050^; ^ηη2050 — ^ηη2060^; ^ηη2060 * ^ηη2070' ^ηη2070 - ^ηη2080⁷ ^ηη2080 — ^ηη2090⁷ ^ηη2090 - ^ηη2100' ^ηΓ12100 - ^ηη2110' ^ηη2110 - ^ηη2120⁷ ^ηη2120 - ^ηη2130⁷ ^ηη2130 - ^ηη2140⁷ ^ηη2140 «· ^ηη2150⁷ ^ηη2150 - ^ηη2160⁷ ^ηη2160 - ^ηη2170^; ^ηη2170 “ ^ηη2180⁷ ^ηη2180 - ^ηη2190⁷ ^ηη2190 ^ηη2 2 00 ⁷ ^ηη2200 - ^ηη2 210 ⁷ ^ΠΠ2210 * ^ηη2220⁷ ^ηΠ2 22 0 * ^ηη2230' ^ηη2230 — ^ηη2240⁷ ^ηη2240 - ^ηη2250⁷ ^ηη2250 — ^ηη2260^; ^ηη2260 — ^ηη2270' ^ηη2270 - ^ηη2280⁷ ^ηη2280 — ^ηη2290 ⁷ ^ηη2290 - ^ηη2300^; ^ηη2300 - ^ηη231Ο⁷ ^ηη2 310 - ^ηη2320^; ^ηη2 32 0 — ^ηη2 3 30 ⁷ ^ηη2330 - ^πη2340 ⁷ ^ηη2340 ^ηη235Ο⁷ ^Πη2350 — ^πη2360⁷ ^ηη2360 - ^ηη2 3 7 0^; ^ηη2370 - ^ηη2380^; ^ηη2380 - ^ηη2390^; ^ηη2390 - ^ηη2400' ^ηΠ2 4 00 * ^ηη241Ο^; ^ηη2410 - ^ηη2420⁷ ^ηη2420 - ^ηη2430⁷ ^ηη2430 — ^ηη2 4 4 0⁷ ^ηη2440 — ^ηη2450^? ^ηη2450 - ^ηη246 0 ? ^ηη2460 ^ηη2470 ? ^ηη2470 ^ηη24βο;

140

^ηη2480 ^ηη2490^; ^ηη2490 — ^ηη2500' ^ηη2500 Μ ^ηη2510^; ^ηη251Ο * ^ηη2520^? ^ηη2520 - ^ηη2530^; ^ηη2530 «· ^ηη2540^? ^ηη2540 — ^ηη2550^; ^ηη2550 W. ^ηη2560^; ^ηη2560 - ^ηη2570' ^ηη2570 - ^ηη2580' ^ηη2580 - ^ηη2590' ^ηη2590 ^ηη2600’ ^ηη2600 — ^ηη2610^; ^ηη2610 — ^ηη2620^; ^ηη2620 — ^ηη26 30⁷ ^ηη2630 - ^ηη2640' ^ηη2640 * ^ηη2650^; ^ηη2650 ^ηη2660' ^ηη2660 ^ηη2670^; ^ηη2670 - ^ηη2 6 8 0' ^ηη2680 — ^ηη2690⁷ ^ηη2690 - ^ηη2700' ^ηη2700 - ^ηη2710^? ^ηη2710 - ^ηη2 7 20^; ^ηη2720 ^ηη2 7 30' ^ηη2730 - ^ηη2740^; ^ηη2740 — ^ηη2750⁷ ^ηη2750 - ^ηη2760' ^ηη2760 - ^ηη2770' ^^2770 ^ηη2780^; ^ηη2780 - ^ηη2 7 90' ^ηη2790 - ^ηη2800^; ^ηη2800 - ^ηη2810⁷ ^ηη2810 - ^ηη2820' ^ηη2820 — ^ηη2830' ^ηη2830 — ^ηη2840' ^ηη2840 - ^ηη2850^; ^2850 - ^ηη2860^? ^ηη2860 - ^ηη2870^? ^ηη2870 - ^ηη2880^; ^ηη2880 ^ηη2890' ^ηη2890 ^ηη2900' ^ηη2900 ^ηη2910^? ^ηΠ2910 — ^ηη2920^? ^ηη2920 «· ^ηη29 30' ^ηη2930 - ^ηη2940^; ^ηη2 9 4 0 - ^ηη2 9 50' ^ηη29 50 — ^ηη2960' ^ηη2960 ^ηη2970^; ^ηη2970 - ^ηη2980^; ^ηη2980 — ^ηη2990' ^ηη2990 • ^ηη3000' ^ηη3000 — ^ηη3010^; ^ηη3010 — ^ηη3020' ^ηη3020 - ^ηη3030' ^ηη3030 - ^ηη3040^; ^ηη3040 — ^ηη3050^; ^ηη3050 - ^ηη3060' ^ηη3060 - ^ηη3070^; ^ηη3070 ^ηη3080^; ^ηη3Ο8Ο - ^ηη3090' ^ηη3090 ^ηη3100' ^ηη3100 - ^ηη3110^; ^ηη3110 - ^ηη3120^; ^ηη3120 ^ηη3130^? ^ηη3130 ^ηη3140^; ^ηη3140 - ^ηη3150^? ^ηη3150 - ^ηη3160^; ^ηη3160 ^ηη3170^; ^ηη3170 - ^ηη3180' ^ηη3180 - ^ηη3190⁷ ^ηη3190 — ^ηη3200' ^ηη3200 - ^ηη3210' ^ηη3210 - ^ηη3220' ^ηη3220 — ^ηη3230' ^ηη3230 - ^ηη3240' ^ηη3240 ^ηη32 50' ^ηη3250 — ^ηη3260^? ^ηη3260 ^ηπ3270^; ^ηη3270 - ^ηη3280^; ^ηη3280 - ^ηη3290^? ^ηη3290 - ^ηη3300' ^ηη3300 — ^ηη3310' ^ηη3310 ^ηη3320' ^ηη3320 - ^ηη3330' ^ηη3 330 ^ηη3 34 0' ^ηη3340 ^ηη3350^; ^ηη3350 - ^ηη3360^; ^ηη3360 - ^ηη3370^; ^ηη3370 - ^ηη3380' ^ηη3380 - ^ηη3390' ^ηη3390 - ^ηη3400^; ^ηη34ΟΟ - ^ΠΠ3410^; ^ηη3410 - ^ηη3420' ^ηη3420 - ^ηη3430^; ^ηη3430 — ^ηη3440^? ^ηη3440 - ^ηη3450^; ^ηη3450 - ^ηη3460^; ^ηη3460 ^ηη3470^; ^ηη3470 - ^ηη3480^; ^ηη3480 - ^ηη3490^? ^ηη3490 — ^ηη3500^; ^ηη3500 - ^ηΠ3510' ^ηη3510 - ^ηη3520' ^ηη3520 ^ηη3530^; ^ηη3530 - ^ηη3540ΐ ^ηη3540 - ^ηη35507 ^ηη3550 — ^ηη35β0?

141

^ηη3560 * ^ηη3570' ^ηη3570 · ^ηη3580^; ^ηη3580 ^ηη3590⁷ ^ηη3590 - ^ηη3600' ^ηη3600 - ^ηη3610⁷ ^ηη3610 ^ηη3620' ^ηη3620 * ^ηη3630^; ^ηη3630 - ^ηη3640^; ^ηη3640 - ^ηη3650' ^ηη3650 - ^ηη3660’ ^ηη3660 - ^ηη3670⁷ ^ηη3670 - ^ηη3680⁷ ^ηη3680 - ^ηη3690⁷ ^ηη3690 — ^ηη370 0^; ^ηη3700 - ^ηη3710⁷ ^ηη3710 ^ηη3720⁷ ^ηη3720 - ^ηη3730⁷ ^ηη3730 - ^ηη3740⁷ ^ηη37 4 0 ^ηη3 7 50⁷ ^ηη3750 - ^ηη37 6 0⁷ ^ηη3760 * ^ηη37 7 0' ^ηη3770 - ^ηη3780⁷ ^ηη3780 - ^ηη379Ο⁷ ^ηη3790 - ^ηη38ΟΟ⁷ ^ηη3800 * ^ηη3810' ^ηη3810 ^ηη3820⁷ ^ηη3820 — ^ηη38 30' ^ηη3830 ^ηη3840^? ^ηη384 0 - ^ηη3850⁷ ^ηη3850 - ^ηη3860⁷ ^ηη3860 - ^ηη3 87 0⁷ ^ηη3870 ^ηη3 8 80⁷ ^ηη3880 — ^ηη3890⁷ ^ηη3890 ^ηη3900' ^ηη3900 - ^ηη3910^? ^ηη3910 - ^ηη3920^; ^ηη3920 ^ηη3930⁷ ^ήη3930 — ^ηη3940^; ^ηη3940 * ^ηη3950' ^ηη3950 ^ηη3960⁷ ^ηη3960 - ^ηη3970^; ^ηη3970 - ^ηη3980^? ^ηη3980 ^ηη399Ο⁷ ^ηη3990 - ^ηη4000' ^ηη4000 - ^ηη4Ο1Ο' ^ηη4010 - ^ηη4020' ^ηη4020 — ^ηη4030⁷ ^ηη4 030 — ^ηη4040^; ^ηη4040 * ^ηη4050⁷ ^ηη4050 ^ηη4Ο6Ο⁷ ^ηη4060 - ^ηη4Ο7Ο⁷ ^ηη4070 ^ηη4 080⁷ ^ηη4080 - ^ηη4090⁷ ^ηη4090 ^ηη4100⁷ ^ηη4100 ^ηη4110⁷ ^ηη4110 — ^ηη4120⁷ ^ηη4120 — ^ηη4130' ^ηη4130 - ^ηη414 0⁷ ^ηη4140 - ^ηη4150^? ^ηη4150 - ^ηη4160^; ^ηη4160 - ^ηη417 0 ⁷ ^ηη417 0 ^ηη4180 ⁷ ^ηη4180 - ^ηη4190⁷ ^ηη419 0 - ^ηη4200⁷ ^ηη4200 ^ηη4 210^; ^ηη4210 — ^ηη4220' ^ηη4220 - ^ηη4230⁷ ^ηη4230 — ^ηη4 24 0⁷ ^ηη4240 — ^ηη4250^? ^ηη4250 * ^πη4260 ⁷ ^ηη4260 - ^ηη4 2 7 0 ⁷ ^ηη4270 - ^ηη4280' ^ηη4280 ^ηη4290⁷ ^ηη4290 — ^ηη4300' ^ηη4300 — ^ηη4310^; ^ηη4310 ^ΠΠ4320⁷ ^ηη4320 - ^ηη4330^; ^ηη4330 — ^ηη4340' ^ηη4340 — ^ηη435Ο⁷ ^ηη4350 — ^ηη4360^; ^ηη4360 — ^ηη4370⁷ ^ηη4370 - ^ηη4 380⁷ ^ηη4 380 - ^ηη4 39 0⁷ ^ηη4390 - ^ηη4400⁷ ^ηη4400 - ^ηη4410⁷ ^ηη4 410 ^ηη4420^; ^ηη4420 - ^ηη4 4 30⁷ ^ηη4430 - ^ηη444Ο⁷ ^ηη4440 - ^ηη4450^; ^ηη4450 - ^ηη446Ο⁷ ^ηη4460 - ^ηη44 70^; ^ηη4470 ^ηη4480^; ^ηη4 4 80 - ^ηη4490^; ^ηη4490 ^ηη4 500 ⁷ ^ηη4500 - ^ΠΠ4 51Ο⁷ ^ηη4 5 10 - ^ηη4520^; ^ηη4520 - ^ηη4530 ⁷ ^ηη4 5 3 0 - ^ηη454Ο⁷ ^ηη4540 ^ηη4 550 ⁷ ^ηη4550 - ^ηη4560⁷ ^ηη4560 * ^ηη4570' ^ηη4 5 7 0 * ^ηη4580⁷ ^ηη4580 ^ηπ4590^; ^ηη4590 - ^ηη4600^; ^ηη4600 * ^ηη461Ο⁷ ^ηη4610 ^ηη4620' ^ηη4620 - ^ηη4630? ^ηη4630 - ηη4640?

142

^πη4640 — ^ηη4650 ⁷ ^ηη4650 - ^ηη4660^; ^ηη4660 * ^ηη4670⁷ ^ηη4670 ·· ^ηη4680⁷ ^ηη4680 — ^ηη469Ο⁷ ^ηη4690 - ^ηη4700⁷ ^ηη4700 ^ηη4710^? ^ηΠ4710 — ^ηη4720^? ^ηη4720 - ^ηη4 730⁷ ^ηη4730 — ^ηη474Ο⁷ ^ηη4740 - ^ηη4750⁷ ^ηη4750 - ^ηη4760^? ^ηη4760 — ^ηη4770^; ^ηη4770 - ^ηη4780⁷ ^ηη47 80 - ^ηη4790⁷ ^ηη4790 — ^ηη4800⁷ ^ηη4800 - ^ηη481Ο⁷ ^ηη48ΐ0 - ^ηη4820^; ^ηη4820 - ^ηη4830' ^ηη4830 - ^ηη4 84 0⁷ ^ηη4840 - ^ηη4850' ^ηη4850 — ^ηη4 860⁷ ^ηη4 860 — ^ηη4870⁷ ^ηη4870 * ^ηη4880⁷ ^ηη4880 - ^ηη4 8 9 0⁷ ^ηη4890 ** ^ηη4900^; ^ηη4900 - ^ηη4910' ^ηη4910 — ^ηη4920^; ^ηη4920 ^ηη4930^; ^ηη4 930 * ^ηη4 94 0⁷ ^ηη4940 - ^ηη4950^; ^ηη4950 - ^ηη4960⁷ ^ηη4960 - ^ηη4970' ^ηη4970 — ^ηη4980^; ^ηη4980 ^ηη499Ο⁷ ^ηη4990 - ^ηη5000' ^ηη5000 — ^ηη5010⁷ ^ηη5010 - ^ηη5020^; ^ηη5020 - ^ηη5Ο3Ο⁷ ^ηη5030 — ^ηη5040⁷ ^ηη5040 ^ηη505 0⁷ ^ηη5050 - ^ηη5060^; ^ηη5060 — ^ηη5070^; ^ηη5070 — ^ηη5080⁷ ^ηη5080 - ^ηη5090⁷ ^ηη5090 — ^ηη5100⁷ ^ηη5100 - ^ηη5110 ⁷ ^ηη5110 - ^ηη512Ο⁷ ^ηη5120 — ^ηη5130⁷ ^ηΠ5130 ^ηη5140' ^ηη5140 - ^Πη5150⁷ ^ηη5150 - ^ηη5160⁷ ^ηη5160 - ^ηη5170⁷ ^ηη517 0 - ^ηη5180⁷ ^ηη5180 — ^ηη5190' ^ηη5190 - ^ηη5200⁷ ^ηη5200 - ^ηη5210⁷ ^ηη5210 — ^ηη5220^; ^ηη5220 — ^ηη52 30⁷ ^ηη5230 - ^ηη524Ο⁷ ^ηη5240 — ^ηη5250^? ^ηη5250 - ^ηη5260^; ^ηη5260 - ^ηη5270⁷ ^ηη5270 — ^ηη5280' ^ηη5280 - ^ηη5290⁷ ^ηη5290 - ^ηη53ΟΟ⁷ ^ηη5300 - ^ηη5310^; ^ηη5310 - ^ηη5320⁷ ^ηη5320 ^ηη5330⁷ ^ηη5330 — ^ηη5340⁷ ^ηη5340 — ^ηη5 3 50⁷ ^ηη5350 - ^ηη536Ο⁷ ^ηη5360 — ^ηη5370^; ^ηη5370 - ^ηη5380' ^ηη5380 - ^ηη5390⁷ ^ηη5390 — ^ηη5400⁷ ^ηη5400 — ^ηη54ΐ0^; ^ηη5410 - ^ηη5420⁷ ^ηη5420 *- ^ηη5430^; ^ηη5430 - ^ηη5440 ⁷ ^ηπ5440 - ^ηη5450⁷ ^ηη5450 — ^ηη5460^; ^ηη5460 ^ηη5470⁷ ^ηη5470 - ^ηη5480⁷ ^ηη5480 ^ηη5490^; ^ηη5490 - ^ηη5500⁷ ^ηη5500 - ^ηη5510⁷ ^ηη5510 - ^ΠΠ5520^; ^ηη5520 ^ηη5530^; ^ηη5530 - ^ηη5540⁷ ^ηη5540 *· ^ηη5550^; ^ηΠ5 550 - ^ηη5560^? ^ηη5560 - ^ηη5570⁷ ^Πη5570 — ^ηη5580' ^ηη5580 - ^ηη5590^; ^ηη5590 ^ηη5600⁷ ^ηη5600 — ^ηη5610 ⁷ ^ηη5610 - ^ηη5620^; ^ΠΠ5620 - ^ηη5630⁷ ^ηη5630 - ^ηη5640^; ^ηη5640 ^Πη5650⁷ ^Πη5650 ^ηη5660⁷ ^ηη5660 Μ ^Πη5670' ^ηη5670 - ^Πη5680' ^ηη5680 - ^ηη5690⁷ ^ηη5690 ⁿⁿ5700r ^ηη5700 - ^ηη57ΐο; ^ηη5710 - ^ηη5720;

143

^ηη5720 «Β ^Πη5730^; ^ηη5730 ^ηη5740^; ^ηη5740 - ^ηη5750^; ^Πη5750 ^ηη5760^; ^ηη5760 - ^ηη5770^? ^ηη5770 - ^ηη5780^? ^ηη5780 — ^ηη5790^; ^ηη5790 - ^ηη5800^? ^ηη5800 ^ηη5810^; ^ηη5810 ^ηη5820^; ^ηη5820 - ^ηη5830' ^ηη5830 - ^Πη5840^; ^ηη5840 ** ^ηη5850^; ^ηη5850 - ^ηη5860^; ^ηη5860 - ^ηη5870^? ^ηη5870 ^ηη5880' ^ηη5880 - ^ηη5890^; ^ηη5890 - ^ηη5900' ^ηη5900 * ^ηη5910^? ^ηη5910 - ^ηη5920^; ^ηη5920 — ^ηη5930^? ^ηη5930 — ^ηη5940^; ^ηη5940 — ^ηη5950' ^ηη5950 ^ηη5960^? ^ηη5960 ^ηη59 7 0' ^ηη5970 ^ηη5980' ^ηη5980 - ^ηη5990^; ^ηη5990 ^πη6000^; ^ηη6000 - ^ηη6010' ^ηη6010 - ^ηη6020^; ^ηη6020 - ^ηη6030' ^ηη6030 - ^ηη6040' ^ηη6040 - ^ηη6050' ^ηη6050 ^ηη6060^; ^ηη6060 - ^ηη6070' ^ηη6070 ^ηη6080^; ^ηη6080 - ^ηη6090' '^ηη6090 - ^ηη6100^? ^ηη6100 — ^ηη6110^; ^ηη6110 ^ηη6120' ^ηη6120 - ^ηη6130^? ^ηη6130 — ^ηη6140^; ^ηη6140 — ^ηη6150^; ^ηη6150 - ^ηη6160' ^ηη6160 — ^ηη6170^; ^ηη6170 ^ηη6180^? ^ηη6180 ^ηη6190' ^ηη6190 - ^ηη6200^; ^ηη6200 ^ηη6210' ^ηη6210 — ^ηη6220^? ^ηη6220 — ^ηη6230' ^ηη6230 - ^ηη6240' ^ηη6240 - ^ηη6250' ^ηη6250 - ^ηη6260^; ^ηη6260 - ^ηη6 2 7 0' ^ηη6270 - ^ηη6280^? ^ηη6280 - ^ηη6290' ^ηη6290 - ^ηη6300^; ^ηη6300 - ^ηη6310^; ^ηη6 310 - ^ηη6320' ^ηη6320 * ^ηη6330' ^ηη6330 — ^ηη6340^? ^ηη6340 — ^ηη6350^; ^ηη6350 ^ηη6360^; ^ηηβ360 - ^ηη6370' ^ηη6370 ^ηη6380^? ^ηη6380 ^ηη6390^; ^ηη6390 - ^ηη6400^; ^ηη6400 - ^ηη6410' ^ηη64ΐ0 - ^ηη6420' ^ηη6420 - ^ηη6430^? ^ηη6430 — ^ηη6440^; ^ηη6440 — ^ηη6450^; ^ηη6450 ^ηη6460^; ^ηη6460 — ^ηη6470' ^ηη6470 - ^ηη6480' ^ηη6480 - ^ηη6490^; ^ηη6490 - ^ηη6500^? ^ηη6500 ^ηη6510' ^ηη6510 - ^ηη6520' ^ηη6520 - ^ηη6530' ^ηη6530 ^ηη654 0^; ^ηη6540 - ^ηη6550^; ^ηη6550 - ^ηη6560^; ^ηη6560 ^ηη6570' ^ηη6570 - ^ηη6580' ^ηη6580 - ^πη6590^; ^ηη6590 ^ηη6600^? ^ηη66ΟΟ ** ^ηη6610^; ^ηη6610 - ^ηη6620^; ^ηη6620 ^ηη6630^; ^ηη6630 - ^ηη6640 ^; ^ηη6640 - ^ηη6650' ^ηη6650 ^ηη6660' ^ηηβ660 ^πη6670' ^πη6670 - ^πη6680^? ^ηη6680 ^ηη6690^; ^ηη6690 - ^ηη6 700⁷ ^ηη6700 - ^ηη6710^? ^ηη6710 - ^ηη6 7 2 0' ^ηη6720 - ^ηη6730' ^ηη6730 - ^ηη6740' ^ηη6740 - ^ηη6750' ^ηη6750 - ^ηη67 60⁷ ^ηη6760 - ^ηη6770^; ΠΠ677Ο - ^ηη6780? ^ηη6780 * ^ηη6790? ^ηη6790 - ηηθθοο;

144

I

Ρ.

ⁿⁿ68Q0 ⁿⁿ6810^? ⁿⁿ6810 - ⁿⁿ6820' ⁿⁿ6820 - ⁿⁿ6830⁷ ⁿⁿ6830 * ⁿⁿ6840' ⁿⁿ6840 * ⁿⁿ6850' ⁿⁿ6850 - ⁿⁿ686Q' ⁿⁿ6860 *· ⁿⁿ6870⁷ ⁿⁿ6870 — ⁿⁿ6880^; ⁿⁿ6880 - ⁿⁿ6890⁷ ⁿⁿ6890 — ⁿⁿ6900’ ⁿⁿ6900 - ⁿⁿ6 910⁷ ⁿⁿ6910 - ⁿⁿ6920^? ⁿⁿ6920 -* ⁿⁿ69 30⁷ ⁿⁿ6930 *· ⁿⁿ6940^; ⁿⁿ6940 - ⁿⁿ6950' ⁿⁿ6950 — ⁿⁿ6960' ⁿⁿ6960 - ⁿⁿ6970' ⁿⁿ6970 - ⁿⁿ6980^; ⁿⁿ6980 ⁿⁿ6990^; ⁿⁿ6990 — ⁿⁿ7000' ⁿⁿ7000 - ⁿⁿ7010^? ⁿⁿ7010 — ⁿⁿ7020^? ⁿⁿ7020 - ⁿⁿ7030' ⁿⁿ7030 - ⁿⁿ7040^; ⁿⁿ7040 — ⁿⁿ7050' ⁿⁿ7050 - ⁿⁿ7060^; ⁿⁿ7060 - ⁿⁿ7070^; ⁿⁿ7070 — ⁿⁿ7 0 80⁷ ⁿⁿ7080 * ⁿⁿ7090' ⁿⁿ7090 - ⁿⁿ7100^; ⁿⁿ7100 — ⁿⁿ7110^? ⁿⁿ7110 - ⁿⁿ7120^; ⁿⁿ7120 - ⁿⁿ7130^; ⁿⁿ7l30 * ⁿⁿ7140⁷ ⁿⁿ7140 - ⁿⁿ7150⁷ ⁿⁿ7150 - ⁿⁿ7160⁷ ⁿⁿ7l60 — ⁿⁿ7170^; nn-₇i7o - ⁿⁿ7180^; ⁿⁿ7180 - ⁿⁿ7190^? ⁿⁿ7190 — ⁿⁿ7200' ⁿⁿ7200 - ⁿⁿ7210^; ⁿⁿ7210 - ⁿⁿ7220^; ⁿⁿ7220 — ⁿⁿ7 2 30⁷ ⁿⁿ7 2 30 ⁿⁿ7240^? ⁿⁿ7240 — ⁿⁿ7250' ⁿⁿ7250 — ⁿⁿ7260⁷ ⁿⁿ7260 - ⁿⁿ7270^; ⁿⁿ7270 - ⁿⁿ7280' ⁿⁿ7280 — ⁿⁿ7 2 90⁷ ⁿⁿ7290 — ⁿⁿ73Q0' ⁿⁿ7300 — ⁿⁿ7310⁷ ⁿⁿ7310 - ⁿⁿ7320' ⁿⁿ7320 - ⁿⁿ7330^; ⁿⁿ7330 - ⁿⁿ7340^? ⁿⁿ7340 - ⁿⁿ7350^; ⁿⁿ7350 - ⁿⁿ7360^? ⁿⁿ7360 - ⁿⁿ737 0⁷ ⁿⁿ7370 — ⁿⁿ7 3 8 0⁷ ⁿⁿ7380 - ⁿⁿ7 3 9 0⁷ ⁿⁿ7390 - ⁿⁿ7400^; ⁿⁿ7400 — ⁿⁿ7410⁷ ⁿⁿ7410 - ⁿⁿ74 20⁷ ⁿⁿ7420 - ⁿⁿ7430⁷ ⁿⁿ7430 — ⁿⁿ7440^? ⁿⁿ7440 - ⁿⁿ7450' ⁿⁿ7450 - ⁿⁿ7460^; ⁿⁿ7460 — ⁿⁿ7470' ⁿⁿ7 4 7 0 - ⁿⁿ7480^? ⁿⁿ7480 - ⁿⁿ7490^; ⁿⁿ7490 — ⁿⁿ7500^? ⁿⁿ7500 — ⁿⁿ7510' ⁿⁿ7510 - ⁿⁿ7520^; ⁿⁿ7520 - ⁿⁿ7530^; ⁿⁿ7530 * ⁿⁿ7540' ⁿⁿ7540 - ⁿⁿ7550^; ⁿⁿ7550 * ⁿⁿ7560^? ⁿⁿ7560 - ⁿⁿ7570⁷ ⁿⁿ7570 - ⁿⁿ7580^? ⁿⁿ7580 - ⁿⁿ7590^; ⁿⁿ7590 - ⁿⁿ7600^? ⁿⁿ76QO - ⁿⁿ7610^; ⁿⁿ7610 — ⁿⁿ7620^? ⁿⁿ7620 - ⁿⁿ7630^; ⁿⁿ7 6 30 - ⁿⁿ7640^; ⁿⁿ7640 * ⁿⁿ7650' ⁿⁿ7650 - ⁿⁿ7660^; ⁿⁿ7660 - ⁿⁿ7 6 70 ⁷ ⁿⁿ7670 - ⁿⁿ7 6 8 0 ⁷ ⁿⁿ7680 - ⁿⁿ7 6 9 0⁷ ⁿⁿ7690 - ⁿⁿ7700' ⁿⁿ77OO w. ⁿⁿ7 710 ⁷ ^ηΠ771Ο - ⁿⁿ7720' ⁿⁿ7720 - ⁿⁿ7730^; ⁿⁿ7730 - ⁿⁿ7 7 4 0 ⁷ ⁿⁿ7 7 4 0 - ⁿⁿ7750^? ⁿⁿ7750 - ⁿⁿ7760^; ⁿⁿ7760 — ⁿⁿ7770' ⁿⁿ7770 ^nri7780' ⁿⁿ7780 - ⁿⁿ7790^? ⁿⁿ7 7 9 0 ⁿⁿ7800' ⁿⁿ7800 - ⁿⁿ7810^; ⁿⁿ7 810 - ⁿⁿ7820' ⁿⁿ7820 — ⁿⁿ7830' ⁿⁿ7830 - ⁿⁿ7 84 0 ⁷ ⁿⁿ7840 - ⁿⁿ7850^? ⁿⁿ7850 - ⁿⁿ7860> ⁿⁿ7860 - ⁿⁿ7870r ηη₇₈₇ο - ⁿⁿ7880'

145

^ηη7880 ^ηη7890^; ^ηη7 890 ^ηη7900' ^ηη7 900 ^ηη7910^; ^ηη7910 * ^ηη7920^? ^ηη7920 — ^ηη79 30 ^; ^ηη7930 - ^ηη7940⁷ ^ηη7940 - ^ηη7950' ^Πη7950 ·* ^ηη7960⁷ ^ηη7960 - ^ηη7970' ^ηη7970 — ^ηη7 9 80⁷ ^ηη7980 - ^ηη7 9 9 0⁷ ^ηη7990 - ^ηη8000^; ^ηη8000 -, ^ηη8010' ^ηη8010 - ^ηη8020^? ^ηη8020 - ^ηη80 30⁷ ^ηη8030 — ^ηη8040' ^ηη8040 - ^ηη8050⁷ ^ηη8050 - ^ηη8060⁷ ^ηη8060 - ^ηη8070' ^ηη8070 - ^ηη8080' ^ηη8080 - ^ηη8Ο90' ^ηη8090 - ^ηη8100' ^ηη8100 — ^ηη8110^; ^ηη8110 - ^ηη8120' ^ηη8120 - ^ηη8130^; ^ηη8130 - ^ηη8140^; ^ηη8140 W ^ηη8150^; ^ηη8150 - ^ηη816 0⁷ ^ηη8160 - ^ηη8ΐ70^? ^ηη8170 — ^ηη8180^? ^ηη8180 - ^ηη8190^? ^ηη8190 - ^ηη8200^; ^ηη8200 - ^ηη8210⁷ ^ηη8210 — ^ηη8220' ^ηη8220 — ^ηη8230' ^ηη8230 ^ηη8240' ^ηη8240 - ^ηη8250' ^ηη8250 - ^πη8260^; ^ηη8260 - ^ηηθ270' ^ηη8270 - ^ηη8280^; ^ηη8280 - ^ηη8290⁷ ^ηη8290 — ^ηη8300⁷ ^ηη8300 - ^ηη8310^; ^ηη8310 - ^ηη8320' ^ηη8320 — ^ηη8330⁷ ^ηη8330 - ^ηη8340' ^ηη8340 — ^ηη8350⁷ ^ηη8350 ** ^ηη8360^; ^ηη8360 ^ηη8370' ^ηη8370 - ^ηη8380⁷ ^ηη8380 ^ηη8390' ^ηη8390 - ^ηη8400^? ^ηη8400 - ^ηη8410⁷ ^πη8410 — ^ηη8420' ^ηη8420 - ^ηη8430' ^ηη8430 ^ηη8440' ^ηη8440 ^ηη8450^; ^ηη8450 - ^ηη8460^? ^ηη8460 - ^ηη8470^? ^ηη8470 — ^ηη8480^; ^ηη8480 «» ^ηη8490' ^ηη8490 - ^ηη8500' ^ηη8500 — ^ηη8510^; ^ηη8510 - ^ηη8520' ^ηη8520 - ^ηη8530⁷ ^ηη8530 — ^ηη8540^? ^ηη8540 - ^ηη8550' ^ηη8550 * ^ηη8560^? ^ηη8560 — ^ηη8570^; ^ηη8570 - ^ηη8580⁷ ^ηη8580 — ^ηη8590⁷ ^ηη8590 — ^ηη8600' ^ηη8600 - ^ηη8610^; ^ηη8610 - ^ηη86 2 0⁷ ^ηη8620 — ^ηη8630' ^ηη8630 - ^ηη8640^; ^ηη8640 - ^ηη8650^; ^ηη8650 — ^ηη8660^; ^ηη8660 - ^ηη8670' ^ηη8670 - ^ηη86 80⁷ ^ηη8680 — ^ηη8690^? ^ηη8690 — ^ηη87 00⁷ ^ηπ8700 ^ηη8710⁷ ^ηη8710 — ^ηη8720^; ^ηη8720 - ^ηη87 30⁷ ^ηη8 7 30 - ^ηη8 7 4 0⁷ ^ηη87 4 0 — ^ηη8750' ^ηη8750 - ^ηη8760^; ^ηη8760 ^ηη8 7 7 0 ^; ^ηη8 ₇ 7 0 ^ηη8780^; ^ηη8780 * ^ηη8790^? ^ηη8790 - ^ηη8800' ^ηη8800 *· ^ηη8810' ^ηη8810 - ^ηη8820' ^ηη8820 — ^ηη8830^; ^ηη8830 — ^ηη8840^; ^ηη8840 - ^ηη8850⁷ ^ηη8850 - ^ηη8860' ^ηη8860 — ^ηη8870' ^ηη8870 - ^ηη8 8 80⁷ ^ηη8880 ^ηη8890^; ^ηη8890 — ^ηη8900^; ^ηη8900 - ^ηη8910⁷ ^ηη8 910 - ^ηη8920' ^ηη8920 ^ηη8930' ^ηη8930 - ηηθ940? ηη₈940 - ^ηη895ο; ^ηη8950 — ^ηη8960 λ

146

ⁿⁿ8960 ⁿⁿ8970' ⁿⁿ8970 ⁿⁿ8980' ⁿⁿ8980 ⁿⁿ8990^? ⁿⁿ8990 ” ⁿⁿ90Q0^? ⁿⁿ9000 ⁿⁿ90l0^? ⁿⁿ90XQ ⁿⁿ9020' ⁿⁿ9020 ⁿⁿ9030^; ⁿⁿ9030 ⁿⁿ9040^; ⁿⁿ9040 ⁿⁿ9050^; ⁿⁿ9050 ⁿⁿ9060·

3- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o oligómero preparado ser constituído por uma sequência que é complementar a uma sequência de, pelo menos, 8 nucleótidos, presente numa sequência conservada de nucleótidos de HCV, no RNA de HCV.
4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada estar localizada na sequência de números de nucleótidos desde a extremidade 5' a cerca de 200, na Figura 1.
5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada estar localizada na sequência de números de nucleótidos de cerca de 4000 a cerca de 5000, na Figura 1.
6- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada estar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de 8000 a cerca de 9040, na Figura 1.
7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada se encontrar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de -318 até cerca de 174, na Figura 1.

147
8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada se encontrar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de 4056 até cerca de 4448, na Figura 1.
9- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada se encontrar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de 4378 até cerca de 4902, na Figura 1.
10- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada se encontrar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de 4042 até cerca de 4059, na Figura 1.
11- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada se encontrar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de 4456 até cerca de 4470, na Figura 1,
12- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência conservada se encontrar localizada na sequência de números de nucleótidos desde cerca de 8209 até cerca de 8217, na Figura 1.
13- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o oligómero preparado ser uma sonda de captura.
14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o oligómero preparado ser uma sonda

148 marcada.
15- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o oligómero preparado ser um primer.
16- Um processo para detecção de uma sequência de HCV, numa cadeia de análise que se suspeita conter um polinucleótido de HCV, compreendendo o polinucleótido de HCV uma região alvo seleccionada, caracterizado pelo facto de o referido processo compreender:

(a) o fornecimento de um oligómero capaz de hibridar com uma sequência de HCV, numa cadeia polinucleotidica de análise, sendo o oligómero constituído por uma sequência de direccionamento para o HCV, complementar de, pelo menos, 4 nucleótidos contíguos do cDNA de HCV, como representado na Figura 1.

(b) a incubação da cadeia de análise com o oligómero de (a), que permite a formação de duplexes híbridos específicos, entre a sequência de direccionamento e a sequência alvo; e (d) a detecção dos híbridos formados entre a região alvo, se existir alguma, e o oligómero.
17- Um processo, conforme reivindicado na reivindicação 16, caracterizado pelo facto de compreender ainda:

(a) o fornecimento de um conjunto de oligómeros que constituem primers para o método de reacção em cadeia de polimerase, e que servem de flanco para a região alvo; e (b) a amplificação da região alvo, através de um método de reacção em cadeia de polimerase.

149
18- Um método de preparação de um kit para detectar uma sequência alvo de HCV, numa cadeia de análise, caracterizado pelo facto de compreender o fornecimento de um oligómero, preparado conforme reivindicado na reivindicação 1, e embalado num recipiente adequado.
19- Um método de preparação de sangue isento de HCV, caracterizado pelo facto de compreender:

(a) o fornecimento de ácidos nucleicos para análise, a partir de uma amostra de sangue que se suspeita conter uma sequência alvo de HCV;

(b) o fornecimento de um oligómero capaz de hibridar com a sequência de HCV, numa cadeia polinucleotidica de análise, se existir alguma, sendo o oligómero constituído por uma sequência de direccionamento para o HCV, complementar a uma sequência de, pelo menos, 8 nucleótidos, presente numa sequência conservada de nucleótidos de HCV, no RNA de HCV.

(c) a reacção de (a) com (b), sob condições que permitem a formação de um duplex polinucleotidico, entre a região de direccionamento e a região alvo, se existir alguma;

(d) a detecção de um duplex formado em (c), se existir algum; e (c) a recolha do sangue a partir do qual não se detectaram complexos em (d).