JP2008142020A - 核酸マイクロアレイの品質管理方法および品質管理試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】出荷前に全数検査を行わずとも核酸マイクロアレイ上の正しい位置に、正しいプローブ核酸が結合していることを保証することができる品質管理方法および品質管理試薬を提供すること。
【解決手段】複数種の核酸塩基との塩基対を形成可能な塩基を配列に含むプローブ核酸、または、あらゆる配列に個別に相補的な配列からなるプローブ核酸セット、を合成して品質管理用試薬として用意し、プローブ固定単体を検体の検査に用いる前、または検体の検査と同時に、これらの品質管理用試薬とハイブリダーゼーションさせる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸の品質管理方法、及びその方法に使用する品質管理試薬に関する。

ヒトゲノム計画に代表されるように、種々の生物について、そのゲノム遺伝子、ミトコンドリア遺伝子などの塩基配列に関して、全般的な解析がなされてきている。更には、解明された遺伝子と、生命活動のメカニズム、各種疾病、疾患、遺伝的な体質等との関連性に関する研究も進み、次々と研究成果が報告されている。これらの研究結果から、特定の遺伝子の有無、その塩基配列の変異、あるいは、その発現産物の存在量（発現量）を知ることで、例えば、各種疾病、疾患等の要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングを行う上で有用な情報が得られることが判明してきている。また、各種疾病、疾患等の要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングがなされると、効果的な治療方法の選択がより容易となり、疾患の診断のみでなく、その治療にも効果的に利用可能であることも検証されてきている。

検体中における、特定の遺伝子の有無、並びに、その発現量を検出する方法として、従来から多数の方法が提案され、また、実際に利用もされている。検出対象の遺伝子あるいは核酸分子の塩基配列が判明している場合、最も広範に利用されている手法として、プローブ・ハイブリダイゼーション法がある。この手法では、検出対象の遺伝子あるいは核酸分子の塩基配列中から特徴的な部分塩基配列を選択し、それに相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が利用される。このプローブ核酸によって、かかる特徴的な部分塩基配列を含む核酸鎖の有無、あるいは、含有量を検出する。具体的には、相補的な塩基配列を有するプローブ核酸用ＤＮＡ鎖を予め調製し、検体中に含まれる遺伝子あるいは核酸分子を一本鎖核酸とした上で、このプローブ核酸とハイブリダイゼーション反応を行わせる。この反応に基づくハイブリッド体形成の有無、あるいは、その形成量を何らかの方法を利用して検出する。

このプローブ・ハイブリダイゼーション法による、特定の核酸分子の検出方法は、形成されるハイブリッド体を分離可能であれば、ハイブリダイゼーション反応自体は、液相中、あるいは、固相担体上のいずれで行ってもよい。例えば、固相担体上でハイブリダイゼーション反応を行う場合には、予め、プローブ核酸を固相担体上に結合、または、吸着によって、固定化しておき、形成されるハイブリッド体を固相上に固定、分離する。その際、検体中に含まれる核酸試料に対して、何らかの検出可能な標識物質によって標識化を施しておき、プローブ核酸とハイブリッド体を形成して、固相上に固定、分離された標識化核酸鎖の有無またはその量を、該標識物質に起因する信号を利用して、測定する。また、プローブ核酸の固定用固相（基材）としては、ガラスや金属などの平面基板表面を用いるチップ、あるいは、微小粒子表面を用いるビーズ等が体表的な形態である。

プローブ・ハイブリダイゼーション法において、固相上に固定化されたプローブ核酸を利用するハイブリダイゼーション反応が好まれる理由の第一は、Ｂ／Ｆ分離が容易であることである。加えて、固相上の所定位置に固定化されているプローブ核酸を利用するため、検出領域を物理的に微小化でき、また、検出領域が特定されている結果、高感度の測定が可能となる。その際、複数種のプローブ核酸の固定位置を物理的に隔離することにより、同時に、多項目の検出が可能である。さらには、予め、所定量のプローブ核酸が固相上に固定化されている核酸マイクロアレイ（またはＤＮＡチップ）の形態を選択すると、その取扱いや応用が一層容易になる利点もある。

例えば、特許文献１には、平面基板上において合成されたオリゴＤＮＡに対し、蛍光色素で標識された核酸を作用させ、その結果形成されるハイブリッド体を、蛍光標識に由来する蛍光により検出する手法が開示されている。この基板上において合成されたオリゴＤＮＡで構成されるＤＮＡアレイと、蛍光色素標識による蛍光検出法を利用することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量の検出を可能としている。

また、特許文献２には、基板表面に予め導入されたアミノ基を利用して、別途作製した複数種のプローブ核酸を固定化する手法を応用してＤＮＡアレイを作製することについて開示されている。特許文献２では、このＤＮＡアレイを用いて、標識された２２ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを検出している。
米国特許第６４１０２２９号明細書 特開２００１−１２８６８３号公報

一般に、核酸マイクロアレイは、ピン法やインクジェット法等に代表される、液滴を精密に配置できる装置を用いて、プローブ核酸溶液を固相担体上にスポッティングして作成されている。従って、核酸マイクロアレイの品質管理としては、核酸マイクロアレイ上の正しい位置に、正しいプローブ核酸が配置され、かつ結合していることを判定することが重要である。正しい位置に、正しいプローブ核酸が配置されているということの判定は、顕微鏡等を利用することによって、製造した核酸マイクロアレイのすべてについて行うことが可能である。さらに、抜き取り検査を行い、実際にハイブリダイゼーションを行うことによって、プローブ核酸が正しく配置されているということだけでなく、プローブ核酸が結合していることの判定を行うことができる場合もある。しかし、これは製造した一部の核酸マイクロアレイについてのみ実施可能でしかない。核酸マイクロアレイの製造において、特にアミノ化基やチオール基で修飾されたオリゴＤＮＡをガラス等の固相担体上に共有結合で固定化する反応を行う場合は、プローブ核酸ＤＮＡの結合の程度はガラスの表面処理状態や結合反応の条件に大きく依存する。そのため、プローブ核酸ＤＮＡが正しく配置されていることを判定するだけでは十分でなく、さらに結合していることを判定することが重要な品質管理項目となる。しかし、製造した核酸マイクロアレイすべてに対して抜き取り検査を行うことは困難である。また、仮に抜き取り検査を行うとしても、核酸マイクロアレイ上のスポットのすべてを同時に検査することのできるプローブ検査用の標的核酸を調整することは困難であるという課題があった。

従って、本発明の目的は、出荷前に全数検査を行わずとも核酸マイクロアレイ上の正しい位置に、正しいプローブ核酸が結合していることを判定できる品質管理方法を提供することである。また本発明の他の目的は、出荷前に全数検査を行わずとも核酸マイクロアレイ上の正しい位置に、正しいプローブ核酸が結合していることを判定できる品質管理試薬を提供することである。

本発明者等は鋭意検討した結果、上記問題点を解決する方法として、以下の方法を見いだすに至った。

すなわち、本発明の第一の態様は、ハイブリダイゼーションによる核酸マイクロアレイの品質管理方法であって、
（ｉ）品質管理用オリゴ核酸を核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程と、
（ｉｉ）前記品質管理用オリゴ核酸と前記プローブ核酸とのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、を有し、
前記品質管理用オリゴ核酸が、複数種の塩基と塩基対を形成することができる特殊塩基を少なくとも１塩基以上含む配列からなることを特徴とする、核酸マイクロアレイの品質管理方法である。

本発明の第二の態様は、ハイブリダイゼーションによる核酸マイクロアレイの品質管理方法であって、
（ａ）品質管理用オリゴ核酸セットを核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程と、
（ｂ）前記品質管理用オリゴ核酸セットと前記プローブ核酸とのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、を有し、
前記品質管理用オリゴ核酸セットが、配列上の少なくとも１塩基以上にミックス塩基を用いて合成して得られる複数のオリゴ核酸からなることを特徴とする核酸マイクロアレイの品質管理方法である。

本発明の第三の態様は、複数種の塩基と塩基対を形成することができる特殊塩基を少なくとも１塩基以上含む配列からなる品質管理用オリゴ核酸、または配列上の少なくとも一塩基以上にミックス塩基を用いて合成して得られる複数のオリゴ核酸からなる品質管理用オリゴ核酸セットを含む、核酸マイクロアレイの品質管理試薬である。

本発明にかかる核酸マイクロアレイの品質管理方法を用いることにより、出荷前に全数検査を行わずとも核酸マイクロアレイ上の正しい位置に、正しいプローブ核酸が結合していることを判定することができる。

以下により具体的な構成例について記載するが、本発明は下記方法に限定されるものではない。
本発明におけるプローブ核酸としては、プローブ・ハイブリダイゼーション法で通常用いられる核酸をいずれも好ましく用いることができる。具体的にはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびその誘導体を少なくとも一つ以上含んで構成されるポリヌクレオチドを挙げることができる。ＰＣＲなどで調製されたもの、化学的に合成されたもの、天然に由来する核酸を、そのまままたは加工して使用したものなどいずれも使用することができるが、調製の容易さから化学的に合成されたものを使用するのが好ましい。さらに合成の容易さから、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ＰＮＡ(ペプチド核酸)等を使用するのが好ましい。
プローブ核酸を固相担体上に固定化させる方法としては、インクジェット法等により製造することができ、例えば、特開平１１−１８７９００号公報に記載された方法などを用いて好適に製造することができる。

本発明に係る標的核酸とは、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されたプローブ核酸と相補性を有し、ハイブリダイゼーションによって当該プローブ核酸とのハイブリッド体を形成することができる核酸をいう。本発明において標的核酸という場合、品質検査時に用いる品質管理用標的核酸と、検体検査において検体中に含まれる標的核酸（検体由来標的核酸）とを区別して用いる。
本発明において検体とは、ＤＮＡマイクロアレイに供して標的核酸の有無、又は量を検査するために、検査対象となる細胞、生体等の試料から調製して得られるものである。そのようなものとして、例えば細胞、組織等から抽出されたｍＲＮＡを逆転写して得られる一本鎖または二本鎖ｃＤＮＡなどが挙げられる。
（核酸の標識）
検体由来標的核酸もしく品質管理用標的核酸と核酸プローブとのハイブリッド体のシグナルの発信を可能とするために、これらの標的核酸、または、これらと核酸プローブとのハイブリッド体を標識する必要がある。標識法には標的核酸分子を予め標識する直接法と、ハイブリダイゼーション中または後に標識を付与する間接法があり、いずれも使用することができるが、良好な検出結果を得るためには直接法を用いることがより好ましい。標的核酸に、標識物質を取り込ませる方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅を行う際に、標識付きデオキシヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰなど）を付加する方法がある。また、ＰＣＲ増幅を行う際、基質となる４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：総称してｄＮＴＰ）と標識付きデオキシヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）をそれぞれ調製して、各ｄＮＴＰの終濃度を揃える。そうすることで、作製される増幅産物中に標識付きデオキシヌクレオチドを取り込ませる方法もある。

また、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する方法が知られている。この予め標識されたプライマーを利用する場合、作製される標的核酸一分子当り、付与される標識物質の量比が制御できるという利点があり、高い定量性が要求される際には、この手法が好適である。

標識物質としては蛍光物質またはビオチンのいずれか一つ以上を含んでいることが、検出感度および標識の簡便さの点から好ましい。蛍光物質としては、従来公知の蛍光色素等をいずれも使用することが出来る。量子収率、耐光性、耐ガス性、化学的安定性、ＤＮＡポリメラーゼの基質としての特性の点においてＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ等を好ましく用いることが出来る。ビオチンおよびジゴキシゲニンの場合は、各種ビオチン結合型の標識酵素タンパク質を反応させ、かかる標識酵素タンパク質の酵素活性を指標として、検出を可能とする。

蛍光標識として利用される各種蛍光物質は、かかる蛍光物質に由来する蛍光強度を観測する光学的検出手段を利用することで、高感度の検出を可能とする。また、前記標識酵素タンパク質の酵素活性を指標とする検出法も、酵素活性は、各種発色反応を利用するものとすることで、光学的検出手段の利用が可能であり、高感度の検出を可能とする。

ハイブリダイゼーション中に標識する方法としては、インターカレーターを用いる方法がある。インターカレーターはハイブリダイゼーション溶液中に混入させて使用することができる。インターカレーターは、その特性からハイブリッド体を形成しているプローブを検出することができるため、本発明の方法に用いることでプローブが配置されているかどうか判定することができる。また、本発明の品質管理方法は、検体核酸と同時にハイブリダイゼーションさせる場合でも、検体由来の標的核酸を色素などで標識しておけば、本発明のオリゴ核酸によるハイブリッド体と区別して検出することができる。それ自身が蛍光を示す物質であってもよいが、共有結合等で蛍光物質等が結合されているものであってもよい。インターカレーターとしては、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅやｃｙｂｅｒ ｇｒｅｅｎ（アプライドバイオシステム社）などの、一般的に二本鎖ＤＮＡを染色できるものを好ましく用いることができる。
（品質管理用オリゴ核酸）
ＤＮＡマイクロアレイの品質管理方法として、抜き取り検査を行う場合は、通常は品質管理用として調製した、品質管理用標的核酸を実際に抜き取ったＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる。そうして形成される各プローブ核酸・標的核酸のハイブリッド体からのシグナルを検出することでプローブ核酸がＤＮＡマイクロアレイ上に良好に結合していたかどうかを判定する。従って、品質管理用標的核酸には、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定化されているプローブ核酸のすべてにハイブリダイズする性能が求められる。この品質管理用標的核酸は多くの場合、複数の標的核酸の混合物である。ヒトやマウスの発現解析等の特定のアプリケーションに対しては、コントロールとなるｍＲＮＡを調製して、すべてのプローブ核酸に個別的に対応する種類の標的核酸を用意し、シグナルを検出することもある。この標的核酸の調製方法は、非常に高価であるし、同方法ではアプリケーション毎にコントロールとなる標的核酸を調製する必要があり、汎用性に欠けている。

本発明では上記のように調製する品質管理用標的核酸の代わりに、すべてのプローブ核酸にハイブリダイズすることのできる品質管理用標的核酸として、次の品質管理用オリゴ核酸または品質管理用オリゴ核酸セットを用いる。すなわち、複数種の塩基と塩基対を形成することができる特殊塩基を塩基配列の少なくとも１箇所以上に用いて合成されたオリゴ核酸を用いることができる。また、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣからなるミックス塩基を塩基配列の一箇所以上に用いて合成されたオリゴ核酸セットを用いることができる。複数種の塩基と塩基対を形成可能である特殊塩基とは、いわゆるＡ−Ｔ（Ａ−Ｕ）、Ｇ−Ｃというワトソン・クリック塩基対において、一対一で塩基対を形成する生体由来の塩基ではなく、一つの塩基で２種以上の塩基と塩基対を形成することのできる塩基のことである。より具体的には、ＡＴＧＣのすべてと塩基対を形成するものとして例えば、イノシン、５−ＮｉｔｒｏＩｎｄｏｌｅあるいは３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅを挙げることができる。また、ピリミジン塩基（Ｃ， Ｔ／Ｕ）と塩基対を形成するものとしてｄＰ−（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ）、プリン塩基（Ａ， Ｇ）と塩基対を形成するものとしてｄＫ （ｐｕｒｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。これらの特殊塩基は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社やｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社からアミダイトモノマーが市販されており、通常のホスホロアミダイト法に適用することができる。これらの特殊塩基を合成の際に塩基配列の一箇所以上に使用することによって、合成されるオリゴ核酸は、複数の配列とハイブリッドを形成することができる。

また、合成の際にミックス塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのアミダイトモノマーからなる塩基混合物）を用いることによって、最終的に合成されるオリゴ核酸は、塩基配列上の特定の部位の塩基についてＡＴＧＣが混在している混合物として得ることができる。よって、この得られる混合物は、塩基配列上の１塩基以上の特定部位に関して、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣから選ばれる重複順列を構成し得る複数のオリゴ核酸からなるオリゴ核酸セットである。特定部位が２塩基以上である場合は、当該塩基は連続して位置しても不連続に位置してもどちらでも可能である。例えば、塩基配列上の不連続な２箇所の塩基について、ミックス塩基を用いて核酸合成を行う場合、特定部位に関して（Ａ、Ａ）、（Ａ、Ｔ）、（Ａ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ）、（Ｔ、Ａ）、（Ｔ、Ｔ）、（Ｔ、Ｇ）、（Ｔ、Ｃ）、（Ｇ、Ａ）（Ｇ、Ｔ）（Ｇ、Ｇ）（Ｇ、Ｃ）（Ｃ、Ａ）（Ｃ、Ｔ）、（Ｃ、Ｇ）、（Ｃ、Ｃ）のバリエーションからなる、１６種類のオリゴ核酸が合成されうる。特定部位以外の配列は同一である。オリゴ核酸ミックス塩基は用途に応じてＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの含量が調整されているアミダイトモノマーが市販されており、これも通常のホスホロアミダイト法に適用することができる。ミックス塩基を用いた合成で得られるオリゴ核酸セットには、すべてのプローブ核酸をハイブリダイゼーションにより検出できる種類のオリゴ核酸が含まれる。よって全てのプローブ核酸に個々に完全に相補的な配列からなるオリゴ核酸が含まれることが望ましいが、ミスマッチによるハイブリダイゼーションも含んですべてのプローブ核酸を検出することができる種類のオリゴ核酸が含まれていればよい。例えば、４種（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のミックス塩基を用いて２５ｍｅｒのオリゴ核酸を合成する場合、すべての種類は４の２５乗と膨大になり、各種類についてハイブリダイゼーションによる検出に必要な量が含まれるように調製するとコストが高くなる。しかし、２５ｍｅｒの末端近くにミスマッチがあってもハイブリダイゼーションは生じるため、ミスマッチも含めてすべてのプローブ核酸を検出できる程度のオリゴ核酸を含むように合成量を調製することができる。

特殊塩基またはミックス塩基を用いて合成されるオリゴ核酸の長さとしては５ｍｅｒ以上１００ｍｅｒ以下の範囲にあるものを好ましく用いることができる。オリゴ核酸中に含まれる特殊塩基およびミックス塩基の数は特には限定されないが、これらの塩基が５個以上含まれていることが好ましい。更には、これらの塩基が５個以上連続して含まれることが更に好ましい。本発明は、上記の特殊塩基を配列に含むオリゴ核酸またはミックス塩基を用いて合成されたオリゴ核酸セットを含む核酸マイクロアレイの品質管理のために提供する品質管理用試薬も包含する。
（ハイブリダイゼーション反応、及びハイブリッド体の検出）
品質管理のハイブリダイゼーションは、製造後の抜き取り検査（使用前）、実際の検体検査での使用と同時（使用中）、実際の検体検査での使用の後（使用後）のいずれにも使用することができるが、特には使用中に行うことが好ましい。この場合、検体核酸は、ハイブリダイゼーションに供せられる前に標識処理さていることが好ましい。

当該オリゴ核酸とプローブ核酸のハイブリッド体の形成を示すシグナルの検出は、検体中の標的核酸の検出と同様に行うことができるが、実際の使用と同時（使用中）に品質検査を行う場合は、検体由来標的核酸の標識とは異なる標識物質を用いることが好ましい。この場合、品質管理用の当該オリゴ核酸に合成段階で直接標識を行うのが好ましい。さらに蛍光色素を標識に用いる場合、当該オリゴ核酸の標識は、検体由来標的核酸の標識に用いた蛍光色素とは検出波長の異なる蛍光色素を用いることが好ましい。

ハイブリダイゼーションの温度は、実際の使用と同時（使用中）に品質検査を行う場合は、実際に使用するプローブ核酸と標的核酸が良好にハイブリッド体を形成できる温度範囲で行うことができる。また品質検査を製造後の抜き取り検査（使用前）に行う場合は、クロスハイブリダイゼーションが起こるがプローブ核酸と標的核酸をより確実にハイブリッド体を形成させる温度で行うこともできる。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に示す態様に限定されるものではない。

（実施例１）
＜プローブ核酸の作製＞
検出および品質管理の例として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓの１０種の菌からのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌分離検出の例を示す。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌由来の核酸分子の選択的検出用プローブ核酸として、表１に示す塩基配列を有するプローブ核酸を設計した。

具体的には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム領域の塩基配列に基づき、表１に示す６種のプローブ核酸の塩基配列を選択した。これらのプローブ核酸の塩基配列は、当該菌に対して非常に特異性が高く、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように選択されている。同時に、それぞれのプローブ核酸の塩基配列相互において、ハイブリダイゼーション感度を比較した際、感度のバラツキのないことが期待できるように設計されている。

表１中に示す各プローブ核酸に対して、ＤＮＡ鎖の合成後、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、核酸の５’末端にチオール基を定法に従って導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブ核酸は、−３０℃の冷凍庫内に保存した。

同様な設計手法により、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ菌由来の核酸分子の選択的検出用プローブ核酸として、表２に示す塩基配列を有するプローブ核酸を設計した。

＜検体中の核酸鎖増幅用ＰＣＲプライマーの作成＞
具体的には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒとして、表３に示す核酸配列を有するＤＮＡプライマーを作成した。

＜Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓＤＮＡの抽出＞
［微生物の培養とゲノムＤＮＡ抽出の前処理］
始めにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ標準株（ＡＴＣＣ １２６００）を定法に従って培養した。

この微生物培養液１８０μｌに溶菌処理用酵素溶液をＬｙｓｏｚｙｍｅ２０μｌ（酵素濃度：２０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）を加えて、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、該微生物の細胞膜の溶解処理を行った。その後、核酸抽出・精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて抽出を行った。

＜ゲノムＤＮＡ抽出物中の検体ＤＮＡのＰＣＲ増幅＞
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡ抽出物中から、検体ＤＮＡとなる、１６ｓ ｒＲＮＡの遺伝子のＰＣＲ増幅を、下記の手順・条件で行う。

先ず、上記Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を含むＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ混合物および上記Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を含むＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ混合物を用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅反応を行う。該ＰＣＲ増幅反応は、市販のＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑ）を利用して行い、その反応溶液組成を表４に示す。

一方、ＰＣＲ反応の温度条件は、下記表５に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーを利用して増幅反応を行った。

このＰＣＲ増幅反応の終了後、市販のＰＣＲ産物精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去し、ＰＣＲ増幅産物を回収した。その際得られたＰＣＲ増幅産物の定量を行った。

＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした、検体核酸の調製＞
蛍光標識としてＲｅｖｅｒｓｅ ＰｒｉｍｅｒにＣｙ３を５’末端に結合した標識付きオリゴヌクレオチドを利用して、標識化ＤＮＡ鎖の調製を下記の手順・条件で行った。

ヌクレオチド鎖の合成後、常法に従って、蛍光標識化合物Ｃｙ３を該ヌクレオチド鎖の５’末端に共有的に結合させた。その後ＨＰＬＣを用いて標識付きオリゴヌクレオチドの精製を行った。合成された標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す（表６）。

上記ＰＣＲ増幅反応で得られるＰＣＲ増幅産物を鋳型とし、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして上記塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドの混合物を利用して、相補的なＤＮＡ鎖の伸長反応を下記の手順・条件で行った。

該ＤＮＡ鎖の伸長反応は、市販のＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑ）を利用して片鎖ＰＣＲ反応の形態で実施した。その反応溶液組成を以下に示す（表７）。

一方、この伸長反応の温度条件は、下記プロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーを利用して、増幅反応を行った（表８）。

この標識反応の終了後、市販のＰＣＲ産物精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去し、５０μＬの純水で溶出し、標識された検体核酸を作成した。

＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英製ガラス基板（サイズ：２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚さ）、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中に浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、基板を取り出し、軽く純水で濯いだ（リンス洗浄）後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。その後、基板を取り出し、純水によるリンス洗浄と、超純水中で超音波洗浄を施した。以上の洗浄操作により、洗浄済みのＤＮＡチップ用石英ガラス基板を用意した。

［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に加え、室温で２時間攪拌し、均一に溶解した。続いて、前記洗浄済み石英ガラス基板をシランカップリング剤水溶液中に浸し、室温で２０分間放置した。石英ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面をリンス洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に、乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、前記アミノシランカップリング剤の基板表面への結合処理を完結させた。基板表面には、該アミノシランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。

同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を調製した。前記ベーク処理の終了後、石英ガラス基板を室温まで放冷した。次いで、表面にアミノ基が導入された石英ガラス基板を、ＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理の間に、アミノシランカップリング剤処理によって基板表面に導入されたアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、石英ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた石英ガラス基板を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒を用いて洗浄し、未反応のＥＭＣＳを除去した。さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で前記表面処理済み石英ガラス基板を乾燥した。

［３］プローブ核酸
上記の方法で作製された検出用プローブ核酸を純水に溶解し、それぞれ最終濃度(インク溶解時)が１０μＭとなるように、マイクロ・バイアルに分注した後、凍結乾燥を行った。水分を除いたプローブ核酸をそれぞれ収納するマイクロ・バイアルは、下記の手順でバブルジェット方式によるスポッティング用のＤＮＡ溶液の調製に利用した。

［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ溶液の吐出、および基板表面への固定化
グリセリン７．０ｗｔ％、エチレングリコール５．０ｗｔ％、ヘキサントリオール５．０ｗｔ％、アセチレノールＥＨ(川研ファインケミカル社製)１．０ｗｔ％を含む水溶液を調製した。続いて、先に用意した６０種類のプローブ核酸（配列番号1から６０）をそれぞれ収納するマイクロ・バイアル中に、ＤＮＡ濃度が、最終濃度(インク溶解時)１０μＭとなるように、前記混合溶媒を所定量加えて、ＤＮＡ溶液(インク)を調製した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター(商品名：ＢＪＦ−８５０、キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、基板面上へのＤＮＡ溶液のスポッティングに使用するために、前記バブルジェットプリンターは平板への印字が可能なように改造が施されている。また、このバブルジェットプリンターの印字ヘッドは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液液滴を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、上記バブルジェットプリンターを用いて、表面にマレイミド基が導入された石英ガラス基板に対して、所定の印字パターンに従って各ＤＮＡ溶液のスポッティング操作を行い、アレイを作製した。アレイ状のスポッティング操作が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、石英ガラス基板表面のマレイミド基とプローブ核酸５’末端のチオール基とを反応させ、プローブ核酸の固定を行った。

［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)により、基板表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流した。石英ガラス基板表面に目的とする複数種の一本鎖ＤＮＡがアレイ状に固定されている遺伝子チップが得られた。

＜品質管理試薬の作成＞
蛍光標識として５’末端にＣｙ５を結合した標識付きオリゴＤＮＡを品質管理用オリゴ核酸セットとして利用する。

ヌクレオチド鎖はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４種のモノマーを混合したものを用いてホスホロアミダイト法にて合成後、常法に従って、蛍光標識化合物Ｃｙ５を該ヌクレオチド鎖の５’末端に共有的に結合させた。その後ＨＰＬＣを用いて標識付きオリゴＤＮＡの精製を行った。合成された標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す（表９参照）。ミックス塩基を用いて合成することにより、表９に示す塩基配列として取り得る配列を含んだオリゴ核酸セットが得られる。

これを、１ｎｍｏｌ／１０μＬになるようにＴＥバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して品質管理試薬を作成した。

＜ハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出および、品質管理＞
前記方法で作製したＤＮＡマイクロアレイと、標識化標的核酸と、品質管理試薬を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光標識を利用して、形成されるハイブリッドを検出し、標的核酸の検出と品質管理を同時に行った。

（遺伝子チップのブロッキング）
１００ｍＭ ＮａＣｌ／ １０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ中に、ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を濃度１ｗｔ％となるように添加し、ＢＳＡ溶液を調製する。このＢＳＡ溶液中に、＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製した遺伝子チップを室温で２時間浸し、遺伝子チップの石英ガラス基板表面に対して、ＢＳＡによるブロッキング処理を施した。ブロッキング処理の終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ （ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ， Ｎａ₃Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇・２Ｈ₂Ｏ） ３０ｍＭ、ｐＨ ７．０）で、遺伝子チップの石英ガラス基板表面に残余するＢＳＡ溶液を洗浄した。次いで、純水でリンス洗浄した後、スピンドライ装置で遺伝子チップ表面の水切りを行った。

（ハイブリダイゼーション反応）
前記ブロッキング処理を施した遺伝子チップをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ． Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、標識化検体ＤＮＡとプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応を下記の手順・条件で行った。

使用したハイブリダイゼーション溶液の組成、条件を以下に示す。

［ハイブリダイゼーション溶液］
前記方法で作製した、精製済み標識化検体ＤＮＡ５０μＬと、品質管理試薬１０μＬを、１０％ＨＣＯＮＨ₂を添加した６×ＳＳＰＥ緩衝液中に溶解した溶液を使用した。
６×ＳＳＰＥ／ １０％ Ｆｏｒｍ ａｍｉｄｅ ／ Ｔａｒｇｅｔ （２ｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ 全量）
（６×ＳＳＰＥ： ＮａＣｌ ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ ６ｍＭ、ｐＨ ７．４）
［ハイブリダイゼーション条件］
ハイブリダイゼーション反応および反応後の洗浄・乾燥の操作の条件を以下に示す（表１０）。

＜ハイブリット体の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて、スピンドライ乾燥済み遺伝子チップ上の各プローブ核酸のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３およびＣｙ５由来の蛍光強度の測定を行った。（５３２ ｎｍ Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ： １００％ ＰＭＴ Ｇａｉｎ：４００ ）
以下に各プローブ核酸のスポット点で観測された蛍光強度を示す（表１１参照）。

表１１のハイブリダイゼーションの結果より、Ｃｙ３の蛍光輝度が４０００以上を示しているのは、００１＿Ｓ＿ａｕｒ＿０１〜００１＿Ｓ＿ａｕｒ＿０６のみであるためＣｙ３標識された標的核酸Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓであることが検出できる。また、Ｃｙ５の蛍光輝度はすべてのスポットで５００以上を示しており、すべてのプローブ核酸が良好に結合していることが分かる。

（実施例２）
品質管理試薬として、表１２に示す配列をもつ標識付きオリゴＤＮＡを品質管理用オリゴ核酸セットとして利用すること以外は、実施例１と同様にしてハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出および、品質管理を行った。

ヌクレオチド鎖はイノシンのアミダイトモノマーを用いてホスホロアミダイト法にて合成後、常法に従って、蛍光標識化合物Ｃｙ５を該ヌクレオチド鎖の５’末端に共有的に結合させた。その後ＨＰＬＣを用いて標識付きオリゴＤＮＡの精製を行った。合成された標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を以下に示す（表１２参照）。

＜ハイブリット体の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて、スピンドライ乾燥済み遺伝子チップ上の各プローブ核酸のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３およびＣｙ５由来の蛍光強度の測定を行った。（５３２ ｎｍ Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ： １００％ ＰＭＴ Ｇａｉｎ：４００ ）
以下に各プローブ核酸のスポット点で観測された蛍光強度を示す（表１３参照）。

表１３のハイブリダイゼーションの結果より、Ｃｙ３の蛍光輝度が４０００以上を示しているのは、００１＿Ｓ＿ａｕｒ＿０１〜００１＿Ｓ＿ａｕｒ＿０６のみであるためＣｙ３標識された標的核酸Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓであることが検出できる。また、Ｃｙ５の蛍光輝度はすべてのスポットで５００以上を示しており、すべてのプローブ核酸が良好に結合していることが分かる。

Claims (12)

1. ハイブリダイゼーションによる核酸マイクロアレイの品質管理方法であって、
   （ｉ）品質管理用オリゴ核酸を核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程と、
   （ｉｉ）前記品質管理用オリゴ核酸と前記プローブ核酸とのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、を有し、
   前記品質管理用オリゴ核酸が、複数種の塩基と塩基対を形成することができる特殊塩基を少なくとも１塩基以上含む配列からなることを特徴とする、核酸マイクロアレイの品質管理方法。
2. 前記工程（ｉ）において、標識された検体核酸と同時にハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項１に記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
3. 前記品質管理用オリゴ核酸が、前記検体核酸の標識とは異なる標識がなされている請求項２に記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
4. 前記品質管理用オリゴ核酸が蛍光色素によって標識されている請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
5. 蛍光インターカレーターを使用してプローブ核酸を検出する請求項１または２に記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
6. 前記特殊塩基として、イノシン、５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ、ｄＰまたはｄＫのいずれか１種以上を使用する請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
7. ハイブリダイゼーションによる核酸マイクロアレイの品質管理方法であって、
   （ａ）品質管理用オリゴ核酸セットを核酸マイクロアレイ上のプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせる工程と、
   （ｂ）前記品質管理用オリゴ核酸セットと前記プローブ核酸とのハイブリッド体の形成を示すシグナルを検出する工程と、を有し、
   前記品質管理用オリゴ核酸セットが、配列上の少なくとも１塩基以上にミックス塩基を用いて合成して得られる複数のオリゴ核酸からなることを特徴とする核酸マイクロアレイの品質管理方法。
8. 前記工程（ａ）において、標識された検体核酸と同時にハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項７に記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
9. 前記品質管理用オリゴ核酸セットが前記検体核酸の標識とは異なる標識がなされている請求項８に記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
10. 前記品質管理用オリゴ核酸セットが蛍光色素によって標識されている請求項７乃至９のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
11. 蛍光インターカレーターを使用してプローブ核酸を検出する請求項７または８に記載の核酸マイクロアレイの品質管理方法。
12. 複数種の塩基と塩基対を形成することができる特殊塩基を少なくとも１塩基以上含む配列からなる品質管理用オリゴ核酸、または配列上の少なくとも一塩基以上にミックス塩基を用いて合成して得られる複数のオリゴ核酸からなる品質管理用オリゴ核酸セットを含む、核酸マイクロアレイの品質管理試薬。