FI106214B - NANBV-diagnostiikka: Hepatiitti-C-viruksen seulonnassa käyttökelpoisia polynukleotidejä - Google Patents

Description

106214 NANBV-diagnostiikka:Hepatiitti C -viruksen seulontaan käyttö-' kelpoisia polynukleotidejä

Keksintö koskee aineita ja menetelmiä ei-A, ei-B -hepatiitti-5 virus (NANBV) -infektion leviämisen selvittämiseksi. Keksintö koskee erityisemmin ei-A, ei-B -hepatiitin (NANBH) etiologista vaikutinta, hepatiitti C -virusta (HCV), ja polynukleotidejä ja niiden analogeja, jotka ovat käyttökelpoisia määrityksissä HCV:n ilmaisemiseksi biologisista näytteistä.

10

Barr et ai., (1986), Biotechniques £:428.

Beaucage et ai., (1981), Tetrahedron Letters 22:1859.

Botstein (1979), Gene 8_:17.

Brinton, M.A. (1986) in THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND 15 FLAVIVIRIDAE (Sarjaedit. Fraenkel-Conrat and Wagner, voi. edit. Schlesinger, Plenum Press), p.327-374.

Broach (1981) in: Molecular Biology of the Yeast

Saccharomyces, Voi. 1, p.445, Cold Spring Harbor Press.

20 Broach et al., (1983), Meth. Enz. 101:307.

Brown et al., (1979), Methods in Enzymology 68:109.

·. : Byrne et al., (1988), Nucleic Acids Res. 16:4165.

Castle et al., (1986), Virology 119:10.

: .·. Chang et al., (1977), Nature 198:1056.

• · · .···. 25 Chirgwin et al., (1979), Biochemistry 18:5294.

• · :·.·. Choo et al., (1989), Science 244:359.

• ·

Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156.

' .·**. Clewell et al., (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159.

φ·« 30 Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.

• · ·

Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110.

• * ♦ V.'. Cousens et al., (1987), Gene 61:265.

• * *·] De Boer et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.

» · · *·* * Dreesman et al., (1985), J. Infect. Disease 151:761.

• ·

Feinstone et ai., (1981), J. Inf. Dis. 144:588.

106214 .

Feinstone et ai., (1983), Infection and Immunology 41:816. Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl.J.

Med. 311:185.

5 Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.).

Fiers et ai., (1978), Nature 273:.113.

Gerety, R.J. et ai., in VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H., eds, io Grune and Stratton, Inc., 1984) pp 23-47.

Goeddel et al., (1980), Nucleic Acids Res. £3:4057.

Graham and Van der Eb (1978), Virology 52:546.

Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961.

is Grych et al. , (1985), Nature 316:74.

Gubler and Hoffman (1983), Gene 25:263.

Hahn et al., (1988), Virology 162:167.

Han (1987), Biochemistry 26:1617.

Hammerling et al., (1981), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL

20 HYBRIDOMAS.

Hess et al., (1968), J. Adv. Enzyme Reg 2:149.

• · *· / Hinnen et al., (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 75:1929.

• · ·

Hitzeman et al., (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.

• · · ·",1 Holland et al., (1978), Biochemistry 17:4900.

« · 25 Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.

• · · —— *..! Houghton et al., (1981), Nucleic Acids Res. 9:247.

» 1 » ’ “

V ' Huynh, T.V. et al. , (1985) in DNA CLONING TECHNIQUES; A

PRACTICAL APPROACH (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, » · U.K.) pp. 49-78.

• · 30 Immun. Rev. (1982) 62:185.

« *·1··’ Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.

• · · • « *”** Kennett et al., (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES.

"·*" Kyte and Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157:105-132.

: Kuo et al., (1989), Science 244:362.

Landegren et ai., (1988), Science 242:229.

3 106214

Maniatis, T., et ai., (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

5 Matthews and Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169:1. METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

Mittlin (1989), Clinical Chem. 35:1819.

Laemmli (1970), Nature 227,680.

Lee et al., (1988), Science 239:1288.

jo Loh et al., (1989), Science 243:217.

Mackow et al., (1987), Virology 159:217.

Mayer and Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London). Mayumi et al., (1990), Japanese J. Exp. Med. 60:167.

/5 Maxam et al., (1980), Methods in Enzymology 65:499. MacNamara et al., (1984), Science 226:1325.

Messing et al., (1981), Nucleic Acids Res. 9:309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press).

20 Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis.

Monath (1986) in THE VIRUSES: THE TOGAVIRADAE AND

• · ’· / FLAVIVIRIDAE (Sarjaedit. Fraenkel-Conrat and Wagner, • · · / * vol.edit. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), • · * ::i.: p. 375-440.

• · .**; 25 Murakawa et al., (1988), DNA 7:287.

• · · 1 *..! Nagahuma et al., (1984), Anal. Biochem. 141:74.

• · · —— ““

Narang et al., (1979), Methods in Enzymology 68:90.

- ... Neurath et al., (1984), Science 224:392.

• ·

Nisonoff et al., (1981), Clin. Immunol. Immunopathol.

*** 30 21:397-406.

‘♦j·’ Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.

• * *·”* Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65.

V* · Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.

·:·*: Peleg (1969), Nature 221:193.

4 106214

Pfefferkorn and Shapiro (1974), in COMPREHENSIVE VIROLOGY, Vol. 2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, eds., Plenum, N.Y.) pp. 171-230.

Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.

5 Rice et al., (1985), Science 229:726.

Rice et al., (1986) in THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Sarjatedit. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol.edit. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p.279-328.

jo Roehrig (1986) in THE VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND

FLAVIVIRIDAE (Sarjatedit. Fraenkel- Conrat and Wagner, vol.edit. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press) Rosenberg et al., (1984), Nature 312:7.

Sadler et al., (1980) , Gene 8_,279.

/5 Saiki et al., (1985), Science 230:1350.

Saiki et al., (1986), Nature 324:163.

Saiki et.al., (1988), Science 239:487.

Sanger et al., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463.

Scharf et al., (1986), Science 233:1076.

20 Schesinger et al., (1986), J. Virol. 60:1153.

, . Schreier, M., et al., (1980) HYBRIDOMA TECHNIQUES

« * ·

I Scopes (1984), PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND

« 4 ( 4 ·% « « PRACTICE, SECOND EDITION (Springer-Verlag, N.Y.).

t I * ]!!/ Shimatake et al., (1981), Nature 292:128.

• · ·"·. 25 Shigekawa and Dower (1988), Bio Techniques 61:742.

• · /·,·, Steimer et al., (1986), J. Virol. 56:9.

• · ·

Stollar (1980), in THE TOGAVIRUSES (R.W. Schlesinger, ed., .···, Academic Press, N.Y.), pp.584-622.

• · .···. Sumyoshi et al., (1987), Virology 161: 497.

·»» *. 30 Taylor et al., (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:342.

• » · “ 1 1 II! Towbin et al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,4350.

• ·

’I*· Tsu and Herzenberg (1980), in SELECTED METHODS IN CELLULAR

»»» *·* [ IMMUNOLOGY (W.H. Freeman and Co.) pp. 373-391.

*··>·

Vytdehaag et al., (1985), J. Immunol. 134:1225.

Valenzuela, P., et al., (1982), Nature 298:344.

5 106214

Valenzuela, P., et al., (1984), in HEPATITIS B (Millman, I., et al., ed, Plenum Press) pp. 225-236.

Warner (1984), DNA 3^:401.

5 Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology Vol. 154, RECOMBINANT DNA, Part E.

Wu (1987), Methods in Enzymology vol 155, RECOMBINANT DNA, part F.

Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

10

Siteeratut patentit US-patentti 4 341 761 US-patentti 4 399 121 US-patentti 4 427 783 is US-patentti 4 444 887 US-patentti 4 466 917 US-patentti 4 472 500 US-patentti 4 491 632 US-patentti 4 493 890 20 US-patentti 4 683 202 . . US-patentti 4 458 066 • « I US-patentti 4 868 105 « · · • · · • · • · « · · ♦ ♦ · \···\ Ei-Ä, ei-B -hepatiitti (NANBH) on välittyvä sairaus tai saira- • · 25 usryhmä, jonka otaksutaan olevan virusten aiheuttama, ja joka • · **j·, on erotettavissa muista viruksiin liittyvistä maksasairauksis- • · · ta, mukaan lukien sairaus, jonka aiheuttavat tunnetut hepa- .···. tiittivirukset, so., hepatiitti A -virus (HAV), hepatiitti B - ' · * • · · .♦♦♦. virus (HBV) ja delta hepatiitti -virus (HDV), samoin kuin he- • · · 30 patiitti, jonka aiheuttavat sytomegalovirus (CMV) tai Epstein- « · » » · ·

Barr -virus (EBV) . NANBH identifioitiin ensin verensiirron • · « · *Γ· saaneista henkilöistä. Välittyminen ihmisestä simpanssiin ja ·»» « » · *.* ’ . jatkosiirtyminen simpansseilla osoitti, että NANBH:n aiheuttaa * * välittyvä infektiivinen aine tai aineet.

6 106214

Epidemiologinen näyttö viitaa siihen, että NANBH:ta voi olla kolme eri tyyppiä: veden kautta kulkeutuva epidemiatyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; ja siellä täällä silloin 5 tällöin esiintyvä (yhteisön hankkima) tyyppi. Vaikuttavien aiheuttajien lukumäärä, jotka voivat aiheuttaa NANBH:n, on kuitenkin tuntematon.

Muutamia NANBV-kandidaatteja on tuotu esille. Esimerkiksi 10 Princen (1983), Feinstonen ja Hoofnaglen (1984) ja Overbyn (1985, 1986, 1987) kokooma-artikkelit ja Iwarsonin artikkeli (1987). Ei kuitenkaan ole mitään näyttöä sille, että yksikään näistä kandidaateista olisi NANBH:n etiologinen syy.

is Tarve saada käyttöön herkkiä, spesifisiä menetelmiä NANBV-kanta j ien ja NANBV:llä kontaminoidun veren tai verituotteiden seulomiseksi ja identifioimiseksi on merkittävän suuri. Verensiirron jälkeistä hepatiittia (PTH) esiintyy suunnilleen 10 %:lla verensiirron saaneista potilaista ja näistä tapauksista 20 90 % selittyy NANBH:11a. Tämän taudin pääongelma on usein .*·.· esiintyvä eteneminen krooniseksi maksavaurioksi (25-55 %) .

• · • · • · · • · · • · : Potilaista huolehtiminen samoin kuin NANBH:n välittymisen es- ··· · täminen veren ja verituotteiden välityksellä tai läheisen hen- • · · :*·*: 25 kilökontaktin kautta edellyttävät luotettavia seulonta-, diag- : : : nostiikka- ja prognoosivälineitä NANBV:hen liittyvien nukle iinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden ilmaisemiseksi.

• · · • ' · • * • · · • · · ‘Alalla tunnetaan menetelmiä spesifisten polynukleotidien il- . 30 maisemiseksi hybridisaatiomääritysten avulla. Esimerkiksi « « «

Matthews ja Kricka (1988), Analytical Biochemistry 169:1; Lan-degren et ai., (1988), Science 242:229; ja Mittlin (1989), • · ·

Clinical Chem. 35:1819. US-patentti 4 868 105, julkaistu 9.

• » 106214 syyskuuta, ja EPO-julk. 225 807 (julkaistu 16. kesäkuuta, 1987).

Menetelmiä spesifisten polynukleotidien eristämiseksi ja/tai s ilmaisemiseksi hybridisaation avulla ei olisi voitu käyttää HCV:n seulomiseksi ennen kuin patentinhakija löysi HCV:n. Keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön aineita ja menetelmiä virusten genomisten sekvenssien saamiseksi, joita esitetään PCT-julkaisussa WO90/14436, ja jäljempänä.

10

Keksintö koskee yhdessä näkökohdassaan menetelmää HCV-sekvens-sin ilmaisemiseksi analyyttijuosteessa, jonka epäillään sisältävän HCV-polynukleotidin, joka HCV-polynukleotidi käsittää valitun kohdealueen, mainitun menetelmän käsittäessä sen, et-15 tä: (a) tuotetaan oligonukleotidi, joka kykenee hybridisortumaan HCV-sekvenssiin analyyttipolynukleotidijuosteessa, joka oligonukleotidi olennaisesti koostuu (i) polynukleotidisekvenssis-tä, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu vähintään 12 nuk-20 leotidin pituisista, HCV-genomin seuraaville alueille komple- ·. : mentaarisista oligonukleotideista (kuten kuviossa 1 on esi- • · · tetty): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-

I I I

:V·. 271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-486, vaihtoeh- ♦ · · · toisesti linkitettynä (ii) muuhun polynukleotidiin kuin luon- «·* :*·*: 25 nossa; • · .*·*: (b) inkuboidaan analyyttijuostetta kohdan (a) nukleotidin kanssa, mikä mahdollistaa spesifisten hybrididupleksien muo- :***: dostumisen kohdistuvan sekvenssin ja kohdesekvenssin välillä; • · · • · · • : ja « · · 30 (c) ilmaistaan hybridit, jotka ovat muodostuneet mahdollisen » · · 4 « · .···. kohdesekvenssin ja oligonukleotidin välillä.

* * « « · · • * · • · · * ; . Keksintö koskee toisessa näkökohdassaan määrityspakkausta tie- • · tyn HCV-kohdesekvenssin ilmaisemiseksi analyyt- 8 106214 tijuosteessa,joka pakkaus käsittää oligonukleotidialukkeen joka pystyy hybridisoitumaan analyytin polynukleotidijuosteen spesifiseen nukleotidisekvensiin, jolloin ilmaistava, spesifinen nukleotidisekvenssi on HCV-sekvenssi ja oligomeeri koostuu 5 (i) polynukleotidisekvenssistä valittuna ryhmästä joka koostuu vähintään 12 nukleotidin pituisista, HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonukleotideista (kuten kuviossa 1 on esitetty): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-io 486, mahdollisesti linkitettynä (ii) muuhun polynukleotidiin kuin luonnossa.

Keksintö koskee toisessa näkökohdassaan vielä menetelmää HCV-vapaan veren valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, et-15 tä: (a) tuotetaan analyyttinukleiinihappoja verinäytteestä, jonka epäillään sisältävän HCV-kohdesekvenssin; (b) tuotetaan oligomeeri(-meerejä), joka kykenee hybridisoitumaan HCV-sekvenssiin analyyttipolynukleotidijuosteessa, joka 20 oligomeeri sisältää polynukleotidisekvenssin, joka on valikoitu ryhmästä, joka sisältää vähintään 12 nukleotidin pituisista ’· * HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonuk- ***** leotideistä (kuten kuviossa 1 on esitetty) : 16-45, 49-78, 82- 111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, .**; 25 365-394, 398-427 ja 457-486, mahdollisesti linkitettyinä muu- • · · • · *..* hun polynukleotidiin kuin luonnossa; • · · • · · * (c) annetaan (a):n reagoida (b):n kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat polynukleotididupleksin muodostumisen kohdistu- • · • · V.'. van sekvenssin ja mahdollisen kohdesekvenssin välillä; • · 30 (d) ilmaistaan (c)-kohdassa mahdollisesti muodostunut duplek- *·*··’ si; ja * · · *···" (e) säästetään veri, josta komplekseja ei (d)-kohdassa ilmaisit * tu.

9 106214

Keksintö koskee toisessa näkökohdassaan vielä HCV:n ilmaisuun käyttökelpoista reagenssia, joka reagenssi käsittää oligonuk-leotidin joka koostuu (i) olennaisesti polynukleotidisekvens-sistä, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu vähintään 12 5 nukleotidin pituisista HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonukleotideista: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-486 (kuten kuviossa 1 on esitetty), mahdollisesti linkitettynä (ii) muuhun polynukleotidiin kuin luonnos-io sa.

Kuvio 1 esitää kootun HCV cDNA -sekvenssin, joka on saatu tässä yhteydessä kuvaillusta kloonista, ja PCT-julkaisussa WO90/14436 esitetystä kootusta HCV cDNA -sekvenssistä. Kloo-15 nit, joista sekvenssi saatiin ovat 5'-klooni32, bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (myös tunnuksella k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, 16jh, 6k, ja pl31jh. 20 Kuviossa esiintyvät kolme vaakasuoraa viivaa sekvenssin ylä- ·. ; puolella osoittavat oletetun metioniini-initiaattorikodonin • « ·

< I

paikan. Kuviossa esitetään myös HCV cDNA:n koodittaman olete- • · : .·. tun polyproteiinin aminohapposekvenssi. Heterogeenisuudet « · · » .···. HCV1: n kloonatussa DNA:ssa osoitetaan aminohapoilla, jotka on • · • » · 25 esitetty suuren ORF:n (open reading frame) oletetusti koodite- • · tun sekvenssin yläpuolella; sulut osittavat, että heterogeeni- suus havaittiin HCV cDNA:n 5'- tai 3'-päissä tai niiden lähel- ·*“· lä kloonissa.

• · • ·· • « · • · ·♦· 30 Kuvio 2 esittää DNA:n konsensussekvenssejä viidelle eri HCV- • · « #···. isolaatille eri maantieteellisiltä alueilta (Japani ja USA), ^ joissa HCVl:n suuren ORF:n koodittamat aminohapot esitetään • · · *·* [ DNA-sekvenssien yläpuolella.

• · 10 106214

Kuvio 3 esittää leimauskoettimien sekvenssejä HCV RNA:n ilmaisemiseksi esimerkissä III käytetyissä biologisissa näytteissä .

5 Kuvio 4 esittää riviin asettettuna koettimet kuviosta 3 HCVl:n kanssa kuvion 1 numeroinnin mukaisesti.

Suoritustavat keksinnön toteuttamiseksi io Alan tutkijat ovat varanneet ilmauksen "hepatiitti C -virus" (HCV) tätä ennen tuntemattomalle NANBH:n etiologiselle aiheuttajalle. HCV:n prototyyppieristys (isolaatti) on identifioitu US-patenttihakemussarjassa 122 714 (katso myös EPO-julkaisu 318 216). Ilmaus HCV sisältää myös saman viruslajin uudet iso-i5 laatit. Tämän terminologian jatkeeksi, HCV:n aiheuttamaa sairautta, jota aikaisemmin nimitettiin veren välityksellä siirtyväksi NANB-hepatiitiksi (BB-NANBH), nimitetään hepatiitti C:ksi. Ilmauksia NANBH ja hepatiitti C voidaan tässä yhteydessä käyttää vaihtovuoroisesti.

20 HCV on viruslaji, jonka patogeeniset kannat aiheuttavat BB-*. v NANBH:n. Myös heikentyneitä kantoja tai siitä saatuja vajavai- siä interferoivia partikkeleita voi esiintyä. Kuten jäljempänä • · • * · ··· · on esitetty HCV-genomi on RNA:ta. .Tiedetään, että RNA:ta si- « · · • ♦ ’···* 25 sältävillä viruksilla spontaanimutaatiofrekvenssit ovat ver- • · · • · · 'rattain korkeat, so., ilmoitettuna luokkaa 10"3 - IO-4 inkorpo-• · · *·* * roitua nukleotidiä kohti (Fields & Knipe (1986) ) . Koska RNA- viruksille on luonteenomaista genotyypin heterogeenisuus ja • · • · *·* epävakaisuus, HCV-lajin sisällä esiintyy sen vuoksi useita • · 30 kantoja/isolaatteja, jotka voivat olla virulentteja tai ei- *.:.· virulentteja. Tässä yhteydessä kuvaillut koostumukset ja mene- % « * telmät mahdollistavat erilaisten HCV-kantojen tai -isolaattien :’i : lisäämisen, identifioinnin, ilmaisun ja eristämisen.

• · „ 106214

Useita erilaisia HCV-kantoja/isolaatteja on identifioitu (PCT-julkaisu WO90/14436). Yksi sellainen kanta tai isolaatti, joka on prototyypi, on nimeltään CDC/HCV1 (toiselta nimeltä HCV1). Informaatio yhdestä kannasta tai isolaatista, kuten esimerkik-s si osa genomisesta sekvenssistä, on riittävä, jotta alaa tuntevat henkilöt pystyvät standarditekniikkaa käyttäen eristämään uusia kantoja/isolaatteja ja identifioimaan sen, ovatko uudet kannat/isolaatit HCV. Useita erilaisia kantoja/isolaatteja kuvaillaan esimerkiksi jäljempänä. Nämä kannat, jotka 10 saatiin joistakin ihmisen seerumeista (ja eri maantieteellisiltä alueilta), eristettiin käyttäen hyväksi informaatiota HCVl:n genomisesta sekvenssistä.

Käyttämällä PCT-julkaisussa WO90/14436 kuvailtua tekniikkaa, is HCVlrn genomista rakennetta ja nukleotidisekvenssiä, genominen RNA on johdettu. Genomi näyttää olevan yksijuosteista RNArta, joka sisältää noin 10000 nukleotidiä. Genomi on juosteeltaan positiivinen ja sisältää yhtenäisen translaationaalisen avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodittaa noin 3000 aminohappoa 20 sisältävää polyproteiinia. ORFrssä rakenneproteiini (-proteiinit) näyttää olevan kooditettuna suunnilleen N-pään alueen « « *· ** ensimmäisessä neljänneksessä, suurimman osan polyproteiinista • · · • · #* * vastatessa ei-rakenteellisia proteiineja. Verrattaessa kaik- • · · • · · ”*.* kiin tunnettuihin virussekvensseihin, pientä mutta merkittävää • · • · 25 kolineaarista homologiaa havaitaan flavivirusryhmän ei-raken- • · · • · ’..I teellisten proteiinien suhteen ja pestivirusten suhteen (joi- • · • · · den katsotaan nyt myös olevan osa Flavivirus-ryhmää).

• · « • · .· ·

Flavivirusten polyproteiini sisältää aminopäästä karboksipää- *** 30 hän mentynä nukleokapsidiproteiinin (C) , matriksiproteiinin ’···* (M) , vaippaproteiinin (E) ja ei-rakenteelliset proteiinit (NS) • · 1, 2(a+b), 3, 4 (a+b) ja 5. Perustuen HCVl:n nukleotidisekvens- • · · V : sissä kooditettuina oleviin oletettuihin aminohappoihin, pieni domeeni HCV-polyproteiinin äärimmäisessä N-päässä näyttää sa- 12 106214 manlaiselta sekä kooltaan että emäksisten tähteiden korkean pitoisuuden osalta kuin flavivirusten polyproteiinien N-päästä tavattava nukleokapsidiproteiini (C) . HCV:n ja keltakuumeviruksen (YFV) ei-rakenteellisilla proteiineilla 2, 3, 4 ja 5 5 näyttää olevan samanlaisen koon ja hydropatisuuden osalta vastineensa, vaikka aminohapposekvensseissä on eroja. Kuitenkin, se HCV:n alue, joka vastaisi niitä YFV-polyproteiinin alueita, jotka sisältävät M-, E- ja NSl-proteiinit, ei eroa ainoastaan sekvenssin osalta, vaan näyttää olevan myös täysin erilainen io sekä koon että hydropatisuuden osalta. Näin ollen, vaikka tiettyjä HCV-genomin domeeneja voidaan tässä yhteydessä nimittää esimerkiksi tunnuksilla NSl tai NS2, tulisi pitää mielessä, että nämä nimitykset ovat spekulatiivisia; HCV-ryhmän ja flavivirusten välillä voi olla huomattavia eroja, joita ei /5 vielä ole arvioitu.

HCV:n eri kantojen, isolaattien tai alatyyppien odotetaan sisältävän eroavuuksia aminohappojen ja nukleiinihappojen osalta verrattuna HCVl:een. Monen isolaatin kokonaisaminohapposek-20 venssin odotetaan olevan hyvin homologinen (so., enemmän kuin . noin 40 %) HCVl:n suhteen. Voidaan kuitenkin myös havaita, et- tä vähemmän homologisia HCV-isolaatteja löytyy. Nämä määri-teltäisiin HCVrksi erilaisten arviointiperusteiden mukaan, .···, joita ovat esimerkiksi suunnilleen. 9000 - suunnilleen 12000 » · • · · ··.·, 25 nukleotidiä sisältävä ORF, joka koodittaa HCVl:n polyproteii- • · • t nin kanssa samankokoista polyproteiinia, HCVl:n polyproteiinin t i · kanssa hydrofobisuudeltaan ja/tai antigeenisuudeltaan saman- .···. lainen kooditettu polyproteiini ja kolineaaristen peptidisek- • · · .···. venssien läsnäolo, jotka ovat säilyneet HCVl:n suhteen. Lisäk- • · · so si uskotaan, että genomi olisi juosteeltaan positiivista RNA:- » « * • · * ta.

• · « · • * · * * · *·’ ‘ Kaikki HCV-isolaatit koodittavat vähintään yhtä epitooppia, joka on immunologisesti samaistettavissa (so., immunologisesti 13 106214 ristireaktiivinen) tässä kuvaillun HCV cDNA: n koodittaman epi-toopin kanssa. Epitooppi sisältyy edullisesti tässä yhteydessä kuvailtuun aminohapposekvenssiin ja on tunnusomainen HCV:lie, verrattuna aikaisemmin tunnettuihin patogeeneihin. Epitoopin s tunnusomaisuus voidaan määrittää sen immunologisesta reaktiivisuudesta anti-HCV-vasta-aineiden kanssa ja immunologisen reaktiivisuuden puutteesta vasta-aineiden kanssa tunnetuille patogeeneille.

10 HCV-kannat ja -isolaatit ovat evolutionistisesti läheisiä. Siitä johtuen otaksutaan, että genomien kokonaishomologia nuk-leotiditasolla voi olla noin 40 % tai enemmän, luultavasti noin 50 % tai enemmän, luultavammin noin 60 % tai enemmän, ja vielä luultavammin noin 80 % tai enemmän; ja että lisäksi vä-15 hintään noin 13 nukleotidiä sisältäviä toisiaan vastaavia viereisiä sekvenssejä löytyy. Tulisi huomata, että HCV-genomin alueella on variaabeleita ja hypervariaabeleita alueita; homo-logian näillä alueilla otaksutaan sen vuoksi olevan merkittävästi vähäisempää kuin homologian kokonaisgenomissa. Vastaako vuus HCV-kannan oletetun genomisen sekvenssin ja esimerkiksi CDC/HCV1 cDNA:n välillä voidaan määrittää alalla tunnetuilla • · • · '· *· menetelmillä. Ne voidaan esimerkiksi määrittää vertaamalla • * • « « ’·’·* suoraan polynukleotidi-informaatiota oletetusta HCV:stä ja • · · tässä kuvailtua HCV cDNA -sekvenssiä (sekvenssejä) toisiinsa.

• · 25 Ne voidaan määrittää myös polynukleotidien hybridisaation * · · • · *..; avulla olosuhteissa, joissa muodostuu pysyviä duplekseja homo- • · · • · · * logisten alueiden välillä (esimerkiksi olosuhteissa, joita ... käytettäisiin ennen Si-pilkontaa) , jota hybridisaatiota seuraa 9 ' · - · · “I pilkkominen yksijuosteisen spesifien nukleaasin (nukleaasien) so avulla, jota seuraa pilkontafragmenttien koon määrittäminen.

« • · · • · * • * * *”·’ Johtuen HCV-kantojen tai -isolaattien evolutionistisestä yh- • · · v : teydestä, oletetut HCV-kannat tai -isolaatit voidaan identifi- oida homologiasta polypeptiditasolla. HCV-kantojen tai 14 106214 -isolaattien homologian otaksutaan yleisesti olevan vähintään 40 %, enemmän kuin noin 50 %, luultavasti enemmän kuin noin 70 % ja vielä luultavammin enemmän kuin noin 80 %, ja joidenkin homologia voi olla jopa enemmän kuin 90 % polypeptiditasolla. s Menetelmät aminohapposekvenssihomologian määrittämiseksi tunnetaan alalla. Aminohapposekvenssi voidaan esimerkiksi määrittää suoraan ja sitä voidaan verrata tässä yhteydessä esitettyihin sekvensseihin. Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää oletetun HCV:n genomisen aineen nukleotidisekvenssi (tavallisesti io cDNA-välituotteen kautta), sen koodittama oletettu aminohapposekvenssi voidaan määrittää ja vastaavia alueita vertailla.

Tässä yhteydessä käytettynä, määrätystä sekvenssistä "saatu" polynukleotidi tarkoittaa polynukleotidisekvenssiä, joka kä-is sittää sekvenssin, joka sisältää suunnilleen vähintään noin 6 nukleotidiä, edullisesti vähintään noin 8 nukleotidiä, edullisemmin vähintään noin 10-12 nukleotidiä ja vielä edullisemmin vähintään noin 15-20 nukleotidiä, jotka vastaavat aluetta määrätyssä nukleotidissä. "Vastaava" tarkoittaa määrätylle sek-20 venssille homologista tai komplementaarista. Alueen sekvenssi, ·. : josta polynukleotidi saadaan, on edullisesti homologinen tai « · · komplementaarinen HCV-genomille tunnusomaiselle sekvenssille.

* · · j ,·. Saatu sekvenssi on edullisemmin homologinen tai komplementaa- • » · • · » · .···. rinen sekvenssille, joka on tunnusomainen kaikille tai suurim- • · ·«♦ Γ.*. 25 malle osalle HCV-isolaateista. Se, onko sekvenssi tunnusomai- • * ♦ ♦ nen HCV-genomille, voidaan määrittää alaa tuntevien tuntemilla • · · ♦ tekniikoilla. Sekvenssiä voidaan esimerkiksi verrata sekvens- .·*·. seihin tietopankeissa, esim., Genebank, sen määrittämiseksi, ··· .***. onko se läsnä infektoitumattomassa isännässä tai muissa or- *·· 30 ganismeissa. Sekvenssiä voidaan verrata myös muiden virusten « » « tunnettuihin sekvensseihin, mukaan lukien ne, joiden tiedetään « · ’·* aiheuttavan hepatiittia, esim., HAV, HBV ja HDV, ja Flaviviri- • · · _| — • · · *·’ * dae-ryhmän jäsenet. Saadun sekvenssin vastaavuus tai vastaa mattomuus muiden sekvenssien suhteen voidaan määrittää myös 15 106214 hybridisaation avulla sopivan kovissa olosuhteissa. Hybri-disaatiomenetelmät nukleiinihapposekvenssien komplementaari-suuden määrittämiseksi ovat alalla tunnettuja ja niitä käsitellään jäljempänä. Katso myös esimerkiksi Maniatis et ai., j (1982). Sen lisäksi hybridisaatiolla muodostuneet dupleksipo-lynukleotidien vastinparittomuudet voidaan määrittää tunnetuilla menetelmillä, mukaan lukien esimerkiksi pilkkominen nukleaasilla kuten Sl:llä, joka pilkkoo spesifisesti yksijuos-teiset alueet polynukleotididuplekseissa. Alueisiin, joista 10 tyypilliset DNA-sekvenssit voidaan "saada", lukeutuvat niihin rajoittumatta esimerkiksi spesifisiä epitooppeja koodittavat alueet samoin kuin ei-kopioidut ja/tai ei-luetut alueet.

Saatu polynukleotidi ei välttämättä ole fysikaalisesti saatu is esitetystä nukleotidistä, vaan se voidaan luoda jollakin tavalla, mukaan lukien esimerkiksi kemiallinen synteesi tai DNA:n replikaatio tai käänteiskopiointi tai kopiointi. Aineyhdistelmiä, jotka vastaavat määrätyn sekvenssin sekvenssiä, voidaan lisäksi modifioida alalla tunnetuilla tavoilla aiottua 20 käyttöä vastaavaksi.

t 1 • i * · · 1 .1 Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "yhdistelmäpolynukleotidi" 4 · ·

• I

.1 1 tarkoittaa alkuperältään genomista, cDNArsta saatua, puolisyn- * · · • · · teettistä tai synteettistä polynukleotidiä, joka alkuperänsä • · 25 tai manipuloinnin nojalla: (1) ei liity kokonaan tai osaksi 4 · polynukleotidiä, jonka kanssa se on liittynyt yhteen luonnos- • 1 · sa, (2) on liittynyt polynukleotidiin, joka on eri kuin mihin φ·ν. se on liittynyt luonnossa tai (3) ei esiinny luonnossa.

• ♦ • · · ··« • · «·· 30 Tässä yhteydessä käytettynä ilmauksella "polynukleotidi" tar- * · 1 *** koitetaan minkä tahansa pituista polymeeristä nukleotidimuo- • · • 4 toa, joko ribonukleotideistä tai deoksiribonukleotideistä. Tä- » · · * mä ilmaus tarkoittaa vain molekyylin primäärirakennetta. Tämä ' ilmaus sisältää siten kaksi- ja yksijuosteisen DNA:n ja RNA:n.

16 106214

Se sisältää myös tunnetut modifikaatiot, esimerkiksi alalla tunnetut leimat, metylaation, "cap"-alueet (emäslisäys), yhden tai useamman luonnossa esiintyvän nukleotidin korvaamisen analogilla, nukleotidien väliset modifikaatiot, kuten esimerkiksi s modifikaatiot varauksettomien liitosten kanssa (esim., metyy-lifosfonaatit, fosfotriesterit, fosfoamidaatit, karbamaatit jne.) ja varauksellisten liitosten kanssa (esim., fosforitio-aatit, fosforiditioaatit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät yhteen kuuluvia lisäosia, kuten esimerkiksi proteiineja io (mukaan lukien esim., nukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipeptidit, poly-L-lysiini jne.), modifikaatiot väliin sijoitettujen aineiden kanssa (esim., akridiini, psoraleeni jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät kelaatinmuodostajia (esim., metallit, radioaktiiviset metallit, boori, hapettavat is metallit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät alkylaattore-ja, modifikaatiot modifioitujen liitosten kanssa (esim., alfa-anomeeriset nukleiinihapot jne.) samoin kuin polynukleotidin modifioimattomat muodot.

20 Tässä yhteydessä käytettynä nukleiinihapon "templaattijuoste" . ("sense strand") sisältää sekvenssin, joka on sekvenssihomolo- * «« ginen mRNA: n kanssa. "Kooditus juoste" ("anti-sense strand") % · « ;*/·, sisältää sekvenssin, joka on komplementaarinen "templaatti- • · · ,··♦, juosteen" sekvenssin kanssa.

« · ♦ · · 25 • » ♦ » Tässä yhteydessä käytettynä viruksen "juosteeltaan positiivi- • · * » nen genomi" on genominen polynukleotidi, joko RNA tai DNA, jo- .···. ka koodittaa vähintään yhtä viruspolypeptidiä. Esimerkkeihin ··· .***. juosteeltaan positiivisista RNA-viruksista lukeutuvat ryhmät ··« *. 3o Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae ja « « ·

Caliciviridae. Mukaan luetaan myös ryhmä Flaviviridae, joka · aikaisemmin luokiteltiin ryhmään Togaviridae. Nämä virukset « · · *·* * ovat tyypillisesti yksijuosteisia. Katso Fields & Knipe (1986).

17 106214 Tässä yhteydessä käytettynä ilmauksella "aluke" tarkoitetaan oligomeeriä, joka kykenee toimimaan polynukleotidijuosteen synteesin aloituskohtana sopivissa olosuhteissa. Aluke on täy-5 sin tai olennaisesti komplementaarinen kopioitavan polynukleotidijuosteen alueen kanssa. Olosuhteissa, jotka ovat sopivat hybridisaatioon, aluke siten pariutuu analyyttijuosteen komplementaarisen alueen kanssa. Lisättäessä sopivia reagensseja (esim. polymeraasi, nukleotiditrifosfaatit ja vastaavat), alu-iq ke pitenee polymeroivan aineen vaikutuksesta, jolloin muodostuu analyyttijuosteen kopio. Aluke voi olla yksijuosteinen tai se voi olla vaihtoehtoisesti osittain tai kokonaan kaksijuos-teinen.

is Ilmaisut "analyyttipolynukleotidi" ja "analyyttijuoste" tarkoittavat yksi- tai kaksijuosteista nukleiinihappomolekyyliä, jonka epäillään sisältävän kohdesekvensin, ja joka voi olla läsnä biologisessa näytteessä.

20 Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "oligomeeri" viittaa aluk- . . keisiin ja koettimiin. Ilmaus oligomeeri ei ilmaise molekyylin • * • · · * kokoa. Oligomeerit eivät tavallisesti ole suurempia kuin 1000 • · · • · · .*\ nukleotidiä, tavallisemmin eivät suurempia kuin 500 nukleoti- • · · • · · '11.' diä, vielä tavallisemmin eivät suurempia kuin 250 nukleotidiä; • · « · .1*^ 25 ne voivat olla pienempiä kuin 100 nukleotidiä ja voivat olla • · *..1^ pienempiä kuin 75 nukleotidiä ja voivat myös olla pienempiä ♦ ♦ · kuin 50 nukleotidiä pituudeltaan.

♦ ♦♦ » - * ·. · .···. Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "koetin" tarkoittaa raken- ♦ · · 30 netta, joka käsittää polynukleotidin, joka muodostaa hybridi- • · · *;*.*. rakenteen kohdesekvenssin kanssa, johtuen koettimen sisältämän « ♦ • · vähintään yhden sekvenssin komplementaarisuudesta kohdealueen »·* » · · *·* * sekvenssin kanssa. Koettimien polynukleotidialueet voivat ’ * koostua DNArsta ja/tai RNA:sta ja/tai synteettisistä nukleoti- ie 106214 dianalogeista. Koettimiin lukeutuvat "kaappaajakoettimet" ja "leimauskoettimet". Koetin ei edullisesti sisällä sekvenssiä, joka on komplementaarinen sekvenssin (sekvenssien) kanssa, jota käytetään polymeraasiketjureaktion (PCR) aloitukseen.

j Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "kohdealue" tarkoittaa nukleiinihapon aluetta, joka on tarkoitus monistaa ja/tai ilmaista. Ilmaus "kohdesekvenssi" tarkoittaa sekvenssiä, jonka kanssa koetin tai aluke muodostavat pysyvän hybridin edullisissa 10 olosuhteissa.

Ilmauksella "kaappaajakoetin" tarkoitetaan tässä käytettynä polynukleotidiä, joka käsittää yksijuosteisen polynukleotidin kytkettynä sitoutumispariin. Yksijuosteinen polynukleotidi kä-is sittää kohteeseen kohdistuvan polynukleotidisekvenssin, joka on komplementaarinen kohdesekvenssin kanssa ilmaistavassa kohdealueessa analyyttipolynukleotidissä. Tämä komplementaarinen alue on riittävän pitkä ja komplementaarinen kohdesekvenssin suhteen, jotta saadaan dupleksiin pysyvyys, joka riittää immo-20 bilisoimaan analyyttipolynukleotidin kiinteään pintaan (sitou-·. : tumisparien välityksellä). Sitoutumispari on spesifinen toisen .·.*. sitoutumisparin suhteen; toinen sitoutumispari voidaan sitoa : kiinteän kantajan pintaan tai se voidaan kytkeä epäsuorasti M» « .***. muiden rakenteiden tai sitoutumisparien välityksellä kiinteään ♦ ·# 25 kantajaan.

• · • · · « ♦ ♦ « · ·

Ilmaus "kohteeseen kohdistuva polynukleotidisekvenssi" tar-koittaa tässä yhteydessä käytettynä polynukleotidisekvenssiä, • · · ·***: joka käsittää nukleotidejä, jotka ovat komplementaarisia koh- ·«· . .·. 30 denukleotidisekvenssin kanssa; sekvenssi on riittävän pitkä ja • · · .···. komplementaarinen kohdesekvenssin kanssa, jotta muodostuu dup- leksi, joka on riittävän pysyvä aiottuun tarkoitukseen.

• · · « « 19 106214

Ilmauksella "sitoutumispari" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä molekyyliä, joka kykenee sitomaan ligandimolekyylin suurella spesifisyydellä, kuten esimerkiksi antigeeni ja sille spesifinen vasta-aine. Spesifisten sitoutumisparien täytyy s yleensä sitoutua riittävällä affiniteetilla analyytti-ko-pio/vastin-juostedupleksin (tässä tapauksessa kaappaajakoetti-met) immobilisoimiseksi eristysolosuhteissa. Alalla tunnetaan spesifisiä sitoutumispareja ja niitä ovat esimerkiksi biotiini ja avidiini tai streptavidiini, IgG ja proteiini A, lukuisat io tunnetut reseptori-ligandiparit ja komplementaariset polynuk-leotidijuosteet. Komplementaaristen polynukleotidisitoutumis-parien ollessa kysymyksessä, parit ovat normaalisti vähintään noin 15 emästä pitkiä ja voivat olla vähintään 40 emästä pituudeltaan; lisäksi niiden G+C-pitoisuus on vähintään noin 40 is % ja niinkin paljon kuin noin 60 %. Polynukleotidit voivat koostua DNA:sta, RNAista tai synteettisistä nukleotidianalo-geista.

Ilmauksella "kytketty” tarkoitetaan tässä yhteydessä kiinnit-20 tyrnistä kovalenttisin sidoksin tai voimakkain ei-kovalenttisin vuorovaikutuksin (esim., hydrofobiset vuorovaikutukset, ve- • · *; / tysidokset jne.). Kovalenttiset sidokset voivat olla esimer- 4 * * / * kiksi esteri-, eetteri-, fosfoesteri-, amidi-, peptidi-, imi- • » · ·**.* di-, hiili-rikki -sidoksia ja vastaavia sidoksia.

• · « · .. . 25 • · · ♦ · *..! Ilmauksella "kantaja" tarkoitetaan mitä tahansa kiinteää tai « · ♦ ♦ · · puolikiinteää pintaa, johon haluttu sitoutumispari voidaan ankkuroida. Sopivia kantajia ovat lasi, muovi, metalli, poly- « ♦ meerigeelit ja vastaavat, ja niiden muotona voivat olla hel-3o met, kaivot, kastotikut, membraanit ja vastaavat.

• · · • · * • · *”· Ilmauksella "leima" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä • · » : mitä tahansa atomia tai osaa, jota voidaan käyttää ilmaistavan • · 20 106214 (edullisesti kvantitoitavan) signaalin aikaansaamiseksi, ja joka voidaan kiinnittää polynukleotidiin tai polypeptidiin.

Ilmauksella "leimauskoetin" tarkoitetaan tässä yhteydessä käy-s tettynä oligomeeriä, joka käsittää kohteeseen kohdistuvan po-lynukleotidisekvenssin, joka on komplementaarinen analyyttipo-lynukleotidissa ilmaistavan kohdesekvenssin kanssa. Komplementaarinen alue on riittävän pitkä ja komplementaarinen kohdesekvenssin suhteen, jotta saadaan dupleksi, joka käsittää io "leimauskoettimen" ja "kohdesekvenssin" ilmaistavaksi leiman avulla. Oligomeeri on kytketty leimaan joko suoraan tai epäsuorasti ligandimolekyyliryhmän välityksellä, spesifisyyden ollessa korkea kullakin. Spesifisyydeltään korkeita ligandimo-lekyyliryhmiä kuvaillaan edellä ja niitä ovat myös multimee-ls rit.

Ilmauksella "multimeeri" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä lineaarista tai haarautunutta polymeeriä, joka käsittää samanlaisen toistuvan yksijuosteisen polynukleotidiyksikön tai 20 erilaisia yksijuosteisia polynukleotidiyksikköjä. Vähintään ; yhdellä yksiköistä on sekvenssi, pituus ja koostumus, joka (·, mahdollistaa sen hybridisaation spesifisesti ensimmäiseen • · · kiinnostuksen kohteena olevaan yksijuosteiseen nukleotidisek- • · · » · t · .···. venssiin, tavallisesti analyyttiin . tai analyyttiin sidottuun • · • · · 25 oligomeeriin (esim., leimauskoetin). Jotta saataisiin aikaan sellainen spesifisyys ja stabiilisuus, tämä yksikkö on normaa- • · · « listi vähintään noin 15 nukleotidiä pitkä, tavallisesti ei .***. enempää kuin noin 50 nukleotidiä pitkä ja edullisesti noin 30 • · · nukleotidiä pitkä; sen lisäksi G+C-pitoisuus on normaalisti M» *. 3o vähintään noin 40 % ja enintään noin 60 %. Sellaisen yksikön « · · (yksikköjen) lisäksi multimeeri sisältää useita yksikköjä, jotka kykenevät hybridisoitumaan spesifisesti ja pysyvästi ’ toiseen yksi juosteiseen kiinnostuksen kohteena olevaan nukle otidiin, tavallisesti leimattuun polynukleotidiin tai toiseen 21 106214 multimeeriin. Näiden multimeerien koko ja koostumus on yleensä sama kuin edellä käsiteltyjen multimeerien. Kun multimeeri on konstruoitu hybridisoitumaan toiseen multimeeriin, ensimmäinen ja toinen oligonukleotidiyksikkö on heterogeeninen (erilai-5 nen), eivätkä ne hybridisoidu toisiinsa valitun määrityksen olosuhteissa. Multimeerit voivat siten olla leimauskoettimia tai ne voivat olla ligandeja, jotka kytkevät leiman koetti-meen.

io Ilmauksella "virus-RNA", joka sisältää HCV RNA:n, tarkoitetaan tässä yhteydessä RNA:ta virusgenomista, sen fragmenteista, sen kopioista ja niistä saaduista mutanttisekvensseistä.

Tässä yhteydessä käytettynä "biologinen näyte" tarkoittaa hen-15 kilöstä eristettyä kudos- tai nestenäytettä, mukaan lukien niihin rajoittumatta esimerkiksi plasma, seerumi, selkäydinneste, imuneste, ihon ulkoiset osat, hengityskanava, maha-suolikanava ja genitourinaalinen kanava, kyynelet, sylki, maito, verisolut, tuumorit, elimet ja myös näytteet in vitro so-20 luviljelyaineosista (mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, solujen käyttämä alusta, joka on tuloksena solujen kasvusta so- *; / luviljelyalustassa, oletetusti virusten infektoimat solut, yh- » · · ,* ' distelmäsolut ja solukomponentit) .

« · · « « « ♦ ·· · ·♦* • · « · .***. 25 Tämän keksinnön mukaisesti käytetään, ellei toisin ole osoi- • « · ♦ · tettu, tavanomaisia menetelmiä koskien kemiaa, molekyylibiologiaa, mikrobiologiaa, yhdistelmä-DNA:ta ja immunologiaa, jotka ovat alalla tunnettuja. Sellaisia menetelmiä selvitetään pe- . · · .·**. rusteellisesti kirjallisuudessa. Katso esim., Maniatis, Fitsch 30 & Sambrook, "Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); *//. DNA Cloning, volyymit I ja II (D.N. Glover edit. 1985) ; Oli- ,* « φ · **.' gonucleotide Synthesis (M.J. Gait edit., 1984); Nucleic Acid • · · ; Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins edit. 1984); sarja, *' ‘ Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) erityisesti voi.

22 106214 154 ja voi. 155 (Wu ja Grossman, edit.). Kaikki tässä, sekä edellä että jäljempänä mainitut patentit, patenttihakemukset ja julkaisut ovat täten sisällytettyinä tässä viitteinä.

s Tämän keksinnön mukaiset aineet ja menetelmät tekee mahdollisiksi HCV:n identifiointi BB~NANBV:n etiologisena vaikuttimena ja nukleotidisekvenssiperheen hankkiminen käyttöön, jotka sekvenssit on eristetty cDNA-kirjastoista, jotka sisältävät HCV cDNA -sekvenssejä. Nämä cDNA-kirjastot saatiin HCV-infektoitu-io neiden simpanssien plasmassa läsnä olevista nukleiinihapposek-vensseistä. Näistä kirjastoista yhden, "c"-kirjaston (ATCC n:o 40394), konstruointia kuvaillaan PCT-julkaisussa WO90/14436.

Käyttämällä hyväksi edellä kuvailtuja HCV cDNA -sekvenssejä is samoin kuin tässä yhteydessä kuvailtua sekvenssiä voidaan konstruoida oligomeerejä, jotka ovat käyttökelpoisia reagens-seina viruspolynukleotidien ilmaisemiseksi biologisista näytteistä. Sekvensseistä on mahdollista esimerkiksi syntetisoida noin 8-10 nukleotidiä tai enemmän sisältäviä DNA-oligomeerejä, 20 jotka ovat käyttökelpoisia hybridisaatiokoettimina HCV RNA:n ·. ; läsnäolon ilmaisemiseksi esimerkiksi luovutetusta verestä, ve- rifraktioista, viruskantajiksi epäiltyjen henkilöiden seeru-: .·. meistä tai soluviljelysysteemeistä, joissa virus replikoituu.

.·**. Tässä yhteydessä kuvaillut uudet oligomeerit mahdollistavat ··* 25 lisäksi HCV-genomin jatkokarakterisoinnin. Näistä sekvensseis- • · tä saatuja polynukleotidikoettimia ja -alukkeita voidaan käyttää cDNA-kirjastoissa läsnä olevien sekvenssien monistamiseksi ja/tai cDNA-kirjastojen seulomi- • «« ·***: seksi koskien muita toisiaan peittäviä cDNA-sekvenssejä, joita ··· so vuorostaan voidaan käyttää toisiaan peittävien sekvensien saa- » · · .···. miseksi lisää. Kuten PCT-julkaisussa WO90/14436 on osoitettu, HCV-genomi näyttää olevan RNA:ta, joka käsittää ensi sijaises- ' . ti suuren avoimen lukukehyksen (ORF), joka koodittaa suurta • · polyproteiinia.

23 106214

Edellä mainitun lisäksi jäljempänä esitettävä informaatio mahdollistaa HCV-kantojen tai -isolaattien identifioinnin. Uusien HCV-kantojen tai -isolaattien eristäminen ja karakterisointi 5 voidaan toteuttaa esimerkiksi eristämällä nukleiinihapot keho-komponenteista, jotka sisältävät viruspartikkeleita ja/tai vi-rus-RNA:ta, luomalla cDNA-kirjastoja käyttäen HCVl-sekvenssiin pohjautuvia oligomeerejä, kirjastojen seulomiseksi kloonien suhteen, jotka sisältävät jäljempänä kuvailtavia HCV cDNA -io sekvenssejä, ja vertailemalla uusien isolaattien HCV cDNA:ta PCT-julkaisussa WO90/14436 ja jäljempänä kuvailtuun cDNA:han. Kannat tai isolaatit, jotka vastaavat HCV-parametrejä, joita on kuvailtu edellä määritelmät-jaksossa, ovat helposti identifioitavissa. Muut menetelmät HCV-kantojen identifioimiseksi is tulevat selviksi alaa tunteville, perustuen tässä yhteydessä annettavaan informaatioon.

HCV cDNA -sekvenssien eristäminen 20 Keksinnön mukaiset oligomeerit sisältävät alueita, jotka muo- . . dostavat hybrididupleksirakenteita kohdesekvenssien kanssa * · · .’ HCV-polynukleotideissä. Oligomeerien HCV-polynukleotidiin hyb- I i * .* ridisoituvat alueet voidaan varmistaa tässä yhteydessä esitet- • « · *”.* tävästä ja PCT-julkaisussa WO90/14436 kuvaillusta HCV cDNA - • · :**·. 25 sekvenssistä (sekvensseistä) . HCVl:n, prototyyppi-HCV:n, yh- • · ’···. distetty HCV cDNA esitetään kuviossa 1. Koostesekvenssi perus- « · · tuu muutamasta HCV cDNA -kloonista saatuun sekvenssi-informaa- .···, tioon, jotka kloonit eristettiin muutamasta HCV cDNA -kirjas- * · ' * # · .··*. tosta, mukaan lukien "c"-kirjasto, joka on läsnä lambda • · ·

30 gtll:sta (Agtll) (ATCC n:o 40394), ja ihmisen seerumista. HCV

cDNA -kloonit eristettiin PCT-julkaisussa WO90/14436 julkais- *·’ tuilla menetelmillä. Lyhyesti, eristetyistä klooneista suurin • · · *·* ' osa sisälsi HCV cDNA "c" -kirjaston sekvenssejä, joka kirjasto konstruoitiin käyttäen seerumikoostetta simpanssista, jolla 24 106214 oli krooninen HCV-infektio, ja joka sisälsi' korkean virustiit-terin, so., vähintään 106 simpanssin infektioannosta/ml (CID/ml). Seerumikoostetta käytettiin viruspartikkelien eristämiseen; näistä partikkeleista saatuja nukleiinihappoja käy-5 tettiin templaattina cDNA-kirjaston konstruoinnissa virus-genomille. Lähtöklooni, 5-1-1, saatiin seulomalla "c"-kirjasto infektoituneiden henkilöiden seerumin kanssa. Lähtökloonin eristämisen jälkeen loput sekvenssistä saatiin seulomalla synteettisten polynukleotidikoettimien kanssa, joiden sekvenssit jo saatiin tunnetun HCV cDNA -sekvenssin (sekvenssien) 5’-alueelta ja 3'-alueelta.

Menetelmien kuvailu DNA-sekvenssien löytämiseksi on enimmäkseen historiallisesti kiinnostavaa. Tuloksena saadut sekvenssi sit (ja niiden komplementit) esitetään tässä yhteydessä, ja sekvenssit tai jokin niiden osa voitiin valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä tai synteettisten menetelmien yhdistelmää osasekvenssien jäljityksen ohella käyttäen samanlaisia menetelmiä kuin PCT-julkaisussa WO90/14436 kuvaillut menetel-20 mät.

• « « · .* Oliqomeerikoettimia ja -alukkeita • · · -^----- — —' —.....- » · • · « * * • · * '«.* Pohjautuen HCV-genomiin (kuvattuna kuviossa 1) ja/tai edulli- • · ··*.·. 25 sesti HCV-genomin säilyneitä alueita, suunnilleen 8 nukleoti- • · *···, diä tai enemmän sisältäviä oligomeerejä voidaan valmistaa, • · · jotka hybridisoituvat HCV RNA:n tai sen komplementin positii- ,···. visen juosteen (juosteiden) kanssa samoin kuin HCV cDNArn • ' · ·»· .··*. kanssa. Nämä oligomeerit voivat toimia koettimina HCV-nukle- ··· *. 3o otidisekvenssejä sisältävien polynukleotidien ilmaisemiseksi • · · ♦ · · III (mukaan lukien eristäminen ja/tai leimaus), ja/tai alukkeina • · HCV-kohdesekvenssien transkriptiota ja/tai replikaatiota var- * · · « · · ten. Oligomeerit sisältävät kohteeseen kohdistuvan polynukle- otidisekvenssin, joka sisältää nukleotidejä, jotka ovat komp- 1···« 25 106214 lementaarisia HCV-kohdenukleotidisekvenssin kanssa; sekvenssi on riittävän pitkä ja komplementaarinen HCV-sekvenssin kanssa dupleksin muodostamiseksi, joka on riittävän pysyvä aiottuun tarkoitukseen. Jos tarkoitus esimerkiksi on HCV-kohdesekvens-s sin sisältävän analyytin eristäminen immobilisaation avulla, oligomeerit sisältäisivät polynukleotidialueen, joka on riittävän pitkä ja komplementaarinen HCV-kohdesekvenssin kanssa, jotta saadaan riittävä pysyvyys dupleksiin analyytin immobi-lisoimiseksi kiinteään kantajaan oligomeereihin sitoutumisen io välityksellä eristämisolosuhteissa. Jos oligomeerien esimerkiksi on tarkoitus toimia myös alukkeina HCV-kohdesekvenssien transkriptiota ja/tai replikaatiota varten analyyttipolynukle-otidissä, oligomeerit sisältäisivät riittävän pitkän ja komplementaarisen polynukleotidialueen HCV-kohdesekvenssin suh-i5 teen, jotta polymerisaatioaineen olisi mahdollista jatkaa replikaatiota alukkeista, jotka ovat pysyvässä dupleksimuodossa kohdesekvenssin kanssa polymerisaatio-olosuhteissa. Jos oligo-meerejä myös esimerkiksi on tarkoitus käyttää leimauskoettimi-na, tai sitoa ne multimeereihin, kohteeseen kohdistuva po-20 lynukleotidialue olisi riittävän pitkä ja komplementaarinen ; muodostaakseen pysyviä hybrididupleksirakenteita leimauskoet- « · · *.t-t timien ja/tai multimeerien kanssa dupleksin ilmaisemiseksi.

• « « . Oligomeerit voivat sisältää vähintään noin 4 viereistä nukle- « i * • · · » .···. otidiä, jotka ovat komplementaarisia kohteena olevan HCV-sek- • · ·· · 25 venssin kanssa; oligomeerit sisältävät tavallisesti vähintään • · • · .···. noin 8 viereistä nukleotidiä, jotka ovat komplementaarisia ♦ · · ♦ HCV-kohdesekvenssin kanssa, ja edullisesti vähintään noin 14 .··*. viereistä nukleotidiä, jotka ovat komplementaarisia HCV-koh- - ·♦· desekvenssin kanssa.

• · · . *·. 30 • · · • · * V.'.' Sopivat kohteeseen kohdistuvat HCV-nukleotidisekvenssit voivat ' · "·’ sisältää nukleotidejä, jotka ovat komplementaarisia nukleoti- • · · dejä valikoituina HCV cDNA -nukleotideistä, jotka esitetään kuviossa 1.

26 106214

Oligomeerin ei tarvitse kuitenkaan sisältää vain kohteena olevan HCV-sekvenssin kanssa komplementaarista sekvenssiä. Se voi lisäksi sisältää nukleotidisekvenssejä tai muita osia, jotka s ovat sopivia niihin tarkoituksiin, joihin oligomeerejä käytetään. Jos oligomeerejä esimerkiksi käytetään alukkeina HCV-sekvenssien monistamista varten PCR:n välityksellä, ne voivat sisältää sekvenssejä, jotka duplekseina ollessaan muodostavat restriktioentsyymikohtia, jotka helpottavat monistettujen sek-10 venssien kloonausta. Jos oligomeerejä on tarkoitus käyttää myös "kaappaajakoettimina" hybridisaatiomäärityksissä (kuvail tu jäljempänä), ne sisältäisivät lisäksi sitoutumisparin, joka kytketään oligomeeriin, joka sisältää kohteena olevalle HCV-sekvenssille komplementaarisen nukleotidisekvenssin. Muita is osia tai sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia, ja joihin oligomeerit voivat sisältyä tai kytkeytyä, ovat ne, joiden tiedetään alalla olevan sopivia useisiin eri tarkoituksiin, mukaan lukien nukleotidikoettimien leimaus.

20 Oligomeerejä valmistetaan alalla tunnetuilla tavoilla, kuten . . esimerkiksi menetelmillä, joita ovat leikkaus, transkriptio .’ tai kemiallinen synteesi. Valittavat genomin kohdesekvenssit I ja/tai alueet, joiden kanssa oligomeerin kohteeseen kohdistu- • · · • · · 'V..\ vat polynukleotidit ovat komplementaarisia, riippuvat päämää- • · .Ι*·# 25 rästä. Jos päämääränä esimerkiksi on seuloa HCV:n läsnäolo • · *♦;·. biologisista näytteistä (esim. verestä), edullisia oligomeere- • · ♦ jä käytettäisiin koettimina ja/tai alukkeina ja ne hybridisoi- .···. tuisivat HCV-genomin säilyneisiin alueisiin. Joitakin HCV-ge- ·«» .···. nomin säilyneitä alueita kuvaillaan tässä, joihin oligomeerit ··♦ *. 30 voivat sitoutua, esimerkiksi alueita, jotka sisältävät nukle- • ♦ ♦ ♦ ♦ · I!’. otidinumerot noin 5'-päästä noin 200:aan tai noin 4000 - noin « ♦ Ί* 5000 tai noin 8000 - noin 9040 kuten kuviossa 1 on esitetty, ♦ · · • * * *·* * tai edullisesti nukleotidit noin -318 - noin 174, noin 4056 - noin 4448 ja noin 4378 - noin 4902. Erityisen edullisia aluk- 27 106214 keitä ja koettimia saadaan nukleotideistä' noin -313 - noin 173, ja noin nukleotidi l:stä noin nukleotidi 540:een kuten kuviossa 1 on esitetty.

5 Muut säilyneet genomin alueet on helppo varmistaa vertailemalla erilaisten HCV-isolaattien nukleotidisekvenssejä, mukaan lukien prototyyppi HCV, HCV1. Alalla tunnetaan menetelmät vertailujen suorittamiseksi genotyyppien välillä säilyneiden ja ei-säilyneiden alueiden määrittämiseksi, ja esimerkkejä näistä io menetelmistä tuodaan esille PCT-julkaisussa WO90/14436.

Tavanomaisessa nukleiinihappojen hybridisaatiomäärityksessä yksijuosteinen analyyttinukleiinihappo (joko DNA tai RNA) hyb-ridisoidaan nukleiinihappokoettimeen ja tuloksena olevat dup-is leksit ilmaistaan. HCV-polynukleotidien (luonnollisten tai johdettujen) koettimilla on pituus, joka mahdollistaa tunnusomaisten virussekvenssien ilmaisun hybridisaation avulla. Vaikka 6-8 nukleotidiä saattaa olla sopiva pituus, 10-12 nukleotidiä sisältävät sekvenssit ovat edullisia ja noin 20 nuk-20 leotidiä tai enemmän vaikuttavat optimaalisilta. Nämä sekvens-, . sit sadaan edullisesti alueilta, joilta puuttuu heterogeeni- ! / suus. Näitä koettimia voidaan valmistaa käyttäen tavanomaisia < f « • « « *. menetelmiä, mukaan lukien oligonukleotidien automaattiset syn- I « « • « · ’/.* teesimenetelmät. Käyttökelpoisia koettimia esimerkiksi ovat • · 25 ne, jotka saadaan tässä esille tuoduista vasta eristetyistä i · klooneista, samoin kuin erilaiset oligomeerit, jotka ovat • » * käyttökelpoisia käsiteltäessä jäljempänä esille tuotuja cDNA-kirjastoja koettimilla. Vastinsekvenssi mille tahansa tun- • · ,···, nusomaiselle HCV-genomin osalle on riittävä. Koetinkäyttöä • · · ·, 50 varten täydellinen komplementaarisuus on toivottava, vaikkei » ♦ · φ · · // se ole välttämätöntä, kun fragmentin pituus kasvaa.

• » % · • ♦ · » • · · • · · ’·* * Käytettäessä sellaisia koettimia vaikuttimina HCV-polynukle- otidien ilmaisemiseksi (esimerkiksi seulottaessa kontaminoi- 28 106214 tunutta verta), analysoitavaa biologista näytettä, kuten esimerkiksi verta tai seerumia, voidaan haluttaessa käsitellä niiden sisältämien nukleiinihappojen uuttamiseksi. Näytteestä tuloksena saatu nukleiinihappo voidaan geelielektroforesoida 5 tai saattaa muuhun koon perusteella erottavaan tekniikkaan; nukleiinihapponäyte voidaan vaihtoehtoisesti pisteblotata ilman kokoerottelua. Hybrididupleksien muodostamiseksi koettimen kohdetta vastaavan sekvenssin kanssa, analyyttinukleiinihapon kohdealueen on oltava yksijuosteisessa muodossa. Silloin kun io sekvenssi on luonnollisena läsnä yksijuosteisessa muodossa, denaturaatiota ei tarvita. Silloin kun sekvenssi kuitenkin on läsnä kaksijuosteisessa muodossa, sekvenssi denaturoidaan. De-naturointi voidaan suorittaa useilla erilaisilla alalla tunnetuilla menetelmillä. Denaturoinnin jälkeen analyyttinukle-/5 iinihappoa ja koetinta inkuboidaan olosuhteissa, jotka edistävät koettimessa olevan kohdesekvenssin pysyvää hybridimuodos-tusta analyytissä olevan oletetun kohdennetun sekvenssin kanssa, ja tuloksena olevat koettimen (koettimet) sisältävät dup-leksit ilmaistaan.

20

Tuloksena olevan mahdollisen dupleksin ilmaisu suoritetaan ta- • · **# vallisesti käyttäen leimattuja koettimia; koetin voi vaih- • · · • · · / ’ toehtoisesti olla leimaamaton mutta se voi olla ilmaistavissa » · « • · ♦ **’.1 sidottaessa spesifisesti ligandiin, joka on leimattu, joko • ♦ • · .**1 25 suoraan tai epäsuorasti. Alalla tunnetaan sopivia leimoja ja • · ♦ • · *..! menetelmiä koettimien ja ligandien leimaamiseksi, ja niitä • · ♦ ovat esimerkiksi radioaktiiviset leimat, jotka voidaan liittää ... tunnetuilla menetelmillä (esim., katkoluenta tai kinaasikäsit- • ♦ /··. tely), biotiini, fluoresoivat ryhmät, kerniluminesoivat ryhmät ♦ • · · *. 30 (esim., dioksetaanit, erityisesti liipaistut dioksetaanit), « « · • · 1 entsyymit, vasta-aineet ja vastaavat leimat.

• 1 » ♦ • · · • » · V 1 Se alue koettimista, jota käytetään analyytin sitomiseen, voi- ' daan tehdä kokonaan komplementaariseksi HCV-genomin suhteen.

29 106214

Erittäin kovat hybridisaatio-olosuhteet ovat sen vuoksi edulliset väärien positiivisten estämiseksi. Kovuustasoltaan suuria olosuhteita tulisi kuitenkin käyttää vain, jos koettimet ovat komplementaarisia niille virusgenomin alueille, jotka ei-s vät ole heterogeenisiä. Hybridisaation kovuustason määräävät muutamat tekijät hybridisaation aikana ja pesutoimenpiteen aikana ja niitä ovat lämpötila, ionivahvuus, käsittelyaika ja formamidipitoisuus. Näitä tekijöitä käsittelee esimerkiksi T. Maniatis (1982).

10 Tämän peruskaavan alalla tunnettuja variaatioita, mukaan lukien ne, jotka helpottavat ilmaistavien dupleksien erottamista ylimääräisistä aineista, ja/tai jotka vahvistavat leimatun osan signaalia, voidaan myös käyttää. Joitakin näistä variaa-/5 tioista tarkastellaan esimerkiksi julkaisussa: Matthews ja

Kricka (1988), Anal. Biochem. 169:1; Landegren et ai., (1988), Science 242:229; ja Mittlin (1989), Clin. Chem. 35:1819. HCV:n ilmaisuun näissä määrityksissä sopivat koettimet sisältävät sekvenssejä, jotka hybridisoituvat HCV-kohdepolynukleotidisek-20 venssien kanssa muodostaen duplekseja analyyttijuosteen kanssa, jolloin dupleksien pysyvyys on riittävä ilmaisua varten » · ** .1 spesifisessä määrityssysteemissä.

» » · - · · ♦ 1 » ♦ • · · 4 4 · **!.1 Sopiva variaatio on esimerkiksi US-patentissa 4 868 105, jul- • · 25 kaistu 9. syyskuuta, 1989, ja EPO-julkaisussa 225807 (julkais- • · *..I tu 16. kesäkuuta, 1987) kuvailtu variaatio. Näissä julkaisuis- 4 4· • 4 4 sa kuvaillaan nukleiinihappojen liuosfaasista hybridisaa-tiomääritystä. jossa analyyttinukleiinihappo hybridisoidaan 4 · V"' leimauskoetinryhmään ja kaappaajakoetinryhmään. Koetin-ana- 4 30 lyyttikompleksi liitetään hybridisaation avulla kiinteään

4 4J

*·" alustaan kiinnitettyyn kaappaajakoettimeen, joka on komplemen- « 4 4 · taannen kaappaajakoetinryhmän kanssa. Tämä mahdollistaa ana- • 4 ♦ V : lyyttinukleiinihapon poistamisen liuoksesta kiinteäfaasisena 1 kompleksina. Analyytin ollessa kiinteäfaasisessa kompleksimuo- 30 106214 dossa seuraavat erotusvaiheet määrityksessä helpottuvat. Leimaus koet inryhmä on komplementaarinen leimauskoettimen suhteen, joka on sidottu hybridisaation avulla kiinteä faasi/analyytti -kompleksiin, j

Yleisesti otaksutaan, että HCV-genomisekvenssit ovat läsnä infektoituneiden henkilöiden seerumissa verrattain alhaisina tasoina, so., tason ollessa suunnilleen 102-103 simpanssin in-fektioannosta (CID)/ml. Tämä taso saattaa edellyttää monista-10 mismenetelmien käyttämistä hybridisaatiomäärityksissä. Sellaisia menetelmiä tunnetaan alalla. Esimerkiksi Enzo Biochemical Corporationin "Bio-Bridge"-systeemissä käytetään terminaalista deoksinukleotiditransferaasia modifioimattomien 3'-poly-dT -häntien lisäämiseksi DNA-koettimeen. dT-hännitetty koetin hyb-15 ridisoidaan kohdenukleotidisekvenssiin ja sen jälkeen bio-tiinilla modifioituun poly-A:han. PCT-julkaisussa W084/03520 ja EPO-julkaisussa 124221 kuvaillaan DNA-hybridisaattiomääri-tystä, jossa: (1) analyytti pariutetaan yksijuosteiseen DNA- koettimeen, joka on komplementaarinen entsyymillä leimatun 20 oligonukleotidin suhteen; ja (2) tuloksena saatu hännitetty , . dupleksi hybridisoidaan entsyymillä leimattuun oligonukleoti- * $ i · · ' .1 diin. EPO-julkaisussa 204510 kuvaillaan DNA-hybridisaatiomää-

• i I

• t .1 ritystä, jossa analyytti-DNA saatetaan kosketuksiin koettimen i · » • ♦ · kanssa, jossa on häntä kuten poly-dT-häntä, monistajajuosteen, • · ··’·. 25 jolla on sekvenssi, joka hybridisoituu koettimen häntään kuten • · poly-A-sekvenssiin, ja joka kykenee sitomaan useita leimattuja • · · juosteita. Hybridisaatiomääritystyypissä, jota kuvaillaan EPO- .···, julkaisussa 317077 (julkaistu 24. toukokuuta, 1989), jonka pi- • · • ·· £ .···. täisi ilmaista sekvenssejä tasolla suunnilleen 10 /ml, käyte- tl· •t 30 tään hyväksi nukleiinihappomultimeerejä, jotka sitoutuvat yk-« · · • · · . i · sijuosteiseen analyyttmukleiinihappoon, ja joka sitoutuu myös • · • 1 useaan yksijuosteiseen leimattuun oligonukleotidiin. Erityisen * 1 1 1 V 1 edullinen tekniikka voi käsittää HCV-kohdesekvenssien monista- 1 misen seerumeissa suunnilleen 10000-kertaisesti (so., suunnil- 3, 106214 leen tasolle 106 sekvenssiä/ml), osana hybridisaatiosysteemiä. Monistaminen voidaan suorittaa esimerkiksi polymeraasiketjureaktio (PCR) -tekniikalla, jota kuvailevat Saiki et ai., (1986), Mullis, CJS-patentissa 4 683 195 ja Mullis, US-paten-5 tissa 4 683 202. Monistaminen voidaan suorittaa ennen HCV-koh-desekvenssin puhdistamista tai edullisesti sen jälkeen. Monistamista voidaan käyttää määritysmenetelmien yhteydessä, joita kuvaillaan US-patentissa 4 868 105, tai jos vielä lisämonista-mista toivotaan, EPO-julkaisussa 317077 kuvaillun hybridisaa-io tiosysteemin yhteydessä.

Edulliset menetelmät HCV-sekvenssien ilmaisemiseksi analyytti- polynukleotidijuosteessa perustuvat hybridisaatioilmaisu- menetelmiin, joita kuvaillaan US-patentissa 4 868 105 ja EPO- 15 julkaisussa 317077. Nämä menetelmät ovat liuosfaasisia ker- roshybridisaatiomäärityksiä, joissa käytetään sekä kaappaus- että leimakoettimia, jotka hybridisoituvat analyyttinukle- iinihapon sisältämiin kohdesekvensseihin. Käytettäessä näitä määrityksiä HCV:n seulomiseksi biologisista näytteistä, käy- 20 tettävät koettimet sitoutuisivat HCV-genomin säilyneisiin alu- : eisiin. Kaappaaja- ja leimauskoettimet voivat olla sekaisin • · sidottaessa kohdesekvenssiin. Vaihtoehtoisesti, edullisessa • · · • · : toimintamallissa kaappaaja- ja leimauskoettimet ovat ryhminä, ·«· · .***; ja toisen ryhmän koettimet eivät sekoitu toisen ryhmän koetti- • · * :*·*: 25 mien kanssa. Jälkimmäisessä toimintamallissa usean kaappaaja- • ♦ koettimen käsittävä ryhmä (ryhmät) hybridisoituu genomin eni-ten säilyneisiin alueisiin, kun taas usean leimauskoettimen ryhmä (ryhmät) voi hybridisoitua alueisiin, jotka ovat jonkin • · · verran erilaisia. Käyttäen esimerkiksi kuviossa 1 esitettyä . .·. 3o prototyyppistä HCV1 cDNA -sekvenssiä voitaisiin käyttää koet-• · * • · · .···. timia, jotka hybridisoituvat sekvensseihin nukleotidialueella • · · noin -318 - noin 174 ja/tai nukleotidialueella noin 4378 - • · · « · · noin 4902 ja/tai nukleotidialueella 4056 - noin 4448. Edulli- set koettimet hybridisoituisivat HCV-genomin 51-alueen sek- • ♦ 32 106214 vensseihin, koska, kuten jäljempänä esitetään, tämä alue näyttää olevan hyvin säilynyt. Edulliset koettimet voivat siten hybridisoitua esimerkiksi nukleotideihin noin -318 - noin 174 kuten kuviossa 1 on esitetty. Voitaisiin käyttää koettimia, s jotka hybridisoituvat joko positiiviseen juosteeseen säilyneillä alueilla ja/tai sen komplementtiin, tarkoituksesta riippuen esimerkiksi genomisten virussekvenssien ilmaisemiseksi tai PCR-monistuksesta tuloksena saatujen HCV cDNA -sekvenssien ilmaisemiseksi tai positiiviselle HCV RNA -juosteelle io replikatiivisten välituotteiden ilmaisemiseksi.

HCV RNA:n ja siitä saatujen polynukleotidien ilmaiseminen käyttäen HCV/cPCR-menetelmää is Erityisen käyttökelpoinen menetelmä HCV RNA:n tai HCV RNA:sta saatujen polynukleotidien ilmaisemiseksi on HCV/cPCR-menetel-mä, joka on yksi tämän patenttihakemuksen kohde, ja jossa käytetään polymeraasiketjureaktiomenetelmää (PCR), jota kuvailevat Saiki et ai., (1986), Mullis US-patentissa 4 683 195 ja 20 Mullis US-patentissa 4 683 202. HCV/cPCR-menetelmässä käyte- < '· tään alukkeita ja koettimia, jotka on saatu tässä yhteydessä ( « '<4.' esitetyn informaation avulla, joka koskee HCV-genomin luonnet- t · i · · I < « , *·* · ta.

«· · < · I · • · · < · · < · · •t>‘* 25 Yleisesti ottaen PCR-tekniikassa valmistetaan lyhyitä oli- i » · '·* * gonukleotidialukkeita, jotka sopivat yhteen halutun sekvenssin ... vastakkaisten päiden kanssa. Alukkeiden välistä sekvenssiä ei • .· \\\ tarvitse tietää. Polynukleotidinäyte uutetaan ja denaturoi- • · *!* daan, edullisesti lämmön avulla, ja hybridisoidaan molaarisena *·*..’ 3o ylimääränä läsnä olevien oligonukleotidialukkeiden kanssa. Po- • · · • * *···’ lymerisaatiota katalysoi templaatista ja alukkeesta riippu- * · · vainen polymeraasi deoksinukleotiditrifosfaattien tai nukle-otidianalogien (dNTP:t) läsnä ollessa. Tämä johtaa "pitkiin tuotteisiin", jotka sisältävät vastaavat alukkeet 5’-päissään 33 106214 kovalenttisesti sidottuina alkuperäisten, juosteiden vasta syntetisoituihin komplementteihin. Replikoitu DNA denaturoidaan jälleen, hybridisoidaan oligonukleotidialukkeiden kanssa, palautetaan polymeroiviin olosuhteisiin ja toinen replikaa-5 tiojakso aloitetaan. Toisessa jaksossa saadaan kaksi alkuperäistä juostetta, kaksi pitkää tuotetta jakso l:stä ja kaksi "lyhyttä tuotetta" replikoituna pitkistä tuotteista. Lyhyet tuotteet sisältävät kohdesekvenssistä saadut sekvenssit (temp-laatti- tai kooditussekvenssi), jotka ovat alukesekvenssien io 5'- ja 3'-päiden viereisiä sekvenssejä. Jokaisessa lisäjaksos-sa lyhyiden tuotteiden lukumäärä replikoituu eksponentiaalisesti. Tällä menetelmällä saadaan siten aikaan spesifisen koh-desekvenssin monistuminen.

is Menetelmässä tuotetaan näyte, jonka epäillään sisältävän HCV RNA:n tai sen fragmentin. Näyte otetaan tavallisesti henkilöstä, jolla epäillään olevan NANBH; muut näytelähteet ovat kuitenkin mahdollisia, esim., solujen vähän käyttämä alusta tai solut in vitro -systeemeistä, joissa avirus on replikoitunut. 20 Näytteen on kuitenkin sisällettävä kohdenukleiinihapposekvens-. si (-sekvenssejä) .

• I · • · • · • tj · Näyte saatetaan sen jälkeen olosuhteisiin, jotka mahdollista- vat HCV RNA:n käänteiskopioinnin HCV cDNA:ksi. Alaa tunteva • · · • *.· 25 tietää RNA:n käänteiskopioinnin olosuhteet ja niitä kuvailevat • · · · esimerkiksi Maniatis et ai. (1982) ja Methods in Enzymology.

Käänteiskopioinnin edullisessa menetelmässä käytetään kään- M· teistranskriptaasia useasta eri lähteestä, mukaan lukien yh- * · · distelmämolekyylit, jotka on eristetty esimerkiksi retroviruk-: ·/: 3q sesta, edullisesti linnun myeloblastoosiviruksesta (AMV), ja

: : transkriptiolle sopivia olosuhteita. Käänteiskopioinnin HCV

.·:·. cDNA -tuote on RNA:DNA -hybridimuodossa, joka on tuloksena en- ....: simmäisestä käänteiskopiointi jaksosta; seuraavaksi tuloksena 34 106214 ovat DNA:DNA -hybridit kahdesta tai useammasta transkriptio jaksosta.

Käänteiskopioinnista tuloksena saatu HCV cDNA viedään sen jäl-5 keen PCR:ään kohdesekvenssin monistamiseksi. Tämän toteuttamiseksi HCV cDNA denaturoidaan ja erotetut juosteet hybridisoi-daan alukkeiden kanssa, jotka ovat kohdesekvenssin viereisiä.

Juosteiden erottaminen voidaan toteuttaa jollakin sopivalla io denaturointimenetelmällä, mukaan lukien fysikaaliset, kemialliset tai entsymaattiset menetelmät, jotka ovat tuttuja alaa tunteville. Edullinen menetelmä, joka on fysikaalinen, käsittää nukleiinihapon kuumentamisen kunnes se on kokonaan denaturoitunut (> 99 %). Tyypillinen lämpödenaturaatio käsittää läm-15 pötila-alueen- noin 80°C - noin 105°C ajanjakson vaihdellessa 1-10 minuuttia.

HCV cDNA:n hybridisoinnin jälkeen alukkeiden kanssa HCV-koh- desekvenssit replikoidaan polymerointimenetelmin, joissa käy- 20 tetään alukeoligonukleotidiä replikaattiketjun synteesin '·“· aloittamiseksi. Alukkeet valitaan niin, että ne ovat komple- * · · mentaariset HCV-genomin sekvensseille. Oligomeeriset alukkeet, • ·

• » I

: jotka ovat komplementaariset HCV cDNA:n templaatti- ja koodi- • · *···* tus juosteiden suhteen, voidaan konstruoida HCV cDNA -sekvens- * * m * · ·>#·* 25 seistä kuviossa 1 esitetystä yhteenkootusta cDNA-sekvenssistä.

• · · • · ·

Alukkeet valitaan siten, että niiden suhteelliset paikat dup- • · ·' · *” leksisekvenssin suhteen ovat sellaiset, että toisesta aluk- * · keesta syntetisoitu pidennystuote, erotettaessa templaatistaan 30 (vastinsekvenssi), toimii templaattina toisen alukkeen ketjun- • · ’···* pidennykselle määrätyn pituisen replikaattiket jun aikaansaa- • · ».

: : : miseksi.

* » « · 106214 35

Aluke on edullisesti yksijuosteinen monistustehon maksimoimiseksi mutta vaihtoehtoisesti se voi olla kaksijuosteinen. Jos aluke on kaksijuosteinen, aluketta käsitellään ensin sen juos-teiden erottamiseksi ennen sen käyttöä pidennystuotteen val-5 mistukseen. Aluke on edullisesti oligodeoksiribonukleotidi.

Alukkeen on oltava riittävän pitkä pidennystuotteiden synteesin aloitukseen polymerisaatioaineksen läsnä ollessa. Alukkei-den tarkka pituus riippuu monesta tekijästä, mukaan lukien lämpötila ja alukelähde ja menetelmän käyttö. Riippuen koh-io desekvenssin monimutkaisuudesta, oligonukleotidialuke sisältää tyypillisesti esimerkiksi noin 15-45 nukleotidiä, vaikka se voi sisältää enemmän tai vähemmän nukleotidejä. Lyhyet aluke-molekyylit tarvitsevat yleensä viileämpiä lämpötiloja riittävän pysyvien hybridikompleksien muodostamiseksi templaatin is kanssa.

Tässä yhteydessä käytetyt alukkeet valitaan "olennaisesti" komplementaarisiksi kunkin spesifisen monistettavan sekvenssin eri juosteiden suhteen. Alukkeiden ei siten tarvitse vastata . . 20 templaatin tarkkaa sekvenssiä mutta niiden on oltava riittävän ! komplementaarisia hybridisoituakseen valikoivasti niitä vas- ! taavien juosteiden kanssa. Ei-komplementaarinen nukleotidi- fragmentti voidaan esimerkiksi kiinnittää alukkeen 5'-päähän, .ΓΙ alukesekvenssin muun osan ollessa juosteen kanssa komplemen- 25 taarinen. Ei-komplementaariset emäkset tai pitemmät sekvenssit • « ♦ voidaan vaihtoehtoisesti sirotella alukkeeseen edellyttäen, ,···, että aluke on riittävän komplementaarinen yhden monistettavan ψ * « · · ' .·»·, juosteen sekvenssin kanssa hybridisoituakseen sen kanssa ja • · · \ muodostaakseen siten dupleksirakenteen, jota voidaan pidentää • » · 3o polymeraatiovaikuttimen avulla. Alukkeiden ei-komplementaari- « · T set nukleotidisekvenssit voivat sisältää restriktioentsyymi- t · · .

*.* * kohtia. Liittämällä restriktioentsyymikohta (-kohtia) koh- ···««.

’ ' desekvenssin päähän (päihin) olisi erityisen edullista koh- desekvenssin kloonausta varten.

36 106214

Tulisi ymmärtää, että "aluke" tässä yhteydessä käytettynä voi tarkoittaa useampaa kuin yhtä aluketta, erityisesti siinä tapauksessa, jossa informaatio on jossain määrin kaksiselittei-j nen koskien monistettavan kohdesekvenssin terminaalista sekvenssiä (sekvenssejä). "Aluke" käsittää tämän jälkeen aluke-oligonukleotidijoukkoa, joka sisältää sekvenssejä, jotka edustavat mahdollisia muunnelmia sekvenssissä, tai se käsittää nukleotidejä, jotka mahdollistavat tyypillisen emäspariutumi-10 sen. Yksi alukeoligonukleotideistä tässä kokoelmassa on homologinen kohdesekvenssin pään kanssa. Erityistapaus on sellainen, jossa oligomeeriryhmiä käytetään HCV-genomin potentiaalisesti vaihtelevan alueen monistuksen aloittamiseksi.

is On odotettavissa, että HCV:stä on olemassa useita erilaisia kantoja tai isolaatteja, joiden sekvenssit poikkeavat HCV1-prototyyppikannasta. Kantamuunnelmien ilmaisemiseksi on siten edullista konstruoida alukkeita, jotka hybridisoituvat HCV-genomin säilyneisiinn alueisiin. Säilyneet alueet voidaan mää-20 rittää vertailemalla useiden HCV-kantojen/isolaattien nukle-·. : otidi- tai aminohapposekvenssejä. Edellä kuvaillussa HCV-geno- missä näyttää olevan vähintään kolme säilyneitä aminohappoja : sisältävää aluetta, joista alukkeet voidaan saada. Näiden alu- eiden otaksutaan olevan säilyneitä. Jäljempänä esimerkeissä • · · 25 kuvailtavat alukkeet saadaan alueilta, joiden otaksutaan ole- • · van HCV:n säilyneitä alueita, perustuen flavivirusten sekvens-sihomologiaan.

* ♦ · • · • · .

♦ ♦· * : Oligonukleotidialukkeet voidaan valmistaa millä tahansa sopi- . jo valla menetelmällä. Alalla tunnetaan menetelmiä spesifisen • * * .**·. sekvenssin sisältävien oligonukleotidien valmistamiseksi, esi- • · » merkiksi sopivien sekvenssien kloonaus ja rajoitus ja suora • · · « · · kemiallinen synteesi. Kemiallisia synteesimenetelmiä voivat « · olla esimerkiksi Narangin et ai. (1979) kuvailema fosfotrieste- 37 106214 rimenetelmä, Brownin et ai.(1979) esittämä fosfodiesteri-menetelmä, ' Beaucagen et ai. (1981) dietyylifosforiamidaatti-menetelmä ja kiinteään kantajaan perustuva menetelmä US-paten-tissa 4 458 066.

5

Alukkeet voidaan leimata haluttaessa liittämällä osia, jotka voidaan ilmaista spektroskooppisin, fotokemiallisin, biokemiallisin, immunokemiallisin tai kemiallisin menetelmin.

io Oligonukleotidialukkeen (-alukkeiden) templaatista riippuva pidennystä katalysoi polymeroiva aine, kun läsnä on riittäviä määriä neljää deoksiribonukleotiditrifosfaattia (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) tai analogia, reaktioalustassa, joka sisältää sopivia suoloja, metallikationeja ja pH-puskurisysteemin. So-is pivia polymeroivia aineita ovat entsyymit, joiden tiedetään katalysoivan alukkeesta ja templaatista riippuvaa DNA-syntee-siä. Tunnettuja DNA-polymeraaseja ovat esimerkiksi E. colin DNA-polymeraasi I tai sen Klenow-fragmentti, T4 DNA -polyme-raasi ja Taq DNA -polymeraasi. Alalla tunnetaan reaktio-olo-20 suhteet DNA-synteesin katalysoimiseksi näiden DNA-polymeraa- ·.*·: sien avulla.

t 4 · • * · • · : Synteesituotteet ovat dupleksimolekyylejä, joita ovat temp- ··· • · *...* laattijuosteet ja alukkeesta pidennetyt juosteet, jotka sisäl- ·· * • » * : ·* 25 tävät kohdesekvenssin. Nämä tuotteet vuorostaan toimivat temp- ·»« • · · ’·* * laattina toisessa replikaatiojaksossa. Toisessa replikaa- tiojaksossa ensimmäisen syklin alukkeesta pidennetty juoste ·«« • · . *··’ pariutetaan sille komplementaarisen alukkeen kanssa; synteesi ·;·* tuottaa "lyhyen" tuotteen, johon on sitoutunut sekä 5’- että 3o 3'-päissä alukesekvenssit tai niiden vastinsekvenssit. Tois- :...: tettaessa denaturaaation, alukepariutumisen ja pidennyksen kä- * sittävät syklit, on tuloksena alukkeiden määräämän kohdesek-*:·*: venssin eksponentiaalinen akkumulaatio. Riittävä syklimäärä toteutetaan, jotta saadaan aikaan toivottu määrä polynukleoti- 38 106214 dia, joka sisältää nukleiinihapon kohdealueen. Toivottu määrä voi vaihdella ja se määritetään sen toiminnon avulla, jossa tuotepolynukleotidin on tarkoitus toimia.

5 PCR-menetelmä voidaan toteuttaa muutamassa ajallisessa jaksossa. Se voidaan esimerkiksi suorittaa asteittain, jolloin kunkin vaiheen jälkeen lisätään uusia reagensseja, tai tavalla, jossa kaikki reagenssit lisätään samanaikaisesti, tai osittain asteittaisella tavalla, jolloin tuoreita reagensseja lisätään io tietyn vaihemäärän jälkeen.

Edullisessa menetelmässä PCR-reaktio suoritetaan automatisoituna prosessina, jossa käytetään lämpökestoista entsyymiä. Tässä prosessissa reaktioseosta kierrätetään denaturaatioalu-15 een, alukepariuttamisalueen ja reaktioalueen läpi. Voidaan käyttää laitetta, joka on spesifisesti sopeutettu käytettäväksi lämpökestoisen entsyymin kanssa, jossa laitteessa käytetään hyväksi lämpötilan jaksotusta ilman nesteen käsittelysystee-miä, koska entsyymiä ei tarvitse lisätä joka jaksossa. Tämän 20 tyyppinen laite on kaupallisesti saatavissa Perkin Elmer Cetus Corp. ' lta.

• · : Monistamisen jälkeen PCR:n avulla kohdepolynukleotidit ilmais- ♦ ·· • · taan hybridisaation avulla koetinpolynukleotidin kanssa, joka • · ♦ • ♦ · • ·’ 25 muodostaa pysyvän hybridin kohdepolynukleotidisekvenssin kans- ·♦· • · · sa hybridisaatio- ja pesuolosuhteissa, jotka tasoltaan ovat kovista kohtalaisen koviin. Jos on odotettavissa, että koetti- «·· • · *···* met ovat kokonaan komplementaarisia (so., noin 99 % tai enem- ♦ · ♦y män) kohdesekvenssin suhteen käytetään kovia (stringent) olo- 30 suhteita. Jos emäspariutumattomuutta on odotettavissa, esimer-:...: kiksi jos kantamuunnoksia on odotettavissa sillä seurauksella, :T: että koetin ei ole täysin komplementaarinen, hybridisaation *:**: kovuutta voidaan vähentää. Epäspesifisen/tilapäisen sitoutumi sen eliminoivat olosuhteet kuitenkin valitaan. Olosuhteet, 39 106214 jotka vaikuttavat hybridisaatioon, ja jotka'valikoivat epäspesifisen sitoutumisen suhteen, ovat alalla tunnettuja ja niitä kuvailee esimerkiksi Maniatis et ai., (1982). Yleisesti ottaen, alhaisempi suolapitoisuus ja korkeampi lämpötila lisäävät j sitoutumisen tiukkuutta. Yleisesti ollaan esimerkiksi sitä mieltä, että kovat olosuhteet käsittävät inkuboinnin liuoksissa, jotka sisältävät suunnilleen 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, inku-baatio/pesulämpötilan ollesa noin 65°C, ja kohtalaisen kovat olosuhteet käsittävät inkuboinnin liuoksissa, jotka sisältävät io suunnilleen 1-2 x SSC, 0,1 % SDS ja inkubaatio/pesulämpötilan noin 50-65°C. Kovuudeltaan matalat olosuhteet käsittävät 2 x SSC ja noin 30-50°C.

Koettimia HCV-kohdesekvensseille voidaan saada kuviossa 1 esi-15 tetystä HCV cDNA -sekvenssistä tai uusista HCV-isolaateista. HCV-koettimilla voi olla mikä tahansa sopiva pituus, joka kattaa kohdealueen, mutta joka sulkee pois alukkeet, ja joka mahdollistaa spesifisen hybridisaation kohdealueeseen. Jos täydellinen komplementaarisuus on kysymyksessä, so., jos kanta 20 sisältää koettimen kanssa identtisen sekvenssin, koska duplek- ·. : si on verrattain pysyvä jopa kovissa olosuhteissa, koettimet » ♦ · voivat olla lyhyitä, so., koon vaihdellessa noin 10-30 emäspä- • · · : ria. Jos koettimessa on odotettavissa jonkinasteista emäspä- • · · • ·· * .···. riutumattomuutta, so., jos epäillään, että koetin hybridisoi- ··* 25 tuu vaihtelevaan alueeseen, koetin voi olla pitempi, koska pi- • · tuus näyttää tasapainottavan jonkin verran vastinparittomuuden (-muuksien) vaikutusta.

·»· • · • · . ··· ·***: Kohdesekvenssin kanssa komplementaarisen sekvenssin omaava • · · 50 koetinnukleiinihappo voidaan syntetisoida käyttäen samanlaisia • · * .···. menetelmiä kuin edellä on kuvailtu koskien alukesekvenssien synteesiä. Koetin voidaan haluttaessa leimata. Edellä on ku- • « « ’ . vailtu sopivia leimoja.

• · · · · 40 106214

Joissakin tapauksissa voi olla edullista määrittää koettimen avulla ilmaistun PCR-tuotteen pituus. Tämä voi olla erityisen tarpeen, jos epäillään, että HCV-kantamuunnokset voivat sisältää deleetioita kohdealueessa, tai jos halutaan varmistaa PCR-5 tuotteen pituus. Sellaisissa tapauksissa on edullista saattaa tuotteet kokoanalyysiin samoin kuin hybridisoida koettimen kanssa. Alalla tunnetaan menetelmiä nukleiinihappojen koon määrittämiseksi ja niitä ovat esimerkiksi geelielektroforeesi, sedimentaatio gradientteina ja geeliekskluusiokromatografia.

10

Kohdesekvenssin läsnäolo biologisessa näytteessä ilmaistaan määrittämällä se, onko hybridi muodostunut HCVpolynukleotidi-koettimen ja PCR-monistusprosessiin saatetun nukleiinihapon välille. Alalla tunnetaan menetelmiä koettimen ja nukleii-15 nihapposekvenssin välillä muodostuneiden hybridien ilmaisemiseksi. Leimaamaton näyte voidaan esimerkiksi mukavuussyistä siirtää kiinteään matriisiin, johon se sitoutuu, ja sidottu näyte saattaa olosuhteisiin, jotka mahdollistavat spesifisen hybridisaation leimatun koettimen kanssa; kiinteästä matrii-20 sista tutkitaan sen jälkeen leimatun koettimen läsnäolo. Vaih-toehtoisesti, näytteen ollessa leimattu, leimaamaton koetin * sidotaan matriisiin ja sopiviin hybridisaatio-olosuhteisiin • · i : : altistamisen jälkeen matriisista tutkitaan leiman läsnäolo.

• · · « -4 » · * ϊ,,.ί Muita hybridisaatiomäärityksiä kuvaillaan edellä.

• · · : V 25 • · · V · HCV-sekvenssimuunnosten määrittäminen käyttäen PCR:ää • · · HCV:n kantamuunnosten identifioimiseksi ja siihen liittyen ko- • · * ettimien konstruoimiseksi noille muunnoksille, edellä ku- : 30 vailtua HCV/cPCR-menetelmää käytetään HCV-genomin muunnosalu- • · · : : eiden monistamiseksi niin, että näiden muunnos kohdealueiden nukleotidisekvenssit voidaan määrittää. Yleisesti ottaen voi-....: täisiin otaksua vaihtelevien HCV-tyyppien esiintyvän erilai silla maantieteellisillä alueilla kuin missä HCVl-kanta on 4i 106214 hallitsevana, esimerkiksi Japanissa, Afrikassa jne.; tai eri selkärankaislajeissa, jotka ovat myös viruksen infektoimia. HCV-muunnelma voi syntyä myös siirtojen kuluessa kudosvilje-lusysteemeissä tai olla seurausta spontaaneista tai indusoi-s duista mutaatioista.

Kohdealuemuunnoksen monistamiseksi alukkeet konstruoidaan vierustallaan epäiltyä aluetta ja ne ovat edullisesti komplementaariset säilyneiden alueiden suhteen. Alukkeet kahdelle HCV-10 alueelle, jotka ovat todennäköisesti säilyneitä, perustuen Flavivirus-malliin. Nämä alukkeet ja koettimet voidaan konstruoida käyttäen kuviossa 1 esitettyä HCVl-kannan sekvenssi-informaatiota .

is Kohdealueen (-alueiden) nukleotidisekvenssi voidaan analysoida PCR-monistustuotteiden suoran analyysin avulla. Saiki et ai.,(1988) kuvailevat menetelmää PCRtllä monistettujen tuotteiden sekvenssin analysoimiseksi suoraan.

20 Monistettu kohdesekvenssi (-sekvenssit) voidaan vaihtoehtoi- ,*·.· sesti kloonata ennen sekvenssianalyysiä. Scharf (1986) on ku- « · ·*:*; vaillut menetelmää entsymaattisesti monistettujen genomisten • · • alueiden kloonaamiseksi suoraan ja sekvenssin analysoimiseksi • 4 · · :***: suoraan. Menetelmässä PCR-tekniikassa käytettyjä alukkeita mo- ··» 25 difioidaan niiden 5'-pään lähellä sopivien restriktiokohtien : : : aikaansaamiseksi suoraa kloonausta varten esimerkiksi M13-sek- vensointivektoriin. Monistamisen jälkeen PCR-tuotteet katkais- *·» taan sopivilla restriktioentsyymeillä. Restriktiofragmentit • · · liitetään M13-vektoriin ja transformoidaan esimerkiksi JM103- . ·*; 30 isäntään, maljaviljellään ja tuloksena saadut plakit seulotaan • · · :***: hybridisaation avulla leimatun oligonukleotidikoettimen kans- ··· sa. Alalla tunnetaan muita menetelmiä kloonaukseen ja sekvens- * i » sin analysoimiseen.

• · 42 106214

Yleisalukkeet flaviviruksille ja HCV:lie

Tutkimukset, jotka koskevat HCV-genomin luonnetta, käyttäen hyväksi HCV cDNA:sta saatuja koettimia, samoin kuin HCV cDNA:n j sisältämää sekvenssi-informaatiota, viittavat siihen, että HCV on flavivirusten kaltainen. Näitä tutkimuksia kuvaillaan PCT-julkaisussa WO90/14436. HCV cDNA -klooneista saadun HCV cDNA -sekvenssin vertaaminen joidenkin flavivirusten tunnettuihin sekvensseihin osoittaa, että HCV sisältää sekvenssejä, jotka jo ovat homologisia flavivirusten säilyneiden sekvenssien kanssa. Nämä säilyneet sekvenssit saattavat tehdä mahdolliseksi aluk-keiden luomisen, jotka voivat olla yleispäteviä käytettäessä flavivirusten kohdealueiden monistamiseen ja HCV:lie. Lajin identifiointi toteutetaan sen jälkeen käyttäen lajille spesi-15 fistä koetinta. Alalla tunnetaan joidenkin flavivirusten geno-mit ja niitä ovat esimerkiksi japanilainen enkefaliittivirus (Sumiyoshi et ai., (1987)), keltakuumevirus (Rice et ai., (1985)), dengue-kuumetyyppi 2 -virus (Hahn et ai., (1988)), dengue-kuumetyyppi 4 -virus (Mackow (1987)) ja Länsi-Niilin 20 virus (Castle et ai., (1986)). HCV RNA:n identifiointi suoritetaan käyttäen HCV:lie spesifistä koetinta, jonka sekvenssi

( I

I · ' "« voidaan määrittää tässä esitettyjen HCV cDNA -sekvenssien < « « avulla.

t · • « · • · * *·♦ · ··· • · *···* 25 Koettimen (koettimia) sisältävien ryhmien käyttäminen vaihto- J · · ehtoisesti, jotka on konstruoitu vastaamaan kodonidegeneraa- • · · tiosta ja sisältävät sen vuoksi flaviviruksille ja HCV:lie ta- ... vallisia sekvenssejä, määritettynä HCV:n aminohapposekvenssien • · • · t” vertaamisen avulla flavivirusten tunnettujen sekvenssien suh- • ♦ « *’* 3o teen, mahdollistaa yleisen ilmaisusysteemin näille viruksille.

• « · 0 · · • » · • ♦ • · · « • · · • · · • * ♦ • · 43 106214

Toivottujen DNA-sekvenssien konstruointi

Synteettisiä oligonukleotidejä voidaan valmistaa käyttäen automatisoitua nukleotidien synteesilaitetta jollaista Warner 5 (1984) kuvailee. Synteettiset juosteet voidaan haluttaessa leimata 32P:llä käsittelemällä polynukleotidikinaasin kanssa 32P-ATP:n läsnä ollessa käyttäen vakio-olosuhteita reaktiolle.

DNA-sekvenssejä, mukaan lukien cDNA-kirjastoista eristetyt io sekvenssit, voidaan modifioida tunnetuilla menetelmillä, joita ovat esimerkiksi paikkakohdennettu mutatointi, jota Zoller (1982) kuvailee. Lyhyesti, modifioitava DNA pakataan faagiin yksijuosteisena sekvenssinä ja muutetaan kaksijuosteiseksi DNA:ksi DNA-polymeraasin avulla käyttäen alukkeena synteettis-15 tä oligonukleotidiä, joka on komplementaarinen DNA:n modifioitavan osan suhteen, ja joka sisältää toivotun modifikaation omassa sekvenssissään. Tuloksena oleva kaksijuosteinen DNA transformoidaan faagia ylläpitävään isäntäbakteeriin. Transformoituja bakteereja sisältävät viljelmät, jotka sisältävät 20 faagin jokaisen juosteen replikaatit, maljataan agariin plak- /..· kien saamiseksi. 50 % uusista plakeista sisältää teoreettises- :Y: ti faagin, joka sisältää mutatoidun sekvenssin, ja loput 50 % • sisältää alkuperäisen sekvenssin. Plakkien jäljenteet hybri- :***: disoidaan leimattuun synteettiseen koettimeen lämpötiloissa ja « · · ·*·*: 25 olosuhteissa, jotka mahdollistavat hybridisaation oikean juos- • · :T: teen kanssa mutta ei modifioimattoman sekvenssin kanssa. Hyb ridisaation avulla identifioidut sekvenssit otetaan talteen ja • · · *. : kloonataan.

··· ·«· • · • · · . 3o Määrityspakkauksia HCV-peräisten polynukleotidien seulomiseksi « · • · • * «

Oligomeerejä, jotka ovat koettimia ja/tai alukkeita monistami- « · « seen ja/tai HCV:n seulomiseksi näytteistä, voidaan pakata mää- « · rityspakkauksiin. Pakkaukset HCV-sekvenssien seulomiseksi si- 44 106214 sältävät oligomeerisiä koetin-DNA-molekyylejä. Pakkaukset HCV-sekvenssien monistamiseksi voivat sisältää monistuksessa käytettäviä oligomeerisiä alukkeita. Pakkaukset sisältävät koet-timia ja alukkeita yleensä etukäteen mitattuina tai etukäteen s määritettyinä määrinä samoin kuin muita sopivia pakattuja rea-gensseja ja aineita erillisissä sopivissa astioissa, joita tarvitaan tiettyjä hybridisaatio ja/tai monistamistoimintaoh-jetta (-ohjeita) varten. Pakkaus voi sisältää esimerkiksi standardeja, puskureita, kantajia, entsyymejä, substraatteja, jo leimauskoettimia, sitoutumispareja ja/tai ohjeita testin suorittamiseksi .

Esimerkit /5 Jäljempänä kuvaillaan tämän keksinnön mukaisia esimerkkejä ainoastaan kuvaamistarkoituksessa eikä tarkoituksena rajoittaa tämän keksiinnön mukaista piiriä.

jE. Positiivisen ja negatiivisen juosteen 5'-HCV RNA:n ilmaisu 20 seerumissa < « ·

Seerumista eristetty HCV 27:n RNA analysoitiin positiivisten ja negatiivisten juosteiden osalta PCR-menetelmää käyttäen.

* « t *···. PCR-menetelmä suoritettiin pääasiallisesti kuten edellä on • * ·· · 25 kuvailtu lukuun ottamatta seuraavaa.

« · • · • * · % · * • · ·

Uutettu HCV27 RNA käänteiskopioitiin yksijuosteiseksi cDNArksi .·*·. käyttäen alukkeena joko Alex90:tä tai JH52:ta. Alex90:llä, M» joka saadaan HCVl-genomin nukleotideistä -312 - -283, on sek- ··· 30 venssi: « · · • * * •«« # · · « · 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'.

<«« • * · i · · « * 106214 45 JH52 saadaan HCV-nukleotideistä -93 - -117; nukleotidinuraerot esitetään suluissa sekvenssien alapuolella. JH52:ssa alleviivattu dinukleotidi on mutatoitu NotI-kohdan luomiseksi. JH52:n sekvenssi on seuraava: s (Aluke) Täyte NotI HCV-sekvenssi (JH52) 5' AGTCTT GCGGCCGC ACGCCCAAATC 3' (-93) (-117) io Alex90:n sekvenssi sopii yhteen HCV RNA:n positiivisen juos-teen nukleotidien -312 - -283 muodostaman sekvenssin kanssa, kun taas JH52 sopii yhteen negatiivisen juosteen nukleotidien -117 - -93 muodostaman sekvenssin kanssa. Tuloksena saadut yksijuosteiset HCV cDNA:t monistettiin kukin erikseen PCR:n is avulla käyttäen Alex90:tä ja JH52:ta. Monistettujen tuotteiden ilmaiseminen suoritettiin Southern-blottauksen avulla käyttäen Alex89:ää koettimena. Alex89 sopii yhteen HCV RNA:n nukleoti-deihin -203 - -175. Alex89:n sekvenssi on: 2o 5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3 ’ .

« « « » I < · t * 'Y: Analyysi osoitti, että tällä menetelmällä kummankin RNA-juos- : teen monistettujen tuotteiden signaalit olivat yhtä voimak- • « · ; · kaat. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HCV RNA 5'-alueel- • · · ' ’ · · ; V 25 la voi esiintyä kaksijuosteisena RNA:na.

• · · ·. · · • · II. HCV RNA:n ilmaiseminen plasmasta käyttäen HCV/cPCR:ää, 99· käyttäen HCV RNA: n 5’-alueelta saatuja alukkeita ja koettimia *·· • » * · · 3o HCV RNA:n uuttaminen plasmasta • « « “ « t « i · I · M» 9 Jäädytettyä plasmaa sulatettiin P3-turvakaapissa. 0,2 ml: n < näyte-erä hydrolyysiseosta (100 millimolaarinen (mM) Tris-HCl, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, 20 mikrogrammaa/millilitra /pg/ml) MS2 46 106214 RNA:ta, 0,5 % SDS ja 2 mg/ml proteinaasi K:ta, pH 8) lisättiin 2 ml:n mikrofugiputkeen ja esilämmitettiin 37°C:seen. Plasma (0,2 ml) lisättiin sen jälkeen ja seoksen annettiin inkuboitua 60°C:ssa 1 tunnin ajan. Seuraavaksi lisättiin fenolia (0,4 ml) s ja seosta pyörresekoitettiin 3x 30 sekuntia, pitämällä 30 sekunnin väli jokaisen pyörresekoituksen välillä. Seosta sent-rifugoitiin sen jälkeen 5 minuuttia ja vesifaasi otettiin talteen. Orgaaninen faasi vastauutettiin 0,1 ml:n kanssa TES:iä ja kootut vesifaasit uutettiin 2x 1 tilavuudella fenoli/kloro-io formi/IAA:ta, sen jälkeen 1 tilavuudella kloroformia. Uutteeseen lisättiin 1 μΐ (2 pg) glykogeenia (Boehringer Mannheim Corp.) ja 25 μΐ NaOAc:tä (3 M, pH 5,4) ja 1,25 ml kylmää EtOHrta, ja tuote jäädytettiin kuivien jäiden päällä ja sent-rifugoitiin 10 min. Pelletti liuotettiin 100 pl:aan tislattua is vettä, ja 5 μΐ NaOAcrtä (pH 5,4) lisättiin 250 μ1:η kanssa kylmää EtOH:ta. Liuos jäädytettiin ja sentrifugoitiin uudelleen ja tuloksena saatu pelletti liuotettiin 10 pl:aan tislattua H20:ta.

20 cDNA-synteesi • * • · « «* • · cDNA:n syntetisoimiseksi uutetusta RNArsta, alunperin 5 μΐ • · • ;*: liuotettua RNA:ta inkuboitiin 4 μ1:η kanssa vettä plus 1 ml (1 • »» · pg eli 166 pmoolia 18-meeriä) RT-aluketta. Seosta inkuboitiin :*·*: 25 70°C:ssa 3 minuuttia ja jäädytettiin sen jälkeen jäähilujen ί päällä. RT-alukkeen sekvenssi oli: 5' CCC AAC ACT act CGG CTA 3' .

··♦ • ♦ Φ • 1« • . ;*j 30 Alkuinkuboinnin jälkeen inkubaatioseokseen lisättiin seuraavat «I» aineet: 10 μΐ 5x ensimmäisen juosteen puskuria (250 mM Tris 4 « · t···, HC1, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitoli) ; *4* * ,,,,· 2,5 μΐ deoksinukleosiditrifosfaatteja (10 mM kutakin); 2,5 μΐ «. * käänteiskopioijaa (MMLV BRL:ltä, 200 yksikköä/μΐ) ja tislattua 47 106214 vettä tilavuuden säätämiseksi 50 piiksi. Seosta inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan, kuumennettiin 90°C:ssa 3 minuuttia ja jäädytettiin jäillä.

5 PCR-monistaminen

Edellä tuotetun HCV cDNA:n PCR-monistaminen suoritettiin käyttäen jäljempänä taulukossa lueteltuja kontrolli- ja koerea-gensseja. Taulukossa "RNA" tarkoittaa kontrollinäytettä, jossa io RNA uutettiin henkilöstä, joka ei ollut infektoitunut HCVlrllä; tällä näytteellä suoritettiin cDNA-synteesin ja PCR-monistuksen prosessivaiheet. "cDNA" tarkoittaa kontrollinäytettä, jolla suoritettiin cDNA-synteesin ja PCR-monistuk-sen prosessivaiheet; tässä tapauksessa kuitenkin RNA-näyte-erä /5 korvattiin vedellä cDNA-synteesin aikana. "Templaatti" oli kontrolli PCR-reaktiolle, josta templaatti jätettiin pois. "Näyte" tarkoittaa seerumia, josta testattiin HCV RNA:n läsnäolo.

c « t c · I « · « € « < « < * * « « ♦ · · ♦ · · · • · · • · • · ··· ·♦ · ♦ · · • · • · • · · • · · ··· • · · • · • · · • · · • · ·«( « · · « · · < « · • · · « · t · • · * « · • · · ( · 48 106214

Taulukko RNA cDNA Templaatti Näyte (μΐ) (μΐ) (ml) (μΐ) 5 vesi 100,0:ksi 100,0:ksi 100,0:ksi 100,0:ksi lOx puskuri 10,0 10,0 10,0 10,0 dNTP: t 16,0 16,0 16,0 16,0 aluke 1 0,5 0,5 0,5 0,5 aluke 2 0,5 0,5 0,5 0,5 io templaatti 2,5 2,5 - 2,5

Taq-pol. 0,5 0,5 0,5 0,5

Aluke l:n ja aluke 2:n pitoisuudet olivat 0,5 pg/μΐ ja vastaa-/5 vasti 0,42 pg/μΐ ja niillä oli seuraavat sekvensit.

Aluke 1: 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'

Aluke 2: 5' AGT CTT GCG GGG GCA CGC CCA AAT 3'

20 Nämä alukkeet hybridisoituvat HCV-genomin 5'-pään säilyneeseen : alueeseen. Näytteet sisälsivät 12,5 seerumiekvivalenttia HCV

cDNA:ta. Monistussyklissä käytetyt olosuhteet olivat: • · » « · • « I » »

I · I

.···. 35 sykliä: Sulatus - 94°C 11,5 min.

• · ··· 25 Pariutus - 60°C 2 min.

• · • ·

Pidennys - 72°C 3 min.

Lopullinen pidennys: 72°C 30 min.

Huljuttelu 4°C:ssa poistamiseen saakka.

• * · IM • · so Monistettua tuotetta koetinkäsiteltiin käyttäen leimattua • · « DNA:ta. Koettimen sekvenssi oli seuraava: • · • · • · · • · · • · ·

Koetin: 5' TTT CTT GGA TCA ACC CGC TCA ATG CCT GGA 3'.

49 106214

Yli 200 HCV-seerumipositiivista näytettä tutkittiin edellä mainitulla menetelmällä. Vain tulokset, joissa kontrollit olivat negatiivisia, otettiin huomioon. Tässä tapauksessa kaikki seerumipositiiviset näytteet olivat myös positiivisia PCR-mää-5 rityksessä.

III. Oletetusta HCV RNA:n "ydinalueesta saadut koettimet cDNA-molekyylien nukleotidisekvenssien analyysi koskien eri-io laisia HCV-eristyksiä osoittaa, että sekvenssien säilymisaste on korkea alueessa nukleotidistä 1 - noin 570, käyttäen kuviossa 1 esitettyä numerointisysteemiä nukleotideille. Tämä alue koodittaa oletettavasti HCV:n "ydin"polypeptidiä. Kuviossa 2 esitetään konsensussekvenssit viidelle eri isolaatille is eri maantieteellisistä paikoista (Japani ja USA), joissa HCV1 on prototyyppi HCV; aminohapot, jotka koodittuvat HCVl:n suuressa ORFrssä, esitetään konsensusnukleotidisekvenssien yläpuolella. Kuviossa 2 esitetyissä sekvensseissä HCV-JH on Toht. Tetsu Miyamuralta henkilökohtaisena yhteytenä (National Insti-20 tute of Health of Japan), ja JC-J1 ja JC-J4 ovat Mayumilta et . ai.(1990). Kuviosta 2 voidaan nähdä, että konsensussekvenssien 1 välillä oletetussa "ydin"alueella vallitsee vähintään 90 %:n < · · .‘!t homologia suhteessa HCVl-sekvenssiin. Ottaen huomioon korkea ’···! homologia-aste alueella nukleotidi välillä +1 - +571, koettimet » · :·.·. 25 tälle alueelle olisivat käyttökelpoisia seulottaessa HCV-posi- • · • · tiivisia biologisia näytteitä.

• · · .···. Kuviossa 3 esitetään ryhmä leimaus koettimia, joita voidaan « · · · · .··*. käyttää HCV RNA:n ilmaisuun alueelta, joka oletettavasti koo- • · · 30 dittaa HCV "ydin"polypeptidiä. Kuviossa 3 ryhmän "koetinnume- 1*.’.^ ro" sisältää sarjan polynukleotidejä, joiden heterogeenisuudet « · *·* on osoitettu kuviossa 3 luetellussa IUB ryhmäkoodin avulla.

« « · · ** * Heterogeenisuudet ovat nukleotidisekvenssierojen sovittamisek si, joita havaitaan eri isolaattien konsensussekvensseissä.

so 106214 HCV-sekvenssialueet, joiden suhteen kuviossa 3 esitetyn koe-tinryhmän koettimet ovat komplementaarisia, esitetään kuviossa 4, jossa nukleotidinumerot vastaavat kuvion 1 numerointia.

s Tätä koetinryhmää käytettiin määrityksessä HCV-sekvenssien ilmaisemiseksi. Määrityskokoonpano kuvailtiin PCT-julkaisussa WO90/14436 esimerkkijaksossa nimeltä "Koettimet HCV:n ker-roshybridisaatiota varten".

ίο Teollinen käytettävyys Tässä yhteydessä kuvaillut menetelmät samoin kuin oligomeerit, sekä koettimet että alukkeet, saatuina HCV cDNA:sta, ja niitä sisältävät määrityspakkaukset, ovat käyttökelpoisia HCV:n läs-15 näolon määrittämiseksi tarkasti, verrattain yksinkertaisesti ja taloudellisesti biologisista näytteistä, erityisemmin verestä, jota voidaan käyttää verensiirtoihin, ja henkilöistä, joilla epäillään olevan HCV-infektio. Tämän lisäksi nämä menetelmät ja oligomeerit voivat olla käyttökelpoisempia HCV-in-20 fektion aikaisemman vaiheen ilmaisemiseksi kuin immunologiset <_ . määritykset, jotka perustuvat yhdistelmä-HCV-polypeptidien käyttöön. Monistettu polynukleotidihybridisaatiomääritys il- f «

maisee HCV RNA:n myös satunnaisnäytteissä, jotka ovat anti-HCV

t « * ♦ · · .···. vasta-ainenegatiivisia. Tässä yhteydessä kuvailtuja koettimia • · • · · 25 ja alukkeita voidaan siten käyttää monistettuina hybridisaa- • * • · tiomäärityksissä, yhdessä immunomääritysten kanssa, jotka pe- • · ♦ rustuvat HCV-polypeptideihin, HCV:stä johtuvien infektioiden .·**. ja HCV-infektoituneiden biologisten näytteiden veri mukaan lu- • · • · · .···. kien identifioimiseksi täydellisemmin.

i·· 3° Tässä yhteydessä esitetty informaatio mahdollistaa alukkeiden « ♦ ja/tai koettimien konstruoinnin, jotka ovat peräisin HCV-geno- · · *·' * min säilyneiltä alueilta. Näiden alukkeiden ja koettimien toi- niittäminen tekee käyttökelpoiseksi yleisen menetelmän, jolla 106214 51 ilmaistaan HCV-kantamuunnoksia, ja josta.on hyötyä seulottaessa verta ja verituotteita.

Jos menetelmässä käytettävät alukkeet ovat peräisin HCV-geno-s min säilyneiltä alueilta, menetelmän pitäisi helpottaa HCV-kantamuunnosten ilmaisua ja/tai identifiointia. Tämän tulisi vuorostaan johtaa uusien immunologisten reagenssien kehittämiseen HCV:n ilmaisemiseksi ja diagnosoimiseksi samoin kuin uusien polynukleotidireagenssien kehittämiseen HCV:n ilmaisuun ίο ja hoitoon.

Aluke- ja koetinryhmät, jotka on konstruoitu flavivirusten ja HCV:n säilyneistä aminohapposekvensseistä, mahdollistavat lisäksi yleispätevän ilmaisumenetelmän näille infektioagensseil-15 le.

Seuraavat luetellut ainekset on talletettu the Budapest trea-tyn puitteissa the American Type Culture Collection'iin (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, ja 20 niille on annettu seuraavat talletusnumerot.

lambda-gtll ATCC n:o Talletuspäivä f · HCV cDNA-kirjasto 40394 1. jouluk. 1987 • · : .1· klooni 81 40388 17. marrask. 1987 • · · ··· · 25 klooni 91 40389 17. marrask. 1987 ·· · ·'·*: klooni 1-2 40390 17. marrask. 1987 • · :T: klooni 5-1-1 40391 18. marrask. 1987 « klooni 12f 40514 10. marrask. 1988 klooni 35f 40511 10. marrask. 1988 • · · ·***: 30 klooni 15e 40513 10. marrask. 1988 klooni K9-1 40512 10. marrask. 1988 .·1··. JSC 308 20879 5. toukok. 1988 • ·· .1. pS356 67683 29. huhtik. 1988 • · · · 52 106214

Seuraavat talletukset tehtiin lisäksi 11. toukokuuta 1989.

Kanta LinkkeritATCC n:o D1210 (Cfl/5-1-1) EF 67967 .? D1210 (Cf 1/81) EF 67968 D1210 (Cf/CA74a) EF 67969 D1210 (Cf/35f) AB 67970 D1210 (Cf/279a) EF 67971 D1210 (Cf/C36) CD 67972 10 D1210 (Cf/13i) AB 67973 D1210 (Cf/C33b) EF 67974 D1210 (Cf/CA290a) AB 67975 HB101 (AB24/C100#3R 67976 is Seuraavat D1210-kannan johdannaiset talletettiin 3. toukokuuta 1989.

Kantajohdanainen ATCC n:o pCFlCS/C8f 67956 20 pCFlAB/C12f 67952 pCFlEF/14c 67949 ·.**: pCFlEF/15e 67954 :.V pCFlAB/C25c 67958 i.i : pCFlEF/C33c 67953 • · · • · *···* 25 pCFlEF/C33f 67050 • · * • · · : ·* pCFlCD/33g 67951 ‘ pCFlCD/C39c 67955 pCFlEF/C40b 67957 • · pCFlEF/CAI67b 67959 • ♦ 30

Seuraavat kannat talletettiin 12. toukokuuta 1989.

: : : Kanta ATCC n:o « . 1 "

Lambda gtll(C35) 40603 53 106214

Lambda gtlO(beeta-5a) 40602 D1210 (C40b) 67980 D1210(M16) 67981 5 Seuraavat biologiset ainekset talletettiin 23. maaliskuuta 1990.

Aines ATCC n:o 5'-klooni 32 (pUC18S:sssä) 68276 10 Tämän patenttihakemuksen hyväksynnän ja julkaisun yhteydessä US-patentiksi kaikki näiden talletusten saatavuuden rajoitukset poistetaan peruuttamattomasti; ja pääsy nimettyihin talletuksiin on käytettävissä edellä nimetyn patenttihakemuksen is ratkaisun aikana sille, jolle viranomainen määrää säännösten 37 CFR 1.14 ja 35 USC 1.22 alaisena oikeutuksen siihen. Sen lisäksi, merkittyjä talletuksia säilytetään kolmenkymmenen (30) vuoden ajan talletuspäivästä lukien tai viisi (5) vuotta talletuksen viimeisen kysynnän jälkeen ; tai US-patentin pa-20 kollisen eliniän, mikä tahansa on pitempi. Tässä yhteydessä , , mainitut talletetut ainekset on tarkoitettu vain soveliaisuu- 4 f !den vuoksi eikä niiden edellytetä toteuttavan tätä keksintöä käytännössä pitäen silmällä tässä olevia kuvailuja ja lisäksi nämä ainekset on tässä sisällytettynä viitteen kautta.

• · • · · ·· 1 25 • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · 1 « · • · · • · · • · • · · φ ·« « ·

Claims (12)

54 106214

1. Menetelmä HCV-sekvenssin ilmaisemiseksi analyyttijuostees-ta, jonka epäillään sisältävän HCV-polynukleotidin, joka HCV- 5 polynukleotidi sisältää valitun kohdealueen, tunnettu siitä, että: (a) tuotetaan oligonukleotidi, joka kykenee hybridisoitumaan HCV-sekvenssiin analyyttipolynukleotidijuosteessa, joka oligonukleotidi olennaisesti koostuu (i) polynukleotidisekvenssis- 10 tä, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu vähintään 12 nukleotidin pituisista, HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonukleotideista (kuten kuviossa 1 on esitetty) : 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-486, vaihtoeh-15 toisesti (ii) linkitettynä muuhun polynukleotidiin kuin luonnossa; (b) inkuboidaan analyyttijuostetta kohdan (a) nukleotidin kanssa, mikä mahdollistaa spesifisten hybrididupleksien muodostumisen kohdistuvan sekvenssin ja kohdesekvenssin välillä; 20 ja , . (c) ilmaistaan hybridit, jotka ovat muodostuneet mahdollisen ; / kohdesekvenssin ja oligonukleotidin välillä- t

2. Menetelmä yksijuosteisen tai kaksijuosteisen, spesifisen » · • · .1**.^ 25 nukleiinihapposekvenssin läsnäolon tai puuttumisen ilmaisemi- • · seksi näytteessä joka sisältää nukleiinihapon tai niiden seok- « · « sen, jolloin .···, (a) käsitellään näyte yhdellä oligonukleotidialukkeella jo- • · .···. kaista spesifisen nukleotidisekvenssin juostetta kohti, joi- • · · •t 30 loin spesifisiä hybrididupleksejä muodostuu oligonukleoti- • « · « · · ;;; dialukkeen ja spesifisen sekvenssin välillä; « · Ί* (b) syntetisoidaan alukepidennystuote; ja I i < V * (c) ilmaistaan mahdollisen spesifisen nukleotidisekvenssin ja ’ ' oligonukleotidialukkeen muodostamat hybridit; 55 106214 tunnettu siitä että kohdan (a) oligonukleotidialukkeet ovat patenttivaatimuksen 1 mukaisia tai sen komplementteja.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä 5 että vaiheet (a) ja (b) toistetaan.

4. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat därav att sagda specifika nukleotidsekvens utgörs av en enkel ίο sträng.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mainittu spesifinen nukleiinihapposekvenssi on yksijuos-teinen. 10

5. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat därav att sagda nukleotidsekvens är RNA och sagda primer är en oli-godeoxiribonukleotid. is

5 HCV genomet (se fig. 1) : 16-45, 49-78, 82-111, 115- 144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 och 457-486, möjligen förenad med (ii) en polynukleotid olika den polynukleotid oligonukleotiden är förenad med i naturen; w (b) inkubering av analytsträngen med oligonukleotiden en-ligt (a), vilket möjliggör att specifika hybridduplex bildas mellan den angripande sekvensen och mälsekven-sen; och 15 (c) detektering av eventuella nybildade hybrider mellan den eventuella mälregionen och oligonukleotiden. 20 2. Förfarande för att detektera närvaron eller fränva- ron av enkla eller dubbla nukleotidkedjor av en specifik nuk- a a *; leinsyrasekvens i ett prov innehällande en nukleinsyra eller « ( « • < ; en blandning av nukleinsyror, varvid ( « »»· · • · · • · • · 25 (a) provet behandlas med en oligonukleotidprimer för var- * I · I · je sträng innehällande den specif ika nukleotidsekven- • · · sen varvid specifika hybridduplex kan bildas mellan oligonukleotidprimer-enheten och den specifika se- • · kvensen; • · «·* • 30 • · · (b) en primer-extensionsprodukt syntetiseras; och a · * · • < · «aa ·.· * (c) eventuella nybildade hybrider mellan den specifika nukleotidsekvensen och oligonukleotidprimer-enheten 106214 detekteras; kännetecknat därav att oligonukleotidpri-mer-enheterna (a) är i enlighet med patentkrav 1 el-ler komplement därav. j 3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat därav att stegen (a) och (b) upprepas.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mainittu nukleotidisekvenssi on RNA:ta ja mainittu aluke on oligodeoksiribonukleotidi. is 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että käytetyn oligonukleotidin 5'-päässä on restriktiokohta.

6. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-5, kännetecknat därav att den använda oligonukleotiden innehäller ett restriktionsomräde vid dess 5'- ände. 20 7. Förfarande enligt nägot av patentkrav 1-6 känne- . . tecknat därav att oligonukleotiden väsentligen bestär av en • « • ( 1 \ polynukleotidsekvens utvald ur gruppen oligonukleotider av * i · 4 * ! minst 12 nukleotiders längd, komplementerande med följande regioner i HCV genomet (se fig. 1) : 16-45, 49-78, 82-111, • · *.:**.. 25 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365- 394, 398-427 och 457-486. • · · r » · · tv, 8. Analysförpackning för att detektera en specifik * * ,···, nukleotidsekvens, omfattande en oligonukleotidprimer som kan * ··· \ 30 hybridisera tili den specifika nukleotidsekvensen i en ana- ’« · « lytpolynukleotidsträng, kännetecknad därav att den specifika « nukleotidsekvensen som skall detekteras är en HCV-sekvens och « < « V * att oligomeren bestär av: (i) en polynukleotidsekvens utvald ‘ * ur gruppen oligonukleotider av minst 12 nukleotiders längd 106214 vilka komplementerar med följande regioner i HCV genomet (se fig. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 och 457-486, eventuellt förenade med (ii) en polynukleotid olik den poly-5 nukleotid med vilken den är förenad i naturen.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tun-20 nettu siitä että oligonukleotidi koostuu olennaisesti polynuk-leotidisekvenssistä joka on valittu ryhmästä joka koostuu vä- « « '· " hintään 12 nukleotidin pituisista, HCV-genomin seuraaville i ( j ' ) alueille komplementaarisista oligonukleotideista (kuten kuvi- c « ossa 1 on esitetty): 16-45, 49-78,.82-111, 115-144, 148-177, • · *.;·:* 25 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457- • · « : ** 486.

« · · • · · ... 8. Määrityspakkaus tietyn HCV-kohdesekvenssin ilmaisemiseksi ♦ · · · analyyttijuosteessa,joka pakkaus käsittää oligonukleotidialuk- * · ’** 20 keen joka pystyy hybridisoitumaan analyytin polynukleotidi- # · ♦ '···* juosteen spesifiseen nukleotidisekvenssiin, tunnettu siitä et- • · · • · '-*·* tä ilmaistava, spesifinen nukleotidisekvenssi on HCV-sekvenssi V : ja oligomeeri koostuu (i) polynukleotidisekvenssistä valittuna ryhmästä joka koostuu vähintään 12 nukleotidin pituisista, 106214 HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonuk-leotideista (kuten kuviossa 1 on esitetty): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-486, mahdollisesti linkitettynä (ii) s muuhun polynukleotidiin kuin luonnossa.

9. Förfarande för att eliminera blod kontaminerat med ett smittoämne frän ett blodförräd bestäende av blodenheter frän enstaka blodgivare, omfattande : 10 (a) att ställa tili förfogande ett analysprov av nukle-insyror frän ett blodprov vilket misstänks innehäl-la en mälsekvens frän ett virus; is (b) att ställa tili förfogande en oligomer vilken kan hybridiseras tili sagda mälsekvens om när-varande i analysprovet av nukleinsyror, kännetecknat därav att 20 (i) smittoämnet är HCV; och • · « « • ·« i .* (ii) oligomeren väsentligen bestär av: (i) en polynukle- t · ! otidsekvens utvald ur gruppen oligonukleotider av minst 12 « t · nukleotiders längd vilka komplementerar med följande regioner • · .·*·. 25 i HCV genomet (se fig. 1) : 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, • « ]·;·. 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 • · · och 457-486, eventuellt förenade med (ii) en polynukleotid .···. olik den polynukleotid med vilken den är förenad i naturen; • * ··· ««· • ♦ ♦ ··· 30 (c) reaktion mellan (a) och (b) under förhäl- • « « « « !!’. landen som möjliggör bildandet av ett polynukleotid- « « duplex mellan angripande sekvens och eventuell mälse- « < « * c « '·* ’ kvens; « * 61 106214 (d) detektering av eventuellt duplex i (c), och (e) tillvaratagande av blod som inte vid (d) uppvisat komplex. 5

9. Menetelmä tartunta-aineella kontaminoidun veren eliminoimiseksi verivarastosta joka koostuu yksittäisistä verenluovuttajista saaduista yksiköistä, jossa: 10 (a) tuotetaan analyyttinukleiinihappoja verinäytteestä, jonka epäillään sisältävän viruskohdesekvenssin; (b) tuotetaan oligomeeri, joka kykenee hybridisoitumaan mah-is dolliseen kohdesekvenssiin analyyttinukleiinihapossa, tunnettu siitä että (i) tartunta-aine on HCV, ja (ii) oligomeeri koostuu olennaisesti (i) polynukleotidise-kvenssistä, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu vähintään 20 12 nukleotidin pituisista HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonukleotideista (kuten kuviossa 1 on / esitetty): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-486, mah- « · · « « 1 dollisesti linkitettynä muuhun polynukleotidiin kuin luonnos- • · · .V'. 25 sa. • · · • · • · • · · • 1 · • · · (c) annetaan (a):n reagoida (b):n kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat polynukleotididupleksin muodostumisen kohdistu- • · t···, van sekvenssin ja mahdollisen kohdesekvenssin välillä; t ··· • 30 « · · (d) ilmaistaan (c)-kohdassa mahdollisesti muodostunut duplek- • · si; ja * » » • · · « · · « · 106214 (e) säästetään veri, josta komplekseja ei (d)-kohdassa ilmaistu.

10. Reagens användbart för att detektera HCV, känne-tecknat därav att sagda reagens omfattar en oligonukleotid väsentligen bestäende (i) av en polynukleotidsekvens utvald ur gruppen bestäende av oligonukleotider av minst 12 nukleo- io tiders längd vilka komplementerar med följande regioner i HCV genomet (se fig. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 och 457-486, eventuellt förenade med (ii) en polynukleotid olika den polynukleotid den är förenad med i naturen. 15

10. HCV:n ilmaisuun käyttökelpoinen reagenssi, tunnettu siitä, 5 että reagenssi käsittää oligonukleotidin joka koostuu (i) olennaisesti polynukleotidisekvenssistä, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu vähintään 12 nukleotidin pituisista HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonuk-leotideista: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, ίο 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 457-486 (kuten kuviossa 1 on esitetty), mahdollisesti linkitettynä (ii) muuhun polynukleotidiin kuin luonnossa.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen reagenssi, tunnettu siitä is että se koostuu olennaisesti polynukleotidisekvenssistä, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu vähintään 12 nukleotidin pituisista HCV-genomin seuraaville alueille komplementaarisista oligonukleotideista: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148- 177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 ja 20 457-486 (kuten kuviossa 1 on esitetty) * · • · • · · I12. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen reagenssi, tunnettu * * * siitä että mainittu oligonukleotidi edelleen käsittää ilmais- « c · *”· tavan leiman. • ♦ • · • · · 25 * · • · • · · • · · • · • · ··· .···. 1. Förfarande för att detektera HCV-sekvensen i en • · · *. 30 analytsträng vilken misstänks innehälla en HCV-polynukleotid « · * *” vilken omfattar en vald mälregion, kännetecknat därav: « « « • · · • « « ** ’ (a) att man tillför en oligonukleotid som kan hybridise- ras tili en HCV-sekvens i en analytpolynukleotid- 106214 sträng varvid oligonukleotiden väsehtligen bestär av: (i) en polynukleotidsekvens utvald ur gruppen bestä-ende av oligonukleotider av en längd om minst 12 nuk-leotider vilka komplementerar med följande regioner i

11. Reagens enligt patentkrav 10, kännetecknat därav att det väsentligen bestär av en polynukleotidsekvens utvald ur gruppen bestäende av oligonukleotider av minst 12 nukleo-tides längd vilka komplementerar med följande regioner i HCV 20 genomet (se fig. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, . . 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 och 457- • · I .* 486. • « « * t

· • · • · « · « « « « *”.* 12. Ett reagens enligt patentkrav 10 eller 11, känne- • · • * .!*! 25 tecknat därav att sagda oligonukleotid vidare omfattar en • 1 ♦ detekterbar märkning. • · · ··· • ' · • · ··· • ·· • · *·· t < f i « I c ( < I « « I « < ' I · « < I I I I I < < « < t « « « t f 11 < ( I