JP5590757B2

JP5590757B2 - 安定なハイブリッド体

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Description

本発明は、固相上プローブとサンプル核酸の安定したハイブリッド体の形成に関する。また、本発明は、かかるハイブリッド体の形成に利用されるプローブ、プローブ担体ＰＣＲ用プライマー、およびそれらの設計方法にも関する。

ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子との関連が次々と調べられている。そして、遺伝子の有無やその存在量(発現量)を知ることで、例えば病気などのより詳細な特徴やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。

検体に含まれている特定の遺伝子の有無やその存在量を調べる方法は、昔から多くの方法が考案されているが、その中でも応用範囲が広く検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子あるいは核酸の特徴的な部分配列を選び、その部分配列の有無や量を調べることにより、その有無あるいは存在量を調べる方法が広く用いられている。具体的には選び出された部分配列の相補鎖に相当する核酸配列（プローブ）を用意し、検体とプローブとがハイブリダイゼーションすることを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸配列の有無を調べる方法である。

ハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法は、固相、液相を問わず用いることが可能である。例えば液相中で行う場合には、二本鎖形成時に分光特性が変化する標識物質を結合させたプローブ溶液を準備し、これを検体に添加し、その分光特性の変化を測定することで検体中の特定核酸の有無を調べる方法がその一例である。

固相上でハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識物質により標識した検体を添加し、固相上からの標識物質の信号を測定することにより検出する方法が代表的である。中でもプローブをガラスや金属などの平面基板上に固定したマイクロアレイ、あるいは微少粒子表面へ固定したビーズ等は代表的な固相ハイブリダイゼーションの形態である。固相上のハイブリダイゼーションが好まれる理由は、Ｂ／Ｆ分離が容易であること、検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できること、複数種のプローブを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能であること、固相ゆえにその取り扱いや応用が容易に出来るからである。

たとえば米国アフィメトリックス社では、平面基板上に合成されたオリゴＤＮＡに対し、標識された核酸を作用させ、そのハイブリダイゼーションを蛍光検出により測定することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量を検出している（特許文献１参照）。また富士フィルム社においては、あらかじめアミノ基が導入された基板を用いてＤＮＡアレイを作製し、これを用いて標識された２２ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを検出している（特許文献２参照）。
米国特許第６４１０２２９号特開２００１−１２８６８３号公報

固相上のハイブリダイゼーションを利用した検出方法は従来技術の中にも記載したように、他の検出方法に比べて高感度であるという長所はあるが、微少量の核酸検出に対するニーズはそれ以上に高く、より高感度かつ高特異的な検出をするためのさらなる改良が求められている。

検出性能の向上に対応するために、様々な角度から改善が試みられている。改善方法としては、例えばターゲットを捕らえるプローブのＴｍ値を高くし、プローブとターゲットの結合力を高める方法がある。また、ターゲットに対する標識率を高める、強い信号を出す標識物質を結合させる、あるいは標識物質そのものを複数の標識物質で多重増幅（増感剤）するなどの方法が取られている。

しかし、プローブの結合力を高める方法は、非特異的な吸着や結合を引き起こし、特異性を大きく低下させる場合があり、その効果は限定的である。また、標識方法を改善する方法は、Ｓ／Ｎ比や定量性を著しく低下させる場合があり、やはりその効果は限定的である。

プローブの改良や標識方法以外に、ハイブリダイゼーション効率を改善する方法としては、プローブとターゲットが形成するハイブリッド体を安定化させる方法がある。ハイブリッド体の安定化を行うためには、ハイブリダイゼーション反応の環境、すなわち塩濃度や変性剤濃度の最適化を行う必要があるが、やはり、特異性、Ｓ／Ｎ比の低下等が生じる場合があった。

従って、核酸検出においてより効果的となる、安定したハイブリッド体の形成方法、そのためのプローブ設計方法、検体調製方法の開発等が強く望まれていた。

上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、固相上のプローブと、プローブがハイブリダイズするサンプル核酸を、特定の条件を満たす配列上の位置関係に設定することで、プローブとサンプル核酸が安定したハイブリッド体を形成することを見出した。

本発明によるハイブリッド体は、
固相に固定されたプローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ配列とにより形成されたハイブリット部を介して結合したハイブリッド体であって、
前記サンプル核酸のターゲット鎖が前記プローブ核酸のプローブ配列より長いことによって、少なくとも該ターゲット鎖の５'末端を含む部分が前記標的配列の５'側に伸びており、
かつ、該ターゲット鎖の３'末端は前記標的配列の３'側端部に相当するか、あるいは前記標的配列の３'側端部から３'方向に少なくとも１塩基分伸びた部分の先端にあり、
前記ターゲット鎖の５'末端を含む部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３'末端の前記標的配列の３'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２（但し、前記ターゲット鎖の３'末端が前記標的配列の３'側端部に相当する場合をＬ２＝０とする）と表わしたときに、Ｌ１／Ｌ２の値が０〜１．５の関係を満たすことを特徴とするハイブリッド体である。

本発明にかかるプローブは、標的配列を有するターゲット鎖に対して、上記のハイブリッド体の構成をなすように設計されたプローブであって、前記ターゲット鎖が、検出対象としての配列を有する試料、該検出対象としての配列を含むＰＣＲ増幅産物または該検出対象としての配列の逆転写産物であることを特徴とするプローブである。

本発明にかかるプローブセットは、上記プローブが２つ以上含まれるプローブのセットであり、本発明のプローブ担体は、担体上の全プローブ数の５０％以上が上記プローブセットであるプローブ担体である。

本発明にかかるプローブ設計方法は、標的配列を有するターゲット鎖に対して、上記のハイブリッド体の構成をなすようにプローブを設計するプローブ設計方法であって、前記ターゲット鎖が、検出対象としての配列を有する試料、該検出対象としての配列を含むＰＣＲ増幅産物または該検出対象としての配列の逆転写産物であることを特徴とするプローブ設計方法である。

本発明にかかるＰＣＲ用プライマーは、上記のプローブに対して、上記のハイブリッド体の構成が可能であるようなサンプル核酸を調製するためのＰＣＲ用プライマーである。

本発明にかかるサンプル核酸の検出方法は、固相に固定されたプローブ核酸に、該プローブ核酸よりも長いサンプル核酸を反応させて得られるハイブリッド体を検出することによるサンプル核酸の検出方法において、
前記プローブ核酸の配列を、以下の構成（１）及び（２）を満たすハイブリッド体を形成可能に設計されていることを特徴とする検出方法である。
（１）前記プローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ核酸とにより形成されたハイブリット部を介して結合したハイブリッド体であって、
（２）前記サンプル核酸が有するターゲット鎖の５'末端は前記標的配列の５'側端部から５’方向に少なくとも１塩基分伸びた部分の先端にあり、かつ、該ターゲット鎖の３'末端は前記標的配列の３'側端部にあるか、あるいは前記標的配列の３'側端部から３'方向に少なくとも１塩基分伸びた部分にあり、
前記ターゲット鎖の５'末端の前記標的配列の５'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３'末端の前記標的配列の３'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２（但し、前記ターゲット鎖の３’末端が前記標的配列の３'側端部にある場合をＬ２＝０とする）と表したときに、Ｌ１／Ｌ２の値が０〜１．５の関係を満たすものである。
また、本発明に係る別のサンプル核酸の検出方法は、固相に固定された複数のプローブ核酸からなるプローブセットと、サンプル核酸が有するターゲット鎖の標的配列と、を反応させて得られる１種類以上のハイブリッド体を検出することによるサンプル核酸の検出方法において、
前記プローブセットの前記プローブ核酸が、前記サンプル核酸とハイブリダイズしたときに、７０％以上の前記ハイブリッド体が以下の（１）および（２）の関係を満たすことを特徴とするサンプル核酸の検出方法：
（１）前記プローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、前記プローブセットの該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ配列とにより形成されたハイブリット部を介して結合したハイブリッド体であって、
（２）前記サンプル核酸が有するターゲット鎖は、前記プローブ核酸よりも長く、該ターゲット鎖の５’末端は前記標的配列の５’側端部から５’方向に少なくとも１塩基分伸びた部分の先端にあり、かつ、該ターゲット鎖の３’末端は前記標的配列の３’側端部から３’方向に少なくとも１塩基分伸びた部分にあり、前記ターゲット鎖の５’末端の前記標的配列の５'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３’末端の前記標的配列の３'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２と表したときに、Ｌ１≦Ｌ２の関係を満たすものである。

この方法におけるサンプル核酸が検体核酸をテンプレートとしたＰＣＲによる増幅産物である場合は、このＰＣＲ用のプライマーと前記プローブを、前記構成（１）及び（２）を満たすハイブリッド体を形成可能に設計することが好ましい。

本発明にかかるサンプル核酸検出用のキットは、検体核酸から標的配列を有するターゲット鎖を有するサンプル核酸を増幅させるためのＰＣＲ用のプライマーと、該検体核酸をテンプレートとして該プライマーを用いて増幅した増幅産物中での前記標的配列の有無を確認するための固相に固定化されたプローブ核酸とを有するサンプル核酸検出用のキットにおいて、
前記プライマーと前記プローブ核酸の配列が、以下の構成（１）及び（２）を満たすハイブリッド体を形成可能に設計されていることを特徴とするキット。
（１）前記プローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ配列とにより形成されたハイブリット部を介して結合したハイブリッド体であって、
（２）前記サンプル核酸が有するターゲット鎖の５'末端は前記標的配列の５'側端部から５'方向に少なくとも１塩基分伸びた部分の先端にあり、かつ、該ターゲット鎖の３'末端は前記標的配列の３'側端部にあるか、あるいは前記標的配列の３'側端部から３'方向に少なくとも１塩基分伸びた部分にあり、
前記ターゲット鎖の５'末端の前記標的配列の５'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３'末端の前記標的配列の３'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２（但し、前記ターゲット鎖の３'末端が前記標的配列の３'側端部にある場合をＬ２＝０とする）と表わしたときに、Ｌ１／Ｌ２の値が０〜１．５の関係を満たすものである。
また、本発明の別の一実施形態において、サンプル核酸検出用のキットは、検体核酸から標的配列を有するターゲット鎖を有するサンプル核酸を増幅させるためのＰＣＲ用のプライマーと、該検体核酸をテンプレートとして該プライマーを用いて増幅した増幅産物中での前記標的配列の有無を確認するための固相に固定化されたプローブ核酸のセットと、を有し、該プローブ核酸と、前記標的配列と、を反応させて得られる１種類以上のハイブリッド体を検出することによりサンプル核酸を検出するサンプル核酸検出用のキットにおいて、
前記セットの前記プローブ核酸が前記サンプル核酸とハイブリダイズしたときに、７０％以上の前記ハイブリッド体が以下の（１）および（２）の関係を満たすことを特徴とするサンプル核酸検出用のキット；
（１）前記プローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、前記プローブセットの該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ配列とにより形成されたハイブリッド部を介して結合したハイブリッド体であって、
（２）前記サンプル核酸が有するターゲット鎖は前記プローブ核酸よりも長く、該ターゲット鎖の５’末端は前記標的配列の５’側端部から５’方向に少なくとも１塩基分伸びた部分の先端にあり、かつ、該ターゲット鎖の３’末端は前記標的配列の３’端部から３’方向に少なくとも１塩基分伸びた部分にあり、前記ターゲット鎖の５’末端の前記標的配列の５’末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３’末端の前記標的配列の３’末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２と表したときに、Ｌ１≦Ｌ２の関係を満たすものである。

本発明によるハイブリッド体は、固相に固定されたプローブ核酸とサンプル核酸とのハイブリッド体であればいかなる組み合わせでも実施可能である。この中でも、ＤＮＡマイクロアレイに代表されるように、プローブとしてオリゴヌクレオチドやｃＤＮＡなどのＤＮＡを平面基板上に固定させ、検出可能な標識により標識されたサンプル核酸とハイブリダイゼーションさせたハイブリッド体は本発明を実施する上で好適な一例である。

固相上に固定させるプローブは、さまざまな方式により固定化することが可能であり、代表的な固定の方法としては、共有結合、イオン結合、吸着等があるが、本発明のハイブリッド体はいずれの固定方法でも実施可能である。

これらのうち、共有結合による固定方法は、ハイブリダイゼーションに伴う様々な条件変化（例えば加熱や高い塩濃度）にも比較的影響されにくく、安定なハイブリッド体を形成する上で好ましい結合方式である。共有結合の具体的な結合方法としては、固相上に導入可能な官能基と核酸プローブ側に導入可能な官能基の組み合わせにより、各種の結合方式が特に制限無く適用可能であるが、プローブに合成オリゴヌクレオチドを使用する場合、チオール基やアミノ基、あるいはその誘導体が修飾官能基として比較的容易に導入しやすいため、よく用いられている。なかでも、オリゴヌクレオチドの５'末端や３'末端に上記の官能基を導入する方法が、合成上容易であり、オリゴヌクレオチドの末端に修飾した官能基を介して固相に固定化したプローブは、本発明によるハイブリッド体に好適に用いることができる。

また、５'末端、３'末端以外でも、オリゴヌクレオチド配列中間部の核酸に由来する官能基や、人工的に合成したヌクレオチド誘導体をサンプル核酸中に取り込ませ、その官能基を利用して固定化することが可能である。

また、ＤＮＡはリン酸エステル結合によりその骨格を形成していることから、分子全体として負の電荷を有しており、例えば固相上に導入した正電荷を有するコーティング剤や固相自体に吸着させることも可能である。

固相に固定したプローブとしては、様々な鎖長を有するプローブを用いることが可能である。鎖長により特異性、結合力等、それぞれ特徴があるが、１５〜３０ｍｅｒ、３１〜５０ｍｅｒ、５１ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの各鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、固相表面に固定化するプローブとしてよく用いられ、本発明のハイブリッド体を構成するプローブとして好適に用いられるプローブの塩基長である。

また、一般的にはプローブとしてオリゴヌクレオチドなどの核酸が用いられることが多いが、強いハイブリダイゼーションが期待できるペプチド核酸（ＰＮＡ）をプローブとして用いることも可能であり、本発明によるＬ１とＬ２の関係を有するハイブリッド体を形成することにより、より安定なハイブリッド体とすることが可能である。

Ｌ１とＬ２の関係はＬ１／Ｌ２の値が０〜１．５の関係を満たすのであれば本発明の安定なハイブリッド体は形成可能である。なかでもＬ１／Ｌ２の値が０〜１の範囲、すなわちＬ１≦Ｌ２である場合にはより一層、安定なハイブリッド体の形成が可能である。

サンプル核酸は、検査対象としての検体自体、あるいは検体から各種の方法で取り出された核酸断片としてプローブとの反応に用いられるものであり、プローブとハイブリダイズする部分である標的配列を有するものである。この標的配列は、検体が有すると想定される配列を特定できるものであればよく、サンプル核酸の種類によって、検体中に直接含まれる検出対象としての配列の一部それ自体であっても、その相補配列であってもよい。サンプル核酸は、プローブとハイブリダイずる標的配列（プローブの有するプローブ配列と相補的である）を有するターゲット鎖を有するもので、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡいずれの核酸でも、適当な条件下で固相プローブとハイブリダイゼーション可能であれば本発明は適用可能である。例えば、一本鎖ＤＮＡの場合は、それ自身がターゲット鎖になる。

また、サンプル核酸の調製方法は特に制限なく適用可能であるが、よく用いられる調製方法として、ＰＣＲ増幅法、ＲＮＡの逆転写があり、それらの調製方法で得られる、ＰＣＲ産物、逆転写産物は本発明のハイブリッド体を形成するために好適に用いることが可能である。

ＤＮＡマイクロアレイなどに代表されるように、固相上ハイブリダイゼーションを特定の塩基配列の検出のために用いる場合、多くはサンプル核酸に何らかの標識物質を結合させるが、標識物質が取り込まれたサンプル核酸であっても、本発明によるハイブリッド体の形成は好適に適用可能である。

標識物質としては、取り扱いも容易で高感度な検出が可能である蛍光物質が一般によく用いられるが、放射線同位体による標識も感度という点では優れており好適に用いることが可能である。蛍光物質を利用する場合、蛍光物質の種類は多岐にわたっておりいずれの蛍光色素も用いることが可能であるが、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光色素は広く利用されており、本発明によるハイブリッド体にも好適に用いることが可能である。

サンプル核酸の鎖長は特に制限なくハイブリッド体を形成できるが、なかでもサンプル核酸の鎖長が５００ｂｐ以上の場合にはより安定したハイブリッド体の形成が可能である。さらには鎖長が５００ｂｐ以上２５００ｂｐ以下の場合、より安定したハイブリッド体の形成が可能である。

本発明では、サンプル核酸に対し、上記のハイブリッド体を形成させるために設計されたプローブも提案する。すなわち、サンプル核酸において、本発明によるハイブリッド体を形成させることが可能な位置にプローブ捕捉領域を設定し、固相プローブとサンプル核酸が本発明による位置関係を有するハイブリッド体を形成するようなプローブを提案する。

また、異なる種類のプローブが２つ以上で構成されるプローブセットも提案する。
また、上記プローブを提供するにあたってはプローブの配列等を設計する必要があるが、そのためのプローブ設計方法も提案する。

標的核酸（配列）検出のためのプローブを効果的に利用するためには、B/F分離を容易にするために、固体担体上にプローブを固定しておく場合があるが、そのために、本発明によるプローブを少なくとも１つ以上、固体担体上に固定したプローブ担体も提案する。１つ以上のプローブを固体担体上に固定化したプローブ担体としてＤＮＡマイクロアレイがあげられるが、ＤＮＡマイクロアレイも本発明によるプローブ固定化担体として好適な一例である。

また、サンプル核酸としては、上述したようにＰＣＲ産物が用いられることが多いが、ＰＣＲ産物を調製するにあたり、上記のＬ１とＬ２の条件を満たすよう設計されるＰＣＲ用のプライマーも提案する。

本発明により、固相上のプローブとサンプル核酸が形成するハイブリッド体において、より安定したハイブリッド体を得ることができ、またその形成する条件を得ることが出来る。さらに、本発明の条件を満たすプローブ、プライマー、さらにそれらの設計の方法、加えてそれらのハイブリッド体が形成されたプローブ担体も合わせて提供することができる。本発明により、固相上でのハイブリダイゼーションを利用した核酸検出方法において、効率的かつ高感度な検出が可能となる。

本発明によるハイブリッド体についてさらに詳しく説明する。

本発明により提供されるハイブリッド体は、固相上に存在するプローブと、配列の一部に相補的な配列を有するサンプル核酸と、から形成されるハイブリッド体であって、サンプル核酸の捕捉対象領域よりも５'側にある塩基鎖長をＬ１とし、３'側にある塩基鎖長をＬ２としたときに、Ｌ１／Ｌ２の値が０〜１．５の関係を有するハイブリッド体である。５'末端が固相に固定された一本鎖プローブ（Ａ鎖）と、相補的な配列を有する一本鎖核酸（Ｂ鎖）とのハイブリッド体の模式図を図１に示した。この図において、Ｂ鎖のプローブ結合領域よりも５'側の塩基鎖長Ｂ₅とし、３'側の塩基鎖長をＢ₃としたときに、Ｂ₅≦Ｂ₃となる関係を有するハイブリッド体が本発明の一例を示すハイブリッド体である。

Ｌ１／Ｌ２の値が０〜１．５であれば本発明の安定したハイブリッド体を形成することは可能であるが、より安定したハイブリッド体を形成するためには、Ｌ１／Ｌ２の値が０〜１であることが望ましい。

プローブは何らかの固相上または固相表面に固定化されていれば、その固定の形態に制限無く本発明のハイブリッド体は形成可能である。このうち、ガラス基板に核酸を固定化したＤＮＡマイクロアレイはその代表例であり、様々な種類のＤＮＡマイクロアレイが本発明のハイブリッド体に適用可能である。固相に用いられる材質としては、ガラス以外にも、樹脂、金属、金属薄膜、繊維等でも適用可能であり、またその外観上の形態も、微粒子、光ファイバー先端、多孔質材料、繊維等、時に制限無く利用可能である。

結合様式としては吸着、化学結合等様々な方式が存在するが、いずれの結合様式でもハイブリッド体は形成可能である。例えば、課題を解決するための手段に記載したイオン結合では、アミノ基をコートしてあるガラス基板または樹脂表面に対し、通常の核酸を供するだけでイオン的に結合させることができる。

また、５'末端、３'末端、あるいは配列の中部にチオール基、アミノ基等の官能基を修飾した修飾オリゴヌクレオチドを用い、導入した官能基の反応を利用して固定化することも可能である。例えばアミノ基を利用する場合、固相表面にアミノ基と効率的に反応するスクシイミド基をあらかじめ結合させておき、５'末端や３'末端などにアミノ基を修飾したオリゴヌクレオチドを固相表面に供給することにより、容易に共有結合を形成させることができ、本発明のハイブリッド体を構成するプローブとして好適に用いることが可能である。

またチオール基を用いる場合には、例えば固相にマレイミド基を結合させておくことにより、アミノ基の場合と同様、共有結合を容易に形成し、本発明のハイブリッド体として好適に用いることが出来る。

プローブの種類としては、ＤＮＡなどのほかに、ＰＮＡなども用いることができる。プローブとしてはｃＤＮＡなども用いることができるが、より精度の高いハイブリッド体の形成を行うためには、化学的な手法により合成されたオリゴヌクレオチドをプローブに使用することが多く、そのプローブの塩基鎖長としては、１５〜３０ｍｅｒ、３１〜５０ｍｅｒ、５１〜８０ｍｅｒのプローブがそれぞれの特性に応じて利用されることが多い。

本発明のハイブリッド体を形成するサンプル核酸は、固相上のプローブ鎖長よりも長ければ特に制限無く本発明のハイブリッド体に用いることが出来る。

本発明によるハイブリッド体は、核酸配列の検出を目的としたＤＮＡマイクロアレイ、ビーズ等でよく用いられる。この場合、サンプル核酸はＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物、転写物、逆転写産物等がよく用いられるが、これらの核酸は本発明のハイブリット体に対して好適に用いることが可能である。すなわち、サンプル核酸は二本鎖、一本鎖いずれでもよく、また、ＤＮＡ、ＲＮＡどちらであっても本発明のハイブリッド体を形成できる。

また、ハイブリッド体の形成を分光学的な手法により検出する場合、サンプル核酸に対し何らかの標識物質、たとえば蛍光物質、放射性物質等によって標識する必要がある場合があるが、このような標識物質を含むサンプル核酸でも、本発明のハイブリッド体は形成可能である。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ (アマシャムファルマシア製)は、核酸標識用の蛍光物質としてよく用いられ、これらの蛍光物質が含まれたサンプル核酸は何ら問題となることなく本発明のハイブリッド体に適用可能である。

また、蛍光物質と同レベルの検出感度を有する標識材料として³²Ｐ等の放射性同位体などが用いられることも多いが、この場合でも、本発明のハイブリッド体は充分、形成可能である。

本発明のハイブリッド体はサンプル核酸の鎖長によらず形成可能であるが、なかでも５００ｂｐ以上の場合により安定したハイブリッド体の形成が可能であり、さらには５００ｂｐ以上かつ２５００ｂｐ以下の鎖長を有するサンプル核酸の場合より安定したハイブリッド体の形成が可能である。

サンプル核酸が例えば二本鎖ＤＮＡの場合、プローブとのハイブリッド形成部以外の部分は、サンプル核酸自体がその相補鎖と二本鎖を形成していることもあるが、そのような場合でも、本発明のハイブリッド体は形成可能である。すなわち、固相上プローブとサンプル核酸が形成するハイブリッド体のうち、部分的であっても、上記のＬ１とＬ２との関係を有する部分が存在すれば、本発明が示す、安定性の高いハイブリッド体の形成は可能である。

また、プローブとサンプル核酸の二本鎖形成部分の鎖長がプローブ長よりも短い場合、すなわちプローブがミスマッチを含む状態でサンプル核酸とハイブリッドを形成している場合であっても、安定したハイブリッド体の形成は可能なサンプル核酸である。その際には、サンプル核酸の５'末端から二本鎖形成部分の末端部分までの鎖長をＬ１とし、３'末端から同じく二本鎖形成部分の末端部分までの鎖長をＬ２として、上記Ｌ１とＬ２の関係を満たすのであれば、本発明のハイブリッド体を形成できる。

特定の塩基配列を認識し、固相上プローブとのハイブリッド体形成により検出対象物の有無を検出するためのプローブ設計は、サンプル核酸を特異的かつ高感度に検出できるよう配慮して設計されることが多い。これらの設計方法の多くは、塩基配列のみを設計のために用いているため、液相系ハイブリダイゼーションでは有効に設計できるが、固相上でのハイブリダイゼーションに対しては、必ずしも最適なプローブ設計ができなかった。本発明のハイブリッド体形成条件は、固相上におけるハイブリッド体安定性に関する指標を与える。そこで、本発明においては、固相上プローブの設計において先に挙げた条件を満たすプローブ設計方法も提案する。

また、このプローブ設計方法により設計された、プローブも提案する。さらにはそれらのプローブが２つ以上集まったプローブセットも提案する。

複数の異なる種類のプローブが固体担体上に固定化されたプローブ担体の一例として、ＤＮＡマイクロアレイが挙げられるが、このようなプローブ担体を構成するプローブとして、本発明によるプローブを利用する場合には、担体上の全プローブ数のうち５０％以上が、本発明のプローブによって構成されていることが好ましく、さらには７０％以上の構成比率であることが好ましいが、本発明においては、そのような複数のプローブ（プローブセット）が固定化されたプローブ担体も提案する。

条件を満たすプローブ数の割合は５０％以上であればよいが、７５％以上であればさらに好ましい。

サンプル核酸がＰＣＲ産物等の場合、サンプル核酸の配列中における相対的なプローブ領域は、ＰＣＲ増幅を実施するために設計されたプライマーの設計により変わってくる。サンプル核酸の塩基配列中、プローブ領域として選択される部分が上記の条件を満たすように設計できれば望ましいが、特異性等の観点から、必ずしもこの条件でプローブが設定できない場合もある。その場合にはプローブ領域を設定したのちに、設定したプローブ領域が請求項１の条件を満たすようなサンプル核酸のプライマー設定を行えばよい。本発明では設定したプローブ領域に対し上記の条件を満たすようなハイブリッド体を形成するためのサンプル核酸増幅用のプライマーも提案する。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

I．ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
検査対象の配列を有する検体のモデルとして、市販のＴａｋａｒａ社製ベクターｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）を選択し、その塩基配列中より、下記の配列を有するプライマー３種を設計した。なお、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全塩基配列情報に関しては、Ｔａｋａｒａ社より提供されており、また、公開されているデータベース等からも入手可能である。

プライマーの設計にあたっては、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの中の、所望の部分塩基配列がＰＣＲ増幅により特異的かつ効率的に増幅されるよう、配列、ＧＣ％、融解温度（Ｔｍ値）に充分配慮して設計を行った。

設計されたプライマーはフォワード側（Ｆ）２種、リバース側（Ｒ）１種の計３種である。ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰをテンプレートとし、Ｆ１とＲ１、またはＦ２とＲ１の組み合わせでＰＣＲ増幅することにより、それぞれ１３２４ｂｐ（ＰＣＲ産物１）、９４０ｂｐ（ＰＣＲ産物２）のＰＣＲ産物が増幅されることになる。設計されたプライマーの塩基配列およびＴｍ値を表１に示す。

またｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ全長における３種のプライマーの位置を図２に示す。なお、この図において矢印の示す方向は、各プライマー鎖において５'末端から３'末端に向かう方向を示している。

（２）プライマーの合成
実施例１の（１）で設計した３種のプライマーを合成した。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製は、カートリッジ精製により行い、３種のプライマーを得た。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。

（３）ＰＣＲ増幅反応
実施例１の（２）で合成した３種のプライマー、鋳型遺伝子ＤＮＡとするＴａｋａｒａ社製ベクターｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、およびＱＩＡＧＥＮ社製ＰＣＲキットＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。ＭａｓｔｅｒＭｉｘ中にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの４種のデオキシヌクレオチドが含まれているが、ＰＣＲ産物を蛍光標識により標識するため、アマシャムファルマシア社製のＣｙ３ｄＵＴＰを加えて、ＰＣＲ産物をＣｙ３により標識した。

フォワード・プライマーとリバース・プライマーの組み合わせとして、（１）中に記載した２組の組み合わせでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、下記のプロトコルによって、下記表２に示す組成の反応液の調製を行った。

調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表３の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。すなわち、９５℃／１５分の保持の後、９２℃(変性)／４５秒、５５℃（アニーリング）／４５秒および７２℃（伸長）／４５秒を１サイクルとして２５サイクル、最後に７２℃／１０分保持した。

増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は精製用カラム（Qiagen QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、２種のＰＣＲ産物それぞれにおいて所望の塩基長を有するバンドが出ていることを確認した。

II．ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）プローブの設計及び合成
上記、ＰＣＲ産物１に対して、３種のプローブを設計した。設計はプライマーの設計と同様、各プローブが、検体中に選択した部分塩基配列（標的配列）を特異的に認識できるよう、配列、ＧＣ％、融解温度（Ｔｍ値）に充分配慮して設計を行った。

設計されたプローブの塩基配列およびＴｍ値を表４に示す。

このプローブ設計においては、プローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成するのは、Ｒ１のプライマーから伸長したＤＮＡ鎖である。

またＰ２およびＰ３はプローブとしてＰＣＲ産物２に対してもハイブリッド体を形成する。

ＰＣＲ産物１および２と各プローブとのハイブリッド体において、ハイブリッド部よりも５'側に存在するターゲット鎖の鎖長をＬ１とし、３'側に存在する鎖長をＬ２として、各ＰＣＲ産物に対する各プローブのＬ１、Ｌ２およびＬ１／Ｌ２の値を表５に示す。

ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ全長における３種のプローブ、３種のプライマーの位置を図３に示す。

（２）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分間、超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡマイクロアレイ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。

（３）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面にシランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。

一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

（４）プローブ用ＤＮＡの合成
上記（１）で設計した３種のプローブを合成した。

プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って、５'末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護を施している保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。

得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

（５）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、尿素７．５重量％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０重量％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面にプローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、プローブごとに１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５'末端のチオール基とを反応させた。

（６）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、１枚あたり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＡＮマイクロアレイを得た。

III．ハイブリダイゼーション反応
IIで作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてIで作製したＰＣＲ増幅産物２種を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。

（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎＶ：Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように、１００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸バッファーに溶解し、この溶液にIIで作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ）３０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスした。その後、スピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。

（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ産物は互いに等モルとなるよう調製したうえで、ＰＣＲ増幅産物溶液を用いて最終濃度が下記の構成となるよう、各ＰＣＲ産物に対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。

＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ６ｍＭ、ｐＨ７．４）
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡマイクロアレイを、ハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

＜ハイブリダイゼーション条件・手順＞
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し３分間保持したあと、さらに９２℃で２分間、続いて５５℃で４時間保持した。そのあと、その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、２５℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、最後にスピン・ドライ装置で水切りを行い乾燥させた。

（４）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡマイクロアレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂ）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。ＰＣＲ増幅産物１、２の蛍光輝度を各プローブに対して測定した結果を下記の表７に示す。

輝度の算出にあたっては、ＤＮＡマイクロアレイ上、プローブＤＮＡのスポットの無い部分において観測される蛍光強度をバックグランド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグランド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。また測定は２回実施し、その平均値を示す。

この結果から、同一のサンプル核酸に対しほぼ同一のＴｍ値を有するように設計したプローブであっても、蛍光輝度値が大きく異なる、すなわち安定性が大きく異なる。蛍光輝度値が上昇するということは、ハイブリッド体がより多く形成していることを示し、すなわちハイブリッド体が安定であることを示している。さらに、ハイブリッド形成部よりも５'側、３'側にある部分の塩基鎖長比（Ｌ１／Ｌ２）によって、ハイブリッド体の安定性が異なり、特に５'側の塩基鎖長が３'側の塩基鎖長に比べて短いほうがより安定したハイブリッド体を形成していることがわかった。

[実施例２]
I．ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
検査対象の配列を有する検体のモデルとして、市販のＴａｋａｒａ社製ベクターｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）を選択し、その塩基配列中より、下記の配列を有するプライマーを設計した。なお、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全塩基配列情報に関しては、Ｔａｋａｒａ社より提供されており、また、公開されているデータベース等からも入手可能である。

設計されたプライマーはフォワード側（Ｆ）８種、リバース側（Ｒ）７種の計１５種である。ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰをテンプレートとし、フォワード側とリバース側のプライマーを各１種ずつ組み合わせてＰＣＲ増幅することにより、１０４ｂｐから２３４５ｂｐの様々な鎖長のＰＣＲ産物が増幅されることになる。
設計されたプライマーの塩基配列を表８に示す。

またｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおける１５種のプライマーの位置関係の概略を図４に示す。なお、この図において矢印の示す方向は、各プライマー鎖において５'末端から３'末端に向かう方向を示している。

（２）プライマーの合成
実施例２の（１）で設計した１５種のプライマーを合成した。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製は、カートリッジ精製により行い、１５種のプライマーを得た。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。

（３）ＰＣＲ増幅反応
実施例２の（２）で合成した１５種のプライマー、鋳型遺伝子ＤＮＡとするＴａｋａｒａ社製ベクターｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、およびInvitrogen社製ＰＣＲキットAccuPrime Taq DNA Polymerase Systemを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。AccuPrimeのキットに含まれる専用のBuffer中にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの４種のデオキシヌクレオチドが含まれているが、ＰＣＲ産物を蛍光物質により標識するため、アマシャムファルマシア社製のＣｙ３ｄＵＴＰを加えて、ＰＣＲ増幅反応を行った。

フォワードプライマーとリバースプライマーを、表９に示すように２４通りに組み合わせ、各組み合わせごとにＰＣＲ増幅反応を行った。なお、ＰＣＲ産物長の単位はｂｐである。

反応条件は、下記のプロトコルによって、下記表１０に示す組成の反応液の調製を行った。

調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表１１の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。すなわち、９４℃／２分の保持の後、９２℃（変性）／３０秒、５５℃(アニーリング)／４５秒、および７２℃（伸長）／６０秒を１サイクルとして３０サイクル、最後に７２℃／１０分間保持した。

増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は精製用カラム（Qiagen QIAquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、２４種のＰＣＲ産物それぞれにおいて所望の塩基長を有するバンドが出ていることと、各PCR産物の生成量を確認した。

II．ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）プローブの設計
上記、２４種のＰＣＲ産物を検出するために、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ上の３つの領域に対してプローブを設計した。図５にｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ上のプローブ領域を示す。３つの領域に対して、各領域ごとに鎖長の異なる３つのプライマーを設計した。鎖長は２５ｍｅｒ、４０ｍｅｒ、６０ｍｅｒの３種である。設計はプライマーの設計と同様、各プローブが、検体中に選択した部分塩基配列（標的配列）を特異的に認識できるような配列を選び、さらに各プローブごとに、ＧＣ％、融解温度（Ｔｍ値）に充分配慮して設計を行った。

計９種の設計されたプローブの名称、塩基配列、およびＴｍ値を表１２に示す。

上記のプローブは、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩの配列上において、フォワードプライマーと同じ配列上にある配列であることから、このプローブとハイブリダイゼーションし二本鎖を形成するのは、相補鎖であるリバースプライマー側の配列（リバースプライマー伸長鎖）である。

各ＰＣＲ産物（ターゲット鎖）と各プローブとのハイブリッド体において、ハイブリッド部よりも５'側に存在するターゲット鎖の鎖長をＬ１とし、３'側に存在する鎖長をＬ２として、各ＰＣＲ産物に対する各プローブのＬ１、Ｌ２およびＬ１／Ｌ２の値を表に示す。２５ｍｅｒのプローブＡ２５、Ｂ２５、Ｃ２５については表１３に、４０ｍｅｒのプローブについては表１４に、６０ｍｅｒのプローブについては表１５に示す。

（２）マイクロアレイの作製
上記プローブの合成からマイクロアレイ作製までは実施例１と同様に行った。本実施例においては、９種のプローブは同一マイクロアレイ上にはのせず、プローブごとにマイクロアレイを作製した。実施例１と同様に、１枚のマイクロアレイ上に１６のスポットを固定した。

III．ハイブリダイゼーション反応
IIで作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてIで作製したＰＣＲ増幅産物を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。

マイクロアレイは９種のプローブごとに作製し、ＰＣＲ産物も２４種作成した。これらを用いて表１３から表１５に記載されている全２４３通りのハイブリダイゼーションを行った
（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
実施例１と同様にＢＳＡを用いてブロッキングを行った。

（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ産物はそれぞれが等モルとなるよう調製したうえで、ＰＣＲ増幅産物溶液を用いて最終濃度が下記の構成となるよう、各ＰＣＲ産物に対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。

＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／０．０５％ＳＤＳ／ＰＣＲ増幅産物溶液（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ６ｍＭ、ｐＨ７．４）
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡマイクロアレイを、ハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

＜ハイブリダイゼーション条件・手順＞
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃でマイクロアレイに添加したのち、９２℃で２分間、続いて５５℃で４時間保持した。そのあと、その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、２５℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、最後にスピン・ドライ装置で水切りを行い乾燥させた。

（４）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後の蛍光測定は実施例１と同様に行った。各ＰＣＲ産物の輝度値を、プローブ長ごとに表１７から表１９に示す。輝度の算出も実施例１と同様に行った。

IV．結果の解析
続いて、この結果をもとに、Ｌ１／Ｌ２の値に対する輝度値のグラフを作成した。わかりやすくするため、縦軸、横軸ともに対数表示にした。２５ｍｅｒのグラフを図６に、４０ｍｅｒを図７に、６０ｍｅｒを図８に示す。

この結果から、同一のサンプル核酸に対しプローブ長に応じてほぼ同一のＴｍ値を有するように設計したプローブに対し、同一濃度の検体をハイブリダイゼーションした場合であっても、蛍光輝度値が大きく異なる、すなわち安定性が大きく異なることがわかる。Ｌ１／Ｌ２の値が０から１．５の範囲では大きな輝度値が得られ安定したハイブリッド体が得られることがわかる。特にＬ１／Ｌ２の値が０から１の場合には、特に安定したハイブリッド体が得られていることがわかった。またこれとは逆に、Ｌ１／Ｌ２の値が２以上の場合には一部の例外を除いてきわめて輝度の低い蛍光輝度しか得られず、ハイブリッド体の安定性が極めて低いことがわかった。

[実施例３]
（１）プローブの設計
実施例２で設計した９種のプローブのうち、２５ｍｅｒの３種について３’末端にチオール基を修飾した下記のプローブを作製した。チオール基は３’末端にのみ修飾してあり、５’末端にはチオール基は結合していない。

計３種の設計されたプローブの名称、塩基配列、およびＴｍ値を表２０に示す。

実施例２と同様に、このプローブとハイブリダイゼーションし二本鎖を形成するのは、相補鎖であるリバースプライマー側の配列（リバースプライマー伸長鎖）である。

ここで合成した３種のプローブと、実施例２で合成した各ＰＣＲ産物（ターゲット鎖）と各プローブとのハイブリッド体において、ハイブリッド部よりも５'側に存在するターゲット鎖の鎖長をＢ₅とし、３'側に存在する鎖長をＢ₃として、ハイブリッド体を示す図を図９に示す。また、実施例２で合成した各ＰＣＲ産物に対する各プローブのＬ１、Ｌ２およびＬ１／Ｌ２の値を表２１に示す。プローブと各ＰＣＲ産物産物（ターゲット鎖）との位置関係は変わらないため、Ｌ１、Ｌ２およびＬ１／Ｌ２の値は実施例２と同じである。

（２）マイクロアレイの作製
３種のプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイの作製は、実施例２と同様に各プローブごとに行い、１マイクロアレイあたり１６スポットのＤＮＡマイクロアレイを作製した。

（３）ハイブリダイゼーション反応および蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応および、反応終了後の蛍光測定は実施例２と同様に行った。各マイクロアレイから得られた輝度値を、表２２に示す。

（４）結果の解析
実施例２と同様に、Ｌ１／Ｌ２の値に対する輝度値のグラフを作成し、図１０に示した。本実施例においても、縦軸、横軸ともに対数表示にした。このグラフからＬ１／Ｌ２の値が０から１．５の間において高い輝度が得られており、安定したハイブリッド体を形成していることがわかる。また、その傾向は特に０から１の間で顕著であることもわかった。

この結果は、３’末端のチオール基を介して固定されたプローブにおいても、５’末端固定の場合と同様にＬ１とＬ２の値に応じて安定したハイブリッド体が得られることを示しており、プローブの固定方法によらず、本発明による安定したハイブリッド体が得られることを示している。

固相に固定したＡ鎖プローブとサンプル核酸であるＢ鎖とのハイブリッド体を示した図である。サンプル核酸においてハイブリッド形成部よりも５'側の塩基鎖長をＢ₅、３'側の塩基鎖長をＢ₃で示した。ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおいて、３つのプライマーの位置を示した図であり、矢印はそれぞれのプライマーにおいて５'から３'に向かう方向を示している。ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおいて、３つのプライマー、および３つのプローブを示した図である。ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおいて、フォワードプライマーＦ１からＦ８、リバースプライマーＲ１からＲ７、計１５種のプライマーの位置関係を示した図であり、矢印はそれぞれのプライマーにおいて５'から３'に向かう方向を示している。ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおいて、各プライマー、および３つのプローブの位置関係を示した図である。２５ｍｅｒのプローブにおけるＬ１／Ｌ２に対する輝度値をプロットしたグラフである。４０ｍｅｒのプローブにおけるＬ１／Ｌ２に対する輝度値をプロットしたグラフである。６０ｍｅｒのプローブにおけるＬ１／Ｌ２に対する輝度値をプロットしたグラフである。３’末端を固定したプローブとターゲット鎖とのハイブリッド体、およびＬ１、Ｌ２の位置関係を示した図である。３’末端固定の２５ｍｅｒのプローブにおけるＬ１／Ｌ２に対する輝度値をプロットしたグラフである。

Claims

固相上に複数のスポットとして固定された、複数種類のプローブ核酸からなるプローブセットと、ＰＣＲ用のプライマーを用いて増幅されたサンプル核酸が有するターゲット鎖の該プライマーよりも３'側の標的配列と、を反応させて得られる１種類以上のハイブリッド体を該固相上で検出することによるサンプル核酸の検出方法において、
前記プローブセットの前記複数種類の前記プローブ核酸が、前記サンプル核酸とハイブリダイズしたときに、該固相上の７０％以上の前記ハイブリッド体が以下の（１）から（３）の関係を満たすことを特徴とするサンプル核酸の検出方法：
（１）前記プローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、前記プローブセットの該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ配列とにより形成されたハイブリット部を介して結合したハイブリット体であって、
（２）前記サンプル核酸が有するターゲット鎖は、前記プローブ核酸よりも長く、該ターゲット鎖の５'末端は前記標的配列の５'側端部から５'方向に少なくとも前記プライマーの塩基分伸びた部分の先端にあり、かつ、該ターゲット鎖の３'末端は前記標的配列の３'側端部から３'方向に少なくとも前記プライマーの塩基分伸びた部分にあり、前記ターゲット鎖の５'末端の前記標的配列の５'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３'末端の前記標的配列の３'末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２と表したときに、Ｌ１≦Ｌ２の関係を満たすものであり、
（３）前記サンプル核酸の鎖長が少なくとも５００ｂｐであることを特徴とする。
前記プローブがＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
固相に固定されたプローブＤＮＡが共有結合により固定されていることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
固相に固定されたプローブＤＮＡが５’側の末端に導入された官能基を介して固定されていることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
固相に固定されたプローブＤＮＡが３’側の末端に導入された官能基を介して固定されていることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
サンプル核酸が直接的または間接的に検出可能な標識物質により標識されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
標識物質が蛍光物質であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
サンプル核酸の鎖長が５００ｂｐ以上、２５００ｂｐ以下であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
検体核酸から標的配列を有するターゲット鎖を有するサンプル核酸を増幅させるための該標的配列よりも５’側のＰＣＲ用のプライマーと、該検体核酸をテンプレートとして該プライマーを用いて増幅した増幅産物中での前記標的配列の有無を確認するための固相上に複数のスポットとして固定化された複数種類のプローブ核酸のセットと、を有し、該プローブ核酸と、前記標的配列と、を反応させて得られる１種類以上のハイブリッド体を該固相上で検出することによりサンプル核酸を検出するサンプル核酸検出用のキットにおいて、
前記セットの前記プローブ核酸が前記サンプル核酸とハイブリダイズしたときに、該固相上の７０％以上の前記ハイブリッド体が以下の（１）から（３）の関係を満たすように前記検体核酸に対して前記プローブ核酸および前記プライマーが設計されていることを特徴とするサンプル核酸検出用のキット製造方法；
（１）前記プローブ核酸とサンプル核酸とが、該サンプル核酸のターゲット鎖の有する標的配列と、前記プローブセットの該標的配列に相補的である該プローブ核酸の有するプローブ配列とにより形成されたハイブリッド部を介して結合したハイブリッド体であって、
（２）前記サンプル核酸が有するターゲット鎖は前記プローブ核酸よりも長く、該ターゲット鎖の５’末端は前記標的配列の５’側端部から５’方向に少なくとも前記プライマーの塩基分伸びた部分の先端にあり、かつ、該ターゲット鎖の３’末端は前記標的配列の３’端部から３’方向に少なくとも前記プライマーの塩基分伸びた部分にあり、前記ターゲット鎖の５’末端の前記標的配列の５’末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ１、前記ターゲット鎖の３’末端の前記標的配列の３’末端部分より伸びた部分の塩基数をＬ２と表したときに、Ｌ１≦Ｌ２の関係を満たすものであり、
（３）前記サンプル核酸の鎖長が少なくとも５００ｂｐであることを特徴とする。
前記固体が異なるサンプル核酸に対する前記プローブがそれぞれスポットとして固定されたＤＮＡマイクロアレイであり、
前記プローブセットの前記プローブ核酸が、前記サンプル核酸とハイブリダイズしたときに、前記ＤＮＡマイクロアレイ上の７０％以上の前記ハイブリッド体が前記の（１）から（３）の関係を満たすことを特徴とする、請求項１に記載の方法。