KR20110081717A - 항바이러스제 내성을 갖는 ｂ형 간염 바이러스 검출을 위한 ｐｎａ 프로브, 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 급·만성 간염의 원인인 B형 간염바이러스(HBV)의 경구용 항바이러스제, 즉 라미부딘, 아데포비어 및 엔테카비어에 대한 내성 돌연변이 검출을 위한 PNA 프로브, 상기 프로브를 포함하는 HBV 항바이러스제 내성 돌연변이 검출 키트, 및 상기 키트를 이용한 HBV 항바이러스제 내성 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 PNA 프로브를 이용한 급·만성 간염의 원인인 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, 이하 'HBV'라 한다)의 항바이러스제 내성 돌연변이 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 경구용 B형 간염 치료제에 대한 내성을 일으키는 HBV 역전사효소(reverse transcriptase, rt) 유전자 내의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브, 상기 PNA 프로브를 포함하는 항바이러스제 내성 HBV 검출 키트, 및 상기 키트를 이용한 항바이러스제 내성 HBV 검출 방법에 관한 것이다.
B형 간염 백신 및 치료방법이 발전하고는 있지만, 전 세계적으로 약 20억 이상의 인구가 B형 간염에 감염되어 있으며, 이 중 3억 5천만 명이 간경변증이나 간암 등으로 만성화되어 성인 사망의 높은 원인이 되고 있다(Hepatitis B virus epidemiology, disease burden, treatment, and current and emerging prevention and control measures, J Viral Hepatol 11:97-107, 2004).
만성 B형 간염의 치료를 위해 인터페론과 같은 면역조절제 및 다양한 종류의 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어, 라미부딘(lamivudine, LMV), 아데포비어(adefovir, ADV), 엔테카비어(entecavir, ETV) 등이 널리 사용되고 있다(Effects of extended lamivudine therapy B, Gastroenterology, 119:172-180, 2000; A one year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. N Engl J Med 339:61-38, 1998). 이들 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체는 대부분의 환자에서 HBV의 RNA-의존 DNA 중합효소(RNA-dependent DNA polymerase, 역전사효소)의 활성을 감소시키거나, HBV-DNA 중합효소의 시발(priming)을 억제하는 기전을 통해 바이러스의 증식을 제어한다(Successful treatment of an Entecavir-Resistant Hepatitis B virus variant, J Med Virol. 79:1811-1817, 2007).
하지만 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 장기간 복용할 경우 역전사효소의 유전자 내 돌연변이가 유발되어, 항바이러스제에 대한 내성을 획득하게 된다. 도 1에 HBV 역전사효소 유전자의 도메인(domains) 및 돌연변이 명명을 나타내었다. 라미부딘에 대한 내성을 갖는 변종은 HBV 역전사효소 유전자의 A 도메인(rtL80V/I), B 도메인(rtV173L)과 C 도메인(rtM204V/I/S, rtV207I)에서 변이가 일어나고, 아데포비어-내성 변종은 HBV 역전사효소 유전자의 B 도메인(rtA181V/T)과 D 도메인(rtN236T)에서 변이가 일어나며, 엔테카비어-내성 변종은 HBV 역전사효소 유전자의 B 도메인(trI169T, rtT184G/S), C 도메인(rtS202G/I)과 E 도메인(rtM250V)에서 변이가 일어난다(Determination of lamivudine-resistant variants of hepatitis B virus by denaturing gradient gel electrophoresis; A novel approach to monitoring drug resistance, Med Sci Monit, 14:CR281-285, 2008).
항바이러스제 내성 바이러스가 출현할 경우, 해당 항바이러스제에 대한 감수성이 현저히 감소하여 치료제를 투여하여도 바이러스의 증식이 억제되지 않는다. 이 경우, 다른 기전의 항바이러스제를 투여하여야 치료의 효과를 볼 수 있다. 또는 치료 초기부터 작용 기전이 다른 항바이러스제의 병용요법(combined therapy)을 사용하여 항바이러스제 내성 변이종의 출현을 줄이거나 늦추어 항바이러스 요법의 치료 효과를 향상시킬 수 있다(Resistance to adefovir in patients with chronic hepatitis B, Korean J Hepatol 12:484-492, 2006). 따라서 B형 간염의 효과적인 치료를 위해서는, 감염 초기에 바이러스의 돌연변이 여부 판단은 물론, 약물 투여 중 정기적으로 바이러스의 돌연변이 유무를 확인하여 항바이러스제에 대한 내성을 획득했는지 여부를 확인할 필요가 있다.
항바이러스제 내성 HBV 변종을 검출하기 위한 방법으로는 주로 염기서열분석법이나 최근 연구되고 있는 PCR-RFMP(restriction fragment mass polymorphism) 방법이 있다. 그러나, 이들 방법은 고가의 장비를 필요로 하며, 진단 결과를 얻기까지 소요되는 시간이 길다는 단점이 있다. 특히, 염기서열분석법은 내성 발생 초기에 변이종이 미량 또는 전체 바이러스의 20% 이하를 차지하는 경우에는 검출이 불가능할 수 있다는 단점을 갖고 있다(Pyrosequencing for Detection of Lamivudine-Resistance Hepatitis B virus, J Clin Microbiol., 42:4788-4795, 2004; HBV mutation during antiviral therapy in patients with chronic hepatitis B, Korean J Hepatol, 11:311-319, 2005).
좀 더 고전적인 방법으로는 RFLP(Restriction fragment length polymorphism)법이 있다. 이 방법은 하나의 검체를 대상으로 각각의 돌연변이에 대한 PCR 및 제한효소 처리를 거쳐야 하는 번거로움이 있고, 돌연변이로 전이되는 단계에서는 검출하기 어렵고 재현성이 떨어진다는 단점이 있다(Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine. J Clin Microbiol, 37:3338-3347, 1999). 또 다른 방법인 라인 프로브 어세이(line probe assay, LiPA)는 미량의 바이러스가 존재하여도 검출할 수 있는 장점은 있으나, 인접 부위의 돌연변이에 의해 위양성(false positive)이 발생할 수 있고, 하나의 스트립 안에서 하나의 샘플만을 검사할 수 있어 다량의 샘플을 동시에 검사하기 어려우며 많은 시간과 노동력이 소모되는 단점이 있다. 또한, 다른 방법에 비해 비교적 여러 단계를 거쳐야 하는 단점도 있다(Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus-infected patients during lamivudine therapy: evaluation of performance of INNO-LiPA HBV DR assay, J Clin Microbiol, 40:3729-3734, 2002).
DNA 마이크로어레이 기술을 이용하여 최근에 개발된 라미부딘 내성 돌연변이 검출 키트(한국등록특허 제650,162호 및 Oilgonucleotide chip for Detection of Lamivudine-resistant Hepatitis B virus, J Clin Microbiol, 42:4181-4188, 2004)들은 특수 코팅된 유리 슬라이드 상에 항바이러스제 내성 HBV 변종을 검출할 수 있는 DNA 프로브를 고정하고, PCR로 증폭된 산물과 혼성화하여 나타나는 반응을 동시에 분석할 수 있는 것이다. 이러한 항바이러스제 내성 HBV DNA 검출용 마이크로어레이 기술은 단시간 내에 HBV의 항바이러스제 내성 돌연변이를 신속하게 검출할 수 있다. 뿐만 아니라, 야생형과 돌연변이형이 혼합되어 있어도 검출이 가능한 민감한 방법으로 항바이러스제 내성 진단에 주로 이용되고 있다. 그러나 DNA 마이크로어레이는 슬라이드에 고정된 DNA 프로브 자체가 생물학적 및 화학적으로 안정성이 매우 낮아 핵산분해효소(nuclease) 등에 의해 쉽게 분해되어 보존 기간 및 상태에 따라 DNA 프로브가 분해되거나 반응 능력이 떨어질 수 있는 문제점이 있다(한국공개특허 제2008-0086687호).
1991년 넬슨(Nielsen)에 의해 개발된 PNA는 핵산분해효소와 같은 생분해효소 등이 인지하지 못하여 DNA나 RNA보다 안정성이 매우 높다(Peptide nucleic acid, PNA, sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, Science, 254:1497-1500, 1991). 도 2에 DNA와 PNA의 기본 구조의 차이를 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, PNA는 DNA의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, DNA와 같은 아데닌, 티민, 구아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA나 RNA와 혼성화 반응을 일으킬 수 있다. 또한 PNA는 전기적으로 중성이라 PNA/DNA 및 PNA/RNA 혼성화가 DNA/DNA, DNA/RNA 상보결합의 친화력보다 크고, DNA 또는 RNA와 친화력이 강한 만큼 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 상보결합에서 부정합(mismatch)에 대하여 더욱 민감하다(PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature, 365:566-568, 1993). 이러한 이유로 DNA 올리고머를 대신하여 PNA 올리고머를 이용하여 분석 또는 진단하는 방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(한국공개특허 제2006-0091708호 및 제2005-0122544호; Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors, Trends Biotechnol, 22: 617-622, 2004; Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support, BMC technology, 5:1-5, 2005).
특히, 본 출원인에 의해 출원된 한국공개특허 제2008-0086687호(2008.09.26. 공개)는 라미부딘 내성과 관련된 rt180, rt204 또는 rt207의 야생형 또는 변종 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브와, 이들이 지지체 상에 고정되어 있는 PNA 어레이를 사용하여 라미부딘 내성 HBV를 검출하는 기술을 개시하고 있다. 이 기술에 따르면, 라미부딘 내성을 일으키는 HBV 변종을 높은 민감도 및 특이도로 검출 분석할 수 있다. 그러나, 이는 라미부딘 내성과 관련된 부위 중 rt180, rt204 및 rt207에 결합하는 프로브를 사용하는 것으로 rt80 및 rt173에 결합하는 프로브는 포함되어 있지 않은 것이다. 또한, 라미부딘 단독에 대한 내성 변이만을 검출하는 것으로, 만성 B형 간염의 병용요법 등에 사용되는 아데포비어나 엔테카비어, 또는 이들과 라미부딘에 대한 내성 변이를 모두 한 번에 하나의 칩으로 검출하는 것은 불가능한 것이었다.
본 발명자들은, 상기 한국공개특허 제2008-0086687호에 이어서, PNA 프로브를 이용하여 라미부딘 내성과 관련된 부위 중 rt80 및/또는 rt173의 돌연변이를 검출할 수 있는 기술, 및 나아가 라미부딘 내성은 물론 아데포비어 및 엔테카비어 내성 HBV를 검출해낼 수 있는 기술을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 특정 PNA 프로브, 및 HBV 검출 키트 및 방법을 사용함으로써 상기 목적을 성공적으로 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 다양한 항바이러스제 내성 HBV의 역전사효소 유전자 내 돌연변이를 높은 특이도 및 민감도로 정확하게 검출할 수 있는 생물학적 효소에 안정한 PNA 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 항바이러스제 내성 HBV 검출키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출키트를 이용한 항바이러스제 내성 HBV의 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비대칭 원-튜브 네스티드 PCR(asymmetric one-tube nested PCR)을 이용하여 HBV DNA를 증폭하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은 서열번호 1 내지 20, 및 22 내지 76 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 PNA에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은
(ⅰ) 라미부딘 내성과 관련된 rt80, rt173, rt180, rt204 또는 rt207의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브;
(ⅱ) 아데포비어 내성과 관련된 rt181 또는 rt236의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브; 및
(ⅲ) 엔테카비어 내성과 관련된 rt169, rt184, rt202 또는 rt250의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브:
중 하나 이상의 PNA 프로브를 포함하는, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트에 관한 것이다. 본 출원인에 의해 출원된 한국공개특허 제2008-0086687호에 rt180, rt204 또는 rt207의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브를 포함하는 라미부딘 내성 HBV의 검출 키트가 개시되어 있으므로, 본 발명은 ⅰ)로서 rt180, rt204 또는 rt207의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브만을 포함하는 경우, ⅱ), ⅲ), 또는 ⅱ) 및 ⅲ)의 PNA 프로브를 함께 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은
(a) 상기 검출 키트에 HBV DNA를 가하고;
(b) 상기 검출 키트의 PNA 프로브와 HBV DNA를 혼성화 반응시키고;
(c) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 시그널을 검출하는;
단계를 포함하는, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4면은
HBV DNA에 대해 하나의 튜브 내에서 정방향 프라이머로서 서열번호 79의 프라이머 및 서열번호 80의 프라이머를, 역방향 프라이머로서 서열번호 81의 프라이머를 사용하여 비대칭 네스티드 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, HBV DNA의 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 항바이러스제 내성을 나타내는 주된 변이인 HBV의 역전사효소 내의 특정 코돈 돌연변이를 정확하게 검출할 수 있고, 하나 이상의 코돈 돌연변이도 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 이용하여 항바이러스제에 대한 내성 HBV를 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있다. 이에 따라, 장기간 치료로 인해 항바이러스제 내성을 나타내는 HBV를 단시간 내에 우수한 민감도와 특이도로 검출 및 분석할 수 있어 항바이러스제로 치료 중인 환자의 추적 검사에 이용할 수 있으며, 바이러스가 해당 치료제에 대한 내성을 갖는지 유무를 조기에 진단할 수 있어 항바이러스제 치료의 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 HBV 역전사효소 유전자의 도메인 및 돌연변이 명명을 나타내는 도면이고;
도 2는 DNA와 PNA의 기본 구조의 차이를 나타내는 도면이며;
도 3은 각 코돈의 돌연변이 검출을 위한 후보군 프로브 중 선별된 최적 프로브를 보여주는 도면이고;
도 4는 항바이러스제 내성 HBV 돌연변이의 핵산을 증폭한 후 전기영동한 결과를 보여주는 도면이며;
도 5는 본 발명의 일례에 따른 하나의 슬라이드 안에 4개 또는 8개의 샘플을 검출할 수 있는 칩과 칩에서의 스팟 위치 및 검출 표적 유형을 표시한 도면이고;
도 6은 본 발명의 일례에 따른 PNA 어레이로 HBV의 야생형과 항바이러스제 내성과 관련된 돌연변이를 검출한 결과를 보여주는 도면이며;
도 7a는 환자의 혈청에서 분리된 HBV DNA에 대해 종래의 염기서열분석법을 이용하여 항바이러스제 내성 유형을 검출한 결과를 보여주는 도면이고;
도 7b는 환자의 혈청에서 분리된 HBV DNA에 대해 본 발명의 일례에 따른 PNA 어레이를 이용하여 항바이러스제 내성 유형을 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
도 2는 DNA와 PNA의 기본 구조의 차이를 나타내는 도면이며;
도 3은 각 코돈의 돌연변이 검출을 위한 후보군 프로브 중 선별된 최적 프로브를 보여주는 도면이고;
도 4는 항바이러스제 내성 HBV 돌연변이의 핵산을 증폭한 후 전기영동한 결과를 보여주는 도면이며;
도 5는 본 발명의 일례에 따른 하나의 슬라이드 안에 4개 또는 8개의 샘플을 검출할 수 있는 칩과 칩에서의 스팟 위치 및 검출 표적 유형을 표시한 도면이고;
도 6은 본 발명의 일례에 따른 PNA 어레이로 HBV의 야생형과 항바이러스제 내성과 관련된 돌연변이를 검출한 결과를 보여주는 도면이며;
도 7a는 환자의 혈청에서 분리된 HBV DNA에 대해 종래의 염기서열분석법을 이용하여 항바이러스제 내성 유형을 검출한 결과를 보여주는 도면이고;
도 7b는 환자의 혈청에서 분리된 HBV DNA에 대해 본 발명의 일례에 따른 PNA 어레이를 이용하여 항바이러스제 내성 유형을 검출한 결과를 보여주는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 클론 확보 및 서열분석
HBV에 감염된 B형 간염 환자의 샘플을 하기 표 2에 나타낸 서열번호 77 및 78의 프라이머로 PCR 증폭하고, 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝(cloning)하였다. 여기서 얻은 클론들을 대장균 JM109에 형질전환하여 DNA를 대량 확보하고, 확보한 클론 DNA를 서열분석하여 HBV의 야생형 유전자 염기서열임을 확인하였다. 유전자형이 확인된 클론은 본 발명의 PNA 어레이 반응조건 확립 시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다. 항바이러스제 내성 HBV 돌연변이 유전자형이 확인된 임상 검체는 본 발명의 PNA 어레이 정확도 분석에 사용하였다.
2. PNA 프로브의 설계 및 제작
항바이러스제 내성 HBV를 검출하기 위한 프로브로서, 항바이러스제 내성을 유도하는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열, 즉 HBV 역전사효소 유전자의 A 내지 E 도메인 내의 돌연변이 염기서열을 포함하는 PNA 프로브를 고안하였다.
라미부딘 내성 HBV를 검출하기 위한 프로브 중 rt180, rt204 또는 rt207 부위에 결합하는 프로브는 본 출원인에 의해 출원된 한국공개특허 제2008-0086687호에 개시된 프로브를 참고하여 고안하였다.
각 코돈에 대한 야생형과 돌연변이 검출을 위한 프로브는 하나의 표적에 2 이상의 후보군 프로브를 고안하여 선별하였다. 특히, 각 부위의 점 돌연변이를 검출할 수 있는 프로브를 설계할 때, 프로브 염기 서열 길이는 12 내지 18머 정도로, 염기서열 내 G, A(퓨린)의 비율이 60% 이하로, 프로브 염기서열 내에서 상보 서열을 갖지 않도록 적절한 프로브 염기서열을 5-10가지 제작하였으며, 엄격한 조건 하의 혼성화 반응에서 혼성화하는 프로브만을 선별하였다.
도 3a 내지 3k는 표 1의 서열번호 1 내지 76의 프로브를 선정하는 과정으로 후보군 프로브 중 비특이 반응이 발생하는 프로브는 제외하였다. 특이 반응 시그널이 강한 프로브를 최적 프로브로 선정하였고, 선정된 프로브는 빨간색 별표로 표시하였다. 일례로, 도 3a의 80I1의 경우, 4개의 후보군 프로브 중 80I1-2, 3, 4는 비특이 반응이 발생하여 제외하였고, 나머지 80I1-1을 최적 프로브로 선정하였다. 모든 표적 코돈의 프로브는 동일한 분석 과정을 거쳐 선정하였다.
표 1에 HBV 역전사효소 유전자 내 A 내지 E 도메인의 코돈과 본 발명에 따른 PNA 프로브의 염기서열, 유형 및 서열번호를 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로브는 각각의 HBV 역전사효소 유전자의 돌연변이에 따라 서열번호 1 내지 76에 기재된 염기서열로 이루어진다. 서열번호 1 내지 8, 14 내지 22, 51 내지 59의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 라미부딘 내성 변종을 검출하기 위한 것이고, 서열번호 23 내지 31, 및 60 내지 71의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 아데포비어 내성 변종을 검출하기 위한 것이며, 서열번호 9 내지 13, 32 내지 50, 및 72 내지 76의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 엔테카비어 내성 변종을 검출하기 위한 것이다. 서열번호 1 내지 20, 및 서열번호 22 내지 76의 PNA 프로브는 본 발명에 의해 새로이 설계되어 항바이러스제 내성 HBV의 신속·정확한 검출이라는 목적 및 효과를 달성하는 것으로, 그 자체로 본 발명의 일 면을 구성한다.
본 발명의 PNA 프로브는, 지지체 상에 효율적으로 고정화하기 위해, N-말단에 아민 또는 티올과 같은 고정화에 필요한 작용기를 가질 수 있으나, 작용기의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 본 발명의 PNA 프로브가 N-말단에 아민기를 갖는 경우, 한국공개특허 제2008-0056096호에 개시된 바와 같은 하기 화학식 1의 다중 아민기(multi-amine linker)를 갖는 것이 바람직하나, 본 발명의 범위가 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
상기 식에서,
L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 선형 사슬이고, 상기 탄소수 1 내지 10의 선형 사슬은 1 내지 3개의 산소를 더 포함할 수 있으며;
X는 CH 또는 N이고;
m은 2 내지 10의 정수이며;
n은 0 또는 1이다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(Synthesis of Peptide Nucleic Acid Monomers Containing the Four Natural Nucleobases: Thymine, Cytosine, Adenine, and Guanine and Their Oligomerization, J Org Chem 59:5767-5773, 1994; Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Peptide Sci. 3:175-183, 1995; Fmoc mediated synthesis of Peptide Nucleic Acids, Tetrahedron Lett 51:6179-6194, 1995). 화학식 1의 다중 아민기를 갖는 PNA는 상기 합성된 PNA 또는 PNA와 결합된 스페이서(spacer)의 N-말단에 1개의 카복실기와 2개 이상의 분지된 아민기를 갖는 덴드론 단량체를 2회 이상 순차적으로 결합시켜 합성되는바, 구체적으로는 (i) PNA 올리고머의 아민기에 결합되어 있는 보호기의 탈보호(deprotection), (ii) 다중 아민기를 갖는 덴드론 단량체와 PNA의 커플링(coupling) 및 (iii) 캡핑(capping)의 3단계를 거쳐 합성될 수 있다(한국공개특허 제2008-0056096호).
본 발명에서 프로브로 이용된 PNA의 펩타이드 결합 형태로 변화된 기본골격(backbone)의 구조적 차이는 DNA나 RNA의 포스페이트 골격의 음이온성 성질을 중성 성질로 바꾸었다. 이러한 중성화로 인한 정전기적 반발력의 제거는 혼성화 반응 시 결합력이 높아지는 직접적 원인이 되며, 혼성화 반응속도가 빠를 뿐만 아니라 특이도도 매우 높아 PM(Perfect Match)과 MM(Miss Match)의 구별이 명확해진다. 이러한 이유로 SNP(single nucleotide polymorphism)과 같은 단일 염기 변이 검출에 유용하게 사용될 수 있다. 아울러, PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하여 보관이나 사용 시 환경변화나 기타 요소들에 의해 영향을 받지 않으므로, DNA 프로브를 이용한 상업적인 HBV 돌연변이 진단, 예들 들어, 서던 블랏, 도트 블랏 하이브리디제이션, 라인 프로브 어세이, 비드 어레이, 마이크로어레이 등에 DNA 프로브를 대신하여 사용하기에 용이할 것으로 기대된다.
3. PNA 어레이의 제작
상기 2.에서 설계된 프로브는 유리 슬라이드, 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스 등의 지지체 위에 고정화 가능하며, 특히 유리 슬라이드에 고정화될 수 있다. 지지체의 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어 유리 슬라이드와 같이 손으로 잡을 수 있는 박판(薄板) 형태뿐만 아니라, 튜브 형태, 또는 액체에 혼합하여 이송할 수 있는 0.1 ㎜ 이하 크기의 비드 형태일 수 있다. 지지체의 표면은 알데히드기, 카복실기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기, N-하이드록시석신이미딜기, 활성화 에스터기 등의 작용기, 특히 에폭시기로 기능화될 수 있다. 프로브를 지지체에 고정화한 후에는 잔여 아민과 에폭시기 등의 작용기를 블록킹 단계를 거쳐 안정화할 수 있다.
본 발명에서, PNA 프로브는 지지체 상의 복수의, 예를 들어, 4개 또는 8개의 의 독립된 영역에 고정화되어 복수의, 예를 들어, 4개 또는 8개의 샘플을 동시에 검출할 수 있다(도 5 참조).
4. PNA 어레이에서 반응 및 분석조건 수립
본 발명에 따른 항바이러스제 내성 HBV의 검출방법은
(a) 상기 PNA 어레이에 HBV DNA를 가하고;
(b) PNA 프로브와 HBV DNA를 혼성화 반응시키고;
(c) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 시그널을 검출하는:
단계를 포함한다.
단계 (a)에서, HBV DNA는 PCR에 의해 증폭되는 것이 바람직하다. 증폭산물은 하나의 반응기에서 2개의 정방향 프라이머(forward primer)와 1개 역방향 프라이머(reverse primer)를 사용하여 네스티드 PCR을 수행함으로써 확보될 수 있다. 즉, 외부(outer) 및 내부(inner) 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 각각 1개씩으로 구성된 비대칭(asymmetric) 원 튜브 네스티드 PCR(one tube nested PCR)을 수행함으로써, 기존 네스티드 PCR에 비해 1회 반응으로 증폭이 가능하여 간편하고, 오염의 위험이 적다. 또한 프라이머 조합에 의해 2종류의 단일가닥(single strand)이 생산되고, 이들 중 외부 프라미어 산물의 일부는 내부 프라이머의 주형으로 사용되므로 PCR 민감도가 높아지며, 이를 어레이에 반응시키는 경우 시그날 세기가 증가하게 된다. 구체적으로, HBV DNA는 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 79 내지 81의 바이오틴(biotin)이 말단에 표지된 프라이머를 이용하여, 약물 치료 중인 HBV 감염 환자로부터 분리된 DNA를 PCR에 의해 증폭하여 사용하는 것이 바람직하다.
| 방향 | 프라이머 이름 | 염기서열(5′→3′) | 서열번호 |
| 정방향 | HBPr 950 | CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC | 77 |
| 역방향 | HBPr | GCAAAGCCCAAAAGACCCAC | 78 |
| 정방향 | M977-b | biotin-TGGCCAAAATTCGCAGTCCC | 79 |
| 정방향 | HB-F3-b | biotin-CTTGTATTCCCATCCCATCATC | 80 |
| 역방향 | HBPr-b | biotin-GCAAAGCCCAAAAGACCCAC | 81 |
단계 (b)에서, PNA 프로브와 표적 핵산의 혼성화 반응이 잘 일어날 수 있도록 적당한 성분을 포함하는 혼성화 완충 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 이 때 프라이머 말단에 표지되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색하는 스트렙트아비딘-시아닌 5(Streptavidin-cyanine 5)를 첨가하여 혼성화하는 것이 바람직하다. 혼성화 반응 후에는, 반응되지 않은 잔여 표적 핵산과 비특이적 반응물을 효과적으로 제거할 수 있는 적당한 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
단계 (c)에서, 검출 수단으로는 PNA/DNA 혼성화 반응 유무에 의한 시그널을 검출하는 광학적, 전기화학적, 기타 방법을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, Cy5, 바이오틴 결합 화합물, Cy3 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 스트렙트아비딘-시아닌 5를 이용하여 표적 핵산의 말단에 부착되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색되는 형광을 스캐닝(scanning)하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 항바이러스제 내성 진단을 위한 HBV PNA 올리고머 합성
항바이러스제 내성 HBV 유전자형 검출을 위하여 사용한 76개의 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 HBV 역전사효소의 점 돌연변이 유전자형에 특이적인 염기서열로 제작하였다. 각 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정화하기 위하여 N-말단에 다중 아민기를 부착하여 합성하였다.
1) PNA 올리고머의 제조
한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라, PNA 올리고머를 Bts기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다.
2) 다중 아민기를 갖는 PNA 프로브의 제조
1)에서 제조된 레진에 부착된 PNA를 1 M 피페리딘의 DMF(dimethylformamide) 용액으로 20 분간 처리하여 N-말단의 Fmoc 보호기를 제거한 후 DMF로 3회 세척하였다(과정(a)). 1 당량의 비스 Fmoc 단량체에 1 당량의 HOBt(1-hydroxybenzotriazole), 2 당량의 DIC(diisopropylcarbodiimide) 및 DMF를 가하고 1 시간 동안 흔들어준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정(b)). 5% 무수 초산(acetic anhydride)과 6% 루티딘(lutidin)이 함유된 DMF를 첨가하고 상온에서 5 분간 흔들어준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정(c)). 상기 (a)-(c) 과정을 2-3회 반복하여 실시하고 최종적으로 (a) 과정을 반복하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 아민기가 4개인 경우 2회 반복하고 8개인 경우 3회 반복하였다. PNA가 부착된 레진을 m-크레솔/TFA(trifluoroacetic acid)(1/4 v/v) 용액으로 2 시간 처리하여 PNA를 레진으로부터 떼어내고, 에테르(ether)로 처리하여 석출시킨 후 HPLC로 정제하여 다중아민기가 포함된 프로브를 제작하였다.
실시예 2: HBV 역전사효소 점 돌연변이 표적 DNA의 제조를 위한 프라이머 합성
PCR을 2회 수행하는 번거로움을 없애고자, 하나의 튜브에서 네스티드 PCR을 수행하는 원 튜브 네스티드 PCR 방법(Development of a multiplex single-tube nested PCR (MSTNPCR) assay for Vibrio cholerae O1 detection, J Microbiol Methods. 72:191-196, 2008)을 이용하였다. 이를 위해 서열번호 79의 정방향 프라이머 및 서열번호 81의 역방향 프라이머에 추가적으로 서열번호 80의 정방향 프라이머를 사용하였다. 이들 프라이머는 상기 표 2에 나타낸 바와 같은 염기서열을 갖는다.
상기 프라이머는 혼성화 반응후 확인을 위하여 5’말단에 바이오틴이 부착되어 혼성화 반응 동안 스트렙트아비딘-시아닌 5와 결합하도록 제작하였다.
실시예 3: 재조합 HBV 제조
HBV 역전사효소의 유전자내 점 돌연변이를 확인하기 위한 표적 DNA 제조를 위해 문헌(Sensitive line probe assay that simultaneously detection mutations conveying resistance to lamivudine and adefovir, J Clin Microbiol, 44:1094-1097, 2006)에 제시된 프라이머 중 조사 대상 돌연변이 부위를 모두 포함하는 서열번호 77 및 78 부위를 분석하여 사용하였다. 상기 표 2의 프라이머 서열번호 77 및 78을 이용하여 임상 샘플에서 표적 유전자인 HBV 역전사효소 유전자내 A 내지 E 도메인의 PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물을 pGEM-T-이지 벡터(Promega, USA)에 바로 삽입하여 대장균 JM109(Stratagene, USA)를 통하여 클로닝하고, 염기서열분석을 통하여 HBV 역전사효소 유전자의 염기서열임을 확인하였다. 이를 주형으로 표준물질을 제작하기 위해 인위적으로 돌연변이를 유발하는 PCR을 수행하고, PCR 산물을 pGEM-T-이지 벡터에 바로 삽입하여 대장균 JM109를 통하여 클로닝하고, 염기서열분석을 통하여 돌연변이가 발생됨을 확인하였다.
실시예 4: 표적 핵산의 제조
임상 샘플에서 추출한 DNA 및 실시예 3의 방법으로 클로닝하여 제조한 변종 HBV 유전자형 DNA를 이용하였다. 하기 조건으로 PCR을 수행하여 DNA를 증폭하였다:
주형 DNA 용액 4 ㎕과 서열번호 79 내지 81의 프라이머를 포함하는 총 50 ㎕의 PCR 반응 용액을 준비하였다. 이 반응 용액을 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 2분, 72℃에서 1분씩 35회 반응시키고, 다시 94℃에서 30초, 52℃에서 2분, 72℃에서 1분씩 30회 반응시킨 후, 72℃에서 10분간 연장하였다.
반응이 끝난 PCR 산물을 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV-transilluminator)에서 산물을 확인하였다. 전기영동 결과를 도 4에 나타내었다.
실시예 5: PNA 어레이의 제작
상기 표 1에 나타낸 서열번호 1 내지 76의 정제된 PNA 올리고머를 스팟팅 완충액에 50 mM로 희석하여 에폭시기로 기능화 된 유리판에 핀 방식으로 스팟팅하고, 80% 습도가 유지되는 상온에서 9 시간 동안 정치한 후, DMF를 가하여 10 분간 초음파 세척하였다. 0.1 M 석신산무수화물(succinic anhydride)을 첨가한 DMF를 가하고, 10분간 초음파로 반응을 아민기 제거 반응을 활성화 시킨 후, 40℃에서 2시간 동안 반응하지 않은 아민기를 제거하였다. 반응 후 반응액을 제거하고 DMF, 3차 증류수 순으로 15 분간 초음파 세척하였다. 이후 0.1 M 에탄올아민이 함유된 100 mM 트리스 완충액(Tris-HCl)을 가하고 고체 표면의 잔여 에폭시기를 불활성화하였다. 3차 증류수로 15 분간 초음파 세척하는 과정을 2회 반복 후, 끓는 물에서 5 분간 처리하고 3차 증류수로 5 분간 세척 후 건조하였다. 혼성화 반응 동안 반응 용액을 담을 수 있는 실리콘 반응기를 유리판 위에 밀착시켰다. 도 5에 하나의 슬라이드 안에 4개 또는 8개의 샘플을 검출할 수 있는 칩과 칩에서 스팟의 위치를 모식적으로 나타내었다.
실시예 6: PNA 어레이에서의 표적 핵산과의 혼성화 반응
실시예 6에서는 혼성화 완충액 95 ㎕에 바이오틴이 부착된 PCR 산물을 5 ㎕ 첨가하여 사용하고, 이때 형광 반응을 일으키기 위하여 스트렙트아비딘-시아닌5를 첨가하였다. 20분간 방치되었던 유리 슬라이드의 실리콘 반응기 구멍을 통하여 100 ㎕의 혼성화 혼합액을 주입하고, 40℃에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후에 세척 완충액으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조후 PNA 어레이의 이미지를 스캐닝하여 결과를 분석하였다(Genepix 4000B, Exon, USA).
도 6에 각 코돈에 대한 돌연변이형 클론을 이용하여 본 발명의 일례에 따른 PNA 어레이로 HBV의 야생형과 각 코돈에 대한 돌연변이를 검출한 결과를 나타내었다.
도 7은 환자의 혈청에서 분리된 HBV DNA를 본 발명에 의한 PNA 어레이와 종래의 염기서열분석법을 이용하여 항바이러스제 내성 유형을 검출한 결과를 나타낸 것으로, 도 7a는 종래 염기 서열분석법을 이용하여 rt180의 류신이 메티오닌으로, rt204의 메티오닌이 발린으로 치환된 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이며, 도 7b는 본 발명의 일례에 따른 PNA 어레이로 rt180의 류신이 메티오닌으로, rt204의 메티오닌이 발린으로 치환된 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
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<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 48
catctatatg aaacccg 17
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 49
catataaatg aaaccct 17
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 50
catatagatg ataagcc 17
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 51
acatcatcca tataac 16
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 52
acatcatcca cataac 16
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 53
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<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 54
cacatcatcg atataact 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 55
cacatcatca atataact 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 56
cacatcatcg ctataact 18
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 57
ccaataccac atcatc 16
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 58
cccaatacaa tatcatc 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 59
ccccaatact atatcatc 18
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 60
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 61
ttagggttta agtgt 15
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 62
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 63
attaggattt aagtgtat 18
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 64
ttcggagtca aatgt 15
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 65
ttcggagtta aatgt 15
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 66
attacgggtc aaatgta 17
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 67
ttaggggtta aatgt 15
<210> 68
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 68
ttaggtgtca aatgt 15
<210> 69
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 69
ttaggtgtta aatgt 15
<210> 70
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 70
tattaggcgt caaa 14
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 71
attaggcgtt aaatgta 17
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 72
atatcccatg aagtta 16
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 73
catatccaac gaagt 15
<210> 74
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 74
tatccgacga agt 13
<210> 75
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 75
catatcctac gaagtt 16
<210> 76
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe
<400> 76
tatcccacaa gttaa 15
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 77
cgtggtggac ttctctcaat tttc 24
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 78
gcaaagccca aaagacccac 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 79
tggccaaaat tcgcagtccc 20
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 80
cttgtattcc catcccatca tc 22
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 81
gcaaagccca aaagacccac 20
Claims (12)
- 서열번호 1 내지 20, 및 22 내지 76 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 PNA(Peptide Nucleic Acid).
- ⅰ) 라미부딘 내성과 관련된 rt80, rt173, rt180, rt204 또는 rt207의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브;
ⅱ) 아데포비어 내성과 관련된 rt181 또는 rt236의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브; 및
ⅲ) 엔테카비어 내성과 관련된 rt169, rt184, rt202 또는 rt250의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브:
중 하나 이상의 PNA 프로브를 포함하되,
ⅰ)로서 rt180, rt204 또는 rt207의 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브만을 포함하는 경우, ⅱ), ⅲ), 또는 ⅱ) 및 ⅲ)의 PNA 프로브를 함께 포함하는, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트. - 제2항에 있어서, ⅰ)의 PNA 프로브는 서열번호 1 내지 8, 14 내지 22, 51 내지 59 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것인, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트.
- 제2항에 있어서, ⅱ)의 PNA 프로브는 서열번호 23 내지 31, 60 내지 71 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것인, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트.
- 제2항에 있어서, ⅲ)의 PNA 프로브는 서열번호 9 내지 13, 32 내지 50, 72 내지 76 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것인, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트.
- 제2항에 있어서, PNA 프로브가 지지체 상에 고정되어 있는, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트.
- 제6항에 있어서, PNA 프로브가 지지체 상의 복수의 독립된 영역에 고정화되어 있어 복수의 샘플을 동시에 검출할 수 있는, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트.
- 제6항에 있어서, 지지체가 유리 슬라이드, 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나일론, 폴리디메틸실록산(PDMS), 셀룰로스 및 니트로셀룰로스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 키트.
- (a) 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 검출 키트에 HBV DNA를 가하고;
(b) 상기 검출 키트의 PNA 프로브와 HBV DNA를 혼성화 반응시키고;
(c) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 시그널을 검출하는;
단계를 포함하는, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 방법. - 제9항에 있어서, 단계 (a)에서 HBV DNA는 하나의 튜브 내에서 비대칭 네스티드 PCR(asymmetric nested PCR)을 수행하여 증폭된 것인, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 방법.
- 제10항에 있어서, PCR이 정방향 프라이머로서 서열번호 79의 프라이머 및 서열번호 80의 프라이머를, 역방향 프라이머로서 서열번호 81의 프라이머를 사용하여 수행되는 것인, 항바이러스제 내성 HBV의 검출 방법.
- HBV DNA에 대해 하나의 튜브 내에서 정방향 프라이머로서 서열번호 79의 프라이머 및 서열번호 80의 프라이머를, 역방향 프라이머로서 서열번호 81의 프라이머를 사용하여 비대칭 네스티드 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, HBV DNA의 증폭 방법.
Priority Applications (2)
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| KR1020100002014A KR20110081717A (ko) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 항바이러스제 내성을 갖는 ｂ형 간염 바이러스 검출을 위한 ｐｎａ 프로브, 키트 및 방법 |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100002014A KR20110081717A (ko) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 항바이러스제 내성을 갖는 ｂ형 간염 바이러스 검출을 위한 ｐｎａ 프로브, 키트 및 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20110081717A true KR20110081717A (ko) | 2011-07-14 |
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ID=44305623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100002014A KR20110081717A (ko) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 항바이러스제 내성을 갖는 ｂ형 간염 바이러스 검출을 위한 ｐｎａ 프로브, 키트 및 방법 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190106471A (ko) * | 2018-03-09 | 2019-09-18 | 건국대학교 글로컬산학협력단 | 약제 내성 b형 간염 바이러스의 검출 방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6905816B2 (en) * | 2000-11-27 | 2005-06-14 | Intelligent Medical Devices, Inc. | Clinically intelligent diagnostic devices and methods |
| EP1644516A4 (en) * | 2003-07-14 | 2007-03-21 | Capitalbio Corp | METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTING SARS VIRUS AND OTHER INFECTIOUS AGENTS |
| KR20080086687A (ko) * | 2007-03-23 | 2008-09-26 | 주식회사 파나진 | 라미부딘 내성 ｂ형 간염바이러스 검출을 위한 ρνα프로브, 키트 및 방법 |
-
2010
- 2010-01-08 KR KR1020100002014A patent/KR20110081717A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-04-22 WO PCT/KR2010/002532 patent/WO2011083894A1/ko active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190106471A (ko) * | 2018-03-09 | 2019-09-18 | 건국대학교 글로컬산학협력단 | 약제 내성 b형 간염 바이러스의 검출 방법 |
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| WO2011083894A1 (ko) | 2011-07-14 |
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