JP3698520B2 - Ｎａｎｂｖの診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド - Google Patents

Ｎａｎｂｖの診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス(NANBV)感染の蔓延を管理するための材料および方法に関する。より詳細には、生物学的試料中のＣ型肝炎ウイルス(HCV)の検出のためのアッセイに有用な、非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH)の病原体であるHCV、およびそのポリヌクレオチドおよび誘導体に関する。
【０００２】
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【０００３】
引用される特許
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米国特許第4,399,121号
米国特許第4,427,783号
米国特許第4,444,887号
米国特許第4,466,917号
米国特許第4,472,500号
米国特許第4,491,632号
米国特許第4,493,890号
米国特許第4,683,202号
米国特許第4,458,066号
米国特許第4,868,105号
【０００４】
【従来技術】
非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH)は、ウイルスにより引き起こされると考えられる伝染性あるいは家族性疾病であり、既知の肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス(HAV)、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)、デルタ肝炎ウイルス(HDV)およびサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)により引き起こされる肝炎を含む、他のウイルス性肝炎と区別がつかない。NANBHは最初、輸血を受けた個体に同定された。ヒトからチンパンジーへの伝染、およびチンパンジーでの連続継代は、NANBHが伝染性の病原体あるいは複数の病原体によることの証拠を提供した。
【０００５】
疫学的証拠は、NANBHには次の３つのタイプがあることを提示する。すなわち、水伝播性流行型；血液あるいは針に関連する型；および散発的に起こる(集団性)型である。しかし、NANBHの原因となり得る病因の数は不明である。
【０００６】
これまでに多数のNANBVの候補が挙げられている。例えば、Prince(1983)、FeinstoneおよびHoofngle(1984)、およびOverby(1985，1986，1987)による総説およびIwarson(1987)による文献を参照のこと。しかし、これらのどの候補も、NANBHの病原体であることを示す証拠はない。
【０００７】
NANBVのキャリヤーおよびNANBVに汚染された血液あるいは血液製剤をスクリーニング、および同定するための、感度が高く特異的な方法の必要性は重大である。輸血後肝炎(PTH)は輸血された患者の約10％に起こり、NANBHはこれらの90％を占める。この疾病の主要な問題は、慢性的な肝臓の損傷(25〜55％)にしばしば進行することである。
【０００８】
患者の処置、および血液および血液製剤によるNANBHの伝染、あるいは密接な個体間の接触によるNANBHの伝染は信頼性のある、スクリーニング、診断および予後診断のための、NANBVに関連する核酸、抗原および抗体の検出の道具を必要とする。
【０００９】
ハイブリダイゼーションアッセイにより特異的ポリヌクレオチドを検出する方法は当該分野で知られている。例えば、MatthewsおよびKricka(1988), Analytical Biochemistry 169:1；Landegreら(1988), Science 242:229；およびMittlin(1989), Clinical Chem. 35:1819、1989年９月発行の米国特許第4,868,105号および欧州特許公開第225807号(1987年６月16日公開)を参照のこと。
【００１０】
出願人は新たなウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスを発見し、これが血液伝播性NANBH(BB-NANBH)の主要な病原体であることを証明した。プロトタイプHCV株CDC/HCV1(HCV1とも呼ばれる)のゲノムの部分配列を含む、出願人の最初の仕事は欧州特許公開第318216号(1989年５月31日公開)およびPCT公開第WO89/04669号(1989年６月１日公開)に記載されている。これらの特許出願の開示およびすべてのこれらに対応する国内出願を本願明細書に参考として援用する。これらの出願は、とりわけ、HCV配列をクローニングする組換えDNA法、HCVプローブによる診断法、および新しいHCV配列の単離法を教示する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
NANBHのスクリーニング、診断および予後診断のための、NANBVに関連する核酸、抗原および抗体の検出の道具を提供する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、欧州特許公開第318216号およびPCT公開第WO89/04669号に記載のHCV配列および本文に記載の他のHCV配列に基づく。ハイブリダイゼーションによる特異的ポリヌクレオチドの単離法および/または検出法は、出願人によってHCVが発見されるまで、HCVのスクリーニングに用いることはできなかった。従って、本発明の１つの観点は、分析物であるヌクレオチド鎖中のHCV配列にハイブリダイズすることができるオリゴマーであり、ここで、オリゴマーは図２３〜４７に示すHCV cDNAの少なくとも４個の連続するヌクレオチドに相補する、HCVを標的とする配列を包含する。
【００１３】
本発明の他の観点は、HCVポリヌクレオチドを含むと考えられる分析物である鎖中のHCV配列を検出する過程であり、ここでHCVポリヌクレオチドは選択された標的部分を包含し、上記過程は以下の過程を包含する。
(ａ)分析物ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列にハイブリダイズ可能なオリゴマーを提供する過程であり、ここで、オリゴマーは図２３〜４７に示すHCV cDNAの少なくとも４個の連続するヌクレオチドに相補する、HCVを標的とする配列を包含する過程、
(ｂ)標的する配列と標的される配列との間の特異的ハイブリッド二重鎖を形成させる、分析鎖を(ａ)のオリゴマーとともにインキュベートする過程、および
(ｃ)標的部分および前記オリゴマーとの間に形成されたハイブリッドを、もし存在するならば、これを検出する過程。
【００１４】
さらに本発明の他の観点はHCVに汚染されていない血液を調製する方法であり：
(ａ)HCV標的配列を含むと疑われる血液試料からの、分析する核酸を提供する方法；
(ｂ)分析ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列に、もし存在するならば、ハイブリダイズ可能なオリゴマーを提供する方法であり、ここで、オリゴマーは、HCV RNAに保持されるHCVヌクレオチド中に存在する、少なくとも８個のヌクレオチド配列に相補するHCVを標的する配列に含まれる、方法；
(ｃ)標的する配列と、もし存在するならば、標的される配列との間のポリヌクレオチド二重鎖を形成させる条件下で(ａ)を(ｂ)に反応させる方法；
(ｄ)もし存在するならば、(ｃ)で形成された二重鎖を検出する方法；および
(ｅ)(ｄ)で二重鎖が検出されなかった血液を貯蔵する方法；
を包含する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」(HCV)は、非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH)の従来未知であった病原性物質に対して、当業者が保留していたものである。HCVのプロトタイプ単離株は、米国特許出願第122,714号に同定されている(欧州特許公開第318,216号も参照のこと)。用語HCVは、それと同じウイルス種の新しい単離株もまた包含する。この用語の延長として、HCVによって引き起こされ、以前には血液伝播性NANB肝炎(BB-NANBH)と呼ばれていた疾病は、現在Ｃ型肝炎と呼ばれている。用語NANBHおよびＣ型肝炎は、本明細書では互換可能に用いられ得る。
【００１６】
HCVは、その病原性株がBB-NANBHを引き起こす、ウイルス種である。それから誘導された弱毒化株あるいは欠損干渉粒子でもあり得る。以下に示すように、HCVゲノムはRNAから構成される。RNAを含むウイルスは、比較的高い割合で突然変異を有することが知られている。すなわち、取り込まれるヌクレオチド当り、10-3から10-4オーダーと報告されている(Fields & Knipe(1986))。従って、RNAウイルス中では遺伝子型の異質性や流動性が受け継がれるため、HCVの種の中には毒性あるいは無毒性などの多数の株/単離株がある。本明細書に記載の組成物および方法によって、種々のHCV株あるいは単離株の、増殖、同定、検出、および単離が可能となる。
【００１７】
HCVの幾種類かの異なる株/単離株が同定されている(以下参照)。プロトタイプであるこのような株あるいは単離株の１つは、CDC/HCV1と呼ばれている(HCV1とも呼ばれている)。ゲノムの部分配列のような、１つの株あるいは単離株から得られる情報は、当業者が標準法を用いて新しい株/単離株を単離し、そしてそのような新しい株/単離株がHCVであるかどうかを同定するのに十分に役立つ。例えば、いくつかの異なった株/単離株が以下に示してある。数多くのヒト血清(そして異なる地理的地域)から得られたこれらの株は、HCV1のゲノムの配列から得られた情報を利用して単離された。
【００１８】
欧州特許公開第318,216号および以下に記載の技術を用いて、HCV1ゲノムのRNAのゲノムの構造およびヌクレオチド配列が予想された。このゲノムは、10,000ヌクレオチドを含む一本鎖のRNAであることが判っている。このゲノムは、正鎖であり、そして約3,000アミノ酸のポリタンパク質をコードする、連続する翻訳オープンリーディングフレーム(ORF)を有している。ORF中では、大部分のポリペプチドタンパク質が非構造タンパク質を担っており、構造タンパク質(単数あるいは複数)は、Ｎ末端領域の最初の約1/4にコードされているように見える。全ての既知のウイルスの配列と比較した場合、フラビウイルスのファミリーの非構造タンパク質、そしてペスチウイルス(これはいまではフラビウイルスのファミリーであると考えられている)と、小さいが十分なコリニアーの相同性が観察される。
【００１９】
フラビウイルスのポリペプチドタンパク質(例として黄熱ウイルス)の可能な領域の概略図およびHCVゲノムの主要なORFにコードされる、推定のポリペプチドタンパク質を図５１に示す。この図では、HCVポリタンパク質の考えられるドメインを示してある。フラビウイルスポリタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向へ、ヌクレオキャプシドタンパク質(Ｃ)、マトリックスタンパク質(Ｍ)、エンベロープタンパク質(Ｅ)、および非構造タンパク質(NS)１、２(a+b)、３、４(a+b)、および５を含む。HCV1のヌクレオチド配列中にコードされる推定のアミノ酸に基づいて、HCVポリタンパク質のＮ末端にある小さなドメインは、フラビウイルスポリタンパク質のＮ末端に見出されるヌクレオキャプシドタンパク質(Ｃ)と、大きさおよび塩基性残基の高い含有率が類似しているように見える。HCVおよび黄熱ウイルス(YFV)の非構造タンパク質２、３、４、および５(NS2〜NS5)は、アミノ酸配列は異なっているが、類似の大きさおよび親水性の相手を有しているようである。しかし、Ｍ、Ｅ、およびNS1タンパク質を含むYFVポリタンパク質の領域に対応するHCVの領域は、配列が異なるだけでなく、大きさおよび親水性の両方もまた全く異なっている。従って、HCVゲノムの特定のドメインが本明細書では、例えばNS1あるいはNS2のように呼ばれ得るが、この命名は推定であることに留意するべきである。HCVファミリーとフラビウイルスとの間には、これから認識されるべき多くの違いが存在し得る。
【００２０】
HCVの異なる株、単離株、あるいはサブタイプは、HCV1と比較して、アミノ酸および核酸に改変が含まれると予想される。多くの単離株は、HCV1と比較した場合、全アミノ酸配列において相当(すなわち約40％より多い)相同性を示すと予想される。しかしながら、他のあまり相同性のないHCV単離株も見出され得る。これらは、例えば、HCV1と類似の大きさのポリタンパク質をコードする約9,000個から約12,000個のヌクレオチドのORF、HCV1と類似の疎水性および/または免疫原性の性質を有するコードされたポリタンパク質、およびHCV1に保存されているコリニアーペプチド配列の存在などの種々の基準によって、HCVであると定義される。さらに、ゲノムは正鎖RNAであると思われる。
【００２１】
全てのHCV単離株は、本明細書に記載のHCV cDNAにコードされるエピトープと免疫学的に同一(すなわち免疫学的に交差反応し得る)と見なし得る、少なくとも１つのエピトープをコードする。好ましくは、このエピトープは、本明細書に記載のアミノ酸配列中に含まれ、そして既に知られている病原体と比べた場合、HCVに特異である。エピトープの特異性は、抗HCV抗体と免疫反応性があって、そして既知の病原体に対する抗体との免疫反応性がないことで決定される。
【００２２】
HCV株および単離株は、進化論的に関連している。従って、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体的な相同性は、約40％以上であり得、おそらく50％以上であり、おそらくは60％以上であり、そしてより一般的には80％である。そして更に、少なくとも約13ヌクレオチドの連続する配列に対応する。以下に示すように、HCVゲノム中には、可変領域および超過変領域が存在することに留意すべきである。従って、これらの領域の相同性は、全体的なゲノムのそれより十分に低いことが予想される。HCV株のゲノムの推定の配列と、例えばCDC/HCV1 cDNAとの間の対応は、当業者の技術によって決定され得る。例えば、推定のHCVからのポリヌクレオチドの配列と本明細書に記載のHCV cDNA配列の情報とを直接比較することによって、決定され得る。あるいは、相同な領域で安定した二本鎖を形成する条件下(例えば、Ｓ1消化に先立って用いられる)で、ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化し、そして消化された断片の大きさを決めることによっても決定され得る。
【００２３】
HCVの株あるいは単離株の進化学的な関連により、推定のHCV株あるいは単離株は、ポリペプチドレベルでの相同性によって同定し得る。一般的に、HCV株あるいは単離株は、ポリペプチドレベルで、少なくとも40％相同であると予想されており、約50％より高く、おそらくは70％より高く、そしてより一般的には80％相同であり、およびある場合には90％より高く相同である。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列は、直接決定し得、そして本明細書に提供されている配列と比較し得る。あるいは推定のHCVのゲノムのヌクレオチド配列が決定され得(普通はcDNAを介して)、そこにコードされる推定アミノ酸が決定され得、そして対応する領域が比較される。
【００２４】
本明細書で、ある配列から「誘導された」ポリヌクレオチドとは、ある配列のヌクレオチド配列中の１つの領域と少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約10から12個のヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは少なくとも約15から20個のヌクレオチドが対応しているポリヌクレオチド配列を言う。「対応している」とは、ある配列と相同であるかあるいは相補的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが誘導された元の領域の配列は、HCVゲノムに特異的な配列と相同であるかあるいは相補的である。より好ましくは、誘導された配列は、HCV単離株のすべてあるいは大部分に特異的である配列に相同であるか相補的である。配列がHCVゲノムに特異的であるか否かは、当業者に公知の方法で決定され得る。例えば配列は、感染してない宿主あるいは他の生物に存在しているかどうかを決定するために、例えばジーンバンク(Genebank)のようなデータバンク中の配列と比較し得る。配列はまた、例えばHAV、HBV、およびHDVの様に肝炎を引き起こすウイルス物質、およびフラビウイルスのメンバーの様なウイルス物質の配列とも比較し得る。誘導された配列の他の配列に対する対応あるいは非対応は、適当にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって決定され得る。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は当該分野で公知であり、以下に述べられている。例えば、Maniatis(1982)らの文献を参照のこと。更に、ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、公知の方法で決定され得る。例えば、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖領域を特異的に消化するS1の様なヌクレアーゼによる消化が含まれる。典型的なDNA配列がそこから「誘導」され得る領域には、例えば、特異的なエピトープをコードする領域および非転写および/または非翻訳領域が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
誘導されたポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列から必ずしも自然に誘導されたものでなくてもよく、例えば、化学合成あるいはDNA複製あるいは逆転写あるいは転写を含むあらゆる方法から作成され得る。更に、明示された配列に対応する領域の組み合せを意図する用途に合うように、当該分野に公知の方法で改変し得る。
【００２６】
本明細書の用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA、半合成、あるいは合成に起源を持つポリヌクレオチドを指す。このヌクレオチドは、その起源あるいは操作によって、(１)天然では結び付いているポリヌクレオチドのすべてあるいは一部と結び付いていない、(２)天然に連結しているものとは別のポリヌクレオチドと連結しており、あるいは(３)天然には存在しない。
【００２７】
本明細書の用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー型のヌクレオチドで、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を指す。この用語は、分子の一次構造のみを指していう。従って、この用語は、二本鎖あるいは一本鎖のDNAおよびRNAを包含する。この用語はまた、例えば、当該分野に既知のラベル、メチル化、「キャップス」、天然のヌクレオチドの１あるいはそれ以上のヌクレオチドのアナログによる置換、などの既知のタイプの改変、例えば、非荷電の連結(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸塩など)および荷電の連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)の様なヌクレオチド間での改変、例えば、タンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリシンなど)の様な修飾部分を含むもの、インターカレター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)と共にあるもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力のある金属など)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結(例えばαアノマー核酸など)、および非修飾型のポリヌクレオチドなどが含まれる。
【００２８】
本明細書の用語、核酸の「センス鎖」は、mRNAと配列上の相同性を有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」と相補的な配列を含む。
【００２９】
本明細書の用語、ウイルスの「正鎖ゲノム」は、RNAであってもDNAであっても、一本鎖で、ウイルスのポリペプチド(単数あるいは複数)をコードするゲノムを指す。正鎖RNAウイルスの例には、トガウイルス科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、ピコルナウイルス科、およびカリチウイルス科が含まれる。あるいは以前はトガウイルス科にクラス分けされていたフラビウイルス科もまた含まれる。Fields & Knipe(1986)を参照のこと。
【００３０】
本明細書の用語「プライマー」は、適当な条件下におかれたとき、ポリヌクレオチド鎖の合成開始点として機能し得るオリゴマーのことを指す。プライマーは、完全に、あるいは実質的に、コピーされるポリヌクレオチドの領域と相補的である。従って、ハイブリダイゼーションを行い得る条件下で、プライマーは、分析物鎖の相補的な領域にアニールする。適当な反応剤(例えばポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェート、など)の添加によって、プライマーは、重合剤によって伸長し、分析物鎖のコピーを形成する。プライマーは、一本鎖、あるいは代わりに一部あるいは全部が二本鎖であり得る。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド分析物」および「分析物鎖」とは、標的の配列を含んでいると思われる一本鎖あるいは二本鎖の核酸分子をいい、そして生物学的試料の中に存在し得る。
【００３２】
本明細書の用語「オリゴマー」とは、プライマーおよびプローブをさす。用語オリゴマーは、分子の大きさを意味しない。しかし、典型的にはオリゴマーは、長さが1000ヌクレオチドより大きくなく、より典型的には、500ヌクレオチドより大きくなく、さらにより典型的には、250ヌクレオチドより大きくない。それは100ヌクレオチドより大きくなくそして75ヌクレオチドより大きくなく、そして50ヌクレオチドより大きくない。
【００３３】
本明細書の用語「プローブ」とは、プローブ中の少なくとも１つの標的の領域の配列との相補性によって、標的の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドを含む構造を言う。プローブのポリヌクレオチドの領域は、DNA、および/またはRNA、および/または合成ヌクレオチドアナログを含み得る。プローブには、「カプチャープローブ」および「ラベルプローブ」が含まれる。好ましくは、プローブには、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライムに使用された配列と相補的な配列は含まない。
【００３４】
本明細書の用語「標的領域」は、増幅および/または検知される核酸の領域をいう。用語「標的の配列」は、所望の条件下でプローブまたはプライマーが安定なハイブリッドを形成する配列をいう。
【００３５】
本明細書の用語「カプチャープローブ」は、結合パートナーと結合する一本鎖ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。一本鎖ポリヌクレオチドは標的のポリヌクレオチド配列からなり、それは分析物であるポリヌクレオチド中で見出される標的領域中の標的配列に相補的である。この相補的な領域は、分析物であるポリヌクレオチドを固体表面に固定するのに充分安定な二本鎖を与えるのに、充分に長く、標的配列に相補的である(結合パートナを介して)。
【００３６】
結合パートナーは、第２の結合パートナーに特有であり、その第２の結合パートナーは固体支持体の表面に結合し得るか、もしくは他の構造体または結合パートナーを介して固体支持体に直接に結合し得る。
【００３７】
本明細書で使用される、用語「標的づけるポリヌクレオチド配列」は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列をいう。その配列は充分に長く、かつ標的配列に相補的であって所望とする充分な安定性を有する二本鎖を形成する。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「結合パートナー」は、リガンド分子に高い特異性で、例えば抗原およびそれに特異的な抗体として、結合可能な分子のことを言う。一般に、特異的な結合パートナーは、単離条件下に分析物コピー/相補鎖の二本鎖(カプチャープローブの場合)を不動化するのに充分なアフィニティーで結合しなければならない。特異的結合パートナーは当該分野に公知であり、例えばビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgGおよびプロテインＡ、多くの既知のレセプター−リガンドの組合せ、および相補的なポリヌクレオチド鎖が含まれる。相補的なポリヌクレオチド結合パートナーの場合、パートナーは通常少なくとも約15塩基対の長さであり、少なくとも40塩基対の長さであり得る；それに加えて、ＧおよびＣの含有量が少なくとも約40％であり、約60％程度である。ポリヌクレオチドは、DNA、RNAまたは合成ヌクレオチドアナログを含み得る。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「結合」は、共有結合または強い非共有性相互作用による結合について言う(例えば、疎水性相互作用、水素結合等)。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄の結合等であり得る。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「支持体」は、所望の結合パートナーがアンカーし得るあらゆる固体または半固体の表面について言う。適当な支持体には、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲル等が含まれ、ビーズ、ウェル、ディップスティック、膜等の形態をとり得る。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ラベル」は、検出可能な(好ましくは定量可能な)信号を与えるために用いられ得、そして、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合可能な、あらゆる原子または部分のことを言う。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「ラベルプローブ」は、分析物ポリヌクレオチド中の検出すべき標的配列に対して相補的な、標的付けポリヌクレオチド配列を含むオリゴマーについて言う。この相補領域は、ラベルにより検出される、「ラベルプローブ」と「標的配列」とを含む二本鎖が与えられるように、標的配列に対し充分な長さおよび相補性を有する。オリゴマーはラベルに直接に、または互いに高い特異性を有する一組のリガンド分子により間接的に、結合する。高い特異性を有する一組のリガンド分子については、前述したが、多量体も含む。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「多量体」は、同一の反復一本鎖ポリヌクレオチド単位の、あるいは異なる一本鎖ポリヌクレオチド単位の、直鎖または分枝状ポリマーのことを言う。この単位のうちの少なくとも１つは、第一の目的の一本鎖ヌクレオチド配列、典型的には分析物または分析物に結合するオリゴマー(例えばラベルプローブ)に、特異的にハイブリダイズすることを可能にする配列、長さ、および組成を有する。このような特異性および安定性を達成するために、単位は通常少なくとも約15ヌクレオチドの長さであり、典型的には約50ヌクレオチド以下の長さであり、好ましくは約30ヌクレオチドの長さである；さらに、ＧおよびＣの含有量は、通常少なくとも約40％であり、せいぜい約60％である。このような単位に加えて、この多量体は、第二の目的の一本鎖ヌクレオチド、典型的にはラベルされたポリヌクレオチドまたは他の多量体に、特異的に、また、安定にハイブリダイズ可能な、多数の単位を含有する。これらの単位は一般に、前述の多量体とほぼ同じサイズおよび組成である。多量体がもう一つの多量体にハイブリダイズするように設計されている場合、第一の、および第二のオリゴヌクレオチド単位はヘテロロガスであり(相違し)、選択されたアッセイ条件下では互いにハイブリダイズしない。従って、多量体は、ラベルリガンドであり得、あるいはプローブにラベルを結合させるリガンドであり得る。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「ウイルスのRNA」にはHCV RNAが含まれるが、ウイルスゲノム由来のRNA、その断片、その転写物、およびそれに由来する変異体配列のことを言う。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「生物学的試料」は、個体から単離された組織または液体試料のことを言い、例えば血漿、血清、骨髄液、リンパ液、皮膚の外部断片、呼吸管、腸管および性尿器管、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍および器官を含み、インビトロ細胞培養物成分の試料(ウイルスに感染していると見られる細胞、組換え細胞、および細胞成分、細胞培養培地中で細胞を生育させて得られる馴化培地が含まれるが、これらに限定されない)も含むが、これらに限定されない。
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明の実施には、他に指示がなければ、当該分野の技術に含まれる化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の通常の技術が用いられる。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Maniatis、FitschおよびSambrook、MOLECULAR CLONING；A LABOLATORY MANUAL(1982)；DNA CLONING、第１巻および第２巻(D.N. Glover編、1985)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J. Gait編、1984)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、1984)；the series、METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press, Inc.)。特に第154巻および第155巻(それぞれ、WuおよびGrossman、およびWu編))。前述および後述の、本明細書で述べられている全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に参考文献として援用される。
【００４７】
本発明に有用な物質および方法は、BB-NANBVの病因因子としてのHCVの同定により、そしてHCV cDNA配列を含有するcDNAライブラリーから単離される、ヌクレオチド配列ファミリーが与えられることにより、可能となる。これらのcDNAライブラリーは、HCV感染したチンパンジーの血漿中に存在する核酸配列に由来する。これらのライブラリーの一つである「ｃ」ライブラリー(ATCC第40394号)の構築は、欧州特許公開第318,216号に記載されている。
【００４８】
本明細書に記載の配列と共に上記のHCV cDNA配列を用いることにより、生物学的試料中のウイルスのポリヌクレオチドを検出する試薬として有用な、オリゴマーが構築され得る。例えば、これらの配列から約８から10ヌクレオチドのDNAオリゴマーを合成することが可能である。このオリゴマーは、例えばウイルスを有すると思われる対象の供血、血液製剤、血清、またはウイルスが複製している細胞培養系の中の、HCV RNAの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。さらに、本明細書に記載の新規なオリゴマーは、HCVゲノムを更に特徴付けることを可能にする。これらの配列に由来するポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは、cDNAライブラリー中に存在する配列を増幅させるために、および/またはオーバーラップする他のcDNA配列のcDNA配列をスクリーニングするために用いられ得、これに続いて、さらにオーバーラップする配列を得るために使用され得る。前述、および欧州特許公開第318,216号に示された通り、HCVゲノムは、大きなポリタンパク質をコードする大きなオープンリーディングフレーム(ORF)を主として含むRNAのようである。
【００４９】
前述に加えて、後述の情報は、さらなるHCV株および分離株の同定を可能にする。さらなるHCV株および分離株の単離と特徴付けは、当業者に公知の技術を用いて行われ得る。例えば、ウイルス粒子および/またはウイルスRNAを含有するウイルス体構成成分から核酸を単離し、前述のHCV cDNA配列を含むクローンライブラリーをスクリーニングするために前述のオリゴマーを用いて、cDNAライブラリーを作成し、そして欧州特許公開第318,216号および前記のcDNAと新規分離株由来のHCV cDNAとを比較することにより、行われ得る。前述の定義部分に記載した、HCVのパラメーター内に適合する株または分離株は、容易に同定できる。HCV株を同定する他の方法は、本明細書中に示された情報に基づき、当業者に自明である。
【００５０】
HCV cDNA配列の単離
本発明のオリゴマーは、HCVポリヌクレオチド中の標的となる配列と、ハイブリッド二本鎖構造を形成する領域を含有する。オリゴマーの、HCVポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域は、本明細書中に与えられ、欧州特許公開第318,216号に記載されたHCV cDNAから確認され得る。プロトタイプHCVであるHCV1由来のHCV cDNAの複合物を、図２３〜４７に示す。この複合配列は、λgt11(ATCC第40394号)中に存在する「ｃ」ライブラリーに含まれる多数のHCV cDNAライブラリーから、およびヒト血清から単離された、多数のHCV cDNAクローンからの配列情報に基づく。HCV cDNAクローンは、欧州特許公開第318,216号に記載の方法により単離された。簡単に述べると、単離されたほとんどのクローンは、慢性HCV感染を伴い、ウイルスの高力価、即ち、少なくとも106チンパンジー感染用量/ml(CID/ml)を含有するチンパンジーからプールした血清を用いて構築されたHCV cDNA「ｃ」ライブラリーに由来する配列を含んでいた。プールされた血清は、ウイルス粒子を単離するために用いられた；これらの粒子から単離された核酸は、ウイルスゲノムに対するcDNAライブラリーを構築するための鋳型として用いられた。最初のクローンである5-1-1は「ｃ」ライブラリーを感染個体の血清でスクリーニングすることにより得られた。最初のクローンの単離の後、配列の残りの部分が、既知のHCV cDNA配列の５'領域および３'領域に由来する合成ポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングすることにより得られた。
【００５１】
cDNA配列を繕う方法の記載は、殆ど歴史的な興味がある。得られた配列(およびその相補鎖)は本明細書に提供されており、この配列またはその任意の部分が、欧州特許公開第318,216号に記載の方法と同様の方法を用いて部分配列を繕うことにより、合成法、あるいは合成法の組合せにより製造され得る。
【００５２】
オリゴマープローブおよびプライマー
HCVゲノム(図２３〜４７に示す)および/または好ましくはHCVゲノムの保存領域を用いて、HCV RNAの正鎖、およびHCV cDNAにハイブリダイズする約８ヌクレオチドまたはそれ以上のオリゴマーが調製され得る。これらのオリゴマーは、HCVヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを検出(単離および/またはラベルすることを含む)ためのプローブとして、および/または標的HCV配列の転写および/または複製のためのプライマーとして機能する。このオリゴマーは、標的となるHCVヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、標的付けられたポリヌクレオチド配列を含有する；この配列は、意図する目的のために充分な安定性を有する二本鎖を、HCV配列とハイブリダイズするのに充分な長さおよび相補性を有する。例えば、意図する目的が、固定化により、標的HCV配列を含む分析物を単離することである場合、オリゴマーは、単離条件下でオリゴマーと結合して固相表面上に分析物が不動化されるに充分な二本鎖安定性を与えるように、充分な長さと標的HCV配列に対する相補性を有するポリヌクレオチド領域を含有するであろう。また、例えば、オリゴマーが、分析物のポリヌクレオチド中の標的HCV配列を転写および/または複製するためのプライマーとして機能する場合、オリゴマーは、ポリメライズ条件下で標的配列と安定な二本鎖をつくっているプライマーからポリメライズ試薬が、連続して複製することを可能にするために、充分な長さと標的HCV配列に対する相補性を有するポリヌクレオチド領域を含有する。また、例えば、オリゴマーがラベルプローブとして用いられ、あるいは多量体に結合する場合、標的ポリヌクレオチド領域は、ラベルプローブおよび/または多量体と安定なハイブリッド二本鎖を形成するために充分な長さと相補性を有する。オリゴマーは最小約４個の連続したHCV配列に相補的なヌクレオチドを含有する；通常オリゴマーは、標的HCV配列に相補的な、連続した最小約８個のヌクレオチド配列を含有し、好ましくは、標的HCV配列に相補的な連続した最小約14個のヌクレオチド配列を含有する。
【００５３】
適切なHCVヌクレオチド標的付け配列は、図２３〜４７に示された以下のHCV cDNAヌクレオチドから選択される相補ヌクレオチドであるヌクレオチドを包含し得る(nnx-nnyは、およその番号ｘのヌクレオチドからおよその番号ｙのヌクレオチドまでを示す〉：
nn-340 - nn-330；nn-330 - nn-320；nn-320 - nn-310；nn-310 - nn-300；nn-300 - nn-290；nn-290 - nn-280；nn-280 - nn-270；nn-270 - nn-260；nn-260 - nn-250；nn-250 - nn-240；nn-240 - nn-230；nn-230 - nn-220；nn-220 - nn-210；nn-210 - nn-200；nn-200 - nn-190；nn-190 - nn-180；nn-180 - nn-170；nn-170 - nn-160；nn-160 - nn-150；nn-150 - nn-140；nn-140 - nn-130；nn-130 - nn-120；nn-120 - nn-110；nn-110 - nn-100；nn-100 - nn-90；nn-90 - nn-80；nn-80 - nn-70；nn-70 - nn-60；nn-60 - nn-50；nn-50 - nn-40；nn-40 - nn-30；nn-30 - nn-20；nn-20 - nn-10；nn-10 - nn1；nn1 - nn10；nn10 - nn20；nn20 - nn30；nn30 - nn40；nn40 - nn50；nn50 - nn60；nn60 - nn70；nn70- nn80；nn80 - nn90；nn90 - nn100；nn100 - nn110；nn110 - nn120；nn120 - nn130；nn130 - nn140；nn140 - nn150；nn150 - nn160；nn160 - nn170；nn170 - nn180；nn180 - nn190；nn190 - nn200；nn200 - nn210；nn210 - nn220；nn220 - nn230；nn230 - nn240；nn240 - nn250；nn250 - nn260；nn260 - nn270；nn270 - nn280；nn280 - nn290；nn290 - nn300；nn300 - nn310；nn310 - nn320；nn320 - nn330；nn330 - nn340；nn340 - nn350；nn350 - nn360；nn360 - nn370；nn370 - nn380；nn380 - nn390；nn390 - nn400；nn400 - nn410；nn410 - nn420；nn420 - nn430；nn430 - nn440；nn440 - nn450；nn450 - nn460；nn460 - nn470；nn470 - nn480；nn480 - nn490；nn490 - nn500；nn500 - nn510；nn510 - nn520；nn520 - nn530；nn530 - nn540；nn540 - nn550；nn550 - nn560；nn560 - nn570；nn570 - nn580；nn580 - nn590；nn590 - nn600；nn600 - nn610；nn610 - nn620；nn620 - nn630；nn630 - nn640；nn640 - nn650；nn650 - nn660；nn660 - nn670；nn670 - nn680；nn680 - nn690；nn690 - nn700；nn700 - nn710；nn710 - nn720；nn720 - nn730；nn730 - nn740；nn740 - nn750；nn750 - nn760；nn760 - nn770；nn770 - nn780；nn780 - nn790；nn790 - nn800；nn800 - nn810；nn810 - nn820；nn820 - nn830；nn830 - nn840；nn840 - nn850；nn850 - nn860；nn860 - nn870；nn870 - nn880；nn880 - nn890；nn890 - nn900；nn900 - nn910；nn910 - nn920；nn920 - nn930；nn930 - nn940；nn940 - nn950；nn950 - nn960；nn960 - nn970；nn970 - nn980；nn980 - nn990；nn990 - nn1000；nn1000 - nn1010；nn1010 - nn1020；nn1020 - nn1030；nn1030 - nn1040；nn1040 - nn1050；nn1050 - nn1060；nn1060 - nn1070；nn1070 - nn1080；nn1080 - nn1090；nn1090 - nn1100；nn1100 - nn1110；nn1110 - nn1120；nn1120 - nn1130；nn1130 - nn1140；nn1140 - nn1150；nn1150 - nn1160；nn1160 - nn1170；nn1170 - nn1180；nn1180 - nn1190；nn1190 - nn1200；nn1200 - nn1210；nn1210 - nn1220；nn1220 - nn1230；nn1230 - nn1240；nn1240 - nn1250；nn1250 - nn1260；nn1260 - nn1270；nn1270 - nn1280；nn1280 - nn1290；nn1290 - nn1300；nn1300 - nn1310；nn1310 - nn1320；nn1320 - nn1330；nn1330 - nn1340；nn1340 - nn1350；nn1350 - nn1360；nn1360 - nn1370；nn1370 - nn1380；nn1380 - nn1390；nn1390 - nn1400；nn1400 - nn1410；nn1410 - nn1420；nn1420 - nn1430；nn1430 - nn1440；nn1440 - nn1450；nn1450 - nn1460；nn1460 - nn1470；nn1470 - nn1480；nn1480 - nn1490；nn1490 - nn1500；nn1500 - nn1510；nn1510 - nn1520；nn1520 - nn1530；nn1530 - nn1540；nn1540 - nn1550；nn1550 - nn1560；nn1560 - nn1570；nn1570 - nn1580；nn1580 - nn1590；nn1590 - nn1600；nn1600 - nn1610；nn1610 - nn1620；nn1620 - nn1630；nn1630 - nn1640；nn1640 - nn1650；nn1650 - nn1660；nn1660 - nn1670；nn1670 - nn1680；nn1680 - nn1690；nn1690 - nn1700；nn1700 - nn1710；nn1710 - nn1720；nn1720 - nn1730；nn1730 - nn1740；nn1740 - nn1750；nn1750 - nn1760；nn1760 - nn1770；nn1770 - nn1780；nn1780 - nn1790；nn1790 - nn1800；nn1800 - nn1810；nn1810 - nn1820；nn1820 - nn1830；nn1830 - nn1840；nn1840 - nn1850；nn1850 - nn1860；nn1860 - nn1870；nn1870 - nn1880；nn1880 - nn1890；nn1890 - nn1900；nn1900 - nn1910；nn1910 - nn1920；nn1920 - nn1930；nn1930 - nn1940；nn1940 - nn1950；nn1950 - nn1960；nn1960 - nn1970；nn1970 - nn1980；nn1980 - nn1990；nn1990 - nn2000；nn2000 - nn2010；nn2010 - nn2020；nn2020 - nn2030；nn2030 - nn2040；nn2040 - nn2050；nn2050 - nn2060；nn2060 - nn2070；nn2070 - nn2080；nn2080 - nn2090；nn2090 - nn2100；nn2100 - nn2110；nn2110 - nn2120；nn2120 - nn2130；nn2130 - nn2140；nn2140 - nn2150；nn2150 - nn2160；nn2160 - nn2170；nn2170 - nn2180；nn2180 - nn2190；nn2190 - nn2200；nn2200 - nn2210；nn2210 - nn2220；nn2220 - nn2230；nn2230 - nn2240；nn2240 - nn2250；nn2250 - nn2260；nn2260 - nn2270；nn2270 - nn2280；nn2280 - nn2290；nn2290 - nn2300；nn2300 - nn2310；nn2310 - nn2320；nn2320 - nn2330；nn2330 - nn2340；nn2340 - nn2350；nn2350 - nn2360；nn2360 - nn2370；nn2370 - nn2380；nn2380 - nn2390；nn2390 - nn2400；nn2400 - nn2410；nn2410 - nn2420；nn2420 - nn2430；nn2430 - nn2440；nn2440 - nn2450；nn2450 - nn2460；nn2460 - nn2470；nn2470 - nn2480；nn2480 - nn2490；nn2490 - nn2500；nn2500 - nn2510；nn2510 - nn2520；nn2520 - nn2530；nn2530 - nn2540；nn2540 - nn2550；nn2550 - nn2560；nn2560 - nn2570；nn2570 - nn2580；nn2580 - nn2590；nn2590 - nn2600；nn2600 - nn2610；nn2610 - nn2620；nn2620 - nn2630；nn2630 - nn2640；nn2640 - nn2650；nn2650 - nn2660；nn2660 - nn2670；nn2670 - nn2680；nn2680 - nn2690；nn2690 - nn2700；nn2700 - nn2710；nn2710 - nn2720；nn2720 - nn2730；nn2730 - nn2740；nn2740 - nn2750；nn2750 - nn2760；nn2760 - nn2770；nn2770 - nn2780；nn2780 - nn2790；nn2790 - nn2800；nn2800 - nn2810；nn2810 - nn2820；nn2820 - nn2830；nn2830 - nn2840；nn2840 - nn2850；nn2850 - nn2860；nn2860 - nn2870；nn2870 - nn2880；nn2880 - nn2890；nn2890 - nn2900；nn2900 - nn2910；nn2910 - nn2920；nn2920 - nn2930；nn2930 - nn2940；nn2940 - nn2950；nn2950 - nn2960；nn2960 - nn2970；nn2970 - nn2980；nn2980 - nn2990；nn2990 - nn3000；nn3000 - nn3010；nn3010 - nn3020；nn3020 - nn3030；nn3030 - nn3040；nn3040 - nn3050；nn3050 - nn3060；nn3060 - nn3070；nn3070 - nn3080；nn3080 - nn3090；nn3090 - nn3100；nn3100 - nn3110；nn3110 - nn3120；nn3120 - nn3130；nn3130 - nn3140；nn3140 - nn3150；nn3150 - nn3160；nn3160 - nn3170；nn3170 - nn3180；nn3180 - nn3190；nn3190 - nn3200；nn3200 - nn3210；nn3210 - nn3220；nn3220 - nn3230；nn3230 - nn3240；nn3240 - nn3250；nn3250 - nn3260；nn3260 - nn3270；nn3270 - nn3280；nn3280 - nn3290；nn3290 - nn3300；nn3300 - nn3310；nn3310 - nn3320；nn3320 - nn3330；nn3330 - nn3340；nn3340 - nn3350；nn3350 - nn3360；nn3360 - nn3370；nn3370 - nn3380；nn3380 - nn3390；nn3390 - nn3400；nn3400 - nn3410；nn3410 - nn3420；nn3420 - nn3430；nn3430 - nn3440；nn3440 - nn3450；nn3450 - nn3460；nn3460 - nn3470；nn3470 - nn3480；nn3480 - nn3490；nn3490 - nn3500；nn3500 - nn3510；nn3510 - nn3520；nn3520 - nn3530；nn3530 - nn3540；nn3540 - nn3550；nn3550 - nn3560；nn3560 - nn3570；nn3570 - nn3580；nn3580 - nn3590；nn3590 - nn3600；nn3600 - nn3610；nn3610 - nn3620；nn3620 - nn3630；nn3630 - nn3640；nn3640 - nn3650；nn3650 - nn3660；nn3660 - nn3670；nn3670 - nn3680；nn3680 - nn3690；nn3690 - nn3700；nn3700 - nn3710；nn3710 - nn3720；nn3720 - nn3730；nn3730 - nn3740；nn3740 - nn3750；nn3750 - nn3760；nn3760 - nn3770；nn3770 - nn3780；nn3780 - nn3790；nn3790 - nn3800；nn3800 - nn3810；nn3810 - nn3820；nn3820 - nn3830；nn3830 - nn3840；nn3840 - nn3850；nn3850 - nn3860；nn3860 - nn3870；nn3870 - nn3880；nn3880 - nn3890；nn3890 - nn3900；nn3900 - nn3910；nn3910 - nn3920；nn3920 - nn3930；nn3930 - nn3940；nn3940 - nn3950；nn3950 - nn3960；nn3960 - nn3970；nn3970 - nn3980；nn3980 - nn3990；nn3990 - nn4000；nn4000 - nn4010；nn4010 - nn4020；nn4020 - nn4030；nn4030 - nn4040；nn4040 - nn4050；nn4050 - nn4060；nn4060 - nn4070；nn4070 - nn4080；nn4080 - nn4090；nn4090 - nn4100；nn4100 - nn4110；nn4110 - nn4120；nn4120 - nn4130；nn4130 - nn4140；nn4140 - nn4150；nn4150 - nn4160；nn4160 - nn4170；nn4170 - nn4180；nn4180 - nn4190；nn4190 - nn4200；nn4200 - nn4210；nn4210 - nn4220；nn4220 - nn4230；nn4230 - nn4240；nn4240 - nn4250；nn4250 - nn4260；nn4260 - nn4270；nn4270 - nn4280；nn4280 - nn4290；nn4290 - nn4300；nn4300 - nn4310；nn4310 - nn4320；nn4320 - nn4330；nn4330 - nn4340；nn4340 - nn4350；nn4350 - nn4360；nn4360 - nn4370；nn4370 - nn4380；nn4380 - nn4390；nn4390 - nn4400；nn4400 - nn4410；nn4410 - nn4420；nn4420 - nn4430；nn4430 - nn4440；nn4440 - nn4450；nn4450 - nn4460；nn4460 - nn4470；nn4470 - nn4480；nn4480 - nn4490；nn4490 - nn4500；nn4500 - nn4510；nn4510 - nn4520；nn4520 - nn4530；nn4530 - nn4540；nn4540 - nn4550；nn4550 - nn4560；nn4560 - nn4570；nn4570 - nn4580；nn458 0 - nn4590；nn4590 - nn4600；nn4600 - nn4610；nn4610 - nn4620；nn4620 - nn4630；nn4630 - nn4640；nn4640 - nn4650；nn4650 - nn4660；nn4660 - nn4670；nn4670 - nn4680；nn4680 - nn4690；nn4690 - nn4700；nn4700 - nn4710；nn4710 - nn4720；nn4720 - nn4730；nn4730 - nn4740；nn4740 - nn4750；nn4750 - nn4760；nn4760 - nn4770；nn4770 - nn4780；nn4780 - nn4790；nn4790 - nn4800；nn4800 - nn4810；nn4810 - nn4820；nn4820 - nn4830；nn4830 - nn4840；nn4840 - nn4850；nn4850 - nn4860；nn4860 - nn4870；nn4870 - nn4880；nn4880 - nn4890；nn4890 - nn4900；nn4900 - nn4910；nn4910 - nn4920；nn4920 - nn4930；nn4930 - nn4940；nn4940 - nn4950；nn4950 - nn4960；nn4960 - nn4970；nn4970 - nn4980；nn4980 - nn4990；nn4990 - nn5000；nn5000 - nn5010；nn5010 - nn5020；nn5020 - nn5030；nn5030 - nn5040；nn5040 - nn5050；nn5050 - nn5060；nn5060 - nn5070；nn5070 - nn5080；nn5080 - nn5090；nn5090 - nn5100；nn5100 - nn5110；nn5110 - nn5120；nn5120 - nn5130；nn5130 - nn5140；nn5140 - nn5150；nn5150 - nn5160；nn5160 - nn5170；nn5170 - nn5180；nn5180 - nn5190；nn5190 - nn5200；nn5200 - nn5210；nn5210 - nn5220；nn5220 - nn5230；nn5230 - nn5240；nn5240 - nn5250；nn5250 - nn5260；nn5260 - nn5270；nn5270 - nn5280；nn5280 - nn5290；nn5290 - nn5300；nn5300 - nn5310；nn5310 - nn5320；nn5320 - nn5330；nn5330 - nn5340；nn5340 - nn5350；nn5350 - nn5360；nn5360 - nn5370；nn5370 - nn5380；nn5380 - nn5390；nn5390 - nn5400；nn5400 - nn5410；nn5410 - nn5420；nn5420 - nn5430；nn5430 - nn5440；nn5440 - nn5450；nn5450 - nn5460；nn5460 - nn5470；nn5470 - nn5480；nn5480 - nn5490；nn5490 - nn5500；nn5500 - nn5510；nn5510 - nn5520；nn5520 - nn5530；nn5530 - nn5540；nn5540 - nn5550；nn5550 - nn5560；nn5560 - nn5570；nn5570 - nn5580；nn5580 - nn5590；nn5590 - nn5600；nn5600 - nn5610；nn5610 - nn5620；nn5620 - nn5630；nn5630 - nn5640；nn5640 - nn5650；nn5650 - nn5660；nn5660 - nn5670；nn5670 - nn5680；nn5680 - nn5690；nn5690 - nn5700；nn5700 - nn5710；nn5710 - nn5720；nn5720 - nn5730；nn5730 - nn5740；nn5740 - nn5750；nn5750 - nn5760；nn5760 - nn5770；nn5770 - nn5780；nn5780 - nn5790；nn5790 - nn5800；nn5800 - nn5810；nn5810 - nn5820；nn5820 - nn5830；nn5830 - nn5840；nn5840 - nn5850；nn5850 - nn5860；nn5860 - nn5870；nn5870 - nn5880；nn5880 - nn5890；nn5890 - nn5900；nn5900 - nn5910；nn5910 - nn5920；nn5920 - nn5930；nn5930 - nn5940；nn5940 - nn5950；nn5950 - nn5960；nn5960 - nn5970；nn5970 - nn5980；nn5980 - nn5990；nn5990 - nn6000；nn6000 - nn6010；nn6010 - nn6020；nn6020 - nn6030；nn6030 - nn6040；nn6040 - nn6050；nn6050 - nn6060；nn6060 - nn6070；nn6070 - nn6080；nn6080 - nn6090；nn6090 - nn6100；nn6100 - 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nn7370；nn7370 - nn7380；nn7380 - nn7390；nn7390 - nn7400；nn7400 - nn7410；nn7410 - nn7420；nn7420 - nn7430；nn7430 - nn7440；nn7440 - nn7450；nn7450 - nn7460；nn7460 - nn7470；nn7470 - nn7480；nn7480 - nn7490；nn7490 - nn7500；nn7500 - nn7510；nn7510 - nn7520；nn7520 - nn7530；nn7530 - nn7540；nn7540 - nn7550；nn7550 - nn7560；nn7560 - nn7570；nn7570 - nn7580；nn7580 - nn7590；nn7590 - nn7600；nn7600 - nn7610；nn7610 - nn7620；nn7620 - nn7630；nn7630 - nn7640；nn7640 - nn7650；nn7650 - nn7660；nn7660 - nn7670；nn7670 - nn7680；nn7680 - nn7690；nn7690 - nn7700；nn7700 - nn7710；nn7710 - nn7720；nn7720 - nn7730；nn7730 - nn7740；nn7740 - nn7750；nn7750 - nn7760；nn7760 - nn7770；nn7770 - nn7780；nn7780 - nn7790；nn7790 - nn7800；nn7800 - nn7810；nn7810 - nn7820；nn7820 - nn7830；nn7830 - nn7840；nn7840 - nn7850；nn7850 - nn7860；nn7860 - nn7870；nn7870 - nn7880；nn7880 - nn7890；nn7890 - nn7900；nn7900 - nn7910；nn7910 - nn7920；nn7920 - nn7930；nn7930 - nn7940；nn7940 - nn7950；nn7950 - nn7960；nn7960 - nn7970；nn7970 - nn7980；nn7980 - nn7990；nn7990 - 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nn8630；nn8630 - nn8640；nn8640 - nn8650；nn8650 - nn8660；nn8660 - nn8670；nn8670 - nn8680；nn8680 - nn8690；nn8690 - nn8700；nn8700 - nn8710；nn8710 - nn8720；nn8720 - nn8730；nn8730 - nn8740；nn8740 - nn8750；nn8750 - nn8760；nn8760 - nn8770；nn8770 - nn8780；nn8780 - nn8790；nn8790 - nn8800；nn8800 - nn8810；nn8810 - nn8820；nn8820 - nn8830；nn8830 - nn8840；nn8840 - nn8850；nn8850 - nn8860；nn8860 - nn8870；nn8870 - nn8880；nn8880 - nn8890；nn8890 - nn8900；nn8900 - nn8910；nn8910 - nn8920；nn8920 - nn8930；nn8930 - nn8940；nn8940 - nn8950；nn8950 - nn8960；nn8960 - nn8970；nn8970 - nn8980；nn8980 - nn8990；nn8990 - nn9000；nn9000 - nn9010；nn9010 - nn9020；nn9020 - nn9030；nn9030 - nn9040；nn9040 - nn9050；nn9050 - nn9060。
【００５４】
しかしながら、オリゴマーは、標的のHCV配列に相補的である配列のみからなる必要はない。さらに、ヌクレオチド配列あるいはオリゴマーが用いられる標的物に適切な他の部分を含み得る。例えば、HCV配列のPCRによる増幅のためのプライマーとしてそのオリゴマーが用いられる場合、それらには、二本鎖のとき、増幅される配列のクローニングを促進する制限酵素部位を形成する配列を含み得る。例えば、さらに、オリゴマーをハイブリダイゼーションアッセイ(下記)の「カプチャープローブ」として用いられる場合に、標的のHCV配列に相補的なヌクレオチド配列を含有するオリゴマーにカップルされる結合パートナーをさらに含む。オリゴマーが含まれ得る、あるいはカップルされ得るのに有用な他の型の部分あるいは配列は、ヌクレオチドプローブのラベル化を含む、種々の目的に適切であることは当該分野では公知である。
【００５５】
オリゴマーの調製は、例えば、削除、転写あるいは化学合成法を含む当該分野において公知の方法によってなされる。標的のゲノムの配列および/または領域は、オリゴマーの標的づけるポリヌクレオチドが標的に依存して相補的であるように選択される。例えば、最終目的が、生物学的サンプル(例えば、血液)中のHCVの存在をスクリーニングすることである場合、好ましいオリゴマーは、プローブおよび/またはプライマーとして用いられ、そしてHCVゲノムの保存領域にハイブリダイズされる。オリゴマーが結合し得るHCVゲノムの保存領域のいくつかは、本明細書に記載されている。例えば、図２３〜４７に示されているように、ヌクレオチド番号が、末端から約５から約200、あるいは約4000から約5000、あるいは8000から約9040、あるいは好ましくは、ヌクレオチド−318から174、4056から4448および4378から4902を含む領域である。保存されているゲノムの他の領域は、プロトタイプHCV、すなわちHCV1を含む種々のHCVの単離株のヌクレオチド配列の比較によって、容易に確定し得る。保存領域および非保存領域を決定するための遺伝子型間の比較をする方法は、当該分野において公知であり、このような方法の例は、本明細書に記載されている。
【００５６】
基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖の分析物核酸(DNAあるいはRNA)は、核酸プローブとハイブリダイズされ、そして生じた二本鎖が検出される。HCVポリヌクレオチドのプローブ(天然のあるいは誘導された)は、ハイブリダイゼーションによる新しいウイルス配列の検出を可能とする長さである。６〜８ヌクレオチドが働き得る長さであるが、10〜12のヌクレオチドの配列が好ましく、そして約20ヌクレオチドあるいはそれ以上が最も好ましい。好ましくは、これらの配列は、異種性を欠く領域に由来する。これらのプローブは、自動オリゴヌクレオチド合成法を含む、定法を用いて調製され得る。有用なプローブのなかには、例えば、本明細書に開示されている新しく単離されたクローン由来のもの、および下記に示すcDNAライブラリーをプローブするのに有用な種々のオリゴマーがある。HCVゲノムの任意の新しい部分への相補体は納得される。プローブとして用いるために、フラグメントの長さが増される必要はないが、完全な相補性が望まれる。
【００５７】
HCVポリヌクレオチドの存在を検出するための因子としてのこのようなプローブの使用(例えば、汚染血液のスクリーニングで)のために、血液あるいは血清のような、分析される生物学的サンプルが、必要に応じて、含有される核酸の抽出のために、処理される。サンプルから得られた核酸は、ゲル電気泳動、あるいは他のサイズ分離技術に供せられ得、あるいは核酸サンプルは、サイズ分離しないでドットブロットされ得る。プローブの標的づける配列に二本鎖にハイブリダイズを形成するのに、分析物核酸の標的の領域が一本鎖にされる。配列が天然に一本鎖である場合、変性は要求されない。しかし、配列が二本鎖である場合、配列は変性される。変性は、当該分野で公知の種々の技術により実施され得る。変性に続いて、分析物核酸およびプローブは、プローブ中の標的の配列の、分析物の推定上の標的の配列とのハイブリッド形成をなすのに適し、そして検出されるプローブを含む二本鎖を得る条件下に、インキュベートする。
【００５８】
得られた二本鎖の検出は、もしあれば、通常、ラベルプローブの使用で達成される：あるいは直接的にあるいは間接的に、ラベルされたリガンドへの特異的結合によって検出され得れば、プローブはラベルされ得ない。適切なラベル、およびプローブおよびリガンドのラベル方法は当該分野において公知であり、例えば、公知の方法(例えば、ニックトランスレーションあるいはキナーゼ処理(kinasing))を用い得る放射活性ラベル、ビオチン、蛍光基、化学発光基(例えば、ジオキシニタン、特に誘起ジオキセタン)、酵素、抗体などを含む。
【００５９】
分析物に結合されるのに用いられるプローブの領域は、HCVゲノムに完全に相補的に作成され得る。従って、通常、不正確さを避けるために、高いストリンジェンシーの条件が望まれる。しかし、高いストリンジェンシーの条件は、プローブが異種性を欠くウイルスゲノムの領域に相補的である場合にのみ、用いられるべきである。ハイブリダーゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度を含み、ハイブリダイゼーションの間、および洗浄の工程の間の多くの因子によって決定される。これらの因子は、例えば、Maniatis,T.(1982)に概説されている。
【００６０】
当該分野において公知のこの基本的な方法の変法もまた、外来物質からの検出されるべき二本鎖の促進された分離および/またはラベル部分からのシグナルの増幅の方法を含んで、用いられ得る。これらの変法の多くは、例えば、MatthewsおよびKricka(1988)、Analytical Biochemistry 169：1；Landegrenら(1988)、Science 242：229；およびMittlin(1989)、Clinical chem. 35：1819に総説されている。これらおよびアッセイの形態が記載されている次の刊行物は、本明細書に引用文献として援用されている。これらのアッセイでHCVを検出するために適したプローブは、標的のHCVポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして分析物鎖と二本鎖を形成する配列を含有する。ここで、この二本鎖は、特定のアッセイ系における検出のために十分に安定である。
【００６１】
適切な変法は、例えば、1989年9月9日発行の米国特許第4,868,105号、および欧州特許公開第225,807号(1987年6月16日公開)に記載されている。これらの刊行物には、分析物核酸が、ラベルプローブセットおよびカプチャープローブセットにハイブリダイズされる、液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。プローブ−分析物複合体は、カプチャープローブセットと相補的である、固体に固定されたカプチャープローブとのハイブリダイゼーションによりカップルされる。分析物アミノ酸は、固相複合体として溶液から除去される。分析物を固相複合体の形態で有することは、アッセイでの次の分離工程を促進にする。ラベルプローブセットは、ハイブリダイゼーションを介しての固相/分析物複合体に結合されるラベルされたプローブと相補的である。
【００６２】
一般に、HCVゲノム配列は、感染患者には比較的低レベル、すなわち、１ml当たり約102〜103のチンパンジー感染用量(CID)で血清中に存在する。このレベルは、ハイブリダイゼーションアッセイで増幅法が用いられるのに要求され得る。このような技術は当該分野において公知である。例えば、Enzo Biochemical Coporationの「Bio-Brige」システムでは、DNAプローブに非修飾の３'-ポリ-dT-末端を付加するために末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼが用いられる。このポリdT末端付加プローブは、標的のヌクレオチド配列にハイブリダイズされて、次いで、ビオチン修飾されたポリＡにハイブリダイズされる。PCT公開84/03520および欧州特許公開第124221号には、(１)分析物が、酵素ラベルされたオリゴヌクレオチドに相補的である一本鎖DNAプローブにアニールされ；そして(２)得られた末端付加された二本鎖が、酵素ラベルされたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、DNAハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。欧州特許出願第204510号には、分析物DNAが、ポリ-dT末端のような末端を有するプローブ、ポリＡ配列のようなプローブ末端にハイブリダイズする配列を有する増幅鎖に結合し、およびラベルされた鎖の大部分に結合し得るDNAハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。欧州特許公開第317,077号(1989年5月24日公開)に記載されているハイブリダイゼーションアッセイは、約106/mlのレベルで配列を検出し、一本鎖分析物核酸に結合し、さらに、多くの一本鎖ラベルオリゴヌクレオチドに結合する核酸マルチマーを用いている。とくに記載されている技術には、ハイブリダイゼーション系の一部として、血清中に約10,000倍(すなわち、約106配列/ml)標的のHCV配列の増幅物が含有される。増幅は、例えば、Saikiら(1986)、Mullis、米国特許第4,683,196号、およびMullisら米国特許第4,683,202号に記載のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により達成される。増幅は、HCVの標的配列の精製の前、あるいは好ましくは、精製に引き続いてなされ得る。例えば、増幅は、米国特許第4,868,105号に記載のアッセイ法とともに用いられ得るし、あるいは、さらに増幅が望まれる場合には、欧州特許公開第317,077号に記載のハイブリダイゼーション系とともに用いられ得る。
【００６３】
分析物ポリヌクレオチド鎖中のHCV配列を検出するための好ましい方法は、米国特許第4,868,105号および欧州特許公開第317,077号に記載のハイブリダイゼーション検出法に基づく。これらの方法は、分析物の核酸中の標的の配列にハイブリダイズするカプチャープローブおよびラベルプローブを用いる、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイである。生物学的サンプルのHCVをスクリーニングするアッセイの使用において、用いられるプローブは、HCVゲノムの保存領域に結合される。カプチャープローブおよびラベルプローブは、標的の配列への結合に配置され得る。あるいは、好ましいモードのカプチャープローブおよびラベルプローブはセットで存在し、そして１つのセットのプローブ他のセットのプローブとともに配置されない。後者のモードにおいて、好ましくは、複数のカプチャープローブのセットがゲノムの最も保存された領域にハイブリダイズし、一方、複数のラベルプローブのセットは、少しの相違を示す領域にハイブリダイズし得る。例えば、図２３〜４７に示されるプロトタイプHCV1 cDNA配列を用いて、約−318から約174のヌクレオチドの領域および/または約4378から4902の領域のヌクレオチド、および/または約4056から約4448の領域のヌクレオチドの配列にハイブリダイズするプローブが用いられた。好ましいプローブは、HCVゲノムの５'領域の配列にハイブリダイズする。なぜなら、下記に示すように、この領域は、高度に保存されるようであるからである。従って、好ましいプローブは、例えば、図２３〜４７に示されているように、約−318から約174のヌクレオチドにハイブリダイズし得る。例えば、ウイルスゲノム配列の検出、あるいはPCR増幅により生じたHCV cDNA配列の検出、あるいは、HCV RNA正鎖に対する複製中間生成物の検出の目的に応じて、保存領域の正鎖および/またはその相補体にハイブリダイズするプローブが用いられる。
【００６４】
HCV/cPCR法を用いた、HCV RNAおよびその由来のポリヌクレオチドの検出
HCV RNAまたはHCV RNAに由来するポリヌクレオチドの特に好ましい検出法は、この出願の主題であるHCV/cPCR法であり、Saiki等(1986)、Mullisによる米国特許第4,683,195号およびMullis等による米国特許第4,683,202号により述べられている、ポリメラーゼ連鎖反応技術(PCR)を利用する。HCV/cPCR法はHCVゲノムの性質に関し、本明細書で与えられる情報に由来するプライマーとプローブを利用する。
【００６５】
一般に、PCR技術では、短いオリゴヌクレオチドプライマーが準備され、所望の配列の反対の末端に合う。プライマー間の配列は知られる必要はない。ポリヌクレオチドのサンプルは好ましくは熱により抽出され、変性され、超過モルに存在するオリゴヌクレオチドプライマーとともにハイブリッドされる。ポリメライゼーションは、三リン酸デオキシヌクレオチドまたはアナログヌクレオチド(dNTP)の存在する時に鋳型およびプライマー依存的なポリメラーゼにより触媒作用される。このことは、５'基のそれぞれのプライマーを含む２つの「長い生成物」に帰着し、元の鎖の新しく合成された補足に共有結合される。複製されたDNAは再び変性され、オリゴヌクレオチドプライマーとともにハイブリッドされ、重合条件にもどされ、２回目の複製回路が始められる。２回目の回路は２つの元の鎖、回路１からの２つの長い生成物、および長い生成物から複製された２つの「短い生成物」を供給する。短い生成物は標的配列に由来する配列(センスまたはアンチノーゼ)をふくみ、プライマー配列のある５'および３'基に側面をもつ。各追加の回路では、短い生成物の数が指数関数的に複製される。従って、このプロセスは特別な標的配列の増幅の原因となる。この方法では、HCV RNA、またはその断片を含むと推測されるサンプルが準備される。このサンプルは通常はNANBHを持つと推測される独立したものから取り出される。しかしながら、サンプルの他の源は例えば、ウイルスが複製されるvitroシステムからのならし培地または細胞が含まれる。サンプルは、しかしながら、標的核酸配列を含まなければならない。
【００６６】
サンプルはそれからHCV RNAの逆転写であるHCV cDNAにする条件が行われる。RNAの逆転写は当業者には公知であり、例えば、Maniatis等(1982)および酵素学法に述べられている。逆転写の好ましい方法は例えば、レトロウイルス、好ましくはトリ骨髄芽球ウイルス(AMV)から分離され、組換え分子を含む、様々な源からの逆転写酵素と、転写に適した条件を利用する。逆転写のHCV cDNA生成物はRNA、逆転写の一回目の結果である、DNAハイブリッド、それ以降のDNA、および２回目以上の転写の結果であるDNAハイブリッド内にある。
【００６７】
逆転写酵素により得られたこのHCVのcDNAを、次に標的配列を増幅するためにPCRした。これを実施するために、このHCVのcDNAを変性し、分離された両鎖は、標的配列に隣接したプライマーとともにハイブリッドした。
【００６８】
鎖の分離は、適切な変性手段ならば、当業者に知られた、物理的、化学的、あるいは酵素的な手段の何によってでもよい。推奨方法は、物理的方法で、完全に(99％)変性するまで核酸を加熱する工程を含む。典型的な熱変性は、約80℃から100℃の間の温度で、約１分から10分間の間行った。HCVのcDNAをプライマーとともにハイブリッドした後、標的のHCV配列は、プライマーのオリゴヌクレオチドにより複製鎖の合成を開始させるという、ポリマー化手段によって複製した。プライマーは、HCVのゲノムの配列に相補的である様に選ばれた。HCVのcDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の領域に相補的なオリゴマー性のプライマーは、図２３〜４７に与えられたcomposite cDNA配列からのHCVのcDNA配列から設計された。
【００６９】
プライマーは、一つのプライマーから合成され、テンプレート(相補鎖)から分離した、伸長産物が、他のプライマーの伸長用テンプレートとして、定義された長さの複製鎖を与えることができる様に、二重鎖配列の上の相対的位置がなる様に選択した。
【００７０】
最高効率の増幅のためには、プライマーは一本鎖であるのが好適であるが、二重鎖であっても構わない。二重鎖の場合には、伸長産物を生成するために用いる前に、先ず、両鎖を分離するために処理しなければならない。プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドが好適である。プライマーは、ポリマー化用の試薬の存在下で伸長産物の合成の開始をするためには、十分長くなくてはならない。プライマーの適切な長さは、温度、およびプライマーの由来、および使用法等を含む、多くの因子に依存する。例えば、標的配列のcomplexityに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には約15から45のヌクレオチドを含むが、場合によってはこれより多いことも少ないこともある。短いプライマー分子で、テンプレートと十分安定なハイブリッド複合体を形成するには、一般により低い温度が要求される。
【００７１】
本明細書に用いたプライマーは、増幅されるべき各特異的な異なる鎖に「実質的に」相補的な様に選択されている。そのためプライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はなく、それらの対応する鎖に選択的にハイブリッドするのに十分な相補性を持たなければならない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片は、プライマー配列の鎖に相補的な残りの部分で、プライマーの５'-末端に結合することもある。あるいは、非相補的な塩基あるいはより長い配列が、プライマーの中に点在し、そのため、増幅されるべき片方の鎖の配列に対し十分なだけ相補的となり、それとハイブリダイズし、ポリマー化手段により伸長された、二重鎖構造を形成する。プライマー中の非相補的なヌクレオチド配列は、制限酵素部位を含むことがある。標的配列の(両)末端に制限酵素部位を加えることは、標的配列をクローニングする際に特に有用である。
【００７２】
本明細書で用いる用語「プライマー」は、特に増幅されるべき標的領域の(両)末端配列に関する情報に幾分かの暖昧さがある場合に、一つ以上のプライマーを指すことがあることは理解されたい。「プライマー」は、配列中の可能な変化を表す配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの集合を包含する、あるいは、典型的な塩基対形成をするヌクレオチドを含むことが許されるためである。この集合中の、プライマーオリゴヌクレオチドの一つが、標的配列の末端と相同的である。実施例にはこの特殊な例を示してあり、44-mersと45-mersのオリゴマーの組を、HCVゲノムの潜在的可変領域の増幅を開始するのに用いている。
【００７３】
プロトタイプ株であるHCV1から誘導された配列を持つHCVの種々の株あるいは単離株があることは予期されていた。そのため、変種株を検出するために、HCVゲノムの保存領域とハイブリッドするプライマーを構成することが好ましい。保存領域は、数種のHCVの株/単離株ヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を比較することによって決定される。前出の文献の記述によると、HCVゲノム中には、少なくとも三つのアミノ酸の保存領域があり、プライマーはその中から由来させている。これらの領域は、信じられているものである。後に実施例中で記述されるプライマーは、Flavivirusesの保存領域との配列相同性に基づいて、HCVの保存領域と信じられている部位から由来したものである。
【００７４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、適切な方法ならば、如何なる方法で調製してもよい。特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製方法は、当該分野では公知であり、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限酵素切断による、および、直接の化学的合成による、方法を含む方法で調製できる。化学的合成法には、例えば、Narangらの(1979)記述したフォスフォトリエステル法、Brownらの(1979)開示したフォスフォジエステル法、Beaucageらの(1981)開示したジエチルフォスフォアミデート法、および米国特許第4,458,066号の固体担体法がある。
【００７５】
所望するならば、分光学的に、光化学的に、微生物学的に、免疫化学的に、あるいは化学的に検出可能な手段を組み込むことにより、プライマーはラベルしてもよい。
【００７６】
テンプレート依存性のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長反応は、ポリマー化薬剤により触媒され、適切な量の四種のデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート(dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP)あるいはその類似物の存在下で、適切な、塩類、金属カチオン、およびpH緩衝系からなる反応溶媒中で行われる。適切なポリマー化薬剤は、プライマー依存性およびテンプレート依存性のDNA合成を触媒する酵素である。知られているDNAポリメラーゼには、例えば、E. coliのDNAポリメラーゼＩあるいはそのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、およびTaq DNAポリメラーゼがある。これらのDNAポリメラーゼを用いてDNA合成を触媒する反応条件は公知である。
【００７７】
この合成の産物は、テンプレート鎖およびプライマー伸長鎖から構成される二重鎖の分子であり、その中に標的配列を包含している。これらの産物は、次には、以降の複製の段階ではテンプレートとして機能する。複製の第２段階では、第１サイクルのプライマー伸長鎖は、その相補的なプライマーとアニールする；この合成は、５'-末端および３'-末端の両方にプライマー配列あるいはその相補体が結合した、「短い」産物を生成する。変性、プライマーのアニーリング、および伸長の繰り返されるサイクルは、プライマーによって定義される標的領域の指数的な蓄積をもたらす。核酸からなる標的領域を包含する、所望する量のポリヌクレオチドを得るために十分なサイクル数が行われる。所望する量は、変化し、ポリヌクレオチド産物の果たす機能によって決定される。
【００７８】
PCR法は、多くの一時的な配列に対して行うことができる。例えば、PCRは、各段階の終わりに新しく試薬を加え、あるいは、予め決めた段階数の後に新鮮な試薬を加えることにより、全ての試薬を同時に入れるような様式で、段階的に行うこともできる。
【００７９】
推奨する方法においては、PCR反応は熱安定性酵素を利用して、自動化された工程として行った。この工程では、反応混合物は、変性過程、プライマーのアニーリング過程、および反応過程をサイクルさせられる。熱安定性酵素を用いた使用法に特に適合した酵素を各サイクル毎に加える必要がないので、液体制御システムを持たない装置を用いてもよい。この種の装置は、Perkin Elmer Cetus Corp.から市販されている。
【００８０】
PCRによる増幅の後、標的ポリヌクレオチドは、かなりストリンジェントから適切にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的配列と安定にハイブリッドを形成するプローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより検出される。もしも、プローブが標的配列と完全に相補的(即ち、約99％あるいはそれ以上)であると期待できるならば、かなりストリンジェントな条件が用いられる。もしも、幾らかのミスマッチが予想されるならば、例えば、プローブが完全に相補的ではない変異株が結果として予想されるならば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは減じられる。しかしながら、条件は非特異的/偶発的結合の排除を目的に選択される。ハイブリダイゼーションに影響を与える条件、および、非特異的結合を選別するための条件は公知であり、例えば、Maniatisらにより(1982)記述されている。一般的に、低い塩濃度および高温は結合のストリンジェンシーを増す。例えば、ストリンジェントな条件とは、約0.1×SSCと、0.1％SDSを含む溶液中でインキュベートし、約65℃のインキュベーション/洗浄温度、適度にストリンジェントな条件とは、約１から2×SSCと、0.1％SDSで、約50から65℃のインキュベーション/洗浄温度と考えられている。低いストリンジェンシー条件は、2×SSCで、約30から50℃である。
【００８１】
HCV標的配列のプローブは、図２３〜４７に示したHCVのcDNA配列から、あるいは新しいHCV分離株から、由来したものでよい。HCVプローブは、標的領域を覆うならば、そしてプライマー部分が排除されているならば、そして標的領域と特異的にハイブリダイゼーションするならば、如何なる長さでもよい。もしも、完全な相補性があるならば、すなわち、その株がプローブと同じ配列を含有するならば、二重鎖はストリンジェントな条件下でさえ相対的に安定であり、プローブは短くとも、すなわち約10から30塩基対の長さでも構わない。もしも、プローブにある程度のミスマッチが予想されるならば、すなわち、プローブが変異した領域とハイブリダイズすることが疑われるならば、長さはミスマッチの効果の幾分かを補償する様に考えられているため、プローブはより長くされる。この例は、プローブをHCVの潜在的な変異株に結合させようと設計した実施例に見られる。この場合、プライマーは、HCVゲノムの仮想的な保存領域に由来したHCV cDNAに結合する様に設計され、標的領域は潜在的に変異(Flavivirusのモデルに基づく)を含む部位である。HCV標的配列を検出するために用いたこのプローブは、およそ268塩基対であった。
【００８２】
標的配列に相補的なプローブの核酸は、以前にプライマー配列の合成用に記述したのと同様な技術を用いて合成できる。所望するならば、プローブはラベルしてもよい。適切なラベルは、以前に記述してある。
【００８３】
時として、プローブにより検出された、PCR産物の長さを決定したいことがある。これは、もし変異したHCV株が標的領域に欠損を有している場合、あるいは、PCR産物の長さを確認したいと望む場合に起こる。この様な場合、プローブとハイブリダイズすると同時に、この産物をサイズ分析に付することが望ましい。核酸のサイズを決定する方法は、公知であり、たとえば、ゲル電気泳動、グラジエント中での沈降、およびゲル排除クロマトグラフィーが含まれる。
【００８４】
生物学的試料中の標的配列の存在は、HCVポリヌクレオチドプローブとPCR増幅技術にかけたその核酸とが、ハイブリッドするかどうかを調べることにより検出される。プローブと核酸配列との間で形成されたハイブリッドを検出する方法は、公知である。簡単には、たとえば、ラベルしていない試料をそれが結合できる固相マトリックスに移し、そして結合した試料をラベルしたプロープと特異的なハイブリダイゼーションが起こる条件に置き；次に、固相マトリックスにラベルプローブが存在しているかどうか調べる。あるいは、試料がラベルされている場合、未ラベルのプローブはこのマトリックスに結合し、適切なハイブリダイゼーション条件下に曝すことで、マトリックスはラベルが存在するかどうかを試験される。他の適切なハイブリダイゼーションアッセイについては以前に記述してある。
【００８５】
PCRを用いるHCV変異株の配列決定
HCV変異株を同定するために、およびそれによってこれらの変異株のプローブを設計するために、上記のHCV/cPCRの方法がHCVゲノムの変異領域を増幅するのに用いられ、それによってこれらの変異した標的領域のヌクレオチド配列が決定され得る。一般に、HCVの変異型は、HCV1株が主(predominant)である地域、例えば、日本、アフリカなどの地域とは異なる地域に存在すること；あるいはウイルスにも感染される異なる脊髄動物種に存在することが予想され得るだろう。HCV変異株は、組織培養系の継代にも現れ得るし、あるいは突然変異あるいは誘導された変異の結果として現れ得る。
【００８６】
変異した標的領域を増幅するのに、疑わしい領域をフランキングするように、プライマーが設計され、好ましくは保存領域に相補的である。HCVの２つの領域(これらの領域はフラビウイルスモデルに基づき、おそらく保存されている)に対するプライマーは実施例に記述される。図２３〜４７に示されるHCV1株の配列の情報を用いて、これらのプライマーおよびプローブを設計し得る。
【００８７】
標的領域のヌクレオチド配列決定はPCRで増幅された生成物を直接分析することによって行われ得る。PCRで増幅された生成物の配列を直接分析する方法がSaikiら(1988)に記述されている。
【００８８】
一方、増幅された標的配列は配列決定の前にクローンされ得る。酵素的に増幅されたゲノム断片の直接クローニングおよび配列分析の方法がScharf(1986)によって述べられた。この方法において、例えば、M13シークエンシングベクターに直接クローニングできるように便利な制限酵素の切断部位を与えるため、PCR技術に用いられるプライマーにはプライマーの５'末端の近傍に改変される。増幅後、PCR生成物が適切な制限酵素で開裂される。制限酵素で切断された断片をM13ベクターに組み込み、そして例えば、JM103宿主に形質転換して、プレートにまき、そしてこのように得られたプラークがラベルしたオリゴポリヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーションによってスクリーニングされる。クローニングおよび配列分析の他の方法は当該分野で公知である。
【００８９】
フラビウイルスのおよびHCVのユニバーサルプライマー
HCVのcDNA由来のプローブを用いて、HCVのゲノムの性質を調べた結果によって、およびHCVのcDNA内に含有される配列情報によって、HCVがフラビ様ウイルス(Flavi-like virus)であることが推定される。これらの研究は、この明細書の譲受人が所有する欧州特許出願公開第318,216号に記述されている。これの全文は本明細書に援用されている。HCVのcDNAクローン由来のHCVのcDNA配列と多数のフラビウイルスの公知の配列との比較から、HCVが、フラビウイルスの保存配列と相同である配列を含有することが分かった。これらの保存配列によって、フラビウイルスの標的領域の増幅、およびHCVに適用するのに、ユニバーサルであり得るプライマーが作製され得る。これらの配列は、実施例に記述されるプライマーの３'末端由来の16-merあるいはそれより小さい配列である。次いで、種特異的プローブを用いて、種の同定は達成される。多数のフラビウイルスのゲノムは当該分野に公知であり、それらには、例えば、日本脳炎ウイルス(Sumiyoshiら(1987))、黄熱ウイルス(Riceら(1985))、デング２型ウイルス(Hahnら(1988)、デング４型ウイルス(Mackow(1987))、および西ナイルウイルス(Castleら(1986))が含まれる。HCV特異的なプローブを用いて、HCVのRNAの同定は達成され、そしてこの配列が本明細書に提供されているHCVのcDNAによって決定され得る。
【００９０】
一方、コドン縮退(codon degeneracy)のために設計されるプローブであって、そして、フラビウイルスおよびHCVの共通配列（フラビウイルスの公知の配列とHCVのアミノ酸配列との比較によって決定される）を含有するプローブのセットの使用は、これらのウイルスを一般の検出システムで検出され得る。
【００９１】
所望のDNA配列の構築
Warner(1984)の方法に従って、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドが調製され得る。所望ならば、反応の標準の条件下で、32Ｐ-ATPの存在下で、ポリヌクレオチドキナーゼの処理によって、合成鎖が32Ｐでラベルされ得る。
【００９２】
cDNAライブラリーから単離されたものを含むDNA配列が、Zoller(1982)に記載の部位特異的突然変異誘発のような公知の技術によって改変され得る。要するに、改変されようとするDNAを単鎖配列として、ファージにパッケージし、そしてプライマー(改変されるDNAの部分に相補的である合成オリゴヌクレオチドであり、自分自身の配列内に所望な改変を有する)を用いて、DNAポリメラーゼで２重鎖DNAに変換する。このように得られた２重鎖DNAを、ファージを維持できる宿主バクテリウムに形質転換する。ファージの各鎖の複製を含有する、形質転換したバクテリアの培養物を寒天にプレートして、プラークを得る。理論的に、50％の新しいプラークは変異した配列を有するプラークを含有し、そして残りの50％は現型の配列を有する。正しい鎖とハイブリダイズするが、改変されない配列とハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーションの温度および条件下で、これらのプラークの複製物をラベルした合成プローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションによって同定された配列を回収し、クローン化する。
【００９３】
HCV由来のポリヌクレオチドをスクリーニングするためのキット
HCVのサンプルの増幅および/またはスクリーニングのための、プローブおよび/またはプライマーであるオリゴマーがキット内にパッケージされ得る。HCV配列のスクリーニングのためのキットには、オリゴマーのプローブDNAが含まれる。HCV配列の増幅のためのキットには、増幅に用いられるオリゴマーのプライマーが含まれ得る。このキットは通常、特定のハイブリダイゼーションおよび/または増幅のプロトコールで必要とされる、前もって測定したあるいは前もって決めた量のプローブあるいはプライマーを含有し、そして他の適切な包装された試薬および材料をも、別々の適当な容器に入れられていて、含有する。例えば、キットは標準物、緩衝剤、支持体、酵素、基質、ラベルプローブ、結合対、および/またはテストを行うための説明書を含有する。
【００９４】
【実施例】
以下、本発明の実施例が述べられている。これらの実施例は本発明について説明するものであって、本発明を制限するものではない。
【００９５】
オーバーラップしているHCVのcDNAクローン13i、26j、CA59a、CA84a、CA156eおよびCA167bの単離および配列
13i、26j、CA59a、CA84a、CA156eおよびCA167bのこれらのクローンを、HCVのcDNAを有するラムダ−gt11ライブラリー(ATCC第40394号)から単離した。このライブラリーの調製は、欧州特許出願公開第318,216号(1989年5月31日公開)およびWO89/04669(1989年6月1日公開)に記載されている。Huynh(1985)が述べられた方法を用いて、下記のプローブで、このライブラリーをスクリーニングした。それぞれのプローブに対するポジティブのクローンの検出する頻度は50,000個に約１個であった。
【００９６】
クローン12fの配列由来の合成プローブを用いて、クローン13iを単離した。このプローブの配列は以下である：
5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'
【００９７】
クローンK9-1の５'領域由来のプローブを用いて、クローン26jを単離した。このプローブの配列は以下である：
5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'
【００９８】
クローン12fおよびクローンk9-1(K9-1とも呼ばれる)の単離の方法が欧州特許出願公開第318,216号に記載されている。これらのクローンの配列は図１および図２〜５それぞれに示されている。クローン13iおよび26jのHCVのcDNA配列は図７および図８にそれぞれ示されている。これらの図には、これらの配列にコードされるアミノ酸、およびクローン13iのクローン12fとのオーバーラップ、およびクローン26jのクローン13iとのオーバーラップも示されている。これらのクローンの配列はクローンK9-1の配列を確認した。クローンK9-1を別のHCVのcDNAライブラリーから単離した(欧州特許出願公開第218,316号参照)。
【００９９】
クローン26jの５'領域の配列に基づくプローブを用いて、クローンCA59aを単離した。このプローブの配列は以下である：
5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'
【０１００】
クローンCA59aの配列由来のプローブが、クローンCA84aの単離に用いられた。この単離に用いられるプローブの配列は以下である：
5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'
【０１０１】
クローンCA84aの配列由来のプローブを用いて、クローンCA156eを単離した。このプローブの配列は以下のとおりであった。：
5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'
【０１０２】
クローンCA156eの配列由来のプローブを用いてクローンCA167bを単離した。このプローブの配列は以下のとおりであった。：
5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'
【０１０３】
クローンCA59a、CA84a、CA156e、およびCA167bにおけるHCV cDNAのヌクレオチド配列は図９、図１０、図１１、および図１２に、それぞれ示されている。ここにコードされているアミノ酸、および関連したクローンの配列を有するオーバーラップもまた、これらの図に示されている。
【０１０４】
「pi」HCV cDNAライブラリーの創製
欧州特許公開第318,216号に記載されているラムダ-gt11 HCV cDNAライブラリーを構築するために用いられる感染チンパンジーの血漿の同一のバッチから、本質的に同様の方法を用いて、HCV cDNAのライブラリー、すなわち「pi」ライブラリーを構築した。しかし、「pi」ライブラリーの構築には、プライマー延長法を用いた。この方法において、逆転写酵素のプライマーはクローンCA59aの配列に基づいている。このプライマーの配列は、以下のとおりである。：
5'GGT GAC GTG GGT TTC 3'
【０１０５】
クローンpi14aの単離および配列
クローンCA167b(上記を参照のこと)を単離するのに用いたプローブによる上記の「pi」HCV cDNAライブラリーのスクリーニングにより、クローンpi14aが得られた。このクローンは、ラムダgt-11 HCV cDNAライブラリー(ATCC第40394号)から単離されたクローンCA167b、CA156e、CA84aおよびCA59aとオーバーラップしている約800塩基対のcDNAを含有している。さらに、pi14aはまた、約250塩基対のDNAを含有しており、その塩基対は、クローンCA167bにおけるHCV cDNAの上流に存在している。
【０１０６】
クローンCA216a、CA290aおよびag30aの単離および配列
クローンCA167bの配列に基づいて、以下の配列を有する合成プローブを製造した。：
5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'
【０１０７】
上記プローブを、スクリーニングするために用い、クローンCA216aを得た。そのHCV配列は図１３に示されている。
【０１０８】
以下の配列を有するクローンCA216aの配列に基づいて、他のプローブを製造した。：
5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'
【０１０９】
このプローブでラムダ-gt11ライブラリー(ATCC第40394号)をスクリーニングすることにより、クローンCA290aが得られた。その中のHCV配列は図１４に示されている。
【０１１０】
パラレルアプローチ(parallel approach)では、上記のオリジナルのラムダ-gt11 cDNAライブラリーにおいて用いた同様の感染血漿から抽出された核酸を用いて、プライマー延長cDNAライブラリーを製造した。用いたプライマーはクローンCA216aおよびCA290aの配列に基づいていた。：
5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'
【０１１１】
クローンpi14aおよびk9-1の単離において用いられるライブラリーの上記で記載された方法と同様の方法を用いて、このcDNAライブラリーを製造した。このライブラリーをスクリーニングするのに用いたプローブはクローンCA290aの配列に基づいていた。：
5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'
【０１１２】
クローンag30aを上記のプローブを用いて新しいライブラリーから単離した。それは、約670塩基対のHCV配列を含んでいる。図１５〜１７を参照のこと。この配列の一部は、クローンCA216aおよびCA290aのHCV配列とオーバーラップしている。しかし、約300塩基対のag30a配列は、クローンCA290a由来の配列の上流に存在する。オーバーラップしていない配列はHCV ORFの開始を示し得る開始コドン(＊)および終止コドンを示す。図１５〜１７には以下のものも含まれる：翻訳を制御する役割を果たし得るコードされた推定される小さいペプチド(#)、および推定されるポリペプチドの推定される最初のアミノ酸(/)、およびその下流でコードされたアミノ酸。
【０１１３】
クローンCA205aの単離および配列
クローンCA290a(図１４)におけるHCV配列由来の合成プローブを用いて、オリジナルのラムダgt-11ライブラリー(ATCC第40394号)からクローンCA205aを単離した。このプローブの配列は以下のとおりであった。：
5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'
【０１１４】
図１８に示されるCA205aにおけるHCV cDNAの配列は、クローンag30aおよびCA290aの両方におけるcDNA配列とオーバーラップしている。CA290aの配列とオーバーラップしている配列はその配列の上に点線で示されている(この図はまた、この断片においてコードされた推定されるアミノ酸を示す)。
【０１１５】
クローンCA205aおよびag30aにおけるHCV cDNA配列から明らかなように、この推定されるHCVポリタンパク質はATG開始コドンで始まると思われる；両クローンにおけるHCV配列は、このATGから42ヌクレオチド上流に、フレーム内の連続するダブルストップコドン(TGATAG)を含有する。このHCV ORFはこれらの終止コドンの後で開始し、そして、少なくとも8907ヌクレオチド延長すると考えられる(図２３〜４７において示されるコンポジット(composite) HCV cDNAを参照のこと)。
【０１１６】
クローン18gの単離および配列
クローンag30a(図１５〜１７を参照のこと)およびオリジナルのラムダgt-11ライブラリー(ATCC第40394号)由来のオーバーラップしているクローンの配列に基づいて、CA230a、すなわち、以下の配列を有する合成プローブを製造した。：
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'
【０１１７】
プローブでオリジナルのラムダ-gt11 HCV cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、クローン18gが得られ、そのHCV cDNA配列は図１９に示されている。この図には以下のものもまた示されている：クローンag30aとのオーバーラップ、およびHCV cDNA中でコードされた推定されるポリペプチド。
【０１１８】
クローン18g(C18gまたは18g)におけるcDNAは、クローンag30aおよびCA205aにおけるcDNAとオーバーラップしており、そのことは上記で記載されている。C18gの配列はまた、クローンag30aにおいて見られるダブルストップコドン領域を含む。これらの終止コドンの上流のポリヌクレオチド領域は、おそらくHCVゲノムの５'領域の一部を表す。これは、短いORFを有し得、そして精製HCVゲノムの直接配列決定法により確認され得る。これらのコードされた推定される小さいペプチドは、翻訳において制御する役割を果たし得る。C18gで表される領域の上流のHCVゲノムの領域は、本質的に欧州特許公開第318,216号に記載された方法(これは、クローン12fにおけるHCV cDNA配列の上流のcDNA配列を単離する方法である。)を用いて、配列決定のために単離され得る。本質的にC18gの配列に基づく逆転写酵素の小さい合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてHCVゲノムRNAにおいて相当する配列と結合するために用いられる。このプライマー配列は既知のC18gの５'末端に近いが、プライマー配列の上流のプローブ配列の設計を可能にするのに十分なだけ下流に存在する。周知のプライミング(priming)およびクローニングの標準法が用いられる。得られたcDNAライブラリーをプライミング部位の上流の配列でスクリーニングする(C18gの明らかにされた配列から推測される)。NANBHを有する個体由来の血漿または肝臓のサンプルのいずれかからHCVゲノムRNAを得る。HCVはフラビ様ウイルスであると考えられるので、このゲノムの５'末端は「cap」構造で修飾され得る。フラビウイルスゲノムが５'末端「cap」構造を含んでいるということは知られている。(黄熱病ウイルス、ライス(Rice)ら、(1988)；デング熱ウイルス、ハーン(Hahn)ら、(1988)；日本脳炎ウイルス(1987))。
【０１１９】
β-HCV cDNAライブラリー由来のクローンの単離および配列
HCVゲノムの３'末端領域を代表するcDNAを含むクローンをオリジナルの感染チンパンジー血漿プール(HCV cDNAラムダ-gt11ライブラリー(ATCC第40394号)の創製のためにもちいられ、欧州特許公開第318,216号に記載されている)から構築したcDNAライブラリーから単離した。DNAライブラリーを創製するために、血漿から抽出されたRNAをポリ(rA)ポリメラーゼを用いてポリrAで付加(tailed)し、そして、cDNAを逆転写酵素のプライマーとしてオリゴ(dT)12-18を用いて合成した。得られたDNA：cDNAハイブリッドをRNAase Hで分解し、そして二本鎖HCV cDNAに変換した。この得られたHCV cDNAを、本質的にヒューン(Huynh)(1985)において記載された方法を用いて、ラムダ-gt10にクローン化し、β(またはｂ)HCV cDNAライブラリーを得た。用いられた方法は以下のとおりであった。
【０１２０】
血漿のアリコート(12ml)をプロティナーゼＫで処理し、0.05MのトリスCl(pH7.5)、0.05％(v/v)β-メルカプトエタノール、0.1％(w/v)ヒドロキシキノロン、１mM EDTAで飽和させた同量のフェノールで抽出した。得られた水相をフェノール混合物で再抽出し、次いで、フェノールおよびクロロホルム：イソアミルアルコール(24：１)を１：１で含有する混合物で３回抽出し、次いで、クロロホルム：イソアミルアルコール(１：１)で２回抽出した。NaClについて水相を200mMに調製した後、水相における核酸を−20℃で一晩、2.5容量の冷却した無水エタノールで沈澱させた。この沈澱物を遠心分離(10,000RPM、40分間)により集め、20mMのNaClを含有する70％エタノール、そして100％冷却したエタノールで洗浄し、デシケーター中で５分間乾燥し、そして、水で溶解した。
【０１２１】
感染チンパンジー血漿プール由来の単離した核酸に、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター(HPRI)(Amersham Corp.から購入)の存在下でポリ-Aポリメラーゼを用い、担体としてMS2 RNAを用いて、ポリrAを付加した。２mlの血漿中の核酸と等量の単離された核酸をTMN(50mMのトリスHCl(pH7.9)、10mMのMgC12、250mMのNaCl、2.5mMのMnCl2、２mMのジチオスレイトール(DDT)、40マイクロモルのα−[32Ｐ]ATP、20単位のHPRI(Amersham Corp.)、および約９から10単位のRNaseを含まないポリ-Aポリメラーゼ(BRL)を含有する溶液中でインキュベートした。37℃で10分間、インキュベートを行い、この反応をEDTAで終了させた(最終濃度約250mM)。この溶液を同量のフェノール−クロロホルムで抽出し、そして、同量のクロロホルムで抽出し、そして、核酸を200mMのNaClの存在下で2.5容量のエタノールで−20℃で一晩、沈澱させた。
【０１２２】
クローンb5aの単離
βHCV cDNAライブラリーを、クローン15e中のHCV cDNA配列に基づいた配列を有した合成プローブを使用するハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。クローン15eの単離は、欧州特許公開第318,216号に記載されており、その配列は、図６に示されている。合成プローブの配列は、以下の通りであった。
5' ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'
【０１２３】
ライブラリーのスクリーニングによって、約1,000個の塩基対のHCV cDNA領域を有するクローンβ-5a(b5a)が生産された。このcDNAの５'領域は、クローン35f、19g、26gおよび15eと重複している(これらのクローンは、前述されている)。
【０１２４】
３'末端ポリＡ配列とクローン15eに重複する３'配列との間の領域は、約200個の塩基対を含んでいる。このクローンによって、３'末端配列の領域がHCVゲノムであると同定され得る。
【０１２５】
b5aの配列は、クローン16jh(以下に記載されている)中のHCV cDNAの配列内に含まれている。さらに、配列はまた、オリジナルのλ-gt11ライブラリー(ATCC第40394号)から単離された、CC34a中に存在している。(オリジナルのλ-gt11ライブラリーは、本願では、「C」ライブラリーと呼ばれる)。
【０１２６】
HCVゲノムの３'領域のPCR増幅によって生成されたクローンの単離と配列
HCVゲノムの３'領域由来のヌクレオチド配列を有する複数のcDNAクローンを生成した。これは、以下に記載のように改変された、Saikiら(1986)およびSaikiら(1988)に記載のポリメラーゼ連鎖反応技術によって、ゲノムの標的領域を増幅させることによって成し遂げられた。増幅されたHCV RNAを、欧州特許公開第318,216号に記載のHCV cDNAλ-gt11ライブラリー(ATCC第40394号)の生産に使用されたオリジナルの感染性チンパンジープラズマプールから得た。HCV DNAの単離については、前述した。チンパンジー血清から単離された核酸を核酸基質の代わりに用いたこと以外は、Sippel(1973)に記載されるように、E.coliポリＡポリメラーゼによって単離されたRNAの３'末端にATPを付加した。ついで、プライマー−アダプターの成分および配列が以下の通りであったこと以外は、実質的にHan(1987)によって記載されるように、付加されたRNAを、オリゴdT-プライマーアダプターを使用して、逆転写酵素によってcDNAに逆転写した。
Figure 0003698520
【０１２７】
得られたcDNAを、２つのプライマーを使用するPCRによって増幅にかけた。
Figure 0003698520
【０１２８】
JH32プライマーは、66℃の算出されたTmで、ｃDNA中の標的領域の５'末端にハイブリダイズ可能な20個のヌクレオチド配列を有していた。JH11は、オリゴdT-プライマーアダプターの一部から由来したものであるため、64℃のTmで、cDNAの３'末端に特異的である。両方のプライマーは、増幅されたHCV cDNAの配列クローニングに使用される、５'末端における制限酵素である、NotIのための認識部位を有するように設計された。
【０１２９】
Perkin Elmer Cetus PCRキット(N801-0043またはN801-0055)中にある、４つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、およびThermus aquaticus(Taqポリメラーゼ)から単離された熱安定性DNAポリメラーゼを含む100マイクロリットルの反応混合液中でcDNAおよびプライマーを懸濁させることによって、PCR反応を行った。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA熱循環器中で、35サイクル行った。各サイクルは、94℃における1.5分間の変性工程、60℃における２分間のアニーリング工程、および72℃における３分間のプライマー延長工程から構成された。PCR生産物を、クローン15eの３'末端領域の配列に基づいた配列である、30個のヌクレオチドプローブ、JH34を使用するサザンブロット分析にかけた。JH34の配列は、以下の通りである。
5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'
【０１３０】
HCV cDNAプローブによって検出されたPCR生産物のサイズは、約50個から約400個の塩基対の範囲であった。
【０１３１】
増幅されたHCV cDNAをクローン化するために、PCR生産物は、NotIで消化されポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってサイズをした。300個の塩基対よりも大きなDNAは、pUC18SのNotI部位にクローン化された。ベクターpUC18Sは、pUC18のEcoRIとSalI部位との間にクローン化されたNotIポリリンカーを含ませることによって構築される。クローンのHCV cDNAの存在を、JH34プローブを使用して、スクリーニングした。陽性クローンの数を得て、配列決定した。これらのクローンの１つである16jh中の、HCV cDNA挿入部のヌクレオチド配列、およびそこにコードされたアミノ酸を、図２０に示す。クローン16jhにおけるHCV cDNAの配列中に検出されたヌクレオチド異変性を、この領域のもう一つのクローンと比較したものを、この図に示す。
【０１３２】
クローン6kの単離および配列
クローン16jhおよびクローンb5a(上記を参照)の配列に基づいて、以下の配列を有する合成プローブを生産した。
5' TCT TCA ACT GGG CAG TAA GAA CAA AGC TCA 3'
【０１３３】
オリジナルのλ-gt11HCV cDNAライブラリーをプローブを用いて(欧州特許公開第318,216号に記載されるように)スクリーニングすることによって、106中約１の頻度でクローンを生産した。これらの一つをクローン6kと名付け(また、C6kとも名付け)、そのHCV cDNA配列を図２１中に示す。また、この図に示されているのは、クローン16jhと重複しているものと、HCV cDNA内にコードされた推定ポリペプチドである。クローン6k中のHCV cDNA上の配列情報を、１本鎖のみから得た。クローンが、λgt11 c6kとして名付けられている、寄託されたこのクローン情報は、以下に記載している。C6K配列が、HCV1ポリペプチドをコードするORFの一部であるという確認は、他の重複クローンを配列決定することによって得られた。
【０１３４】
クローンp131jhの単離および配列
HCVゲノムの３'領域からの配列を含み、インフレーム終止コドンを含むクローンを、実質的に以下に記載されるように単離した。すなわち、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、HCV1 RNAをcDNAに変換したこと以外は、ゲノムの３'領域のPCR増幅によって生成されたクローンを単離した。
5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GAT TTA GGT GAC ACT ATA GAA T15 3'
【０１３５】
次いで、ｃDNAを、以下のプライマーを使用して、PCR反応によって増幅させた。
5' TTC GCG GCC GCT ACA GCG GGG GAC ACA T 3'
および
5' AAT TCG CGG CCG CCA TAC GA 3'
【０１３６】
増幅後、PCR生産物を、スペルミンで沈澱させ、NotIで消化し、フェノールで抽出した。精製された生産物を、pUC18SのNotI部位にクローン化し、HCV陽性クローンを以下のオリゴヌクレオチドを使用して選択した。
5' CGA TGA AGG TTG GGG TAA ACA CTC CGG CCT 3'
【０１３７】
p131jhとして名付けられた１つのクローン中のHCV cDNAは、図２２に示される。このクローンは、HCVゲノム中に含まれる大きなORFのインフレーム終止コドンを含んでいる。
【０１３８】
クローン５'-クローン32の単離および配列
クローンb114a中の配列の上流側である、HCVゲノムの５'領域からの配列を含むクローンを単離し、本願に参考のために取り入れた米国特許出願第456,637号に記載される、ゲノムの３'領域のPCR増幅によって生成されたクローン単離と配列のための方法を改変したものによって、ヌクレオチド配列を決定した。一般に、ゲノムの標的領域を、Saikiら(1986)およびSaikiら(1988)に記載のPCR法によって増幅させた。増幅されたHCV RNAを、Hanら(1987)によって記載されるコールドグアニジニウムチオシアネート法を使用して、ヒト血清(米国臨床単離株、HCV27)を抽出することによって得た。抽出されたRNAを、HCVゲノムのヌクレオチド−250から−223に相補的なプライマーJH94を使用して、逆転写酵素を用いて、一本鎖cDNAに変換した(図２３〜４７を参照)。JH94の配列は、以下の通りである。
5' CCT GCG GCC GCA CGA CAC TCA TAC TAA 3'
【０１３９】
一本鎖から二本鎖HCV cDNAへの変換を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、約20から50個のdA残基をDNAに付加(Sambrookら(1989), MOLECULAR CLONING)、NotI部位およびsp6プロモーターを有する以下のオリゴdTプライマー−アダプターを使用して、この付加された分子を複製することによって成し遂げた。
Figure 0003698520
【０１４０】
得られたcDNAを、JH94(上記に記載されている)および以下の配列を有しているJH11の２つのプライマーを使用して、PCRによって増幅にかけた。
Figure 0003698520
【０１４１】
Perkin Elmer Cetus PCRキット(N801-0043またはN801-0055)中にある、４つのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、緩衝塩、金属イオン、およびThermus aquaticus(Taqポリメラーゼ)から単離された熱安定性DNAポリメラーゼを含む100マイクロリットルの反応混合液中でcDNAおよびプライマーを懸濁させることによって、PCR反応を行った。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA熱循環器中で、35サイクル行った。各サイクルは、94℃における1.5分間の変性工程、60℃における２分間のアニーリング工程、および72℃における３分間のプライマー延長工程から構成された。
【０１４２】
PCR生産物を、NotIで消化し、pUC185にクローン化した。HCVヌクレオチド配列を含むクローンを、以下の配列を有する、HCV1ゲノムのヌクレオチド−312から−283由来のプローブであるAlex90でスクリーニングすることによって得た。 5' ACC ATG AAT CAC TCC CCT GTG AGG AAC TAC 3'
【０１４３】
単離されたクローン中のHCV cDNAを、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら(1977))によって配列決定した。単離されたクローンの１つである５'-クローン32中のHCV cDNAの配列は、図２３〜４７のヌクレオチド−224から−341までの領域に至っている。
【０１４４】
HCV cDNAのヌクレオチド配列を分析すると、HCV RNAストランドの複製物が、安定したヘアピン構造を形成し得るGCが豊富な配列を含んでいるのが示された。
【０１４５】
【化１０】
Figure 0003698520
【０１４６】
この構造において、ダッシュ線は、相補的なヌクレオチド間の可能な水素結合を示す。
【０１４７】
コンピューターデータベースである遺伝子バンク(Genebank)をサーチして、相同な配列が、既知のウイルス配列には見られないことが示された。従って、この配列は、HCVゲノムの５'末端に特有のものであり得る。
【０１４８】
ヘアピン構造は、転写酵素の認識信号としての役割を果たし得、および/または５'末端におけるRNAの安定性に貢献し得る。
【０１４９】
編集されたHCV cDNA配列
本願および欧州特許公開第318,216号に記載の様々なHCV cDNAライブラリー由来の一連の重複クローンから、HCV cDNAを編集した。図２３〜４７が由来するところのクローンは、5'-32、b114a、18g、ag30a、CA205a、CA290a、CA216a、pi14a、CA167b、CA156e、CA84a、CA59a、K9-1(またK9-1とも名付けられている)、26j、13i、12f、14i、11b、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、32、33b、25c、14c、8f、33f、33g、39c、35f、19g、26g、15e、b5a、16jh、C6kおよびp131jhである。これらのクローンの単離方法および配列は、本願および本願に参考のために取り入れられた欧州特許公開第318,216号に記載されている。図２３〜４７において、配列の上にある３つのダッシュは、推定開始メチオニンコドンの位置を示す。
【０１５０】
クローンb114aが、クローン18g(すなわち、5'-CA)における配列の上流側にさらに２つヌクレオチドを含んでいること以外は、クローンb114aは、クローン18g、ag30aおよびCA205aと重複している。これらの余分な二つのヌクレオチドは、図２３〜４７に示されるように、HCVゲノム配列中に含まれている。
【０１５１】
上記に記載のクローンのいくつかは、オリジナルのHCV cDNAλ-gt11 Cライブラリー(ATCC第40394号)以外のライブラリーから得られたが、これらのクローンは、オリジナルのライブラリー中のHCV cDNA配列と重複するHCV cDNA配列を含んでいる。従って、実質的にすべてのHCV配列が、第１HCV cDNAクローン(5-1-1)を単離するのに使用されたオリジナルのλ-gt11 Cライブラリー(ATCC第40394号)から抽出できる。クローン5-1-1の単離については、本願で参考のために取り入れた欧州特許公開第318,216号に記載されている。
【０１５２】
HCV cDNAの複合体(composite)中にコードされた主要なHCVポリタンパク質の推定配列をまた示す。この配列中の第１アミノ酸は、大きなORFの推定開始メチオニンである。クローナル不均一性による、変異アミノ酸は、配列の上に示されている。λgt11ライブラリーは、１つの個体から得られた血清から生産された(欧州特許公開第318,216号)ため、この結果は、変異型ウイルス配列(ヌクレオチドおよびアミノ酸)が、この個体中に存在していることを示唆している。
【０１５３】
複合(composite)HCV cDNA配列を調べると、大きなORFの他に、ポリタンパク質をコードする配列の上流側に、多数のORFが存在し、ポリタンパク質をコードする配列内においては、他の２つの翻訳フレーム中に多数の小さなORFが存在していることが示される。HCVポリタンパク質の上流側にあるORFは、表１に示されている。
【０１５４】
【表１】
Figure 0003698520
【０１５５】
ポリタンパク質の推定イニシエータMETをコード化する配列より下流側のORFのリーディングフレーム、位置およびサイズを表２に示す。主要なポリタンパク質はリーディングフレーム２から翻訳されるものである。
【０１５６】
【表２】
Figure 0003698520
【０１５７】
上記に加えて、HCV RNAのゲノムストランドと相補する配列の試験もまたいくつかの小さなORFを含有する。HCV RNA配列の−341から＋837のヌクレオチドと相補するこれらORFの１つは、385アミノ酸のポリペプチドをコード化する。
【０１５８】
異なる地理的場所からのHCV単離株から得られる５'領域の配列の比較
米国(HCV18、HCV27)、イタリア(HCVI1、HCVI24)および韓国(HCVK1)のそれぞれからのHCV単離株の５'領域からのヌクレオチド配列を比較した。
【０１５９】
HCV cDNA配列の単離は、以下の点を除いては、本質的には上述の５'クローン32の単離に対してと同様に行われた。HCVヌクレオチド−90から−73および366から383にそれぞれ相補するJH51またはr16のいずれかをプライマーとして使用して、抽出されたRNAをcDNAへと逆転写した。これらのプライマーの配列は以下の通りである。
Figure 0003698520
【０１６０】
HCV dsDNAの増幅は、５'および３'プライマーとしてそれぞれJH93およびJH52を使用してPCR方法により行なわれた。JH92におけるHCV配列は−317から−296のHCVヌクレオチド由来であり、JH52における配列は−93から−117のHCVヌクレオチドに由来する。ヌクレオチド番号は配列の下の括弧内に示す。JH52では下線を引いたジヌクレオチドが突然変異してNotIサイトを生成した。これらのプライマーの配列は以下の通りである。
Figure 0003698520
【０１６１】
増幅の後、PCR生成物はNotIにより分裂しpUC18Sへとクローン化された。HCV cDNAは、PCRによる増幅のあと直接配列決定により、またはクローン化されたHCV cDNAがプライマーの延長およびジデオキシ法により配列決定された。配列決定のプライマーの延長およびジデオキシ法は、上述の５'クローン32に対してと同様に行われた。
【０１６２】
直接配列決定のためのPCR法は５'プライマーとしてAlex90(上記の該配列について参照)を使用し、また３'プライマーとしてr25を使用した。Alex90は−312から−283のHCVヌクレオチドに由来し、r25は365から342のヌクレオチドに由来する(図２３〜４７参照)。r25の配列は以下の通りである。
5' ACC TTA CCC AAA TTG CGC GAC CTA 3'
【０１６３】
HCV27、HCVK1、HCVI1、HCVI24、およびHCV18の５'領域の配列と、プロトタイプHCV、HCV1の配列との比較は以下のことを示した。試験された５'領域は５つのHCV単離株の間に高度に保存される。配列は、HCVI24の位置−171で削除された１つのヌクレオチド、および単離株HCVK1の位置−222から−219の４個のヌクレオチドが不明瞭である以外は同じであるように見えた。
【０１６４】
この領域での高レベルの配列保持はウイルスの複製および/または転写および/または翻訳におけるこの領域の役割を反映し得る。
【０１６５】
異なる個体からのHCV単離株における配列変異
CDC/HCV1から逸脱する配列を含むHCVの単離株がヒトの個体において同定された。これらのいくつかは抗C100-3抗体に対して血清学的にポジティブであった(EC10は抗体に対してネガティブであった)。これらの新しい単離株の同定は、CDC/HCV1配列を使用するPCR法により増幅されたHCVゲノムのクローン化および配列決定セグメントにより行われた。増幅は本質的にはHCV/cPCR法に基づいて行われた。この方法は本明細書にて述べたHCV cDNAに基づいてプライマーおよびプローブを使用する。この方法の第１段階は、逆転転写酵素を使用してcDNAをHCVゲノムまたはその複製中間物のいずれかへと合成することである。HCV cDNAの合成後、および増幅の前にサンプルのRNAは当該分野において既知の方法により減退される。HCV cDNAの特定のセグメントは次に適切なプライマーを使用して増幅される。増幅された配列はクローン化され、増幅した配列を含むクローンが、プライマーの間に存在するがプライマーとは重複しない配列に相補するプローブにより探知される。
【０１６６】
米国のヒトから単離されたHCV単離株
HCVビリオンの源として使用された血液サンプルがノースカロライナ州シャーロットの米国赤十字社およびミズーリ州カンサスシティのCommunity Blood Center of Kansasから得られた。サンプルは、欧州特許公開第318,216号にて述べられているELISAアッセイを使用してHCV C100-3抗原に対する抗体を求めてスクリーニングされ、またポリクローナルヤギ抗ヒトHRPを使用して相補するWesternブロット分析を行って抗HCV抗体を測定した。それぞれ米国赤十字社およびCommunity Blood Center of Kansasからの２つのサンプル、#23および#27がこれらのアッセイによりHCVポジティブであると決定された。
【０１６７】
これらのサンプルの血清中に存在するウイルス粒子が、Bradleyら(1985)の述べた条件の下で超遠心分離法により単離された。10マイクログラム/mlのプロティナーゼＫおよび0.l％のSDSという最終濃度でプロティナーゼＫおよびSDSによる消化によりRNAが粒子から抽出された。消化は37℃で１時間の間行われた。ウイルスRNAは、欧州特許公開第318,216号にて述べられているようにクロロホルム−フェノールによる抽出によりさらに精製された。
【０１６８】
RNAの調製においてHCV RNAはcDNA配列1958〜1939に対応し、また次の配列をもつオリゴヌクレオチドJHC7が逆転写酵素の反応のためのプライマーとして使用されたということ以外は、本質的には欧州特許公開第318,216号にて述べられているように、cDNAへと逆転写された。
JHC7： CCA GCG GTG GCC TGG TAT TG
【０１６９】
cDNAの両ストランドが合成された後、結果として得られたcDNAは次に、使用したオリゴヌクレオチドプライマー、すなわちJHC6およびALX80が、673から1751のCDC/HCV1ヌクレオチドからのHCVゲノムの1080ヌクレオチドセグメントを増幅するように設計されているという点以外は、本質的にはPCR増幅により生成されたクローンの単離に対して上述したPCR法により増幅された。さらに、プライマーはPCR生成物の３'末端でNOTI制限サイトを、および５'終端でブラント末端を組み込むように設計されている。プライマーの配列は次の通りである。
ALX80： TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG
および
JHC6： ATA TGC GGC CGC CTT CCG TTG GCA TAA
【０１７０】
ALX80はCDC/HCV1配列のヌクレオチド673〜702に対応する。JHC6はHCV1のヌクレオチド1752〜1738に対応する。(さらにNotIサイトをコード化する12個の余分のヌクレオチドがある)。JHC6におけるヌクレオチドの命名、すなわち下降番号はアンチセンス鎖における配置を示している。
【０１７１】
PCRの上述のプライマーとの増幅の後、ブラントエンドテルミヌスは次のようにNOTIサイトに変換された。15DgSのホモポリマーテイルが最後のデオキシヌクレオチド転写酵素を使用してPCR生成品に接着され、この生成品はJHC6およびJHC13をプライマーとして使用してPCRにより再び増幅された。下記の配列をもつ後者のプライマー、JHC13は、SP6ファージプロモータに加えてNOTIサイトを含有するように設計されている。(SP6プロモータについてはJ.Setlow編のGENETIC ENGINEERING(1988)に述べられている。)
Figure 0003698520
【０１７２】
増幅されたHCV cDNAをクローン化するために、PCR生成品がNotIにより分裂され、スペルミンにより沈澱して遊離オリゴヌクレオチドを除去(Hoopesら(1981))、次いでpUC18SのNotIサイトヘとクローン化された(第IV.A.34参照)。各HCV単離株に由来する３個のクローンにおけるHCV cDNAに対して配列分析が行われた。分析は本質的にはChenおよびSeeburg(1985)により述べられた方法により行われた。
【０１７３】
サンプル23および27においてHCVに由来するクローンのコンセンサス配列をそれぞれ図７４、および図７５および７６に示す。これらの図には、コンセンサス配列においてコード化されたアミノ酸と同様、変異配列もまた示されている。
【０１７４】
図６７〜６９および図７０は、サンプル23、27およびHCV1の整合したポジティブストランドのヌクレオチド配列(図６７〜６９)および推定のアミノ酸配列(図７０)の比較を示す。図６７〜６９のHCV1のアミノ酸配列は、HCVゲノムRNAの中の大きなORFによりコード化されたHCVポリタンパクのアミノ酸番号129〜467を表わす。図７４、および図７５および７６の試験は３個の単離クローンの配列において変異が存在することを示す。ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルでの配列変異を表３にて要約する。表３において、ＳおよびNS1と命名されたポリペプチドはそれぞれアミノ酸番号130から約380、および380から約470を表す。番号付けは推定イニシエータメチオニンからのものである。ＳおよびNS1という用語はFlavivirusモデルを使用してポリペプチドをコード化する配列の位置決めに基づくものである。しかし上述のように、ウイルスのポリペプチド領域、特に推定のE/NS1領域に関してはHCVとFlavivirusとの間には全体的な相関関係はないことが最近明らかとなっている。実際には、HCVポリペプチドおよびそれらのコーディング領域はFlavivirusモデルからの実質的な由来を示し得る。
【０１７５】
【表３】
Figure 0003698520
【０１７６】
新たに単離されたHCV配列においては変異は存在しないが、サンプル23および27(HCV23およびHCV27と呼ばれる)からクローン化された配列はそれぞれ1019ヌクレオチドを含有し、選択されたクローンにおけるこの領域の削除および追加ミュータントの欠如を示している。図６７〜６９および図７０における配列はまた単離配列がこの領域で再配列されていないことを示す。
【０１７７】
HCV1のための同意配列とHCVのその他の単離株のための同意配列との比較を上の表に要約する。チンパンジーの単離HCV1とヒトから単離されたHCVとの間の配列変異は、ヒト起源のHCVの間に見られるものとほとんど同じであった。
【０１７８】
２つの推定領域における配列変異が均一ではないということは興味深い。推定Ｓ領域における配列は比較的一定しているように見え、領域を通じて不規則に分散されている。これに対して、推定NS1領域は全体の配列より変異程度が高く、変異は推定ポリタンパク質の推定N-テルミヌスから約70個のアミノ酸だけ下流に位置する約28個よりなる高可変ポケット内にあるように見える。
【０１７９】
探知された変異は、増幅プロセスの間に導入されたと論じられ得るが、変異のすべてはこの結果からであるとは思われない。Taqポリメラーゼがサイクル当りのDNAテンプレート10キロベース当り約１ベースで配列にエラーを導入することが概算されている(Saikiら(1988))。この概算に基づけば、1019bp DNAフラグメントのPCR増幅の間に最大７個のエラーが導入されたであろうことになる。しかし、HCV-23およびHCV-27の３個のサブクローンはそれぞれ29および14のベース変異を生じた。次のことはこれらの変異が自然に発生することを示唆する。ベース変化の約60％はアミノ酸配列を変化させない静かな突然変異である。Taqポリメラーゼにより導入された変異は無作為に起こることが予想される。しかし結果は、変異配列が少なくとも１つの特定の領域に密集する。さらに、PCR増幅生成品から由来する多数の異なるクローンを配列決定することにより、コンセンサス配列が由来する。
【０１８０】
イタリアおよび米国に於けるヒトからのHCV分離株
異なった分離株に存在するHCV RNAのセグメントはHCV/cPCR法により拡大された。これらのセグメントは推定HCVポリタンパク質のメチオニンコード開始コドンから下流の〜0.6kbから〜1.6kbの領域を作り出す。分離株はHCV感染の個体から得られる生物学的標本からのものである。より詳細には、分離株HCT#18は米国に於ける個体のヒトプラズマから、EC1およびEC10はイタリアの患者の肝臓の生検から、そしてThはアメリカ人の患者の末梢血単核球分画からのものである。HCV RNAの比較できるセグメントはチンパンジーから単離された。
【０１８１】
RNAはヒトプラズマの標本からフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出液を使用して抽出された。0.1mlまたは0.01mlのプラズマを10から40μg/mlのポリアデニル酸を含むTENB/プロテアーゼＫ/SDS溶液(0.05Mトリス-HCL(pH8.0)、0.001M EDTA、0.1M NaCl、１mg/mlプロテアーゼＫ、および0.5％SDS)で最終容量の1.0mlに希釈し、37℃で60分間培養した。このプロテアーゼＫの消化の後、得られたプラズマ分画をTE(50mMトリス-HCl(pH8.0)、１mM EDTA)飽和フェノールで、pH6.5で抽出することによって除タンパクした。フェノール相を遠心分離によって分離し、0.1％SDSを含むTENBで再抽出した。得られた各抽出からの水相を集め、等容量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール/［１：１(99：１)］で二度抽出し、次いで等容量のクロロホルム/イソアミルアルコールの99：１混合液で二度抽出した。遠心分離により相分離をし、水相を0.2M酢酸ナトリウムの最終濃度にし、二容量のエタノールを加えて核酸を沈澱させた。沈澱した核酸をSW41 38Kのローター中で４℃で60分間超遠心分離により、または10Kのマイクロフェージ中で４℃で10分間超遠心分離した。
【０１８２】
肝臓の生検から抽出されたRNAが、Ospedale Maggiore di S. Giovanni Battista, Torino, ItalyのF. Bonino博士により提供された。
【０１８３】
単核球分画がメーカーの指示を用いてFicoll-PaqueTM(ファルマシア社)を通して得られる個体の血の部分標本の沈澱によって得られた。全RNAを分画から欧州特許公開第318,216号(Chooら(1989)をも参照)に記載のグアニジンチオシアネート法を用いて抽出した。サンプルからのHCV cDNAの合成を逆転写酵素と、クローン156eおよびクローンK91由来のプライマーを使用して行った。ゲノムRNAに相対的なアンチセンスであるこれらのプライマーは次の様な配列を有する。
156e16B： 5' CGA CAA GAA AGA CAG A 3'、
および
K91/16B 5' CGT TGG CAT AAC TGA T 3'。
【０１８４】
エタノール沈澱に続いて沈澱したRNAまたは核酸分画を乾燥し、DEPC処理された希釈水中に再懸濁した。核酸中の二次構造を65℃で10分間加熱して壊し、そのサンプルを直ちに氷上で冷却した。cDNAを１から３μgの肝臓から全RNA、または10から100μlのプラズマから抽出された核酸(またはRNA)を使用して合成した。その合成には逆転写酵素が用いられ、メーカーにより特定されたプロトコールのBRLを用いて25μlの反応であった。cDNA合成のためのすべての反応混合物はRNAase阻害剤、RNASIN(Fisher/Promega)の23単位を含んでいた。cDNA合成に続いて、その反応混合物を水で希釈し、10分間ボイルし、そして速やかに氷上で冷却した。
【０１８５】
各サンプルは２周のPCR増幅を受けた。反応のためのプライマーを「EnvL」および「EnvR」と示された領域を増幅するために選択した。「EnvL」領域はヌクレオチド669〜1243、および推定アミノ酸117〜308を包含しており；「EnvR」領域はヌクレオチド1215〜1629を包含し、推定アミノ酸300〜408(推定アミノ酸は推定メチオニン開始コドンから始めて番号づけられる)をコードする。これらの領域のHCV cDNAにコードされた推定ポリタンパク質に対する相対的な関係、そしてFlavirusモデルにコードされたポリペプチドに対する相対的な関係を図７７に示す。
【０１８６】
第１ラウンドのPCR反応のためのプライマーはクローンag30a、クローン156e、またはクローンK9-1のいずれかのHCV cDNA配列から誘導された。EnvL領域の増幅のために用いられるプライマーは156e16B(上出の)、およびセンス鎖のためのag30a16Aであった；EnvRの増幅にはプライマーK91/16B(上出の)が使用され、センス鎖のためには156e16aが用いられた。センス鎖プライマーの配列は次の様である。
For EnvR, ag30a16A: 5' CTC TAT GGC AAT GAG G 3'
および
For Envr, 156e16A: 5' AGC TTC GAC GTC ACA T 3'。
【０１８７】
PCR反応は、１μgのRNaseAを加えること以外は本質的にメーカーの指示(Cetus-Perkin-Elmer)に従って行われた。反応は最終容量が100μlになるように行われた。PCRを、94℃(１分)、37℃(２分)、および72℃(３分)、そして最終サイクルの72℃では７分間延長する方式を利用して30サイクル行った。次いで、サンプルをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで２回沈澱させ、10mMトリス塩酸中にpH8.0で再懸濁させ、Centricon-30(Amicon)濾過を用いて濃縮した。この方法は効率的に30ヌクレチドより小さなオリゴヌクレオチドを除去する；このようにして、PCR増幅の第１ラウンドからのプライマーを除去する。
【０１８８】
Centricon-30で濃縮されたサンプルは、次いで、EnvL領域のためにクローン202aおよび156eから、そしてEnvR領域のために156eおよび59aから設けられたプローブを用いるPCR増幅の第２ラウンドにかけられた。EnvL領域の増幅のためのプライマーは次の様な配列を有する。
Figure 0003698520
【０１８９】
ヒト由来のRNAのEnvR領域の増幅のためのプライマーは次の様な配列を有する。
Figure 0003698520
【０１９０】
PCRによる増幅は、94℃(１分)、60℃(１分)、および72℃(２分)で、最後のサイクルでは72℃で７分間延長する方式を用いた35サイクルであった。そのサンプルを、次いで、フェノール：クロロホルムで抽出し、２回沈澱させ、そしてEcoRIで消化した。PCR反応生成物を６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により生成物を分析した。ほぼ推定された大きさの期待されたPCR生成物のDNAがゲルから電気溶出され、pGEM-4プラスミドベクターまたはλgt11のいずれかにサブクローンされた。増幅の第一ラウンドの後、EnvLおよびEnvRに期待される生成物の大きさはそれぞれ615bpおよび683bpであり；増幅の第二ラウンドの後、EnvLおよびEnvRに期待される生成物の大きさはそれぞれ414bpおよび575bpである。増幅された生成物を含むプラスミドを宿主細胞を形質転換するために用いた；pGEM-4プラスミドをDH5-アルファを形質転換するために使用し、λgt11をc600デルタ-HFLを形質転換するために使用した。適当なHCVプローブ(以下に記述される)にハイブリダイズするかまたは正しい大きさの挿入物を有するプローブにハイブリダイズした形質転換された細胞のクローンを選択した。次いで、挿入物をM13にクローンし、配列した。
【０１９１】
すべてのHCV/cPCR生成物のためのプローブは、HCV cDNAの32Ｐラベル化セクションから成り、このcDNAはクローン216(プライマーとしてCA216a16Aおよび216a16Bを使用する)、およびクローン84(プライマーとしてCA84a16AおよびCA84a16BまたはCA84a16cを使用する)の領域のPCR増幅によって調製された；32Ｐはニッケル翻訳によりPCR生成物の中に導入された。EnvL増幅の第一および第二ラウンドのプローブはクローン216からのものであった。EnvR増幅の第一ラウンドのためのプローブは84(すなわち、CA84a16AおよびCA84a16B)からのものであり、EnvL増幅の第二ラウンドのためのプローブはCA84a16AおよびCA84a16Cであった。これらのプローブはHCV/cPCR反応に用いられるプライマーとオーバーラップしなかった。プローブのPCR増幅のためのプライマー配列は表４のようである。
【０１９２】
【表４】
Figure 0003698520
【０１９３】
EnvL領域の変位体(Variants)についての配列情報はHCT#18からの３クローン、THからの２クローン、EC1からの３クローンから得られ、そして前出の欧州特許公開第318,216号に記載のHCV1クローンから得られた。図７８〜８０には、これらのクローン由来の各々の分離株の複合のヌクレオチド配列の比較が示されている。この図では、各配列がEnvL領域のセンス鎖のために５'から３'に示され、そしてその配列が並べられている。垂直線および大文字は配列相同性を示し、線がなくて大文字化されていない文字は相同性がないことを示している。
【０１９４】
線で示されている配列は次の様である：
線１，Thorn；線２，EC1；線３，HCT#18；線４，HCV1。
【０１９５】
EnvR領域の変位体についての配列情報はEC10の２つのクローンから、そして前出の欧州特許公開第318,216号に記載されているHCV1クローンから得られた。二つのEC10クローンは一つのヌクレオチドだけ異なっていた。図８１に、EC10(クローン２)のヌクレオチド配列と複合物のHCV1配列との比較が示されている：各々の配列をEnvR領域のセンス鎖に対して５'から３'と示されており、その配列が並べられている。配列間のタブルドットは配列相同性を示している。
【０１９６】
EnvL(アミノ酸#117〜308)にコードされたアミノ酸配列と各々の単離株のEnvR領域(アミノ酸#300〜438)との比較が図８２および図８３にそれぞれ示されている。これらの図に前述の分離株JH23およびJH27の配列が含まれている。日本人の分離株からの配列もまた示されている；これらの配列は日本のT.Miyamuraによって提供された。図には、その領域のアミノ酸がHCV1に対してそっくりそのまま与えられており、種々の分離株の非相同アミノ酸が示されている。
【０１９７】
図８２からわかるように、EnvL領域ではHCV1と他の分離株との間に全体でおよそ93％の相同性がある。HCT18、Th、およびEC1はHCV1とおよそ97％の相同性があり；JH23およびJH27はHCV1と、それぞれおよそ96％および95％の相同性を有する。図８３はEnvR領域の相同性がEnvL領域よりも有意に少なくて；さらに、一つの副領域は超可変性(すなわちアミノ酸383〜405から)のように見える。このデータを表５に要約する。
【０１９８】
【表５】
Figure 0003698520
【０１９９】
ポジティブおよびネガティブストランドの検出
血清中の５'HCV RNA
血清から単離された、HCV27のRNAは、PCR法を用いてポジティブおよびネガティブストランドの存在について分析した。PCR法については、次の事柄を除いて、基本的に上述のように実施した。抽出したHCV27 RNAは、Alex90またはJH52(配列については前出参照)をプライマーとして用いて、一本鎖cDNAに逆転写した。Alex90の配列はHCV RNAのポジティブストランドの−312から−283位のヌクレオチドに一致している。これに対して、JH52は、ネガティブストランドの−117から−93位のヌクレオチドに一致している。得られた一本鎖HCV cDNAは、各々Alex90およびJH52を用いたPCRにより増幅を行った。増幅された生産物はAlex89をプローブとしてサザンブロッティングにより行われた。Alex89はHCV RNAの−203から−175位のヌクレオチドに一致する。Alex89の配列は次のとおりである。
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'
【０２００】
この方法によると、分析により、RNAの両ストランドの増幅生産物のシグナルは同等の強度を有することが示された。このことにより、HCVのRNAの５'領域は二本鎖RNAとして存在し得ることが示唆された。
【０２０１】
HCVのサンドイッチハイブリダイゼーションのためのプローブ
本実施例は、米国特許第4,868,105号に記載の分析方法を基本的に用いて生物学的試料中のHCV RNAを検出するのに有用な一対のラベルおよびカプチャープローブを例示する。この方法は、溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであり、このアッセイにおいては、分析物である核酸において標的の配列にハイブリダイズする、カプチャーおよびラベルプローブを用いる。生物学的試料のスクリーニングにおいて使用されたプローブは、HCVゲノムの保存領域(conserved regions)に結合し、HCV結合領域はHCVゲノムに対するユニーク性について選択される。カプチャープローブの結合パートナーに結合する領域、またはラベル部分(あるいは、欧州特許公開第317,077号に開示の方法が用いられるのであれば、増幅多量体)に結合するラベルプローブの部分は、次のように選択される。つまり、それらはデータバンクまたはHCVの既知の配列のいずれにも結合しないように、そしてそれらは選択条件下において、それらの相補体と安定な二本鎖を形成するようにＧおよびＣの適切な量を有するように選択される。カプチャーおよびラベルプローブはセットであり、一組のプローブは他の組のプローブに変化を与えない。これらのプローブは、図２３〜４７に示されるプロトタイプHCV cDNA配列のコード鎖の中の表６〜表８中のヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。
【０２０２】
【表６】
Figure 0003698520
【０２０３】
【表７】
Figure 0003698520
【０２０４】
【表８】
Figure 0003698520
【０２０５】
上記表中のセットにおいて、各々のカプチャープローブは、HCV配列に相補的な配列に加えて、次の配列をHCV配列の下流(つまり、３'末端)に有する：
5' CTT CTT TGG AGA AAG TGG TG 3'
【０２０６】
各々のカプチャープローブに共通の配列は結合パートナーの配列に相補的であり、従って、ハイブリダイゼーションの後、二本鎖は固相に固定することにより捕捉され得る。
【０２０７】
各セットにおいてまた、各ラベルプローブはHCV配列の相補的な配列に加えて、次の配列をHCV配列の下流に有する：
5' TTA GGC ATA GGA CCC GTG TC 3'
【０２０８】
欧州特許公開第317,007号に記載の方法が用いられる場合には、各ラベルプローブに共通の配列は、多量体(multimer)の配列に相補的であり、この多量体とのハイブリッド二本鎖の形成を可能とする。
【０２０９】
上記セット中のプローブの配列を図４８〜５０に示す。
【０２１０】
PCR増幅を用いたHCVポリヌクレオチド配列の検出
cPCRによるHCV RNAの増幅の一般化された方法において、RNA鎖はビリオンまたはmRNA鎖であり、これは「センス」鎖である。しかし、中間体の複製型がまた、「アンチセンス」であるとして検出されることも可能である。この場合には、プライマーが「センス」である。標的領域を含むRNAセンス鎖がアンチセンスプライマーとハイブリダイズし、このアンチセンスプライマーは、標的を含む複製ストランドの合成をプライムする。RNA鋳型に対するcDNAは、プライマーおよび鋳型依存性逆転写酵素を用いて合成される。得られたRNA：cDNAハイブリッドのcDNAは変性およびRNAseによる処理により放出される。プライマーはcDNAにアニールし、プライマーおよび鋳型依存DNAポリメラーゼにより伸長する。生産物は変性され、プライマーに再びアニールされ、２回目の合成が続けられる。標的領域を含む増幅された生産物が所望の量(これは少なくとも検知し得るレベルである)に達するまで、何度も繰り返して行われる。
【０２１１】
NANBHを有するチンパンジー由来の肝臓および血漿標品におけるHCV核酸配列由来の、増幅されたHCV核酸配列の検出
NANBHを有するチンパンジーの肝臓および血漿に存在し、コントロールのチンパンジーには存在しないHCV核酸は、基本的にSaikiら(1986)に記載されたポリメラーゼ連鎖反応により増幅された。プライマーオリゴヌクレオチドは、クローン81(図５２)、またはクローン36(図５３)およびクローン37b(図５４)中のHCV cDNA配列に由来する。増幅された配列は、ゲル電気泳動および改変されたサザンブロッティング法を用いて決定された。この方法においては、２つのプライマー間の配列であってプライマーを含まない配列により適当なcDNAオリゴマーまたはニック翻訳されたcDNA配列をプローブすることにより、決定された。
【０２１２】
増幅システムにより調べられるHCV配列を含むRNAのサンプルが、NANBHを有する３匹のチンパンジーおよび２匹のコントロールのチンパンジーの肝臓生検材料から単離された、poly A+ RNAフラクションの単離は、Maniatisら(1982)に記載のグアニジンチオシアネート法により行われた。
【０２１３】
増幅システムにより調べられたRNAのサンプルはまた、NANBHを有する２匹のチンパンジーおよび一匹のコントロールのチンパンジー、さらにコントロールのチンパンジーの血漿のプールから単離された、一匹の感染したチンパンジーは106CID/ml以上の力価を有し、もう一匹の感染したチンパンジーは105CID/ml以上の力価を有していた。
【０２１４】
核酸を血漿から次のように抽出した。0.1mlまたは0.01mlの血漿を、10μg/mlのポリアデニル酸を含むTENB/プロティナーゼＫ/SDS溶液(0.05MトリスHCl、pH8.0、0.001M EDTA、0.1M NaCl、１mg/mlプロティナーゼＫ、および0.5％SDS)で希釈して、最終容量を1.0mlとして、37℃で60分間インキュベートした。このプロティナーゼＫでの消化の後、得られた血漿画分は、TE(10.0mMトリスHCl、pH8.0、１mM EDTA)で飽和したフェノールにより抽出することにより除タンパクを行った。フェノール相を遠心分離により分離し、0.1％SDSを含むTENBで再抽出した。各抽出物から得られた水相をプールし、等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール［１：１(99：１)］で抽出し、次いでクロロホルム/イソアミルアルコールの99：１の混合物等量により２度抽出した。遠心分離による相分離に続き、水相を酢酸ナトリウムが0.2Mの濃度となるようにし、そしてエタノール２倍容量を加えて核酸を沈澱させた。沈澱した核酸はSW41ローターを用い、38Kで４℃にて60分間超遠心分離により回収した。
【０２１５】
上記に加えて、高力価のチンパンジー血漿およびプールされたコントロール血漿を、それぞれ、ChomcyzskiおよびSacchi(1987)の方法により50μgのポリＡキャリアを用いて抽出した。この方法においては、酸性グアニジンチオシアネート抽出(acid guanidinium thiocyanate extraction)を用いる。RNAを、10,000RPMで４℃にて10分間、エッペンドルフマイクロチューブにより遠心分離することにより回収した。
【０２１６】
２つの場合において、PCR反応にてcDNAの合成に先立ち、プロティナーゼＫ/SDS/フェノール法により血漿から抽出された核酸は、さらに、ＳおよびS Elutip-Rカラムに結合および溶出させることにより精製される。製造者の指示による方法が、それに続いて行われる。
【０２１７】
PCR反応に鋳型として用いられるcDNAは、上記のようにして調製された核酸(総核酸またはRNA)由来である。エタノール沈澱に続き、沈澱した核酸を乾燥し、DEPC処理された蒸留水に再懸濁する。核酸の２次構造を、65℃で10分間加熱することにより破壊し、サンプルを直ちに氷上で冷却した。チンパンジーの肝臓由来、または10〜100μlの血漿から抽出した核酸(またはRNA)由来の、チンパンジーの総RNA１〜３μgを用いて合成された。合成には逆転写酵素を用い、製造業者であるBRLにより決められたプロトコルにより25μlで反応を行った。cDNAの合成に用いたプライマーはまた、PCR反応に用いたそれである。cDNA合成のためのすべての反応混合物は、RNAaseインヒビター、RNASINTM(Fisher/Promega)23単位を含有していた。cDNAの合成に続き、反応混合物を水で希釈し、10分間煮沸し、そして、速やかに氷上で冷却した。
【０２１８】
PCR反応は、RNaseAを１μg加えたことを除いては、基本的には製造業者であるCetus-Perkin-Elmerの指示書に従って行った。反応は、最終容量100μlで行った。PCR反応は37℃(２分)、72℃(３分)および94℃(１分)で35サイクル行った。
【０２１９】
cDNA合成のためのプライマーおよびPCR反応のためのプライマーはクローン81、クローン36またはクローン37bのHCV cDNA配列に由来していた。(クローン81、36および37bのHCV cDNAの配列を、各々図５２、図５３および図５４にそれぞれ示す。)クローン81由来の２種の16量体の配列は次のとおりである。
5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3'
および
5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3'
【０２２０】
クローン36由来のプライマーの配列は次のとおりである：
5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'
【０２２１】
クローン37b由来のプライマーの配列は次のとおりである：
5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'
【０２２２】
PCR反応において、プライマー対を、クローン81由来の２つの16-mer、またはクローン36由来の16-merおよびクローン37b由来の16-merから構成した。
【０２２３】
PCR反応生産物を、アルカリゲル電気泳動法による生産物の分離に次いで、サザンブロットおよびプライマーに重複しないHCV cDNAの領域由来の32Ｐでラベルされた内部オリゴヌクレオチドプローブで、増幅されたHCV-cDNA配列を検出することによって分析した。PCR反応混合液を、フェノール/クロロホルムで抽出し、核酸を塩およびエタノールを用いて水溶相から沈澱させた。沈澱させた核酸を、遠心分離によって収集し、蒸留水中に溶解させた。サンプルの一部を、1.8％のアルカリアガロースゲル上で電気泳動にかけた。長さが60、108および161のヌクレオチドの一本鎖DNAを、分子量マーカーとしてゲル上で共電気泳動にかけた。電気泳動の後、ゲル中のDNAを、Biorad Zeta ProbeTM紙上に移した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、ならびに洗浄条件は、製造業者(Biorad)によって規定されたものであった。
【０２２４】
増幅されたHCV cDNA配列のハイブリダイゼーション検出に使用されたプローブは、以下の通りであった。一対のPCRプライマーをクローン81から得たとき、プローブは、２つのプライマーの配列間の領域中に配置されている配列に対応する配列を有する108-merであった。一対のPCRプライマーをクローン36および37bから得たとき、プローブは、そのヌクレオチド配列が図６２および６３に示されるクローン35由来のニックトランスレートされたHCV cDNAインサートであった。プライマーを、クローン37bインサートのヌクレオチド155〜170およびクローン36インサートのヌクレオチド206〜268から得る。クローン35中のHCV cDNAインサートの３'末端は、クローン36中のインサートのヌクレオチド１〜186に重複し、クローン35インサートの５'末端は、クローン37b中のインサートのヌクレオチド207〜269に重複する。(図５３、図６２および６３、および図５４を比較すること)。従って、クローン35中のcDNAインサートは、クローン36および37b由来のプライマーの配列間の領域の一部に延長し、これらのプライマーを含む増幅された配列のプローブとして有用である。
【０２２５】
肝臓検体からのRNAの分析は、プライマーおよびプローブの両方を使用して、上記の手法に従った。NANBHを有する３匹のチンパンジーの肝臓からのRNAは、予想されたサイズ(81および36および37bのそれぞれに対する161および586のヌクレオチド)の増幅配列に対して陽性のハイブリダイゼーション結果を生み出したのに対して、対照群のチンパンジーは、陰性のハイブリダイゼーション結果を生み出した。実験を３回繰り返すと、同一の結果が得られた。
【０２２６】
核酸およびプラズマからのRNAの分析はまた、プライマーおよびクローン81からのプローブを使用して、上記の手法に従った。プラズマは、NANBHを有する２匹のチンパンジー、対照群のチンパンジーおよび対照群のチンパンジーからプールされたプラズマから得た。NANBHプラズマの両方は、PCR増幅されたアッセイにおいて陽性の結果を生み出したのに対して、対照群のプラズマの両方は、陰性の結果を生み出した。これらの結果は、繰り返して何度も得られた。
【０２２７】
欠陥ウイルスは、RNAウイルス中に発生することが知られている。PCR技術を使用することによって、HCVゲノムの配列を増幅させるためにプライマーを設計することが可能である。増幅された生産物を分析することによって、ウイルスゲノムの欠陥および野生型のウイルス種の両方を同定することが可能であると予想される。従って、既知のHCV配列に基づいて２つのプライマーを使用すると、PCR生産物の予想サイズが正確に予想され得る。ゲル電気泳動法およびハイブリダイゼーション分析によって観察された大きな種はいずれも、潜在的に異型のゲノムを示し得た。あるいは、このように観察された小さな種のいずれもが、欠陥作用因を示し得た。これらの型の分析は、それが本当に野生型ウイルス配列であるかまたは欠陥ゲノムであるか、既知のHCV配列の正確な起源を確認するのに有用であり得る。これらの分析の技術および方法は、当該技術分野において既知であり、前述されている。この方法によって、当業者は、ウイルスゲノムの関連した(野生または欠陥)型を得ることが可能となる。
【０２２８】
PCRで増幅されたときにクローン81の由来のHCV cDNAと雑種形成する、捕捉粒子の配列の検出
捕捉粒子のRNAは下記のようにして得た。クローン81由来のHCV cDNAと雑種成形する配列の分析は、雑種形成プローブが、クローン81のcDNA配列由来のキナーゼ処理を行ったオリゴヌクレオチドであることを除いて、先に述べたのと同様のPCR増幅法を利用して実施した。試験結果は、増幅された配列が、HCV cDNAプローブと雑種形成したことを示している。
【０２２９】
粒子は、クローン5-1-1にコードされているポリペプチドに対する免疫精製抗体でコードされたポリスチレンビーズを用いて、HCVを感染させたチンパンジーの血漿から捕捉された。免疫精製された抗体の製剤の製造方法は、本願出願人が権利を有する欧州特許公開第318,216号に記載されているが、この特許出願は本願に援用するものとする。簡単に述べれば、クローン5-1-1内にクローン化されたHCVポリペプチドは、スーパーオキシドジムスターゼ(SOD)によって融合ポリペプチドとして発現された。これは、クローン5-1-1 cDNA挿入断片を発現ベクターpSODcf1にサブクローン化することによって行った(Steimerらの1986年の文献)。pSODcf1から単離したDNAをBamIとEcoRIで処理し、これら制限酵素によって生成した線状DNAに下記のリンカーを連結させた。
5' GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA 3'
【０２３０】
クローン化した後、上記挿入断片を含有するプラスミドを単離した。この挿入断片を含有するプラスミドをEcoRIで切断した。クローン5-1-1中のHCV cDNA挿入断片をEcoRIで切取り、上記のEcoRIで線状にしたDNAに連結させた。得られたDNA混合物を用いて、イーコリ(E.Coli)菌株D1210(Sadlerらの1980年の文献)を形質転換させた。ORFを発現するのに正しい配向の5-1-1 cDNAを有する組換え体を、制限地図を作成し、ヌクレオチドの配列を決定することによって同定した。１つのクローン由来の組換え体細菌を、IFTGの存在下、増殖させることによって、SOD-NANB5-1-1ポリペプチドを発現するよう誘導した。生成した融合ポリペプチドを、細胞抽出液を尿素で分画抽出し次いでアニオン交換カラムとカチオン交換カラムのクロマトグラフィを行うことによって、組換え体イー・コリから精製した。精製されたSOD-NANB5-1-1ポリペプチドをニトロセルロース膜に結合させた。HCV感染血漿の試料中の抗体を、前記のマトリックスに結合させたポリペプチドに吸収させた。洗浄して、非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後、結合した抗体を結合したポリペプチドから放出させた。
【０２３１】
NANBHを有する個体由来の肝臓と血清中のHCV RNAを検出するcPCR法
HCVの感染を検出する、PCR検定法すなわちcPCR検定法の改変法の信頼性と有用性を、感染個体由来の全肝臓RNAと血漿について検定することによって試験した。cPCR検定法では、試料中の推定ウイルスRNAは、逆転写酵素によってcDNAに逆転写され、得られたcDNAのセグメントは、次に、Saikiらの1986年の文献に記載されたPCR法の改変法を利用して増幅される。このcPCR法のプライマーは、HCV RNAから誘導され、本願発明で提供されるHCV cDNAのファミリーによって同定することができる。HCV-RNAに対応する増幅生成物は本願発明のファミリー由来で提供されるHCV cDNAのプローブを利用して検定される。
【０２３２】
これらの試験に用いられるcPCR/HCV検定法は、次のような方法を使って行った。すなわち、RNAを製造し、得られたRNAをcDNAに逆転写し、得られたcDNAの特異的セグメントをPCRで増幅し、次いでPCR産生物を分析する方法である。
【０２３３】
RNAは、Maniatisらの1982年の文献に記載されている、全RNAの製造法のグアニジウムイソシアネート法を利用して肝臓から抽出した。
【０２３４】
血漿から全RNAを単離するために、血漿をTENS［0.1M NaCL、50mMトリス-HCl(pH8.0)，１mM EDTA］で５倍〜10倍希釈し、プロティナーゼＫ/SDS溶液(0.5％のSDS、１mg/mlのプロティナーゼ、20μg/mlのポリＡキャリアー)中で37℃にて60〜90分間インキュベートした。得られた試料をフェノール(pH6.5)で１回抽出し、生成した有機相を、0.1％SDS含有TENSで１回再抽出し、両抽出の水性相をプールして、同容積のフェノール/CHCl3/イソアミルアルコール［１：１(99：１)］で２回抽出した。生成した水性相を同容積のCHCl3/イソアミルアルコール(99：１)で２回抽出し、0.2M酢酸ナトリウム(pH6.5)と2.5倍容積の100％エタノールを使用してエタノール沈澱を行い、20℃で一夜沈澱させた。
【０２３５】
PCR反応の鋳型として用いられるcDNAは、対応するcDNAを製造するための指定の試料を利用して製造した。各RNA試料(2μgの熱変性させた全チンパンジー肝臓RNA、2μlの血漿由来のRNAまたは10mm×4mmの円筒形のヒト肝臓生検品から抽出したRNAを100％含有している)を、１μMの各プライマー、１mMの各デオキシリボヌクレオチド３リン酸(dNTP)，50mMトリス-HCl(pH8.3)，5mM MgCl2、5mMジチオトレイトール(DTT)、73mM KCl、40単位のRNアーゼ阻害剤(RNASiN)および５単位のAMV逆転写酵素を含有する25μlの反応物中でインキュベートした。このインキュベーションは、37℃で60分間行った。cDNAの合成に続いて、得られた反応混合物を、50μlの脱イオン水(DIW)で希釈し、10分間沸騰させてから氷上で冷却した。
【０２３６】
HCV cDNAのセグメントの増幅は、２つの合成オリゴマーすなわち、HCV cDNAクローン36(アンチセンスクローン)と同クローン37b(センスクローン)由来の配列を有する16マーのプライマーを利用して行った。
【０２３７】
クローン36由来のプライマーの配列は、
5' GCA TGT CAT GAT GTA T 3'であり、
クローン37b由来のプライマーの配列は、
5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3'であった。
【０２３８】
これらのプライマーは、各々１mMの最終の濃度で使用した。プライマーが隣接しているHCV cDNAのセグメントを増幅するために、cDNA試料を、0.1μgのRNアーゼAと、Perkin Elmer Cetus PCRキット(N801-0043もしくはN801-0055)のPCR反応物質とともに、このメーカーの説明書に従って、インキュベートした。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal cycler中で30サイクルまたは60サイクル行った。各サイクルは、94℃で１分間の変性工程、37℃で２分間のアニール工程および72℃で３分間の伸長工程で構成されている。しかし最終サイクル(30もしくは60サイクル)は、３分間ではなくて７分間にした。増幅後、試料を、同容積のフェノール：クロロホルム(１：１)で抽出し、次に同容量のクロロホルムで抽出し、得られた試料を0.2Mの酢酸ナトリウムを含有するエタノールで沈澱させた。
【０２３９】
CPCR生成物は次のようにして分析した。生成物を、Murakawaらの1988年の文献に記載されている方法に従って、1.8％のアルカリ性アガロースゲル上で電気泳動させ、ゲルを0.4M NaOH中で一夜ブロットさせることによって、ゼータTMプローブ紙(BioRad Corp.社)に転移させた。得られたブロットを２×SSC(１×SSCは0.15M NaClと0.015Mクエン酸ナトリウムを含有している)で中和し、0.3M NaCl、15mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)、15mM EDTA、1.0％SDS、0.5％脱脂牛乳(Carnation Co.社)、および0.5mg/mlの音波処理を行った変性サケ精子DNAを含有する液中で予備雑種形成を行った。HCV cDNA断片について分析すべきブロットを、欧州特許公開第318,216号に記載されている。クローン35のHCV cDNA挿入断片配列のニックトランスレーションによって作成した、32Ｐでラベルを受けたプローブと雑種形成させた。雑種形成を行った後、ブロットを0.1×SSC(１×SSCは0.15MのNaClと0.01Mのクエン酸ナトリウムを含有している)中で65℃にて洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフにかけた。予想生成物の大きさは長さが586ヌクレオチドであり、プローブと雑種形成し、この大きさの範囲でゲル中に移動する生成物は、ウイルスRNAに対して陽性であった。
【０２４０】
対照として、α-1抗トリプシンmRNAを増幅するよう設計されたcPCRプライマーを、各被分析試料中にRNAが存在することを確認するために用いた。α-1抗トリプシン遺伝子のコーディング領域は、Rosenbergらの1984年の文献に記載されている。α-1抗トリプシン遺伝子のコーディング領域の365ヌクレオチドの断片を増幅するように設計された合成オリゴマーの16マープライマーは、ヌクレオチド22〜37(センス)およびヌクレオチド372〜387(アンチセンス)から誘導した。cDNA/PCRプライマーの配列の間に存在してその配列を含有せず、ニックトランスレーションを行い、32Ｐでラベルをつけたプローブを用いて、PCR産生物を検出した。
【０２４１】
PCR反応は高度に感受性なために、全試料について少なくとも３回試験した。次のような注意、すなわち、１)ゴム製Ｏリング密閉具を備えた、ねじぶた付きチューブを用いてエーロゾルをなくし、２)使い捨てピストン/キャピラリーを有するRanin MicromanTM容量ピペットでピペット採取し、および３)非隣接cDNAクローンから、cDNAとPCRプライマーのオリゴヌクレオチド配列を選択することによって、すべての偽陽性がなくなった。
【０２４２】
cPCR法により肝臓サンプルのＣ型肝炎ウイルスHCV RNAの検出
実験的に非Ａ非Ｂウイルス性肝炎因子に感染させたチンパンジー３頭の肝臓および、慢性非Ａ非Ｂウイルス性肝炎と診断されたイタリア人患者の肝臓生検から分離した総RNAのcPCR検定を実施した。
【０２４３】
図５５Ａは、肝臓総RNAの各標本から１μgを用いたcPCR検定の結果を表している。このRNAは、非Ａ非Ｂウイルス性肝炎慢性期のチンパンジー１頭(910)(レーン１)および、感染急性期のチンパンジー２頭(1028および508)(それぞれレーン２および３)の肝臓サンプルから分離したものである。30サイクル用レーン１〜３のサンプルについてPCRを実施し、これらのレーンを含むプロットのオートラジオグラムを５時間曝露した。急性感染動物1028(レーン４)および非感染チンパンジー３頭(レーン５〜７)の総RNA １μgから得られたcDNAを60サイクル用に増幅し、これらのレーンを含むオートラジオグラムを７日間曝露した。32ＰラべルしたMspI-同化pBR322 DNAをオートラジオグラム全てのマーカーとして用いた。結果からわかるように、HCV RNAに相当するcDNAは、急性・慢性を問わず、非Ａ非Ｂウイルス性肝炎チンパンジーのサンプルにのみ認められた(レーン１、３、４)。これらのレーンにおけるcPCR産物は527から622ヌクレオチドまでのマーカーフラグメントを移動した(表示せず)。
【０２４４】
図５５Ｂは、慢性非Ａ非Ｂウイルス性肝炎患者15例の10mm×４mmの肝臓生検シリンダーから抽出したRNAの10％を使用して検定したcPCRの結果を表すもので(レーン１〜15)、１症例は細胞発生性肝臓疾患患者(レーン16)、もう１症例は慢性Ｂ型肝炎患者のコントロールサンプル(レーン17)である。PCRによる増幅は30サイクル用とし、ブロット用オートラジオグラムはレーン１の15時間曝露を除き、４日間曝露した。結果からわかるように、ヒトサンプルの9/15(60％)はHCV RNA陽性であった(レーン１，２，４，６，７，10〜13)。細胞発生性肝臓疾患と診断された１症例(レーン16)および慢性HBV感染患者１症例(レーン17)はcPCR検定を繰り返しても陰性であった。
【０２４５】
ヒト肝臓生検のHCV/cPCR検定とHCV C100-3ポリペプチドを用いた血清のラジオイムノアッセイとの比較
SOD/HCV C100-3ポリペプチド(C100とも呼ぶ)は、ウイルスのアミノ酸363個を含む組み換え型融合ポリペプチドである。本ペプチドはHCVに対する抗体の検出に有用である(Kuoら(1989)参照)。C100の調製法はB.P.O 318,216号公報に記述されている。
【０２４６】
上記肝臓サンプルのHCV/PCR検定を行った患者と同じ患者17例から採取した血清について、C100を使用したラジオイムノアッセイを実施した。肝臓生検と同じ日に血清を採取した。一般に所有され、参考文献によりここに組み込まれているB.P.O 318,216号公報の記述に本質的に従って検定した。簡潔に言うと、Microtiterプレート(Immunol 2, Removeawell Strips)を0.1μgの純粋なC100でコーティングした。コーティングしたプレートを、血清サンプル(１：100希釈液100μl)または適切なコントロールと共に37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、非結合物質を除去し、このプレートを洗浄してから125Ｉラベルしたヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとインキュベートしてヒト抗体-C100複合体を検出した。結合していないラベルした抗体を吸引で除去し、プレートを洗浄した。ウェルごとの放射能を測定した。
【０２４７】
イムノラジオアッセイの結果から、これらのサンプルの67パーセットが抗C100抗体陽性であった。細胞発生性肝臓疾患と診断された患者の血清は抗C100抗体陽性であったが、本症例の肝臓サンプル中のウイルスRNAレベルは検出不可能であった。抗C100抗体の存在とHCV RNAとの相関水準は70％であった。ラジオイムノアッセイで抗体陰性であった症例の肝臓HCV RNAレベルは有意であった(データは示さず)。
【０２４８】
循環性抗C100抗体を有する患者の肝臓には往々にしてウイルスが存在していることをこの結果は示しており、抗C100抗体の存在がHCV被曝を正確に表すことが確証により明白である。さらに、これらを組み合わせると、本研究の症例では、このタイプのHCVが非Ａ非Ｂウイルス性肝炎の少なくとも75％の原因であり、イタリアで優勢のHCV菌株が合衆国で流行するHCV菌株と密接な関係があると考えられる。
【０２４９】
血清のHCV/cPCR検定：チンパンジーにおける急性期感染症のウイルスRNAの検出肝障害の発症、HCV RNAの存在、抗HCV抗体の存在との間の一般的な関係を、実験的に非Ａ非Ｂウイルス性肝炎を感染させたチンパンジー２頭の血清でモニターした(No.771および910)。アラニンアミノトランスフェラーゼ(alanine amino transferase；ALT)レベルにより肝障害を測定し、また上述のHCV cPCR検定でHCV RNAの存在を決定し、さらに抗HCV抗体はC100ラジオイムノアッセイを用いて検出した。
【０２５０】
チンパンジーの血漿１μgから抽出したRNAのHCV/cPCR分析を実施した。注射後25、32、70、88日にチンパンジー771から血清を採取し、30サイクル用cPCRを実施してオートラジオグラムを18日間曝露した。注射後11、28、67日にチンパンジー910から血清を採取し、60サイクル用cPCRを実施してオートラジオグラムを５日間曝露した。
【０２５１】
アッセイの結果は、チンパンジー771は、図５６Ａに、そしてチンパンジー910については図５６Ｂに示している。図５６Ａと図５６Ｂとの比較から、急性肝炎間の初期のよく特徴づけられたALT値は、感染した個体中のウイルスRNAの存在に相関するようである。
【０２５２】
データは、HCVのRNAの存在をも示唆しており、そのことは抗HCV抗体の存在に先立つウイルス血症の状態を示している。チンパンジー771(図５６Ａ)は、28日目に輸血後のNANBHのはっきり特徴づけられた急性の症状を示す。これは、ALTレベルの初期のピークに特徴的である。HCVのRNAは、25日目および32日目に集められた血清中に検出された。しかしながら、この急性の時期に、抗HCV抗体は、存在しない。反対に、70日目のHCVのRNAは、実験で検出するレベルを下回っていた。そして抗HCV抗体は上昇していた。88日目に、HCVのRNAは検出されないままで、一方抗HCV抗体は、70日目の値より有意に上昇していた。
【０２５３】
チンパンジー910の血清から得られた結果は、パターンとだいたい同様であったが、感染によって誘導されたHCV抗体の時間は、疾病の急性の時期では検出されず、少なくとも67日目まで伸びた。11日目にRIAによって検出された抗HCV抗体は、動物の接種に用いたプラズマ由来の抗体で個体910を受動免疫したことによった。抗HCV抗体は、感染の後期の慢性期のチンパンジー910の血清に見いだされた(データは示さない)。
【０２５４】
慢性のNANBHにかかっている個体由来のプラズマ中の低いALT値は、必ずしも弱いウイルスの生産と相関しているわけではない。接種後２年から３年および１年半にわたって、チンパンジー910から取った17の異なるプラズマ試料のプールのALTレベルおよびHCVのRNAをモニターした。試料のALT値は45mU/mlを越えず、力価研究は、HCVの高い力価を示した(3×106CID/ml)。cPCRは、30サイクル行い、そしてオートラジオグラムを15時間でとった。cPCR分析で、ウイルスRNAの存在がはっきりと示された(データは示していない)。
【０２５５】
血清のHCV/cPCRアッセイ：ヒトの急性期の感染でのウイルスRNAの発見
早期の急性NANBHの間収集された人の外科患者からの血清が、それぞれHCV/cPCRアッセイおよびC100-RIAを利用して、HCV RNAおよび抗HCV抗体を試験した。
【０２５６】
HCV/cPCRアッセイは、その患者からの１マイクロリッターの血漿を用いて行われ、そして、知られた血統の４人から行われた。cPCRは13回行われ、そして、ハイブリダイゼーションと洗浄の後、オートラジオグラムが８時間曝露された。
【０２５７】
感染の急性期の間、外科患者から収集された血清は高い値のウイルスRNAを含み、そして抗HCV抗体はC100-RIAによって検出されなかった結果を示した(データは現在示されない)。(外科患者からの急性期の血漿は、NANBH感染試薬の高い力価を有していることが知られた。［106.5CID/ml、フェインストーン(Feinstone)らにより決定された(1981)：フェインストーン(Feinstone)ら(1981)])。しかしながら、この患者は感染後ほぼ９カ月、C100/RIAにより抗HCV抗体にセロ変換されたことは注意すべきである。
【０２５８】
人制御血漿の血統からの血清は、HCV/cPCRアッセイとC100-RIAに対してともに否定的であった。
【０２５９】
HCV/cPCRアッセイの感度
HCV/cPCRアッセイの感度は、既知の力価の血清の10倍連続希釈の分析によって決定された。チンパンジーの血漿は〜３×105CIDの力価を持っていた。そしてRNAはその血漿１マイクロリッターの10倍希釈から抽出されたcPCRは30回なされた。そしてハイブリダイゼーションと洗浄の後、オートラジオグラムが15時間曝露された。300、30および３倍のHCVのCIDゲノム増幅から得られたcPCR生成物は、図５９のコース１〜３に示す。
【０２６０】
コース１と２は２時間曝露されたオートグラムに検知されたものである。
【０２６１】
感染されたHCVの力価の平均は、ほぼ100と10,000CID/ml血清の間であるので、このデータはHCV/cPCRアッセイは臨床的に有用であると思われる。
【０２６２】
種々のHCV株のためのHCV/cPCRアッセイ
オリゴマー44-merのセットとオリゴマー45-merのセットからなるプライマーはHCV株を増幅するために設計された。その株は図２３〜４７の中のcDNA配列が導かれているHCVから分離されたHCVに類似または同一である。
【０２６３】
これらのプライマーの設計の土台となる前提は、我々の発見であり、HCVはフラビ様(Flavi-like)ウイルスである。
【０２６４】
フラビウイルス科ファミリーのメンバーは、HCVと比較されるとき、二つの主に保存されたアミノ酸配列セットを有する。それはTATPPGとQRRGRであり、これらのウイルスのNS3の中にある。他の少量のセットのいくつかは、例えば、推定上のNS5領域中のGDOである。他のセットは既知のアミノ酸配列のHCVとの比較によって決定される。この情報はいくつかのフラビウイルス科のメンバーの配列から推論される。そのフラビウイルス科は、日本脳炎ウイルス(Sumiyoshiら(1987))、黄熱ウイルス(Riceら(1985))、デング熱２型ウイルス(Mackow(1987))、および西ナイルウイルス(Castleら(1986))らによって開示されている。変換されたアミノ酸配列とコドン利用は表９にある。
【０２６５】
【表９】
Figure 0003698520
【０２６６】
注：プライマー配列の３'末端におけるヌクレオチド縮退性の数を最低限にし、上記に示した保存されたアミノ酸をコードする可能なヌクレオチド配列またはその相補体のいずれかに、正確に適合する、それぞれのプライマーの３'末端におけるヌクレオチド数を最高にするように、プライマー配列を選択した。
【０２６７】
44-merおよび45-merのオリゴマープライマーは、これらのアミノ酸をコードした配列がプライマー内に組み込まれるように明示された。さらに、それらは、それぞれのプライマーの３'末端における縮退を含有し、クローン40b(図５８参照)に存在し、HCVの推定NS3をコードする領域から誘導されるHCVゲノムの異なった２つの領域から誘導される。組になったオリゴヌクレオチドプライマーの配列式は、XがA、T、GまたはCの時、
5' GAC TGC GGG GGC GAG ACT GGT TGT GCT CGC ACC GCC ACC CCX CC 3'
であり、YがTまたはCの時
5' TCT GTA GAT GCC TGG CTT CCC CCT GCC AGT CCT GCC CCG ACT YTG 3'
である。
【０２６８】
HCV/cPCRアッセイが、チンパンジー910プラズマにおけるHCV RNAを増幅するために、これらのプライマーを用いて実施された。アッセイ方法は、オリゴマープライマーの44-merおよび45-merの組が、クローン36およびクローン37bより誘導されたプライマーに代換される以外は、本質的に前述部分で説明した通りである。加えて、増幅されたHCV cDNAの検出がクローン40aから誘導されたプローブとのハイブリッド形成によって行われ、その配列は図６０に示されている。
【０２６９】
該プローブは、前述のPCR法を用いて、クローン40aのセグメントを増幅することによって準備され、18-merのプライマーは以下の配列を含有していた。
5' GAG ACA TCT CAT CTT CTG 3'
と
5' GAG CGT GAT TGT CTC AAT 3'
【０２７０】
増幅の後、プローブの準備はニックトランスレーションにより32Ｐでラベルされた。
【０２７１】
図６１は、クローン40aから誘導された配列でプローブされたサザンブロットの放射線写真を示している。32ＰでラベルされたMspI消化pBR322 DNAの断片がマーカーとして使われた(レーン１)。これらのプライマーを用いて増幅した結果のPCR産物の予想される大きさは、490ヌクレオチド(nt)である。複製反応がレーン２および３に示されている。
【０２７２】
HCVの５'領域における変形の分析
フラビウイルスモデルに基づいて、クローンag30aおよびk9-1に標本された領域に隣接する５'領域のHCV cDNAは、推定容器および/またはマトリックスプロテインのセグメントをコードする(E/M)。「ｃ」ライブラリーが構成されるチンパンジーから得た血清が、この標的領域に変形が存在するか否かを判断するためにHCV/cPCRによって分析された。
【０２７３】
HCV/cPCRアッセイが、クローン5'-32の単離に対して、使用されるプライマーとプローブ以外は、前述と本質的には同様に行われる。図６５は、プライマーおよびプローブ(およびその誘導されたクローン)の関係とHCV cDNAの標的領域の関係とを示している。PCRプライマーの１組である、ag30a16AおよびK91Env16Bは、クローンag30aおよびk9-1から誘導されたが、これらはそれぞれ標的配列の上流および下流にある。ag30a16AおよびK91Env16BによりプライムされたcPCR産物の期待される大きさは、HCV cDNAの確認された配列に基づいて1.145kbである。ag30a16AおよびK91Env16Bを用いて増幅された領域におよび、互いに重複しているPCRプライマーの他の２組もまた、血清中のHCV RNAのPCR増幅のために用いられる。このように、この場合には、プライマーag30a16AおよびCA156e16Bを１つの組として、プライマーCA156e16Aおよびk91Env16Bをもう１つの組として用いることによって、PCR反応が起こされる。これらの組に対する予測されるPCR産物の大きさは、それぞれ615ヌクレオチド(NT)および683ヌクレオチドであった。表１０は、プライマーおよびそれが誘導されたクローンおよびプライマー配列を記載している。
【０２７４】
【表１０】
Figure 0003698520
【０２７５】
すべてのHCV/cPCR産物のためのプローブが、クローン216(CA216a16Aおよび216a16Bをプライマーとして用いて)およびクローン84(CA84a16AおよびCA84a16Bをプライマーとして用いて)の領域をPCR増幅して準備された、HCV cDNAの32Ｐでラベルされた部分から成り、32ＰはニックトランスレーションによりPCR産物に導入された。これらのプローブは、HCV/cPCR反応に用いられたプライマーには重複しなかった。
【０２７６】
図６６は、HCV/cPCR産物が32Ｐでラベルされたプローブとハイブリッド形成されたサザンブロットの放射線写真を示している。プライマーag30a16AおよびK91Env16B(レーン１)から伸びたHCV/cPCR産物は、約1.1kbであった。15時間放射の間に、他のPCR産物は観察されなかった。プライマーの組ag30a15A/CA156e16B(レーン２)およびCA156e16A/K91Env16B(レーン３)から伸びたHCV産物は、それぞれ約625NTおよび約700NTであった。PCR産物の大きさは、MspIでのpBR322の消化およびHaeIIIで消化されたPhiX174の消化の結果としての相対的な断片移動に比較して決定される(レーン５)。
【０２７７】
上記の研究は、約20NTから50NTの小ささの挿入または欠失、および標的DNAの大きさを変化させるDNAの再配列を検出する。
【０２７８】
図６６の結果により、チンパンジー血清内のHCVのE/M領域から誘導されたcDNAの唯一の主要種が存在することが確信できる。
【０２７９】
フラビウイルスゲノム配列の保存された領域から誘導されたプライマーおよびPCRを使用したHCV cDNA配列のクローニングのための増幅
HCVがフラビ様ウイルスであるという我々の発見により、PCR技術を用いての、特徴づけされていないHCV cDNA配列のクローニングのための戦略、およびフラビウイルスにおいて保存されたアミノ酸配列をコードする領域から誘導されたプライマーが可能になる。一般に、プライマーの１つが、定義されたHCVゲノム配列から誘導され、そして配列されていないHCVポリヌクレオチドの領域に隣接する他のプライマーが、フラビウイルスゲノムの保存された領域から誘導される。フラビウイルスゲノムは、NS1およびフラビウイルスゲノムの５'末端にコードされたＥポリペプチドに保存された配列を包含することは公知である。このように、HCVゲノムの推定比較領域から誘導されたcDNA配列を単離するためには、これらのフラビウイルスポリペプチドに保存された配列から誘導された上流プライマーが明示される。下流プライマーは、HCV cDNAの公知の上流末端から誘導される。
【０２８０】
コードの変性のため、フラビウイルスプローブおよび対応するHCVゲノム配列の間に適合間違いが起こり得る。ゆえに、Lee(1988)によって説明されているものに類似した戦略が用いられる。Leeの手順は、アミノ酸配列の逆トランスレーション産物に相補的な混合オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。混合プライマー内の配列は、保存されたアミノ酸配列のそれぞれのコドン変性を考慮に入れている。
【０２８１】
３組のプライマー混合物が、デング熱-2，4(D-2，4)、日本脳炎ウイルス(JEV)、黄熱病(YF)および西ナイルウイルス(WN)を含むいくつかのフラビウイルス内に見られるアミノ酸同族に基づいて発生させられる。最上流に保存された配列(5'-1)から誘導されるプライマー混合物は、アミノ酸配列gly-trp-glyに基づいており、これは、D-2、JEV、YFおよびWNのＥタンパク質に見られる保存された配列asp-arg-gly-trp-gly-aspNの一部である。その次のプライマー混合物(5'-2)は、Ｅタンパク質内の下流に保存された配列phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileuに基づいており、phe-gly-aspから誘導される。保存された配列はD-2、JEV、YFおよびWNに存在する。三番目のプライマー混合物(5'-3)は、アミノ酸配列arg-ser-cysに基づいており、これは、D-2、D-4、JEV、YFおよびWNのNS1タンパク質に保存された配列cys-cys-arg-ser-cysの一部である。5'-3の混合物を形成する個別のプライマーは図８４に示されている。保存された領域から誘導された変性配列に加えて、それぞれの混合物内のそれぞれのプライマーは、酵素、HindIII、MboI、およびEcoRIを制限するためにコードする配列位置を含有する、５'末端において不変領域をも包含する。
【０２８２】
下流プライマーssc5h20Aは、クローン14iおよび11bの配列とオーバーラップする配列を有するHCV cDNAを含有し、クローン5h中のヌクレオチド配列から誘導される。ssc5h20Aの配列は、
5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3'
である。
【０２８３】
これに代わるプライマーssc5h34Aも使用され得る。このプライマーは、クローン5h中の配列から誘導される。そしてさらに制限酵素部位をつくるヌクレオチドを５'末端に持ち、そのためクローン化を促している。この配列ssc5h34Aは、
5' GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3'
である。
【０２８４】
はじめにSaikiらによって開示された(1986)PCR反応は、cDNAのためのテンプレートがHCVに感染したチンパンジーの肝臓から分離されたRNAである点、またはHCVに感染したチンパンジーの血清から分離されたウイルス粒子からなる点を除いて、Leeらに開示された(1988)ように、本質的に行われた。さらに、HVC配列にアニーリングするプライマーの一部は、ヌクレオチドが９しかなく、そしてミスマッチし得るので、アニーリング条件は増幅の一回目において緩和されている(0.6M NaCl，25℃)。さらに、もし、ssc5h34Aが使用されるならば、HCVゲノムから誘導されていない付加的な配列は、プライマー−テンプレートハイブリッドを不安定にする傾向がある。一回目の増幅の後、アニーリング条件はよりストリンジェントになり得る(0.066M NaCl，32℃〜37℃)。なぜなら増幅された配列は、このときプライマーと相補的なまたは重複する領域を持っているからである。加えて、増幅のはじめの10サイクルは、Klenow酵素Ｉと共に、その酵素に適したPCR条件の下で行われる。これらのサイクルが終了すると、サンプルは抽出され、Kit方向に沿って、Cetus/Perkin-Elmerにより供給されるように、Taqポリメラーゼと共に使用される。
【０２８５】
増幅の後、増幅されたHVC cDNA配列は、クローン5hから誘導されるプローブを使用して交雑されることにより、検知される。このプローブは、プライマーを誘導するために使用される配列の上方の配列から誘導され、プライマーを誘導したクローン5hの配列とオーバーラップしない。このプローブの配列は、
Figure 0003698520
である。
【０２８６】
【発明の効果】
ここに記載される方法、オリゴマー、HCV cDNAから誘導されたプローブとプライマーの両方、そしてそれらを含むキットは、正確で、比較的簡単で、経済的に、生物学的なサンプル中、(さらに詳細には、輸血に使用され得る血液、およびHCV感染を持つ疑いのある人の中に)HCVが存在することを決定するために有用である。さらにまた、これらの方法とオリゴマーは、再結合HCVポリペプチドの使用に基づく免疫学的分析法よりも早い段階でのHCV感染を検知するために有用である。また、増幅されたポリヌクレオチド交雑分析法は、抗HCV抗体を持たない場合のサンプルにおいてHCV RNAを検知する。このようにして、本明細書に記述されたプローブとプライマーは、HCV、および血液を含むHCV感染された生物的検体による感染を一層完全に同定するためにHCVポリペプチドに基づく免疫学を利用して、増幅交雑分析法に使用され得る。
【０２８７】
本明細書で提供される情報により、HCVゲノムの保存領域から誘導されたプライマーそして/またはプローブが明示できる。これらのプライマーとプローブを提供することで、種々のHCV株を検知し且つ血液と血液製剤をスクリーニングする際に使用される一般的な方法が利用可能になる。
【０２８８】
もし、この方法で使用されるプライマーが、HCVゲノムの保存領域から誘導されると、この方法は種々のHCV株の検知そして/または同定に有用である。これは、換言すると、HCVの検知と分析のさらなる免疫学的な試薬の開発、およびHCVの検知そして/または処理のためのさらなるポリヌクレオチド試薬の開発を可能にする。
【０２８９】
加えて、FlavivirusesおよびHCVの保存されたアミノ酸配列から示されたプライマーおよびプローブの組は、これらの感染性薬剤の万能な検知法を与える。
【０２９０】
以下に挙げられた素材は、American Type Culture Collection(ATCC), 12301 Parklawn Dr.,Rockville, Maryland 20852に、ブダペスト条約に基づいて寄託されており、以下の受託番号が付与されている。
【０２９１】
【表１１】
Figure 0003698520
【０２９２】
さらに、以下の寄託が1989年5月11日になされた。
【０２９３】
【表１２】
Figure 0003698520
【０２９４】
以下の株D1210は、1989年5月3日に寄託された。
【０２９５】
【表１３】
Figure 0003698520
【０２９６】
以下の株は、1989年5月12目に寄託された。
【０２９７】
【表１４】
Figure 0003698520
【０２９８】
以下の生物的素材は、1990年3月23日に寄託された。
【０２９９】
【表１５】
Figure 0003698520

【図面の簡単な説明】
【図１】クローン12f中のHCV cDNAの配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。
【図２】クローンk9-1中のHCV cDNA配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】クローン15eの配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。
【図７】クローン13i中のHCV cDNAのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン12fとオーバーラップする配列を示す。
【図８】クローン26j中のHCV cDNAのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン13iとオーバーラップする配列を示す。
【図９】クローンCA59a中のHCV cDNAのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン26jおよびK9-1の配列とオーバーラップする配列を示す。
【図１０】クローンCA84a中のHCV cDNAのヌクレオチド配列、それにコードされるアミノ酸およびクローンCA59aとオーバーラップする配列を示す。
【図１１】クローンCA156e中のHCV cDNAの配列、およびクローンCA84aとオーバーラップする配列を示す。
【図１２】クローンCA167b中のHCV cDNAの配列、およびクローンCA156eとオーバーラップする配列を示す。
【図１３】クローンCA167b中のHCV cDNAの配列、およびクローンCA156eとオーバーラップする配列を示す。
【図１４】クローンCA290a中のHCV cDNAの配列、およびクローンCA216aとオーバーラップする配列を示す。
【図１５】クローンag30a中のHCV cDNAの配列、およびクローンCA290aとオーバーラップする配列を示す。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】図１６の続きである。
【図１８】クローンCA205a中のHCV cDNAの配列、およびクローンCA290a中のHCV cDNA配列とオーバーラップする配列を示す。
【図１９】クローン18g中のHCV cDNAの配列、およびクローンag30a中のHCV cDNA配列とオーバーラップする配列を示す。
【図２０】クローン16jh中のHCV cDNAの配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン15e中のHCV cDNAの配列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
【図２１】クローン6k中のHCV cDNAの配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン16jh中のHCV cDNA配列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
【図２２】クローンp131jh中のHCV cDNAの配列、それにコードされるアミノ酸およびクローン6k中のHCV cDNA配列とオーバーラップするヌクレオチドを示す。
【図２３】本明細書中に記載されているクローンおよび欧州特許公開第318,216号に示されているコンパイルされたHCV cDNA配列由来のコンパイルされたHCV cDNAを示している。配列が由来するクローンは、５'−クローン32、b114a、18g、ag30a、CA205a、CA290a、CA216a、pi14a、CA167b、CA156e、CA84a、CA59a、K9-1(k9-1とも呼ばれる)、26j、13i、12f、14i、11b、7f、7e、8h、33c、40b、37b、35、36、81、320、33b、25c、14c、8f、33f、33g、39c、35f、19g、26g、15e、b5a、16jh、6k、およびp131jhである。図中で、配列上部の３つの水平なダッシュは推定開始因子のメチオニンコドンの位置を示している。この図の中には、HCV cDNAにコードされた推定ポリタンパク質のアミノ酸配列もまた示されている。HCV1のクローン化されたDNAの異質性(heterogeneities)は、大きなORFの推定的にコードされた配列の上部に示されたアミノ酸によって示されている；括弧は、クローン中のHCV cDNAの５'-または３'-末端部あるいはそれらの近傍で異質性が検出されたことを示している。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】図２７の続きである。
【図２９】図２８の続きである。
【図３０】図２９の続きである。
【図３１】図３０の続きである。
【図３２】図３１の続きである。
【図３３】図３２の続きである。
【図３４】図３３の続きである。
【図３５】図３４の続きである。
【図３６】図３５の続きである。
【図３７】図３６の続きである。
【図３８】図３７の続きである。
【図３９】図３８の続きである。
【図４０】図３９の続きである。
【図４１】図４０の続きである。
【図４２】図４１の続きである。
【図４３】図４２の続きである。
【図４４】図４３の続きである。
【図４５】図４４の続きである。
【図４６】図４５の続きである。
【図４７】図４６の続きである。
【図４８】生物学的サンプルのHCV RNAの検出のためのカプチャープローブおよびラベルプローブの配列を示している。
【図４９】図４８の続きである。
【図５０】図４９の続きである。
【図５１】フラビウイルスポリタンパク質とHCVゲノムの主要なORFにコードされた推定HCVポリタンパク質の模式的な配列を示している。図には、また、フラビウイスルポリタンパク質から切断されたフラビウイルスポリペプチドの可能な機能が示されている。加えて、HCVポリペプチド、NANB5-1-1およびC100の、推定HCVポリタンパク質に対して相対的な位置が示されている。
【図５２】クローン81中のHCV cDNA挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列、およびそこにコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示している。
【図５３】クローン36中のHCV cDNA配列、クローン81のNANBV cDNAとオーバーラップするセグメント、およびクローン36の中にコードされたポリペプチド配列を示している。
【図５４】クローン37b中のHCV cDNA配列、クローン35とオーバーラップするセグメント、およびそこにコードされたポリペプチドを示している。
【図５５】 NANBHを有するチンパンジーの肝臓サンプル由来のRNA(Ａ)およびNANBHを有するイタリア人の患者(Ｂ)に関するHCV cPCRアッセイのオートラジオグラフの写真を示している。
【図５６】肝臓の損傷の表示、HCV RNAの存在と、NANBHを有する２匹のチンパンジーに対する抗HCV抗体の存在との間の一時的な関係を示すグラフである。
【図５７】クローンCA84a中のHCV cDNAのヌクレオチド配列、そこにコードされたアミノ酸、およびクローンCA59aとオーバーラップする配列を示している。
【図５８】クローン40b中のHCV cDNA配列、クローン37bにオーバーラップするセグメント、およびそこにコードされたポリペプチドを示している。
【図５９】 HCVゲノムの、約300、30、および３CIDのラベルされ増幅された生成物を示すオートラジオグラフの写真である。
【図６０】クローン40a中のHCV cDNAのヌクレオチド配列を示している。
【図６１】 HCVゲノムの保存領域由来のプライマーから伸長された増幅された生成物を示すオートラジオグラフの写真である。
【図６２】クローン35中のHCV cDNA配列、クローン36とオーバーラップするセグメント、およびそこにコードされたポリペプチドを示している。
【図６３】図６２の続きである。
【図６４】診断結果とALTレベルとの関係を示す。
【図６５】プローブとクローンag30aとk9-1中のHCV cDNA由来のHCV RNAの５'-領域由来のプライマーとの関係を示す図表である。
【図６６】 ag30aおよびk9-1由来のプライマーのセットから伸張され増幅された生成物のオートラジオグラフの写真である。
【図６７】ヒト単離株23および27ならびにHCV1の整列されたヌクレオチド配列を示している。相同な配列は符号(＊)で示されている。非相同配列は小文字である。
【図６８】図６７の続きである。
【図６９】図６８の続きである。
【図７０】ヒト単離株23および27ならびにHCV1の整列されたアミノ酸配列を示している。相同な配列は符号(＊)で示され、非相同配列は小文字である。
【図７１】 BB-NANBV感染チンパンジーの肝臓から単離され、クローン81のBB-NANBV cDNAでプローブされたRNAのノーザンブロットのオートラジオグラフの写真を示している。
【図７２】抗NANAB5-1-1で、感染されたプラズマから捕捉されたNANBV粒子から抽出されクローン81由来の32ＰラベルNANBV cDNAでプローブされた核酸のオートラジオグラフの写真を示している。
【図７３】単離されたNANBV核酸、クローン81中のNANBV cDNA由来の32Ｐラベルされた正鎖および負鎖DNAプローブでプローブされた核酸を含有するフィルターのオートラジオグラフの写真を示している。
【図７４】ヒト単離株23のヌクレオチドコンセンサス配列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されている。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた示されている。
【図７５】ヒト単離株27のヌクレオチドコンセンサス配列を示し、変位体配列が配列ラインの下に示されている。コンセンサス配列中にコードされたアミノ酸もまた示されている。
【図７６】図７５の続きである。
【図７７】フラビウイスルポリタンパク質および推定HCVポリタンパク質に対するEnvLとEnvRプローブとの関係を示すグラフである。
【図７８】単離株Thorn、EC1、HCT#18、およびHCV1の複合整列させたヌクレオチド配列の比較を示している。
【図７９】図７８の続きである。
【図８０】図７９の続きである。
【図８１】 EC10のヌクレオチド配列とHCV1配列の複合体との比較を示している；このEC10配列はドットの上部にあり、そしてHCV1配列はドットの下部にある。
【図８２】ヒト単離株HCT#18、JH23、JH27、Thorne、EC1、およびHCV1のコンセンサス配列の「EnvL」領域にコードされたアミノ酸配列117〜308(HCV1に相対的に)の比較を示している。
【図８３】ヒト単離株HCT#18、JH23、JH27、Thorne、EC1、およびHCV1のコンセンサス配列の「EnvR」領域にコードされたアミノ酸配列330〜360(HCV1に相対的に)の比較を示している。
【図８４】プライマー混合物5'-3の個々のプライマーのヌクレオチド配列を示している。

Claims (13)

  1. 少なくとも１５個のヌクレオチドの連続する配列を含む、ハイブリダイゼーションのためのポリヌクレオチドプローブまたはＤＮＡ合成のためのポリヌクレオチドプライマーであって、（ｉ）該少なくとも１５個のヌクレオチドの連続する配列が、ＨＣＶのゲノムまたはそのｃＤＮＡコピーのいずれか一方の鎖と選択的にハイブリダイズし得、そして、(ii)該少なくとも１５個のヌクレオチドの連続する配列が、以下に示すＨＣＶヌクレオチドの保存配列のいずれか一方の鎖から得られる、ポリヌクレオチドプローブまたはプライマー：
    Figure 0003698520
    。
  2. 以下の配列からなる群より選択される配列を含む、ハイブリダイゼーションのためのポリヌクレオチドプローブまたはＤＮＡ合成のためのポリヌクレオチドプライマー：
    Figure 0003698520
    。
  3. カプチャープローブである、請求項２に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  4. ラベルプローブである、請求項２に記載のポリヌクレオチドプローブ。
  5. プライマーである、請求項２に記載のポリヌクレオチドプライマー。
  6. ＨＣＶのポリヌクレオチドを増幅するための、一対のＰＣＲプライマーであって、該一対のＰＣＲプライマーが、それぞれ独立して、１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列を含み、ここで、
    （ａ）該１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列が、該ＨＣＶのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、それによって該ＨＣＶのポリヌクレオチドの増幅が可能となり；そして、
    （ｂ）該１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列が、以下に示す配列のいずれか一方の鎖から得られる、
    一対のＰＣＲプライマー：
    Figure 0003698520
    但し、該一対のＰＣＲプライマーの両方の PCR プライマーは、同時には、上記ヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖から得られる１５個以上のヌクレオチドの連続する配列を含まない。
  7. ＨＣＶのポリヌクレオチドを増幅するための、一対のＰＣＲプライマーであって、該一対のＰＣＲプライマーが、それぞれ独立して、１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列を含み、ここで、
    （ａ）該１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列が、該ＨＣＶのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、それによって該ＨＣＶのポリヌクレオチドの増幅が可能となり；そして、
    （ｂ）該対のうちの一方のプライマーの連続する配列が、以下に示す配列１のいずれか一方の鎖から得られ、他方のプライマーの連続する配列が、以下に示す配列２のいずれか一方の鎖から得られる、
    一対のプライマー：
    配列１；
    Figure 0003698520
    配列２；
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    Figure 0003698520
    。
  8. 少なくとも一方が標識されている、請求項６または７のいずれかに記載の一対のＰＣＲプライマー。
  9. 請求項６〜８のいずれかに記載の一対のＰＣＲプライマーを、適当な容器中に含む、ＰＣＲアッセイキット。
  10. サンプル中のＨＣＶのポリヌクレオチドを増幅し検出するためのＰＣＲアッセイであって：
    （ａ）請求項６〜８のいずれかに記載の一対のＰＣＲプライマーから開始されるポリメラーゼチェインリアクションで、ＨＣＶのポリヌクレオチドを増幅すること；および、
    （ｂ）増幅されたポリヌクレオチドを検出すること、
    を含むアッセイ。
  11. ＨＣＶのポリヌクレオチドを増幅するための一対のＰＣＲプライマーを調製する方法であって：
    １０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列をそれぞれ独立して含む、２つのポリヌクレオチドを合成すること、ここで、
    （ａ）該１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列が、該ＨＣＶのポリヌクレオチドとハイブリダイズし得、それによって該ＨＣＶのポリヌクレオチドの増幅が可能となり；そして、
    （ｂ）該１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列が、以下に示すヌクレオチド配列のいずれか一方の鎖から得られる、
    を含む方法：
    Figure 0003698520
     または
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    但し、該一対の PCR プライマーのうちの一方の PCRプライマーは、ヌクレオチド配列８８６７〜９０６０位のいずれか一方の鎖から得られ、そして他方のプライマーは、ヌクレオチド配列−３１９〜８８６７位のいずれか一方の鎖から得られるか；または
    該一対の PCR プライマーの両方のプライマーは、ヌクレオチド配列８８６７〜９０６０位のいずれか一方の鎖から得られ、そして同時には、ヌクレオチド配列８８６７〜９０６０位のいずれか一方の鎖から得られる１５個以上のヌクレオチドの連続する配列を含まない。
  12. 請求項１１に記載の方法であって、ここで、前記１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列を含むポリヌクレオチドが：
    （ａ）該１０〜１４個のヌクレオチドの連続する配列を含むポリヌクレオチドを提供すること；
    （ｂ）該ポリヌクレオチドを使用して組換えＤＮＡベクター調製すること：
    （ｃ）該ベクターで宿主細胞を形質転換すること；
    （ｄ）該ベクターが複製し得る条件下で、該宿主細胞をインキュベートすること；
    （ｅ）該宿主細胞から該複製されたベクターを単離すること；および
    （ｆ）該複製されたベクターから該ポリヌクレオチドを単離すること、
    により合成される、方法。
  13. 前記ポリヌクレオチドが化学的に合成される、請求項１１に記載の方法。
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