JPH07322881A - オリゴヌクレオチド、それから成るｃ型肝炎診断試薬及びそれを用いたｃ型肝炎の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 検体中のＨＣＶ間にゲノムの塩基配列に関し
て変異があるか否かを簡便にかつ高感度に知ることがで
きるＣ型肝炎の診断手段を提供すること。 【構成】 配列番号１〜１０の新規なオリゴヌクレオチ
ドを提供した。また、配列番号１、３、５、７、８及び
９記載のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオ
リゴヌクレオチドと、配列番号２、４及び６記載のオリ
ゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、検体中の
ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を変性状態
で電気泳動にかけ、バンドの位置を検出することを含む
Ｃ型肝炎の診断方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なオリゴヌクレオ
チド、それから成るＣ型肝炎診断薬及びそれを用いたＣ
型肝炎診断方法及びＣ型肝炎ウイルスの増幅方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎に対しては、インターフェロン
（以下、「ＩＦＮ」ということがある）が有効であるこ
とが知られている。しかしながら、ＩＦＮによるＣ型肝
炎の治療効果は、人体中のＣ型肝炎ウイルス（以下、
「ＨＣＶ」ということがある）のクローン数が多くなる
と低下することも知られている。すなわち、人体中のＨ
ＣＶが単一クローン起源である場合にはＩＦＮによる治
療効果が高いが、複数クローン起源の場合には治療効果
が低く、例えば、ＨＣＶが人体中で変異を起こして複数
クローンとなる場合には治療効果が低い。従って、検体
中のＨＣＶに変異が存在するか否かを調べることは、そ
の患者にＩＦＮによる治療が有効であるか否かを知る上
で重要である。

【０００３】従来より、ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡをＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法）により
増幅し、電気泳動にかけることによりＣ型肝炎の診断を
行うことが知られている。例えば、特開平５−３０１８
８７号公報には、特定のオリゴヌクレオチドを用いてＨ
ＣＶゲノムのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅後、電気泳動
にかけてバンドを検出することによりＨＣＶを４種類の
ジェノタイプに分類する方法が記載されている。しかし
ながら、この方法では、ＨＣＶを４種類のジェノタイプ
に重複することなく分類することは可能であるが、検体
中に含まれるＨＣＶが単一クローン起源か否か、すなわ
ち、各ＨＣＶ間に変異があるか否かを知ることはほとん
どできない。すなわち、当該変異により、決定されるジ
ェノタイプが異なってくる場合には変異があるか否かを
知ることができるが、同一のジェノタイプに包含される
ＨＣＶ間に変異があるか否かは知ることができない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、検体中のＨＣＶ間にゲノムの塩基配列に関して変異
があるか否かを簡便にかつ高感度に知ることができるＣ
型肝炎の診断手段を提供することである。また、本発明
は、高感度にＨＣＶを増幅できる方法を提供することで
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ＨＣＶゲノムには、超可
変領域（以下、「ＨＶＲ」と言うことがある）と呼ばれ
る、高い頻度で変異を起こす領域が知られている（中沢
貴秀ら、日本臨牀 ５１巻２号（２，１９９３）、６６
−７０頁）。本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることによ
り、現在知られている全てのＨＣＶクローンについて、
このＨＶＲを含む領域をＰＣＲで増幅することができ、
かつ、ＰＣＲの増幅産物を変性状態で、電気泳動にかけ
ることにより各ＨＣＶのＨＶＲに変異が存在するか否か
を容易に知ることができることを見出し、本発明を完成
した。

【０００６】すなわち、本発明は、下記の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドを提供する。 5' CACCGCATGGCWTGGGATAT 3'（ただし、ＷはＡ又はＴ）
（以下、このオリゴヌクレオチドを「ＭＳ１」と言う） 5' GGGCTNGGRGTGAAGCARTA 3'（ただし、ＮはＡ又はＣ又
はＧ又はＴ、ＲはＡ又はＧ）（以下、このオリゴヌクレ
オチドを「ＭＲ１」と言う） 5' TTGGGATATGATGATGAACTGG 3'（以下、このオリゴヌク
レオチドを「ＭＳ２」と言う） 5' CTGTTGATGTGCCAGCTGCC 3'（以下、このオリゴヌクレ
オチドを「ＭＲ２」と言う） 5' GGATATGATGATGAAGTGG 3' （以下、このオリゴヌクレ
オチドを「ＭＳ３」と言う） 5' TCYGTCTCATTYGCCCCCA 3' （ただし、ＹはＴ又はＣ）
（以下、このオリゴヌクレオチドを「ＭＲ１’」と言
う） 5' GGNCAYHGNATGGCNTGG 3'（ただし、ＮはＡ又はＣ又は
Ｇ又はＴ、ＹはＴ又はＣ）（以下、このオリゴヌクレオ
チドを「ＭＳ４」と言う） 5' GCTACTCTTTGCCGGCGT 3'（以下、このオリゴヌクレオ
チドを「ＭＳ５」と言う） 5' CTCTTTGCCGGCGTTGACG 3' （以下、このオリゴヌクレ
オチドを「ＭＳ６」と言う） 5' GAGGAACTACTGTCTTCACG 3'（以下、このオリゴヌクレ
オチドを「ＭＳ１３」と言う）

【０００７】また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド
から成るＣ型肝炎診断薬を提供する。さらにまた、本発
明は、オリゴヌクレオチドの少なくとも２種類をプライ
マーとして用いたＰＣＲにより、検体中のＨＣＶゲノム
のｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を変性状態で電気泳動に
かけ、バンドの位置を検出することを含むＣ型肝炎の診
断方法を提供する。さらにまた、本発明は、上記本発明
のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つをプライマーと
して用いたＰＣＲにより、検体中のＨＣＶゲノムのｃＤ
ＮＡを増幅することを含むＣ型肝炎ウイルスの増幅方法
を提供する。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】本願発明者らは、ＨＣＶゲノムのＨＶＲ領
域を含む領域をＰＣＲにより増幅し、増幅産物を変性
後、電気泳動にかけ、現れるバンドを検出することによ
り、検体中に何クローンのＨＣＶが含まれているかを知
ることができることに想到した。ＤＮＡを変性状態（一
本鎖状態）で電気泳動にかけることにより、ＤＮＡ中の
点突然変異の有無を検出できることは公知である（Orit
a et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86: 2766, 198
9)。この方法はＳＳＣＰ法（single strand conformati
on polymorphism)と呼ばれている。一本鎖ＤＮＡは、そ
の塩基配列に特有の立体構造をとる。従って、ＤＮＡの
塩基配列が１塩基でも異なっておれば、それによって立
体構造が異なるため、電気泳動における移動度が異な
る。従って、一本鎖状態でＤＮＡを電気泳動にかけ、バ
ンドが何本現れるかによって試料ＤＮＡが何種類のＤＮ
Ａを含んでいるかを知ることができる。

【００１０】この方法を適用して、ＨＣＶの変異を調べ
るためには、先ず、数十種類にも及ぶＨＣＶの全てのＨ
ＶＲ領域を増幅できるプライマーを開発しなければなら
ない。さらに、ＳＳＣＰ法は、試料ＤＮＡのサイズが大
きくなると感度が低下するので、増幅される領域のサイ
ズは約４００ｋｂ以下でなければならない。このような
制約の下でプライマーとして用いることができるオリゴ
ヌクレオチドを見つけ出さなければならない。

【００１１】本願発明者らは、後述の参考例１に詳述す
るように、データベースに登録されたＨＣＶゲノムのＨ
ＶＲを包含する領域（Ｅ１−Ｅ２／ＮＳ１領域）の塩基
配列及び慢性Ｃ型肝炎患者の血清からクローニングした
ＨＣＶのＥ１−Ｅ２／ＮＳ１領域の塩基配列を丹念に比
較し、上記の条件を満足し得るプライマーを提供するこ
とに成功した。このようにして開発されたプライマーが
上述のＭＳ１、ＭＲ１、ＭＳ２、ＭＲ２、ＭＳ３、ＭＲ
１’、ＭＳ４、ＭＳ５及びＭＳ６である。

【００１２】また、ＨＣＶの５’非翻訳領域を増幅する
ためのプライマーとして、従来のプライマーよりも検出
感度が高い上記ＭＳ１３を見出した。５’非翻訳領域に
おける変異もＨＣＶの変異を調べるために有効な領域で
あることが知られており、５’非翻訳領域の変異と上記
ＨＶＲ領域の変異を調べることにより、ＨＣＶの変異を
より高感度に検出することができる。

【００１３】これらのオリゴヌクレオチドの位置を図１
及び図２に示す。なお、図１及び図２に示される塩基配
列は、日本人のＣ型肝炎患者から得られたＨＣＶのゲノ
ムの塩基配列の一部を一例として示したものである（Ka
to, N. et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 87, 95
24-9528 (1990) 、GeneBank) 。これらのオリゴヌクレ
オチドは、市販のＤＮＡ合成機を用いて容易に化学合成
することができる。

【００１４】なお、上記プライマーのうち、ＭＳ１、Ｍ
Ｒ１、ＭＲ１’及びＭＳ４は一般式で示されているが、
Ｃ型肝炎の診断にあたっては、一般式に包含される全て
のオリゴヌクレオチドを混合して用いる。

【００１５】なお、上記した本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、ＰＣＲのためのプライマーとしてのみならず、ｃ
ＤＮＡ合成のためのプライマーとしても用いることがで
きる。本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いて合成したｃＤＮＡも本発明の方法に供することが
できる。

【００１６】次に、上記オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いてＣ型肝炎を診断する方法を説明する。

【００１７】診断に供する検体としては、人の体液を用
いることができ、例えば血清を好ましく用いることがで
きる。先ず、検体から全ＲＮＡを抽出し、それらのｃＤ
ＮＡを合成する。これらの操作はこの分野において周知
の方法により行うことができ、そのための試薬も市販さ
れている。

【００１８】次いで、得られたｃＤＮＡライブラリーを
鋳型として、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅する。ＰＣＲの
操作自体はこの分野において周知であり、そのためのキ
ットも市販されている。ＰＣＲに用いるプライマーとし
て、上記した本発明のオリゴヌクレオチドを用いる。Ｐ
ＣＲを行うためには、増幅する領域の両端にハイブリダ
イズする第１及び第２のプライマーを用いる必要があ
る。ＨＣＶのＨＶＲを含む領域を増幅する場合、ＨＶＲ
領域の上流領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドを第１のプライマーとして用い、ＨＶＲ領域の下流領
域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを第２のプ
ライマーとして用いる。図１及び図２に示すように、上
記オリゴヌクレオチドのうち、ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ
３、ＭＳ４、ＭＳ５及びＭＳ６がＨＶＲ領域の上流領域
にハイブリダイズするので、これらのうちのいずれかを
第１のプライマーとして用いる。また、ＭＲ１、ＭＲ２
及びＭＲ１’がＨＶＲ領域の下流領域にハイブリダイズ
するので、これらのうちのいずれかを第２のプライマー
として用いる。また、５’非翻訳領域を増幅する場合に
は、上記ＭＳ１３を第１のプライマーとして用い、第２
のプライマーとしては、例えば従来より公知のＹＣＡ
（5'-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3')又はＹＣＳ１（5'ーCGACA
CTCCACCATAGATCー3' ）を用いることができる（下記実施
例５参照）。

【００１９】ＰＣＲは一段階で実施してもよいが、二段
階で実施すると検出の感度が高まるので好ましい。すな
わち、１回目のＰＣＲでＨＶＲ領域を含む領域又は５’
非翻訳領域を増幅し、２回目のＰＣＲでその増幅された
領域内の領域を増幅し、この２回目のＰＣＲで増幅され
た領域を電気泳動で検出することにより、より高感度の
診断が可能になる。この場合、１回目のＰＣＲで用いる
プライマー及び２回目のＰＣＲで用いるプライマーは、
１回目のＰＣＲで増幅される領域が２回目のＰＣＲで増
幅される領域よりも広くなるように選択する。また、１
回目のＰＣＲで増幅された領域のバンドが後の電気泳動
で検出されないように２回目に用いるオリゴヌクレオチ
ドは１回目よりＴｍ値（Ｔｍ値＝４℃ｘＧ、Ｃの数＋２
℃ｘＡ、Ｔの数）を高く設定することが好ましい。この
ような例として、１回目のＰＣＲのプライマーとしてＭ
Ｓ１とＭＲ１又はＭＳ１とＭＲ１及びＭＲ２を用い、２
回目のＰＣＲのプライマーとしてＭＳ２とＭＲ２、ＭＳ
３とＭＲ２、ＭＳ５とＭＲ２又はＭＳ６とＭＲ２を用い
る場合を挙げることができる。下記実施例３に示すよう
に、１回目のＰＣＲにＭＳ１とＭＲ１及びＭＲ２を用
い、２回目のＰＣＲにＭＳ２とＭＲ２又はＭＳ３とＭＲ
２を用いた場合が最も高感度になるので好ましい。な
お、この例から明らかなように、１回目のＰＣＲでは上
記のオリゴヌクレオチドのうち、複数のものを用いるこ
とも可能である。さらに、２回目のＰＣＲにおけるアニ
ール温度を１回目のＰＣＲにおけるアニール温度よりも
高く設定することが好ましい。例えば、下記実施例で
は、１回目のＰＣＲのアニール温度を４５℃とし、２回
目のＰＣＲのアニール温度を５５℃としている。

【００２０】ＰＣＲによりＤＮＡを増幅した後、増幅さ
れたＤＮＡを変性状態、すなわち一本鎖の状態で電気泳
動にかける。変性は、例えばフォルムアミド溶液にＰＣ
Ｒ産物を加え、これを８０℃〜９５℃程度の温度に加熱
することにより行うことができる。変性状態で電気泳動
にかけるために、変性した増幅産物をアニールすること
なく急冷する。これは、例えば、変性した増幅産物を含
むチューブを氷上で１０分間程度放置することにより達
成することができる。次いで、この冷却した試料を、１
〜４２℃、好ましくは４〜３７℃程度、さらに好ましく
は約１０℃程度に保持されたゲル上で電気泳動にかけ
る。

【００２１】上述の、変性状態での電気泳動は、上記の
ようにＳＳＣＰ法と呼ばれるものであり、この方法で
は、２つのＤＮＡのヌクレオチド配列が１塩基でも異な
っておれば、ＤＮＡがとる立体構造の相違に基づく移動
度の差により、この２つのＤＮＡのバンドが異なった位
置に現れる。従って、増幅されたＤＮＡが何種類あるか
を知ることができる。従って、検体中に含まれるＨＣＶ
が単一クローンである場合、すなわち、増幅されたＤＮ
Ａが１種類しか存在しない場合には、２本のバンドが現
れる（変性により１本の二本鎖ＤＮＡが二本の一本鎖Ｄ
ＮＡに分離するため）。同様に、２クローンの場合には
４本、３クローンの場合には６本のバンドが現れる。な
お、バンドの検出は、常法により、臭化エチジウム染色
や銀染色等により容易に行うことができる。

【００２２】なお、増幅産物は、上記のようなＳＳＣＰ
法による解析の他、ＴＧＧＥ法やＤＧＧＥ法により解析
することも可能である。ＤＧＧＥとはdenaturing gradi
entgel electrophoresis の略語（Fischer, S.G., et a
l., Proc. Natl. Acid. Sci.: 1579, 315, 1985) でア
ルカリ変性濃度勾配アクリルアミドゲルを用い電気泳動
を行うものである。ＴＧＧＥとはtemperature gradient
gel electrophoresisの略語で、温度勾配アクリルアミ
ドゲルを用いて電気泳動を行う方法である（文献：D. R
iesner et al., Electrophoresis 10: 377-389 (1989)
）。

【００２３】これらの電気泳動の際、塩基配列に依存し
たＤＮＡバンドの分離をよくする方法として、先のヘテ
ロ２重鎖法（heteroduplex analysis: C.M. Nagamine,
et al.,: Am. J. Hum. Genet., 45, 337, 1989) を用い
ることができる。この方法では、ＤＮＡを変性後（アル
カリ変性又は熱変性）アニール（再生）させる。１種類
の塩基配列では１本のバンドを形成する。ＤＧＧＥ、Ｔ
ＧＧＥでは２種類（複数）の塩基配列では元の２本鎖
（複数）以外に２種類（複数）のヘテロ２重鎖を形成
し、適当なアクリルアミドゲル（たとえば、ＭＤＥ Ｇ
ｅｌ：Mutation detection enhancement gel, AT Bioch
em. Inc. 30 Spring Mill Drive, Malvern,PA 19355)
を用いた場合は元の２本鎖（複数）以外に１種類（複数
／２）のヘテロ２重鎖を形成する（J. Keen, et al.,:
Genetics, 7, 5, 1991) 。また、検出されるバンド数を
減らす方法として、アシメトリックＰＣＲ法を用いるこ
とができる（Gyllensten, U.B., et al.,: Proc. Nat.
Acad. Sci, USA, 85, 7652, 1988) 。この方法は、ＰＣ
Ｒを行う際に使用する２対のオリゴヌクレオチドの一方
を他方より量的に少なくし（たとえば５０：１）、１本
鎖を優先的に増幅する方法で、２本鎖に比べ、ＳＳＣＰ
電気泳動後の出現バンド数は半分となり、出現バンドが
多い場合、バンドの分離が改善され、また、出現するバ
ンドがＤＮＡの種類となる。

【００２４】なお、ＴＧＧＥ法やＤＧＧＥ法を用いる場
合には、２回目のＰＣＲの際に用いるオリゴヌクレオチ
ドの５’末端に 5' CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCC
CCCGCCCC 3' のオリゴヌクレオチドをつけることが望ま
しい。

【００２５】本発明はまた、上述のように、上記本発明
のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つをプライマーと
して用いたＰＣＲにより、検体中のＨＣＶゲノムのｃＤ
ＮＡを増幅することを含む、ＨＣＶの増幅方法を提供す
る。ＨＣＶゲノムで非常に共通性の高い上記本発明のオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いることで、
５’非翻訳領域と、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１領域の塩基配列
決定を高感度（検出率）で行うことができる。また、同
様な理由で、Ｃ型肝炎ウイルスを高感度で検出すること
ができる。

【００２６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２７】参考例１ プライマー配列の設定 本発明のオリゴヌクレオチドの配列は、次のようにして
決定した。すなわち、データベース（商品名GeneBank、
ロスアラモス、ＵＳＡ）に登録された種々のＨＣＶクロ
ーンのＥ１−Ｅ２／ＮＳ１領域を比較することにより、
ＨＶＲ領域を挟む、保存性の高い領域と相補的なオリゴ
ヌクレオチドである上記ＭＳ１及びＭＲ１を設定した。
ＭＳ１及びＭＲ１は、検出率をできるだけ上げるために
混合オリゴヌクレオチドとした。

【００２８】Ｃ型慢性肝炎患者の血清よりＲＮＡを抽出
し、オリゴヌクレオチドＭＳ１，ＭＲ１を用いてＨＶＲ
を含むＨＣＶのＥ１−Ｅ２／ＮＳ１領域の一部をＰＣＲ
により増幅後、BluescriptII(STRATAGENE,USA)にクロー
ニングし、各クローンに単離した。それらの塩基配列を
決定した。さらにＨＣＶのＥ１−Ｅ２／ＮＳ１領域の既
存の塩基配列をＧｅｎｅＢａｎｋ（商品名）より入手
し、さきに得られた塩基配列と比較した。

【００２９】さらに、プライマー設定に際しては、でき
るだけＨＣＶ間で共通で特に３’末端が共通であるよう
に設定した。また、検出率を上げるために混合プライマ
ーを設定した。ＨＣＶは変異を起こしやすくプライマー
の設定は、検出率に影響を与える為にその選定は検出率
に影響を与える。また、これらのプライマーはＧＣ％が
１０から９０％の範囲で、望ましくは４０から６０％が
良い。これらを考慮した上で検討した結果、図２〜図１
４に示すように比較的各ＨＣＶクローン間で保存性の高
い共通配列を見いだし同領域のＤＮＡ増幅に適したプラ
イマーである上記ＭＳ２、ＭＲ２、ＭＳ３、ＭＲ１’、
ＭＳ４、ＭＳ５及びＭＳ６を設定した。また、５’非翻
訳領域についても同様な検索を行い、上記ＭＳ１３を設
定した。

【００３０】実施例１ ＨＣＶのＨＶＲ領域の変異の検
出 ＩＦＮα治療に対しての著効例であった慢性Ｃ型肝炎患
者より経時的に末梢血を採取しＨＣＶ−ＨＶＲのＳＳＣ
Ｐ解析を以下のようにして行った。

【００３１】(1) ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ 患者血清１００μｌをＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、ＢＩＯ
ＴＥＸ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））９００μｌ及びクロロホ
ルム１５０μｌと混合し、５秒間攪拌し、−２０℃で５
分間インキュベートした。次いで１２０００ｒｐｍで５
分間遠心し、上清（６００μｌ）を５００μｌのイソプ
ロパノール及び５μｌ（２０ｎｇ）のグリコーゲンと混
合し、４℃で１５分間反応させた。次いでこれを１２０
００ｒｐｍで２０分間遠心した。沈殿に１ｍｌの７５％
エタノールを加えて懸濁後、１２０００ｒｐｍで５分間
遠心した。この７５％エタノール処理−遠心操作をさら
に２回行い、沈殿をデシケーター中で１５分間乾燥さ
せ、精製された抽出ＲＮＡを得た。次いで、抽出したＲ
ＮＡを鋳型とし、ランダムヘキサマーのオリゴヌクレオ
チド（５’ー ＮＮＮＮＮＮ−３’；Ｎ＝ＡまたはＴまた
はＧまたはＣ）をプライマーとして用いて常法によりｃ
ＤＮＡ合成した（３７℃、９０分）。その一部をオリゴ
ヌクレオチドＭＳ１，ＭＲ１，ＭＲ２を用いてＰＣＲ法
（Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、４８７ー４
９１、１９８８）により増幅（ＰＣＲサイクル３５、変
性９４℃、１分、アニール４５℃、２分、伸長７２℃、
３分）し、増幅産物の一部をオリゴヌクレオチドＭＳ
２、ＭＲ２を用いて２回目のＰＣＲ（ＰＣＲサイクル２
５、変性９４℃、１分、アニール５５℃、２分、伸長７
２℃、３分）を行いさらに増幅させた。３％アガロース
電気泳動で３１５ｂｐの増幅産物を確認した。

【００３２】(2) ＳＳＣＰ解析 その一部を８０℃で２分間処理することにより熱変性
後、１０℃に保ち、５分放置した。これをあらかじめ冷
却型恒温水槽（スーパースッタッドミニＰＩＤ、AB-160
0 型、アトー株式会社）で１０℃一定に保った電気泳動
漕（レゾマックス・２連ミニスラブ、ゲルサイズ：９０
ｍｍ（Ｗ）ｘ８０ｍｍ（Ｈ））で厚さ１ｍｍの１／３Ｍ
ＤＥゲル（ＡＴ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて電気泳動を
行った。電気泳動条件：３００Ｖ一定、トリス−グリシ
ンバッファー、３時間、１０℃。電気泳動後、臭化エチ
ジウムの水溶液で１５分染色後、紫外線照射下でポラロ
イド撮影を行った。その結果、明瞭な２本のバンドが観
察された。

【００３３】著効例である本症例ではＩＦＮ投与前のＨ
ＣＶ−ＨＶＲのＳＳＣＰ解析バンド数が２本であり、Ｈ
ＣＶは単一クローンであった。ＩＦＮ治療中もクローン
数は変わらず、バンド移動度は変化しなかった。また、
ＨＣＶ−ＲＮＡは、１６週から陰性化し、ＧＰＴは正常
化、ＩＦＮ治療終了後２４週でもＨＣＶ−ＲＮＡは検出
されなかった。この結果は多くの文献の結果と一致（著
効例ではクローン数が単一か少ない）するものである。

【００３４】実施例２ ＩＦＮα不応例の慢性Ｃ型肝炎患者について、ＩＦＮ治
療中及び治療後のＨＣＶ−ＨＶＲのＳＳＣＰ解析を実施
例１と同様に行った。ＩＦＮ治療中はＳＳＣＰ結果のバ
ンドパターンが変動し、バンド数も増加し、ＩＦＮ治療
後も変動し続けた（図１５）。なお、図１５における各
レーンの血清採取時期及びその時点でのＧＴＰ活性を表
１に示す。ＨＣＶはＨＩＶ同様エンベロープ蛋白を変化
させる事により免疫系を逃れ、慢性感染を起こす事が予
想されており、本発明はＨＣＶのＨＶＲを含むＥ１−Ｅ
２の一部のＳＳＣＰバンドパターンの変化を簡便に経時
的にとらえこのことを証明する共に、Ｃ型肝炎に対する
薬物療法の効果判定のモニターとして有用であると考え
られた。

【００３５】

【表１】

【００３６】実施例３ Ｃ型肝炎慢性患者血清（ＭＳ１３とＹＣＡ（5'-ACTCGCA
AGCACCCTATCA-3')を用いたＰＣＲによりｃＤＮＡが増幅
されたもの）５０例を用い、実施例１と同様にして、１
回目のＰＣＲまでを行った。次いで、下記表２に示す組
合せのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて２
回目のＰＣＲを行った。各組合せのプライマーを用いた
場合の検出率を下記表２に示す。表２に示すように、２
回目のＰＣＲにはＭＳ２とＭＲ２又はＭＳ３とＭＲ２を
用いた時検出率が最も高かった。

【００３７】

【表２】

【００３８】実施例４ 参考例１に記載した方法により得られたクローンのうち
の３つ（クローンＡ、Ｂ、Ｃ）を用いて次の実験を行っ
た。すなわち、クローンＡとクローンＢを１：０、１：
１、１：０．８、１：０．６、１：０．４、１：０．
２、１：０．１、及び０：１の比率に混合した試料につ
いて、実施例１と同様に、ＰＣＲ、ＳＳＣＰ解析を行っ
た。なお、１回目のＰＣＲにはＭＲ１とＭＳ１をプライ
マーとして用い、２回目のＰＣＲにはＭＳ２とＭＲ２を
プライマーとして用いた。その結果、クローンが単一の
場合は２本のバンドが、２種混合の場合には４本のバン
ドが検出された。しかも、混合の場合、混合比率により
クローンＢのバンドの太さが変化したので、ある程度定
量的にその比率を予測することができた。

【００３９】クローンＢとクローンＣの混合物及びクロ
ーンＡ、Ｂ、Ｃの混合物についても同様に試験した。そ
の結果、３クローン混合の場合には６本のバンドが検出
され、２クローン混合の場合には４本のバンドが検出さ
れた。このように、本発明の方法により、検体中のＨＣ
Ｖのクローン数を確実に知ることができる。なお、クロ
ーンＡ、Ｂ、ＣのＨＶＲ領域の変異部分の配列を図１６
に示す。

【００４０】実施例５ ＨＣＶの5'非翻訳領域の増幅 5'非翻訳領域についてもその共通塩基配列を検索しオリ
ゴヌクレオチドＭＳ１３を設定した。実施例１同様、Ｃ
型慢性肝炎患者の血清よりＲＮＡを抽出し、オリゴヌク
レオチドＹＣＡ：5'-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3' でｃＤＮ
Ａ合成し、１回目のＰＣＲ増幅でオリゴヌクレオチドＭ
Ｓ１３とＹＣＡを用い、２回目にＹＣＳ２とＹＣＡを用
いてＰＣＲを行った（ＭＳ１３系）。同様に１回目のオ
リゴヌクレオチドをＭＳ１３をＹＣＳ１：5'ーCGACACTCC
ACCATAGATCー3' にかえた場合（ＹＣＳ１系）と検出率の
比較を行った。下記表３に示すように１回目のＰＣＲに
ＭＳ１３を用いた場合の方が従来用いられていたＹＣＳ
１を用いるより検出率が高かった。ＨＣＶタイプIII、 I
V で特に検出率がより高くなった。

【００４１】

【表３】

【００４２】実施例６ 複数の領域を同時にＳＳＣＰ解析を行うことを試みた。
この際、増幅する遺伝子の長さを変える事により各領域
ごとにＳＳＣＰによる解析を後述のように行った。ＨＣ
ＶのＨＶＲを含む領域とＨＣＶゲノム中、最も保存性の
高い5'非翻訳領域を同時に増幅し、同時にＳＳＣＰ解析
を行った。5'非翻訳領域を同時に増幅する事でＨＣＶー
ＲＮＡの存在および5'非翻訳領域の変異の確認をＨＶＲ
の解析と同時に行う事ができる。

【００４３】Ｃ型慢性肝炎患者より実施例１と同様に血
清よりＲＮＡ抽出後、オリゴヌクレオチドＭＲ１，ＹＣ
Ａを等量混合しｃＤＮＡ合成後、オリゴヌクレオチドＭ
Ｓ１，ＭＲ１，ＭＳ１３，ＹＣＡを等量混合しＰＣＲを
行い、その一部をさらにオリゴヌクレオチドＭＳ２，Ｍ
Ｒ２，ＹＣＳ２，ＹＣＡを用いてＰＣＲを行った。増幅
産物を実施例１と同様にＳＳＣＰ解析を行った。

【００４４】その結果、図１７に示すように、ＨＣＶの
ＨＶＲと5'非翻訳領域を同時に判別し、１つのレーンで
複数の領域を同時にＳＳＣＰ解析する事ができた。

【００４５】

【発明の効果】本発明により、検体中のＨＣＶのクロー
ン数を確実、簡便に調べることができるＣ型肝炎の診断
方法及びそれに用いられるオリゴヌクレオチドが提供さ
れた。上記から明らかなように、本発明により、検体中
のＨＣＶのクローン数を確実に簡便に知ることができる
ようになったので、そのＣ型肝炎のＩＦＮによる治療効
果を確実に予想することができる。従って、本発明はＣ
型肝炎の診断及び治療に大いに貢献する。

【００４６】実施例７ ５’非翻訳領域をＳＳＣＰ解析によりゲノタイピングを
試みた。Ｃ型慢性肝炎患者８例より実施例３と同様に、
オリゴヌクレオチドＹＣＡを用いてｃＤＮＡ合成し、１
回目のＰＣＲにオリゴヌクレオチドＭＳ１３、ＹＣＡを
用い、２回目のＰＣＲにはオリゴヌクレオチドＹＣＳ２
とＹＣＡを用いた。実施例１同様ＳＳＣＰ解析を行っ
た。

【００４７】その結果、図１８に示すように、検出バン
ド位置により少なくとも２つのパターンに分類できた。
岡本らの方法（H. Okamoto et al., J. Gen. Virol. 7
3: 673-679)でのタイピングを同一検体で実施し、先の
結果と比較したところ、下記表４及び５に示すように、
相関性を示した。

【００４８】

【表４】

【００４９】

【表５】

【００５０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３３６０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to genomic RNA 配列 TTGGGGGCGA CACTCCACCA TAGATCACTC CCCTGTGAGG AACTACTGTC TTCACGCAGA 60 AAGCGTCTAG CCATGGCGTT AGTATGAGTG TTGTGCAGCC TCCAGGACCC CCCCTCCCGG 120 GAGAGCCATA GTGGTCTGCG GAACCGGTGA GTACACCGGA ATTGCCAGGA CGACCGGGTC 180 CTTTCTTGGA TCAACCCGCT CAATGCCTGG AGATTTGGGC GTGCCCCCGC GAGACTGCTA 240 GCCGAGTAGT GTTGGGTCGC GAAAGGCCTT GTGGTACTGC CTGATAGGGT GCTTGCGAGT 300 GCCCCGGGAG GTCTCGTAGA CCGTGCATC ATG AGC ACA AAT CCT AAA CCT CAA 353 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln 1 5 AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC 401 Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe 10 15 20 CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG 449 Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg 25 30 35 40 GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG 497 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 45 50 55 CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG 545 Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu 60 65 70 GGT AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAC 593 Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn 75 80 85 GAG GGT ATG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGT GGC TCT CGG 641 Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg 90 95 100 CCT AGT TGG GGC CCC ACA GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT 689 Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly 105 110 115 120 AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC 737 Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr 125 130 135 ATT CCG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCA 785 Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala 140 145 150 CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT 833 His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn 155 160 165 CTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTA GCT TTG CTG TCT TGT 881 Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 170 175 180 TTG ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAC GAG GTG CGC AAC GTG TCC GGG ATA 929 Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile 185 190 195 200 TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA 977 Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala 205 210 215 GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTC CGG GAG 1025 Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 220 225 230 AGT AAT TTC TCC CGT TGC TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 1073 Ser Asn Phe Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala 235 240 245 AGG AAC AGC AGC ATC CCC ACC ACG ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 1121 Arg Asn Ser Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu 250 255 260 CTC GTT GGG GCG GCT GCT CTC TGT TCC GCT ATG TAC GTT GGG GAT CTC 1169 Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 265 270 275 280 TGC GGA TCC GTT TTT CTC GTC TCC CAG CTG TTC ACC TTC TCA CCT CGC 1217 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg 285 290 295 CGG TAT GAG ACG GTA CAA GAT TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC 1265 Arg Tyr Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His 300 305 310 GTA TCA GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT 1313 Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro 315 320 325 ACA ACG GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC GTC 1361 Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val 330 335 340 GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGT GTC CTA GCG GGC CTT GCC 1409 Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala 345 350 355 360 TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTC TTG ATT GTG ATG CTA 1457 Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu 365 370 375 CTC TTT GCT GGC GTT GAC GGG CAC ACC CAC GTG ACA GGG GGA AGG GTA 1505 Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr His Val Thr Gly Gly Arg Val 380 385 390 GCC TCC AGC ACC CAG AGC CTC GTG TCC TGG CTC TCA CAA GGC CCA TCT 1553 Ala Ser Ser Thr Gln Ser Leu Val Ser Trp Leu Ser Gln Gly Pro Ser 395 400 405 CAG AAA ATC CAA CTC GTG AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAC AGG 1601 Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg 410 415 420 ACC GCT CTG AAT TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC ATT GCT GCG 1649 Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Ile Ala Ala 425 430 435 440 CTG TTC TAC GCA CAC AGG TTC AAC GCG TCC GGG TGC CCA GAG CGC ATG 1697 Leu Phe Tyr Ala His Arg Phe Asn Ala Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met 445 450 455 GCT AGC TGC CGC CCC ATC GAT GAG TTC GCT CAG GGG TGG GGT CCC ATC 1745 Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Glu Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile 460 465 470 ACT CAT GAT ATG CCT GAG AGC TCG GAC CAG AGG CCA TAT TGC TGG CAC 1793 Thr His Asp Met Pro Glu Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His 475 480 485 TAC GCG CCT CGA CCG TGC GGG ATC GTG CCT GCG TCG CAG GTG TGT GGT 1841 Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly 490 495 500 CCA GTG TAT TGC TTC ACT CCG AGC CCT GTT GTA GTG GGG ACG ACC GAT 1889 Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp 505 510 515 520 CGT TTC GGC GCT CCT ACG TAT AGC TGG GGG GAG AAT GAG ACA GAC GTG 1937 Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val 525 530 535 CTG CTA CTT AGC AAC ACG CGG CCG CCT CAA GGC AAC TGG TTT GGG TGC 1985 Leu Leu Leu Ser Asn Thr Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys 540 545 550 ACG TGG ATG AAC AGC ACT GGG TTC ACC AAG ACG TGC GGG GGC CCT CCG 2033 Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro 555 560 565 TGC AAC ATC GGG GGG GTC GGC AAC AAC ACC TTG GTC TGC CCC ACG GAT 2081 Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Val Cys Pro Thr Asp 570 575 580 TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG GCC ACT TAC ACA AAG TGT GGC TCG GGG 2129 Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly 585 590 595 600 CCC TGG TTG ACA CCC AGG TGC ATG GTT GAC TAC CCA TAC AGG CTC TGG 2177 Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp 605 610 615 CAC TAC CCC TGC ACT GTT AAC TTT ACC GTC TTT AAG GTC AGG ATG TAT 2225 His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Val Phe Lys Val Arg Met Tyr 620 625 630 GTG GGG GGC GTG GAG CAC AGG CTC AAT GCT GCA TGC AAT TGG ACT CGA 2273 Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg 635 640 645 GGA GAG CGC TGT GAC TTG GAG GAC AGG GAT AGG TCA GAA CTC AGC CCG 2321 Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro 650 655 660 CTG CTG CTG TCT ACA ACA GAG TGG CAG ATA CTG CCC TGT TCC TTC ACC 2369 Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr 665 670 675 680 ACC CTA CCG GCC CTG TCC ACT GGC TTG ATC CAT CTT CAC CGG AAC ATC 2417 Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Arg Asn Ile 685 690 695 GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC GGT ATA GGG TCG GCA GTT GTC TCC TTT 2465 Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile Gly Ser Ala Val Val Ser Phe Va 700 705 710 GCA ATC AAA TGG GAG TAT ATC CTG TTG CTT TTC CTT CTT CTG GCG GAC 2513 Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Ile Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp 715 720 725 GCG CGC GTC TGT GCC TGC TTG TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCC CAG GCT 2561 Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala 730 735 740 GAG GCC ACC TTA GAG AAC CTG GTG GTC CTC AAT GCG GCG TCT GTG GCC 2609 Glu Ala Thr Leu Glu Asn Leu Val Val Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala 745 750 755 760 GGA GCG CAT GGC CTT CTC TCC TTC CTC GTG TTC TTC TGC GCC GCC TGG 2657 Gly Ala His Gly Leu Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp 765 770 775 TAC ATC AAA GGC AGG CTG GTC CCT GGG GCG GCA TAT GCT CTC TAT GGC 2705 Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Leu Tyr Gly 780 785 790 GTA TGG CCG TTG CTC CTG CTC TTG CTG GCC TTA CCA CCA CGA GCT TAT 2753 Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr 795 800 805 GCC ATG GAC CGA GAG ATG GCT GCA TCG TGC GGA GGC GCG GTT TTT GTA 2801 Ala Met Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe Val 810 815 820 GGT CTG GTA CTC TTG ACC TTG TCA CCA TAC TAT AAG GTG TTC CTC GCT 2849 Gly Leu Val Leu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Val Phe Leu Ala 825 830 835 840 AGG CTC ATA TGG TGG TTA CAA TAT TTT ATC ACC AGA GCC GAG GCG CAC 2897 Arg Leu Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His 845 850 855 TTG CAA GTG TGG GTC CCC CCT CTC AAT GTT CGG GGA GGC CGC GAT GCC 2945 Leu Gln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala 860 865 870 ATC ATC CTC CTT ACA TGC GCG GTC CAT CCA GAG CTA ATC TTT GAC ATC 2993 Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala Val His Pro Glu Leu Ile Phe Asp Ile 875 880 885 ACC AAA CTC CTG CTC GCC ATA CTC GGT CCG CTC ATG GTG CTC CAG GCT 3041 Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala 890 895 900 GGC ATA ACT AGA GTG CCG TAC TTT GTA CGC GCT CAG GGG CTC ATC CGT 3089 Gly Ile Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg 905 910 915 920 GCA TGC ATG TTA GTG CGG AAG GTC GCT GGA GGC CAC TAT GTC CAA ATG 3137 Ala Cys Met Leu Val Arg Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met 925 930 935 GCC TTC ATG AAG CTG GCC GCG CTG ACA GGT ACG TAC GTA TAT GAC CAT 3185 Ala Phe Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His 940 945 950 CTT ACT CCA CTG CGG GAT TGG GCC CAC GCG GGC CTA CGA GAC CTT GCG 3233 Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala 955 960 965 GTG GCA GTA GAG CCC GTC GTC TTC TCT GAC ATG GAG ACT AAA CTC ATC 3281 Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Leu Ile 970 975 980 ACC TGG GGG GCA GAC ACC GCG GCG TGT GGG GAC ATC ATC TCG GGT CTA 3329 Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu 985 990 995 1000 CCA GTC TCC GCC CGA AGG GGG AAG GAG ATA C 3360 Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Lys Glu Ile 1005 1010

【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CACCGCATGG CWTGGGATAT 20

【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGCTNGGRG TGAAGCARTA 20

【００５３】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TTGGGATATG ATGATGAACT GG 22

【００５４】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CTGTTGATGT GCCAGCTGCC 20

【００５５】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGATATGATG ATGAAGTGG 19

【００５６】配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TCYGTCTCAT TYGCCCCCA 19

【００５７】配列番号：８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGNCAYHGNA TGGCNTGG 18

【００５８】配列番号：９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GCTACTCTTT GCCGGCGT 18

【００５９】配列番号：１０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CTCTTTGCCG GCGTTGACG 19

【００６０】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GAGGAACTAC TGTCTTCACG 20

【００６１】配列番号：１２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ACTCGCAAGC ACCCTATCA 19

【００６２】配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CGACACTCCA CCATAGATC 19

【００６３】配列番号：１４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 CGCCCGCCGC GCCCCGCGCC CGTCCCGCCG CCCCCGCCCC 40

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＣＶゲノムの一部の塩基配列の一例と、本発
明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域を示
す図である。

【図２】図１の続きを示す図である。

【図３】本発明のオリゴヌクレオチドＭＳ１、ＭＳ２、
ＭＳ３及びＭＳ４を設定した根拠となる、種々のクロー
ンの当該領域の塩基配列を異同を比較する図である。

【図４】図３の続きを示す図である。

【図５】図４の続きを示す図である。

【図６】図５の続きを示す図である。

【図７】本発明のオリゴヌクレオチドＭＲ２を設定した
根拠となる、種々のクローンの当該領域の塩基配列を異
同を比較する図である。

【図８】図７の続きを示す図である。

【図９】図８の続きを示す図である。

【図１０】図９の続きを示す図である。

【図１１】図１０の続きを示す図である。

【図１２】本発明のオリゴヌクレオチドＭＲ１を設定し
た根拠となる、種々のクローンの当該領域の塩基配列を
異同を比較する図である。

【図１３】本発明のオリゴヌクレオチドＭＳ５及びＭＳ
６を設定した根拠となる、種々のクローンの当該領域の
塩基配列を異同を比較する図である。

【図１４】本発明のオリゴヌクレオチドＭＲ１’を設定
した根拠となる、種々のクローンの当該領域の塩基配列
を異同を比較する図である。

【図１５】ＩＦＮα不応例の慢性Ｃ型肝炎患者につい
て、ＩＦＮ治療中及び治療後のＨＣＶ−ＨＶＲのＳＳＣ
Ｐ解析を本発明の方法により行った結果の電気泳動パタ
ーンを示す模式図である。

【図１６】３種のクローンを利用して、本発明の方法に
よりクローン数の測定を行った実験に用いた各クローン
の変異領域の塩基配列を示す図である。

【図１７】ＨＶＲ領域と５’非翻訳領域の両方を長さを
変えて同時に増幅させた産物についてのＳＳＣＰ電気泳
動のパターンを示す模式図である。

【図１８】ＨＣＶの５’非翻訳領域のＳＳＣＰ解析を本
発明の方法により行った結果の電気泳動パターンを示す
模式図である。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 5' CACCGCATGGCWTGGGATAT 3'（ただし、
   ＷはＡ又はＴ）で示される塩基配列を有するオリゴヌク
   レオチド。
2. 【請求項２】 5' GGGCTNGGRGTGAAGCARTA 3'（ただし、
   ＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴ、ＲはＡ又はＧ）で示される
   塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 5' TTGGGATATGATGATGAACTGG 3'で示され
   る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 5' CTGTTGATGTGCCAGCTGCC 3'で示される
   塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 5' GGATATGATGATGAAGTGG 3' で示される
   塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 5' TCYGTCTCATTYGCCCCCA 3' （ただし、
   ＹはＴ又はＣ）で示される塩基配列を有するオリゴヌク
   レオチド。
7. 【請求項７】 5' GGNCAYHGNATGGCNTGG 3'（ただし、Ｎ
   はＡ又はＣ又はＧ又はＴ、ＹはＴ又はＣ）で示される塩
   基配列を有するオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 5' GCTACTCTTTGCCGGCGT 3'で示される塩
   基配列を有するオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 5' CTCTTTGCCGGCGTTGACG 3' で示される
   塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 5' GAGGAACTACTGTCTTCACG 3'で示され
    る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 請求項１ないし１０のいずれか１項に
    記載のオリゴヌクレオチドから成るＣ型肝炎診断薬。
12. 【請求項１２】 請求項１、３、５、７、８及び９記載
    のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌ
    クレオチドと、請求項２、４及び６記載のオリゴヌクレ
    オチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチドをプ
    ライマーとして用いたＰＣＲにより、検体中のＨＣＶゲ
    ノムのｃＤＮＡを増幅し、増幅産物を変性状態で電気泳
    動にかけ、バンドの位置を検出することを含むＣ型肝炎
    の診断方法。
13. 【請求項１３】 前記ＰＣＲを２段階に分けて行い、１
    回目のＰＣＲに用いるプライマーと２回目のＰＣＲに用
    いるプライマーが異なっている請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 １回目のＰＣＲに請求項１、請求項２
    及び請求項４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーと
    して用いる請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 ２回目のＰＣＲに請求項３及び請求項
    ４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる
    請求項１３又は１４記載の方法。
16. 【請求項１６】 ２回目のＰＣＲに請求項５及び請求項
    ４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる
    請求項１３又は１４記載の方法。
17. 【請求項１７】 ２回目のＰＣＲに請求項８及び請求項
    ４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる
    請求項１３又は１４記載の方法。
18. 【請求項１８】 ２回目のＰＣＲに請求項９及び請求項
    ４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる
    請求項１３又は１４記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記電気泳動は１℃〜４２℃の温度下
    で行う請求項１２ないし１８のいずれか１項に記載の方
    法。
20. 【請求項２０】 請求項１ないし１０のいずれか１項に
    記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰ
    ＣＲにより、検体中のＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを増幅す
    ることを含むＣ型肝炎ウイルスの増幅方法。