KR100832738B1

KR100832738B1 - 펩타이드 핵산 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한표적 유전자의 검출 방법

Info

Publication number: KR100832738B1
Application number: KR1020070006874A
Authority: KR
Inventors: 곽규범; 윤홍식; 이승구
Original assignee: 포천중문의과대학교 산학협력단
Priority date: 2007-01-23
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2008-05-27

Abstract

본 발명은 (a) 마이크로어레이용 고체 지지체 상에 5 내지 30개의 염기서열을 갖는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 고정화(immobilization)하여 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이(PNA probe-immobilized microarray)를 준비하는 단계; (b) 상기 PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 표적 유전자 증폭용 정방향 프라이머(forward primer)의 5'-말단에 결합시키는 단계; (c) 표적 유전자 증폭용 역방향 프라이머(reverse primer)에 하나 이상의 형광물질을 결합시키는 단계; (d) (b)단계 및 (c)단계에서 얻어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여, 검체로부터 얻은 핵산 시료의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및 (e) (d)단계에서 얻어진 PCR 산물을 (a)단계에서 얻어진 마이크로어레이에 가하여 표적 유전자의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 표적 유전자의 검출 방법에 관한 것이다.

펩타이드 핵산, 단일염기다형, 마이크로어레이

Description

펩타이드 핵산 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 표적 유전자의 검출 방법{Methods for detecting a target gene using a peptide nucleic acid probe immobilized microarray}

도 1은 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)의 일반 구조를 나타낸다.

도 2는 본 발명에 따라 인식서열(addressor) 및 형광물질이 각각 결합된 프라이머의 구조를 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따라 PNA를 프로브로 사용하여 제작한 PNA-DNA 혼성화 칩( Hybridization chip)의 일 예를 나타낸다.

도 4는 본 발명에 따라 제작한 프라이머쌍을 사용하여 다중 PNA 클램핑 PCR (Multiplex PNA clamping PCR)을 수행하여 얻어진 결과를 나타낸다.

도 5 내지 도 7은 본 발명에 따라 제작한 PNA-DNA 혼성화 칩을 사용하여 Traf-1 내 존재하는 SNP의 유전자형(genotype)을 분석한 결과로서, 각각 샘플 LR11, KHG, 및 HR2에 대한 결과를 나타낸다.

본 발명은 펩타이드 핵산 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 표적 유 전자의 검출 방법에 관한 것이다.

인간을 포함한 다양한 동물 및 식물의 게놈 프로젝트가 완성됨에 따라, 종래의 분석 방법으로는 감당하지 못할 만한 양의 생명 정보가 발표되고 있으며, 이러한 정보의 중심이 되는 방대한 양의 염기서열들은 각 유전자들의 기능과 역할, 그리고 다양한 질병에 관계된 유전자들을 찾을 수 있는 계기를 마련해 주었다. 무수히 많은 유전자들의 기능과 역할을 분석하기 위하여, 짧은 시간 동안 다량의 유전자들을 검색할 수 있는 방법으로서, 바이오칩(Bio chip)에 의한 분석방법이 다양하게 연구되고 있다.

바이오칩 기술을 크게 방법을 기준으로 하여 나누면, 칩의 제작(Fabrication), 칩 상에서의 생화학적 반응(Lab on a chip), 동정(Detection), 분석(Analysis), 적용(Application) 등의 5 가지로 나눌 수 있다. 다양한 소재를 이용한 칩의 제작(fabrication)의 경우 칩의 재료, 칩의 표면 가공, 칩에 부착되는 물질 등에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있고, 칩 상에서의 생화학적 반응(Lap on a chip)의 경우 칩에 사용되는 시료들의 주입, 전처리, 화학반응, 분리/분석 등에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

마이크로어레이(microarray)라 함은 DNA, 단백질 등의 생물분자 분자가 고체 지지체(즉, 기판) 상의 일정한 영역에 고밀도로 고정화된 것을 말하며, 칩(chip)으로도 불리운다. 이러한 마이크로어레이에는 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 마이크로어레이가 포함된다. 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호는 생물분자를 검출할 수 있는 마이크로어레이를 개시하고 있으며, 상기 마이크로어레이 는 포토리소그래피 등의 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드 마이크로어레이를 제조하거나, 이미 합성된 폴리뉴클레오티드를 예를 들어 스팟팅법, 잉크젯 프린터와 같은 압전 인쇄 방식(piezoelectric printing), 및 마이크로 피펫팅법 등의 고정화 방법으로 고정화시켜 마이크로어레이(또는 칩)를 제조할 수다.

펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)이란 핵산염기(nucleobases)를 갖는 천연 펩타이드-유사 지지체(backbone)을 갖는 분자로서, 통상의 올리고뉴클레오티드 보다 더 높은 친화성(affinity)으로 상보적인 RNA 또는 DNA와 혼성화한다. PNA의 분자구조는 DNA와 유사하지만, 데옥시리보오스 포스페이트 지지체가 아마이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글라이신 단위체로 치환되어 있다(도 1 참조). 또한, PNA는 핵산분해효소(nucleases) 및 단백질분해효소(proteases)에 대해서도 저항성(resistant)을 가진다. PNA는 안티센스 시약으로서, DNA-opner로서, 또는 PCR-억제(clamping) 또는 단일염기다형(single nucleotide polymorphism, SNP) 검출을 위한 도구로서 사용될 수 있다. PNA는 DNA 또는 RNA 자체보다 DNA 또는 RNA에 더 높은 선택성을 가지며, 더욱 강한 결합을 나타낸다. 또한, PNA는 DNA보다 같은 온도를 가할 경우 먼저 주형(template)과 결합하며, 상보적 서열과 결합할 경우 오히려 DNA 보다 강력하게 결합할 뿐만 아니라 효소(enzyme)에도 견딜 수 있는 효소 내성을 지니고 있다. 이러한 성질은 혼성화(hybridization) 이후 세척 과정에서 발생되는 DNA들의 소실을 기존의 마이크로어레이보다 줄일 수 있을 뿐만 아니라 반영구적인 수명을 기대할 수 있다. 따라서, 칩-고정 결합 분자(chip-bound capture molecules)로서 DNA 올리고머 대신 PNA를 사용할 경우 높은 감 도(sensitivity) 및 안정성(stability)을 가질 것으로 예상된다.

그러나, PNA 탐침이 고정된 유전자 검출용 마이크로어레이를 제작하여, 중합효소 연쇄 반응(polymeraze chain reaction, PCR)을 이용하여 표적 유전자를 검출하는 경우, 표적 유전자가 달라질 때마다 마이크로어레이에 고정되는 PNA 탐침을 새롭게 설계하여 마이크로어레이를 제작하여야 하므로, 많은 시간과 비용이 소모되는 문제가 있다.

본 발명자들은 표적 유전자의 종류와 관계없이 범용적으로 사용될 수 있는 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 유전자의 검출 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 인식서열(addressor)로 사용하여 표적 유전자 증폭용 프라이머에 연결시켜 PCR을 수행한 후, 얻어진 PCR 산물 중의 해당 인식서열의 검출을 수행할 경우, 이미 제작된 마이크로어레이를 다시 제작하지 않고 그대로 사용할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 인식서열(addressor)로 사용하여 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 표적 유전자의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 마이크로어레이용 고체 지지체 상에 5 내지 30개의 염기서열을 갖는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 고정화(immobilization)하여 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이(PNA probe- immobilized microarray)를 준비하는 단계; (b) 상기 PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 표적 유전자 증폭용 정방향 프라이머(forward primer)의 5'-말단에 결합시키는 단계; (c) 표적 유전자 증폭용 역방향 프라이머(reverse primer)에 하나 이상의 형광물질을 결합시키는 단계; (d) (b)단계 및 (c)단계에서 얻어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여, 검체로부터 얻은 핵산 시료의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및 (e) (d)단계에서 얻어진 PCR 산물을 (a)단계에서 얻어진 마이크로어레이에 가하여 표적 유전자의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 표적 유전자의 검출 방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 PNA는 고상 합성(Solid Phase Synthesis) 방법 등을 사용한 커플링-캡핑-디프로텍팅(Coupling-Capping-Deprotecting)를 통하여 원하는 염기서열을 갖도록 제조할 수 있다. 상기 PNA의 염기서열의 길이는 크게 제한되지는 않으나, 약 5 내지 30개, 바람직하게는 약 10 내지 20개의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

마이크로어레이용 고체 지지체(solid support)는 생물분자 검출용 마이크로어레이 분야에서 통상적으로 사용되는 고체 지지체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 나일론 막, 유리 슬라이드 등을 포함한다.

PNA 탐침은 마이크로어레이용 고체 지지체 상에 아미노기, 알데히드기, 에폭사이드기, 에스테르기 등의 통상의 관능기를 매개로 고정화시킬 수 있다. 예를 들어, 실리콘 기판의 아미노실란-변형 표면(aminosilane modified surface)을 디숙신 이미딜 카본(disuccinimidyl carbon, DSC), 디숙신이미딜 옥살레이트(disuccinimidyl oxalate, DSO), 수베린산 비스(N-히드록시숙신이미드 에스테르)(suberic acid bis(N-hydroxysuccinimide ester)) 등의 호모-이중관능기적(homo-bifunctional) 링커로 활성화시킨 후, 고체 지지체 표면에 PNA를 스팟팅(spotting)함으로써, 고정화시킬 수 있다. 상기 스팟팅은 마이크로스팟팅 핀(Telechem)이 장착된 자동 스팟터(예를 들어, Engineering Services Inc.)를 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 검출 방법에서, 인식서열(addressor)로 사용하는 PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열은 자동합성기(예를 들어, 433A Peptide Synthesizer, Applied Biosystems사) 등을 사용하여 통상의 방법에 따라 제조할 있다. 또한, 표적 유전자 증폭용 정방향 및 역방향 프라이머도 통상의 방법에 따라 합성할 수 있다. 상기 표적 유전자는 검출 목적에 따라 다양한 유전자일 수 있으며, 유전자 전체 또는 유전자의 일부(즉, 단편)일 수 있다. 표적 유전자가 유전자의 단편인 경우, 해당 표적 유전자는 단일염기다형(single nucleotide polymorphism) 또는 돌연변이(mutation)를 포함하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 검출방법에 있어서, 상기 인식서열(addressor)은 표적 유전자 증폭을 위한 정방향 프라이머(forward primer)의 5'-말단에 결합되며, 3'-방향에서 5'-방향으로 단일염기가 하나씩 차례로 붙으면서 염기사슬(올리고뉴클레오타이드)을 신장시키는 방법을 통해 합성할 수 있다. 또한, 표적 유전자 증폭용 역방향 프라이머(reverse primer)에는 하나 이상의 형광물질(예를 들어, Cye3, Cye5 등의 형 광물질)이 결합된다. 형광물질은 3'-방향에서 5'-방향으로 단일염기가 하나씩 차례로 붙으면서 염기사슬(올리고뉴클레오타이드)을 신장시키며, 결합된 염기의 5'-OH를 보호하고 있는 보호기(예를 들어, DMTr 기)가 제거하고, 형광 물질(예를 들어, Cye3, Cye5)을 결합시킬 수 있다.

상기한 인식서열이 결합된 정방향 프라이머 및 형광물질이 결합된 역방향 프라이머를 사용하여, 검체로부터 얻은 핵산 시료의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행한다. PCR 은 통상의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어 PNA와 DNA 올리고머의 어닐링(annealing) 온도 및 시간을 각각 약 67 ℃ 및 약 61 ℃로 설정하고, 변성화 구간은 약 94 ℃, 그리고 나머지 신장(elongation) 구간은 약 72 ℃로 설정하고, PCR 반응물의 체적을 약 25 ul로 하여 PCR을 수행함으로써, PCR 산물을 얻을 수 있다. 상기 PCR은 분석하고자 하는 표적 유전자에 따라 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 단일염기다형(SNP)의 유전자형(genotype)을 분석하고자 하는 경우에는 다중 PNA 클램핑 PCR (Multiplex PNA clamping PCR)을 수행할 수도 있다.

상기와 같이 얻어진 PCR 산물은 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이에 가함으로써, 표적 유전자의 존재 여부를 검출할 수 있다. 상기 검출은 ScanArray 400XL(Packard BioScience)등의 기기를 이용하여 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 표적 유전자의 선정

유전자로는 TRAF-1(TNF receptor associated factor-1) 유전자를 선정하였다. TRAF-1 유전자는 하기 3개의 단일염기다형(서열번호 1 내지 3)을 포함한다(표 1 참조). 본 발명자들은 PNA-억제 중합효소 연쇄반응(PNA clamping PCR) 등의 예비시험을 통하여, Traf-1 유전자의 상기 SNP의 유전자형이 GAG 및 CGA 임을 밝혀냈다.

유전자: Traf-1 (NM_005658.3)			위치
표적 SNPs	rs2241003 [C/G]	서열번호 1	3'UTR
	rs9886724 [A/G]	서열번호 2	3'UTR
	rs3561847 [A/G]	서열번호 3	프로모터 부위(5'UTR)

실시예 2. PNA 탐침의 제작 및 고정화

마이크로어레이 고체 지지체 상에 고정되는 PNA 탐침으로서, 하기 표 2의 서열을 갖는 PNA 탐침을 제작하였다. 즉, cycling Bts Monomer에 의한 PNA 올리고머의 고상 합성(Solid Phase Synthesis) 방법에 의해 커플링-캡핑-디프로텍팅(Coupling-Capping-Deprotecting)을 통하여 PNA 탐침을 제작하였다.

서열번호	올리고명(Oligo name)	서열(N-C)
4	Traf-1-1AFC	TCGCTACAGATAACGG
5	Traf-1-2AFC	AACCGCATATTGACCG
6	Traf-1-3AFC	GCTATATCGGCGTAGG
7	Traf-1-4AFC	CCGCCTTGAAGCCTAA
8	Traf-1-PC	ACGGGATGTTGTGCTA

상기와 같이 제작된 각각의 PNA 탐침을 Q-array mini(Genetix Ltd., UK)를 이용하여 스팟팅(spatting)하여 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이(PNA probe-immobilized microarray)를 제작하였다.

실시예 3. 프라이머의 제작

서열번호 1 내지 3의 SNP를 증폭하기 위한 프라이머를 제작하였으며, 제작된 프라이머의 서열은 다음 표 3과 같다.

서열번호	올리고명(Oligo name)	방향	서열(5'-3')
9	T2241003F	정방향	TTTCCAGAACCCCTGTAGCTCTAGGA
10	T2241003R	역방향	GTTTGAATGCAGTCTGTCCAGGCTC
11	T9886724F	정방향	CGTTTTCAAGTCGGTACTCTTCCCTT
12	T9886724R	역방향	GAGATGCAGCCATTCTTTCAGCAAA
13	T3561847F	정방향	GTACATCAGGACCTCCACCCCCATA
14	T3561847R	역방향	GCGAGAGTAGATGTAGAAATTGGAGACG

실시예 4. 인식서열( addressor ) 및 형광물질의 결합

실시예 2에서 제조한 PNP 탐침과 혼성화할 수 있는 인식서열(addressor)을 실시예 3에서 제작된 정방향 프라이머에 결합시켜 인식서열이 결합된 정방향 프라이머를 제작하였다 (하기 표 4 및 도 2 참조).

서열번호	올리고명(Oligo name)	서열(5'-3')
15	T2241003MAF	TCGCTACAGATAACGG-TTTCCAGAACCCCTGTAGCTCTAGGA
16	T9886724MAF	AACCGCATATTGACCG-CGTTTTCAAGTCGGTACTCTTCCCTT
17	T3561847MAF	CCGCCTTGAAGCCTAA-GTACATCAGGACCTCCACCCCCATA

또한, Cye3 및 Cye5를 단일염기가 하나씩 차례로 붙으면서 염기사슬(올리고뉴클레오타이드)을 신장시키면서, 결합된 염기의 5'-OH를 보호하고 있는 DMTr기가 제거되고, 여기에 형광 물질(Cye3, Cye5)을 결합시켜 실시예 3에서 제작된 역방향 프라이머에 결합시켜, 형광물질이 결합된 역방향 프라이머를 제작하였다 (표 5 및 도 2 참조).

올리고명(Oligo name)	서열(5'-3')
Traf-1-PC(양성 대조군)	cy3-ACGGGATGTTGTGCTA
Traf-1-PC(양성 대조군)	cy5-ACGGGATGTTGTG CTA
T2241003MF3R(1SET)	cy3-GTTTGAATGCAGT CTGTCCAGGCTC
T2241003MF5R(2SET)	cy5-GTTTGAATGCAGT CTGTCCAGGCTC
T9886724MF3R(1SET)	cy3-GAGATGCAGCCAT TCTTTCAGCAAA
T9886724MF5R(2SET)	cy5-GAGATGCAGCCAT TCTTTCAGCAAA
T3561847MF3R(1SET)	cy3-GCGAGAGTAGATG TAGAAATTGGAGACG
T3561847MF5R(2SET)	cy5-GCGAGAGTAGATG TAGAAATTGGAGACG

실시예 5. 중합효소 연쇄 반응 및 분석

어닐링 온도를 PNA와 DNA 올리고머에 각각 따로 준 상태(PNA-67℃, DNA-61℃)에서 실시예 4에서 제작한 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가하여 다중 PNA 클램핑 PCR (Multiplex PNA clamping PCR)을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 전기영동을 통해 분석하였으며, 그 결과를 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 2% 아가로스 겔상에서 확인하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.

실시예 6. PNA - DNA 혼성화 칩( hybridization chip )의 혼성화 및 분석

다중 PNA 클램핑 PCR 과정을 거쳐 얻은 PCR 산물을 프로브를 심어놓은 실시예 2에서 제작한 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이 고체 지지대 위에 적당량 분주하여 혼성화시킨 다음, scan array 4000XL(PerkinElmer, Inc. Boston, USA)를 통해 샘플의 Traf-1내 존재하는 각각의 SNP들의 유전자형(genotype)을 분석하였다. PCR 산물과 상기 칩(chip)과의 혼성화 과정은 아래와 같다.

실시예 5에서 얻어진 다중 PNA 클램핑 PCR 산물 100㎕를 Wizard PCR clean up kit (Promega사, USA)를 이용하여 PCR 산물 내 존재하는 연쇄 중합 반응되지 않은 잔여 프라이머, 다수의 염, 작은 DNA 조각 내지 protein등을 제거하였다. 얻어진 PCR 산물은 각각 cy3 와 cy 5로 나누어 5∼7 ㎕와 양성 대조군(positive control) 5㎕를 E-tube에 넣고 혼합시킨 다음 95℃에서 5분 정도 변성(denature) 시켰다. 변성시킨 혼합물은 4 ℃에 2분 정도 식혔다. PNA 어레이 혼성화 용액(PNA array hybridization solution)은 cy 3, cy 5 PCR 산물에 대략 15 ㎕씩 들어가므로 총 30 ㎕를 준비하여 PNA 어레이 혼성화 용액의 농도는 1×로 진행하였으며, 비특이적으로 잔여 프라이머, 작은 DNA 조각들이 PNA 프로브나 고체 지지대 주변에 붙지 않게 하기 위하여 PNA 어레이 혼성화 용액 15 ㎕당 BSA (10 mg/mL) 0.5 ㎕ 및 Salmon sperm DNA(0.1 mg/mL) 0.2 ㎕를 첨가하였다. PCR 산물인 cy 3, cy 5 혼합물에 PNA 어레이 혼성화 용액 17㎕ 섞어 준 다음, PNA가 프로브로 심어져 있는 고체 지지대 위에 스팟(spot)이 찍혀져 있는 4개의 구획 중 왼쪽 2칸은 cy 3 혼합물 20 ㎕을 분주하고, 오른쪽 두 칸은 cy 5 혼합물 20 ㎕을 분주하였다 (도 3 참조). 그 후 그 위를 커버 글라스(cover glass)로 덮어 주고 혼성화 체임버에 칩을 넣은 다음 55℃에서 2시간 정도 방치하였다. 2시간 후 칩을 PNA 세척용 완충액(PANAGENE 사, Deajeon, Korea)으로 총 3회 (15분) 세척한 다음, scan array 4000XL(PerkinElmer, Inc. Boston, USA)을 이용하여 각각의 cy 3, cy 5 구획에서의 spot의 존재 여부를 통해 SNP의 유전자형(genotype)을 분석하였다.

샘플 LR11은 클램핑되는 쪽은 cy 3를 가진 프라이머를 사용한 쪽이고 그와 반대로 cy 5를 가진 프라이머를 사용한 쪽은 클램핑이 되지 않아 PCR 산물이 산출된다 (도 5 참조). 샘플 KHG는 각각의 SNP들이 모두 나타나는 헤테로형(heterotype)이기 때문에 클램핑되는 쪽은 cy 3와 cy 5를 가진 모든 프라이머에서 PCR 산물이 산출된다 (도 6 참조). 샘플 HR2은 클램핑되는 쪽은 cy 5를 가진 프라이머를 사용한 쪽이고 그와 반대로 cy 3를 가진 프라이머를 사용한 쪽은 클램핑이 되지 않아 PCR 산물이 산출된다 (도 7 참조).

본 발명의 검출방법은 PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 인식서열(addressor)로 사용하여 표적 유전자 증폭용 프라이머에 연결시켜 PCR을 수행한 후, 얻어진 PCR 산물 중의 해당 인식서열의 검출을 수행할 수 있으므로, 이미 제작된 마이크로어레이를 다시 제작하지 않고 그대로 사용하면서, 상기 인식서열만을 각각의 프라이머에 연결시켜 분석할 수 있으므로, 기 제작된 마이크로어레이를 범용적으로 사용되도록 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) 마이크로어레이용 고체 지지체 상에 5 내지 30개의 염기서열을 갖는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 고정화(immobilization)하여 PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이(PNA probe-immobilized microarray)를 준비하는 단계;

(b) 상기 PNA의 염기서열에 상보적인 염기서열을 표적 유전자 증폭용 정방향 프라이머(forward primer)의 5'-말단에 결합시키는 단계;

(c) 표적 유전자 증폭용 역방향 프라이머(reverse primer)에 하나 이상의 형광물질을 결합시키는 단계;

(d) (b)단계 및 (c)단계에서 얻어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여, 검체로부터 얻은 핵산 시료의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및

(e) (d)단계에서 얻어진 PCR 산물을 (a)단계에서 얻어진 마이크로어레이에 가하여 표적 유전자의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는,

PNA 탐침이 고정화된 마이크로어레이를 이용한 표적 유전자의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 PNA가 10 내지 20개의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 유전자가 단일염기다형(single nucleotide polymorphism) 또는 돌연변이(mutation)를 포함하는 유전자인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 유전자가 서열번호 1 내지 3의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 TRAF-1(TNF receptor associated factor-1) 유전자인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 PNA가 서열번호 4 내지 8의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계 및 (c)단계의 표적 유전자 증폭용 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍이 서열번호 9 및 10의 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12의 프라이머쌍; 및 서열번호 13과 14의 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 얻어지는 정방향 프라이머가 서열번호 15 내지 17의 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출방법.