KR101401710B1 - HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커 - Google Patents

Abstract

본원은 HBe 항원 음성 HBV 감염 검출 또는 진단용 마커 및 이의 용도를 개시하며, HBV의 코어 단백질 C 영역 또는 preC 영역에 존재하는 아미노산 변이에 근거한 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커, 이를 포함하는 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 진단 방법을 개시한다. 본원에 따른 마커는 종래 진단이 어려웠던 HBe 항원 음성 HBV 감염을 진단할 수 있어, 이로 인한 간경변, 간암과 같은 간질환의 조기 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커 {Markers for diagnosing HBe Ag negative infection and its use}

본 발명은 B형 간염 바이러스로 인한 질환의 진단 분야에 관한 것으로, 구체적으로 HBe 항원 음성 HBV 감염증 검출/진단이 가능한 바이오 마커 및 이의 검출방법에 관한 것이다.

효과적인 백신이 이용할 수 있음에도 불구하고 전세계적으로 3억 5천만 이상의 사람들이 HBV (Hepatitis B virus, B형 간염 바이러스)에 만성적으로 감염되어 있고 (특히, 남한은 HBV의 풍토병 지역으로 알려져 있다) 많은 경우에 간경화 및 간세포암과 같은 심각한 간질환으로 이행된다.

완전한 게놈 서열에서 8% 이상의 그룹간 분기(divergence)에 기초하여, HBV 균주는 A-H로 표기되는 8 개의 게놈 그룹 또는 유전형으로 분류된다. HBV 유전형과 만성 B형 간염(CHB)에 중요한 역할을 하는 것으로 제시되었다 (Lee WM. Hepatitis B virus infection. The New England journal of medicine. 1997; 337(24):1733-45; Lee DH, Kim JH, Nam JJ, Kim HR, Shin HR. Epidemiological findings of hepatitis B infection based on 1998 National Health and Nutrition Survey in Korea. Journal of Korean medical science. 2002; 17(4):457-62; Norder H, Hammas B, Lofdahl S, Courouce AM, Magnius LO. Comparison of the Amino-Acid-Sequences of 9 Different Serotypes of Hepatitis-B Surface-Antigen and Genomic Classification of the Corresponding Hepatitis-B Virus-Strains. J Gen Virol. 1992; 73:1201-8; Kidd-Ljunggren K, Miyakawa Y, Kidd AH. Genetic variability in hepatitis B viruses. J Gen Virol . 2002; 83:1267-80; 및 Miyakawa Y, Mizokami M. Classifying hepatitis B virus genotypes. Intervirology. 2003; 46(6):329-38).

한국인의 경우 유전형 B보다 바이러스성이 더 강하다고 알려진 유전형 C2가 비정상적으로 우세한 것으로 나타났고, 한국인 환자에서 기초적인 코어 프로모터(BCP) 및 주요 친수성 영역(MHR)에서 비교적 높은 빈도로 변이가 발견되는 것으로 이미 보고된 바 있다 (Kim H, Jee YM, Song BC, et al. Analysis of hepatitis B virus quasispecies distribution in a Korean chronic patient based on the full genome sequences. J Med Virol. 2007; 79(3):212-9; 및 Yoo BC, Park JW, Kim HJ, Lee DH, Cha YJ, Park SM. Precore and core promoter mutations of hepatitis B virus and hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B in Korea. J Hepatol. 2003; 38(1):98-103).

한편, 과거 십여 년에 걸쳐 간질환의 임상 중증도, 특히 HCC에 관여하는 HBV 변이체에 대한 관심이 증가되고 있다. 지금까지 뉴클레오티드 1896(G→A)에서의 프리코어 변이 또는 기초적 코어 프로모터(BCP) 부위에서의 이중 변이 (뉴클레오티드 1762 (A→T) 및 1764 (G→A))와 같은 HBV의 몇 가지 변이 패턴은 임상 중증도와 관계된 HBV 변이로서 널리 연구되어 왔다. 표면 항원 (HBsAg)에서 미성숙 종결에 이르게 하는 F141L preS2 변이와 S182*의 두 가지 타입의 임상 중증도 관련 변이는 최근에 한국인 만성 환자에서 발견되었다 (Mun HS, Lee SA, Kim H, Hwang ES, Kook YH, Kim BJ. Novel F141L Pre-S2 Mutation in Hepatitis B Virus Increases the Risk of Hepatocellular Carcinoma in Patients with Chronic Genotype C Infections. J Virol. 2011; 85(1):123-32; 및 Lee SA KK, Kim H, Kim BJ. Nucleotide change of codon 182 in the surface gene of hepatitis B virus genotype C leading to truncated surface protein is associated with progression of liver diseases. J Hepatol. 2012; 56:63?9).

바이러스 코어의 단백질 외피인 HBcAg는 길이가 183 잔기이고, 이것의 N 말단의 149 잔기는 어셈블리 도메인이다. HBcAg는 숙주의 면역 반응, 특히, 세포독성 T 림파구 공격의 주된 타겟이다. 이 부분에서의 면역 에피토프를 변화시키는 변이가 면역 회피 변이체의 생산에 이르게 할 수 있고 그 결과 HBV를 지속적으로 유지하게 한다. 또한, C 부위에서의 변이는 핵심 HBV 면역조절 단백질인 HBe Ag (HBe 항원)에서의 동시적인 변이를 일으킬 수 있기 때문에 상기 변이는 만성 B형 간염(chronic hepatitis B, CHB)의 자연적인 경로에 크게 영향을 미칠 수 있다.

preC/C 부위의 변이 빈도 및 간 질환의 진행도간의 관련성이 알려졌지만, 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)와 관련된 단일 코돈 변이 또는 HBeAg 혈청상태 (serostatus)에의 영향에 대하여는 알려진 바 없다. 또한 최근에 p53, β-catenin, Axin1과 같은 종양억제 유전자 (tumor suppressor gene) 또는 종양성 유전자(oncogene)의 변이(mutation)가 종양 조직에서 발견되었고 이들이 간암발생에 관여할 것이라는 보고가 있지만, 이들 유전자 변이 빈도가 매우 낮아 이러한 유전자 변형으로 간암 발생 또는 발병의 인과관계를 설명하기는 부족하다. 따라서 간암의 원인과 진행에 대한 분자 생물학적 기전은 아직도 연구해야 할 과제로 남아있다. 최근 바이오 마커 DCP(Des-gamma carboxyprothrombin)라고도 명명되는 PIVKA-II(prothrombin induced by vitamin K absence-II), AFP-L3(lens cularis agglutinin-reactive), GPC3(glypican-3) 등에 대하여 현재 조기간암을 진단할 수 있는 지에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 간암의 진단율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 추가적 마커가 필요한 실정이다.

한편, 대한민국 공개특허 2010-0039528은 HBV성 간암 진단에 관한 것으로, 시알산전이효소 ST3Gal III, 후코스전이효소 FUT III, 후코스전이효소 FUT VII 또는 β1-3 갈락토실트랜스퍼라아제 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 검출하는 방법을 통해 HBV성 간암 마커를 검출하는 방법을 개시하고 있다.

대한민국 공개특허 2009-0052670는 ANXA2, G22P1, PPIA, CANX, CXCL16 등의 유전자의 mRNA 수준 혹은 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간세포암 진단용 조성물을 개시하고 있다.

대한민국 공개특허 2011-0103016은 간암진단용 TGFβIII 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성 마커를 개시하고 있다.

미국 공개특허 2010-0092978은 CDH17의 과별현 혹은 상향조절을 판단하여 간암을 진단하는 방법을 개시하고 있다.

하지만 이들 특허문헌은 직접적으로 간염 바이러스로부터 유래한 바이러스 코어 단백질을 코딩하는 유전자의 변이로부터 HBe 항원 음성 HBV 감염 여부 또는 이로 인한 질환을 진단하거나 그 예후를 예측하는 방법에 대해서 개시하고 있지 않으며, 추가 마커 개발에 대한 필요성이 있다.

HBe 항원 음성 HBV 감염증은 비교적 간염의 후기 단계에 나타나기 때문에 간경변이나 간암과 같은 합병증을 동반하는 간 질환으로 진행되었을 가능성이 높은 것으로 알려져 있으나, 혈청 HBV DNA 정량검사를 해석하는데 어려움이 있는 등 이의 판별이 매우 어려웠다. 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역 및 preC 영역에서 특징적인 변이의 검출을 통해 감염여부의 진단이 어려웠던 HBe 항원 음성 HBV 감염을 진단할 수 있는 방안을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째, 131번째, 181번째, 또는 preC 영역의 28번째 또는 29번째의 아미노산의 변이에 대응하는 하나 이상의 코돈을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 10개 내지 200개의 연속 염기서열의 폴리뉴클레오티드 및 이의 상보적 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커로, 상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기순서를 따르며, 상기 HBV의 코어 단백질 C 영역의 상기 50번째 아미노산 변이는 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상; 상기 131번째 아미노산 변이는 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상; 상기 181번째 아미노산 변이는 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상; 상기 preC 영역의 상기 28번째 아미노산 변이는 트립토판에서 종결코돈(W28*); 및 상기 preC 영역의 29번째 아미노산 변이는 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로의 변이인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커를 제공한다. 상기 위치 중 181번째의 경우 A형에서는 183번째에 해당한다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 HBV는 A 또는 C형인 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커를 제공한다.

본원에 따른 다른 일 구현예에서, 상기 HBV의 코어 단백질 preC 영역은 서열번호 1, 5, 9 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 C 영역은 서열번호 2, 6, 10 또는 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산은 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상; 131번째 아미노산은 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상; 181번째 아미노산은 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상; 및 preC 영역의 28번째 아미노산은 트립토판에서 종결코돈(W28*); 상기 29번째 아미노산은 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로의 변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이에 대응하는 코돈 변이를 코딩하는 부위를 포함하는 뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 프로브 및 프라이머를 포함하며, 상기 프로브 및 프라이머는 각각 단독으로 또는 함께 사용되고, 상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기 순서를 따르며, A형의 경우 상기 181번째는 183번째에 해당하는 것인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서, 상기 HBV는 A 또는 C 형인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서, 상기 HBV의 코어 단백질 preC 영역은 서열번호 1, 5, 9 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 C 영역은 서열번호 2, 6, 10 또는 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물을 제공하며, 다른 일 구현예서 상기 프라이머는 상기 변이 부위를 각각, 또는 두 개 이상의 변이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 프라이머는 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍, 또는 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 본원에 따른 조성물을 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 키트를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, i) HBV에 감염된 환자의 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; ii) 상기 수득한 핵산 시료 중 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산의 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상으로의 변이; 131번째 아미노산의 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상으로의 변이; 181번째 아미노산의 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상으로의 변이; preC 영역의 28번째 아미노산의 트립토판에서 종결코돈(W28*); 및 29번째 아미노산의 글라이신에서 아스파르트산 (G29D) 변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이에 대응하는 하나 이상의 코돈을 코딩하는 염기 서열을 결정하는 단계로, 상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기 순서를 따르며, A형의 경우 상기 181번째는 183번째에 해당하고; 그리고 iii) 상기 단계 ii)에서 상기 하나 이상의 변이가 검출된 경우, 이를 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단과 연관시키는 단계를 포함하는, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커의 검출방법을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원의 마커 또는 방법에 사용되는 검체는 예를 들면 간 조직, 간 세포, 혈액, 혈청, 혈장 및 뇨일 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본 방법에 사용되는 염기서열 분석은 예를 들면 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법 중 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 제시하는 HBV의 코어 단백질의 C 영역 또는 preC 영역의 아미노산 변이에 대응하는 코돈 변이를 가지는 HBc Ag 변이로 인한 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커나 상기 코돈 변이를 검출하는 분석방법을 이용할 경우, 종래 진단이 어려웠던 HBe 항원 음성 HBV 감염을 진단할 수 있어, 이로 인한 간경변, 간암과 같은 간질환의 조기 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 내지 1c는 간 질환의 중증도에 기초한 preC /C 영역에서의 아미노산 변이의 분포 및 빈도를 나타내는 그래프이며; 검은색 및 회색 막대는 각각 HCC 및 mild form과 관련된 것을 나타내고, 바탕의 짙은색 및 밝은색 영역은 각각 MHC 클래스 I-제한 (core aa 18-27, 88-96, 130-140, 141-151) 및 MHC 클래스 II 제한 HBcAg의 T-세포 에피토프(core aa 1-20, 50-69, 81-105, 117-131, 141-165)를 나타낸다. 별(★)과 세모(▲)는 각각 HCC에 관련성이 있는 것 및 HBe Ag 상태에 영향을 주는 변이를 가리킨다. 붉은색 화살표는 종전에 HCC에 음성적으로 관련된 것으로 알려진 6개의 변이를 나타낸다.
도 2(a)는 간질환의 중증도와 관련된 preC/C 변이의 빈도를 나타낸 것이다. MHC 클래스 II 제한 T-세포 에피토프의 부위 내 변이타입이 별(★)로 표시되어 있다.
도 2(b)는 두 가지 다른 HBeAg 혈청상태(-, +)를 가지는 환자 사이에서 HBeAg 혈청상태에 영향을 주는 preC/C 변이의 빈도를 비교한 것이다. MHC 클래스 II 제한 T-세포 에피토프의 부위 내 변이 타입이 별(★)로 표시되어 있다.

이하, 명세서에 사용된 용어의 정의를 포함하여 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명한다.

본원에서 사용된 용어,“진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것)을 포함한다.

본원에서 사용된 용어,“진단용 마커, 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하고, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 차별적인 양상을 보이는 핵산(DNA, mRNA), 폴리펩티드, 단백질, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 좀더 구체적으로, 상기 용어 “진단용 마커 또는 진단 마커”는 특정 유전자 좌위에서의 돌연변이나 변형에 기인하는 변이(variation)로 구체화될 수 있으며, 변위된 부의를 둘러싸는 짧은 핵산 서열 또는 미니세털라이트(minisatellite)를 포함하는 그보다 좀더 긴 핵산 서열을 포함하고, 특히 본 발명에서와 같이 HBV의 코어 단백질의 C 영역 또는 preC 영역의 MHC Class II 제한 부위 내에 주로 분포하는 아미노산 코돈 변이를 가지는 약 8~1000 bp, 특히 약 20~600 bp, 보다 특히 약 20~100 bp, 더더욱 특히 약 10~ 50 bp 길이의 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 아미노산 코돈의 변이 내용에 관한 용어, 예를 들어,“C-P5H/L/T”는 HBV 코어 단백질의 C 영역의 5번째 아미노산이 프롤린에서 히스티딘, 루이신 또는 트레오닌으로 치환된 경우를 의미한다.

본원에서 사용된 용어, "프라이머"는 표적 타겟 뉴클레오티드 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지며 이에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드로서, DNA 또는 RNA 중합효소 존재 하에서 자신의 3’말단에 모노뉴클레오티드를 부가함으로서 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 서열을 의미하며, 펩티드 핵산 프라이머, 표지된 프라이머, DNA 분자의 포스포디에스터 결합이 포스포로티오에이트 등과 같은 것으로 수식된 프라이머 등을 포함한다.

본원에서 사용된 용어,“프로브”는 타겟 핵산을 검출하는데 사용하는 올리고뉴클레오티드로, 혼성화 프로브, 형광 프로브, FRET 프로브 등 다양한 유도체의 형태를 포함하며, 그 자체로 또는 프라이머와 함께, 특정 염기서열의 존재여부, 또는 정량 분석 등에 사용된다.

본원에서 사용된 용어, "대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

본원에서 사용된 용어, "검체 또는 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분일 수 있다. 예를 들면 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본원의 샘플 또는 검체는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등) 및 세포 배양 상등액 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 한 구현예에서는 인간 유래의 샘플이 사용되며, 상기 샘플은 HBV 보균자로부터 얻은 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 골수액, 타액, 분변, 안구액, 정액, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 및 세포 조직액이며, 가장 바람직하게는 조직, 간세포, 혈액, 혈청, 혈장 및 뇨이다.

본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역 및 preC 영역에서의 아미노산의 변이와 간암, 특히 간세포암과의 관련성은 물론 HBe Ag의 혈청 상태 (음성 또는 양성)와의 관련성을 발견하였다.

본원에서 사용된 용어 “간질환” 이란, 간 기능에 장애가 있는 증상을 가리킨다. 예를 들어, 바이러스성 간염(특히, HBV에 의해 매개된 간염), 간경화 및 간세포암을 들 수 있다. 병명이 확실치 않은 경우라도, GOT, GPT, γ-GTP 등의 간 기능의 지표에 이상이 관찰되는 증상도 간질환에 포함된다. 한 구현예에서 상기 간질환은 간세포암이다. 다른 구현예에서, 상기 간세포암은 A 내지 H 형 중 하나 이상, 특히, A형, 더욱 특히 C형 HBV 감염으로 인한 것이다.

간세포암은 간에서 발생하는 원발성 간암을 의미하며, 다른 부위에서 생겨서 간으로 전이된 암은 간세포암은 포함되지 않는다. 간세포암은 전체 간암의 90％ 이상을 차지하며, 환자의 40∼80％는 재발하는데, 대부분 다시 간에 재발하지만, 폐와 림프절, 복강을 둘러싸고 있는 안쪽 벽과 종격동에서 나타날 수도 있으며, 이러한 암도 본원에 포함된다. 원인은 B형간염 바이러스와 C형 간염 바이러스, 알코올성 간질병, 대사성 만성 간질병, 독성물질 등이 있다.

본원의 한 구현예에서 본원의 마커, 조성물, 키트 또는 방법이 사용될 수 있는 간질환은 간세포암이다. 특히 상기 간세포암은 HBV 유래의 간세포암이다. 또한 야생형 HBV는 그 유전자 서열에 따라 A 형 내지 H형으로 분류될 수 있으며, 한 구현예에서는 A형 또는 C형 HBV로 감염된 간세포암이다. 다른 구현예에서 간세포암은 C형 HBV로 감염된 것이다.

간세포암의 경우 대부분 선행적으로 간경화와 더불어 진행되기 때문에 간경화를 동반한 간조직의 경우 간암 전구병변이라 할 수 있는 비종양성 재생성 결절(nonneoplastic regenerating nodule)과 악성 간세포암(malignant hepatocellular carcinoma)의 중간 단계를 포함하고 있을 것으로 알려져 있다. 이러한 결절병변을 이형성 결절(dysplastic nodule)이라고 하며, 그 정도에 따라 저등급(low grade dysplastic nodule) 또는 고등급(high grade dysplastic nodule) 이형성 결절로 세분할 수 있다. 고등급 이형성 결절은 경우에 따라 조직내 미세한 간세포암이 관찰됨에 따라 간세포암의 전암단계로 여겨지고 있으며, 이러한 전암단계의 간세포암종도 본원에 포함될 수도 있다. 간세포암은 조직병리학적으로 에드몬슨등급(Edmoson grade) 방법에 따라 모두 4등급으로 나눌 수 있으며, 이러한 단계별 암종도 본원에 포함될 수도 있다.

HBV는 유전체가 부분적으로 이중가닥인 3.2 kb의 원형 DNA 바이러스로, 유전체에는 4개의 겹친 해독틀이 존재하며, 이로부터 표면 단백질 (HBs), 코어단백질 (HBc), 중합효소 (HBV pol), 및 X 단백질 (HBx)이 발현된다 (Seeger, C. et al., 2000). 코어단백질은 HBV pol, 프리게놈 RNA (pgRNA) 및 기타 다른 단백질의 패키징에 관여하며, HBV 라이프사이클에서 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 있다. 바이러스의 생성에는 코어단백질과 바이러스 게놈 및 기타 단백질의 어샘블리가 필요하기 때문에, 코어단백질의 어샘블리는 HBV 복제에 있어 중요한 단계이다.

코어 단백질은 코어 어샘블리에 필요한 N-말단 부위와 바이러스 복제를 조절하는 C 말단으로 이루어진 두 개의 영역을 갖는 183-185개 아미노산으로 구성되어 있다. 코어단백질은 바이러스의 캡시드를 형성하며, 캡시드는 패키지된 바이러스와 숙주 인자 (host factor)의 보호에 필수적인 역할을 한다.

preC는 코어 앞부분 29개 아미노산으로 구성되어 있으며 e-항원을 생성한다. HBeAg는 HBV가 숙주내에서 활발하게 증식할 때 바이러스로부터 분비되는 단백질로 항원성을 갖는다. 일반적으로 HBeAg의 검출을 통해 HBV 감염여부를 판별할 수 있기 때문에 혈청 HBeAg 존재여부는 만성 B형 간염의 치료계획에 중요한 역할을 한다. 그러나 HBeAg 음성환자의 경우 HBeAg가 검출되지 않기 때문에 감염 여부의 검출이 매우 어렵다.

HBe 항원 음성 HBV 감염증은 혈청 HBV DNA 정량검사를 해석하는데 어려움이 있는 등 그 검출이 어렵고, 비교적 간염의 후기 단계에 나타나기 때문에 간경변이나 간암과 같은 합병증을 동반하는 간 질환으로 진행되었을 가능성이 높아 감염 여부의 조기발견이 매우 중요하다. 본원에서는 preC/C 영역에서의 특정 아미노산의 변이와 HBcAg 변이에 의한 HBe 항원의 음성 또는 양성 상태와 연관성을 발견하였다.

따라서 한 양태에서 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째, 131번째, 181번째, preC 영역의 28번째 및/또는 29번째의 아미노산의 변이에 대응하는 하나 이상의 코돈을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 10개 내지 200개의 연속 염기서열의 폴리뉴클레오티드 및 이의 상보적 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커 관한 것이다.

상기 잔기번호는 현재까지 규명된 HBV 유전자 형 A 형 내지 H형의 상응하는 잔기 순서를 따른다. HBV의 유형에 따라 상응하는 잔기의 위치 및 구체적 잔기에 변동이 있을 경우, 이에 상응하는 위치, 그 위치에 상응하는 아미노산을 포함하는 것이다. 예를 들면 HBV 유전자 A 형의 경우 83번째 코돈이 아스파르트산 (D)이며, 유전자 A 형은 코어 말단 부분에 2개 아미노산이 추가되어 preC/C 총 아미노산 서열은 185개로 유전자형 C보다 2개 아미노산만큼 더 길기 때문에, 상기 유전자 C형의 Q182K/* (종결)은 유전자 A형에서 Q184K/*에 해당한다. 한 구현예에서, 상기 HBV의 코어 단백질 preC/C 영역의 아미노산 잔기 번호는 편의를 위해 예를 들면 유전형 A형, B형, C형 또는 D형 등의 잔기순서를 따를 수 있다.

다른 구현예에서는 A형 또는 C형의 잔기 번호를 따른다. HBV C형의 preC/C 영역의 잔기 순서를 따를 경우, 상기 본원에 따른 HBe Ag 음성 HBV 감염의 검출과 연관된 변이는 다음과 같다: 코어 단백질 C 영역의 상기 50번째 아미노산 변이는 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상; 상기 131번째 아미노산 변이는 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상; 상기 181번째 아미노산 변이는 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상; 그리고 상기 preC 영역의 상기 28번째 아미노산 변이는 트립토판에서 종결코돈(W28*), 상기 29번째 아미노산 변이는 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로 변이된 것이다.

상기 언급한 바와 같이 HBV의 유형에 따라 구체적 잔기의 위치에 변동이 있을 경우, 이에 상응하는 위치 또는 위치에 따른 구체적 아미노산의 변동이 있을 경우, 그 위치에서의 아미노산을 포함한다. 예를 들면, HBV의 C형의 181번째는 A형의 경우 183번째에 해당하는 것이다.

본원의 한 구현예에서 상기 HBV의 코어 단백질 preC 영역의 아미노산 잔기 번호는 서열번호 1, 5, 9 또는 13에 기재된 잔기의 순서에 따르고, 상기 C 영역의 아미노산 잔기 번호는 편의를 위해 서열번호 2, 6, 10 또는 14에 기재된 잔기의 순서에 따른다.

본원에 개시된 야생형 HBV의 preC 영역의 서열은 HBV 유전자형에 따라 A 내지 H로 분류될 수 있으며, 이러한 유형에 존재하는 preC 영역을 모두 포괄하는 것이다. 한 구현예에서는 유전자형 A 또는 C형 유래이다. 다른 구현예에서 코어단백질 preC영역은 C형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 1, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 3의 서열로 나타낼 수 있다. 또다른 구현예에서 코어단백질 preC영역은 A형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 5, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 7의 서열로 나타낼 수 있다. 또다른 구현예에서 코어단백질 preC영역은 B형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 9, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 11의 서열로 나타낼 수 있다. 또다른 구현예에서 코어단백질 preC영역은 D 형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 13, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 15의 서열로 나타낼 수 있다.

본원에 개시된 야생형 HBV의 코어 단백질의 C 영역의 서열은 HBV 유전자형에 따라 A 내지 H로 분류될 수 있으며, 이러한 유형에 존재하는 C 영역을 모두 포괄하는 것이다. 한 구현예에서는 유전자형 A 또는 C형 유래이다. 다른 구현예에서 코어단백질 C영역은 C형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 2, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 4의 서열로 나타낼 수 있다. 또다른 구현예에서 코어단백질 C영역은 A형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 6, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 8의 서열로 나타낼 수 있다. 또다른 구현예에서 코어단백질 C영역은 B형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 10, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 12의 서열로 나타낼 수 있다. 또다른 구현예에서 코어단백질 C영역은 D 형 유래이며, 단백질 서열은 예를 들면 서열번호 14, 핵산 서열은 예를 들면 서열번호 16의 서열로 나타낼 수 있다.

한 구현예에서 본원의 마커는 유의한 수준으로 HBe 항원 음성인 간세포암 환자군의 검체에 변이의 빈도가 높게 존재하는 것으로 판별되었으므로 HBe 항원 음성 HBV 감염의 진단에 사용될 수 있다. 이럴 경우 간경변이나 간암과 같은 합병증을 동반하는 간 질환으로 진행되기 이전에 감염 여부를 판별하여 질환을 조기에 예방할 수 있다.

본원에 따른 마커로서는 상기 나열된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 이용할 수도 있으나, 한 위치에서 하나 이상의 변이를 포함하여, 둘 이상의 위치에서의 변이를 동시에 검출하는 두 개 이상의 마커가 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 마커의 검출을 위해 사용되는 검체는 간염, 또는 간세포암 조직, 또는 HBV 보균자 유래의 간조직 또는 간세포암 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상이다. 다른 구현예에서 본 발명에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 판별이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 유형의 간세포암 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산은 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상; 131번째 아미노산은 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상; 181번째 아미노산은 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상; 및 preC 영역의 28번째 아미노산은 트립토판에서 종결코돈(W28*); 29번째 아미노산은 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로의 변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이에 대응하는 코돈 변이를 코딩하는 부위를 포함하는 뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 프로브 및 프라이머를 포함하며, 상기 프로브 및 프라이머는 각각 단독으로 또는 함께 사용되고, 상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기 순서를 따르는 것인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물에 관한 것이다. 상기 HBV의 코어 단백질 preC 영역 및 C 영역의 구체적 아미노산 잔기는 앞서 언급한 바에 따른다.

본원에 따른 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold Spring Harbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등을 포함할 수 있다.

또한, 본원은 상기 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물 또는 하나 이상의 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단 마커를 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 진단용 키트에는 본원에 따른 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 프라이머, 프로브, dNTP, 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

또한, 본원에 따른 진단 마커는 상기 기술된 바와 같이 본원에서 규명한 변이 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 이외에도 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것이다.

본 발명의 마커는 단백질 또는 핵산 수준에서 검출될 수 있다. 단백질 또는 핵산 수준의 검출 방법은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있다. 상기 본 발명의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

핵산 수준에서의 검출은 칩 방식을 이용한 혼성화법, 프라이머 또는 프로브를 이용한 중합효소연쇄반응, 서던 블롯 등의 기존의 방식을 이용할 수 있고, mRNA 수준에서의 검출은 역전사 중합효소연쇄반응/중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 또는 노던 블롯 등을 이용한 방식으로 검출될 수 있다. 본 발명에서 검출이란, 정량 및 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 또는 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본 발명의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

한 구현예에서는 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용되며, 변이 부위를 포함하는 부분의 폴리뉴클레오타이드를 증폭한 후, 증폭산물에 포함된 변이를 염기서열 분석 또는 혼성화 방법으로 검출할 수 있다. PCR은 검체의 DNA를 분리한 후, 특정 프라이머 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H.; Bearss, D. J.; Browne, L. W.; Calaluce, R.; Nagle, R. B.; Von Hoff, D. D., Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer cells using cDNA microarray. Cancer Res 2002, 62, (10), 2890-6) 에 기재되어 있다.

본원의 조성물 또는 키트에 포함될 수 있는 상기“프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합효소) 및 적당한 온도 하에서 주형-의존적 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 예를 들면 상기 프라이머는 변위 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 변이의 존재를 나타낸다. 다른 예로 상기 프라이머는 변위부위를 포함하는 양 쪽 부위에 결합하는 한쌍 프라이머일 수 있다.

PCR에 사용되는 프라이머는 쌍으로 사용되며, 본원에 따른 변이를 각각, 또는 여러 개, 예를 들면 2개 이상의 변이를 한 쌍의 프라이머로 증폭할 수 있는 프라이머가 사용될 수 있다. 각각 또는 여러 개의 변이를 한 번에 증폭할 수 있는 프라이머는 단일 PCR 또는 다중 (multiplex) PCR 방식으로 수행될 수 있다. 역전사 중합효소연쇄반응은 주형으로 사용하기 위하여, 검체의 mRNA로부터 cDNA를 합성하는 것을 제외하고 일반적인 PCR 방법과 크게 차이가 없다.

다른 구현예에서는 상술한 프라이머와 함께 프로브가 PCR에서 사용될 수 있으며, 예를 들면 시중의 표지된 프로브, 예를 들면 TaqMan (Applied Biosystems, USA) 프로브를 프라이머와 함께 사용하여, 변이 여부를 확인할 수 있다. 예를 들면 상기 프로브는 본원에 따른 변이 부위와 특이적으로 혼성화 할 수 있는 서열을 포함하며, 상기 프라이머는 그 주변서열을 포함한다. 상기 프로브의 변이 부위와의 혼성화 여부에 따라 신호증폭(방출)여부가 결정되어, 사용된 검체의 특정 위치에서의 변이여부를 판별할 수 있다.

다른 구현예에서는 본원에 따른 진단 마커의 발현 산물인 변이된 HBV 코어 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 이용하여 실시될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

다른 측면에서 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산은 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상; 131번째 아미노산은 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상; 181번째 아미노산은 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상; 및 preC 영역의 28번째 아미노산은 트립토판에서 종결코돈(W28*); 29번째 아미노산은 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로의 변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이에 대응하는 하나 이상의 코돈 변이를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 진단 키트는 마커의 존재/부존재의 검출과 관련해서는 앞서 언급한 바와 같으며, 본 발명의 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서의 검출에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다. 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯, 서던 블롯 등에 사용되는 시약으로, 예를 들면 각 마커에 특이적인 프라이머, 프로브 등을 포함하는 것이다.

이러한 본 발명의 마커를 특이적으로 인식하는 물질은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본 발명은 또한 본 발명의 마커를 특이적으로 인식할 수 있는 분자를 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다.

본 발명의 키트와 사용되는 검체는 간세포암 조직, 또는 HBV 보균자 유래의 간조직, 간세포암 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장 중 하나 이상이다. 다른 구현예에서 본 발명에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 판별이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 유형의 간세포암 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산은 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상; 131번째 아미노산은 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상; 181번째 아미노산은 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상; 및 preC 영역의 28번째 아미노산은 트립토판에서 종결코돈(W28*); 29번째 아미노산은 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로의 변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 코돈 변이를 코딩하는 부위를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이 (또는 chip based assay)는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이가 사용된다. 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기“프로브 폴리뉴클레오티드”는 검체 중의 상응하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 하나의 프로브는 특정 부위에서 하나의 아미노산 변이에 상응하는 코돈의 변이를 검출하는 것으로, 변이형에는 결합하는 변이이외에 다른 염기서열에는 혼성화하지 않도록 혼성화 강도에 차이가 있어야 하며, 목적하는 특정 변이에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 본원에 따른 마커는 DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도에서 보통 수행될수 있다. 예를 들면, 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30 ℃의 조건이 변이의 검출을 위한 혼성화에 적합할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 프로브로 사용되는 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

다른 양태에서 본 발명은 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 본원에 따른 간질환 진단 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다. 마커의 검출은 핵산 또는 단백질의 존재 여부를 확인하여 수행될 수 있다.

상기 방법은 예를 들면 i) HBV 감염 여부 검출이 필요한 환자로부터 핵산 시료를 수득하는 단계; ii) 상기 수득한 핵산 시료 중 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산의 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상으로의 변이; 131번째 아미노산의 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상으로의 변이; 181번째 아미노산의 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상으로의 변이; preC 영역의 28번째 아미노산의 트립토판에서 종결코돈(W28*)으로의 변이; 또는 29번째 아미노산의 글라이신에서 아스파르트산 (G29D) 변이에 대응하는 하나 이상의 코돈을 코딩하는 염기 서열을 결정하는 단계로, 상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기 순서를 따르며; 그리고 ii) 상기 단계 ii)에서 상기 하나 이상의 변이가 검출된 경우, 이를 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단과 연관시키는 단계를 포함한다.

상기 HBV의 코어 단백질 preC 및 C 영역의 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A형 내지 H 형의 잔기순서를 따르며, 유형에 따른 preC 및 C 영역의 구체적 서열 및 잔기 변동은 앞서 언급한 바와 같다. 또한 상기 HBV의 코어 단백질 preC 영역 및 C 영역의 구체적 아미노산 잔기는 앞서 언급한 바에 따른다.

본원에 따른 마커의 검출은 핵산 또는 단백질의 존재 여부, 특히 특정 염기서열의 핵산의 검출로 수행될 수 있다.

상기에서 (i)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 (ii)단계의 염기서열 결정은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행할 수 있다. 상기 방법이 표적 핵산 부위의 증폭을 수반하는 경우, PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

본원의 방법에 사용되는 검체는 상술한 바와 같다.

본 발명의 진단 마커는 복수개의 마커가 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 마커의 존재/부존재의 검출은 단백질 및/또는 핵산 수준에서 결정될 수 있으며, 이에 관해서는 언급한 바와 같다.

본 발명에 따른 마커를 검출하는 방법을 통해 상기 변이부위의 염기 서열을 판별함으로써 간암의 감수성을 예측, 간암의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 상기와 같은 진단 또는 예후에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 마커분석이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 마커분석이외의 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 초음파, 전산화 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 혈관조영술, 내시경적 역행성 췌담관 조영술, 초음파 내시경, 종양 표지자, 또는 복강경 검사를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명은 달리 언급이 없는 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 면역학의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 세포배양 및 배지에 관한 일반적 기술에 관하여는 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251)를 참조할 수 있다. 본 명세서에 기술된 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, and ClonTech 등과 같은 회사에서 구입할 수 있다.

실시예 1

검체

2003~2009년 국립제주대학교병원, 2004~2006년 서울보훈병원 또는 2005년 서울대병원을 방문한 70명의 만성 B형 간염 환자로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 이중 35명의 세럼 샘플은 HBeAg-양성이고, 35명은 HBeAg-음성이었으며, 환자의 임상 진단 상태는 만성 간염(Chronic Hepatitis, CH)(n=27), 간 경화(Liver Cirrhosis, CH)(n=8) 및 간세포암(Hepato Cellular Carcinoma, HCC)(n=35)이었다.

급성 간염 B, 동반 간염 C 또는 D 바이러스 감염, 항바이러스 치료력, 면역억제 치료력 및 심한음주력들 중 어느 하나에 해당되는 환자는 제외하였다. HBsAg, 항HBs, HBeAg 및 항HBe는 시중의 효소면역분석 키트(Abbott Lab.Wiesbaden, Germany)를 제조자의 안내서에 따라 이용하여 분석하였다. HBV DNA는 하이브리드 캡쳐 HBV DNA 분석 키트(Diagene, Gaithersburg, MD, USA)를 제조자의 안내서에 따라 이용하여 정성적으로 판정하였다.

본 실험은 서울대학교병원 기관 리뷰 이사회 (institutional review board of Seoul National University Hospital)에 의해 승인되었다(IRB No. C-1110-106-382). 본 연구에 참여한 환자들의 임상적 특징은 아래와 같다.

BV DNA 증폭 및 시퀀싱

본 실시예에서는 상기 환자의 혈청에서 비리온 DNA를 분리한 후 PCR을 수행하여 HBV 게놈의 1682 nt에서 2698 nt의 1017 bp 앰플리콘을 생성하였다. 비리온의 분리를 위해 혈청 200 ㎍을 TES 용액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 0.5% SDS 그리고 proteinase 50㎍) 600 ul에 넣고 65℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이어 Phenol/chloroform/isoamylalcohol (50:49:1) 혼합액을 이용하여 DNA를 분리하여 이소프로필 알코올을 이용하여 DNA를 침전하였다. DNA 펠렛은 TE 용액 20 ul (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 이용하여 용해하였고, 용해된 DNA 2 ul을 PCR에 사용하였다.

전체 preC/C 부위 내 결실 및 삽입의 빈도와 변이 패턴을 분석하기 위하여, 네스티드 PCR을 사용하였다. 먼저 1회 PCR에서는 센스 프라이머 CoreF1 (5'-AAC GAC CGA CCT TGA GGC ATA CTT-3')와 안티센스 프라이머 CoreR1 (5'-ATT TGG TAA GGT TAG GAT AGA A-3')를 이용하여 1차 PCR을 수행하였으며, 그 결과 HBV 유전체의 1682 nt부터 2698 nt까지 증폭하여 1017bp 산물을 수득하였다.

2차 PCR은 센스 프라이머 CoreF2 (5'-GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGG TTA-3') 및 안티 센스 프라이머 CoreR2 (5'-CAC TCA GGA TTA AAG ACA G-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 HBV 게놈의 1734 nt에서 2555 nt의 822 bp 산물을 생성하였다.

PCR은 1.5 mM MgCl₂, 200 μM dNTP, 및 2.6 U of Expand High Fidelity Taq polymerase를 포함하는 50 ㎕ PCR mixture 내에서 시작되었다. 두 회 모두의 실험 조건은 95℃에서 10분; 95℃ (45sec), 52℃ (45sec) 및 72℃ (90sec)으로 구성된 20 주기; 마지막으로 72℃에서 5분의 조건으로 행해졌다. 1회로부터 5㎕의 산물을 사용하였고 2회 PCR도 1회와 같다.

PCR 산물은 2.5% 아가로스 젤에서 전기영동으로 분석하고, 에티디움 브로마이드로 염색 후 UV로 가시화하였다. 정제된 PCR 산물은 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction V.2 키트 및 fluorescent 373A DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 2회째 PCR에 사용한 CoreF2 및 CoreR2 프라이머를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 서열이 혼합되있을 경우 우세한 것을 채택하였다.

HBV 유전형 결정

유전형 결정 (genotyping)을 위해서, 모든 70 HBV 균주에 대하여 전체 preC/C 부위 (639 bp)의 전체 서열에 기초한 계통발생학적 분석을 수행하였다. 계통발생학적 분석은 neighbor-joining of MEGA version 4.1을 이용하여 결정하였다.

통계 분석

결과는 백분율, 평균± SD 또는 중간값(범위)으로 나타냈다. 카테고리상 변수 사이의 차이는 피셔의 직접확률검정법 또는 카이-스퀘어 테스트를 이용하여 분석되었다. 연속 변수를 위하여 데이터가 정규분포를 보일 때는 스튜던트의 t 테스트가 사용되었고, 데이터가 정규 분포를 보이지 않을 때는 Mann-Whitney U test가 사용되었다. 0.05보다 작은 p 수치는 통계적으로 유의한 것으로 본다.

실험결과

유전형 결정 분포

preC/C 부위의 모든 639 bp 서열에 기초한 계통발생학적 분석에서는 임상 상태 및 HBeAg 혈청상태에 상관없이 한국인 환자로부터 유래한 모든 70 HBV 균주가 유전형 C2에 속하는 것으로 나타났다 (결과는 나타내지 않음).

HBV preC /C 부위 변이의 분포

70명 중 60명의 환자(85.7%)로부터 212개의 코돈 (preC에서 29개 코돈, C에서 183개 코돈) 중 총 82개 코돈에서 변이가 발견되었다(도 1, 표 1 참조). 일반적으로, preC/C 부위에서 변이를 가진 환자(60명 환자)가 변이가 없는 환자(10명 환자)보다 유의하게 더 고령이었다(51.9 vs. 36.9, P<0.001). 유의한 차이에 이르는 다른 임상 요소는 두 그룹 간에 발견되지 않았다(표 1 참조).

[표 1] 야생형 및 변이에 따른 환자들의 임상 특징의 비교

상기 표에서 a: 본 연구 및 17개의 참조 스트레인 유래의 HBV의 공통서열과의 비교를 통해 결정됨; b: 유의하지 않음; c: CH (Chronic Hepatitis, 만성간염), LC (Liver Cirrhosis, 간경변), HCC (Hepatocellular carcinoma, 간세포암); d: ALT 수치가 정상 ALT 의 상한 값보다 큰 경우로 여자 (19IU/L), 남자 (30 IU/L).

70명 환자의 preC/C 부위에서 치환을 제외한 어떠한 결실도 발견되지 않았다(데이터 미표시). preC/C 부위 내 변이에서는 무작위적이지 않은 분포가 나타났다. 70 개의 HBV 균주로부터의 전체 preC/C 부위 내 모든 변이율의 평균값은 2%였다(212개 아미노산 중 4.2 변이). MHC 클래스 I 제한 부위(M1RR로 명명)(2.2%) 또는 클래스 II 제한 부위(M2RR로 명명)(2.3%)에서의 변이율은 T-세포 에피토프가 없는 비제한 부위(NRR, 또는 immuno-inactive region)(0.8%)에서보다 유의하게 높았다(P < 0.001). 이는 MHC 클래스 II 제한 부위 내 아미노산 잔기 81-105 부위인 핫스팟 상의 변이율(4.1%)을 고려할 때, 보다 뚜렷한 것으로 나타났다(표 2).

[표 2] preC/C 영역의 역활성화 부위 및 비활성화 부위간의 변이 비교

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간질환 진행도와 관련되고 HBeAg 생산의 억제에 이르게 하는 28번째 코돈 내 변이(트립토판에서 종결코돈, preC-W28*로 표기)는 preC 부위에서 가장 빈번하게 발견되었다(17명 환자, 24.3%). C 부위에서, 101번째 코돈 내 변이(루신에서 트립토판 또는 세린, C-L101W/S로 표기)는 가장 빈번하게 발견되었다 (22명 환자, 31.4%)(도 1).

HCC 환자 및 대조군 환자 ( LC + CH ) 사이의 변이 빈도

HCC 환자(2.2%)의 전체 preC/C 부위의 변이 빈도는 대조군 환자(간 경화 LC + 만성 간염 CH)(1.8%) (P=0.061)에서보다 높은 경향을 나타내었다. 두 임상 그룹 사이의 NRR에서의 변이 빈도의 차이는 발견되지 않았다(HCC 0.7%, 대조군 0.8%). 그러나 M1RR (2.5% vs. 1.9%, p=0.248)에서가 아닌 M2RR에서의 변이율 (2.7% vs. 1.9%, P=0.024)은 대조군 환자보다 HCC 환자에서 유의하게 높았다. 나아가, 아미노산 잔기 81-105 부위에서의 차이는 더 뚜렷하였다(5.6% vs. 2.6%, P=0.002) (표 3). 이는 바이러스 감염 후 병변의 진행경과에 따른 면역회피 (immune evasion) 현상으로 M2RR에서의 변이빈도가 높아지는 것을 나타내는 것이다.

[표 3] HBcAg 내 4 영역에서 HCC 환자와 대조군 환자(LC+CH)의 변이 빈도의 비교

두 가지 다른 HBeAg 혈청상태를 가지는 환자간 변이 빈도

전체적으로 전체 preC/C 부위에서의 변이 빈도는 HBeAg 음성 그룹(2.5%)이 HBeAg 양성 그룹(1.5%)보다 유의하게 높았다(P < 0.001). 그러나, HBcAg 내 각 영역에 따라 어느 정도의 차이가 발견되었다. NRR의 변이율(0.9% vs. 0.6 %, P=0.144)에서는 두 그룹간 차이가 통계학적으로 유의한 수준에 이르지 못하지만, M1RR (2.6% vs. 1.7%, P=0.094) 및 M2RR (3.0% vs. 1.7%, P<0.001) 내의 변이율, 특히, 아미노산 잔기 81-105 부위 (5.0%)에서의 변이율은 HBeAg 양성 환자보다 음성 환자에서 각각 유의하게 더 높았다. M2RR (3.0 %)는 M1RR (2.6 %)보다 HBeAg 혈청전환(seroconversion)에 의해 유도된 변이에 좀더 민감하였다(표 4). 이는 HBeAg 음성 환자에서 특히 M2RR과 관련하여 세포독성 T 세포에 대하여 면역회피 현상을 보이는 것임을 나타낸다.

[표 4] HBcAg 내 4 영역에서 두 가지 다른 HBeAg 혈청 상태를 가지는 환자간 변이 빈도의 비교

HCC 와 관련된 preC /C 부위의 변이 패턴의 확인

C 부위에서의 5 위치에서의 변이(C-P5H/L/T, C-E83D, C-I97F/L, C-L100I, C-Q182K/*)와 preC 부위에서의 1 위치에서의 변이(preC-W28*)는 LC 및 CH와 같은 질환의 다른 단계(stage)의 환자와 각각 비교하여 HCC 환자와 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, C 부위에서의 5개 위치에서의 변이는 상기 질환의 다른 단계의 대조군 환자에서보다 HCC 환자에서 유의하게 더 높은 수준으로 발견되었다. 또한 HCC 환자에서 preC-W28* 우성(prodominance)은 통계적으로 유의한 수준에 근접하였다 (P=0.093) (도 2a).

주목할 만하게, 5개의 HCC 관련 C영역 돌연변이 중 4개 (C-P5H/L/T, C-E83D, C-I97F/L, C-L100I)는 MHC 클래스 II 제한 T 세포 에피토프에 위치하였다. 6개의 HCC 관련 preC/C 돌연변이 중에서, HBcAg 어셈블리의 결함에 이르게 하는 것으로 알려진 C-I97F/L는 HCC 환자에서 가장 빈번하게 발견되었다(13 환자). C-I97F/L이 있거나 없는 환자 사이에서 임상 데이터의 비교는 이 돌연변이가 노령(57.4 vs. 47.3, P=0.01) 및 HBV DNA의 낮은 수준(29300 vs. 5534304 P=0.084)과 관련있는 것으로 나타났다.( 표 5)

[표 5] 야생형과 I97F/L 변이를 갖는 환자 간의 임상적 특징의 비교

HBeAg 혈청상태에 영향을 주는 preC /C 부위에서의 변이 패턴의 확인

C 부위에서의 5 위치에서의 변이 (C-D32N/H, C-E43K, C-P50A/H/Y, C-A131G/N/P, C-S181H/P)와 preC에서의 2개 위치에서의 변이(preC-W28*, preC-G29D)는 HBeAg 혈청상태에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다(도 2b). 이들 중 2 종류의 변이 (C-D32N/H, C-E43K)와 5개의 다른 변이(preC-W28*, C-G29D, C-P50A/H/Y, C-A131G/N/P, C-S181H/P)는 각각 HBe Ag 양성 및 HBe Ag 음성 혈청상태와 관련된 것으로 밝혀졌다. 이들 마커는 모두 통계학적으로 유의하거나 (preC-W28*, C-E43K, C-P50A/H/Y, C-A131G/N/P, C-S181H/P)의 유의수준에 근접(C-G29D, C-D32N/H)하였다. 흥미롭게도, C 부위에서 2개의 음성적으로 관련된 HBeAg 변이(C-P50A/H/Y, C-A131G/N/P)가 M2RR에 위치하였다(도 2b).

HCC를 가지는 35명을 포함하여 총 70명의 한국인 만성 환자의 HBV 유전형 분석과 preC/C 변이의 염기서열 분석결과, 모든 환자는 유전형 C 감염을 가지는 것으로 확인되었다. preC/C 영역에서의 여섯 개의 타입 (preC-W28*, C-P5H/L/T, C-E83D, C-I97F/L, C-L100I, C-Q182K/*)의 변이가 HCC와 유의하게 관련되어 있었으며, 특히, MHC 클래스 II 제한 영역에서의 변이가 우세하였다. 또한 preC/C 영역에서의 다섯 개의 타입변이(preC-W28*, C-G29D, C-P50A/H/Y, C-A131G/N/P, C-S181H/P)는 HBeAg 음성 혈청과 관련된 것으로 밝혀졌다.

이는 본원에서 규명된 HBV 코어 단백질의 C 영역 및 preC 영역에서의 변이가 특히 유전형 C로 감염된 HBe Ag이 음성인 환자의 HBV 감염여부 판단, 만성 B형 간염, 간경화 환자들에서 HCC로의 진행여부, HCC 진단 등에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Markers for diagnosing HBe Ag negative HBV infection and its use <130> DP201201009P <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(29) <223> HBV genotype C preC region <400> 1 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 1 5 10 15 Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly 20 25 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(183) <223> HBV gentoype C C region <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp 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(1)..(183) <223> HBV genotype B C region <400> 10 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Val Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Lys Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Trp Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 11 <211> 87 <212> DNA <213> Hepatitis B Virus <220> <221> gene <222> (1)..(87) <223> HBV genotype B preC region <400> 11 atgcaacttt ttcacctctg cctagtcatc tcttgttcat gtcctactgt tcaagcctcc 60 aagctgtgcc ttgggtggct ttggggc 87 <210> 12 <211> 552 <212> DNA <213> Hepatitis B Virus <220> <221> gene <222> (1)..(552) <223> HBV genotype B C region <400> 12 atggacattg acccctataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc ttttttgcct 60 tctgacttct ttccgtcggt gcgggacctc ctagataccg tctctgctct gtatcgggaa 120 gccttaaaat ctcctgagca ttgctcacct caccacacag cactcaggca agctattctg 180 tgctgggggg aattaatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca 240 tcccgggatc tagtagtcaa ttatgttaac actaacatgg gcctaaagat caggcaacta 300 tggtggtttc acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttctgga atatttggta 360 tcttttggag tgtggattcg cactcctcct gcctacagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatca ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tcccaatgtt ag 552 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(29) <223> HBV genotype D preC region <400> 13 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr 1 5 10 15 Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly 20 25 <210> 14 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B Virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(183) <223> HBV genotype D C region <400> 14 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 15 <211> 87 <212> DNA <213> Hepatitis B Virus <220> <221> gene <222> (1)..(87) <223> HBV genotype D preC region <400> 15 atgcaacttt ttcacctctg cctaatcatc tcttgttcat gtcctactgt tcaagcctcc 60 aagctgtgcc ttgggtggct ttggggc 87 <210> 16 <211> 552 <212> DNA <213> Hepatitis B Virus <220> <221> gene <222> (1)..(552) <223> HBV genotype D C region <400> 16 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc atttttgcct 60 tctgactttt ttccttcggt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggat 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagca 240 tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaacta 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagtcataga gtatttggtg 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgtt ag 552 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested PCR 1st set: sense primer CoreF1 <400> 17 aacgaccgac cttgaggcat actt 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested PCR 1st set : antisense primer CoreR1 <400> 18 atttggtaag gttaggatag aa 22 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested PCR 2nd set : sense primer CoreF2 <400> 19 gagttggggg aggagattag gtta 24 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested PCR 2nd set : antisense primer CoreR2 <400> 20 cactcaggat taaagacag 19

Claims (14)

1. HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산은 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y); 131번째 아미노산은 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P); 181번째 아미노산은 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P); 및 preC 영역의 29번째 아미노산은 글라이신에서 아스파르트산 (G29D)으로의 변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이에 대응하는 코돈 변이를 코딩하는 부위를 포함하는 뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 프로브 및 프라이머를 포함하며,
   상기 프로브 및 프라이머는 각각 단독으로 또는 함께 사용되고,
   상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기 순서를 따르며, A형의 경우 상기 181번째는 183번째에 해당하고, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 HBV는 A 또는 C형인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 HBV의 코어 단백질 preC 영역은 서열번호 1, 5, 9 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 C 영역은 서열번호 2, 6, 10 또는 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머는 상기 변이 부위를 각각, 또는 두 개 이상의 변이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍, 또는 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍인, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 조성물.
   
9. 삭제
10. 제 1 항에 따른 조성물을 포함하는 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 키트.
    
11. 삭제
12. HBe 항원 음성 HBV 감염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    i) HBV 감염 여부 검출이 필요한 환자 유래의 핵산 시료를 제공하는 단계;
    ii) 상기 수득한 핵산 시료 중 HBV의 코어 단백질 C 영역의 50번째 아미노산의 프롤린에서 알라닌, 히스티딘 또는 타이로신(P50A/H/Y) 중 하나 이상으로의 변이; 131번째 아미노산의 알라닌에서 글라이신, 아스파라진 또는 프롤린(A131G/N/P) 중 하나 이상으로의 변이; 181번째 아미노산의 세린에서 히스티딘 또는 프롤린 (S181H/P) 중 하나 이상으로의 변이; preC 영역의 29번째 아미노산의 글라이신에서 아스파르트산 (G29D) 변이에 대응하는 하나 이상의 코돈을 코딩하는 염기 서열을 결정하는 단계로, 상기 각 아미노산 잔기 번호는 HBV 유전자형 A 형 내지 H 형 중 어느 하나의 preC 및 C 영역의 상응하는 잔기 순서를 따르며, A형의 경우 상기 181번째는 183번째에 해당하고; 그리고
    iii) 상기 단계 ii)에서 상기 하나 이상의 변이가 검출된 경우, 이를 HBe 항원 음성 HBV 감염 진단과 연관시키는 단계를 포함하는, HBe 항원 음성 HBV 감염 진단용 마커의 검출방법.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 환자 유래의 핵산 시료는 간 조직, 간 세포, 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇨에서 추출된 것인, 검출 방법.
    
14. 제 12 항에 있어서, 상기 염기서열 분석은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법 중 하나 이상의 방법으로 수행되는 것인, 검출 방법.
    

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