RO109952B1 - Procedeu si reactiv pentru detectarea secventei de hcv, intr-o secventa suspectata a contine polinucleotida hcv, care cuprinde o regiune tinta, selectata - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu și un reactiv pentru detectarea secvenței de HCV într-o secvență suspectată a conține o polinucleotidă, care cuprinde o regiune țintă selectată, în scopul de a controla 5 răspândirea infectării cu virusul hepatinei nonA, non-B (NANBV). Aceasta se referă mai ales la un agent etiologic al virusului hepatitei non-A, non-B(NANBV), al hepatitei C(HCV) și la polinucleotide și analogi ai acestora, care 10 sunt utili în determinările pentru detectarea HCV în probele biologice. Hepatita non-A, non-B (NANBH) este o boală transmisibilă sau o familie de boli despre care se crede a fi induse pe cale virală și care sunt diferențiabile 15 de alte forme de boli ale ficatului asociate unui virus, incluzând pe cele cauzate de virusurile cunoscute ale hepatitei, adică virusul hepatitei A (HAV), virusul hepatitei B(HBV) și virusul delta al hepatitei (ADV), ca și hepatita indusă 20 de citomogalovirus(CMV) sau de virusul Epstein - Barr(EBV).

NANBH a fost identificat pentru prima dată la persoanele care au fost supuse transfuziei. Transmiterea de la om la cimpan- 25 zeu și trecerile succesive la cimpanzei, pun în evidență faptul că NANBH se datorează unui agent sau unor agenți transmisibili. Evidența epidemiologică sugerează că ar putea exista trei tipuri de NANBH: tipul epidemic apărut în 30 apă; tipul asociat sângelui sau acului de injectare; și tipul apărând sporadic (căpătat în comunitate). Totuși, numărul agenților care pot cauza NANBH este necunoscut. A existat un număr de candidați NANBH, dar nu există nici 35 o dovadă că vreunul dintre ei reprezintă agentul etiologic al NANBH.

Necesitatea de metode sensibile, specifice pentru testare și identificarea purtătorilor de NANBH și a sângelui sau a pro- 40 duselor din sânge contaminate cu NANBH este semnificativă. Hepatita post-transfuzie (PTH) apare la aproximativ 10% dintre pacienții transfuzați și pentru până la 90% din aceste cazuri este răspunzător NANBH. Problema 45 majoră în această boală este progresia frecventă de lezare cronică a ficatului (25 - 55%). îngrijirea bolnavului ca și prevenirea transmiterii NANBH prin sânge și produse din sânge, sau prin contact personal apropiat, necesită o testare sigură, unelte de diagnostic și prognoză pentru a detecta acizii nucleici, antigenii și anticorpii înrudiți cu NANBH.

Există metode pentru detectarea polinucleotidelor specifice, prin determinări de hibridizare cunoscute persoanelor ce lucrează în domeniu. Metode de izolare și/sau detectarea polinucleotidelor specifice prin hibridizare nu au putut fi folosite pentru testarea HCV.

Termenul de virus al hepatitei C(HCV) a fost conferit de specialiștii în domeniu pentru un agent etiologic al NANBH necunoscut până în prezent. Prototipul izolat de HCV a fost identificat. Termenul HCV include, de asemenea, noi izolate din aceleași specii vitale. Ca o extensie a acestei terminologii, boala cauzată de HCV, mai înainte denumită hepatita NANBH care ia naștere în sânge (BBNANBH), este denumită hepatita C. Termenii NANBH și hepatita C pot fi utilizați pe rând în cele ce urmează.

HCV este un soi viral ale cărei specii patogenice produc BB-NANBH. Pot exista, de asemenea, specii atenuate sau particule deteriorate care interferează, derivate de la acesta. Așa cum se arată mai jos, genomul HCV este conținut în ARN. Este cunsocut că ARN-urile ce conțin virusuri au viteze relativ mari de mutație spontană, adică, raportate a fi de ordinul 10'³ la IO^-4 de nucleotidă încorporată. Prin urmare, întrucât heterogenitatea și fluiditatea genotipului sunt inerente în virusurile ARN, există multiple specii/izolate care pot fi virulente sau avirulente, în cazul speciilor de HCV. Compozițiile și metodele descrise pe parcursul descrierii ușurează propagarea, identificarea, detectarea și izolarea diverselor specii mai izolate de HCV.

Este cunoscut un procedeu pentru amplificarea și detectarea unei secvențe țintă de acid nucleic conținută într-un acid nucleic sau amestec ale acestora. Procedeul cuprinde tratarea, separată, a structurilor complementare ale acidului nucleic cu un exces molar de două oligonucleotide primare, urmărind ca acestea să formeze produse extinse de primeri complementari, care acționează ca template pentru sintetizarea secvenței acidului nucleic dorit și pentru detectarea secvenței astfel amplificate. Etapele reacției se pot realiza, pas cu pas sau simultan, și se pot repeta ori de câte ori se dorește. în plus, o secvență specifică de acid nucleic poate fi donată într-un vector folosind primari pentru amplificarea secvenței care conține zone de restricție la capetele lor non-complementarc. Un fragment de acid nucleic poate fi preparat dintr-un fragment existent mai scurt, folosind procesul de amplificare.

Se cunosc, de asemenea, procedee și materiale de obținere a secvențelor genomice virale.

Au fost identificate mai multe specii/ izolate diferite de HCV(WO 90/14436). Una dintre aceste specii sau izolate, care este un prototip, este denumită CDC/HCV1 (denumită de asemenea HCV). Informația dintr-o specie sau dintr-un izolat, cum ar fi, o secvență genomică parțială, este suficientă pentru a permite specialiștilor, utilizând tehnici standard, să izoleze noi specii/izolate și să identifice dacă acestea sunt HCV. De exemplu, mai multe specii/izolate diferite sunt descrise mai jos. Aceste specii care au fost obținute dintr-un număr mare de seruri umane ( și din zone geografice diferite) au fost izolate utilizând informația din secvența genomică de HCV1. Utilizând telmicile cunoscute, a fost dedusă structura genomică și secvența nucleotidică de HCV1 genomic ARN. Genomul apare a fi ARN monocuatemar, conținând aproximativ 10000 nucleotide. Genomul este catenat pozitiv și posedă o structură (ORF) de citire, translațională, deschisă, care codifică o poliproteină de circa 3000 aminoacizi. In ORF, proteinele structurale apar a fi codificate aproximativ în primul sfert al regiunii Nterminale, cu majoritatea poliproteinei responsabile pentru proteinele nestructurale. Când se face comparația cu toate secvențele virale cunoscute, se observă o omologie coliniară mică, dar nesemnificativă, cu proteinele nestructurale din familia Flavivirus, și cu virusurile epidemice (care acum sunt considerate de asemenea a face parte din familia Flavivirus. Proteina flavivirus conține, de la amino terminal la caiboxilul terminal, proteina nucleocapsidă (C), proteina matrice (M), proteina de înveliș (I) și proteinele nestructurale (NS) 1,2 (a+b), 3,4 (a+b) și 5. Bazat pe presupușii aminoacizi codificați în secvența nucleotidică a HCV1, un mic domeniu la extrema N-terminală a poliproteinei HCV apare similară atât prin mărime, cât și prin înaltul conținut în reziduuri bazice cu proteina nucleocapsidă (C) găsită N-terminal al poliproteinelor flavivirus. Proteinele nonstructurale 2,3,4 și 5 (ND-2..5) ale HCV și ale virusului febrei galbene (YFV) apar a avea perechi de mărime și hidropatie similară, deși există divergență între secvențele de aminoacid. Totuși, regiunea HCV care ar corespunde poliproteinei YVF conținând proteinele Μ, E și NS1 nu numai că diferă ca secvență, dar apar, de asemenea, a fi cu totul diferită atât ca mărime, cât și ca hidropatie. Astfel, pe când la anumite domenii ale genomului HCV se poate face referire aici, ca, de exemplu, NS1 sau NS2, trebuie să fie clar că aceste desemnări sunt speculative; pot exista diferențe considerabile între familia HCV și flavivirusuri care mai trebuie încă deteiminate. Se așteaptă ca diferite specii, izolate sau subtipuri de HCV să conțină variații la aminoacid și la acizii nucleici cu HCV1. Se așteaptă ca multe izolate să prezinte mare omologie (adică mai mult de 40%) în secvența totală de aminoacid comparativ cu HCV1. Totuși, s-aiputea găsi de asemenea că există alte izolate HCV mai puțin omoloage. Acestea vor fi definite ca HCV conform unor criterii variate, cum ar fi, de exemplu, un ORF de aproximativ 9000 nucleotide la aproximativ 12000 nucleotide, codificând o poliproteină codificată de hidrofobicitate și/sau caracter antigenic similar aceluia a HCV1 și prezenței secvențelor coliniare de peptide, care sunt conservate cu HCV1. în plus, se crede că genomul ar fi un ARN cu catenă pozitivă.

Toate izolatele HCV codifică cel puțin un epitop care este identificabil imunologic (adică reacționând transversal din punct de vedere imunologic) cu un epitop codificat în HCV a ADN-urilor descrise aici. Preferabil, epitopul este conținut într-o secvență de aminoacid descrisă aici și unic pentru HCV, comparativ cu patogenii cunoscuți mai înainte. Unicitatea epitopului poate fi determinată prin reactivitatea sa imunologică cu anticoipi antiHCV și lipsa de reactivitate imunologică cu anticorpi pentru patogeni, cunoscuți. Speciile și izolatele HCV sunt prezentate ca evoluționale. Prin urmare, se așteaptă ca întreaga omologie a genomilor la nivel de nuclcotidă să poată fi circa 40% sau mai mare, probabil va fi circa 50% sau mai mare, probabil circa 60% sau mai mare, și mai sigur circa 80% sau mai mare; și în plus că vor exista secvențe învecinate ccorespunzătoare pentru cel puțin circa 13 nucleotide. Se va nota că există regiuni variabile și hipervariabile în genomul HCV, prin urmare, omologia acestor regiuni se așteaptă să fie semnificativ mai mică decât aceea din întregul genom. Corespondența între presupusa secvență genomică de specie HCV și, de exemplu, secvența CDC/HCV1 cADN poate fi determinată printr-o comparare directă a informației secvenței polinucleotidei în secvențele presupuse de HCV și HCV c ADN descrise aici. Acestea pot fi determinate, de asemenea, prin hibridizarea polinu- cleotidelor în condiții care formează duplexuri stabile între regiuni omoloage (de exemplu, cele care se vor utiliza înainte de digestia SA) unnată de digestie cu nucleaze specifice monocatenare, urmată de determinarea mărimii fragmentelor digerate.

Datorită relației evolutive a speciilor sa izolatelor de HCV, presupusele specii sau izolate de HCV sunt identificabile prin omologia lor la nivelul polipeptidei. în general, izolatele sau speciile de HCV este de așteptat a fi de cel puțin 40% omoloage, mai mult de 90% omoloage, probabil mai mult de circa 70% omoloage și chiar și mai probabil mai mult de 80% omoloage, iar unele pot fi chiar mai mult de circa 90% omoloage la nivelul polipeptidei. Tehnicile pentru determinarea omologiei secvențiale aminoacid sunt cunoscute persoanelor din domeniul de specialitate. De exemplu, secvența de aminoacid poate fi determinată direct și comparată cu secvențele despre care se vorbește aici. în mod alternativ, secvența de nucleotidă a materialului genomic a presupusului HCV poate fi determinată (în mod obișnuit prin intermediul unui intermediar cADN), secvența presupusă de aminoacid, codificată aici, poate fi determinată, iar regiunile corespunzătoare sunt comparate.

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru detectarea secvenței de HCV într-o secvență suspectată a conține o polinucleotidă HCV, care cuprinde o regiune țintă selectată, care cuprinde: obținerea unui oligomer de țintire capabil să hibrideze la o secvență țintită HCV într-o catenă polinucleotidă de analizat, în care oligomerul conține o secvență polinucleotidică selectată din grupul constând din oligonucleotide complementare la următoarele regiuni ale genomului HCV(ca în figura 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427, 457-486; incubarea secvenței de analizat cu oligomerul de mai sus, care permite să se formeze duplexuri hibride specifice între o secvență de ologonucleotid și secvența țintă; detectarea hibrizilor formați, dacă există, între regiunea țintă și oligomer. Procedeul cuprinde: obținerea primului și celui de al doilea oligomer primar care sunt primari în reacția în lanț a polimerazei și care flanchează regiunea țintă selectată, în care regiunea țintă selectată cuprinde o regiune a genomului HCV, ales din grupul constând din (ca în fig. 1): amplificarea regiunii țintă printr-o metodă de reacție în lanț a polimerazei, în scopul de a obține secvențe de analizat amplificate de polinucleotidă; incubarea secvențelor de analizat amplificate cu oligomerul reactiv, cuprinzând oligonucleotide de țintire, care permit duplexurilor de hibrizi specific să se formeze între secvența de țintire și regiunea țintită; detectarea hibrizilor formați între regiunea amplificată țintă, dacă există, și oligomerii de țintire. Procedeul pentru eliminarea sângelui contaminat cu HCV de la donatorii individuali este cel descris mai sus și mai cuprinde și: obținerea de acizi nucleici de analii dintr-un eșantion de sânge suspectat de a conține o zonă țintă HCV și eliminarea sângelui în care au fost detectate duplexuri. Invenția se mai referă și la un reactiv pentru detectarea secvenței de HCV într-o secvență suspectată conține o polinucleotidă de HCV, care cuprinde o regiune țintă selectată care conține o oligonucleotidă având o secvență complementară la o regiune a unui genom HCV selectată dintr-un grup conținând nucleotidele (ca în fig. 1), iar nucleotida este marcată cu izotopi radioactivi pentru a detecta hibrizi.

Primul aspect al invenției este, deci, un procedeu pentru detectarea unei secvențe HCV într-o catenă de analit suspectată a conține o polinucleotidă HCV, în care polinucleotidă HCV conține o regiune țintă selectată, procedeul respectiv cuprinzând:

a) găsirea unui oligomer (sau oligomeri) capabil să hibrideze la o secvență HCV într-o catenă polinucleotidică de analit , în care oligomerul cuprinde o secvență polinucleotidică selectată din grupul constând din oligonucleotide complementare următoarelor regiuni ale genomului HCV (așa cum se arată în fig.l): 16-45, 49-78, 82-111, 115144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 și 457-486;

b) incubarea catenei de analit cu oligomerul (oligomerii) din (a), care permit să se formeze duplexuri hibride specifice între secvența de țintire și secvența țintă; și

d) detectarea hibrizilor formați între regiunea țintă, dacă apar, și a oligomerului (oligomerilor).

Alt aspect al invenției este un procedeu pentru detectarea unei secvențe HCV într-o catenă de analit suspectată de a conține o polinucleotidă HCV, în care polinucleotidă HCV cuprinde o regiune țintă, selectată; procedeul respectiv cuprinzând:

a) găsirea unui oligomer (oligomeri) capabil să hibrideze la o secvență HCV într-o catenă polinucleotidică a unui analit, în care oligomerul este alcătuit dintr-o secvență polinucleotidică selectată din grupul constând din oligonucleotide complementare următoarelor regiuni ale genomului HCV (așa cum se arată în fig. 1) 16-45, 49-78, 82-111, 115144, 148-177, 211-240, 242-271, 275-304,

332-361, 365-394, 398-427 și 457-486;

b) incubarea catenei de analit cu oligomer (oligomeri) de la punctul (a), care permit să se formeze duplexuri hibride specifice între secvența țintitoare și secvența țintă; și

d) detectarea hibrizilor formați între regiunea țintă, dacă există, și a oligomerului (oligomerilor), în care celălalt oligomer (oligomeri) este aclătuit dintr-o secvență polinucloetidică selectată de grupul constând din oligonucleotide complementare la următoarele regiuni ale genomului HCV (așa cum se arată în fig.l) 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177,211-240, 242-271, 175-304, 332-361, 365-394, 398-427 și 457-486.

încă un aspect al invenției este o metodă de a prepara sânge fără HCV, cuprinzând:

a) obținerea de acizi nucleici analiți dintr-o probă de sânge suspectat a conține o secvență țintă HCV;

b) oferirea unui oligomer (oligomeri) capabil să hibridizeze la secvența de HCV întro catenă polinucleotidică de analit, dacă există, în care oligomerul este constituit dintr-o secvență polinucleotidică selectată din grupul constând din oligonucleotide complementare la următoarele regiuni ale genomului HCV (așa cum se arată în fig. 1): 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 211-240, 242-271,275-304, 332-361, 365-394, 398-427 și 457-485;

c) reacționarea lui (a) cu (b) în condiții care permit formarea unui duplex polinucleotidic între secvența țintitoare și secvența țintă, dacă există;

d) detectarea unui duplex format în (c), dacă există, și

e) păstrarea sângelui în care nu au fost detectate complexe în (d).

Un aspect suplimentar al invenției este o metodă pentru prepararea de sânge lipsit de

HCV, cuprinzând:

a) asigurarea de acizi nucleici dintr-o probă de sânge suspectat a conține o secvență țintă HCV;

b) asigurarea unui (unor) oligomer (oligomeri) capabil să hibridizeze la secvența de HCV într-o catenă polinucleotidică de 5 analii, dacă există, în care oligomerul este constituit dintr-o secvență polinucleotidică;

c) reacționarea lui (a) cu (b) în condiții ' care permit formarea unui duplex polinucleotidic între secvența țintitoare și secvența 10 țintă, dacă există;

d) detectarea unui duplex format în (c), dacă există, cu alt oligomer (oligomeri), în care celălalt oligomer (oligomeri) conține o secvență polinucleotidică; și 15

e) păstrarea sângelui în care nu au fost detectate complexe in (d).

Se dau în continuare 3 exemple de realizare a invenției, în legătură cu fig. 1... 4, care reprezintă: 20

-fig.l, prezintă alcătuirea secvenței HCV c ADN, prezentate în publicația PCT Nr. WO 90/14436. Clonii de la care a fost derivată secvența sunt 5’clon 32, bl 14a, 18 g, ag 30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, Cal676, 25 CA1560, CA84a, CA39a, K9-1 (denumită de asemenea K9-1), 26 j, 13i, 12f, 141, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 87, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, 65a, 16jh, 6k și pl31jh. în figură cele trei liniuțe 30 orizontale din fața secvenței indică poziția codonului metioninic inițiator pretins. De asemenea, în figură este prezentată secvența de aminoacid a presupusei poliproteine codificate în HCV c ADN. Heterogenitățile în ADN-urile 35 donate ale HCV1 sunt indicate prin amino10 acizii indicați deasupra presupusei secvențe codificate a ORF-ului voluminos; parantezele indică că a fost detectată heterogenitatea la/sau aproape de capătul 5’ - sau 3' - al HCV c ADN din clon;

- fig.2, prezintă secvențele de ADN de consens pentru cinci HCV diferite izolate din localizări geografice diferite (Japonia și SUA), în care aminoacizii codificați de ORF-ul voluminos al HCV1 sunt prezentați deasupra secvențelor de ADN;

- fig.3, prezintă secvențele probelor de marcare pentru detectarea HCV ARN în probe biologice utilizate în exemplul 3 care urmează;

- fig.4, prezintă însușirea probelor din fig.3 cu HCV1, conform numărătorii din fig.l.

Exemplul 1. Detectarea catenei 5'HCV ARN, pozitivare și negativare în ser ARN-ul din HCV 27, izolat din ser, este analizat pentru determinarea catenelor pozitive și negative, utilizând metode PCR. Metoda PCR este realizată în esență așa cum este știut, cu excepția următoarelor:

HCV 27 ARN-ul extras este transcris revers în cADN monocatenar, utilizând drept primer fie Alex 90, fie JH 52. Alex 90, care este derivat de la nucleotidele -312 la - 283 ale genomului HCV1, are secvența:

5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'.

JH52 este derivat de la nucleotidele HCV-93 la - 117:numerele nucleotidice sunt indicate între paranteze sub secvențe. în jH52, dinucleotida subliniată a fost mutată pentru a crea situsul NctI. Secvența pf JH52 este după cum urmează:

Primer Introducător (JH51) 5' AGTOTT (-93)

Secvența de Alex 90 se împerechează cu cea din nucleotidele -312 la -283 ale catenei pozitive de HCV ARN, pe când JH52 se împerechează cu cea din nucleotidele -117 la 93 ale catenei negative. HCV c ADN-urile mono catenare rezultate sunt amplificate fiecare 50

Not I Secvență HCV

GGGGOOGO AGGCCCAAATC 3' (-117) separat prin PCR, utilizând Alex 90 și JH 52. Detectarea produșilor de amplificare este realizată prin absorbția Southern, utilizând ca probă Alex 89. Alex 89 se împerechează cu numerele nucleotidice -203 la -175 ale HCV. Secvența de Alex 89 este:

5’ CCA TAG TGG TCT

Analiza indică că, prin această metodă, semnalele produselor amplificate ale ambelor catene ARN sunt egale cu intensitate. Aceste rezultate sunt sugestive că HCV ARN în regiunea 5' - poate exista ca ARN dublu catenar.

Exemplul 2. Detectarea HCV ARN în 10 plasmă utilizând HCVIcPCR. Utilizând primeri și probe derivați de la regiunea 5' - a HCV ARN

Extracția HCV ARN din plasmă

Plasma congelată este deghețată într-un 15 capac P3. Un alicot de 0,2 ml de amestec de digestie (100 mM) Tris-HCl, 2mM EDTA, 200 mM NaCl, 20 pg/ml M82 ARN, 0,5% SDS și 2 mg/ml proteină J pH 8 se adaugă la un tub microdispersant de 2 ml și se preîncălzeșze la 20 37°C. Apoi, se adaugă 0,2 ml plasmă și amestecul este lăsat la incubare la 60° C timp de o oră. Se adaugă, apoi, 0,4 ml fenol și amestecul este turbionat 3 x 30 s și lăsând

5’ CCC AAC ACT ACT

După incubarea inițială, la amestecul de 30 incubare se adaugă următoarele: 10 μΐ din 5 x primerul tip tampon (250 mM Tris HC1, pH 8,3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl₂, 50 mM ditiotreitol); 2,5 μΐ deoxinucleozid trifosfați (10 mM din fiecare); 2,5 μΐ transcriptază reversă 35 (MMLV din BRL, 200 unități/ml) și apă

GGG GAA CCG GTG AGT ACA 3' s între fiecare turbionare. Amestecul este apoi centrifugat timp de 5 min și este recuperată faza apoasă. Faza organică este extrasă, din nou, cu 0,1 ml TFS și fazele apoase reunite sunt extrase cu 2 x 1 volum fenoI/cloroform/IA-A apoi cu un volum cloroform. în extract se adaugă 1 μΐ (2pg) glicom și 25 ul AcONa (3M, pH=5,4) și 1,25 ml EtOh rece, și este congelat pe gheață uscată și presat timp de 10 min. Paleta obținută este dizolvstă în 100 ul apă distilată și se adaugă 5 ul NaOAc AcONa(pH=5,4) cu 250 μΐ EtOH rece. Soluția este congelată și presată din nou. Paleta rezultată este dizolvată în 10 μΐ dH₂O.

Sinteza cADN; Pentru a sintetiza cADN-ul extras inițial, 5 μΐ din ARN-ul dizolvat este incubat cu 4 μΐ și 1 μΐ (1 ug sau 166 p moli de 18-mer) primer RT. Incubarea se face la 70° C timp de 3 min, urmată de răcirea pe gheață. Secvența primarului Rt este:

CGG CTA 3' distilată pentru a aduce volumul Ia 50 ul. Amestecul este incubat la 37°C, timp de o oră, este încălzit la 90°C timp de 3 min și apoi este răcit pe gheață. Amplificare PCR: Amplificarea PCR a HCV cADN obținut mai sus este condusă utilizând controlul și reactivii care sunt în tabelul de mai jos:

14

	ARN(pl)	cADn(pi)	Templat(pl)	Eșantion(pl)
Apă	la 100,0	la 100,0	la 100,0	Ia 100,0
10 x tampon	10	10	10	10
dNTP-uri	16	16	16	16
primer 1	0,5	0,5	0,5	0,5
primer 2	0,5	0,5	0,5	0,5
templat	2,5	2,5	2,5	2,5
Tag Pel	0,5	0,5	0,5	0,5

în tabel ARN indică un eșantion de control, în care ARN-ul este extras de la un individ care nu este infectat cu HCV; acest eșantion este condus de-a lungul etapelor sintezei de cADN și a amplificării PCR. cADN indică un eșantion de control care este purtat de-a lungul etapelor sintezei de cADN și a amplificării PCR; totuși, în acest caz alicotul

Primer 1: 5

Primer 2: 5'

ACC

AGT

ATG	AAT	CAC
CTT	GCG	GGG
la o	regiune	20

Acești primeri hibridizează conservată în capătul 5 al genomului HCV. Eșantioanele conțin 12,5^ul echivalenți de ser din HCV cADN. Condițiile ciclului de amplificate utilizate sunt după cum urmează: 35 cicluri: Topire-94°C pentru 1,5 min.

de ARN este înlocuit cu apă pe timpul sintezei cADN. Templat este un control pentru reacția PCR din care este omis templatul. Eșantion indică serul care este testat pentru prezența HCV ARN.

Primer 1 și primer 2 sunt 0,5 pg/I, și, respectiv, 0,42 ug/ul și au următoarele secvențe:
CCT GTG	AGG	AAC	TAC 3’
GCA CGC	CCA	AAT	C 3’

Consolidare-60°C timp de 2 min. Elongare-72°C timp de 3 min.

Elongare finală: 72°C timp de 30 min. Stors la 4°C până la îndepărtare. Produsul amplificat este cercetat utilizând un ADN marcat.

Secvența probei este următoarea:

5'

TTT CTT GGA TGA ACC CGC TCA ATG CCT GGA 3'

Prin procedura de mai sus au fost examinate 35 peste 200 eșantioane HCV sero-pozitive. Au fost luate în considerație numai rezultatele în care controlurile s-au dovedit a fi negative. în acest caz, toate eșantioanele sero-pozitive s-au demonstrat a fi pozitive la determinarea PCR. 40 Exemplul 3. Probe derivate de la

Regiunea Presupusă Miez a HCV ARN

O analiză a secvențelor nucleotidice de cADN-uri de la diferite izolate HCV arată că există un înalt grad de conservare de secvență 45 în regiunea de la circa nucleotide 1 la circa nucleotide 570, utilizând sistemul de numerotare pentru nucleotide arătate în fig.l. Această presupusă regiune codifică un miez polipeptidă de HCV. Secvențele de consens pentru cinci izolate diferite din localizări geografice diferite (Japonia și SUA) sunt prezentate în fig.2, în care HCV1 este HCV-ul prototip; aminoacizii codificați în ORF-ul larg al HCV1 sunt prezentate deasupra secvențelor nucleotidice de consens. în secvențele prezentate în fig.2, HCVJH provine dintr-o comunicare persoanlă din Japonia, și JC-J1 și JCV-4 sunt tot din Japonia. Se poate vedea în fig.2 că între secvențele de consens din presupusa regiune miez există cel puțin 90% 5 omologie relativ la secvența HCV1. Având în vedere înaltul grad de omologie în regiunea dintre nucleotidele +1 la +571, probe din această zonă vor fi utile în testarea pentru specimenele biologice HCV pozitive. Un set de 10 probe de marcare care pot fi utilizate în detectarea HCV ARN din regiunea care este presupusă a codifica un miez polipeptidic este prezentat în fig.3. In fig. 3 un număr de probe include o serie de polinucleotide cu 15 heterogenități indicate Codul Grup IUS listat în fig.3. Heterogenitățile apar pentru a adapta diferențele de secvență nucleotidică găsite în secvențele de consens a diverselor izolate.

Regiunile secvenței HCV la care sunt 20 complementare probele din proba set din fig.3 sunt arătate în fig.4, în care numerele nucleotidice corespund numărătorii din fig.l. Acest set de probe a fost utilizat într-o determinare pentru a detecta secvențele 25 HCV(denumite probe pentru hibridizarea sandvici pentru HCV).

Metodele descrise aici, ca și oligomerii, atât primari,, cât și probe derivate de la HCV cADN și trusele conținându-i, sunt utile pentru 30 determinarea cu acuratețe, relativ simplă și economică, a prezenței HCV în eșantioanele biologice, mai ales în sânge, care poate fi utilizat pentru transfuzii, și la indivizii suspectați de a avea infecția HCV. Mi, mult, 35 aceste metode și oligomeri pot fi utili pentru detectarea unui stadiu de infecție HCV timpuriu față de determinările imunologice bazate pe utilizarea unei polipeptide HCV recombinate. De asemenea, o determinare de hibridizare amplificate a unei polinucleotide detectează HCV ARN îh eșantioane ocazionale care sunt negative pentru anticorpii anti-HCV. Astfel, probele și primerii descriși în invenție pot fi utilizați pentru determinarea de hibridizare amplificată în combinație cu imunodeterminarea bazat pe polipeptide HCV, pentru a identifica mai complet infectările datorate HCV, și specimenele biologice infectate cu HCV, incluzând sânge.

Informația care este oferită aici permite proiectarea de primeri și/sau probe care sunt derivate de la regiuni conservate ale genomului HCV. Prevederea unor astfel de primeri și probe face accesibilă o metodă generală care să detecteze specii HCV variate și care vor fi utilizate ăn testarea sângelui și a produselor din sânge. Dacă primerii utilizați în metodă sunt derivați de la regiuni conservate ale genemului HCV, metoda va ajuta în detectarea și/sau identificarea speciilor HCV diferite de tipul caracteristic. Acest lucru va conduce la rândul său la apariția de reactivi imunologici adiționali pentru detectarea și diagnosticul HCV, ca și apariția de reactivi polinucleotidici adiționali pentru detectarea și tratamentul HCV.

în plus, setul de primeri și probe proiectat din secvențele conservate de aminoacizi de Flavivirusuri și HCV permite o metodă universală de detectare a acestor agenți infecțioși.

Următoarele materiale listate sunt depuse, în condițiile Tratamentului de la Budapesta, la Colecția Americană de Culturi Tip(ATCC), 12301 Parklawn Dr., Reckville, Maryland 20852 și li s-au atribuit următoarele numere de acces.

lamda-atll	Nr.ATCC	Data de depozit
HCV cADN	40394	01.12.1987
clona 81	40388	17.11.1987
clona 91	40389	17.11.1987
clona 1-2	40390	17.11.1987
clona 5-1-1	40391	18.11.1987
clona 12f	40514	10.11.1988
clona 35f	40511	10.11.1988
clona 150	40513	10.11.1988
clona K9-1	40512	10.11.1988
JSC 308	20879	05.05.1988
pS356	67683	20.04.1988

în plus, pe data de 11 mai 1989 au fost făcute următoarele depozite:

Specie	Linkeri	Nr.ATCC
D1210 (Cfl/5-1-1)	EF	67967
D1210 (Cfl/81)	EF	67968
D1210 (Cfl/CA74a)	EF	67969
D1210 (Cfl/35f)	AB	67970
D1210 (Cfl/279a)	EF	67971
D1210 (Cfl/C36)	CD	67972
D1210 (Cfl/131)	AB	67973
D1210	EF	67974
D1210 /Cfl/CA290a)	AB	67975
HB101 (AB24/C100//3R)		67976

Următorii derivați de specie D1210 au fost depuși pe 3 mai 1989.

Derivat de specie	Nr.AT
pCFlCS/C8f	67956
pCFlAB/C12f	67952
pCFlEF/140	67949
pCFlEF/150	67954
pCFlAB/C250	67958
pCFlEF/C33O	67953
pCFlEF/C33f	67950
pCFlCD/33g	67951
PCF1EF/C390	67955
pCFlEF/C40b	67957
pCFlEF/CA167b	67959

Următoarele specii au fost depuse pe 12 mai 1989.
Specia	Nr.ATCC
Lambda gtl 1(C35)	40603
Lambda gtl0(beta-5a)	40602
D1210 (C40b)	67980
D1210 (M16)	67981

Următoarele materiale biologice au fost 40 depuse pe 25 martie 1990.

Material Nr.ATCC

5'-clon-32(în pUC18S) 68276

Așa cum se utilizează în cele de față, o polinucleotidă derivată de la o secvență 45 desemnată se referă la o secvență de polinucleotidă care este alcătuită dintr-o secvență de aproximativ cel puțin circa 6 nucleotide, preferabil cel puțin circa 8 nucleotide, mai ales cel puțin circa 10-12 50 nucleotide, și chiar și mai preferabil cel puțin circa 15-20 nucleotide corespunzând unei regiuni a secvenței nucleotidice desemnate. Preferabil, secvența regiunii din care este derivată polinucleotidă este omoloagă cu/sau complementară la o secvență care este unică pentru un genom HCV. Mai preferabil, secvența derivată este omoloagă sau complementară la o secvență care este unică pentru toate sau pentru o majoritate a izolatelor HCV. Dacă o secvență este unică sau nu la genom HCV poate fi determinat prin tehnici cunoscute specialiștilor în domeniu. De exemplu, secvența poate fi comparată cu secvențele din băncile de date, pentru a se determina dacă este prezentă în gazda neinfectată sau alte organisme. Secvența poate fi comparată de asemenea cu secvențele cunoscute ale altor agenți virali, incluzând pe cei care sunt cunoscuți a induce hepatita, de exemplu, HAV și HDV, și cu membri ai Flaviviridelor. Corespondența sau lipsa de corespondență a secvenței derivate față de alte secvențe poate fi determinată, de asemenea, prin hibridizare în condiții de strictețe adecvate. Tehnici de hibridizare pentru determinarea complementarității secvențelor de aminoacid sunt cunoscute în domeniu și sunt discutate mai jos. în plus, împerecherea nepotrivită a polinucleotidelor duplex formate prin hibridizare poate fi determinată prin tehnici cunoscute, incluzând, de exemplu, digestia cu o nuclează, cum ar fi SI, care digerează în mod specific zonele monocatenare din duplexurile polinucleotidice. Regiunile din care pot fi derivate” secvența ADN tipice includ, dar nu se limitează la, de exemplu, regiuni care codifică epitopi specifici, ca și regiuni netranscrise și/sau netranspuse.

Polinucleotida derivată nu este în mod obligatoriu derivată fizic de la secvența nucleotidică arătată, dar poate fi generată în orice manieră, incluzând, de exemplu, sinteza chimică sau replicarea ADN sau transcrierea reversată sau transcrierea. în plus, combinații de regiuni corespunzând celei a secvenței desemnate pot fi modificate în moduri cunoscute în specialitate ca compatibile cu o utilizare intenționată.

Termenul polinucleotidă recombinată așa cum este utilizat în cele de față intenționează a însemna o polinicleotidă de origine genomică, Cadn, semisintetică sau sintetică, care, în virtutea originii sale sau a manipulării: (1) nu este asociată cu întreaga sau o porțiune a unei polinucleotide cu care este asociată în natură (2) este legată la o polinucleotidă, alta decât cea la care este legată în natură, sau (3) nu se află în natură.

Termenul polinucleotidă așa cum este utilizat aici se referă la o formă polimerică de nucleotide de orice lungime, fie ribonucleotide, fie dezoxiribonucleotide.

Acest termen se referă numai la structura primară a moleculei. Astfel, acest termen include ADN și ARN, dublu sau monocatenar. El include de asemenea tipuri cunoscute de modificări, de exemplu marcări care sunt cunoscute în specialitate, medierea, acoperiri, substituirea unora sau mai multor nucleotide apărute natural cu un analog, modificări intemucleotidice, cum ar fi, de exemplu, cele cu încărcări neîncărcate (cum ar fi, fosfonați de metil, fosfotriesteri, fosfoamidați, carbonați etc) și cu legături încărcate (de exemplu, fosforotionați, fosforoditionați etc.) cele conținând legături atașate, cum ar fi, de exemplu, proteine (incluzând, de exemplu, nucleaze, toxine, anticorpi, peptide semnal, poli-I-lizină etc.), cele cu intercalatori (de exemplu, acridină, psoralen etc.) cele conținând chelatori (de exemplu, metale, metale radioactive, bor, metale oxidative etc.), cele conținând alchilatori, cele cu legături modificate (de exemplu), acizi nucleici alfa anomerici etc.), ca și formele nemodificate ale polinucleotidelor.

Așa cum se utilizează aici catena sens a unui acid nucleic conține secvența care are omologie de secvență ca aceea a mARN. Catena anti-sens conține o secvență care este complementară celei a catenei sens.

Așa cum se utilizează aici, un genom catenat pozitiv a unui virus este o polinucleotidă genomică, fie ARN, fie ADN, care codifică cel puțin o polipeptidă virală. Exemple de virusuri ARN catenate pozitiv includ Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae și Calciviridae. Sunt incluse, de asemenea, Flaviviride care au fost clasificate mai înainte ca Togaviridae. Aceste virusuri sunt în mod tipic monocatenare.

Termenul primer, așa cum este utilizat aici, se referă la un oligomer care este capabil să acționeze ca punct de inițiere a sintezei unei catene polinucleotidice atunci când este plasat în condiții potrivite. Primerul va fi total sau în cea mai mare parte complementar la o regiune a catenei polinucleotidice, care este de copiat. Astfel, în condiții care conduc la hibridizare, primerul se va consolida în regiunea complementară a catenei de analit. După adăugarea de reactanți adecvați (de exemplu, polimerază, trifosfați de nucleotide și alții asemenea), primerul este extins de către agentul de polimerizare pentru a forma o copie a catenei de analit. Primerul poate fi monocatenar, sau în mod alternativ poate fi parțial sau total dublucatenar.

Termenii polinucleotid analit și catenă de anlit se referă la o moleculă de acid nucleic mono sau dublu catenară, care este suspectată a conține o secvență țintă și care poate fi prezentă într-o probă biologică.

Așa cum se utilizează în cele de față, oligomer se referă la primeri și probe. Termenul oligomer nu implică mărimea moleculei. Totuși, oligomerii tipici nu sunt mai mari de 1000 nucleotide, mai ales nu sunt mai mari de 500 nucleotide, în special nu sunt mai mari de 250 nucleotide; aceștia pot fi nu mai mari de 100 nucleotide, și pot fi nu mai mari de 75 nucleotide și, de asemenea, pot să fie nu mai mari de 50 nucleotide în lungime.

Așa cum se utilizează în cele de față, termenul probă se referă la o structură conținând o polinucleotidă care formează o structură hibrid cu o secvență țintă, datorită complementarității cel puțin unei secvențe din probă cu o secvență din regiunea țintă. Regunile polinucleotidice ale probelor pot fi alcătuite din ADN și/sau ARN, și/sau analogi nucleotidici. Incluse între probe sunt probe captură și probe marcat. Preferabil, proba nu conține o secvență complementară la secvențe utilizate pentru a iniția reacția în lanț a polimerazei (PCR).

Așa cum se utilizează aici, regiunea țintă se referă la o regiune a acidului nucleic care este de amplificat sau detectat. Termenul secvență țintă se referă la o secvență cu care o probă sau un primer formează un hibrid stabil în condiții dorite.

Termenul probă captură, așa cum este utilizat aici, se referă la o polinucleotidă, alcătuită dintr-o polinucleotidă monocatenară legată la un partener de legare. Polinucleotidă monocatenară conține o secvență polinucleotidică de țintire, care este complementară la o secvență țintă într-o regiune țintă de detectat în polinucleotidul analit. Această regiune complementară este de o lungime și complementate suficientă față de secvența țintă, pentru a conferi un duplex de stabilitate care este suficient pentru a imobiliza polinucleotidul analit pe o suprafață solidă (prin intermediul partenerului de legare). Partenerul de legare este specific pentru un al doilea partener; al doilea partener de legare poate fi legat la suprafața unui suport solid, sau poate fi legat indirect prin intermediul altor structuri sau parteneri de legare la un suport solid.

Tennenul secvență polinucleotidică țintitoare, așa cum este utilizat aici, se referă la o secvență polinucleotidică care conține nucleotide care sunt complementare unei secvențe nucleotidice țintă, secvența de lungime și complementaritatea suficientă față de secvența țintă pentru a forma un duplex care are suficientă stabilitate pentru scopul intenționat.

Termenul partener de legare, așa cum este utilizat aici, se referă la o moleculă capabilă să lege o moleculă ligand cu specificitate înaltă, ca, de exemplu, un antigen și un anticorp specific pentru acesta. In general, partenerii specifici de legare trebuie să se lege cu afinitate suficientă pentru a imobiliza duplexul copie analit/catenă complementară (în cazul probelor de captură) în condiții de izolare. Partenerii de legare specifici sunt cunoscuți în specialitate și includ, de exemplu, biotinul și avidinul sau streptovidinul, IgG și proteina A, numeroasele cupluri cunoscute receptor ligand și catenele polinucleotidice complementare. în cazul partenerilor de legare polinucleotide complementare, partenerii sunt în mod normal de cel puțin 15 baze de lungime și pot fi de cel puțin 40 baze în lungime; în plus aceștia au un conținut de Gs și Cs de cel puțin circa 40% și până la circa 60%. Polinucleotidele pot fi compuse din ADN, ARN sau analogi de nucleotide sintetice.

Termenul de cuplat, așa cum se utilizează în cele de față, se referă la atașare prin legături covalente sau prin interacțiuni puternice monovalente (de exemplu interacțiuni hidrofbbice, legături de hidrogen etc.). Legături covalente pot fi, de exemplu, legături de eter, ester, fosfoester, amidă, peptidă, carbon-sulf, legături carbon-fosfor și altele asemenea.

Termenul suport se referă la orice suprafață solidă sau semisolidă la care poate fi ancorat partenerul de legare dorit. Suporturile potrivite includ sticlă, plastic, metal, geluri polimerice și altele asemenea, și pot lua formă de perle, adâncituri, striuri, membrane sau altele asemenea.

Termenul marcat, așa cum se utilizează aici, se referă la orice atom sau radical care poate fi utilizat pentru a oferi un semnal detectabil (de preferință calitativ) și care poate fi atașat la o polinucleotidă sau polipeptidă.

Așa cum se utilizează aici, termenul de probă de marcare se referă la un oligomer care cuprinde o secvență polinucleotidică de țintire, care este complementară la o secvență țintă de detectat în polinucleotidul analit. Această regiune complementară este de lungime complementară față de secvența țintă pentru a duce la obținerea unui duplex alcătuit din proba de marcare și secvența țintă pentru a fi detectată prin marcat. Oligomerul este cuplat la un marcat fie direct, fie indirect prin intermediul unui set de molecule ligand cu înaltă specificitate una față de cealaltă. Seturi de molecule ligand cu înaltă specificitate sunt descrise și includ, de asemenea, multimeri.

Termenul mulțime r, așa cum este utilizat aici, se referă la polimeri liniari sau ramificați ale acelorași unități polinucleotidice monocatenare, care se repetă sau ale altor unități polinucleotidice monocatenare diferite. Cel puțin una dintre unități are o lungime, o secvență și o compoziție care îi permit să hibridizeze în mod specific la o primă secvență nucleotidică monocatenară de interes, în mod tipic un analit sau un oligomer (de exemplu, o probă de marcare) legat la un analit Pentru a realiza o astfel de specificitate și stabilitate, această unitate va fi în mod normal de cel puțin circa 15 nucleotide în lungime, în mod tipic nu mai mult de circa 50 nucleotide în lungime, și preferabil de circa 30 nucleotide în lungime, mai mult, conținutul de Gs și Cs ca fi în mod normal cel puțin circa 40% și cel mult 60%. în afară de astfel de unități multimerul include o multitudine de unități care sunt capabile să hibridizeze în mod specific și stabil la o a doua nucleotidă monocatenară de interes, în mod tipic o polinucleotidă marcată sau alt multimer. Aceste unități sunt, în general, aproximativ de aceeași dimensiune și compoziție ca și multimerii discutați mai sus. Atunci când un multimer este desemnat a fi hibridizat de alt multimer, prima și a doua dintre unitățile oligo-nucleotidice sunt heterogene (diferite) și nu hibridizează una cu cealaltă în condițiile de testare selectate. Astfel, multimerii pot fi probe de marcare sau pot fi liganzi care cuplează marcantul la probă.

Așa cum se utilizează în cazul de față, termenul de ARN viral care include ARN HCV se referă la ARN din genomul viral, fragmente ale acestuia, transcrisuri ale acestuia și secvențe mutant derivate de la el.

Termenul de probă biologică, așa cum se utilizează aici, se referă la o probă de țesut sau fluid izolată de la un individ, incluzând, dar fără a se limita la, de exemplu, plasmă, ser, fluid spinal, fluid limfatic, secțiuni externe ale pielii, ale tractului respirator, intestinal și genito-urinar, lacrimi, salivă, lapte, celule din sânge, tumori, organe și, de asemenea, probe de constituenți ai culturilor celulare in vitro (incluzând, dar fără a se limita la mediu condiționat, rezultând din creșterea celulelor în medii de cultură celulară, celule presupuse a fi infectate viral, celule recombinate și componente celulare). în practică, în prezenta invenție, se folosesc (cu excepția cazului în care se indică altfel) tehnicile convenționale în chimie, biologie moleculară, microbiologic, ADN recombinat și imunologie, care sunt la îndemâna specialistului în domeniu. Astfel de tehnici sunt cunoscute din literatura de specialitate.

Materialele și procedeele utile din prezenta invenție sunt accesibile prin identificarea HCV-ului ca fiind agent etiologic al BB-NANBV și prin punerea la dispoziție a unei familii de secvențe nucleotidice izolate din băncile de CADN, care conține secvenți HCV cADN. Aceste bănci cADN sunt derivate de la secvențe de acdi nucleic prezente în plasma unui cimpanzeu infectat cu HCV.

Utilizând secvențele HCV cADN descrise mai sus, ca și pe aceea descrisă în prezenta invenție, pot fi construiți oligomeri care sunt utili ca reactivi pentru detectarea polinucleotidelor virale în probe biologice. De exemplu, este posibil să se sintetizeze, din secvențe, oligomeri ADN de circa 8 10 nucleotide, sau mai mari, care sunt utili ca probe de hibridizare pentru a detecta prezența HCV RAN în, de exemplu, sânge donat, fracțiuni de sânge, ser de la subiecții suspectați a găzdui virusul sau sinteze de cultură celulară, în care virusul este replicat. în plus, aici oligomerii descriși facilitează caracterizarea suplimentară a genomului HCV.

Se pot utiliza probe de polinucleotide și primeri derivați de secvențe pentru a amplifica secvențele prezente în băncile cADN și/sau pentru a testa băncile cADN pentru suprapunerea adițională a secvențelor cADN, în schimb pot fi utilizate pentru a se obține mai multe secvențe care se suprapun. Așa cum s-a arătat, genomul de HCV apare a fi ARN conținând, în primul rând, o catenă de citire cu deschidere mare (ORF) care codifică o poliproteină mare.

în plus față de cele de mai sus, informațiile oferite mai jos permit identificarea de specii sau izolate HCV adiționale. Izolarea și caracterizarea de specii sau izolate HCV adiționale poate fi realizată, de exemplu, prin izolarea acizilor nucleici din componente ale corpului care conțin particule virale și/sau ARN viral, creând bănci cADN utilizând oligomeri bazați pe secvența HCV1, pentru testarea băncilor în căutarea de cloni conținând secvențe HCV cADN descrise mai jos și comparând HCV cARN-urile din noile izolate cu cARN-urile descrise în PCT nr. WO90I14436 și mai jos. Speciile sau izolatele care se potrivesc cu parametrii HCV, așa cum este descris în partea conținând definiții de mai sus, pot fi identificabili cu ușurință. Alte metode pentru identificarea speciilor HCV vor fi evidente specialiștilor în domeniu, pe baza infonnațiilor oferite în descrierea de față.

Izolarea secvențelor HCV cADN

Oligomerii din invenție conțin regiuni care fonnează structuri duplex hibride cu secvențele țintite din polinucleotidele HCV. Regiunile care hibridizează, din polinucleotidele HCV ale oligomerilor, pot fi stabilite din secvențele HCV cADN oferite aici, și descrise în PCT nr. WO90!14436. Un compozit de HCV cADN din HCV1, un HCV polipeptidic, este prezentat în fig.l. Secvența compozit este bazată pe informația de secvență derivată de la un număr de cloni HCv cADN, care au fost izolați dintr-un număr de bănci HCV cADN, incluzând banca c prezentă în lambda gt llțATCC nr. 40394), și în ser uman. Clonii HCV cADN au fost izolați prin metode descrise în WO90I14436. Pe scurt, majoritatea clonilor care au fost izolați conțineau secvențe din banca c de HCV cADN care a fost construită utilizând ser recoltat de la un cimpanzeu cu infecția HCV cronică și conținând un titra înalt al virusului, adică cel puțin IO⁶ doze infecțioase cimpanzeu/ml(CID/ml). Serul recoltat a fost utilizat pentru a izola particule virale: acizi nucleici izolați din aceste particule au fost utilizați ca templați în construcția băncilor ADN la genomul viral. Clonul inițial 1,5-1-1, a fost obținut prin testarea băncii c cu ser de la indivizii infectați. După izolarea clonului inițial, restul de secvență este obținut prin cu probe de polinucleotide sintetice a căror secvențe sunt derivate de la regiunea 5' și 3' a secvențelor HCV cADN cunoscute. Descrierea metodelor de recuperare a secvențelor cADN este mai mult de interes istoric. Secvențele rezultante (și complementele lor) sunt obținute aici, și secvențele lor, sau orice porțiune a acestora, pot fi preparate utilizând metode de sinteză, sau printr-o combinație de metode de sinteză și recuperare a secvențelor parțiale (utilizând metode similare celor descrise îri publicația PCT nr. WO90/14436.

Probe de oligomeri șiprimeri

Utilizând drept bază genomul HCV (așa cum se ilustrează în fig.l) și/sau preferabil regim ni conservate ale genomului HCV, pot fi preparați oligomeri de aproximativ 8 nucleotide sau mai mult, care hibridizează cu catenele pozitive de HCV ARN sau complementele acestora, ca și la HCV cADN-uri. Acești oligomeri pot servi ca probe pentru detectarea (incluzând) izolarea și/sau marcarea) polinucleotidelor care conțin secvențe nucleotidice HCV, și/sau primari pentru transcrierea și/sau replicarea secvențelor HCV țintite. Oligomerii conținând o secvență polinucleotidică țintitoare, care este alcătuită din nucleotide care sunt complementare la o secvență nucleotidică HCV țintă; secvența este de lungime și complementaritate suficientă cu secvența HCV, pentru a forma un duplex care are o stabilitate suficientă pentru scopul intenționat. De exemplu, dacă scopul este izolarea, prin intermediul imobilizării unui analit conținând o secvență HCV ținta, oligomerii vor conține o regiune polinucleotidică care este de lungime și complementaritate suficientă față de secvența HCV țintită, pentru a da o stabilitate suficientă a duplexului pentru a imobiliza analitul pe o suprafață solidă, prin intermediul legării sale de oligomeri, în condiții de izolare. De exemplu, dacă oligomerii trebuie să servească drept primeri pentru transcrierea sau replicarea secvențelor HCV țintă într-un amalit polinucleotidă, oligomerii vor conține o regiune polinucleotidică de lungime și complementaritate suficientă față de secvența HCV țintit, pentru a permite ca agentul de polimerizare să continuie replicarea de la primerii care sunt sub formă de duplexuri stabile cu secvența țintă, în condiții de polimerizare. De exemplu, de asemenea, dacă oligomerii urmează a fi utilizați ca probe de marcare sau urmează a fi legați de multimeri, regiunea polinucleotidică țintită va fi de lungime și complementaritate suficientă pentru a forma o structură duplex hibridă stabilă cu probele de marcare și/sau cu multimerii, pentru a permite detectarea duplexului. Oligomerii pot conține un minimum de circa 4 nucleotide învecinate care sunt complementare la o secvență HCV țintită; în mod uzual, oligomerii vor conține un minimum de 8 nucleotide învecinate, care sunt complementare la secvența HCV țintită și preferabil va conține un minimum dc circa 14 nucleotide învecinate casre sunt complementare la secvența HCV țintită.

Secvențele HCV nucleotidice țintitoare adecvate pot fi alcătuite din nucleotide care sunt nucleotide complementare selectate dintre nucleotidele HCV cADN și care sunt prezentate în fig.l. Totuși, oligomerul nu are nevoie șSrezide din secvența care este complementară la secvența HCV țintită. Aceasta poate să conțină, în plus, secvențe polinucleotidice sau alte porțiuni care sunt potrivite pentru scopurile pentru care sunt utilizați oligomerii. De exemplu, dacă oligomerii sunt utilizați drept primeri pentru amplificarea secvențelor HCV prin intermediul PCR, aceștia pot conține secvențe care, atunci când sunt în duplex, formează situsuri de restricție a enzimelor care facilitează donarea secvențelor amplificate. De exemplu, de asemenea, dacă oligomerii urmează să fie folosiți ca probe de captură în determinările de hibridizare (descrise mai jos) aceștia vor conține în plus un partener de legare, care este cuplat la oligomerul conținând secvența de nucleotidă, care este complementară la secvența HCV țintită. Alte tipuri de porțiuni sau secvențe care sunt utile și care pot face parte din alcătuirea oligomerilor sau să fie cuplate la aceștia sunt cele care sunt cunoscute în domeniul de specialitate ca fiind adecvate pentru o diversitate de scopuri, incluzând marcarea probelor de nucleotide.

Prepararea oligomerilor se face prin mijloace cunoscute specialiștilor în domeniu, incluzând, de exemplu metoda care include excizia, transcrierea sau sinteza chimică, secvențele țintă și/sau regiunile genomului, care sunt selectate ca fiind cele la care sunt complementare, polinucleotidele țintitoare ale oligomerilor depind de scop. De exemplu, dacă țelul este de a testa prezența de HCV în probe biologice (de exemplu, sânge), oligomerii preferați vor fi utilizați drept probe și/sau primeri și vor hibridiza la regiunile conservate ale genomului HCV. Unele din regiunile conservate ale genomului la care se pot lega oligomerii sunt descrise în cele de față, de exemplu, regiunile care includ numere de nucleotide de la circa 5-terminali la circa 200, sau de Ia circa 4000 la circa 5000 sau de la circa 8000 la circa 9000, așa cum se arată în fig.l, sau preferabil nucleotide circa -318 la circa 174, circa 4056 la circa 4448, și circa 4378 la circa 4902. Primerii și probele preferate în mod deosebit sunt derivate de la circa -313 la circa -173 și de la nucleotida 1 la circa 540, așa cum se arată în fig.l- AltS* regiuni ale genomului care sunt conservate, sunt ușor de stabilit prin compararea secvențelor nucleotidelor a diverse izolate HCV, incluzând prototipul HCV, HCV1. Metodele pentru conducerea comparației între genotipuri pentru a determina regiuni conservate sau neconservate sunt cunoscute în domeniul de specialitate, și exemple ale acestor metode sunt dezvăluite în publicația PCT nr. WO80/14436. în detenninarea hibridizării de bază a acidului nucleic, este hibridizat un acid nucleic analit monocatemar (fie ADN, fie ARN) la o probă de acid nucleic, și sunt detectate duplexurile rezultate. Probele pentru nucleotidele HCV (naturale sau derivate) sunt de lungime care permite detectarea secvențelor virale unice prin hibridizare. Pe când 6-8 nucleotide pot fi o lungime prelucrabilă, secvențe de 10-12 nucleotide sunt preferate, și circa 20 nucleotide sau mai mult apar a fi opționale. Preferabil, aceste secvențe vor deriva de la regiuni care sunt lipsite de heterogenitate. Aceste probe pot fi preparate utilizând metode de rutină, incluzând metode automate de sinteză nucleotidică. Pentru probele utile, de exemplu, sunt cele derivate de la cloni proaspăt izolați aici, ca și diverșii oligomeri utili în cercetarea băncilor cADN, expuse în invenție. Un complement la orice porțiune unică a genomului HCV va fi satisfăcător. Pentru utilizare drept probe, este de dorit o complementaritate completă, deși s-ar putea să fie lipsită de necesitatea în măsura în care lungimea fragmentului este crescută. Pentru utilizarea unor astfel de probe, drept agenți pentru a detecta prezența polinucleotidelor HCV(de exemplu, testarea pentru sânge contaminat), probele biologice pentru analizat, cum ar fi, sânge sau ser, pot fi tratate, dacă se dorește, pentru a extrage acizii nucleici pe care îi conțin. Acizii nucleici rezultați din probă pot fi supuși electroforezei pe gel sau altor tehnici de separare dimensionată, într-o alternativă, proba de acid nucleic poate fi absorbită punctiform, fără separarea dimensională. Pentru a forma duplexuri hibride cu secvențe țintitoare ale probei, regiunea țintită a acidului nucleic analit trebuie să fie în formă monocuatemară. Acolo unde secvența este prezentă în mod natural în formă monocatenară, nu va fi necesară denaturarea. Totuși, acele unde secvența este prezentă în formă dublucatenară, secvența va fi denaturată. Denaturarea poate fi realizată prin diverse tehnici cunoscute specialiștilor. După denaturare, acidul nucleic analit și proba sunt incubate în condiții care favorizează formarea de hibrid stabil a secvenței țintă din probă cu secvența țintită presupusă din analit și sunt detectate duplexurile rezultate care conțin proba (probele). Detectarea duplexului rezultat, dacă există, este realizată în mod obișnuit prin utilizarea de probe marcate; alternativ proba poate fi nemarcată, dar poate fi detectabilă prin legarea specifică cu un ligand care este marcat, fie direct, fie indirect. Marcatorii adecvați și metode pentru marcarea probelor și liganzilor sunt cunoscute în domeniul de specialitate și includ, de exemplu, marcatorii radioactivi care pot fi încorporați prin metode cunoscute (de exemplu, translație prin retezare sau kinazare), bioțintă, grupări fluorescente, grupări chemiluminiscente (de exemplu, dioxietani, mai ales dioxietani activați) enzime, anticorpi și alți asemenea. Regiunile din probe care sunt utilizate pentru a se lega de analit pot fi făcute complet complementare la genomul HCV. Prin urmare, în mod obișnuit, pentru a preveni rezultatele false pozitive, este de dorit să fie condiții de exigență înaltă. Totuși, condiții de înaltă exigență se vor utiliza numai dacă probele sunt complementare la regiuni ale genomului viral, care sunt lipsite de heterogenitate. Exigența hibridizării este determinată de un număr de factori pe timpul hibridizării și pe timpul procedurii de spălare, factorii incluzând temperatura, tăria ionică, durata de timp și concentrația de formaldehidă. Acești factori sunt descriși în linii generale în literatura de specialitate. Se pot utiliza, de asemenea, variații ale acestei scheme de bază, care sunt cunoscute specialiștilor, incluzând pe cele care facilitează separarea duplexurilor de detectat de materialele de prins și/sau amplifică semnalul de la porțiunea de marcare. Probele adecvate pentru detectarea HCV în aceste determinări sunt alcătuite din secvențe care hibridizează cu secvențele polinucleotidice HCV țintă, pentru a forma duplexuri cu catena analit, în care duplexurile sunt de stabilitate suficientă pentru detectare în sistemul specific de determinare. Este cunoscută determinarea de hibridizare de acid nucleic în gază de soluție, în care acidul nucleic analit este hibridizat la un set probă de marcare și la un set probă de captare. Complexul probă analit este cuplat prin hibridizare cu o probă de captare, pe suport solid, complementar la setul probă de captare. Acest fapt permite ca acidul nucleic analit să fie îndepărtat din soluție sub formă de complex în fază solidă. Având analitul sub forma unui complex în fază solidă, sunt facilitate etapele ulterioare de separare din determinare. Setul probă de marcare este complementar la o probă marcată, care este legată prin hibridizare la complexul fază solid/analit. în general, este de așteptat ca secvențele de genom HCV să fie prezente în setul indivizilot infectați la niveluri relativ scăzute, adică la aproximativ IO² - IO³ doze infecțioase de cimpanzeu(CID) pe ml. Acest nivel poate necesita utilizarea de tehnici de amplificare în determinările de hibridizare. Astfel de tehnici sunt cunoscute de specialiști. De exemplu, sistemul care utilizează deoxinucleotid transferază terminală pentru a adăuga cozi 3'-poli-dT la o probă de ADN. Proba cu coadă poli-dT este hibridizată la secvența nucleotidică țintă și apoi la o poli-A modificată cu biotină. Este cunoscută o determinare de hibridizare ADN în care:(l) analitul este consolidat la o probă ADN, monocatenară, care este complementară la oligonucleotidă marcată enzimatic și (2) duplexul cu coadă rezultat este hibridizat la o oligonucleotidă marcată enzimatic. Se cunoaște, de asemenea, o determinare de hibridizare ADN, în care ADN-ul analit este cu o probă care are o coadă, cum ar fi, o coadă poli-dT, o catenă amplificatoare care are o secvență cart hibridizează la coada probei, cum ar fi, o secvență poli-A și care este capabilă să lege o pluritate de catene marcate. Un tip de determinare de hibridizare este acela care trebuie să detecteze secvențele la nivelul de aproximativ 16⁶ ml, utilizează muldmeri de acid nucleic care se leagă la un acid nucleic analit monocatenar și care, de asemenea, se leagă la o multitudine de oligonucleotide marcate monocatenare. O tehnică deosebit de dezirabilă poate implica amplificarea secvențelor HCV ținta în ser de aproximativ 10000 ori (adică la aproximativ IO⁶ secvențe/ml ca parte a sistemului de hibridizare. Amplificarea poate fi dusă la bun sfârșit, de exemplu, prin reacții în lanț ale polimerazei(PCR). Amplificarea poate fi anterioară sau ulterioară purificării secvenței țintă HCV. De exemplu, amplificarea poate fi utilizată în legătură cu metodele de determinare, sau dacă se dorește o amplificate în plus, în legături cu sistemul de hibridizare. Metodele preferate pentru detectarea secvențelor HCV într-o catenă polinucleotidică de analit sunt bazate pe metode de detectare a hibridizării. Aceste metode sunt determinări de hibridizare sandvici în fază de soluție, care utilizează atât probele de captare, cât și pe cele de marcare, care hibridizează la secvențe țintă într-un analit de acid nucleic. în utilizarea acestor determinări pentru testarea probelor biologice pentru HCV, probele utilizate se vor lega la regiuni conservate ale genomului HCV.

Probele de captură și de marcare pot fi întrepătrunse de legarea lor în secvența țintă. în mod alternativ, într-un mod preferat probele de captură și de marcare sunt sub formă de seturi, și probele unuia dintre seturi nu se întrepătrund cu probele altui set. în modul din urmă, preferabil, seturile de probă de captură multiple hibridizează la cele mai multe dintre regiunile conservate ale genomului, pe când seturile de probe de marcare multiple pot hibridiza la regiunile care prezintă mici cantități de divergențe. De exemplu, utilizând secvența prototip HCV1 cADN, arătată în fig.l, pot fi utilizate probe care hibridizează la secvențe în regiunea de nucleotide de la circa -318 la circa 174, și/sau de nucleotide în regiunea de la circa 4378 la circa 4902 și/sau de nucleotide în regiunea de la circa 4056 la circa 4448. Probele preferate vor hibridiza la secvențe în regiunea 5' a genomului HCV, pe când așa cum s-a arătat mai sus, această regiune apare a fi înalt conservată. Astfel, probe hibridizate pot fi hibridizate, de exemplu, la nucleotide de la circa -318 la circa 174, așa cum s-a arătat în fig.l. Pot fi utilizate probe care hibridizează fie la catena pozitivă din regiunile conservate și/sau la complementul său, funcție de scop, de exemplu pentru a detecta secvențele genomice virale, sau pentru a detecta secvențe HCV cADN, rezultând din amplificare PCR, sau pentru a detecta intermediarii replicativi la catena HCV ARN pozitivă.

Detectarea HCV și a polinucleotidelor derivate de la aceasta, utilizând o metodă

HCV/cPCR

O metodă deosebit de utilă pentru detectarea HCV ARN sau polinucleotidelor derivate de la HCV ARN este metoda HCV/cPCR, care reprezintă subiectul invenției de față și care utilizează tehnica reacției de lanț a polimerazei(PCR), care este cunoscută de cei care lucrează în domeniu. Metoda HCV/PCR utilizează primeri și probe derivate de la informația oferită privind natura genomului HCV.

în general, în tehnica PCR, sunt preparați primeri oligonucleotidici scurți, care se potrivesc cu capetele opuse ale unei secvențe dorite. Secvența dintre primeri nu este nevoie să fie cunoscută. O probă de polinucleotidă este extrasă și denaturată, preferabil prin încălzire, și este hibridizată cu primeri oligonucleotidici care sunt prezenți în exces molar. Polimerizarea este catalizată de o polimerază templat- și primer- dependentă în prezența de dezoxinucleotid trifosfați sau analogi nucelotdici(DNTPa). Acest lucru duce la obținerea a două produse lungi, care conțin primerii respectivi la capetele -5', legate covalent la complementele proaspăt sintetizate ale capetelor originale. ADN-ul replicat este denaturat din nou, este hibridizat cu primeri oligonucleotide, esre readus în condiții de polimerizare și este inițiat ca al doilea ciclu de replicare. Cel de al doilea ciclu duce la obținerea a celor două catene originale a celor două produse lungi din ciclul 1, și două produse scurte replicate din produsele lungi. Produsele scurte conțin secvențe (sens sau antisens) derivate de la secvența țintă flancată la capetele 5' și 3' - cu secvențe primer. La fiecare ciclu adițional, numărul de produse scurte este replicat exponențial. Astfel, acest procedeu produce amplificarea unei secvențe țintă specifice.

în metodă este prevăzută o probă care este suspectată a conține HCV ARN sau un fragment al acestuia. Proba este luată, în mod uzual, de la un individ suspect de a avea NANBH. Totuși, sunt incluse și alte surse de probe, de exemplu, mediu condiționat sau celule din sistem in vitro, în care a fost replicat virusul. Totuși, proba trebuie să conțină secvența(secvențele) țintă de acid nucleic. Proba este supusă apoi unor condiții care permit transcrierea reversă a HCV ARN în HCV cADN. Condițiile pentru transcrierea reversă a ARN sunt cunoscute specialiștilor în domeniu. O metodă preferată de transcriere reversă utilizează revers transcriptaza de la o varietate de surse, incluzând molecule recombinate și izolați din, de exemplu, un retrovirus, preferabil de la virus mieloblastozei păsărilor(AMV) și condiții adecvate pentru transcriere. Produsul HCV cADN al transcrierii reverse este sub forma unui hibrid ARN:ADN, care rezultă din primul ciclu de transcriere reversă: ulterior, hibrizii ADN+ADN rezultă din două sau mai multe cicluri de transcriere. HCV cADN-ul, rezultând din transcriere reversă este supus apoi la PCR, pentru a amplifica secvența țintă. Pentru a realiza aceasta, HCV cADN-ul este denaturat și catenele separate sunt hibridizate cu primeri care flanchează secvența țintă. Separarea de catenă poate fi realizată prin orice metodă potrivită de denaturare, incluzând căi fizice, chimice sau enzimatice, care sunt cunoscute specialiștilor. O metodă preferată, care este fizică, implică încălzirea acidului nucleic până este complet(90%) denaturat. încălzirea tipică de denaturare implică temperaturi situându-se în intervalul de la circa 80°C la circa 105°C, și pentru un timp situându-se în intervalul de la circa 1 la 10 min. După hibridizarea HCV cADN-ului cu primerii, secvențele HCV țintă sunt replicate pe o cale implicțnd polimerizare, care utilizează o oligonucleotidă primer pentru a iniția sinteza lanțului replicat. Primerii sunt selectați astfel încât aceștia sunt complementari Ia secvențe ale genomului HCV. Primerii oligomerici care sunt complementari la regiuni ale catenelor sens și antisens de HCV cADN pot fi proiectate la secvențele HCV cADN din secvența compozit cADN prezentată în fig.l. Primerii sunt selectați astfel încât pozițiile lor relative de-a lungul unei secvențe duplex sunt de așa manieră încât un produs de extensie sintetizat dintr-un primer, atunci când este separat de templatul său (complement), servește ca templat pentru extensia celuilalt primer, pentru a da un lanț replicat de lungime definită. Primerul este absolut monocatenar pentru maximum de eficiență la amplificare, dar poate fi în mod alternativ dublu catenat. Dacă este dublu catenat, primerul este tratat mai întâi pentru a separa catenele sale înainte de utilizare, pentru a prepara produși de extensie. Preferabil, primerul este o oligodezoxiribonucleotidă. Primerul trebuie să fie suficient de lung pentru a prima sinteza produșilor de extensie în prezența agentului de polimerizare. Lungimea exactă a primerilor va depinde de mulți factori, incluzând temperatura și sursa primerului, precum și utilizarea metodei. De exemplu, funcție de complexitatea secvenței țintă, primerul oligonucleotidic conține circa 15...45 nucleotide, deși poate conține mai puțin sau mai multe nucleotide. Moleculele primer scurte cer, în general, temperaturi mai scăzute, pentru a forma complexe hibrid suficient de stabile cu templatul. Primerii utilizați sunt selectați pentru a fi în cea mai mare parte complementari la diferitele catene ale fiecărei secvențe specifice, de amplificat. Prin urmare, primerii nu trebuie să reflecte secvența exactă a templatului, dar trebuie să fie suficient de complementară pentru a hibridiza selectiv cu catenele lor respective. De exemplu, un fragment de nucleotidă necomplementar poate fi atașat la capătul 5' al primerului, cu restul secvenței de primer fiind complementară la catenă. Alternativ, baze sau secvențe mai lungi necomplementare pot fi răspândite în primer, cu condiția că primerul are suficientă complementaritate cu secvența unuia dintre catenele de amplificat, pentru a hibridiza cu aceasta și a forma astfel o structură duplex, care poate fi extinsă prin mijloace de polimerizare. Secvențele nucleotidice necomplementare ale primerilor pot include situsuri de restricție a enzimei. Atașarea unui situs a enzimei la capătul (capetele) secvenței țintă va fi un deosebit ajutor pentru donarea secvenței țintă. Se va înțelege că primer, așa cum se utilizează aici, se poate referi la mai mult de un primer, mai ales, în cazul în care există oarecare ambiguitate în informația privind secvențele temiinale țintă de amplificat, în consecință, un primer” include o colecție de oligonucleotide primer, conținând secvențe reprezentând variațiile posibile în secvență sau include nucleotide care permit o împerechere de bază tipică. Una din oligonucleotidele primer din această colecție va fi omoloagă cu capătul secvenței țintă. Un caz specific este acela în care seturile de oligomeri sunt utilizate pentru a prima amplificarea unei regiuni potențial diferită a genomului HCV. Se anticipă că va exista o varietate de specii sau izolați de HCV cu secvențe care deviază de specia prototip HCV1. Prin urmare, pentru a detecta specii variate este preferabil să se construiască primeri care hibridizează la regiuni conservate ale genomului HCV. Regiunile conservate pot fi determinate prin compararea secvențelor de nucleotidă sau aminoacid a mai multor specii/izolate HCV. Se dovedește a exista cel puțin trei regiuni de aminoacid conservate în genomul HCV descris mai sus, din care primerii pot fi derivați. Aceste regiuni se consideră că există. Primerii care sunt descriși în exemplele de realizare sunt derivați din ceea ce se crede a fi regiuni conservate ale HCV, bazate pe omologia de secvență ca aceea a Flavivirusurilor. Primerii oligonucleotidici pot fi preparați prin orice metode potrivite și cunoscute în domeniu. Metode pentru prepararea oligonucleotidelor de secvență specifică sunt cunoscute în specialitate și includ, de exemplu, clonarea și restricția secvențelor adecvate, precum și sinteza chimică directă. Metodele de sinteză chimică pot include, de exemplu, metoda cu fosforiester cunoscută, metoda cu dietilfosforamidat și metoda cu suport solid. Primerii pot fi marcați, dacă se dorește, prin încorporarea de mijloace detectabile prin metode spectroscopice, fotochimice, biochimice, imunochimice sau chimice. Extensia dependentă de templat a primerilor oligonucleoditici este catalizată de un agent de polimerizare, în prezența unei cantități adecvate din cele patru deoxiribonucleotide trifosfat (dATP, dGTP, dCTP și dTTP) sau a unor analogi, într-un mediu de reacție care este alcătuit din sărurile potrivite, cationi metalici și sistem tampon pentru pH. Agenții de polimerizare adecvați sunt enzime cunoscute a cataliza sinteza ADN-primar și templatdependentă. ADN-polimerazele includ, de exemplu, ADN-polimerază I de E.Coli sau fragmentul său Klenow, ADN polimerază T₄ și ADN polimerază Taq. Condițiile de reacție pentru catalizarea sintezei ADN cu acest ADN polimeraze sunt cunoscute persoanelor care lucrează în domeniul de specialitate. Produșii sintezei sunt molecule duplex, constând din catene de templat și catene de extensie a primerului care includ secvența țintă. Aceste produse servesc drept templat pentru un alt ciclu al replicării. în al doilea ciclu de replicare, catena de extensie a primerului din primul ciclu este consolidată cu primenii său complementar, sinteza duce la obținerea unui produs scurt, care este legat la ambele capete 5' și 3', prin secvențe primer sau complementele lor. Ciclurile repetate de denaturare, consolidarea primerului și extensia duc la o acumulare exponențială a regiunii țintă, definită prin primeri. Pentru a realiza cantitatea dorită a polinucleotidă conținând regiunea țintă de acid nucleic sunt realizate suficiente cicluri. Cantitatea dorită poate varia și este determinată de funcția pe care polinucleotidă produs o va avea. Metoda PCR poate fi condusă într-un număr de secvențe temporale. De exemplu, poate fi realizată sub formă de etape, unde, după fiecare etapă, se adaugă noi reactivi, sau într-un mod în care toți reactivii sunt adăugați ăn mod simultan, sau în mod parțial sub formă de etape în care reactivi proaspeți sunt adăugați după un număr dat de etape. într-o metodă preferată, reacția PCR este condusă sub forma unui proces automat, care utilizează o enzimă termostabilă. în acest procedeu, amestecul de reacție este ciclat printr-o regiune denaturată, o regiune de consolidare a primerului și o regiune de reacție. Se poate folosi un utilaj care este adaptat specific pentru utilizare cu o enzimă termostabilă, care utilizează ciclarea la temperatură fără sistem lichid de manipulare, întrucât nu este nevoie ca enzima să fie adăugată la fiecare ciclu. Acest tip de utilaj este accesibil din comerț. După amplificare prin PCR, polinucleotidele țintă sunt detectate prin hibridizare cu o probă polinucleotidică care formează un hibrid stabil cu cel al secvenței țintă în condiții de la exigente la moderate, de hibridizare și spălare. Dacă se așteaptă ca probele să fie complet complementare (adică circa 99% sau mai mari) la secvența țintă, se vor utiliza condiții stringente. Dacă sunt de așteptat unele nepotriviri, de exemplu, dacă este de așteptat să apară variante ale catenelor având drept rezultat faptul că proba nu va fi complet complementară, poate fi scăzută sringența hibridizării. Totuși, sunt alese condiții care elimină legarea nespecifică accidentală. Condiții care afectează hibridizarea și care selectează împotriva legării nespecifice sunt cunoscute în domeniul de specialitate. în general, concentrația mai scăzută de sare și temperaturi mai înalte cresc exigența legării. în mod uzual, se consideră că condițiile stringente sunt incubările în soluții care conțin aproximativ 0,1 x SSC, 0,1% SDS, la circa 65°C temperatură de incubare/spălare, și condițiile moderat stringent sunt incubările în soluții care conțin aproximativ 1 - 2 x SSC, 0,1% SDS la circa 50 - 65°C temperatură de incubare/ spălare. Condiții de mică stringență sunt 2 x SSC și o temperatură de circa 30 ... 50°C. Probele pentru secvențele țintă HCV pot fi derivate de la secvența HCV sADN arătată în fig.l, sau de la izolate HCV noi. Probele HCV pot fi de orice lungime adecvată care acoperă regiunea țintă, dar care exclud primerii și care permit hibridizarea specifică la regiunea țintă. Dacă este necesar să existe comple- mentalitate completă, adică dacă specia conține o secvență identică cu cea a probei, întrucât duplexul va fi relativ stabil chiar și în condiții mai exigente, proba poate fi scurtă, adică în domeniul de circa 10 ... 30 perechi de baze. Dacă este așteptat un oarecare grad de nepotrivire cu probă, adică dacă se suspectează că proba va hibridiza la o regiune vacantă, proba poate fi de lungime mai mare, întrucât lungimea pare să contrabalanseze unele dintre efectele nepotrivirii (nepotrivirilor). Acidul nucleic probă, având o secvență complementară la secvența țintă, poate fi sintetizată utilizând tehnici similare descrise mai sus, pentru sinteza secvențelor primer. Dacă se dorește, proba poate fi marcată. Marcanții adecvați sunt cei cunoscuți în domeniu. în unele cazuri, poate fi de dorit să se determine lungimea produșilor PCR detectați de către probă. Acest lucru poate fi deosebit de adevărat, dacă se suspectează că specii HCV variante pot să conțină eliminări în interiorul regiunii țintă sau dacă se dorește să se confirme lungimea produsului PCR. în astfel de cazuri, este preferabil ca produșii să fie supuși analizei dimensionale, ca și hibridizării cu proba. Metodele pentru determinarea dimensiunii acizilor nucleici sunt cunoscute în domeniul de specialitate și includ, de exemplu, electroforeza pe gel, sedimentarea în gradienți și cromatografie pe gel cu excludere. Prezența secvenței țintă într-un eșantion biologic este detectată prin determimnarea dacă un hibrid s-a format între proba polinucleotidică de HCV și acidul nucleic supus tehnicii de amplificare PCR. Metodele pentru detectarea hibrizilor formați între o probă și o secvență de acid nucleic sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, pentru conveniență, un eșantion nemarcat poate fi transferat pe o matrice solidă la care aceasta se leagă, și eșantionul legat este supus la condiții care permit hibridizarea specifică cu o probă marcată; matricea solidă este examinată apoi pentru prezența probei marcate. Alternativ, dacă eșantionul este marcat, proba nemarcată este legată la matrice, și după expunere la condițiile adecvate de hibridizare matricea este examinată pentru determinarea prezenței marcatului. Alte determinări potrivite de hibridizare s-au descris în prezenta invenție.

Determinarea variantelor secvențelor HCV utilizând PCR

Pentru a identifica speciile HCV diferite de tipul caracteristic, și prin aceasta pentru a desemna probele pentru aceste variante, este utilizată metoda HCV/cPCR pentru a amplifica regiuni variate ale genomului HCV, astfel încât secvențele de nucleotide ale acestor variante de regiuni țintă pot fi determinate. în general, tipurile variante de HCV se pot aștepta să se ivească în localizări geografice diferite față de cele în care este predominant specia HCV1, de exemplu Japonia, Africa etc.; sau la diferite specii de vertebrate care sunt, de asemenea, infectate cu virusul acesta. HCV-urile diferite de tipul caracteristic pot să apară, de asemenea, în timpul trecerii în sisteme de cultură tisulară sau să fie rezultatul mutațiilor spontane sau induse. Pentru a amplifica variantele de regiuni țintă, primerii sunt desemnați pentru a flanca regiunea suspectată și, preferabil, sunt complementari la regiuni conservate. Primerii la două regiuni ale HCV, care sunt probabil conservați, bazat pe modelul Flavivirus. Acești primeri pot fi desemnați utilizând informații de secvență pentru specia HCV1 prezentată în fig.l. Analiza secvenței de nucleotidă țintă se poate face prin analiză directă a produșilor PCR amplificați. Un procedeu pentru analiza directă a produșilor amplificați este cunoscut în domeniul de specialitate. Alternativ, secvențele țintă amplificate pot fi donate înainte de analiza de secvență. O metodă pentru donarea directă și analiza de secvență a segmentelor genomice amplificate enzimatic, de asemenea, este descrisă în domeniul de specialitate. în metodă, primerii utilizați în tehnica PCR sunt modificați în apropierea capetelor lor 5 pentru a produce situsuri de restricție convenabile pentru donare directă, într-un exemplu, vector M13 de secvențiere. După amplificare, produșii PCR sunt scindați cu enzimele de restricție adecvate. Fragmentele de restricție sunt legate în vectorul Ml 3 și transformate, de exemplu, într-o gazdă JM 103, întinse pe plăcuțe; și plăcuțele rezultate sunt testate prin hibridizare cu o probă oligonucleotidică marcată. Metoda pentru donare și analiză de secvență sunt cunoscute în tehnica de specialitate.

PrimeriiuniversalipentruFlavivirusuri și pentru HCV

Studiile naturii genomului de HCV, utilizând probe derivate de la HCV cADN, ca și informațiile de secvență conținute în HCV cADN, sunt sugestive pentru faptul că HCV este un virus de tip Flavi. O comparație între secvența HCV, derivată de la clonii HCV cADN cu secvențele cunoscute ale unui număr de Flavivirusuri arată că HCV conține secvențe care sunt omoloage la secvențele conservate din Flavivirusuri. Aceste secvențe conservate pot permite crearea de primeri care pot fi universali în aplicarea lor pentru amplificarea de regiuni țintă ale Flavivirusurilor și pentru HCV. Identificarea speciilor este astfel realizată utilizând o probă specifică pentru specii. Genomii unui număr de Flavivirusuri sunt cunoscuți în domeniul de specialitate și includ, de exemplu, virusul Japonez al encefalitei, virusul febrei galbene, virusul Dengue de Tip 2, virusul Dengue de Tip 4 și virusul West Nile. Identificarea HCV ARN este realizată utilizând o probă specifică pentru HCV, a cărei secvență poate fi determinată din secvențele HCV cADN prevăzute. Alternativ, utilizarea de seturi de probe desemnate să dea explicație pentru degenerarea codonului și care, prin urmare, conțin secvențe comune Flavivirusurilor și HCV-ului, așa cum s-a determinat prin comparația secvențelor de aminoacizi ale HCV cu secvențele cunoscute ale Flavivirusurilor, permit introducerea unui sistem general de detectare pentru aceste virusuri.

Construcția secvențelor ADN dorite

Oligonucleotide sintetice pot fi preparate utilizând un sintetizator automat de oligonucleotide. Dacă se dorește, catenele sintetice pot fi marcate cu 32_p prin tratarea ci polinucleotid kinază în prezență de 32p__ATP, utilizând condiții standard pentru reacție. Secvențele ADN, incluzând pe cele izolate din băncile cADN, pot fi modificate prin tehnici cunoscute, incluzând, de exemplu, mutageneză direcționată spre situs, așa cum se cunoaște din literatura de specialitate. Pe scurt, ADN-ul de modificat este introdus într-un fag de forma unei secvențe monocatenare și este convertit la un ADN dublu catenar cu ADN polimerază, utilizând drept primer o oligonucleotidă sintetică complementară la porțiunea din ADN de modificat și având modificarea dorită inclusă în propria sa secvență. ADN-ul dublu catenar rezultat este transformat într-un fag pe suport de bacterie gazdă. Culturile bacteriilor transformate, care conțin replicări ale fiecărei catene ale fagului, sunt întinse încorporate în agar, pentru a se obține plăci. Teoretic, 50% din plăci conțin fag, având secvențe mutate și restul de 50% are secvența originală. Replicatele de pe plăci sunt hibridizate la probe sintetice, la temperatură și condiții care permit hibridizarea cu catena corectă, dar nu cu secvența modificată. Secvențele care au fost identificate prin hibridizare sunt recuperate și donate.

Truse pentru testarea prezenței polincleotidelor derivate de la HCV

Oligomerii care sunt probe și/sau primeri pentru amplificare și/sau testarea eșantioanelor pentru prezența HCV pot fi reuniți în truse. Trusele pentru testarea 5 prezenței secvențelor HCV includ probe de ADN-uri oligomerici. Trusele pentru amplificarea HCV pot include primeni oligomerici utilizați în amplificare. Trusele conțin, în mod . obișnuit, probele sau primerii într-o cantitate 10 premăsurată sau predeterminată ca și alți reactivi și materiale potrivite necesare pentru hibridizarea și/sau amplificarea particulară. De exemplu, trusa poate conține standarde, tampoane, suporturi, enzime, substraturi, probe 15 de marcare, parteneri de legare și/sau instrucțiuni de utilizare a testului de determinare.

Claims (5)

1. Procedeu pentru detectarea secvenței de HCV într-o secvență suspectată a conține o polinucleotidă, care cuprinde o regiune țintă, selectată, caracterizat prin aceea că cuprinde 25 obținerea unui oligomer de țintire capabil să hibridizeze la o secvență țintită HCV într-o catenă polinucleotidică de analizat, în care oligomerul conține o secvență polinucleotidică, selectată din grupul constând din oligo- 30 nucleotide complementare Ia următoarele regiuni ale genomului HCV (ca în fig.l): 1645,49-78, 82-111,115-144,148-177,211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 și 457-486; incubarea secvenței de analizat cu 35 oligomerul de mai sus, care permite să se formeze duplexuri hibride specifice între o secvență de oligonucleotid și secvența țintă; detectarea hib rizilor formați, dacă există, între regiunea țintă și oligomer. 40

2. Procedeu, conform revendicării 1, în cadrul căruia regiunea țintă necesară a fi detectată este amplificată de reacția în lanț a polimerazei, caracterizat prin aceea că cuprinde: obținerea primului și celui de-al 45 doilea oligomer primar, care sunt primari în reacția în lanț a polimerazei și care flanchează regiunea țintă selectată, în care regiunea ți ntă selectată cuprinde o regiune a genomului HCV, ales din grupul constând (ca în fig.l): 16-45, 50

49-78, 82-111, 115-144, 148-177, 2112-240, 242-271,275-304, 332-361, 365-394, 398-427, 457-486; amplificarea regiunii țintă printr-o metodă de reacție în lanț a polimerazei, în scopul de a obține secvențe de analizat amplificate polinucleotidă; incubarea secvențelor de analizat, amplificate cu oligomerul reactiv, cuprinzând oligonucleotide de țintire, care permit dublexurilor de hibrizi specific să se formeze între secvența de țintire și regiunea țintită; detectarea hibrizilor formați între regiunea amplificată țintă, dacă există, și oligomerii de țintire.

3. Procedeu, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizat prin aceea că, pentru eliminarea sângelui contaminat cu HCV dintr-o alimentare cu sânge de la donatorii individuali, cuprinde: obținerea de acizi nucleici de analizat dintr-un eșantion de sânge, suspectat a conține o secvență țintă de HCV; obținerea unui oligomer de țintire capabil să hibridizeze la o secvență HCV țintă într-o secvență polinucleotidă, în care oligomerul conține o secvență de țintire, selectată din grupul constând din oligonucleotide complementare cu următoarele regiuni ale genomului HCV (ca în fig.l): 1645, 49-78, 82-111, 115-144,148-177,211-240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 și 457-486; reacționarea acizilor nucleici de analizat cu oligomerul de țintire, în condiții care permit formarea unui duplex polinucleotidic între oligomerul de țintire și regiunea țintă, dacă există; detectarea unui duplex format prin reacție, dacă există; eliminarea sângelui, în care duplexurile.au fost detectate.

4. Reactiv pentru detectarea secvenței de HCV într-o secvență suspectată a conține o polinucleotidă, care cuprinde o regiune țintă selectată, caracterizat prin aceea că conține o oligonucleotidă având o secvență complementară la o regiune a genomului HCV, selectată din grupul constând din nucieotidele: 16-45, 49-78, 82-111, 115-144, 148-178, 211240, 242-271, 275-304, 332-361, 365-394, 398-427 și 457-486 (ca în fig.l).

5. Reactiv, conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că oligonucleotidă este marcată cu izotopi radioactivi, pentru a detecta hibrizi în procedeele descrise în revendicările 1,2 sau 3.