CZ282573B6 - Způsob detekce HCV sekvence, souprava a reakční činidlo pro detekci HCV - Google Patents

Abstract

Reakčními činidly pro izolaci, zesílení a detekci HCV polynukleotidů jsou oligomery obsahující polynukleotidové sekvence, které jsou schopny vytvářet hybridní struktury s HCV cílovými polynukleotidovými sekvencemi. HCV je nově objevený virus Hepatitis C /HCV/, který se hlavně podílí na krvi přenášeném infekčním onemocnění jater.ŕ

Description

Způsob pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu v analytovém řetězci, souprava a reakční činidlo pro jeho provádění a způsob detekce in vitro krve znečištěné infekčními látkami

Oblast techniky

Vynález se týká materiálů a metodologie pro zvládnutí infekce virem hepatitis ne-A, ne-B (NANBV non-A, non-B hepatitis virus). Především se vynález týká etiologického činidla viru neA, ne-B hepatitis (NANBH), hepatitis C (HCV) a polynukleotidů a jejich analogů, které jsou vhodné pro detekční zkoušky HCV v biologických vzorcích. Vynález je zaměřen na způsob pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu v analytovém řetězci, na soupravu a reakční činidlo pro tento účel a na způsob eliminace krve znečištěné infekčními látkami

Dosavadní stav techniky

Ne-A, ne-B hepatitis (NANBH) je infekční onemocnění nebo rod onemocnění, považovaných za navozených virem, a která jsou odlišitelná od jiných typů virových onemocnění jater, včetně onemocnění, způsobených známými viry hepatitis, jako je například hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV) a delta hepatitis virus (HDV), jakož také hepatitis, kterou navozuje cytomegalovirus (CMV) nebo virus Epstein-Barr (EBV). NANBH byl poprvé identifikován u jedinců po transfuzi. Infekce z lidí na šimpanze a sériová pasáž v případě šimpanzů dokládají, že NANBH je způsobena přenosným infekčním činidlem nebo přenosnými infekčními činidly.

Z epidemiologického výskytu se usuzuje na tři typy NANBH: epidemický typ pocházející z vody, typ spojený s krví nebo s jehlami a typ sporadicky se vyskytující ve společenství. Avšak četná činidla, která mohou být příčinou onemocnění NANBH jsou neznáma.

Jsou četné příčiny NANBH (Prince A:M:, Annu. Rev. Microbiol., 37, str. 217, 1983; Feinstone S. M. a Hoofnagle J. H., New Engl. J. Med., 311, str. 185, 1984; Overby L. R., Curr. Hepatol, 5, str. 49, 1985, Curr. Hepatol, 6, str. 65, 1986 a Curr. Hepatol, 7, str. 35, 1987; a Iwasrson, British Medical J., 295, str. 946, 1987), avšak ve známé literatuře nejsou uváděna činidla, která jsou příčinou NANBH.

Americký patentový spis číslo 4 683195 popisuje základní způsob polymerasové řetězové reakce pro zesílení, detekci a klonování sekvencí nukleové kyseliny. Nepopisuje tedy HCV sekvence a ze spisu nikde nevyplývá jeho použitelnost pro řešení problému podle vynálezu, jelikož se netýká problematiky detekce specifikovaných HCV sekvencí.

Americký patentový spis 5 106726 popisuje specifikované peptidové komposice, které se používají při detekci anti-HCV protilátek. Je zaměřen na imunozkoušky, založené na vzájemných reakcích proteinů a nikoliv na polynukleotidové kompozice a na zkoušky pro polynukleotidy založené na hydridizaci. Netýká se hybridizačních zkoušek pro detekci specifikovaných HCV polynukleotidů a nelze z něho odvodit detekci specifikovaných HCV sekvencí, právě proto, že se týká imunozkoušek pro detekci anti-HCV protilátek a popisuje peptid, který je užitečný pro tyto imunozkoušky.

Světový patentový spis W090/09457 se týká modifikace základního PCR zesilovacího způsobu. V tomto patentovém spise W090/09457 rovněž není ani zmínky o detekci HCV polynukleotidů obsahujících specifikované sekvence. Týká se na sekvenci nezávislém genovém zesilovacím způsobu. Způsoby a popisované polynukleotidy se netýkají specifikovaných HCV sekvencí.

Je proto třeba vyvinout citlivé, specifické způsoby pro clonění (skríning) a identifikaci nosičů NANBH a krve nebo krevních produktů, kontaminovaných NANBH. K. posttransfuzní hepatitidě dochází přibližně v případě 10 % pacientů po transfuzi a NANBH se na těchto případech podílí 90 %. Hlavním problémem tohoto onemocnění je častý přechod na chronické poškození jater (25 až 55 %).

Péče o nemocné a předcházení přenosu NANBH krví a krevními produkty nebo úzkým osobním stykem vyžaduje spolehlivé clonění, diagnostiku a prognostiku k detekci nukleových kyselin, antigenů a protilátek, vztahujících se k NANBH.

Způsoby detekce specifických polynukleotidů hybridizačními zkouškami jsou v oboru známé (Matthews a Kricka, Analytical Biochemistry, 169, str. 1, 1988; Landegren a kol., Science, 242, str. 229, 1988; a Mittlin, Clinical Chem., 35, str. 1819, 1989; americký patentový spis číslo 4 868105 a evropská přihláška vynálezu číslo 225807, zveřejněná 16. 6. 1987).

Nejsou však známé citlivé, specifické způsoby pro clonění a identifikaci nosičů NANBH a krve nebo krevních produktů, kontaminovaných NANBH. Proto je úkolem vynálezu takové způsoby vyvinout.

Podstata vynálezu

Způsob pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu v analytovém řetězci, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, jejich komplementy a RNA ekvivalenty sekvencí a jejich komplementy, spočívá podle vynálezu v tom, že se

a) inkubuje analytový řetězec s polynukleotidem obsahujícím zacilující sekvenci za podmínek umožňujících vytvoření specifických hybridních duplexů mezi cílovou sekvencí a zacilující sekvencí a zacilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv následující sekvenci podle obr. 1: 16-45,49-78, 82-111, 115-144, 148177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486 ajejich komplementy,

b) stanovují se hybridy případně vytvořené mezi cílovou oblastí a zacilující sekvencí.

Zvláště se

a) inkubuje analytový řetězec se sadou oligomerů, přičemž oligomery sady lemují cílovou oblast a její komplement a jsou primery pro způsob polymerasové řetězcové reakce a

b) zesiluje se cílová oblast způsobem polymerasové řetězcové reakce.

Souprava pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu v analytovém řetězci, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, jejich komplementy a RNA ekvivalenty sekvencí ajejich komplementy, spočívá podle vynálezu vtom, že zahrnuje polynukleotid zacilující sekvence a zacilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv sekvenci podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486 a k jejich komplementům.

Reakční činidlo pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle

-2CZ 282573 B6 obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, jejich komplementy a RNA ekvivalenty sekvencí a jejich komplementy spočívá podle vynálezu vtom, že zahrnuje polynukleotid zacílující sekvence azacilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv 5 sekvenci podle obr. 1: 16-45,49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332361, 365-394, 398-427 a 457-486 a k jejich komplementům.

S výhodou polynukleotid zacílující sekvence obsahuje přídavně značení.

ίο Způsob detekce in vitro krve znečištěné infekčními látkami k eliminaci ze zdroje krve, vytvořeného z jednotek od jednotlivých dárců krve, spočívá podle vynálezu v tom, že

a) se inkubují analytové nukleové kyseliny ze vzorku krve podezřelého, že obsahuje polynukleotid se zvolenou cílovou sekvencí HCV polynukleotidu, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 1645, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, s polynukleotidem obsahujícím zesilující sekvenci, přičemž zesilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv Sekvenci podle obr. 1: 16-45,49-78, 82-111, 115-144, 148-177,211-240, 242-271,275-304, 332-361,36520 394, 398-427 a 457-486 a jejich komplementům,

b) zjišťují se případné hybridní duplexy, vytvořené mezi analytovými nukleovými kyselinami, obsahujícími případnou cílovou oblast, a polynukleotidem obsahujícím zacílující sekvenci a

c) uchovává se krev, ve které nebyly podle odstavce b) zjištěny hybridní duplexy.

Vynález blíže objasňuje následující popis a přiložené výkresy:

Na obr 1

3o je sestavená HCV cDNA sekvence, odvozená od klonu zde popsaného a od sestavené sekvence HCV cDNA presentované v PCT No. W090/14436. Klony, od nichž jsou sekvence odvozeny, jsou 5'-klon32, bl 14a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (označovaný také jako k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k apBljh. Na obr.

jsou tři vodorovné pomlčky nad sekvencí indikující pozici domnělého iniciátoru methioninového kodonu. Na obr. 1 je také aminokyselinová sekvence domnělé polybílkoviny zakódované v HCV cDNA. Heterogenity v klonovaných DNA HCV1 jsou vyznačeny aminokyselinami indikovanými nad domnělou zakódovanou sekvenci velké ORF; závorky indikují, že heterogenita byla zjištěna na/nebo v blízkosti zakončení 5' nebo 3' HCV cDNA v klonu.

Na obr. 2 jsou DNA konvenční sekvence pro pět různých HCV isolátů z různých geografických oblastí (Japonska a Spojených států amerických), přičemž aminokyseliny, kódované velkým ORF HCV1 jsou znázorněny nad DNA sekvencemi.

Na obr. 3 jsou sekvence značkovacích polynukleotidových sond (labeling probes) pro detekci HCV RNA v biologických vzorcích, použitých v příkladu 3.

Na obr. 4 je seřazení polynukleotidových sond v obr. 3 s HCV1 podle číslování na obr. 1.

Výraz hepatitis C virus (HCV) je pracovníky v oboru vyhrazen pro až dosud neznámé etiologické činidlo NANBH. Prototyp izolátu HCV byl identifikován v americkém patentovém spise

-3 CZ 282573 B6 číslo (přihláška vynálezu číslo 122,714) (viz též zveřejněnou evropskou přihlášku vynálezu číslo 318,216). Výraz HCV také zahrnuje nové izoláty téhož virového druhu. Jakožto rozšíření této terminologie nemoc způsobovaná HCV, dříve označovaná jako NANB hepatitis z krve (bloodbome NANB hepatitis - BB-NANBH) se označuje jako hepatitis C. Výrazy NANBH a hepatitis C se zde vzájemně zaměnitelně používají.

HCV je virový druh, jehož pathogenní kmeny způsobují BB-NANBH. Mohou být také atenuovanými kmeny nebo defektními interferujícími částicemi od nich odvozenými. Jak shora uvedeno, HCV genom je obsažen v RNA. Je známo, že RNA obsahující viry má poměrně vysoký stupeň spontánní mutace, to je označovaný řádem 10'³ až W⁴ na včleněný nukleotid (Fields & Knipe, 1986). Proto, jelikož heterogenita a fluidita genotypu jsou inherentní ve RNA virech, existují četné kmeny/izoláty, které mohou být uvnitř druhů HCV virulentní nebo avirulentní. Zde popisovaná složení a způsoby umožňují šíření, identifikaci, detekci a izolaci různých HCV kmenů a izolátů.

Byly identifikovány různé kmeny/izoláty HCV (viz zveřejněná přihláška vynálezu PCT Pub. No. W090/14436). Jeden takový kmen nebo izolát, který je prototypem, se označuje jako CDC/HCV1 (rovněž jako HCV1). Informace o kmeni nebo izolátu, jako je parciální genomová sekvence, jsou pro pracovníka v oboru dostatečné, aby mohl za použití standardních technik izolovat nové kmeny/izoláty a identifikovat zda takové nové kmeny/izoláty jsou HCV. Například různé odlišné kmeny/izoláty jsou dále popsány. Tyto kmeny, které se získají z četných lidských sér (a z různých zeměpisných oblastí) byly izolovány za využití informace z genomové sekvence HCV1.

Za použití technik, popsaných v PCT Pub. No. W090/14436, byla odvozena genomová struktura a nukleotidová sekvence HCV1 genomové RNA. Genom se jeví jako jednořetězcová RNA obsahující přibližně 10000 nukleotidů. Genom je pozitivně řetězen a má kontinuální translacionální otevřený čtecí rámec (ORF - open reading frame), který kóduje polybílkovinu s přibližně 3000 aminokyselinami. V ORF se strukturální bílkovina nebo strukturální bílkoviny jeví jako zakódované v přibližně první čtvrtině N-koncové oblasti, s většinou polybílkovin zodpovědných za nestrukturální bílkoviny. Při srovnání se všemi známými virovými sekvencemi se pozoruje malá, avšak významná kolineámí homologie s nestrukturálními bílkovinami flavivirového rodu a s pestiviry (které se považují také jako část rodu Flavivirus).

Flavivirová polybílkovina obsahuje od aminokonce po karboxylový konec nukleokapsidovou (nucleocapsid) bílkovinu C, matricovou bílkovinu (M), obalovou bílkovinu (E) a nostrukturální bílkovinu (NS) 1, 2 (a+b), 3,4 (a+b) a 5. Na základě domnělých aminokyselin, zakódovaných v nukleotidové sekvenci HCV1, se malá oblast na extremním N-konci HCV polybílkoviny jeví podobná jak velikostí, tak výškou obsahu bázických zbytků nukleokapsidové bílkovině (C), nalezené na N-zakončení flavivirových polybílkovin. Nestrukturální bílkoviny 2,3, 4 a 5 (NS2-5) HCV a virus žluté horečky (YFV) mají zdánlivě protějšky podobného rozměru a hydropathicity, ačkoliv je rozlišnost amionokyselinových sekvencí. Avšak oblast HCV, která by odpovídala oblastem YFV polybílkoviny, která obsahuje Μ, E aNSl bílkovinu, se liší nejen v sekvenci, jeví se avšak jako dosti odlišná jak co do velikosti a tak hydropathicity. Proto jakkoliv určité oblasti HCV genomu se zde mohou označovat například NS1 nebo NS2, je nutno si uvědomit, že označení je spekulativní: mohou být značné rozdíly mezi rodem HCV a flaviviry, které ještě nebyly vyhodnoceny.

Různé kmeny, izoláty nebo podtypy HCV budou podle očekávání obsahovat obměny aminokyseliny a nukleových kyselin ve srovnání s HCV1. Očekávají se četné izoláty s mnohem větší (to znamená více než přibližně 40%) homologií v celkové aminokyselinové sekvenci ve srovnání s HCV1. Může se však také zjistit, že jsou jiné, méně homologované izoláty HCV. Tyto by se definovaly jakožto HCV podle různých kriterií, jako například ORF s přibližně 9000 nukleotidů až přibližně 12000 nukleotidů zakodovávající polybílkovinu podobné velikosti jako

-4CZ 282573 B6

HCVI, zakodovávající polybílkovinu podobného hydrofobního a/nebo antigenového charakteru jako HCVI a přítomnost kolineámí peptidové sekvence, které jsou konservovány sHCVl. Kromě toho se má za to, že genomem je RNA s pozitivním řetězcem.

Všechny izoláty zakodovávají alespoň jeden epitop, který je imunologicky identifikovatelný (to je imunologicky reaktivní) s epitopem zakódovaným v HCV cDNA zde popsanými. S výhodou je epitop obsažen v aminokyselinové sekvenci zde popsané jakožto specifický k HCV ve srovnání se shora uvedenými pathogeny. Specifičnost epitopu se může stanovit jeho imunologickou reaktivitou s anti-HCV protilátkami a nedostatkem imunologické reaktivity s antilátkami známých patogenů.

HCV kmeny a izoláty jsou vývojově příbuzné. Proto se očekává, že celková homologie genomů nukleotidové úrovně může být 40 % nebo větší, pravděpodobně bude 50 % nebo větší, pravděpodobně 60 % nebo větší a především pravděpodobně 80 % nebo větší; kromě toho se očekává, že bude odpovídající sousední sekvence s alespoň přibližně 13 nukleotidy. Připomíná se, že jsou variabilní a hypervariabilní oblasti v HCV genomu. Proto se očekává homologie v těchto oblastech výrazně menší než v genomu jako celku. Korespondence mezi předpokládanou HCV kmenovou genomovou sekvencí a například CDC/ HCVI cDNA sekvencí se může zjistit způsoby v oboru osobě známými. Například se může zjistit přímým srovnáním sekvenční informace polynukleotidu z předpokládané, zde popsané HCV a HCV cDNA sekvence nebo sekvencí. Mohou být také zjištěny hydridizací polynukleotidů za podmínek, které vytvářejí stabilní duplexy mezi homologickými oblastmi (například použitými před Si digescí), s následnou digescí s jednořetězcovou specifickou nukleasou nebo s jednořetězcovými specifickými nukleasami, s následným stanovením velikosti digerovaných fragment.

Vzhledem k vývojovému vztahu kmenů nebo izolátů HCV, jsou předpokládané HCV kmeny nebo izoláty identifikovatelné jejich homologií v polypeptidové úrovni. Obecně se má za to, že HCV kmeny nebo izoláty jsou alespoň ze 40 % homologické, více než přibližně z 50 % homologické, pravděpodobně více než ze 70 % homologické a nej pravděpodobněji více než z 80 % homologické a některé dokonce více než z 90 % homologické na úrovni polypeptidů. Techniky ke stanovení aminokyselinové sekvenční homologie jsou v oboru známy. Například se může sekvence aminokyselin zjistit přímo a porovnávat se zde uvedenými sekvencemi. Alternativně se může zjistit nukleotidová sekvence genomového materiálu předpokládané HCV (obvykle přes cDNA meziprodukt) a sekvence předpokládaných aminokyselin, v nich zakódovaných, a odpovídající oblasti se pak porovnají.

Zde používaným výrazem polynukleotid odvozený od označovaná sekvence se týká polynukleotidové sekvence, která se skládá ze sekvence přibližně alespoň 6 nukleotidů, s výhodou z alespoň 8 nukleotidů, výhodněji z alespoň přibližně 10 až 12 nukleotidů a ještě výhodněji z alespoň přibližně 15 až 20 nukleotidů korespondující oblasti označované nukleotidové sekvence. Výrazem korespondující se míní homologický nebo komplementární k označované sekvenci. S výhodou sekvence oblasti, z níž byl polynukleotid odvozen, je homologická nebo komplementární k sekvenci, která je specifická ke HCV genomu. Výhodněji je odvozená sekvence homologická nebo komplementární k sekvenci, která je specifická ke všem nebo k většině HCV izolátů. Zdali je sekvence nebo zdali není specifická pro HCV genom, se může stanovit způsoby o sobě známými pracovníkům v oboru. Například se sekvence může porovnat se sekvencemi v databankách, jako je například genová banka pro stanovení, zdali je přítomna v neinfikovaném hostu nebo v jiných mikroorganismech. Sekvence se také může porovnávat se známými sekvencemi jiných virových činidel, včetně činidel, která jsou známa, že navozují hepatitidu, jako jsou například HAV, HBV aHDV, a členy rodu Flaviviridae. Korespondence nebo nekorespondence odvozené sekvence s jinými sekvencemi se také může zjistit hybridizací za vhodných přesných podmínek. Hybridizační techniky pro stanovení komplementarity sekvencí nukleových kyselin jsou v oboru známé a je o nich v literatuře pojednáno. Například se připomíná práce Maniatise a kol. (1982). Kromě toho nevhodná spojení duplexních poly

-5CZ 282573 B6 nukleotidů, vytvořená hybridizací, se mohou zjistit o sobě známými způsoby, včetně například digescí s nukleasou, jako Sl, která specificky digeruje jednořetězcové oblasti v duplexních polynukleotidech. Oblasti, z nichž mohou být odvozeny typické DNA sekvence zahrnují například oblasti kódující specifické epitopy, jako netranskribované a/nebo nepřemístěné oblasti, přičemž tento výčet není míněn jako nějaké omezení.

Odvozený polynukleotid není nutně fyzikálně odvozený od ukázané nukleotidové sekvence, může však být generován jakýmkoliv způsobem, včetně například chemické syntézy nebo replakací DNA nebo reverzní transkripcí nebo transkripcí. Kromě toho kombinace oblastí, odpovídajících označené sekvenci se mohou modifikovat o sobě známým způsobem odpovídajícím záměru.

Zde používaným výrazem rekombinantní polynukleotid se míní polynukleotid genomového, cDNA, polosyntetického nebo syntetického původu na základě svého původu nebo manipulace: (1) není spojen s celým nebo s částí polynukleotidu, se kterým je spojen v přírodě, (2) je vázán na polynukleotid jiný, než ke kterému je vázán v přírodě nebo (3) v přírodě se nevyskytuje.

Zde používaným výrazem polynukleotid se míní polymemí forma nukleotidů jakékoliv délky, buď ribonukleotidů, nebo desoxyribonukleotidů. Tento výraz se týká pouze primární struktury molekuly. Proto tento výraz zahrnuje DNA a RNA s jedním a se dvěma řetězci. Zahrnuje také známé typy modifikací, například značení v oboru známé, methylaci, čepičky, substituce jednoho nebo několika přírodně se vyskytujících nukleotidů analogem, intemukleotidové modifikace, jako například modifikace za použití vazeb bez náboje (například methylfosfonáty, fosfotriestery, fosfoamidáty, karbamáty) a vazeb s nábojem (například fosforothioáty, fosforodithioáty), vazeb se zavěšenými podíly, jako jsou například bílkoviny (včetně například nukleas, toxinů, protilátek, signálních peptidů, poly-L-lysinu), vazeb s interkalátory (jako je například akridin, psoralen), vazeb obsahujících chelátory (například kovy, radioaktivní kovy, bor, oxidační kovy), vazeb, obsahujících alkylátory, například modifikované vazby (například a anomemí nukleové kyseliny) a nemodifikované formy polynukleotidů

Zde používaným výrazem negativní DNA řetězec (sense strand) nukleové kyseliny se míní sekvence, která má sekvenci homologickou s mRNA. Anti negativní DNA řetězec (anti-sense strand obsahuje sekvenci, která je komplementární se sekvencí (sense strand) s negativním DNA řetězcem

Zde používaným výrazem pozitivní genomový řetězec (positive stranded genome) viru se míní genomový polynukleotid buď RNA, nebo DNA, který zakodovává alespoň jeden virový polypeptid. Jakožto příklady pozitivního RNA řetězce viru se uvádějí Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picomaviridae a Caliciviridae. Zahrnuty jsou také Flaviviridae, které byly dříve klasifikovány jakožto Togaviradae. Tyto viry mají typicky jeden řetězec (viz Fields & Knipe, 1986).

Zde používaným výrazem primer (primer) se vždy míní oligomer, který je schopen působit jakožto bod iniciace syntézy polynukleotidového řetězce, jestliže se umístí do vhodných podmínek. Primer je kompletně nebo v podstatě komplementární k oblasti polynukleotidového kopírovaného řetězce. Tudíž za podmínek, vedoucích k hybridizaci, primer působí totální hybridizací komplementární oblasti analytového řetězce. Po přidání vhodných reakčních činidel (například polymerasy, nukleotidových trifosfátů) se primer nastaví polymeračním činidlem k vytvoření kopie analytového řetězce. Primer může mít jeden řetězec nebo může být částečně nebo plně se dvěma řetězci.

Zde používaným výrazem analytový polynukleotid a analytový řetězec (analyte polynucleotide, analyte strand) se míní molekula nukleové kyseliny s jedním nebo se dvěma řetězci,

-6CZ 282573 B6 o které se předpokládá, že má cílovou sekvenci a která může být obsažena v přírodních vzorcích. Zde používaným výrazem oligomer se míní příměry a nukleotidové sondy. Výraz oligomer neznamená velikost molekuly. Zpravidla však oligomery nejsou větší než 1000 nukleotidů, výhodněji nejsou větší než 500 nukleotidů a zvláště nejsou větší než 250 nukleotidů. Délkově mohou být menší než 100 nukleotidů a mohou být menší než 75 nukleotidů a rovněž mohou být menší než 50 nukleotidů.

Zde používaným výrazem nukleotidová sonda (probe) se míní struktura obsahující polynukleotid, který vytváří hybridní strukturu s cílovou sekvencí v důsledku komplementarity alespoň jedné sekvence v nukleotidové sondě se sekvencí v cílové oblasti. Polynukleotidové oblasti nukleotidových sond mohou být složeny z DNA a/nebo RNA a/nebo ze syntetických nukleotidových analogů. Výraz nukleotidové sondy zahrnuje také zachycené nukleotidové sondy (capture probes) a značené nukleotidové sondy (label probes). S výhodou neobsahuje nukleotidová sonda sekvenci komplementární se sekvencí nebo se sekvencemi používanými k navození polymerasové řetězové reakce (PCR).

Zde používaným výrazem cílové oblast (target region) se míní oblast nukleové kyseliny, která se zesiluje a/nebo zjišťuje. Výrazem cílová sekvence (target sequence) se míní sekvence, se kterou nukleotidová sonda nebo primer vytváří stabilní hybrid za žádaných podmínek.

Zde používaným výrazem zachycená nukleotidová sonda (capture probe) se míní polynukleotid obsahující polynukleotid sjedním řetězcem kopulovaný na vazný partner. Polynukleotid sjedním řetězcem obsahuje cílovou polynukleotidovou sekvenci, která je komplementární s cílovou sekvencí v cílové oblasti, která se má zjistit v analytovém polypeptidu. Tato komplementární oblast je dostatečné délky a komplementarity vůči cílové sekvenci k dosažení stability duplexu, která je dostatečná k immobilizaci analytového polynukleotidu na pevném povrchu (přes vazné partnery). Pojmem vazný partner (binding partner) se míní druhý vazný partner. Druhý vazný partner se může vázat na povrch pevného nosiče nebo se může vázat nepřímo přes jiné struktury nebo vazné partnery na pevný nosič.

Zde používaným výrazem cílová polynukleotidová sekvence (targeting polynucleotide sequence) se míní polynukleotidová sekvence, která zahrnuje nukleotidy, které jsou komplementární s cílovou nukleotidovou sekvencí. Sekvence má dostatečnou délku a komplementaritu s cílovou sekvencí k vytvoření duplexu, který je dostatečně stálý pro zamýšlené účely.

Výrazem vazný partner se zde vždy míní molekula schopná vázat ligandovou molekulu s vysokou specificitou, jako je například antigen a pro něj specifická protilátka. Obecně musejí mít specifické vazné partnery dostatečnou afinitou k imobilizaci analytového kopírovacího/komplementámího řetězcového duplexu (v případě zachycené nukleotidové sondy) za podmínek izolace. Specifické vazné partnery jsou v oboru známy a zahrnují například biotin a avidin nebo streptavidin, IgG a protein A, četné známé receptor-ligandové dvojice a komplementární polynukleotidové řetězce. V případě komplementárních polynukleotidových vazných partnerů mají partnery délku zpravidla alespoň přibližně 15 bází a mohou být dlouhé alespoň 40 bází. Kromě toho mají obsah G aC alespoň přibližně 40 % a až přibližně 60 %. Polynukleotidy mohou být složeny z DNA, RNA nebo ze syntetických nukleotidových analogů.

Zde používaným výrazem kopulovaný se míní vázaný kovalentními vazbami nebo silnými nekovalentními interakcemi (například hydrofobním vzájemným působením, vodíkovými vazbami). Kovalentní vazby mohou být například esterové, etherové, fosfoesterové, amidové, peptidové, imidové, vazby uhlík-síra, vazby uhlík-fosfor.

Zde používaným výrazem nosič (support) se míní jakýkoliv pevný nebo polopevný povrch, do kterého se má žádaný partner zakotvit. Jakožto vhodné nosiče se příkladně uvádějí sklo, plasty, kovy, polymemí gely a tyto nosiče mohou mít formu například kuliček, jímek, ponorných tyček

-7CZ 282573 B6 a membrán.

Výrazem značení (label) se zde vždy míní jakýkoliv atom nebo podíl, kterého se může použít pro vytvoření zjistitelného (s výhodou kvantitativně stanovitelného) signálu a který se může vázat na polynukleotid nebo polypeptid.

Zde používaným výrazem značená nukleotidová sonda (label probe) se míní oligomer, který zahrnuje cílovou polynukleotidovou sekvenci, která je komplementární s cílovou sekvencí, která se má zjistit v analytovém polynukleotidu. Tato komplementární oblast je dostatečně dlouhá a komplementární s cílovou sekvencí k poskytnutí duplexu zahrnujícího značenou nukleotidovou sekvenci a cílovou sekvenci, která se má zjistit značením. Oligomer se kopuluje se značením buď přímo, nebo nepřímo přes sadu ligand molekul s vysokou vzájemnou specifičností. Sada ligandových molekul s vysokou specificitou je popsána shora a zahrnuje také multimery.

Zde používaným výrazem multimer se míní lineární nebo rozvětvené polymery téže opakující se polynukleotidové jednořetězcové jednotky nebo různých polynukleotidových jednořetězcových jednotek. Alespoň jedna z těchto jednotek má sekvenci, délku a složení, které umožňují hybridizaci specificky na první určovanou jednořetězcovou nukleotidovou sekvenci, zpravidla na analyt nebo na oligomer (například značená nukleotidová sonda), vázaný na analyt. K dosažení takové specificity a stability má tato jednotka délku zpravidla alespoň přibližně 15 nukleotidů, zpravidla ne více než přibližně 50 nukleotidů a s výhodou přibližně 30 nukleotidů. Kromě toho obsah G a C je zpravidla alespoň přibližně 40 % a zvláště přibližně 60 %. Kromě takové jednotky nebo takových jednotek zahrnuje multimer četné jednotky, které jsou schopny hybridizace specificky a stabilně na druhý určovaný jednořetězcový nukleotid, zpravidla značený polynukleotid nebo jiný multimer. Tyto jednotky jsou obecně přibližně stejné velikosti a složení jako multimery shora uvedené. Jestliže je multimer určen k hydridizaci s jiným multimerem, jsou první a druhé polynukleotidové jednotky heterogenní (odlišné) a nehybridizují spolu navzájem za podmínek volených při zkoušce. Proto mohou být multimery značenými nukleotidovými sondami, nebo mohou být ligandy, které kopulují značení na nukleotidovou sondu.

Zde používaným výrazem virová RNA (viral RNA), který zahrnuje HCV RNA se míní RNA z virového genomy, jeho fragmenty, jeho transkripty a mutantové sekvence, od nich odvozené.

Zde používaným výrazem biologický vzorek se míní vzorek tkáně nebo kapaliny, izolovaný z individuí, včetně, nikoliv však jako omezení, například plasmy, sera, míšní kapaliny, lymfatické kapaliny, vnějších částí pokožky, částí respiračního traktu, střevního nebo genitourinálního traktu, slz, slin, mléka, krevních buněk, nádorů, orgánů a také vzorků in vivo buněčných kultur (včetně, nikoliv však s omezením, kondicionovaných prostředí, získaných z růstu buněk v prostředí pro kultivaci buněk, údajně viry infikovaných buněk, rekombinantních buněk a buněčných komponent).

Při provádění způsobu podle vynálezu se používá, pokud není uvedeno jinak, běžných chemických technik, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA a imunologie, které jsou pracovníkům v oboru známy. Takové techniky jsou v literatuře dokonale vysvětleny. Viz například Maniatis, Fitsch & Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Molekulární klonování; Laboratorní příručka) 1982; DNA Cloning (Klonování DNA), svazek I a II, vyd. D. N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis (Oligonukleotidová syntéza), vyd. M. J. Gait, 1984; Nucleic Acid habridization (Hybridizace nukleových kyselin), vyd. B. D. Hames & S. J. Higgins 1984; série publikací Methods in Enzymology (Způsoby v enzymologii) Academie Press, lne. zvláště svazek 154 a 155, vyd. Wu aGrossman. A dále všechny patentové spisy a zveřejněné přihlášky vynálezu zde uváděné.

-8CZ 282573 B6

Užitečné materiály a způsoby podle vynálezu byly umožněny identifikaci HCV jakožto ekologického činidla BB-NANBV a zajištěním rodu nukleotidových sekvencí izolovaných z cDNA řad, které obsahují sekvence HCV cDNA. Tyto cDNA řady (cDNA libraries) byly odvozeny od sekvencí nukleové kyseliny obsažených v plasmě šimpanzů infikovaných HCV. Konstrukce jedné takové řady c řady (ATCC No. 40394) je popsána v PCT Pub. No W090/14436.

Za použití shora popsaných sekvencí HCV cDNA a zde popsaných sekvencí se mohou konstruovat oligomery, které jsou vhodné jakožto reakční činidla pro detekci virových polynukleotidů v biologických vzorcích. Například ze sekvence je možné syntetizovat DNA oligomery o přibližně 8-10 nukleotidech nebo větší, které jsou užitečné jakožto hybridizačni nukleotidové sondy k detekci přítomnosti HCV RNA například v dárcovské krvi, v krevních frakcích, v séru subjektů s údajným virem nebo v buněčných kulturních systémech, ve kterých se virus replikuje. Kromě toho nové oligomery, zde popsané umožňují další charakterizaci HCV genomu. Polynukleotidové sondy a primery, odvozené od těchto sekvencí, se mohou použít k amplifikaci sekvencí přítomných v cDNA řadách a/nebo k clonění cDNA řad pro přídavné překrytí cDNA sekvencí, kterých se opět může použít k získání překrývajících sekvencí. Jak uvedeno ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436, genom HCV se jeví jako že obsahuje primárně velký otevřený čtecí rámec (ORF) RNA, který kóduje velkou polybílkovinu.

Kromě toho informace shora uvedená umožňuje identifikaci přídavných HCV kmenů a izolátů. Izolace a charakterizace přídavných HCV kmenů nebo izolátů je možná například izolací nukleových kyselin z tělesných složek, obsahujících virové částice a/nebo virovou RNA, vytvářející cDNA řady za použití oligomerů založených na HCV1 sekvenci pro clonění řad klonů, obsahujících HCV cDNA sekvence, dále popsané, a obsahující HCV cDNA žňových izolátů s cDNA, popsaných ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436 a v literatuře. Kmeny a izoláty, které spadají do parametrů HCV, jak popsáno v definiční části, jsou snadno identifikovatelné. Jiné způsoby identifikace HCV kmenů jsou pracovníkům v oboru zřejmé a jsou založeny na zde uvedených informacích.

Sekvence HCV cDNA se izolují následujícím způsobem:

Oligomery podle vynálezu obsahují oblasti, které vytvářejí hybridové duplexní struktury s cílovými sekvencemi v HCV polynukleotidech. HCV polynukleotidové hybridizačni oblasti oligomerů se mohou zjišťovat z HCV cDNA sekvence nebo sekvencí zde uvedených a popsaných ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436. Komposit z HCV cDNA zHCVl, prototypický HCV je na obr. 1. Kompositová sekvence je založena na sekvenční informaci, odvozené z četných HCV cDNA klonů, které byly izolovány z četných HCV cDNA řad, včetně c řady, obsažení v lambda gtl 1 (gtl 1) (ATCC No. 40394) a z lidského séra: HCV cDNA klony se izolují způsobem popsaným ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436. Krátce řečeno, většina isolovaných klonů obsahuje sekvence z HCV cDNA c řady, která byla zkonstruována za použití spojeného séra šimpanze s chronickou HCV infekcí a obsahující vysoký titr viru, to je alespoň 10⁶ šimpanzích infekčních dávek/ml (CID/ml). Shromážděného séra se používá k izolaci virových částic. Nukleové kyseliny izolované z těchto částic, se používají při uvažované konstrukci cDNA řad na virový genom. Počáteční klon, 5-1-1, se získá cloněním c řady se sérem od infikovaných individuí. Po izolaci počátečního clonu se získá zbylá sekvence cloněním se syntetickou polynukleotidovou sondou, jejíž sekvence je odvozena od oblasti 5' a oblasti 3' známé HCV cDNA sekvence nebo známých HCV cDNA sekvencí.

Popis způsobů hledání cDNA sekvencí má většinou historický význam. Výsledné sekvence (a jejich doplňky) jsou zde uvedeny a sekvence nebo jakékoliv jejich díly se mohou připravovat za použití syntetických způsobů nebo kombinací syntetických způsobů s hledáním parciálních sekvencí za použití podobných způsobů jako je popsáno ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436.

-9CZ 282573 B6

Oligomemí nukleotidové sondy a primery.

Za použití jakožto báze HCV genomu (jak znázorněno na obr. 1) a/nebo s výhodou konservovaných oblastí HCV genomu se mohou připravit oligomery s přibližně 8 nukleotidy nebo s více nukleotidy, které hybridizují s pozitivním řetězcem nebo s pozitivními řetězci HCV RNA nebo jeho komplementu, jakož také s HCV cDNA. Tyto oligomer mohou sloužit jakožto nukleotidové sondy pro zjištění (včetně izolace a/nebo značení) polynukleotidů, které obsahují HCV nukleotidové sekvence a/nebo jakožto primery pro transkripci a/nebo replikaci cílových HCB sekvencí. Oligomery obsahují cílovou polynukleotidovou sekvenci, která sestává z nukleotidů, které jsou komplementární s cílovou HCV nukleotidovou sekvencí. Tyto sekvence jsou dostatečně dlouhé a komplementární s HCV sekvencí k vytvoření duplexu, který má dostatečnou stabilitu pro záměrný účel. Například pro účel izolace prostřednictvím imobilizace analytu, obsahujícího cílovou HCV sekvenci, by oligomery mohly obsahovat polynukleotidovou oblast, která je dostatečně dlouhá a komplementární s cílovou HCV sekvencí k dosažení dostatečné stability duplexu k imobilizaci analytu na pevném povrchu prostřednictvím jeho vázání na oligomery za podmínek izolace. Například také jestliže oligomery slouží jakožto primery pro transkripci a/nebo replikaci cílové HCV sekvence v analytovém polynukleotidu, obsahovaly by oligomery polynukleotidovou oblast dostatečné délky a komplementarity k cílové HCV sekvenci, aby polymemí činidlo pokračovalo v replikaci z primerů, které jsou ve stabilním duplexním tvaru s cílovou sekvencí za podmínek polymerace. Například také jestliže se oligomery mají použít jakožto značené nukleotidové sondy nebo se mají vázat na multimery, cílující polynukleotidová oblast by měla dostatečnou délku a komplementaritu k vytvoření stabilních hybridových duplexních struktur se značenou polynukleotidovou sondou a/nebo s multimery k umožnění detekce duplexu. Oligomery mohou obsahovat minimálně přibližně 4 styčné nukleotidy, které jsou komplementární s cílovou HCV sekvencí. Zpravidla oligomery obsahují minimálně přibližně 8 styčných nukleotidů, které jsou komplementární s cílovou HCV sekvenci a s výhodou obsahují minimálně přibližně 14 styčných nukleotidů, které jsou komplementární s cílovou HCV sekvenci.

Vhodné HCV nukleotidové cílující sekvence mohou být tvořeny nukleotidy, které jsou komplementární k nukleotidům, voleným ze souboru HCV cDNA nukleotidů, které jsou na obr. 1.

Oligomer však nemusí sestávat pouze ze sekvence, která je komplementární k cílové HCV sekvenci. Může přídavně obsahovat nukleotidové sekvence nebo jiné podíly, které jsou vhodné pro účely, pro které se oligomeru používá. Například jestliže se oligomeru používá jakožto primeru pro zesílení HCV sekvencí prostřednictvím PCR, mohou obsahovat sekvence, které jsou-li duplexní, vytvářejí restrikční enzymové polohy, které usnadňují klonování zesílených sekvencí. Například také, jestliže má být oligomerů použito jakožto zachycených polynukleotidových sond (capture probes) při hybridizačních pokusech (jinde popsaných), obsahují přídavně vazný partner, který je kopulovaný na oligomer obsahující nukleotidovou sekvenci, která je komplementární s cílovou HCV sekvencí. Jiné typy podílů nebo sekvencí, které jsou užitečné, které mohou obsahovat oligomer nebo se kopulovat na oligomer, jsou v oboru o sobě známy jakožto vhodné pro nejrůznější účely včetně značení nukleotidových sond.

Oligomery se připravují o sobě známým způsobem včetně například způsobů zahrnujících štěpení, transkripci nebo chemickou syntézu. Cílové sekvence a/nebo oblasti genomu, které jsou vybrány, k nimž jsou cílené polynukleotidy oligomerů komplementární, závisí na účelu. Například jestliže je cílem clonění se zřetelem na přítomnost HCV v biologických vzorcích (například v krvi), použilo by se výhodných oligomerů jakožto nukleotidových sond a/nebo primerů a hybridizovaly by ke konservovaným oblastem HCV genomu. Některé z konservovaných oblastí HCV genomu, ke kterému se oligomery mají vázat, jsou zde popsány, například oblasti, které zahrnují nukleotid čísel přibližně zakončeni 5 až přibližně 200 nebo přibližně 4000 až přibližně 5000 nebo přibližně 8000 až přibližně 9040, jak je zřejmé z obr. 1, nebo s výhodou

- 10CZ 282573 B6 nukleotidy přibližně -318 až přibližně 174, přibližně 4056 až přibližně 4448 a přibližně 4378 až přibližně 4902. Obzvláště výhodné primery a nukleotidové sondy jsou odvozeny od přibližně nukleotidů -313 až přibližně -173 a od přibližně nukleotidu 1 až přibližně nukleotidu 540, jak je zřejmé z obr. 1.

Jiné oblasti genomu, které jsou konservovány, jsou snadno stanovitelné porovnáním nukleotidových sekvencí různých izolátů HCV, včetně prototypu HCV, HCV1. Způsoby srovnávání mezi genotypy ke stanovení konservovaných a nekonservovaných oblastí jsou v oboru znány a příklady těchto způsobů jsou popsány ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436.

V základních zkouškách hybridizace nukleové kyseliny se hybridizuje jednořetězcová analytová nukleová kyselina (buď DNA, nebo RNA) na nukleotidovou sondu nukleové kyseliny a zjistí se výsledné duplexy. Nukleotidové sondy pro HCV polynukleotidy (přírodní nebo odvozené) mají délku, která umožňuje detekci specifických virových sekvencí hybridizací. Jakkoliv 6 až 8 nukleotidů může být pracovní délkou, dává se přednost sekvencím 10 až 12 nukleotidů a optimální se jeví sekvence přibližně 20 nukleotidů. S výhodou se tyto sekvence odvozují od oblastí, které jsou prosty heterogenity. Tyto nukleotidové sondy se mohou připravovat rutinními způsoby včetně automatizovaných oligonukleotidových syntezních postupů. Mezi užitečné nukleotidové sondy patří nukleotidové sondy, odvozené od nově izolovaných klonů, o nichž bude pojednáno, jakož také různé oligomery užitečné pro sondování cDNA řad, jak bude rovněž popsáno. Doplněk kjakékoliv specifické oblasti HCV genomu bude uspokojující. Pro použití jakožto nukleotidové sondy je žádoucí dokonalá komplementarita, jakkoliv může být nepotřebná, jestliže délka fragmentu vzrůstá.

Pro použití takových nukleotidových sond jakožto činidel ke detekci přítomnosti HCV polynukleotidů (například při clonění kontaminované krve) se může biologický analyzovaný vzorek, jako krev nebo krevní sérum, popřípadě zpracovávat k extrakci obsažených nukleových kyselin. Rezultující nukleová kyselina ze vzorku může být podrobena gelové elektroforese nebo jiné technice dělení. Alternativně se vzorek nukleové kyseliny může tečkován bez separace rozměru. K vytváření hybridových duplexů s cílovou sekvencí nukleotidové sondy musí být cílová oblast analytové nukleové kyseliny ve formě s jedním řetězcem. Když je sekvence přírodně v jednořetězcové formě, není nutná denaturace. Jestliže je však sekvence obsažena ve dvouřetězcové formě, sekvence se má denaturovat. Denaturace se může provádět různými o sobě známými způsoby. Po denaturaci se analytová nukleová kyselina a nukleotidová sonda inkubuje za podmínek, které podporují vytváření stabilního hybridu cílové sekvence v nukleotidové sondě s údajnou cílovou sekvencí v analytu a zjistí se vzniklé duplexy obsahující nukleotidovou sondu nebo nukleotidové sondy.

Detekce případného výsledného duplexu se zpravidla provádí použitím značených nukleotidových sond. Alternativně může být nukleotidová sonda neznačená, má však být zjistitelná specifickým vázáním se značeným ligandem buď přímo, nebo nepřímo. Vhodné značení a způsoby pro značení nukleotidových sond a ligandů jsou v oboru známy a zahrnují například radioaktivní značení, které se může vytvářet o sobě známými způsoby (například posunem jednořetězcového zlomu nebo kinasováním), biotin, fluorescenční skupiny, chemiluminiscenční skupiny (například dioxetany, zvláště spouštěcí dioxetany), enzymy, protilátky a pod.

Obor nukleotidových sond, kterých se používá k vázání analytu, může být dokonale komplementární k HCV genomu. Proto jsou zpravidla nutné velmi přísné podmínky, aby se předešlo chybné pozitivitě. Avšak vysoce přísných podmínek se má použít pouze, když je nukleotidová sonda komplementární k oblasti virového genomu, prosté heterogenity. Přísnost hybridizace je stanovena četnými faktory v průběhu hybridizace a v promývacích operacích, včetně teploty, iontové síly, trvání a koncentrace formamidu. Tyto faktory přehledně popsal například T. Maniatis (1982).

- 11 CZ 282573 B6

Variace základního schéma, které jsou v oboru známy, včetně variací usnadňujících separaci duplexů, které se mají zjistit z cizích materiálů a/nebo které zesilují signál ze značeného podílu, se mohou rovněž používat. Četné takové variace popsal například Matthews a Kricka (1988), Anal. Biochem. 169:1; Landegren a kol. (1988), Science 242:229: a Mittlin (1989), Clin. Chem. 35:1819. Nukleotidové sondy, vhodné pro zjištění HCV v těchto testech, jsou obsaženy v sekvencích, které hybridizují s cílovými HCV polynukleotidovými sekvencemi za vytvoření duplexů s analytovým řetězcem, přičemž duplexy jsou dostatečně stabilní pro zjištění ve specifickém zkoušeném systému.

Vhodnou variací je například způsob, popsaný v americkém patentovém spise číslo 4 868105, zveřejněném 9. 9. 1989 a v evropské přihlášce vynálezu číslo 225807, zveřejněné 16. 6. 1987. Tyto publikace popisují hybridizační zkoušku roztokové fáze nukleové kyseliny, při které se analytová nukleová kyselina hybridizuje na sadu značených nukleotidových sond a na sadu zachycených nukleotidových sond. Komplex nukleotidové sondy a analytu se kopuluje hybridizací se zachycenou nukleotidovou sondou na pevném nosiči, která je komplementární k sadě zachycených nukleotidových sond. To umožňuje, aby se analytová nukleová kyselina odstranila z roztoku jakožto pevná komplexní fáze. Jestliže je analyt ve formě pevné komplexní fáze, jsou usnadněny následující dělicí stupně. Značkující sestava nukleotidové sondy je komplementární ke značené nukleotidové sondě, která je hybridizací vázána na komplex pevná fáze/analyt.

Obecně se očekává, že HCV genomová sekvence bude obsažena v séru infikovaných jedinců v poměrně nízké koncentraci, to znamená v množství přibližně 10 až 10³ šimpanzích infekčních dávek (CID) na ml. Tato koncentrace může vyžadovat použití technik zesílení při hybridizačních zkouškách. Takové techniky jsou v oboru známy. Například systém Enzo Biochemical Corporation Bio-Bridge používá koncové deoxynukleotidové transferasy k adici nemodifikovaných 3'poly-dT zakončení (tails) k DNA nukleotidové sondě. Nukleotidová sonda, modifikovaná póly dT se hybridizuje na cílovou nukleotidovou sekvenci a pak na biotinem modifikovaný poly-A. Zveřejněná přihláška vynálezu PCT Pub. No. W084/03520 a zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo 124221 popisuje DNA hybridizační zkoušku, při které: (1) analyt se tepelně hybridizuje na jednořetězcovou DNA nukleotidovou sondu, která je komplementární s oligonukleotidem, značkovaným enzymem a (2) získaný duplex se hybridizuje na enzymem značený oligonukleotid. Ve zveřejněné evropské přihlášce vynálezu číslo 204510 se popisuje DNA hybridizační zkouška, podle které se analyt DNA uvádí do styku s nukleotidovou sondou, která má zakončení, například poly-dT zakončení, zesílený řetězec, který má sekvenci, která hybriduje na zakončení nukleotidové sondy, například poly-A-sekvenci, a která je schopna vázat četné značené řetězce. Typ hybridizační zkoušky, který je popsán v evropské přihlášce vynálezu číslo 317077 (zveřejněné 24. 5. 1989), podle které se zjišťují sekvence v koncentraci přibližně 10⁶/ml, používá multimerů nukleové kyseliny, které váží jednořetězcovou analytovou nukleovou kyselinu a které se také váží na četné jednořetězcové značené oligonukleotidy. Zvlášť žádoucí postup může zahrnovat zesílení cílových HCV sekvencí v séru přibližně 10000 násobné (to znamená na přibližně 10⁶ sekvencí/ml) jakožto součást hybridizačního systému. Tohoto zesílení se například může dosáhnout polymerasovými řetězcovými rekcemi (PCR), které popsal Saiki a kol. (1986), Mullis, americký patentový spis číslo 4 683195 a Mullis a kol, americký patentový spis číslo 4 683202. Zesílení se má provádět před čištěním HCV cílové sekvence nebo výhodně po něm. Například zesílení se může využít ve spojení se způsobem, popsaným v americkém patentovém spise 4 868105 nebo, pokud je žádoucí ještě další zesílení spolu s hybridizačním systémem, popsaným ve zveřejněné evropské přihlášce vynálezu číslo 317077.

Výhodné způsoby zjištění HCV sekvencí v analytovém polynukleotidovém řetězci jsou založeny na hybridizačních detekčních způsobech, popsaných v americkém patentovém spise číslo 4 868105 a v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo 317077. Těmito způsoby jsou sendvičové hybridizační zkoušky v roztokové fázi, které využívají jak zachycené nukleotidové

- 12CZ 282573 B6 sondy tak značené nukleotidové sondy, které hybridizují s cílovými sekvencemi v analytové nukleové kyselině. Při použití těchto zkoušek k clonění biologických vzorků se zřetelem na HCV, by se použité nukleotidové sondy vázaly ke konservovaným oblastem HCV genomu. Zachycovací a značkovací nukleotidové sondy mohou být rozptýleny při svém vázání na cílovou sekvenci. Alternativně podle výhodného způsobu jsou zachycovací a značkovací nukleotidové sondy v sadách a nukleotidové sondy jedné sady se nerozptylují do nukleotidových sond druhé sady.

Podle dalšího způsobu s výhodou sada nebo sady četných zachycovacích nukleotidových sond hybridizují na většinu konservovaných oblastí genomu, zatím co sada nebo sady četných značkovacích nukleotidových sond mohou hybridizovat na oblastech, které vykazují malý rozsah divergence. Například za použití prototypu HCV 1 cDNA sekvence podle obr. 1 se může použít nukleotidových sond, které hybridizují na sekvence v oblasti nukleotidů přibližně -318 až přibližně 174 a/nebo nukleotidů oblasti přibližně 4378 až přibližně 4902 a/nebo nukleotidů oblasti přibližně 4056 až přibližně 4448. Výhodné nukleotidové sondy by hybridizovaly na sekvence v oblasti 5' HCV genomu, jelikož, jak je uvedeno v literatuře, se tato oblast jeví jako vysoce konservovaná. Proto výhodné nukleotidové sondy mohou hybridizovat například na nukleotidy od přibližně -318 do přibližně 174, jak je zřejmé z obr. 1. Mohlo by se používat nukleotidových sond, které hybridizují buď na pozitivní řetězec v konservované oblasti a/nebo na jeho doplněk v závislosti na účelu, například ke zjištění virových genomových sekvencí, nebo ke zjištění HCV cDNA sekvencí, vzniklých zPCR zesílení nebo k detekci replikačních meziproduktů pro pozitivní HCV RNA řetězec.

Způsob zjištění HCV RNA a polynukleotidů od nich odvozených za použití způsobu HCV/cPCR

Obzvláště užitečným způsobem pro zjištění HCV RNA nebo polynukleotidů odvozených od HCV RNA je způsob HCV/cPCR, kterého se vynález týká, a při kterém se používá polymerasové řetězcové reakční techniky (PCR) (polymerase chain reaction technique), kterou popsal Saiki a kol. (1986), Mullis v americkém patentovém spise číslo 4 683195 a Mullis a kol. v americkém patentovém spise číslo 4 683202. Způsob HCV/cPCR využívá primerů a nukleotidových sond, odvozených z informace o povaze HCV genomu, zde popsané.

Obecně se při způsobu PCR připravují krátké oligomemí primery, jejichž protějškem jsou opačné konce žádané sekvence. Sekvence mezi primery nemusí být známa. Vzorek polynukleotidu se extrahuje a denaturuje, s výhodou teplem, a hybridizuje se s oligonukleotidovými primery, které jsou přítomny v molámím nadbytku. Polymerace se katalyzuje polymerasou závislou na matrici a primeru v přítomnosti deoxynukleotidových trifosfátů nebo nukleotidových analogů (dNTP). Způsob vede ke dvěma dlouhým produktům, které obsahují příslušné primery na svém 5' zakončení, kovalentně vázané na nově syntetizované doplňky původních řetězců. Replikovaná DNA se opět denaturuje, hybridizuje se s oligonukleotidovými primery, vrací se do polymeračních podmínek a iniciuje se druhý cyklus replikace. Druhý cyklus produkuje dva originální řetězce, dva dlouhé produkty z cyklu 1 a dva krátké produkty replikované z dlouhých produktů. Krátké produkty obsahují sekvence (negativní DNA řetězec nebo antinegativní DNA řetězec) odvozené od cílové sekvence, lemované na zakončení 5', 3' příměrovými sekvencemi. Na každý přídavný cyklus se počet krátkých produktů replikuje exponenciálně. Tak vede způsob k zesílení specifické cílové sekvence.

Při způsobu se obstará vzorek s podezřením na obsah HCV RNA nebo jeho fragmentu. Vzorek se zpravidla odebírá jedinci s podezřením na NANBH. Jsou však zahrnuty také jiné zdroje vzorku, například kondicionované prostředí nebo buňky v systémech in vitro, ve kterých se replikoval virus. Vzorek však musí obsahovat cílovou sekvenci nukleové kyseliny nebo cílové sekvence nukleové kyseliny.

- 13 CZ 282573 B6

Vzorek se pak podrobuje podmínkám, které umožňují reversní transkripci HCV RNA na HCV cDNA. Podmínky pro reverzní transkripci RNA jsou pracovníkům v oboru známy a popsal je například Maniatis a kol. (1982) a jsou popsány v publikaci Methods in Enzymology. Výhodný způsob reverzní transkripce využívá reverzní transkriptasy z různých zdrojů, včetně rekombinantních molekul a izolovaných například z retrovirů, s výhodou z ptačího myeloblastosis viru (AMV) a vhodných podmínek pro transkripci. HCV cDNA produkt reversní transkripce je RNA:DNA hybrid, který je produktem prvního pochodu reversní transkripce: následně se získají DNA:DNA hybridy ze dvou nebo několika pochodů transkripce.

HCV cDNA jakožto produkt reversní transkripce se pak podrobuje PCR k zesílení cílové sekvence. Aby se toho dosáhlo, HCV cDNA se denaturuje a oddělené řetězce se hybridizují s primery, které lemují cílovou sekvenci.

Separace řetězce se může dosáhnout jakýmkoliv vhodným denaturačním způsobem, včetně fyzikálních, chemických nebo enzymatických způsobů, které jsou pracovníkům v oboru známy. Výhodný způsob, který je fyzikální, zahrnuje zahřívání nukleové kyseliny až kjejí dokonalé denaturaci (z více než 99 %). Typická denaturace teplem zahrnuje působení teploty přibližně 80 až přibližně 105 °C po dobu přibližně 1 až 10 minut.

Po hybridizaci HCV cDNA s primery, cílové HCV sekvence se replikují polymeračními prostředky, které využívají příměrového oligonukleotidu k iniciaci syntézy replikačního řetězce. Primery se volí tak, aby byly komplementární k sekvencím HCV genomu. Oligomemí primery, které jsou komplementární k oblastem negativního DNA řetězce a antinegativního DNA řetězce cDNA se mohou konstruovat ze HCV cDNA sekvencí z kompozitu cDNA sekvence podle obr. 1.

Primery se volí tak, že jejich relativní polohy podél duplexové sekvence jsou takové, že prodloužený produkt, syntetizovaný z primeru při oddělování ze své matrice (koplementu) slouží jakožto matrice pro prodloužení jiného primeru k získání replikačního řetězce definované délky.

Primer je s výhodou jednořetězcový pro maximální účinnost zesílení, alternativně však také může mít dva řetězce. V případě dvou řetězců se primer nejdříve zpracovává k oddělení svých řetězců před použitím pro přípravu prodloužených produktů. S výhodou je primerem oligodeoxyribunukleotid. Primer musí být dostatečně dlouhý k podpoře syntézy prodloužených produktů v přítomnosti polymeračního činidla. Přesné délky primerů závisí na četných faktorech, včetně teploty a zdroje primeru a užitého způsobu. Například v závislosti na komplexnosti cílové sekvence obsahuje oligonukleotidový primer zpravidla přibližně 15 až 45 nukleotidů, jakkoliv může obsahovat více nebo méně nukleotidů. Krátké primerové molekuly obecně vyžadují chladnější teplotu k vytvoření dostatečně stabilních hybridových komplexů s matricí.

Zde používané primery jsou voleny tak, aby byly v podstatě komplementární k různým řetězcům každé specifické sekvence, která se má zesilovat. Proto primery nemusejí reflektovat přesně sekvenci matrice, musí však být dostatečně komplementární k selektivní hybridizaci s jejich řetězci. Například nekomplementámí nukleidový fragment se může vázat na 5' zakončení primeru se zbytkem primerové sekvence komplementárním pro řetězec. Alternativně nekomplementámí báze nebo delší sekvence se mohou rozptýlit do primeru, za podmínky, že má primer dostatečnou komplementaritu se sekvencí jednoho z řetězců, který se zesiluje, k hybridizaci s ním a k vytvoření duplexní struktury, která se může prodloužit polymeračními prostředky. Nekomplementámí nukleotidové sekvence primerů mohou zahrnovat restrikční enzymová místa. Připojování restrikčního enzymového místa ke konci nebo ke koncům cílové sekvence by bylo zvláště nápomocné pro klonování cílové sekvence.

Připomíná se, že zde používaný výraz primer, se může vztahovat na více než jeden primer, zvláště v případě, kdy je v určitém sousedství v informaci vztahující se na koncovou sekvenci nebo na koncové sekvence cílové oblasti, která se má zesilovat. Primer tudíž zahrnuje kolekci

- 14CZ 282573 B6 příměrových oligonukleotidů, obsahujících sekvence, představující možné variace v sekvencích nebo zahrnující nukleotidy, které umožňují typické vytváření párů bází. Jeden z příměrových oligonukleotidů v této kolekci bude homologický s koncem cílové sekvence. Specifický případ je, kdy se používá sady oligomerů k zesílení potenciálně variantní oblasti HCV genomu.

Očekává se, že je rozdílnost řetězců nebo izolátů HCV se sekvencemi, které se odchylují od HCV1 prototypového řetězce. Proto ke zjištění variantních řetězců je výhodné konstruovat primery, které hybridizují ke konservovaným oblastem HCV genomu. Konservované oblasti se mohou zjišťovat porovnáním nukleotidu nebo aminokyselinových sekvencí několika HCV řetězců/isolátů. Zdá se, že jsou alespoň tři oblasti konservované aminokyseliny v HCV genomu, shora popsaného, od které se mohou primery odvodit. Má se za to, že tyto oblasti existují. Primery, popsané dále v příkladech, jsou odvozeny od primerů, o kterých se předpokládá, že jsou konservovanými oblastmi HCV založenými na homologické sekvenci s Flaviviry.

Oligonukleotidové primery se mohou připravovat jakýmkoliv vhodným způsobem. Způsoby pro přípravu oligonukleotidů specifické sekvence jsou v oboru známy a zahrnují například klonování a restrikci vhodných sekvencí a přímou chemickou syntézu. Chemické syntetické způsoby mohou zahrnovat například fosfortriesterovou metodu, kterou popsal Narang a kol. (1979), fosfodiesterovou metodu, kterou popsal Brown a kol. (1979), diethylfosforamidátovou metodu, kterou popsal Beaucage a kol. (1981) a metodu s pevným nosičem podle amerického patentového spisu číslo 4 458066.

Primery se mohou popřípadě značit včleněním činidel stanovitelných spektroskopicky, fotochemicky, biochemicky, immunochemicky nebo chemicky.

Na matrici závislé prodloužení oligonukleotidového primeru nebo oligonukleotidových primerů se katalyzuje polymerizačním činidel v přítomnosti vhodného množství čtyř deoxyribonukleotidových trifosfátů (dATP, dGTP, dCTP a dTTP) nebo analogů v reakčním prostředí, které je tvořeno ve vhodném prostředí soli, kovových kationtů a pufračního systému pH. Vhodnými polymeračními činidly jsou enzymy, o nichž je známo, že katalyzují na primeru a na matrici závislou syntézu DNA. Známé DNA polymerasy zahrnují například E. coli DNA polymerasu I nebo fragment Klenow, T₄ DNA polymerasu a Taq DNA polymerasu. Reakční podmínky pro katalýzu DNA syntézy s těmito DNA polymerasami jsou v oboru známé.

Produkty syntézy jsou duplexní molekuly, sestávající z matricových řetězců a příměrových prodloužených řetězců, které zahrnují cílovou sekvenci. Tyto produkty opět slouží jako matrice pro další pochod replikace. Ve druhém pochodu replikace příměrový prodloužený řetězec z prvního cyklu se tepelně hybridizuje s komplementárním primerem. Syntéza poskytuje krátký produkt, který se váže na obě 5'a 3' zakončení příměrových sekvencí nebo jejich doplňků. Opakované cykly denaturace, tepelné hybridizace primeru a prodlužování vedou k exponenciální akumulaci cílové oblasti definované primery. Provádí se dostatečný počet cyklů k dosažení žádaného množství polynukleotidu obsahujícího cílovou oblast nukleové kyseliny. Žádané množství se může měnit aje dáno funkcí, pro kterou je polynukleotidový produkt určen.

Způsob PCR se může provádět v četných časových sekvencích. Například se může provádět postupně, kdy se po každém stupni přidávají nová reakční činidla, nebo se provádí tak, že se současně přidají všechny reagencie nebo se může provádět parciálně postupným způsobem, kdy se čerstvé reagencie přidávají vždy po daném počtu stupňů.

Podle výhodného způsobu se PCR reakce provádí jakožto automatizovaný proces za použití tepelně stálého enzymu. Při tomto způsobu se reakční směs cyklicky vede denaturační oblastí, oblastí tepelné hybridizace primeru a reakční oblastí. Může se používat strojního zařízení, specificky upraveného pro použití s tepelně stálým enzymem, které využívá tepelné cyklizace bez kapalného manipulačního systému, jelikož se enzym nemusí přidávat v každém cyklu. Tento

- 15 CZ 282573 B6 typ zařízení je obchodně dostupný u společnosti Perkin Elmer Cetus Corp.

Po zesílení způsobem PCR se cílové polynukleotidy zjišťují hybridizací s nukleotidovou sondou, která vytváří stabilní hybrid s cílovou sekvencí za přísných až mírně přísných podmínek 5 hybridizace a promývání. Pokud se očekává, že nukleotidová sonda bude dokonale komplementární (to znamená z 99 a více procent) k cílové sekvenci, používá se přísných podmínek. Pokud se očekává určitý nesouhlas, například pokud se očekávají variace kmenů s výsledkem, že nukleotidová sonda nebude dokonale komplementární, přísnost hybridizačních podmínek se může snížit. Podmínky se však zpravidla volí tak, aby splňovaly nespecifické/nahodilé vázání. 10 Podmínky, které ovlivňují hybridizaci a které se volí proti nespecifickému vázání, jsou v oboru známy a popsal je například Maniatis a kol. (1982). Obecně nižší koncentrace soli a vyšší teplota zvyšují přísnost vázání. Například se obecně soudí, že přísné podmínky jsou inkubace v roztoku, který obsahuje přibližně 0,1 x SSC, 0,1 % SDS při teplotě přibližně 65 °C při inkubaci a promývání a za mimě přísné podmínky se považuje inkubace v roztoku, který obsahuje 15 přibližně 1 - 2 x SSC, 0,1 % SDS za přibližné teploty 50 až 65 °C při inkubaci a promývání. Za málo přísné podmínky se považuje 2 x SSC a teplota přibližně 30 až 50 °C.

Nukleotidové sondy pro HCV cílové sekvence se mohou odvodit od HCV cDNA sekvence podle obr. 1. nebo z nových HCV isolátů. HCV nukleotidové sondy mohou být jakékoliv délky, která 20 překlenuje cílovou oblast, která však vylučuje příměry a která umožňuje specifickou hybridizaci cílové oblasti. Pokud má být komplementarita úplná, to znamená pokud kmen obsahuje sekvenci identickou k sekvenci nukleotidové sondy, jelikož duplex bude poměrně stabilní i za přísných podmínek, mohou být nukleotidové sondy krátké, to znamená v oboru páru bází 10 až 30. Pokud se očekává určitý stupeň nesouhlasu s nukleotidovou sondou, to znamená, že je podezření, že 25 nukleotidová sonda bude hydridizovat na variantní oblast, má mít nukleotidová sonda větší délku, jelikož se má za to, že délka bude určitým vyvážením účinku nesouhlasu.

Nukleotidová sonda nukleové kyseliny, mající sekvenci komplementární k cílové sekvenci, se může syntetizovat za použití podobných způsobů, jako shora popsáno pro syntézu příměrových 30 sekvencí. Pokud je to žádoucí, může se nukleotidová sonda značit. Vhodná značení jsou shora uvedena.

V některých případech může být žádoucí stanovit délku PCR produktu, zjištěného nukleotidovou sondou. To může přicházet v úvahu zvláště tehdy, jestliže se předpokládá, že variantní HCV 35 kmeny mohou obsahovat delece uvnitř cílové oblasti nebo je žádoucí potvrdit délku PCR produktu. V takových případech je výhodné podrobovat produkty rozměrové analýze jakož také hybridizaci s nukleotidovou sondou. Způsoby stanovení velikosti nukleových kyselin jsou v oboru známé a zahrnují například gelovou elektroforesu, sedimentaci v gradientech a gelovou vylučovací chromatografii.

Přítomnost cílové sekvence v biologickém vzorku se zjišťuje stanovením, zdali se vytvořil hybrid mezi HCV polynukleotidovou sondou a nukleovou kyselinou, podrobenou PCR zesilovací technice. Způsoby zjištěni hybridu, vytvořeného mezi nukleotidovou sondou a nukleokyselinovou sekvencí, jsou v oboru o sobě známy. Například pro jednoduchost neznačený vzorek se 45 může přenést na pevnou matrici, ke které se váže a vázaný vzorek se podrobuje podmínkám, které umožňují specifickou hybridizaci se značenou nukleotidovou sondou. Pevná matrice se pak zkouší na přítomnosti značené nukleotidové sondy. Alternativně pokud je značen vzorek neznačená nukleotidová sonda se váže na matrici a po vystavení vhodným hybridizačním podmínkám se matrice zkouší na přítomnost značení. Jiné vhodné hybridizační postupy jsou 50 popsány shora.

Stanovení variantu HCV sekvenci za použití PCR

Pro stanovení variantních HCV kmenů a tak ke zjištění nukleotidových sond pro tyto varianty se

- 16CZ 282573 B6 používá shora uvedeného HCV/cPCR způsobu pro zesílení variantních oblastí HCV genomu, takže se může stanovit nukleotidová sekvence těchto variantních cílových oblastí. Obecně se může očekávat výskyt variantních typů HCV v odlišných zeměpisných oblastech, než ve kterých je HCV1 převládající, například v Japonsku a v Africe, nebo u různých druhů obratlovců, které jsou virem rovněž infikovány. Varianty HCV mohou také vzrůstat při pasáži v tkáňových kultivačních systémech nebo mohou být následkem spontánní nebo navozené mutace.

Pro zesílení variantní cílové oblasti jsou určeny primety k matricování podezřelých oblastí a s výhodou jsou komplementární ke konservovaným oblastem. Příměry ke dvěma oblastem HCV, které jsou pravděpodobně konservovány, jsou založeny na Flavivirovém modelu. Tyto primery a nukleotidové sondy mohou být určeny k použití informační sekvence pro HCV 1 kmen podle obr. 1.

Analýzou nukleotidové sekvence cílové oblasti nebo cílových oblastí může být přímá analýza PCR zesílených produktů. Proces pro přímou analýzu sekvencí PCR zesílených produktů popsal Saiki a kol. (1988).

Nebo se zesílená cílová sekvence nebo zesílené cílové sekvence mohou klonovat před sekvenční analýzou. Způsob pro přímé klonování a sekvenční analýzu enzymaticky zesílených genomových segmentů popsal Scharf (1986). Při tomto způsobu se použité primery v PCR technice modifikují v blízkosti jejich 5' zakončení k produkci vhodných restrikčních míst pro přímé klonování například do Ml3 sekvenčního vektoru. Po zesílení se PCR produkty štěpí se vhodnými restrikčními enzymy. Restrikční fragmenty se ligátují do M13 vektoru a transformují se například do JM 103 hostu naplátovaného a získané plakety se cloní hybridizací se značenou oligonukleotidovou sondou. Jiné způsoby klonování a sekvenční analyzy jsou v oboru známy.

Univerzální primery pro Flaviviry a pro HCV

Studie povahy genomu HCV za použití nukleotidových sond, odvozených od HCV cDNA jakož také sekvenční informace obsažená v HCV cDNA dávají podnět ktomu že HCV je vir Flavi typu. Tyto studie jsou popsány ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No. W090/14436. Porovnání HCV cDNA sekvence, odvozené od HCV cDNA klonů se známými sekvencemi četných Flavivirů ukazuje, že HCV obsahuje sekvence, které jsou homologické s konservovanými sekvencemi Flavivirů. Tyto konservované sekvence mohou umožnit vytvoření příměrů, které mohou být univerzální ve svém použití pro zesílení cílových oblastí Flavivirů a pro HCV. Identifikace druhů se pak provádí za použití nukleotidové sondy specifické pro druhy. Genomy četných Flavivirů jsou v oboru známy a zahrnuje je například virus japonské encefalitidy (Sumiyoshi et al. (1987)), virus žluté horečky (Rice et al. (1985)), virus typu Dengue 2 (Hahn et al. (1988)), virus typu Dengue 4 (Mackow (1987)), a virus západního Nilu (Castle et al. (1986)). Identifikace HCV RNA se provádí za použití nukleotidové sondy specifické pro HCV, jejíž sekvence se může stanovit HCV dDNA sekvence zde uvedené.

Alternativně použití souboru nukleotidové sondy nebo nukleotidových sond určených k vysvětlení degenerace kodonu a obsahující proto běžné sekvence k Flavivirům a k HCV, jak stanoveno ze srovnání HCV aminokyselinových sekvencí se známými sekvencemi Flavivirů umožňuje obecný detekční systém pro tyto viry.

Konstrukce žádaných DNA sekvencí

Syntetické polynukleotidy se mohou připravovat za použití automatického oligonukleitidového syntetizeru, který popsal Wamer (1984). Popřípadě se syntetické řetězce mohou značit ³²P zpracováním polynukleotidovou kinasou v přítomnosti ³²P-ATP za použití standardních reakčních podmínek.

- 17CZ 282573 B6

DNA sekvence včetně sekvencí izolovaných z řad cDNA, se mohou modifikovat o sobě známými způsoby včetně například místně řízené mutagenese, kterou popsal Zoller (1982). Stručně řečeno se může modifikovaná DNA vnášet do fágu jakožto jednořetězcová sekvence a převádět na dvouřetězcovou DNA za použití DNA polymerasy při použití jakožto primeru, syntetického oligonukleotidu komplementárního k části DNA, jež se má modifikovat a majícího žádanou modifikaci včleněnou do své vlastní sekvence. Vzniklá dvouřetězcová DNA se převádí do fágu nesoucího hostující bakterium. Kultury transformovaných bakterií, které obsahují replikace každého řetězce fágu, se nanesou na agar k získání plaket. Teoreticky 50 % nových plaket obsahuje fag mající mutovanou sekvenci a zbylých 50 % má původní sekvenci. Replikáty plaket se hybridizují na zančenou syntetickou nukleotidovou sondu za teplot a podmínek, které umožňují hybridizaci se správným řetězcem nikoliv však s nemodifikovanou sekvencí. Sekvence, které byly identifikovány hybridizaci se získají a klonují se.

Soubory pro clonění polynukleotidů odvozených od HCV

Oligomery, které jsou nukleotidovými sondami a/nebo primery pro zesílení a/nebo pro clonění vzorků HCV se mohou sestavovat do souborů. Soubory pro clonění pro HCV sekvence zahrnují oligomemí nukleotidovou sondu DNA. Soubory pro zesílení HCV sekvencí mohou zahrnovat oligomemí primery, používané pro zesílení. Soubory zpravidla obsahují nukleotidové sondy nebo primeiy v předem naměřeném nebo předem stanoveném množství, jakož také jiné vhodně balené reagencie a materiály v oddělených vhodných obalech, potřebných pro určitý hybridizační a/nebo zesilující protokol. Například soubor může obsahovat standardy, pufry, nosiče, enzymy, substráty, značené nukleotidové sondy, vazné partnery a/nebo instrukce pro provádění zkoušky.

Následující příklady praktického provedení vynález objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Detekce pozitivního a negativního řetězce 5'-HCV RNA v séru

RNA v HCV27, izolovaném ze séra se analyzuje na obsah pozitivních a negativních kmenů za použití způsobu PCR. PCR způsob se provádí v podstatě shora popsaným způsobem s následujícími výjimkami.

Extrahovaná HCV27 RNA se reverzně transkribuje do jednořetězcové cDNA za použití jako primeru buď Alex90, nebo JH52. Alex90, je odvozen od nukleotidů -312 až -283 HCVI genomu a má sekvenci:

5'ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAT TAC 3’.

JH52 je odvozen od HCV nukleotidů -93 až -117. Počet nukleotidových členů je uveden v závorkách pod sekvencí. V JA52 podtržený dinukleotid je mutatován k vytvoření Notl polohy. Sekvence pf JH52 je následující (primer) stuffer_______Notl_________HCV sekvence (JH52) 5'AGTCTT GCGGCCGC ACGCCCAAATC 3' (-93) (-117)

Sekvence Alex90 odpovídá v nukleotidech -312 až -283 pozitivního řetězce HCV RNA, zatím co JH52 odpovídá v nukleotidech -117 až -93 negativního řetězce. Rezultující jednořetězcové HCV

- 18CZ 282573 B6 cDNA se odděleně zesilují PCR za použití Alex90 aJH52. Detekce zesílených produktů se provádí skvrnou Southem za použití Alex89 jakožto nukleotidové sondy. Alex89 odpovídá nukleotidovým číslům -203 až -175 HCV RNA. Sekvence Alex89 je

5'CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'

Analýza naznačuje, že při tomto způsobu signály zesílených produktů obou RNA řetězců jsou stejné intenzity. Tyto výsledky naznačují, že HCV RNA v 5'oblasti může existovat jako dvouřetězcová RNA.

Příklad 2

Detekce HCV RNA v plasmě za použití HCV/cPCR, za použití primerů a nukleotidových sond odvozených od 5' oblasti HCV RNA

Extrakce HCV RNA z plasmy

Zmrazená plasma se nechá roztát v P3 čepičce. Přidá se 0,2 ml alikvot degesční směsi (100 milimolámí (mM) Tris-HCl, 2mM EDTA, 200 mM NaCl, 20 mikrogram/mililitr (pg/ml) MS2 RNA, 0,5% SDS a 2 mg/ml proteinasy D, hodnota pH 8) do 2 ml zkumavky a předehřeje se na 37 °C. Pak se přidá plasma (0,2 ml) a směs se inkubuje po dobu jedné hodiny při teplotě 60 °C. Pak se přidá fenol (0,4 ml) a směs se vířivě míchá 3 x po dobu 30 sekund, přičemž mezi každým mícháním se ponechá 30 sekund. Směs se odstřeďuje po dobu 5 minut a vodná fáze se získá. Organická fáze se zpětně extrahuje 0,1 ml TES a spojené vodné fáze se extrahují 2 x 1 objemem systému fenol/chloroform/IAA a pak jedním objemem chloroformu. Do extraktu se přidá 1 μΐ (2 pg) glykogenu (Boehringer Mannheim Corp.) a 25 μΐ octanu sodného (3M, hodnota pH 5,4) a 1,25 ml studeného ethanolu a produkt se mrazí na suchém ledu a míchá se 10 minut. Peleta se rozpustí ve 100 μΐ destilované vody a přidá se 5 μΐ octanu sodného (hodnota pH 5,4) a 250 μΐ studeného ethanolu a opět se míchá a získaná peleta se rozpustí v 10 μΐ dH₂O.

Syntéza cDNA

Pro syntézu cDNA z extrahované RNA se inkubuje 5 μΐ rozpuštěné RNA se 4 μΐ vody a 1 μΐ (1 pg nebo 166 pmol 18-mer) RT primeru. Inkubace se provádí při teplotě 70 °C po dobu tří minut, načež se provede rychlé ochlazení na ledu. Sekvence RT primeru je následující: 5'CCC AAC ACT ACT CGG CTA 3'

Po počáteční inkubaci se do inkubační směsi přidá: 10 pl 5 x prvního pufru (250 mM Tris HC1, hodnota pH 8,3, 375 mM K.C1, 15 mM MgCl₂, 50 mM dithiothreirol); 2,5 pl deoxynukleosidtrifosfátů (10 mM), 2,5 pl reversní transkriptasy (MMLV zBRL, 200 jednotek na pl) a destilovanou vodou se upraví na objem 50 pl. Směs se inkubuje při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny, zahříváním se udržuje na teplotě 90 °C po dobu tří minut a ochladí se na ledu.

PCR zesílení

PCR zesílení HCV cDNA, shora produkované, se provádí za použití kontrolních a zkušebních činidel dále uvedených v tabulce. V tabulce znamená RNA kontrolní vzorek, ve kterém se RNA extrahuje z jedinců, kteří se infikovali HCV1. Tento vzorek se přenáší stupni cDNA syntézy a PCR zesílení. Avšak v tomto případě alikvot RNA se nahrazuje vodou v průběhu cDNA syntézy. Matrice je kontrolou pro PCR reakci ve které je matrice vypuštěna. Vzorek indikuje sérum, které se zkouší na přítomnost HCV RNA.

- 19CZ 282573 B6

Tabulka

	RNA μΐ	cDNA μΐ	Matrice μΐ	Vzorek μΙ
voda	do 100,0	do 100,0	do 100,0	do 100,0
10 x pufr	10,0	10,0	10,0	10,0
dNTP	16,0	16,0	16,0	16,0
primer 1	0,5	0,5	0,5	0,5
primer 2	0,5	0,5	0,5	0,5
matrice	2,5	2,5	-	2,5
Taq Pol	0,5	0,5	0,5	0,5

Primeru 1 a primeru 2 je 0,5 pg/μΐ a 0,42 pg/μΐ a mají následující sekvence

Primer 1: 5’ ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'

Primer 2: 5' AGT CTT GCG GGG GCA CGC CCA AAT C 3'

Tyto příměry hybridizují na konservovanou oblast v zakončení 5' HCV genomu. Vzorky obsahují 12,5 μΐ ekvivalenty séra HCV cDNA.

Podmínky zesilovacího cyklu jsou následující:

cyklů: tavení 94 °C po dobu 1,5 minut tepelná hybridizace 60 °C po dobu dvou minut prodloužení 72 °C po dobu 3 minut

Konečné prodloužení 72 °C po dobu 30 minut

Nasáknutí při 4 °C do vyjmutí.

Zesílený produkt se zkouší za použití značené DNA. Sekvence nukleotidové sondy je následující:

nukleotidová sonda: 5' TTT CTT GGA TCA ACC CGC TCA TCA ATG CCT GGA 3'

Přes 200 HCV sera-pozitivních vzorků se zkouší shora uvedeným způsobem. Pouze výsledky, ve kterých jsou kontroly negativní se uvažují. V tomto případě všechny pozitivní zkoušky jsou také pozitivní ve zkoušce PCR.

-20CZ 282573 B6

Příklad 3

Nukleotidové sondy odvozené od údajné jádrové oblasti HCV RNA

Analýza nukleotidových sekvencí na různé HCV isoláty ukazuje, že je vysoký stupeň sekvenční konservace v oblasti od přibližně nukleotidu 1 k přibližně nukleotidu 570 za použití systému číslování pro nukleotidy podle obr. 1. Tato oblast údajně zakodovává jádro polypeptidu HCV. Souhlasné sekvence pro pět různých izolátů z různých zeměpisných oblastí (Japonska a Spojených států amerických) je na obr. 2, kde je HCV1 prototypem pro HCV. Aminokyseliny zakódované ve velkém ORF HCV1 jsou ukázány nad souhlasnými nukleotidovými sekvencemi. V sekvencích podle obr. 2 HCV-JH je podle osobního sdělení Dr Tetsu Miyamura (National Institute of Health of Japan - Japonský ústav národního zdraví) a JC-J1 a JC-J4 jsou od Mayumi a kol. (1990). Z obr. 2 může být zřejmé, že mezi souhlasnými sekvencemi v údajné jádrové oblasti je alespoň 90% homologie se zřetelem na sekvence vHCVl. Se zřetelem na vysoký stupeň homologie v oblasti mezi nukleotidy +1 až + 571, nukleotidové sondy pro tuto oblast budou užitečné při clonění pro HCV pozitivní biologické vzorky.

Sady značených nukleotidových sond se může použít pro detekci HCV RNA z oblasti, která údajně zakodovává HCV jádro polypeptidu, jak je naznačeno na obr. 3. Na obr. 3 číslo nukleotidové sondy v sadě zahrnuje řadu polynukleotidů s heterogenitou udanou IUB skupinovým kódem podle obr. 3. Heterogenity jsou přizpůsobeny nukleotidovým sekvenčním rozdílům, zjištěným v souhlasných sekvencích různých izolátů. Oblasti HCV sekvence, ke kterým jsou nukleotidové sondy v sadě nukleotidové sondy podle obr. 3 komplementární, jsou uvedeny na obr. 4, kde čísla nukleotidů odpovídají číslování podle obr. 1.

Tato sada nukleotidových sond se použila při zkoušce k detekci HCV sekvencí. Zkušební formát je popsaný ve zveřejněné přihlášce vynálezu PCT Pub. No W090/14436 v příkladové sekci, označené jako Probes for sandwich Hybridization for HCV (Nukleotidové sondy pro sendvičovou hybridizací HCV).

Následující materiály podle seznamu jsou uloženy podle budapeštské dohody v organizaci Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville Maryland 20852 a mají přidělena následující čísla.

lambda gtl 1	ATCC No.	Den uložení
HCV cDNA řada	40394	1. 12. 1987
klon 81	40388	17. 11. 1987
klon 91	40389	17. 11. 1987
klon 1-2	40390	17. 11. 1987
klon 5-1-1	40391	18. 11. 1987
klon 12f	40514	10. 11. 1988
klon 35f	40511	10. 11. 1988
klon 15e	40513	10. 11. 1988
klon K9-1	40512	10.11.1988
JSC 308	20879	5. 5. 1988
pS356	67683	29. 4.1988

Kromě toho došlo k dalšímu uložení 11.5. 1989

Kmen	Spojovník	ATCC No.
D1210 (Cfl/5-1-1)	EF	67967
D1210 (Cfl/81)	EF	67968
D1210 (Cfl/CA74a)	EF	67969
D1210 (Cfl/35f)	AB	67970

	CZ 282573 B6
D1210 (Cfl/279a) D1210 (Cfl/C36) D1210 (Cfl/13i) D1210 (Cfl/C33b) D1210 (Cfl/CA290a) HB101 (AB24/C100 # 3R)	EF 67971 CD 67972 AB 67973 EF 67974 AB 67975 67976

Následující deriváty kmene D1210 byly deponovány 3. 5. 1989

Derivát kmene PCF1CS/C8f pCFlAB/C12f pCFlEF/14c pCFlEF/15e pCFlAB/C25c pCFlEF/C33c pCFlEF/C33f pCFlCD/33g pCFlCD/C39c pCFlEF/C40b pCFlEF/CA167b

ATCC No. 67956 67952 67949 67954 67958 67953 67950 67951 67955 67957 67959

Následující kmeny byly deponovány 12. 5. 1989

Kmen Lamda gtl 1 (C35) Lamda gtl0(beta-5a) D1210(C40b) D1210(M16)

ATCC No. 40603 40602 67980 67981

Následující biologické materiály byly deponovány 23. 3. 1990

Materiál 5'klon32 (v pUC18S)

ATCC No. 68276

Po schválení a udělení amerického patentu na tuto přihlášku vynálezu všechna omezení dostupnosti těchto depozitů byla neodvolatelně zrušena. Přístup k uvedeným depozitům je po dobu platnosti tohoto vynálezu prostřednictvím stanoveného komisaře pod označením 37 CFR 1.14 a 35 USC 1.22. Kromě toho se uvedené depozity uchovávají po dobu 30 let od data uložení nebo po dobu pěti let po posledním projeveném zájmu o depozit nebo po prodlouženou životnost patentového spisu jakkoliv dlouhou. Uvedené deponované materiály se příkladně uvádějí a nejsou nutné pro provádění vynálezu podle shora uvedeného popisu.

Průmyslová využitelnost

Popsané způsoby a oligomery, jak nukleotidové sondy tak primery, odvozené od HCV cDNA a soubory je obsahující, jsou užitečné pro přesné, poměrně jednoduché a ekonomické zjištění přítomnosti HCV v biologických vzorcích, zvláště v krvi, které se má používat pro transfuze a v případě jedinců, u kterých je podezření na HCV infekci. Kromě toho způsoby a oligomery mohou být užitečnými pro detekci časnějšího stadia infekce HCV než imunologické zkoušky založené na použití rekombinantních HCV polypeptidů. Rovněž zesílená polynukleidová hybridizační zkouška zjišťuje HCV RNA v případných vzorcích, které jsou negativní na antiHCV protilátky. Proto se popisovaných nukleotidových sond a příměrů může použít pro

zesílení hybridizačních zkoušek spolu s imunozkouškami založenými na HCV polypeptidech k dokonalejší identifikaci infekce způsobené HCV a HCV infikovaných biologických vzorků, včetně krve.

Je možno konstruovat primery a/nebo nukleotidové sondy, které jsou odvozeny od konservovaných oblastí HCV genomu. Obstarání těchto primerů a nukleotidových sond umožňuje obecný způsob k detekci variantů HCV kmenů a pro clonění krve a krevních produktů.

Jestliže se při způsobu použije primerů, odvozených od konservovaných oblastí HCV genomu, pomáhá způsob při detekci a/nebo identifikaci variantů kmenů HCV. To naopak vede k vývoji přídavných imunologických činidel pro detekci a diagnostiku HCV, jakož také k vývoji přídavných polynukleotidových reakčních činidel pro zjištění a/nebo ošetřování HCV.

Kromě toho sady primerů a nukleotidových sond, konstruovaných z konservovaných aminokyselinových sekvencí Flavivirů a HCV umožňují univerzální detekční způsob těchto infekčních činidel.

Claims (8)

1. Způsob pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu v analytovém řetězci, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, jejich komplementy a RNA ekvivalenty sekvencí a jejich komplementy, vyznačující se tím, že se

a) inkubuje analvtový řetězec s polynukleotidem obsahujícím zacilující sekvenci za podmínek umožňujících vytvoření specifických hybridních duplexů mezi cílovou sekvencí a zacilující sekvencí a zacilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv následující sekvenci podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486 ajejich komplementy,

b) stanovují se hybridy případně vytvořené mezi cílovou oblastí a zacilující sekvencí.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se cílová oblast zesiluje.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se

a) inkubuje analytový řetězec se sadou oligomerů, přičemž oligomery sady lemují cílovou oblast a její komplement a jsou primery pro způsob polymerasové řetězcové reakce a

b) zesiluje se cílová oblast způsobem polymerasové řetězcové reakce.

4. Způsob podle nároků l,2a3, vyznačující se tím, že analytovým řetězcem je RNA.

-23 CZ 282573 B6

5. Souprava pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu v analytovém řetězci, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, jejich komplementy a RNA ekvivalenty sekvencí a jejich komplementy, podle nároků laž4, vyznačující se tím, že souprava zahrnuje polynukleotid zacílující sekvence azacilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv sekvenci podle obr. 1: 1645, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486 a k jejich komplementům.

6. Reakční činidlo pro detekci vybrané cílové oblasti HCV polynukleotidu, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 16-45,49-78, 82-111, 115-144, 148-177,211-240, 242-271,275-304, 332-361,365394, 398-427 a 457-486, jejich komplementy a RNA ekvivalenty sekvencí a jejich komplementy, podle nároku 5, vyznačující se tím, že reakční činidlo zahrnuje polynukleotid zacílující sekvence azacilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv sekvenci podle obr. 1: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486 a k jejich komplementům.

7. Reakční činidlo podle nároku 6, vyznačující se tím, že polynukleotid zacílující sekvence obsahuje přídavně značení.

8. Způsob detekce in vitro krve znečištěné infekčními látkami k eliminaci ze zdroje krve, vytvořeného z jednotek od jednotlivých dárců krve podle nároku 1, vyznačující se tím, že

a) se inkubují analytové nukleové kyseliny ze vzorku krve podezřelého, že obsahuje polynukleotid se zvolenou cílovou sekvencí HCV polynukleotidu, přičemž cílová oblast zahrnuje sekvenci alespoň deseti nukleotidů ze souboru zahrnujícího sekvenci nukleotidů podle obr. 1: 1645, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 a 457-486, s polynukleotidem obsahujícím zesilující sekvenci, přičemž zesilující sekvence obsahuje lineární sekvenci alespoň deseti nukleotidů komplementárních ke kterékoliv sekvenci podle obr. 1: 16-45,49-78, 82-111, 115-144, 148-177,211-240, 242-271,275-304, 332-361,365394, 398-427 a 457-486 a jejich komplementům,

b) zjišťují se případné hybridní duplexy, vytvořené mezi analytovými nukleovými kyselinami, obsahujícími případnou cílovou oblast, a polynukleotidem obsahujícím zacílující sekvenci a

c) uchovává se krev, ve které nebyly podle odstavce b) zjištěny hybridní duplexy.