KR20070037235A - Ｈｂｖ 특이 유전자 정량키트 - Google Patents
Ｈｂｖ 특이 유전자 정량키트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20070037235A KR20070037235A KR1020050092552A KR20050092552A KR20070037235A KR 20070037235 A KR20070037235 A KR 20070037235A KR 1020050092552 A KR1020050092552 A KR 1020050092552A KR 20050092552 A KR20050092552 A KR 20050092552A KR 20070037235 A KR20070037235 A KR 20070037235A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hbv
- gene
- sample
- specific
- kit
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 PCR 반응혼합물, HBV의 HBsAg(surface antigen region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 대조군 유전자를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 혼합물, HBV 표준 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 HBV 특이 유전자 정량키트 및 전기 키트를 이용하여 HBV 특이 유전자를 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HBV 정량키트를 사용할 경우, B형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 정량할 수 있으므로, B형 간염의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
HBV 특이 유전자, HBV 특이 유전자 정량키트
Description
본 발명은 HBV 특이 유전자 정량키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 PCR 반응혼합물, HBV의 HBsAg(surface antigen region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 유전자를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 혼합물, HBV 표준 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 HBV 특이 유전자 정량키트 및 전기 키트를 이용하여 HBV 특이 유전자를 정량하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염은 특히 열대아프리카, 동남아시아 및 극동아시아에서 흔히 발생하는 바이러스성 질병으로, B형 간염바이러스(HBV)에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다. 전기 HBV는 헤파드나바이러스 과(Hepadnavirus family)에 속하는 피막을 갖고 있는 DNA 바이러스로서, 혈청학적으로 바이러스의 표면항원(HBsAg)에 따라 크게 8 가지의 아형(subtype), 즉, ayw, ayw2, ayw3, ayr, adw, adw2, adw4 및 adr으로 분류된다. 현재까지 보고된 바에 의하면, B형 간염은 전세계적으로 약 3억 정도의 인구가 감염되어 있는데, 감염이 되면 간염 또는 간경변이 유발되고 만성간염으로 되는 경우 간암으로까지 이행한다고 알려져 있다(참조: Tiollais and Buenda, Scientific American, 246, 48(1991); Hu et al., PNAS, 87, 7140(1990); Wei et al., J. Med. Virol., 45, 82(1995)).
B형 간염을 발병초기에 발견할 경우에는 비교적 용이하게 치료할 수 있기 때문에, 이의 조기진단이 매우 중요하게 여겨지고 있으며, 이에 따라 HBV의 감염을 조기 진단할 수 있는 방법에 대한 연구가 매우 활발하게 진행되고 있다. 초기에는 HBV의 특정 단백질을 인식할 수 있는 항체를 이용한 면역학적인 방법이 집중적으로 연구되었으나, 검사에 대량의 시료가 소요되고, 항체생산에 많은 비용이 소요되며, 보관이 어렵다는 다양한 단점으로 인하여, 점차적으로 PCR을 이용한 방법이 개발되고 있는 실정이다.
예를 들어, 대한민국 특허등록 제 41318호에는 환자의 시료로부터, HBV의 표면항원 유전자를 검출하여 B형 간염을 진단하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제 180987호에는 환자의 시료로부터, HBV의 조절단백질인 X 단백질의 유전자를 검출하여 B형 간염을 진단하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제 2005-15407호에는 HBV 특이적인 유전자를 포함하는 DNA칩을 포함하는, 환자의 시료로부터 HBV의 감염여부를 진단할 수 있는 진단키트가 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제 2003-47954호에는 다중 PCR 방법을 이용하여, 환자의 시료로부터 HBV의 감염여부를 진단할 수 있는 진단키트가 개시되어 있다. 이처럼 PCR을 이용하는 방법 또는 진단키트는 환자의 시료에 HBV 유전자가 충분히 존재할 경우에 사용될 수 있어, HBV가 충분히 감염되지 않은 초기 환자로부터 수득한 시료에서는 검출이 용이하지 않아 경우에 따라서는 대량의 시료를 필요로 할 수도 있고, 시료의 미세한 오염만으로도 큰 오차를 나타낸다는 단점이 제기되었다.
상술한 단점을 극복하기 위한 방법으로, 최근에는 미량의 시료로부터 표적 RNA의 정량까지 가능한 실시간 RT-PCR 방법을 활용한 진단 키트들이 개발되어 시판되고 있다. 그러나, 상기 진단키트들은 표준 유전자로 RNA를 제공함으로써 안정성 및 재현성의 문제점을 내포하고 있거나, 표준화에 사용되는 참조 유전자정량용 프라이머 및 프로브가 포함되어 있지 않아, 정확한 진단이 수행될 수 없을 뿐만 아니라, HBV의 감염여부를 확인하는 것은 가능하지만, 감염된 HBV 유전자를 정량할 수 없어, 질병의 진행정도를 파악할 수 없다는 단점이 지적되어, 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 HBV 특이 유전자를 정량할 수 있는 방법을 개발하려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
따라서, 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 HBV 특이 유전자를 정량할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 보다 간편하고, 정확하게 환자에 감염된 HBV 특이 유전자를 정량할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, HBV의 HBsAg(surface antigen region) 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브와 대조군 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 HBV 특이 유전자 정량키트를 사용할 경우, 보다 간편하고, 정확하게 HBV 특이 유전자를 정량할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 간편하면서도 정확하게 HBV 특이 유전자를 정량할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 키트를 이용하여, HBV 특이 유전자를 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 HBV 정량키트는 (ⅰ) 완충용액, DNA 중합효소, KCl, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 포함하는 PCR 반응혼합물; (ⅱ) HBV의 HBsAg(surface antigen region) 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)로 구성된 HBV 프로브 및 프라이머 혼합물; (ⅲ) 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 TaqMan프로브(서열번호 6)로 구성된 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물; (ⅳ) ㎕당 1x101 내지 1x105복제수(copy)의 HBV HBsAg 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 HBV 표준 유전자시료; (ⅴ) 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전 자의 전체 또는 일부를 포함하는 내부대조군 유전자시료; 및, (ⅵ) 반응용 멸균수를 포함한다. 이때, 완충용액은 특별히 이에 제한되지 않으나, pH 7 내지 8의 중성완충용액을 사용함이 바람직하고, PCR 반응혼합물에 (NH4)2SO4, 송아지혈청알부민, EDTA, ROX(6-carboxy-X-rhodamine) 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수도 있다. 또한, HBV 특이적 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 5' 말단이 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein) 또는 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)으로 표지되고, 3' 말단이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine)으로 표지된 것을 사용함이 바람직하고, 대조군 특이적 프로브는 특별히 이에 제한되지 않으나, 5'말단이 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지되고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지되며, 3'말단이 인산화된 것을 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 환자에 감염된 HBV의 감염 정도를 정량할 수 있는 방법을 다각적으로 연구하던 중, 종래의 키트를 개량하는 방법을 모색하게 되었다.
지금까지 사용된 환자에 감염된 HBV의 감염 정도를 정량하는 키트 중에서 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 이용하는 키트의 경우, 상대적으로 정확도가 우수함 이 알려져 있는데, 이의 기술적 원리는 다음과 같다: 먼저, 시료에 존재하는 HBV 특이 유전자를 주형으로 하고, 적절한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행할 때, HBV 특이 유전자와 결합할 수 있는 프로브를 첨가한다. 이때, 사용되는 프로브는 3'말단과 5'말단에 각각 서로 다른 2종류의 형광물질로 표지하도록 제조되는데, 사용되는 2종류의 형광물질은 일정한 간격내에 존재할 경우, 발색되는 형광이 상호 간섭현상을 나타내어, 형광이 발색되지 않는 것을 사용하게 된다. 결과적으로, 중합효소 연쇄반응을 수행할 때, 주형의 일측방 말단에는 프라이머가 결합하고 이를 인식하는 DNA 중합효소에 의하여 중합효소 연쇄반응이 순차적으로 수행되고, 주형의 가운데 부분에는 2종류의 형광물질로 표지된 프로브가 결합된다. 이어, 중합효소가 전기 프로브가 결합된 부위에 도달하면, 프로브를 형광물질이 표지된 5'말단부터 순차적으로 분해시키면서, 중합반응을 계속적으로 수행하게 되므로, 5'말단에 표지된 형광물질이 소실되는 결과를 초래한다. 이에 따라, 간섭현상이 소실되어, 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색반응을 수행하여, HBV 특이 유전자가 증폭되고 있음을 나타내게 된다.
또한, 본 발명자들은 PCR이 정상적으로 수행되었는지의 여부를 확인할 수 있도록, 내부대조군을 이용하였다. 즉, 환자로부터 수득한 검체시료에서 HBV의 감염여부에 상관없이 정상적으로 발현되는 유전자를 내부대조군으로 활용하여, HBV 특이 유전자와 함께 PCR을 수행하였을 경우, 내부대조군이 증폭되지 않았다면, PCR이 정상적으로 수행되지 않은 것으로 간주할 수 있으므로, 검출된 결과에 대한 신뢰성 을 높일 수 있었다.
본 발명의 HBV 정량키트를 사용할 경우, B형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 정량할 수 있으므로, B형 간염의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다: 즉, 유전자분석시료 및 전기 HBV 정량키트의 HBV 표준 유전자시료와 내부대조군 유전자시료에, 각각 전기 HBV 정량키트의 HBV 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 및 PCR 반응혼합물을 가하고 혼합한 다음, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 유전자분석시료 및 HBV 표준 유전자시료의 HBV PCR 산물과 내부대조군 PCR 산물을 각각 수득하고, 이를 분석하여, HBV 특이 유전자의 유무를 확인하였으며, 이어, 전기 HBV 정량키트의 HBV 표준 유전자시료의 PCR 산물을 정량하여 HBV 유전자의 정량 표준곡선을 수득한 후, 전기 수득한 HBV 유전자의 정량 표준곡선을 이용하여, 전기 확인된 유전자분석시료에 존재하는 HBV 특이 유전자를 정량함으로써, B형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하게 정량할 수 있다.
아울러, 이러한 측정방법은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 실행될 수 있는데, 실시간 중합효소 연쇄반응기기는 특별히 이에 제한되지는 않으나, LightCyclerTM(Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA), iCyclerTM(Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM(PharmaTech, USA) 등을 사용함이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: HBV 정량키트의 제조
PCR 반응혼합물, HBV 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물, HBV 표준 유전자시료, 양성내부대조군 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수로 구성된 HBV 정량키트를 제조하였다.
실시예 1-1: PCR 반응혼합물, HBV 프로브 및 프라이머 혼합물 및 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물의 작제
먼저, PCR 반응혼합물은 100mM Tris/HCl(pH 8.3), 20mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 7mM MgCl2, 1.625U DNA 중합효소, 0.8mM dUTP, 0.8mM dATP, 0.8mM dCTP 및 0.8mM dGTP를 혼합하여 제조하였다.
다음으로, HBV 프로브 및 프라이머 혼합물은 하기의 염기서열을 갖는 HBV 특이 유전자에 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)를 혼합하여 제조하고, 이들의 5' 말단을 6-카르복시플루오레세인으로 표지하고, 3' 말단을 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지하였다.
센스 프라이머 : 5'-gccatttgttcagtggttcg-3'(서열번호 1)
안티센스 프라이머 : 5'-aggtaaaaagggactcaagatgttgtac-3'(서열번호 2)
프로브 : 5'-agggctttcccccactgtttggct-3'(서열번호 3)
끝으로, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물은 하기의 염기서열을 갖는 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 프로브(서열번호 6)를 혼합하여 제조하였다. 이때, 프로브의 5'말단은 형광물질인 VIC로 표지하고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지시켰으며, 3'말단을 인산화시켰다.
센스 프라이머 : 5'-cagactgtccacagcattcc-3'(서열번호 4)
안티센스 프라이머 : 5'-ccaacgagcggcttcact-3'(서열번호 5)
프로브 : 5'-agaccctgaggctcaaagtcagatgctact-3'(서열번호 6)
실시예 1-2: HBV 표준 유전자시료의 작제
HBV 표준 유전자시료로는 112bp의 HBV 표면항원(surface antigen) 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하였다. 구체적으로, ACCURUN 325 HBV DNA positive control(BBI Diagnostics, MA, USA)로부터 HBV 표면항원의 DNA를 분리하여, 이를 주형으로 사용하고, 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 112bp의 HBV 표면항원 유전자의 일부를 얻었으며, 이를 발현벡터(PCR 2.1 TOPO vector)에 삽입하여 제조한 재조합 플라스미드 DNA를 순차적으로 희석하여, 1x105카피수/㎕을 포함하는 HBV 표준 유전자시료 1, 1x104카피수/㎕을 포함하는 표준 유전자시료 2, 1x103카피수/㎕을 포함하는 HBV 표준 유전자시료 3, 1x102카피수/㎕을 포함하는 HBV 표준 유전자시료 4 및 1x101카피수/㎕을 포함하는 HBV 표준 유전자시료 5를 각각 수득하였다.
센스 프라이머 : 5'-gccatttgttcagtggttcg-3'(서열번호 7)
안티센스 프라이머 : 5'-aggtaaaaagggactcaagatgttgtac-3'(서열번호 8)
실시예 1-3: 내부대조군 유전자시료의 작제
내부대조군 유전자시료로는 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자인 b3a2 융합 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하였다. 구체적으로, RNA 추출키트(RNAqueous kit, Ambion, USA)을 사용하여, K-562 세포주 (ATCC No. CCL-243)로부터 K562 RNA를 추출하고, 전기 K562 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하여 443bp의 b3a2 융합 유전자를 얻었으며, 이를 발현벡터(PCR 2.1 TOPO vector)에 삽입하여 재조합 플라스미드 DNA를 수득한 다음, 이를 200카피수로 희석시켜 내부대조군 유전자시료를 제조하였다.
실시예 1-4: HBV 정량키트의 제조
전기 실시예 1-1에서 수득한 PCR 반응혼합물 1.25㎖, 전기 실시예 1-1에서 수득한 HBV 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 전기 실시예 1-1에서 수득한 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 300㎕, 전기 실시예 1-2에서 수득한 HBV 표준 유전자시료 1 50㎕, HBV 표준 유전자시료 2 50㎕, HBV 표준 유전자시료 3 50㎕, HBV 표준 유전자시료 4 50㎕, HBV 표준 유전자시료 5 50㎕, 전기 실시예 1-3에서 수득한 내부대조군 유전자시료 400㎕ 및 반응용 멸균수 l㎖로 구성된 HBV 정량키트를 제조하였다.
실시예 2: HBV 정량키트를 이용한 HBV 특이 유전자의 정량
전기 실시예 1에서 제조한 HBV 정량키트를 이용하여, 정상인과 B형 간염환자의 시료로부터 HBV 특이 유전자를 검출하여, 정상인과 B형 간염환자를 구별하고, B형 간염환자에서 검출된 HBV 특이 유전자를 정량하였다.
실시예 2-1: 측정할 시료의 준비
먼저, 치료된 B형 간염 환자의 혈청 1, 0.5 및 0.2ml(실험군 1-1 내지 1-3)과 치료되지 않은 B형 간염 환자의 혈청 1, 0.5 및 0.2ml(실험군 2-1 내지 2-3)를 각각 수득하고, 전기 각 혈청을 DNA 정제키트(High pure nucleic acid purification kit, Roche, Germany)에 적용하여 각각의 DNA를 추출하고, 이를 시료로서 사용하였다.
실시예 2-2: 시료의 증폭 및 증폭결과의 분석
PCR용 튜브에 전기 실시예 1-1에서 제조한 PCR 반응혼합물 12.5㎕, HBV 프로브 및 프라이머 혼합물 3㎕, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 3㎕, 및 멸균수 1.5㎕를 분주하여, 반응용 튜브를 준비하였다. 이어, 전기 준비된 각각의 반응용 튜브에 전기 실시예 1-2에서 제조한 HBV 표준 유전자시료(HBV 표준 유전자시료 1, HBV 표준 유전자시료 2, HBV 표준 유전자시료 3, HBV 표준 유전자시료 4 및 HBV 표준 유전자시료 5), 전기 실시예 1-3에서 제조한 내부 대조군 유전자시료 및 전기 실시예 2-1에서 수득한 실험군 1-1 내지 2-3의 DNA를 각각 5㎕씩 분주하고, 이를 실시간 중합효소 연쇄반응기기인 ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems, USA)에 적용하고, PCR을 수행하여, HBV 표준 유전자시료 PCR 산물, 내부대조군 유전자시료 PCR 산물 및 시료 PCR 산물을 각각 수득하였다. 이때, PCR은 95℃에서 10분간 변성(denaturation)시키고, 95℃에서 20초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초동안 반응시키는 일련의 과정을 45회 반복하여 수행하였다. 이러한 과정에서, 3' 말단에 표지된 6-카르복시테트라메틸-로다민으로부터 유래된 형광이 지속적으로 발색됨을 확인하였으므로, 정상적으로 증폭이 수행됨을 알 수 있었다.
이어, 전기 증폭된 PCR 절편을 수득한 다음, 전기영동하여, 목적하는 절편의 존재유무를 확인하여 O와 X로 표시하였다(참조: 표 1). 이때, O는 목적 유전자가 증폭되어 전기영동상에 밴드로 확인됨을 의미하고, X는 목적 유전자가 증폭되지 않아 전기영동상에 밴드로 확인되지 않음을 의미한다.
| 실험군 | HBV 표준 유전자 | 내부대조군 유전자 | 시료 유전자 |
| 실험군 1-1 | O | O | X |
| 실험군 1-2 | O | O | X |
| 실험군 1-3 | O | O | X |
| 실험군 2-1 | O | O | O |
| 실험군 2-2 | O | O | O |
| 실험군 2-3 | O | O | O |
상기 표 1에서 보듯이, 정상인을 대상으로 한, 실험군 1-1 내지 1-3의 시료 유전자는 증폭되지 않았고, B형 간염환자를 대상으로 한, 실험군 2-1 내지 2-3의 시료 유전자는 증폭되었으므로, 본 발명의 HBV 정량키트를 이용할 경우, B형 간염환자를 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 모든 실험군에서 112bp의 HBV 표준 유전자와 443bp의 내부대조군 유전자가 모두 증폭됨을 알 수 있었다. 이때, HBV 표준 유전자는 센스프라이머(서열번호 1)에 의하여 증폭되는데, 증폭된 HBV 표준 유전자로부터 시료 유전자가 비특이적으로 증폭되지 않았다고 분석되었고, 증폭된 내부대조군 유전자로부터 전기 PCR 증폭에 오류가 없다고 분석되었다.
실시예 2-3: HBV 특이 유전자의 정량
전기, 실시예 2-2의 결과로부터, 실험군 2-1 내지 2-3의 시료에 HBV 특이 유전자가 존재함을 확인하였는 바, 실험군 2-1 내지 2-3의 시료에 존재하는 HBV 특이 유전자를 정량하고자 하였다.
먼저, 전기 실시예 2-2에서 수득한 HBV 표준 유전자시료(HBV 표준 유전자시료 1, HBV 표준 유전자시료 2, HBV 표준 유전자시료 3, HBV 표준 유전자시료 4 및 HBV 표준 유전자시료 5) PCR 산물의 흡광도(OD260)를 측정하고, 이를 이용하여, HBV 유전자의 정량 표준곡선을 작성하였다.
그런 다음, 전기 실시예 2-2에서 수득한 실험군 2-1 내지 2-3의 PCR 산물의 흡광도(OD260)를 측정하고, 이를 전기 작성한 HBV 유전자의 정량 표준곡선에 적용하여, 각 시료의 카피수를 정량하였다(참조: 표 2).
| 실험군 | HBV 특이 유전자의 정량값 |
| 실험군 2-1 | 2.4x104 |
| 실험군 2-2 | 1.3x104 |
| 실험군 2-3 | 4.9x103 |
상기 표 2에서 보듯이, 각 실험군에 존재하는 HBV 특이 유전자의 정량값은 각 실험군에 포함된 시료의 양에 비례함을 알 수 있었는 바, 본 발명의 정량키트를 사용할 경우, HBV 특이 유전자를 신뢰성있게 정량할 수 있음을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 PCR 반응혼합물, HBV의 HBsAg(surface antigen region) 유전자 특이적인 프로브 및 프라이머 혼합물, 대조군 유전자를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 혼합물, HBV 표준 유전자시료, 내부대조군 유전자시료 및 반응용 멸균수를 포함하는 HBV 특이 유전자 정량키트 및 전기 키트를 이용하여 HBV 특이 유전자를 정량하는 방법을 제공한다. 본 발명의 HBV 정량키트를 사용할 경우, B형 간염 특이적인 유전자를 보다 간편하고, 정확하 게 정량할 수 있으므로, B형 간염의 정확한 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
<110> BIOSEWOOM INC.
<120> Kit for Quantitative Analysis of HBV Specific Gene
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gccatttgtt cagtggttcg 20
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
aggtaaaaag ggactcaaga tgttgtac 28
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 3
agggctttcc cccactgttt ggct 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cagactgtcc acagcattcc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ccaacgagcg gcttcact 18
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 6
agaccctgag gctcaaagtc agatgctact 30
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gccatttgtt cagtggttcg 20
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
aggtaaaaag ggactcaaga tgttgtac 28
Claims (3)
- (ⅰ) 완충용액, DNA 중합효소, KCl, MgCl2, dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 포함하는 PCR 반응혼합물;(ⅱ) HBV의 HBsAg(surface antigen region) 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 1), 안티센스프라이머(서열번호 2) 및 프로브(서열번호 3)로 구성된 HBV 프로브 및 프라이머 혼합물;(ⅲ) 내부대조군 유전자 특이적인, 센스프라이머(서열번호 4), 안티센스프라이머(서열번호 5) 및 TaqMan프로브(서열번호 6)로 구성된 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물;(ⅳ) ㎕당 1x101 내지 1x105복제수(copy)의 HBV HBsAg 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 HBV 표준 유전자시료;(ⅴ) 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 융합유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 내부대조군 유전자시료; 및,(ⅵ) 반응용 멸균수를 포함하는, HBV 정량키트.
- 제 1항에 있어서,HBV 특이적 프로브는 5' 말단이 6-카르복시플루오레세인(6- carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein) 또는 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein)으로 표지되고, 5'으로부터 10 내지 20번째 염기중 티민이 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine)으로 표지되며, 3'말단이 인산화되고, 내부대조군 특이적 프로브는 5'말단이 형광물질인 6-카르복시플루오레세인으로 표지되고, 5'말단으로부터 19번째 티민염기를 형광물질인 6-카르복시테트라메틸-로다민으로 표지되며, 3'말단이 인산화된 것을 특징으로 하는HBV 정량키트.
- (ⅰ) 유전자분석시료, 제 1항의 HBV 정량키트의 HBV 표준 유전자시료 및 제 1항의 HBV 정량키트의 내부대조군 유전자시료에, 각각 제 1항의 HBV 정량키트의 HBV 프로브 및 프라이머 혼합물, 내부대조군 프로브 및 프라이머 혼합물 및 PCR 반응혼합물을 가하고 혼합한 다음, 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여, 유전자분석시료 및 HBV 표준 유전자시료의 HBV PCR 산물과 내부대조군 PCR 산물을 각각 수득하고, 이를 분석하여, HBV 특이 유전자의 유무를 확인하는 단계;(ⅱ) 제 1항의 HBV 정량키트의 HBV 표준 유전자시료의 PCR 산물을 정량하여 HBV 유전자의 정량 표준곡선을 수득하는 단계; 및,(iii) 전기 수득한 HBV 유전자의 정량 표준곡선을 이용하여, 전기 확인된 유전자분석시료에 존재하는 HBV 특이 유전자를 정량하는 단계를 포함하는, HBV 특이 유전자의 정량방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050092552A KR100772616B1 (ko) | 2005-09-30 | 2005-09-30 | Ｈｂｖ 특이 유전자 정량키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050092552A KR100772616B1 (ko) | 2005-09-30 | 2005-09-30 | Ｈｂｖ 특이 유전자 정량키트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070037235A true KR20070037235A (ko) | 2007-04-04 |
| KR100772616B1 KR100772616B1 (ko) | 2007-11-01 |
Family
ID=38159184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020050092552A KR100772616B1 (ko) | 2005-09-30 | 2005-09-30 | Ｈｂｖ 특이 유전자 정량키트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100772616B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012002597A1 (ko) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | (주)바이오니아 | Β형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 β형 간염 바이러스 진단 방법 |
| CN109457050A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-03-12 | 苏州德思普生物科技有限公司 | 检测乙型肝炎病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
-
2005
- 2005-09-30 KR KR1020050092552A patent/KR100772616B1/ko active IP Right Grant
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012002597A1 (ko) * | 2010-07-02 | 2012-01-05 | (주)바이오니아 | Β형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 β형 간염 바이러스 진단 방법 |
| CN109457050A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-03-12 | 苏州德思普生物科技有限公司 | 检测乙型肝炎病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100772616B1 (ko) | 2007-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5534406A (en) | Method of detecting antigenic nucleic acid-containing macromolecular entities | |
| US5858658A (en) | Method of quantitating genomic DNA | |
| Ryschkewitsch et al. | Comparison of PCR-southern hybridization and quantitative real-time PCR for the detection of JC and BK viral nucleotide sequences in urine and cerebrospinal fluid | |
| Gerken et al. | Assay of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction and its relationship to pre-S-and S-encoded viral surface antigens | |
| US6172193B1 (en) | Escape mutant of the surface antigen of hepatitis B virus | |
| CA2159044A1 (en) | Method of quantitating nucleic acids | |
| US7344837B2 (en) | PCR primer set for detecting hepatitis B virus, method for detecting hepatitis B using the primer set, and hepatitis B virus detection kit including the primer set | |
| AU772692B2 (en) | Diagnostic assay | |
| KR20100116954A (ko) | 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｂｖ 검출 방법 | |
| KR100772616B1 (ko) | Ｈｂｖ 특이 유전자 정량키트 | |
| Walter et al. | Spot‐blot hybridization assay for the detection of hepatitis B virus DNA in serum: factors determining its sensitivity and specificity | |
| Wang et al. | Detection of YMDD mutants using universal template real-time PCR | |
| Chaiteerakij et al. | Intrahepatic HBV DNA and covalently closed circular DNA (cccDNA) levels in patients positive for anti-HBc and negative for HBsAg | |
| KR20070037234A (ko) | Ｈｂｖ 특이 유전자 검출키트 | |
| Manzin et al. | A single-step DNA extraction procedure for the detection of serum hepatitis B virus sequences by the polymerase chain reaction | |
| US20060194217A1 (en) | Method of genotyping and phenotyping hepatitis B viruses resistant to antiviral molecules | |
| Ghabeshi et al. | Molecular evaluation of HBV core gene mutations in asymptomatic HBV infected blood donors in Iran | |
| CN104109720B (zh) | 乙型肝炎病毒p区变异及其用途 | |
| KR19990067282A (ko) | 인간 비형 간염 바이러스 디엔에이 | |
| Malakhova et al. | Hepatitis B virus genetic typing using mass-spectrometry | |
| KR20070037228A (ko) | Ｈｃｖ 특이 유전자 검출키트 | |
| Keum et al. | Heterogeneous HBV mutants coexist in Korean hepatitis B patients | |
| KR101948816B1 (ko) | B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물 | |
| KR20070037231A (ko) | Ｈｃｖ 특이 유전자 정량키트 | |
| JP3909889B2 (ja) | 新規核酸断片から成るプライマーを用いた非ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121025 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131018 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140829 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151023 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161018 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171018 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181023 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191114 Year of fee payment: 13 |