JP2007068542A - Hcvを遺伝子型分類するためのヘテロ二本鎖トラッキングアッセイ(hta) - Google Patents
Hcvを遺伝子型分類するためのヘテロ二本鎖トラッキングアッセイ(hta) Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】HCVを遺伝子型分類するための、ハイブリダイゼーションに基づいて2つ以上のウイルスゲノム間の遺伝的関係を決定する方法である、ヘテロ二本鎖トラッキングアッセイ(HTA)が開示される。HCVを遺伝子型分類するためのHTAは、HCVサブタイプ(1a、1b、2a、2b、および3a)に対するE1のコアのカルボキシ末端および一部に由来する、一本鎖プローブを用いて開発された。HTAは、HCVのサブタイプ分類についてRFLPよりも正確であり、そして新規の変異体を同定する能力を有し、そして疫学研究に有用である。
【選択図】なし
Description
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)の遺伝子型分類に関する。特に、本発明は、好ましくはHCVのコアおよびエンベロープ領域由来の特異的プライマー、ならびにヘテロ二本鎖移動度またはトラッキングアッセイ(次にこれは特異的プライマーを利用する)を用いたHCVの遺伝子型を決定するための方法に関する。
ウイルス性肝炎は、A、B、C、D、およびE型肝炎として知られる5つの異なるウイルスにより引き起こされることが知られている。HAVはRNAウイルスであり、そして長期の臨床的徴候を導かない。HBVは、DNAウイルスである。HDVは、HBVの非存在下で細胞を感染させ得ない依存性ウイルスである。HEVは、飲料水媒介性ウイルスである。HCVは最初に同定され、そして非A非B肝炎NANBHの原因として特徴付けられた(Houghtonら、特許文献1および特許文献2)。これは、HCVの同定における免疫学的試薬として有用な多くの一般的および特異的なポリペプチドの開示を導いた。例えば、非特許文献1;非特許文献2、および非特許文献3を参照のこと。
(項目1)配列番号1に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目2)配列番号2に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目3)配列番号3に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目4)配列番号4に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目5)配列番号5に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目6)配列番号6に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目7)配列番号7に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目8)配列番号8に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目9)配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
(項目10)センスプライマーが配列番号1からなり、そしてアンチセンスプライマーが、配列番号2、配列番号3、配列番号4、および配列番号5からなる群より選択される、PCRプライマー対。
(項目11)アンチセンスプライマーが配列番号6からなり、そしてセンスプライマーが、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群より選択される、PCRプライマー対。
(項目12)HCV株のHCV遺伝子型を決定する方法であって、以下の工程:
(a)該HCV株を、1段階以上のPCRに供する工程であって、ここで該1段階以上のPCRが、HCVゲノムのコアまたはE1領域由来のセンスプローブおよびHCVゲノムのコアまたはE1領域由来のアンチセンスプローブを利用する、工程;
(b)工程(a)で得られた増幅産物の混合物と、既知のHCV遺伝子型のDNAまたはRNAフラグメントとを変性および再アニールすることにより、ヘテロ二本鎖を形成する工程;
(c)サイズにより分離する系において該ヘテロ二本鎖の移動度と、既知遺伝子型のDNAまたはRNAフラグメントのホモ二本鎖の移動度とを比較して、該HCV株の遺伝子型を決定する工程
を包含する、方法。
(項目13)項目12に記載の方法であって、ここで前記HCV株が、2段階のPCRに供され、第1のセットのプライマーが、前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来のユニバーサルセンスプローブおよび前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来の型特異的アンチセンスプローブを含み、そして第2のセットのPCRプライマーが、前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来のユニバーサルアンチセンスプローブおよび前記HCVゲノムのコアまたはE1領域由来の型特異的センスプローブを含む、方法。
(項目14)項目12に記載の方法であって、ここで前記第1のセットのPCRプライマーが項目10に記載のプライマーであり、そして前記第2のセットのPCRプライマーが項目11に記載のプライマーである、方法。
(項目15)前記既知の遺伝子型のDNAまたはRNAフラグメントがDNAプローブを含む、項目12に記載の方法。
(項目16)前記プローブが一本鎖である、項目15に記載の方法。
(項目17)前記DNAプローブが放射標識される、項目16に記載の方法。
(項目18)前記一本鎖DNAプローブがPCR増幅により得られる、項目16に記載の方法。
(項目19)項目18に記載の方法であって、ここで前記DNAプローブが、前記第1の段階に項目10に記載のプライマーおよび前記第2の段階に項目11に記載のプライマーを利用する2段階PCR増幅により得られる、方法。
(項目20)前記HCV株が前記ヘテロ二本鎖を形成する混合物中に過剰に存在する、項目12に記載の方法。
(項目21)HCV株の薬物治療に対する応答を、該HCV株に感染した患者から予測する方法であって、既知のHCV遺伝子型の該薬物治療に対する感受性を決定する工程、項目12に記載の方法により該HCV株の該HCV遺伝子型を決定する工程、および該薬物治療前の該株の該HCV遺伝子型と、該薬物治療に対する既知のHCV遺伝子型の該感受性とを比較する工程を包含する、方法。
(項目22)HCV株の治療ワクチンに対する応答を、該HCV株に感染した患者から予測する方法であって、既知のHCV遺伝子型の該治療ワクチンに対する感受性を決定する工程、項目12に記載の方法により該HCV株の該HCV遺伝子型を決定する工程、および該治療ワクチンの投与前の該株の該HCV遺伝子型と、該治療ワクチンに対する既知のHCV遺伝子型の該感受性とを比較する工程を包含する、方法。
(項目23)所定のサンプル集団に対する予防ワクチン組成物の適性を予測する方法であって、該予防ワクチンの遺伝子型を決定する工程、項目12に記載の方法により該サンプル集団における既知のHCV遺伝子型の優勢を決定する工程、および該予防ワクチンの該集団サンプルへの投与前に、該予防ワクチン株の該HCV遺伝子型と決定された優勢遺伝子型とを比較する工程を包含する、方法。
本発明は、ヘテロ二本鎖トラッキングアッセイ(HTA)に基づいた、HCV遺伝子型分類およびサブタイプ内変異の特徴付けのためのプライマーおよび方法を含む。好ましいプローブ/プライマーは、HCVのコアのカルボキシ末端およびE1領域の一部由来の一本鎖である。
本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術の範囲内の分子生物学、微生物学、組換えDNA、ポリペプチド合成および核酸合成、ならびに免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献中で十分に説明される。例えば、Sambrookら,MOLECULAR CLONING;A LABORATORY MANUAL,第2版(1989);DNA CLONING,第IおよびII巻(D.N Glover編、1985);OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J.Gait編,1984);NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編,1984);TRANSCRIPTION AND TRANSLATION(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編,1984);ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編,1986);IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES(IRL Press,1986);B.Perbal、A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984);シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.);GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.H.MillerおよびM.P.Calos編,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)、Methods in Enzymology第154巻および第155巻(それぞれ、WuおよびGrossman、ならびにWu編)、MayerおよびWalker編(1987),IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY(Academic Press,London)、Scopes,(1987),PROTEIN PURIFICATION:PRINCIPLES AND PRACTICE,第2版(Springer-Verlag,N.Y.)、ならびにHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,第I-IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編 1986)を参照のこと。
本発明におけるHCV遺伝子型を決定する方法は、複雑な準種における少数の変異体を利用する。1つのこのような技術は、二本鎖トラッキングアッセイ(HTA)である。HIVを用いた使用について当該分野で周知のHTA(例えば、Delwartら、J.Virol.(1994)68:6672-6683;Delwartら、Science(1993)262:1257-1261;Delwartら、PCR Methods and Applications 4:S202-S216(1995)Cold Springs Harbor);およびDelwartら、Heteroduprex Mobility Analysis HIV-1 env Subtyping Kit Protocol Version 3(これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される)を参照のこと)は、配列が感染個体の末梢血単核細胞からネスティッドPCRにより増幅された場合、分岐テンプレートから同時増幅された関連DNA産物が、ランダムに再アニールして、中性ポリアクリルアミドゲルにおいて減少した移動度で移動するヘテロ二本鎖を形成し得たという観察に起因する。これらの技術を用いて、複数のウイルスDNAテンプレート分子間の遺伝的関係が確立され得る。
E1またはコア領域がHCV不均一性を研究するための最良の領域であり得ることが決定され、従って、E1領域は、本発明におけるプライマーのための選択となった。本発明のゲノムの最も不均一な領域である部分的E1配列、ならびにより長いフラグメント(すなわち、400nt)(1000ntほどの長さであり得るが)の使用は、サブタイプ/型間で交差ハイブリダイズしないプローブの設計を可能にし、従って正確な遺伝子型分類を可能にする。不均一な領域を隣接させることにより、センスおよびアンチセンスプライマーの保存nt配列が同定された。好ましくは、第1回のPCRのためのユニバーサルセンスプライマーと型特異的アンチセンスプライマーとの組合せ、ならびに第2回のためのユニバーサルアンチセンスプライマーと型特異的センスプライマーとの組合せが利用された。PCRは2回である必要はなく、そしてプライマーは、上記の組合せに限定されない。しかし、好ましい組合せは、一本鎖プローブの調製を可能にし、そしてPCRプライマー組合せの数を最小にする。
HCVの遺伝子型を決定するためのキットは、本発明の範囲内にある。Delwartら、Heteroduprex Mobility Analysis HIV-1 env Subtyping Kit Protocol Version 3においてHIVについて記載されるように、このようなキットは、特異的なプライマーを含む。好ましいプライマーは、HCVゲノムのコアおよびE1領域由来である。2段階のPCRが所望される場合、第1回のプライマーは、例えば、ユニバーサルセンスプローブ(好ましくは、HCVゲノムのコア/E1領域に位置する)を含み得る。1つのこのようなユニバーサルプライマーは、HCV-1のヌクレオチド508〜529に位置し、そして表1に示される。ユニバーサルプライマーと対となるのは、好ましくはまたHCVゲノムのコア/E1領域に位置し得る、型特異的アンチセンスプライマーであり得る。これらのプライマーの例は、HCVゲノムの1型、2a型、2b型、および3a型についてはヌクレオチド1032〜1012由来であり、そしてまた表1に示される。
(患者サンプル)
規則的な血液透析を受けている35人の血液透析患者を研究した:平均年齢64.8±13歳の20人男性(57%)および15人女性(43%)。血清サンプルを、1995年8月に回収し、アリコートに分け、そして-80℃で保存した。26人の患者が抗HCV ELISA陽性であり、そして9人が抗HCV ELISA陰性であった。26人のELISA陽性のうち25人はまたRIBA III陽性であったが、1人は不確定であった。9人のELISA陰性は、全てRIBA III陰性であった。15人の患者がHCV-RNA 5'UTRおよびE1 PCR陽性であった。15個の5'NCR産物の直接的配列決定により、5人の患者が1型;3人が2型;そして7人の患者が3型に帰された。
(cDNAおよびPCR)
HCV-RNAを、Stratagene RNA Isolation KitからのStratagene試薬を用いて、少なくとも2つの異なる回数で抽出した(ChomezynskyおよびSacchi法)。
(HTA)
一本鎖プローブを、プライマー320Aの1つをビオチン化した以外は、上記のような同じPCRプライマーを用いた既知の遺伝子型のHCV ELISAおよびRIBA陽性血清のRT-PCRにより調製した。ssDNAプローブを、Heng PanおよびEric Delwartのプロトコルに従って、Dynabeads M-280 Streptavidinを用いて作製した。非ビオチン化一本鎖を、磁気ビーズ/ストレプトアビジンカラムから溶出した。プローブを、異なる遺伝子型の20ngのssDNAから作製し、そしてT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Gibco BRL)および100μCiの32P ATPを用いて末端標識し、次いでカラム精製した。キナーゼプローブを、Pharmacia Bio Sepharoseカラムを用いて32P ATPから分離した。32P標識一本鎖プローブを、100倍過剰量のドライバーと混合し、そしてPCR産物を、患者サンプルまたはコントロール血清/血漿から生成した。ハイブリダイゼーションは2×SSCであった。混合物を、94℃のヒートブロックに3分間置いた。次いで、それらを55℃のヒートブロックに少なくとも2時間移した。全反応容量を、1mm厚の6%ポリアクリルアミドMDEゲル(Baker)にロードし、そして500Vで16時間電気泳動した。ゲルを80℃で濾紙上で真空乾燥し、そしてX線フィルムに暴露した。各サンプルの遺伝子型を、Delwart法に基づいて決定した。表2は、HTAを用いることにより決定した遺伝子型結果を示す。
Claims (1)
- 実施例に記載のオリゴヌクレオチド。
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