KR19990067282A - 인간 비형 간염 바이러스 디엔에이 - Google Patents

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모리토시 기노시타
기요노리 가쓰라기
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오쓰까 아끼히꼬
오쓰까 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 인간 B형 간염 바이러스의 1701 내지 1794 영역을 선택적으로 증폭시킬 수 있도록 설계된, 예를 들면 서열번호 1 및 2로 나타내어지는 PCR 프라이머쌍; 및 인간 B형 간염 바이러스의 1701 내지 1794 영역으로 이루어진, 예를 들면 서열번호 3 내지 8로 나타내어지는 DNA 단편(표준물)을 제공한다. 이를 사용하여 인간 B형 간염 바이러스 게놈의 프리코어 영역에서의 돌연변이체의 유전형질을 결정할 수 있을 뿐만 아니라 그와 동시에 각 유전형질을 분석할 수 있다.

Description

인간 비형 간염 바이러스 디엔에이
그린버그(Greenberg) 및 그의 공동연구원들이 만성 B형 간염의 치료에 최초로 인터페론(IFN)을 사용함에 대해 보고한 1976년 이래로(그린버그 에이치 비(Greenberg, H.B.)의 문헌[N. Engl., J.Med., 295, 517-522, 1975]을 참조), HBe 항원-양성 만성 활성 B형 간염에 대한 IFN의 효능에 대해 많은 보고가 이루어졌으며 다소 호응을 얻었다. 일반적으로 만성 B형 간염은 HBV가 활성 복제됨과 동시에 혈중 HBV DNA 및 DNA 폴리머라제 활성 수준이 상승하고, 사진상으로 볼 때 활성 간염의 증세가 조직학적으로 뚜렷하고, 많은 경우에 있어서, 간 병변의 진행이 관찰되는 HBe 항원-양성 단계, 및 이어서 HBe 항원이 없어지고 HBe 항체가 나타나서(혈청-전환이 일어나서) HBV의 복제가 끝나고 간 병변이 진정되는 단계를 특징으로 하는 과정을 거친다.
따라서, HBe 항원-, HBV DNA- 및 DNA 폴리머라제-양성인 만성 활동성 간염에 있어서, HBe 항원을 제거하고 HBe 항체에 유리하도록 혈청-전환이 일어나게 하도록 INF를 투여한다.
그러나, HBe 항원-음성 또는 HBe 항체-양성임에도 불구하고 높은 혈중 HBV DNA 및 DNA 폴리머라제 수준, 빠른 진행, 나쁜 예후를 보이는 만성 B형 간염이 존재한다. 이러한 간염에서 검출된 HBV의 DNA를 검사한 결과 프리코어의 83-위치에서 G가 A로 돌연변이됨과 동시에 HBe 항원이 혈액으로 분비됨을 알 수 있으며, 따라서 HBV는 비-HBe 항원-생성 바이러스로 간주된다(카르만 더블유 제이(Carman, W.J.) 등의 문헌[Lancet, ii, 588-591, 1989]을 참조).
이렇게 프리코어 돌연변이가 일어나는 경우에, HBe 항체 및 항원의 분석치를 보고서 혈청 전환이 진행중이므로 당연히 간염 병변이 진정될 것이라고 오진할 수가 있다. 그러므로, 만성 B형 간염의 INF 요법에 있어서, 전술된 DNA 영역의 돌연변이를 검출 및 정량함으로써 앞으로의 치료 계획을 짜거나 치료요법의 예후를 예측하는데 유용한 척도를 얻을 수 있을 것이다.
HBV의 프리코어에서의 돌연변이를 검출 및 분석하는 것으로 공지된 방법은 프리코어 영역의 83-위치에서의 돌연변이의 서열과 동일한 서열을 갖는 프라이머 셋트를 사용하여 MSSA에 의해 경쟁적 반응 분석을 하는 것이다(기노시타 엠(Kinoshita, M.) 등의 문헌[CCA, 228, 83-90, 1994]을 참조).
그러나, 상기 방법에서는 (1) 101내지 108카피에 이르는 8개의 상이한 표준물을 사용하여 경쟁적 반응을 수행하기 때문에, 각 하나의 샘플에 대해 8회씩 수행해야 하므로, 많은 수의 샘플을 시험하려면 시간이 많이 걸리고; (2) 이 방법은 프리코어 83-위치에서의 돌연변이체에만 국한되기 때문에 야생형 바이러스 및 기타 돌연변이체를 동시에 분석할 수 없다는 단점을 갖는다.
다른 한편으로, 폴리머라제 연쇄 반응-단쇄 형태 다형성(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism: PCR-SSCP) 분석법이 돌연변이 검출 방법으로서 공지되어 있다(예를 들면 오리타 엠(Orita, M.) 등의 문헌[Genomics, 5, 874-879, 1989]을 참조). 이 방법은 단쇄 DNA의 형태 변화에 따른 전기영동 이동성의 변화를 이용한다. SSCP 분석에서는, 시험 DNA가 단일 형태를 가져서 단일 띠를 제공하는 경우에 이상적으로 바람직하지만, 실제로 시험 DNA는 수개의 준안정한 구조를 가져서 수개의 띠를 제공하는 것으로 알려져 있기 때문에 이 방법을 사용하는 것은 한계가 있다(문헌[Analytical Chemistry, 43, 731-743, 1994]을 참조).
PCR-SSCP 분석법에 의해 HBV 프리코어 영역의 돌연변이체를 정성 분석 또는 규명하는 것에 대해서는 전혀 보고가 없으며, 이점에 관해서, 이러한 돌연변이체에 대해서 검출 및 분석을 동시에 수행하는 방법도 공지되어 있지 않다.
본 발명은 인간 B형 간염 바이러스(HBV)의 검출 방법에 관한 것이며, 더욱 특히는 HBV의 프리코어(precore) 영역의 유전형질 결정(genotyping)과 분석을 동시에 하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 DNA 시약에 관한 것이다.
도 1은 실시예 1에 따라 인간 B형 간염 바이러스 DNA의 프리코어 영역을 PCR-SSCP 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에 따라 인간 B형 간염 바이러스 DNA의 프리코어 영역을 PCR-SSCP 분석을 위한 표준 곡선을 보여준다.
본 발명의 목적은 단일 반응 방법에 의해서 야생형 바이러스 및 HBV 프리코어 영역의 돌연변이체의 유전형질을 결정함과 동시에 이 유전형질을 분석하는 방법 및 DNA 시약을 제공하는 것이다.
이 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 PCR-SSCP 분석에 의한 HBV 프리코어 영역의 돌연변이체의 규명에 대해 집중적으로 연구하였고, 그 결과 각 돌연변이체 DNA 및 야생형 바이러스 DNA에 고유한 단 하나의 형태만을 가질 수 있으므로 SSCP 분석에서 단일 띠만을 나타내고 현저한 이동성 차를 나타내기 때문에 SSCP 분석에 의해 구분이 가능한, 연구 대상인 HBV 프리코어 영역 돌연변이체의 모든 돌연변이 부위를 포함하는 특정 영역을 발견하였다. 본 발명은 상기 발견을 기초로 완성되었다.
본 발명은 HBV DNA의 1701 내지 1794 영역을 포함하는 DNA 단편을 제공한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 HBV가 야생형 바이러스이거나, 38-위치에서 G가 A로 치환된 것, 42-위치에서 T가 C로 치환된 것, 80-위치에서 T가 C로 치환된 것, 83-위치에서 G가 A로 치환된 것 및 86-위치에서 G가 A로 치환된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된, 프리코어 영역에 하나이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 바이러스인 DNA 단편을 제공한다.
본 발명은 추가로 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 DNA 단편을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 HBV DNA의 1701 내지 1794 영역을 선택적으로 증폭시키도록 설계되어 있는 PCR 프라이머쌍, 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명은 추가로 프라이머쌍 및 표준물로서 DNA 단편을 사용함을 포함하는 HBV 시험 방법을 제공한다.
38-위치에서 G가 A로 치환된 것, 42-위치에서 T가 C로 치환된 것, 80-위치에서 T가 C로 치환된 것, 및 86-위치에서 G가 A로 치환된 것을 포함하는, 프리코어 영역의 전술된 돌연변이체는 본 발명에 의해 제공된 신규한 돌연변이체인 것으로 생각된다.
본 명세서에서 아미노산, 펩티드, 누클레오티드 서열, 핵산, 제한 효소 등을 표시하는데 사용된 약자들은 IUPUC 및 IUPUC-IUB에 의해 권장된 명명법 및 "누클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서의 초안 작성에 대한 지침서(Guideline for Drafting of Specifications Including Nucleotide Sequences or Amino Acid Sequences)(1994년 11월, 일본 특허청 조정실 심사기준팀(Examination Standard Group, Coordination Section)"에 따른 것이다.
또한, 본 명세서에서 사용된 HBV의 누클레오티드 서열 수는 공지된 누클레오티드 서열의 수에 따른 것이다(문헌[Gene, 30, 227-232, 1984]을 참조).
본 발명에 따른 프라이머쌍은 HBV DNA의 1701 내지 1794 영역을 선택적으로 증폭시키도록 설계됨을 특징으로 한다. 프라이머는 상기 영역을 증폭시킬 수만 있다면 임의의 통상적인 방법에 의해 설계된다.
이렇게 설계된 프라이머의 바람직한 예는 이하 실시예에서 기술될 바와 같은 서열번호 1과 2의 프라이머쌍이다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 프라이머(올리고-DNA)는 전술된 특정 영역을 증폭시킬 수 있는 HBV DNA 프리코어 영역의 플러스 쇄의 누클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 서열번호 2의 프라이머(올리고-DNA)는 동일한 영역의 마이너스 쇄의 서열을 갖는다.
이들 두 개의 프라이머는 본 발명의 프라이머쌍으로서 성공적으로 사용되며, 포르포아미디트(phosphoamidite) 방법과 같은 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 화학적 합성 절차뿐만 아니라, 본 발명에서 사용되는 다양한 절차, 예를 들면 DNA 절단, 삭제, 부가 또는 접합을 위한 효소 처리, 및 DNA 단리, 정제, 전사, 선별 등과 같은 절차도 모두 통상적인 방법으로 수행될 수 있다(문헌[Bunshi-Idengaku Jikkenho(Experimental Protocols in Molecular Genetics), Kyoritsu Shuppan, 1983] 및 문헌[PCR Technology, Takara Shuzo, 1990]을 참조).
예를 들면 DNA 단리 및 정제를 아가로스 겔 전기영동에 의해서 수행할 수 있고 DNA 결정을 예를 들면 디데옥시 방법(상거 에프(Sanger, F.), 니클렌 에스(Nicklen, S.) 및 쿨손 에이 알(Coulson, A.R.)의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 74, 5463-5467, 1977]을 참조) 또는 맥섬-길버트(Maxam-Gilbert) 방법(맥섬 에이 엠(Maxam, A.M.) 및 길버트 더블유(Gilbert,W.)의 문헌[Method in Enzymology, 65, 499-560, 1980]을 참조)에 의해 수행할 수 있다. DNA의 서열은 통상적인 서열 결정 키트를 사용해서도 쉽게 밝혀낼 수 있다. 이러한 기본적인 방법들이 본 명세서에서 언급된 다양한 보고서에서 사용되었으며, 이들 문헌 및 이하에 주어질 실시예를 참고로 할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 바와 같은 HBV DNA의 1701 내지 1794내에 포함되는 DNA 단편은, 각 돌연변이체 및 야생형 바이러스 DNA에 고유한 단지 하나의 형태를 가져서 각 SSCP 분석에 있어서 단일 이동성 띠를 나타내고, 현저한 이동성 차를 나타내므로 SSCP 분석에 의해 구분이 가능한, PCR-SSCP 분석에 의해 결정될 HBV 프리코어 돌연변이체의 모든 돌연변이 부위를 포함하는 특정 영역이다.
본 발명에 따른 DNA 단편은 야생형 HBV 바이러스의 DNA 단편이거나, 38-위치에서 G가 A로 치환된 것, 42-위치에서 T가 C로 치환된 것, 80-위치에서 T가 C로 치환된 것, 83-위치에서 G가 A로 치환된 것 및 86-위치에서 G가 A로 치환된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된, 프리코어 영역에 하나이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 바이러스의 DNA 단편이다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 서열을 갖는 DNA 단편이 언급될 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 3의 DNA 단편은 HBV 프리코어 영역의 서열에 있어서, 83-위치에서의 G가 A로 돌연변이되고 42-위치에서 T가 C로 돌연변이됨을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 서열번호 4의 DNA 단편은 프리코어 영역에서 86-위치에서의 G가 A로 돌연변이됨을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 서열번호 5의 DNA 단편은 프리코어 영역에서 83-위치에서의 G가 A로 돌연변이됨을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 서열번호 6의 DNA 단편은 프리코어 영역에서 야생형 바이러스 서열을 가짐을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 서열번호 7의 DNA 단편은 프리코어 영역에서 83-위치에서의 G가 A로 돌연변이되고 80-위치에서의 T가 C로 돌연변이됨을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 서열번호 8의 DNA 단편은 프리코어 영역에서 83-위치에서의 G가 A로 돌연변이되고 83-위치에서의 C가 T로 돌연변이됨을 특징으로 한다.
이들 모든 DNA 서열을, PCR-SSCP 분석에 의해 HBV를 시험함에 있어서 프리코어 영역의 유전형질을 결정함과 동시에 특정 바이러스 유전형질을 분석하는데 있어서 표준물로서 유리하게 사용할 수 있다.
시험 방법은 지금부터 보다 자세하게 기술될 것이다.
PCR-SSCP 분석법을 사용한 이러한 시험 방법을 통상적인 프로토콜에 따라 수행하거나 그 프로토콜을 참조로 하여 수행할 수 있다. 예를 들면 DNA의 특정 영역을 증폭시키기 위한 PCR에 대한 정보를 얻기 위해서 하기 문헌을 참고로 할 수 있다: 사이키 알 케이(Saiki, R.K.), 샤프 에스(Scharf, S.), 팔루나 에프 에이(Faloona, F.A.), 물리스 케이 비(Mullis, K.B.), 혼 지 티(Horn, G.T.), 얼리치 에이치 에이(Erlich, H.A.) 및 아른하임 엔(Arnheim, N.)의 문헌[Science, 230, 1350-1354, 1985] 등. SSCP 분석에 있어서, 하기 문헌이 참고된다: 마키노 알(Makino, R.) 등의 문헌[Cold Spring Harbor Lab., 2, 10-13, 1992] 등.
PCR-SSCP에 의한 단쇄 DNA의 분석에 관해서, 이 기술은 (1) 본 발명의 프라이머쌍을 사용하여 PCR에 의해 시험 샘플중 HBV DNA를 증폭시키는 단계; (2) SSCP 방법에 의해 (1) 단계에서 수득된 증폭 산물을 분석하는 단계를 가짐을 특징으로 하는, 시험 샘플중 HBV를 분석하는 방법이다.
이 분석 방법에서, 공지된 등급화된 농도로 제조된 본 발명의 DNA 단편을 표준물로서 사용할 수 있다. SSCP 분석에 의해 각 표준물의 이동성 및 피크 면적을 (1) 단계의 증폭 산물인 시험 샘플의 이동성 및 피크 면적과 비교함으로써, HBV DNA의 프리코어 영역에서의 임의의 돌연변이체를 검출함(유전형질 결정)과 동시에 특정 바이러스를 분석할 수 있다.
이와 관련하여, 결정될 HBV DNA를 함유하는 시험 샘플은 DNA를 함유하기만 한다면 특별히 제한되지는 않고, 혈액, 혈청, 땀, 뇨, 단리된 조직, 및 기타 생물학적 물질을 포함한다. HBV DNA를 통상적인 방법으로 상기 물질로부터 추출하고 정제하고 제조할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서, 시험 샘플중 HBV DNA의 1701 내지 1794 위치의 특정 영역은 본 발명의 프라이머쌍을 사용한 PCR에 의해 특별히 증폭된다. 증폭된 영역은 HBV DNA 프리코어 누클레오티드 38-, 42-, 80-, 83- 및 86-위치를 함유하며 이러한 위치에서 돌연변이를 갖는다. 상기 위치에서 돌연변이의 존재 유무와는 상관없이, 증폭 산물(DNA 단편)은 각각의 DNA에 고유한 한가지 형태를 갖추며, 그 결과, (2)단계에서의 후속적인 SSCP 분석에 의해서 이들은 각각 현저한 이동성 차를 갖는 단일 띠를 제공하여 DNA가 구분될 수 있게 한다.
따라서, 이러한 표준 DNA 단편의 예정된 전기영동 이동성을 (1) 단계에서 증폭된 시험 샘플의 이동성과 비교함으로써, HBV DNA의 프리코어 영역에서의 돌연변이 검출(유전형질 결정)을 높은 감도로써 편리하게 수행할 수 있다.
더욱이, 표준물을 공지된 등급의 농도로 사용하면, 표준물의 피크 면적과 샘플의 증폭 산물의 피크 면적을 비교함으로써 시험 샘플중 바이러스 역가를 동시에 분석할 수 있다.
따라서, 본 발명은 HBV DNA 프리코어 영역 돌연변이체의 검출(유전형질 결정) 및 돌연변이체의 분석을 수행하는 편리한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 시험 방법의 실시태양을 이제 자세하게 기술하려고 한다. 본 명세서의 개시 내용을 근거로 당해 분야의 숙련자들이 본 방법에서 사용된 프라이머쌍, 표준물, PCR-SSCP 분석, 검출 수단 등을 자유롭게 변경할 수 있는데, 이러한 변경 또는 변형이 본 발명의 범주에 속해야 함은 물론이다.
본 발명의 방법의 이러한 실시태양에 따라서, 종래의 방법에 의해, 예를 들면 알칼리 또는 산 처리함으로써 바이러스 DNA를 B형 간염 환자의 혈청으로부터 추출한다. 이어서 프라이머쌍, 즉 서열번호 2의 프라이머와 서열번호 1의 형광물질-표지된 프라이머, 및 내열성 DNA 폴리머라제를 전술된 바와 같이 수득된 DNA 용액상에서 작용시키고 이렇게 표지된 DNA 단편을 증폭시킨다.
다른 한편으로, 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 DNA 단편을 각각 플라스미드 벡터에 연결(ligation)시키면 이들은 대장균을 형질감염시켜 형질전환체를 제공한다. 대규모로 배양 및 정제시킨 후, 정제된 재조합 플라스미드를 사용하여 각각 예를 들면 103카피, 104카피, 105카피, 106카피, 107카피 및 108카피의 쇄를 제조한다. 이어서, 프라이머쌍, 즉 서열번호 2의 프라이머 및 형광물질-표지된 서열번호 1의 프라이머, 및 내열성 DNA 폴리머라제를 전술된 바와 같이 수득된 DNA 용액상에서 작용시키고 이렇게 표지된 DNA 단편을 증폭시킨다.
증폭된 DNA-용액을 약 5분동안 약 95℃로 가열시키고, 그 즉시 얼음으로 냉각시키고, SSCP 분석용 자동 씨퀀서(sequencer)에 공급함으로써 형광성 피크를 검출한다. 이 SSCP 분석에서 전기영동을 약 30±1℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 환자의 혈청 DNA 피크(이동성)를 표준물의 피크(이동성)와 비교한다. 이동 시점으로부터 표준물의 피크와 일치하는 피크를 규명함으로써 환자 HBV의 유전형질을 규명한다. 또한, 각 표준물의 피크 면적을 계산하고 표준 곡선을 작성함으로써 환자 DNA의 계산된 피크 면적으로부터 HBV DNA를 정량(분석)할 수 있다.
본 발명에 따라서, HBV DNA의 프리코어 영역이 PCR에 의해 증폭될 수 있고 그 결과의 증폭 산물이 SSCP 분석에 의해 단일 피크로서 검출될 수 있음을 특징으로 하는 프라이머쌍이 제공된다. 본 발명은 추가로 야생형 바이러스 및 HBV의 돌연변이체에 대한 표준물로서 유용한 증폭 산물과 동일한 영역을 갖는 DNA 단편을 제공한다. 상기 프라이머쌍을 이와 같은 표준물과 사용함으로써 HBV DNA의 프리코어 영역의 유전형질 결정 및 바이러스 DNA의 분석을 1회 PCR 수행에 의해 동시에 달성할수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하며 결코 본 발명의 정의를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
1.1 프라이머의 제조
본 실시예에서 사용되는 두 개의 프라이머는 HBV E-1 및 HBV E-2였다. HBV E-1은 서열번호 1에 따라 화학적으로 합성된 올리고 DNA이고 HBV E-2는 서열번호 2에 따라 화학적으로 합성된 올리고 DNA이다.
상기 프라이머 둘다를 DNA 합성기(파마시아 엘케이비 진 어셈블러 플러스(Pharmacia LKB Gene Assembler Plus))를 사용하여 합성하였다.
1.2 표준물의 제조
표준물로서 사용되는 DNA 단편을 다음과 같이 제조하였다. 따라서 후술될 방법에 의해 만성 B형 간염 환자의 혈청중의 DNA의 서열을 결정함으로써 돌연변이체를 규명하는데, 각각 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8에 해당하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 표준 DNA 단편은 각각 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 서열을 가졌다.
상기 DNA 단편 각각을 플라스미드 벡터(PT7 블루(Blue) T-벡터, 다카라 스조)에 삽입시키고 대장균을 형질감염시키는데 사용하였다. 형질전환 세포로부터 재조합 플라스미드를 대규모로 배양시키고 정제시켰다. 이 재조합 플라스미드를 사용하여, 서열번호 3의 DNA 서열을 위해 103카피/㎕, 서열번호 4의 DNA 서열을 위해 104카피/㎕, 서열번호 5의 DNA 서열을 위해 105카피/㎕, 서열번호 6의 DNA 서열을 위해 106카피/㎕, 서열번호 7의 DNA 서열을 위해 107카피/㎕ 및 서열번호 8의 DNA 서열을 위해 108카피/㎕의 농도로 연어의 변성된 DNA 200㎍/㎖를 함유하는 멸균수를 사용하여 각각의 표준 용액을 제조하였다.
1.3 B형 간염 바이러스 DNA의 추출
만성 B형 간염 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리하고 10㎕의 혈청을 관에 넣었다. 이 관에 10㎕의 0.2N-NaOH를 첨가하고, 혼합물을 5분동안 격렬하게 교반시킨 후 20분동안 37℃에서 정치시켜 DNA를 추출하였다. PCR에 사용하기 위해, 0.2N-HCl 10㎕를 첨가함으로써 DNA 용액을 중화시켰다.
1.4 PCR
각각 1.2에서 제조된 표준물 용액 1㎕ 및 1.3에서 제조된 환자 혈청 DNA 용액 5㎕을 깨끗한 관에 넣었다. 각 관에 FITC-표지된(파마시아) HBV E-1 용액 5㎕(멸균 증류수중 FITC-표지된 HBV E-1 10μM) 및 HBV E-2 용액(멸균 증류수중 HBV E-2 10μM)를 첨가하고, PCR 효소 용액 30㎕를 첨가하였다. 멸균 증류수 50㎕를 사용하여 총 부피를 조정한 후에, 광유를 첨가하고, 94℃에서 1분, 58℃에서 1.5분 및 72℃에서 1.5분동안의 30 사이클동안 PCR 기기(스트라타젠(Stratagene))에서 증폭 반응을 수행하였다.
1.5 SSCP 분석에 의한 유전형질 결정 및 분석
1.4에서 수득된 PCR 산물 용액 1㎕을 깨끗한 관에 옮기고 10㎕의 중단(stop)-변성 용액(80% 탈이온화된 포름아미드, 0.01% 블루 덱스트란)을 첨가하였다. 이 혼합물을 3분동안 95℃로 가열시키고, 그 즉시 얼음으로 냉각시키고, ALF 자동 씨퀀서(파마시아)를 사용한 5% 글리세롤-7% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 SSCP 분석하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 이 도면에서, 세로좌표는 형광성의 세기를 나타내며 가로좌표는 이동성을 나타낸다. 위쪽 줄(표준물)은 표준물의 혼합물을 사용하여 수득된 결과를 나타낸다. 화살표로 나타내어진, 돌연변이체에 의해 유도된 6개의 피크 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 DNA 단편에 상응하는 것이다.
도면으로부터 각각의 표준물의 피크는 완전 분리된 단일 피크이며 피크 면적은 그들의 농도에 상응함을 알 수 있을 것이다.
다른 한편으로, 아래쪽 줄(환자)은 환자 혈청으로부터 유도된 PCR 산물에 대한 결과를 보여준다. 이 환자 혈청은 화살표로 표시된 두 개의 피크 1 및 2를 나타낸다. 두 개의 피크의 이동성을 표준물의 이동성과 비교해보면, 환자 피크 1은 표준물 피크 3(서열번호 5)에 일치하므로 프리코어 영역의 83-위치에서 G가 A로 돌연변이된 유전형질임을 알 수 있다. 환자 피크 2는 표준물 피크 4(서열번호 6)에 일치하므로 야생형 바이러스인 것으로 밝혀졌다.
또한, 표준물의 피크 면적은 각각 도 1로부터 계산되었다(프래그먼트 매니저 파마시아(Fragment Manager, Pharmacia)). 그 결과로, 피크 면적은 피크 1에 대해서는 37, 피크 2에 대해서는 46, 피크 3에 대해서는 60, 피크 4에 대해서는 212, 피크 5에 대해서는 375 및 피크 6에 대해서는 713였다. 상기 데이터를 사용하여 얻은 표준 곡선은 도 2에 도시되어 있다(세로 좌표: 피크 면적, 가로 좌표: 피크 번호).
환자 피크 1 및 2의 피크 면적도 유사하게 계산되며(피크 1: 220, 피크 2: 1372), 상기 표준 곡선으로부터 각각의 개체수를 결정하였다. 그 결과 환자 피크 1의 개체수는 3×106카피였고, 환자 피크 2의 개체수는 3×1012카피였다.
따라서, 이 시험에서 사용된 환자 혈청은 HBV의 프리코어 영역에서 83-위치에서 G가 A로 돌연변이된 돌연변이체 HBV 3×106카피 및 야생형 HBV 1×1012카피를 함유하였다.
본 발명은 한 번의 조작으로 인간 B형 간염 바이러스(HBV) 게놈의 프리코어 영역에서의 돌연변이체의 유전형질의 결정과 각각의 유전형질의 분석을 동시에 수행하는 방법 및 정확한 HBV 시험을 수행하는데 사용되는 프라이머 및 표준 DNA 단편을 제공한다.
서열 목록
(1) 서열번호 : 1
서열의 길이: 22 염기쌍
쇄의 수: 단쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: 합성 DNA
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
존재 위치: 1701..1722
서열 기술:
(2) 서열번호 : 2
서열의 길이: 20 염기쌍
쇄의 수: 단쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: 합성 DNA
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
존재 위치: 1775..1794
서열 기술:
(3) 서열번호 : 3
서열의 길이: 94 염기쌍
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: PCR 산물
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: 돌연변이
존재 위치: 1701..1794
서열 기술:
(4) 서열번호 : 4
서열의 길이: 94 염기쌍
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: PCR 산물
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: 돌연변이
존재 위치: 1701..1794
서열 기술:
(5) 서열번호 : 5
서열의 길이: 94 염기쌍
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: PCR 산물
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: 돌연변이
존재 위치: 1701..1794
서열 기술:
(6) 서열번호 : 6
서열의 길이: 94 염기쌍
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: PCR 산물
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
서열의 특징
존재 위치: 1701..1794
서열 기술:
(7) 서열번호 : 7
서열의 길이: 94 염기쌍
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: PCR 산물
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: 돌연변이
존재 위치: 1701..1794
서열 기술:
(8) 서열번호 : 8
서열의 길이: 94 염기쌍
쇄의 수: 2본쇄
토폴로지: 선형
분자의 타입: PCR 산물
기원: 인간 B형 간염 바이러스 DNA
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: 돌연변이
존재 위치: 1701..1794
서열 기술:

Claims (5)

  1. 인간 B형 간염 바이러스 DNA의 1701 내지 1794 영역을 선택적으로 증폭시킬 수 있도록 설계된 PCR 프라이머쌍.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내어지는 프라이머쌍.
  3. 인간 B형 간염 바이러스 DNA의 1701 내지 1794 영역을 포함하는 DNA 단편.
  4. 제 3 항에 있어서,
    인간 B형 간염 바이러스가 야생형 바이러스이거나, 38-위치에서 G가 A로 치환된 것, 42-위치에서 T가 C로 치환된 것, 80-위치에서 T가 C로 치환된 것, 83-위치에서 G가 A로 치환된 것 및 86-위치에서 G가 A로 치환된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된, 프리코어(precore) 영역에 하나이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 바이러스인 DNA 단편.
  5. 제 3 항에 있어서,
    서열번호 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 나타내어지는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 DNA 단편.
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