KR20110097032A - 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 위한 ｐｎａ 프로브, 키트 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성 매개성 감염(sexually transmitted infection, STI) 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 위한, 각각의 원인균에 대해 종-특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브, 상기 PNA 프로브를 포함하는 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트, 및 상기 키트를 사용하는 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법에 관한 것으로서, STI를 신속·간편하고 정확하게 진단할 수 있고 한 번에 다수의 다양한 STI 원인균의 유전자형을 검출할 수 있으므로, 적절한 항생제 선택 및 치료결과 모니터링에 의한 STI의 효율적인 치료를 가능하게 한다.

Description

성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 위한 ＰＮＡ 프로브, 키트 및 방법{PNA probes, kits, and methods for the diagnosis of sexually transmitted infections or for the genotyping of pathogens causing the same}
본 발명은 성 매개성 감염(sexually transmitted infection, 이하 'STI'라 함) 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 위한, 각각의 원인균에 대해 종-특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 프로브, 상기 PNA 프로브를 포함하는 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트, 및 상기 키트를 사용하는 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법에 관한 것이다.
STI는 성적 접촉에 의해 감염자로부터 상대방에게 전염되는 것으로, 명백한 증후를 갖고 있는 질환을 성 매개성 질환(Sexually Transmitted Disease, STD)이라 하고, 증상 및 증후가 없는 무증상 감염까지 포함하는 개념을 성 매개성 감염 (Sexually Transmitted Infection, STI)이라고 하였는데, 최근에는 STI로 통용되고 있다. STI는 전체 성인남녀의 약 50%가 평생에 한 번 이상 감염될 만큼 흔한 질병으로, 세계보건기구에 따르면 전세계적으로 치료 가능한 STI 환자는 매년 3억4천만 명 이상 새롭게 발생한다고 한다(J Microbiol., 45:453-459. 2007; WHO. Global Strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections 2006-2015, 2007).
STI는 30개 이상의 원인균에 의한 감염 질환으로서, 원인에 따라 세균 감염, 바이러스 감염, 원충 감염 및 곰팡이균 감염으로 나눌 수 있으며, 해당 질환과 대표적인 원인균은 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.
질환 대표적 원인균
성전파성 질환 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)
우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum)
성기궤양 헤모필러스 두크레이(Hemophilus ducreyi)
트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum)
헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 2(Herpes simplex virus type 2) 등
요도염 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)
트리코모나스(Trichomonas)
마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)
마이코플라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)
우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum)
가드네렐라 배지날리스(Gardnerella vaginalis)
스트렙토코커스 sp.(Strepcoccus sp.)
캔디다 알비칸스(Candida albicans)
세균성 전립선염 에쉐리치아 콜라이(Escherichia coli)
크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)
엔테로코커스(Enterococcus)
스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)
베일로넬라(Veillonella)
프로테우스(Proteus)
프레보텔라(Prevotella)
펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus)
STI의 조기 진단과 치료가 이루어지지 않을 경우, 불임, 태아 사망, 자궁 외 임신, 항문생식기계통의 암, 미성숙 사망, 영유아 감염과 같은 합병증 또는 후유증을 초래할 수 있으며, 때론 치명적인 질환으로 생명에 위협을 줄 수 있다. STI는 무증상으로 잠복되어 증세가 악화되는 경우가 많고, 재감염이 용이하므로 STI의 진단 대상자인 유흥접객원 및 기타 STI 매개우려자 등에 대해 정기적인 STI 검진을 통한 감염자의 조기 발견과 치료로 STI 전파를 미연에 방지하는 것이 중요하다(Korean J UTII, 3:55-62, 2008). 그러므로 STI 원인균을 조기에 검출하여 무증상의 보균자도 효과적으로 진단할 수 있는 방법의 개발이 중요하다. 또한, STI는 질환별 다양한 원인균에 따른 항균제 및 치료 경과가 서로 다르기 때문에 정확한 원인균의 유전자형 검출을 통해 적합한 항균제로 신속한 치료를 받아야 하며, 정확한 원인균 검출에 따른 항균제를 복용함으로써 항균제 오남용을 막을 수 있다.
STI의 원인균 검출 방법으로 그람염색, 선택배지에 의한 배양동정법, 혈청학적 방법, 및 핵산증폭 방법(PCR, SDA, TMA 등)이 주를 이루고 있다. 그람염색 및 배양동정법은 검사과정이 번거롭고 복잡하며, 장시간이 소요되며 진단 민감도가 낮은 문제점이 있다. 효소면역검사법(enzyme immunoassay, EIA)과 면역형광검사법(immunofluorescence technique)은 배양동정법에 비해 더 신속하고 민감도와 특이도가 높은 것으로 보고되고 있으나, 고비용의 단점이 있다. 핵산증폭의 대표적인 방법인 PCR(multiplex PCR과 specific PCR)은 원인균 게놈의 유전자형(DNA 및 RNA 염기서열)을 분석하는 유전자 검사법으로, 하나의 반응기 내에서 한 번의 반응으로 검사가 가능한 대상 원인균 수 및 검사 가능 샘플 수에 제한이 있으며, 각 대상 원인균에 대한 정확한 유전자형 검출이 가능한 유전자와 염기서열 부위 선택이 어렵고, 이에 대한 최적의 PCR 조건 수립에 어려움이 있다(J Microbiol., 45:453-459. 2007; Can J Infect Dis Med Microbiol., 16:73-76, 2005; J Microbiol Methods., 62:245-256, 2005).
핵산증폭기술의 한계를 극복하기 위한 마이크로어레이(microarray) 기술을 이용한 검사방법이 개발되고 있다. 검체로부터 목적하는 원인균의 핵산 단편의 PCR 반응산물과 원인균의 유전자형 특이적인 프로브들을 어레이 기판 위에 고정화시켜, 특정 온도에서 혼성화(hybridization) 반응 결과를 분석하는 방법으로, 1회 검사로 신속·간편하고 높은 민감도와 정확도로 감염 원인균을 검출할 수 있다(Curr Opin Biotechnol, 12:53-58, 2001). DNA 마이크로어레이(DNA microarray 또는 DNA chip) 기술을 이용한 STI 원인균 검출법은 유리 슬라이드 위에 STI 원인균 유전자형 특이적인 DNA 프로브와 PCR 증폭산물의 혼성화 반응 결과를 동시에 분석할 수 있다. 한국등록특허 제619189호는 4종의 STD 원인균에 대한 유전자형 검출용 DNA 칩을 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2008-0024503호는 12종의 STI 원인균에 대한 유전자형 검출용 DNA 마이크로어레이를 개시하고 있다. 상기 특허들은 각각 4종 및 12종의 개별 유전자를 표적으로 증폭 프라이머 및 종-특이적(species-specific) 프로브를 디자인하였으며, 4종 또는 12종에 대한 4쌍 또는 12쌍의 개별 프라이머를 단일 또는 멀티플렉스 PCR로 증폭하여 프로브와 혼성화 반응 결과를 분석하는 것으로, 각각의 원인균 증폭을 위해 개별 프라이머를 이용하여 PCR 효율이 감소하며 PCR 혼합물 제작에 번거로움이 따른다. 한국등록특허 제819634호는 18종의 원인균의 유전자형 검출용 DNA 마이크로어레이에 관한 것으로, 그중 중요 원인균에 대해 속-특이적(genus-specific) DNA 프로브를 적용하여 정확한 수준의 유전자형 검출이 불가능하다.
DNA 마이크로어레이는 대상 원인균의 핵산 단편의 PCR에 의해 증폭된 DNA와 유전자형 특이적인 DNA 프로브 간의 DNA/DNA 혼성화 반응 결과를 분석하여 유전자형을 검출하게 되지만, 슬라이드에 고정된 DNA 프로브 자체가 생물학적 및 화학적으로 안정성이 매우 낮아 핵산분해효소(nuclease) 등에 의해 쉽게 분해되어 보존 기간 및 상태에 따라 DNA 프로브가 분해되거나 반응 능력이 떨어질 수 있는 문제점이 있다(한국공개특허 제2008-0086687호; J Clin Microbiol., 47:1785-1790, 2009; J Chem Technol Biotechnol., 81:892-899, 2006).
최근에 DNA 자체의 불안정성을 해결하기 위해서, DNA 유사체들(analogues) 중의 하나인 PNA가 개발되었다. PNA는 1) 핵산분해효소와 같은 생분해효소 등에 대한 안정성이 DNA나 RNA보다 훨씬 높고, 2) DNA의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, 3) 아데닌, 티민, 구아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA나 RNA와 혼성화 반응이 가능하며, 4) 전기적으로 중성이라 PNA/DNA 및 PNA/RNA 상보결합의 친화력이 DNA/DNA 및 DNA/RNA 상보결합의 친화력보다 크고, 5) PNA/DNA 또는 PNA/RNA 상보결합이 DNA/DNA 및 DNA/RNA 상보결합보다 부정합(mismatch)에 대하여 더욱 민감하다. 상기와 같은 PNA의 특징으로 인해 PNA 올리고머를 이용한 분석 또는 진단 방법 연구가 활발히 진행되고 있다(한국공개특허 제2008-0086687호; 한국등록특허 제725579호 및 제766752호; J Clin Microbiol., 47:1785-1790, 2009; Trends Biotechnol., 22: 617-622, 2004; BMC technology, 5:1-5, 2005).
본 발명자들은, 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 상기한 장점을 갖는 PNA를 이용하여 STI의 원인균에 대해 유전자형 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브를 고안·제작하여 PNA 칩을 제작하였으며, 이들을 이용하여 다양한 STI 원인균에 대한 유전자형을 높은 특이도와 민감도로 검출 가능함을 확인하였다. 또한, 복수의 STI 원인균의 표적(target) DNA를 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하여 증폭하고, 증폭산물을 변성(denaturation) 과정 없이 프로브와 직접 혼성화 반응시켜 간편하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 신속·간편하고 높은 특이도 및 민감도로 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 수행할 수 있는, 생물학적 효소에 안정한 PNA 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트를 이용한 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 복수의 STI 원인균의 표적 DNA를 비대칭 PCR을 이용하여 동시에 증폭하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은
서열번호 1 내지 44 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 위한 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은
지지체 상에 상기 PNA 프로브가 고정화되어 있는, STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은
⒜ 상기 진단 또는 검출 키트에 STI 원인균의 표적 DNA를 가하고;
⒝ 상기 진단 또는 검출 키트의 PNA 프로브와 STI 원인균의 표적 DNA를 혼성화 반응시키고;
⒞ PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는:
단계를 포함하는, STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4면은
STI 원인균의 DNA에 대해 정방향 프라이머로서 서열번호 45의 프라이머와, 역방향 프라이머로서 서열번호 46의 프라이머 및 서열번호 47의 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, STI 원인균의 DNA 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 신속·간편한 방법으로 수행할 수 있고, 하나 이상의 원인균 감염에 의한 중복감염 원인균의 유전자형을 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 이용하여 높은 특이도와 민감도로 STI 진단 또는 원인균의 유전자형을 검출할 수 있다. 이에 따라, 성 매개성 질환의 조기 진단 및 적절한 항생제 처방이 가능하여 항생제 오남용을 감소시킬 수 있다. 또한, 항생제 치료 결과에 대한 추적 검사에 이용할 수 있다. 결과적으로, 성 매개성 질환의 조기 진단 및 예방에 기여할 수 있으며, 항균제 치료 중인 환자의 추적 검사에 이용할 수 있어 치료 효과 및 관리를 극대화할 수 있다. 또한, PNA 프로브는 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하여 보관이나 사용 시 환경 변화나 기타 요소들에 의해 영향을 받지 않으므로 DNA 프로브를 이용한 상업적인 STI 진단 및 유전자형 검출, 예들 들어, 서던 블랏, 도트 블랏 하이브리디제이션, 라인 프로브 어세이, 비드 어레이, DNA 어레이 등에 사용하기에 용이할 것으로 기대된다.
도 1은 PNA와 DNA의 혼성화 반응에 의한 상보결합을 나타내는 도면이고;
도 2는 표 3의 프라이머를 이용하여 STI 원인균의 ITS 지역을 표적으로 핵산을 증폭한 후 2% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 결과를 보여주는 도면이며;
도 3은 본 발명의 일례에 따른, 그리드가 4개와 8개로 나누어져 한 번에 다수의 샘플을 검사할 수 있는 PNA 칩, 및 상기 PNA 칩 상의 프로브의 종류 및 위치를 나타내는 도면이고;
도 4a 내지 4o는 본 발명의 일례에 따른 PNA 칩을 이용하여 STI 원인균 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 헤모필러스 듀크레이( Haemophilus ducreyi), 펩토스트렙토코커스 프레보티(Peptostreptococcus prevotii), 가드네렐라 배지날리스(Gardnerella vaginalis), 프레보텔라 부카에(Prevotella buccae), 베일로넬라 sp.(Veillonella sp.), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococus epidermidis), 스트렙토코커스 sp.(Streptococcus sp.), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrheae), 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum), 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum), 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 유전자형 검출 결과를 보여주는 도면이며;
도 5a 및 5b는 본 발명의 일례에 따른 PNA 칩으로 하나 이상의 원인균에 대한 유전자형 검출 결과로, 도 5a는 펩토스트렙토코커스 프레보티(Peptostreptococcus prevotii)와 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum)의 중복감염에 대한 유전자형 검출 결과이며, 도 5b는 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrheae)와 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum)의 중복감염에 대한 유전자형 검출 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명은 STI 원인균의 유전자형 검출을 위하여 ITS(16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer) 지역을 표적으로 종-특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브와 이를 고정화시킨 검출 키트(예: PNA 칩)에 관한 것이다. 또한, 상기 검출 키트를 이용한 STI 원인균의 유전자형 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 STI 원인균의 유전자형 검출용 PNA 프로브, 검출 키트 및 방법은 다음과 같은 단계로 완성되었다.
1. 클론 확보 및 서열분석
STI 원인균의 DNA를 하기 표 3에 나타낸 프라이머로 PCR 증폭하고, 증폭된 PCR 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝(cloning)하였다. 여기서 얻은 클론들을 대장균 JM109에 형질전환하여 DNA를 대량 확보하고, 확보한 클론 DNA의 염기서열을 분석하여 STI 원인균의 표적이 포함된 클론을 확보하였다. 염기서열분석으로 유전자형이 확인된 클론은 본 발명의 PNA 칩 반응조건 확립 시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다.
2. PNA 프로브의 설계 및 제작
다양한 STI 원인균의 유전자형 검출을 위하여, ITS 지역을 표적으로 종-특이적으로 상보적 결합을 할 수 있는 PNA 프로브를 고안하였다. 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 염기서열 데이터베이스인 GenBank로부터 원인균의 ITS 지역의 염기서열을 확보하고, 확보한 유전정보를 이용하여 프로브를 설계하였다. 본 발명에 따른 프로브는 바람직하게 12개 이상, 더욱 바람직하게는 14~30개, 더욱 더 바람직하게는 14~24개의 염기서열로 구성된다. 표 2에 본 발명에 따른 PNA 프로브의 표적 원인균(유전자형), 염기서열 및 서열번호를 각각 나타내었다.
Figure pat00001
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로브는 STI 원인균 각각의 유전자형에 따라 서열번호 1 내지 44에 기재된 염기서열로 이루어진다. 본 발명의 프로브는 STI의 주요 원인균 16종에 대한 유전자형 검출을 위한 것이다.
표 2의 프로브들을 적용하여 16종 원인균의 유전자형을 검출한 결과, 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 검출을 위해 서열번호 1; 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 검출을 위해 서열번호 4; 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 검출을 위해 서열번호 6; 헤모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi) 검출을 위해 서열번호 10 및 11; 펩토스트렙토코커스 프레보티(Peptostreptococcus prevotii) 검출을 위해 서열번호 12; 가드네렐라 배지날리스(Gardnerella vaginalis) 검출을 위해 서열번호 15; 프레보텔라 부카에(Prevotella buccae) 검출을 위해 서열번호 17; 베일로넬라 sp.(Veillonella sp.) 검출을 위해 서열번호 20; 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococus epidermidis) 검출을 위해 서열번호 22 및 23; 스트렙토코커스 sp.(Streptococcus sp.) 검출을 위해 서열번호 26; 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrheae) 검출을 위해 서열번호 28; 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum) 검출을 위해 서열번호 29; 우레아플라스마 우레아리티컴(Ureaplasma urealyticum) 검출을 위해 서열번호 33 및 34; 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 검출을 위해 서열번호 36 및 37; 에쉐리치아 콜라이(Escherichia coli) 검출을 위해 서열번호 39; 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 검출을 위해 서열번호 42 내지 44의 프로브들이 특히 우수한 효과를 나타내었다(도 4 참조).
본 발명의 PNA 프로브는 지지체 상에 효율적으로 고정화하기 위해, N-말단 에 아민 또는 티올과 같은 고정화에 필요한 작용기를 가질 수 있으나, 작용기의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 본 발명의 PNA 프로브가 N-말단에 아민기를 갖는 경우, 한국등록특허 제938777호에 개시된 바와 같은 다중 아민기(multi-amine linker)를 갖는 것이 바람직하나, 본 발명의 범위가 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464261호 및 제938777호, 및 한국공개특허 제2008-0081750호의 방법에 따라 합성될 수 있다. 다중 아민기를 갖는 PNA는 상기 합성된 PNA 또는 PNA와 결합된 스페이서(spacer)의 N-말단에 1개의 카복실기와 2개 이상의 분지된 아민기를 갖는 덴드론 단량체를 2회 이상 순차적으로 결합시켜 합성되는바, 구체적으로는 PNA 올리고머의 아민기에 결합되어 있는 보호기의 탈보호(deprotection), 다중 아민기를 갖는 덴드론 단량체와 PNA의 커플링(coupling) 및 캡핑(capping)의 3단계를 거쳐 합성될 수 있다.
본 발명에서 프로브로 이용된 PNA의 펩타이드 결합 형태로 변화된 기본골격(backbone)의 구조적 차이는 DNA나 RNA의 포스페이트 골격의 음이온성 성질을 중성 성질로 바꾸었다. 이러한 중성화로 인한 정전기적 반발력의 제거는 혼성화 반응시 결합력이 높아지는 직접적 원인이 되며, 혼성화 반응 속도가 빨라지며 특이도가 매우 높아져 유전자형의 더욱 명확한 검출이 가능해진다. 또한 PNA가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하여 보관, 사용 시 환경변화와 기타 요소들에 의해 영향을 받지 않으므로, DNA 프로브를 이용한 상업적인 STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출, 예를 들어, 서던 블랏, 도트 블랏 하이브리디제이션, 라인 프로브 어세이, 비드 어레이, 마이크로어레이 등에 DNA 프로브를 대신하여 사용하기에 용이한 것으로 기대된다.
3. PNA 칩의 제작
상기 2에서 설계된 프로브는 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스, 특히 유리 슬라이드 등의 지지체 위에 고정화된다. 지지체의 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어 유리 슬라이드와 같이 손으로 잡을 수 있는 박판(薄板) 형태뿐만 아니라, 튜브 형태 또는 액체에 혼합하여 이송할 수 있는 0.1 ㎜ 이하 크기의 비드 형태일 수 있다. 지지체의 표면은 알데히드기, 카복실기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기, N-하이드록시석신이미딜기, 활성화 에스터기 등의 작용기, 특히 에폭시기로 기능화될 수 있다. 프로브를 고정화한 후에는 잔여 아민과 에폭시기 등의 작용기를 블록킹하여 배경신호를 감소시키는 처리를 거쳐 안정화할 수 있다(실시예 5 참조).
본 발명에서, PNA 프로브는 지지체 상의 복수의 독립된 영역에 고정화되어 복수의 샘플에 대해 동시에 검출을 수행할 수 있다. 예를 들어, 도 3에 그리드가 4개와 8개로 나누어져 한 번에 다수의 샘플에 대해 검출을 수행할 수 있는 PNA 칩 및 상기 PNA 칩 상의 프로브의 종류 및 위치를 나타내었다.
4. PNA 칩에서 반응 및 분석조건 수립
본 발명에 따른 STI 원인균의 유전자형 검출방법은
⒜ 상기 PNA 칩에 STI 원인균의 표적 DNA를 가하고;
⒝ 상기 PNA 칩의 PNA 프로브와 STI 원인균 DNA를 혼성화 반응시키고;
⒞ PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는:
단계를 포함한다.
단계 ⒜에서, 표적 DNA로는 상기 16종의 STI 원인균 중에서 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 제외한 15종은 서열번호 45의 정방향 프라이머 및 서열번호 46의 역방향 프라이머를 이용하고, 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 서열번호 45의 정방향 프라이머 및 서열번호 47의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 산물을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 정방향 프라이머로서 서열번호 45의 프라이머와, 역방향 프라이머로서 서열번호 46의 프라이머 및 서열번호 47의 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR을 수행함으로써, 16종의 STI 원인균의 DNA를 동시에 증폭할 수 있다. 상기 프라이머는 5′ 말단에 바이오틴(biotin)이 표지된 것이 바람직하다.
단계 ⒝에서, PNA 프로브와 표적 핵산의 혼성화 반응이 잘 일어날 수 있도록 적당한 성분을 포함하는 혼성화 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 프라이머 말단에 표지되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색하는 스트렙트아비딘-시아닌 5(Streptavidin-cyanine 5)를 첨가하여 혼성화 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 혼성화 반응 후에는, 반응되지 않은 잔여 표적 핵산과 비특이적 반응물을 효과적으로 제거할 수 있는 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
단계 ⒞에서, 검출 수단으로는 DNA/DNA 혼성화 반응 유무에 의한 신호를 검출하는 광학적, 전기화학적, 기타 방법을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, Cy5, 바이오틴 결합 화합물, Cy3 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 스트렙트아비딘-시아닌 5를 이용하여 표적 핵산의 말단에 부착되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색되는 형광을 스캐닝(scanning)하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: PNA 올리고머 합성
STI 원인균의 유전자형 검출을 위한 PNA 프로브를 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 각각의 원인균 유전자형에 특이적인 염기서열로 제작하였다. 각 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정화하기 위하여 N-말단에 다중 아민기를 부착하여 합성하였다.
1) PNA 올리고머의 제조
한국등록특허 제464261호의 방법에 따라, PNA 올리고머를 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다.
2) 다중 아민기를 갖는 PNA 프로브의 제조
한국공개특허 제2008-0081750호의 방법에 따라, 1)에서 제조된 레진에 부착된 PNA를 1 M 피페리딘의 DMF(dimethylformamide) 용액으로 20 분간 처리하여 N-말단의 Fmoc 보호기를 제거한 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 ⒜). 1 당량의 비스 Fmoc 단량체에 1 당량의 HOBt(1-hydroxybenzotriazole), 2 당량의 DIC (diisopropylcarbodiimide) 및 DMF를 가하고 1 시간 동안 흔들어 준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 ⒝). 5% 무수 초산(acetic anhydride)과 6% 루티딘(lutidin)이 함유된 DMF를 첨가하고 상온에서 5 분간 흔들어준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 ⒞). 상기 ⒜-⒞ 과정을 2-3회 반복하여 실시하고 최종적으로 ⒜ 과정을 반복하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 아민기가 4개인 경우 2회 반복하고 8개인 경우 3회 반복하였다. PNA가 부착된 레진을 m-크레솔/TFA(trifluoroacetic acid)(1/4 v/v) 용액으로 2 시간 처리하여 PNA를 레진으로부터 떼어내고, 에테르(ether)로 처리하여 석출시킨 후 HPLC로 정제하여 다중 아민기가 포함된 프로브를 제작하였다.
실시예 2: 표적 DNA의 제조를 위한 프라이머 합성
STI 원인균의 표적 DNA 제조를 위한 서열번호 45의 정방향 프라이머는 문헌 (Appl Environ Microbiol. 64:759-799, 1998)을 참고로 하여 디자인되었으며, 서열번호 46 및 47의 역방향 프라이머는 본 발명에 의해 디자인되었다. 서열번호 47은 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 증폭을 위한 역방향 프라이머로 사용되었으며, 그 외 원인균은 서열번호 46의 프라이머를 역방향 프라이머로 사용하였다.
Figure pat00002
상기 프라이머는 혼성화 반응 후 확인을 위하여 5′말단에 바이오틴이 부착되어 혼성화 반응 동안 스트렙트아비딘-시아닌 5와 결합하도록 제작하였다.
실시예 3: 재조합 클론 제조
STI 원인균의 ITS 지역의 표적 핵산을 포함하도록 표 3의 프라이머로 증폭하여 각각의 STI 원인균에 대한 ITS 지역의 PCR 산물을 확보하였다. PCR 산물을 pGEM-T-이지 벡터(Promega, USA)에 삽입하여 대장균 JM109(Stratagene, USA)를 통하여 클로닝하고, 염기서열분석으로 각각의 원인균 유전자형을 확인하였다.
본 실시예에서 사용된 균주는 다음과 같다:
Klebsiella oxytoca (KCTC 1686),
Enterococcus faecium (KCTC 2022),
Proteus mirabilis (KCTC 2510),
Haemophilus ducreyi (KCTC 2745),
Peptostreptococcus prevotii (KCTC 3319),
Gardnerella vaginalis (KCTC 5096),
Prevotella buccae (KCTC 5317),
Veillonella sp. (KCTC 5487),
Staphylococus epidermidis (KCTC 13170),
Streptococcus sp. (ATCC 15678),
Neisseria gonorrheae (ATCC 21823),
Treponema pallidum (ATCC 27087),
Ureaplasma urealyticum (ATCC 27814),
Mycoplasma genitalium (ATCC 49898),
Candida albicans (ATCC 10231)
실시예 4: 표적 핵산의 제조
실시예 3의 방법으로 클로닝하여 제조한 각각의 STI 원인균의 표적 DNA를 이용하였다. 하기 조건으로 PCR을 수행하여 DNA를 증폭하였다:
주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 3 ㎕, 표 3에 나타낸 1개의 바이오틴화 센스 프라이머(1 pmol/㎕) 1 ㎕, 2개의 바이오틴화 안티센스 프라이머(10 pmol/㎕) 각각 5 ㎕, dNTP(25 mM) 3 ㎕, 10× Taq 완충액(MgCl2 포함) 5 ㎕, Taq(5 유닛/㎕, 솔젠트(한국)) 0.6 ㎕, 증류수 30.4 ㎕의 조성으로 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃에서 60초, 50℃에서 60초 및 72℃에서 90초를 40회 반복한다. 반응이 끝난 PCR 산물(600~950 bp, 5 ㎕)에 젤 로딩 완충액을 가하고 1.5% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 후 1 ㎍/㎖ 에티디움브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV-transilluminator)에서 산물을 확인하였다. 전기영동한 결과를 도 2에 나타내었다(레인 1: K. oxytoca, 레인 2: E. faecium, 레인 3: P. mirabilis, 레인 4: H. ducreyi, 레인 5: P. prevotii, 레인 6: G. vaginalis, 레인 7: P. buccae, 레인 8: V. sp., 레인 9: S. epidermidis, 레인 10: S. sp., 레인 11: N. gonorrheae, 레인 12: T. pallidum, 레인 13: U. urealyticum, 레인 14: M. genitalium, 및 레인 15: Candida albicans).
실시예 5: PNA 칩의 제작
상기 표 2에 나타낸 서열번호 1 내지 44의 정제된 PNA 올리고머를 스팟팅 완충액에 50 mM로 희석하여 에폭시기로 기능화된 유리판에 핀 방식으로 스팟팅하고, 80% 습도가 유지되는 상온에서 5시간 동안 정치하였다. 이후 과정은 한국공개특허 제2008-0081750호의 방법을 따라 진행하였다.
실시예 6: PNA 칩에서의 표적 핵산과의 혼성화 반응
혼성화 반응 완충액 95 ㎕에 바이오틴이 표지된 PCR 산물을 5 ㎕를 첨가하여 사용하고, 이때 형광 반응을 일으키기 위하여 스트렙트아비딘-시아닌5를 첨가하였다. 20분간 방치되었던 유리 슬라이드의 실리콘 반응기 구멍을 통하여 100 ㎕의 혼성화 반응 혼합액을 주입하고, 50℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후에 세척 완충액으로 상온에서 5분간 2회 세척하고 건조 후 PNA 칩의 이미지를 스캐닝하여 결과를 분석하였다(Genepix 4000B, Exon, USA).
도 4에 각각의 원인균의 클론을 이용하여 본 발명의 일례에 따른 PNA 칩으로 유전자형 검출 결과를 나타내었다. 도 5에는 2종의 원인균의 중복감염에 대한 각각의 유전자형 검출에 대해 본 발명의 일례에 따른 PNA 칩으로 검출한 결과를 나타내었다. 상기 도면에 나타난 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르면, STI 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 신속·간편한 방법으로 수행할 수 있고, 하나 이상의 원인균 감염에 의한 중복감염 원인균의 유전자형도 정확하게 검출할 수 있다.
<110> Panagene, Co. <120> PNA probes, kits and methods for the diagnosis of sexually transmitted infections or for the genotyping of pathogens causing the same <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 1 cacttgctgg ttcgt 15 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 2 acttgccttt gtagtg 16 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 tttagcctca agca 14 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 tcggacttct atcgc 15 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 cgtgttatgt gcag 14 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 taccacttat ctgacg 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 gtatattggt gagtct 16 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 8 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Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 44 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출을 위한 PNA 프로브.
  2. 지지체 상에 제1항에 따른 PNA 프로브를 포함하는, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트.
  3. 제2항에 있어서, PNA 프로브가 지지체 상의 복수의 독립된 영역에 고정화되어 있어 복수의 샘플에 대해 동시에 검출을 수행할 수 있는, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트.
  4. 제2항에 있어서, 지지체가 유리 슬라이드, 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나일론, 폴리디메틸실록산(PDMS), 셀룰로스 및 니트로셀룰로스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 키트.
  5. ⒜ 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 진단 또는 검출 키트에 성 매개성 감염 원인균의 표적 DNA를 가하고;
    ⒝ 상기 진단 또는 검출 키트의 PNA 프로브와 성 매개성 감염 원인균의 표적 DNA를 혼성화 반응시키고;
    ⒞ PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는;
    단계를 포함하는, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 ⒜에서 성 매개성 감염 원인균의 표적 DNA는 비대칭 PCR을 수행하여 증폭된 것인, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 정방향 프라이머로서 서열번호 45의 프라이머와, 역방향 프라이머로서 서열번호 46의 프라이머 및 서열번호 47의 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR을 수행하는 것인, 성 매개성 감염 진단 또는 원인균의 유전자형 검출 방법.
  8. 성 매개성 감염 원인균의 DNA에 대해 정방향 프라이머로서 서열번호 45의 프라이머와, 역방향 프라이머로서 서열번호 46의 프라이머 및 서열번호 47의 프라이머를 사용하여 비대칭 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 성 매개성 감염 원인균 DNA의 증폭 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20140046688A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.

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KR20140046688A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.

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