KR20080086687A - 라미부딘 내성 b형 간염바이러스 검출을 위한 ρνα프로브, 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 급·만성 간염의 원인인 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, 이하 'HBV'라 함)의 라미부딘 내성(lamivudine resistant) 돌연변이 검출을 위한 PNA(peptide nucleic acid) 프로브, 이를 포함하는 라미부딘 내성 HBV 검출키트 및 이를 이용한 라미부딘 내성 HBV 검출방법에 관한 것으로서, 라미부딘 내성을 나타내는 주된 변이인 HBV의 DNA 중합효소 유전자의 B 및 C 영역(domains) 내 rtL180M, rtM204V, rtM204I 및 rtV207I의 돌연변이의 유전자형을 정확하게 검출할 수 있고, 하나 이상의 혼합 돌연변이의 유전자형도 정확하게 검출할 수 있으며, 라미부딘 내성 HBV를 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있다.
PNA 프로브, PNA 칩, B형 간염바이러스, 라미부딘, 약제내성, HBV, Hepatitis B virus
Description
도 1은 HBV DNA 중합효소 유전자의 영역 및 돌연변이 명명을 나타내는 도면이고;
도 2는 DNA와 PNA의 기본구조의 차이를 나타내는 도면이며;
도 3은 표 2의 프라이머를 이용하여 다양한 라미부딘 내성 HBV 돌연변이의 핵산을 증폭한 후 2% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 결과를 보여주는 사진이고;
도 4는 본 발명의 일례에 따른 하나의 슬라이드 안에 4개의 샘플을 검출할 수 있는 칩(a)), 칩의 스팟 위치(b)) 및 스팟 위치에 따른 프로브를 유형별로 표시(c))한 모식도이며;
도 5a 내지 5l은 각각 본 발명의 일례에 따른 PNA 칩으로 HBV의 라미부딘 내성과 관련된 야생형과 돌연변이를 검출한 결과를 보여주는 사진이고;
도 6은 기존의 DNA 칩과 본 발명의 일례에 따른 PNA 칩에서 라미부딘 내성 HBV 돌연변이를 검출하여 정량분석한 신호를 나타낸 그래프이며;
도 7은 기존의 DNA 칩과 본 발명의 PNA 칩의 각 프로브에 대한 특이신호와 S/N 비율을 비교하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 PNA 프로브를 이용한 급·만성 간염의 원인인 B형 간염바이러스(Hepatitis B virus, 이하 'HBV'라 함)의 항생제 내성 점 돌연변이(변종) 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 만성 B형 간염 치료제인 라미부딘(lamivudine)에 대한 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자 내의 점 돌연변이를 검출하기 위한 PNA 프로브, 이를 포함하는 라미부딘 내성 HBV 검출키트, 및 이를 이용한 라미부딘 내성 HBV 검출방법에 관한 것이다.
HBV는 약 3.2 kb의 4개의 해독틀(open reading frame)인 pre-core/core, pre-s/s, P 및 X 유전자로 이루어진 불완전한 이중나선 바이러스로서, 급성 또는 만성 간염을 일으킨다(문헌 [Management of viral Hepatitis B, Chutima Pramoolsinsup, 2002, J Gastroenterology and Hepatology Castrol, S125-S145]. B형 간염 백신 및 치료방법의 발전에도 불구하고 전 세계적으로 약 3억의 인구가 감염되어 있으며, 이중 300만 명이 간경변증이나 간암 등의 만성 간질환으로 전환되어 성인 사망의 높은 원인이 되고 있다(문헌 [Hepatitis B: global importance and need for control, Maynard JE, Vaccine, 1990, 8:18-28]).
만성 B형 간염 치료를 위해 면역조절제와 항바이러스 제제 등의 많은 연구가 이루어지고 있다. 그중 라미부딘((-)-B-L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine, 3T)은 뉴클레오사이드 유사체로 HBV의 RNA-의존 DNA 중합효소(역전사효소)의 활성을 감소시키는 기작에 의해 HBV 증식을 억제하는 효과적인 치료제로서, 현재 만성 활동성 B형 간염의 일차 치료 약제로 널리 사용되고 있다(문헌 [Effects of extended lamivudine therapy in Asian patients with hepatitis B, Liaw et al., 2000, J Gastroenterology, 119:172-180], [A one year trial of lamivudine for chronic hepatitis B, Lai et al., N Engl J Med 1998:339L61-38]). 라미부딘은 경구요법이 가능하고 치료 후 조직학적, 미생물학적 및 생화학적 소견의 개선 정도가 우수하며 안전하여 효과적인 치료제로 알려져 있으나, 2 년 이상 복용 시 환자의 10~15%, 3 년 이상 복용 시 환자의 절반 이상에서 라미부딘 내성 바이러스가 나타나게 된다(문헌 [Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B, Lai et al., 2003, J Clin infect Dis, 36:687-696], [Evaluation of wild type and mutants of the YMDD motif of hepatitis B virus polymerase during lamivudine therapy, Xinxin Zhang et al., 2003, J Gastroenterology and Hepatology, 18:1353-1357]). 라미부딘에 대한 내성은 HBV 중합효소(역전사효소) 유전자의 YMDD 모티프(tyrosine-methionine-aspartate-aspartate amino acid motif) 부위에 돌연변이가 일어나 발생하는 것으로 알려져 있다. YMDD 모티프 부위는 라미부딘이 결합하는 부위로 일반적으로 변이를 잘 일으키지는 않으나 라미부딘으로 장기간 치료하게 되면 YMDD 모티프 내 코돈 552 부위의 메티오닌(M)이 이소류신(I), 발린(V) 또는 세린(S)으로 변이를 일으키고, 코돈 528 부위의 류신(L)이 메티오닌(M)으로 변이를 일으켜 라미 부딘의 결합을 방해하여 내성이 생기게 된다(문헌 [Lamivudine resistance in hepatitis B: mechanisms and clinical implications, Fischer et al., 2001, Drug Resistance Updates, 4:118-128]). 기존에는 라미부딘 내성 돌연변이 번호체계가 HBV의 7가지 유전형에 따라 달라 혼선을 빚어 왔으나 2001년 스투이버(Stuyver) 등(문헌 [Nomenclature for antiviral resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region, Stuyver et al., 2001, Hepatology 33:751-757])이 제안한 각 영역(domain)의 시작점으로부터 번호를 매기는 통일된 rt 영역 번호체계를 따름으로써 HBV의 라미부딘 내성 돌연변이를 유전자형에 관계없이 표준화된 방법으로 명명할 수 있게 되었다. 상기 명명법에 따른 돌연변이는 HBV DNA 중합효소 유전자의 A 영역 내 rtL80V/I, B 영역 내 rtL180M, 및 C 영역 내 rtM204I, rtM204V, rtM204S 및 rtV207I이다(도 1 참조). 이중 rtL180M은 기존에 보고되었던 아미노산 528, 526, 515 또는 525의 변이에 해당하며, rtM204V/I는 아미노산 552, 550, 539 또는 549의 변이에 해당한다.
이러한 HBV 변종은 라미부딘에 대한 내성을 가져 라미부딘에 의해 증식이 억제되지 않는다. 그러므로 아데포비어(adefovir) 및 팜시클로비어(famciclovir)와 같은 다른 약제를 투여하거나, 치료 초기부터 두 가지 약물을 복합 처방하여 HBV 변종 발생률을 억제하여야만 효과적인 치료가 가능하다(문헌 [Suppressing hepatitis B without resistance-so far, so good, Mailliard et al., 2006 N Engl J Med, 348:848-850] ). 따라서 만성 B형 간염 환자에서 라미부딘 내성 HBV 변종을 조기에 진단하는 것은 개개인의 치료 및 치료방향 계획에 있어 매우 중요하므로 라미부딘 내성 여부를 민감하고 신속하게 검출하기 위한 방법이 필요하다.
현재 라미부딘 내성 HBV 변종을 검출하기 위한 방법으로는 주로 염기서열 분석법이나 최근에 연구되고 있는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법을 이용한다. 그러나 이들 방법은 고가의 장비를 필요로 하고 내성 발생 초기에 변종이 전체 바이러스의 20% 이하를 차지하는 경우에는 검출되지 않을 수 있다(문헌 [대한 진단검사의학회지 제23권 제4호 2003]), [Pyrosequencing for Detection of Lamivudine-Resistance Hepatitis B virus, Anna et al., 2004, J clin Microbiol., 4788-4795]. PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 돌연변이 검출법은 여러 돌연변이에 대해 각각의 프라이머를 사용해야 하므로 많은 수의 증폭 반응을 필요로 하며(문헌 [Detection of YMDD mutation using mutant-specific primers in chronic hepatitis B patients before and after lamivudine treatment, Cha-Ze et al., 2006, World Gastroenterol, 12(33):5301-5305]), RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 방법은 변이로의 전이단계는 검출하기 어렵고 재현성이 떨어지는 단점이 있다(문헌 [Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine. Allen et al., 1999, J Clin Microbiol, 37:3338-3347). 또 다른 방법으로는 라인 프로브 어세이(line probe assay, LIPA)가 있는데, 이 방법은 인접 부위의 돌연변이에 의해 위양성이 발생할 수 있을 뿐 아니라, 하나의 스트립 안에서 하나의 샘플만을 검사할 수 있어 다량의 샘플을 동시에 검사하기 어려운 단점이 있다(문헌 [Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus-infected patients during lamivudine therapy: evaluation of performance of INNO-Lipa HBV DR assay, Lok AS et al., 2002, J Clin Microbiol, 40:3729-3734]).
최근에는 DNA 마이크로어레이(DNA chip) 기술을 이용하여 라미부딘 내성 HBV 변종을 검출하는 방법이 개발된 바 있다(한국공개특허 제2005-0015407호 및 문헌[Oligonucleotide chip for Detection of Lamivudine-resistant Hepatitis B virus, Jang et al., J Clin Microbiol 2004, 4181-4188]). 특히 상기 한국공개특허 제2005-0015407호는 약제 내성 HBV를 검출하기 위한 표적 프로브(target probes)와 마이크로어레이 제작과정과 혼성화 반응과정의 품질관리를 위한 QC 프로브(QC probes) 및 한 가지 이상의 야생형과 돌연변이 유형의 혼합 여부 및 정도의 결정, 비특이적 교차 혼성화 반응에 의한 배경 측정, 또는 동형접합체와 이형접합체의 구별을 위한 음성 대조 프로브(negative control probes)를 혼합하여 제작한 마이크로어레이와 이를 이용한 약제 내성 HBV 바이러스의 검출, 마이크로어레이의 품질관리와 한 가지 이상 유형의 혼합 여부 및 정도의 결정과 각 프로브에 대한 양성과 위양성 결정을 동시에 수행하는 방법에 대해 기술하고 있다. 상기 특허는 마이크로어레이에 PNA(peptide nucleic acids), LNA(locked nucleic acids)와 HNA(hexitol nucleic acids) 등의 DNA 유사체(analogues)도 사용가능한 것으로 언급하고 있기는 하나, 실제로는 DNA 칩에 대해서만 개시하였고 DNA 유사체를 이용한 어떠한 칩에 대해서도 개시하지 못하였다. 상기 DNA 칩은 단시간 내에 HBV의 약제 내성 점 돌연변이를 신속하게 검출할 수 있고, 음성 대조 프로브를 포함하고 있어 야생형과 돌연변이형이 혼합되어 있는 경우에도 검출이 가능한 매우 민감한 방법으 로서 약제 내성 진단 시 많이 이용되고 있다
나아가, 최근에는 미세구 현탁액 어레이(Microsphere suspension array)를 이용한 변이 및 유전자형 검출법들이 이용되고 있다. 이 방법에서는 폴리스티렌으로 만들어진 비드(beads)에 표적물질을 검출할 수 있는 프로브로 DNA, 항원, 항체, 효소, 기질, 수용체 등 다양한 생체물질을 부착할 수 있으며, 프로브가 부착된 각각의 비드에 표적물질을 혼성화시킨 후 빠르게 흐르는 유체(fast flowing fluid)를 통해 흘러가는 비드를 두 방식의 레이저를 이용하여 검출한다. 이때 하나의 레이저는 표적물질과 혼성화 반응이 일어난 비드의 형광을 검출하고, 또 하나의 레이저는 비드에 붙어있는 고유의 번호를 검출하여 선별하는 방법에 의해 변이를 검출한다. 따라서 유리 슬라이드 등에 프로브를 고정화시키는 일반적인 DNA 칩에 비해 소량의 시료로도 분석이 가능하고, 민감도가 매우 높아 단시간 내에 다량의 샘플을 처리할 수 있으며, 높은 특이도와 분리능으로 변이를 검출할 수 있어 매우 유용하다(문헌 [Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm, Facile, John P. Nolan and Larry A. Sklar, 2002, Trends in Biotechnology, vol. 20] 및 [Microsphere suspension array technology for SNP detection in cattle, Dunbar et al., 2003, Engineering in Medicine and Biology magazine, 22: 158-162]).
그러나 상기 DNA 칩이나 미세구 현탁액 어레이는 고정된 DNA 프로브 자체가 핵산분해효소(nuclease) 등에 대한 생물학적 및 화학적 안정성이 매우 낮은 관계로 안정성이 낮아 보존 기간에 따라 DNA가 변질되거나 반응력이 떨어질 수 있는 문제 점이 있다(한국공개특허 제2006-0091708호 참조).
상기한 바와 같은 DNA 자체의 불안정성을 해결하기 위해서, 다양한 DNA 유사체들이 개발되고 있으며, 그중 PNA는 1991년 넬슨(Nielsen)에 의해 개발되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, PNA는 DNA의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, DNA와 같은 아데닌, 티민, 구아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA나 RNA와 혼성화 반응을 일으킬 수 있다. 특히, 펩타이드 결합 형태로 변화된 기본골격(backbone)의 구조적 차이는 DNA나 RNA의 포스페이트 골격의 음이온성 성질을 중성 성질로 바꾸었다. 이러한 음이온성 성질의 중성화로 인한 음이온들 간의 정전기적 반발력의 제거는 혼성화 반응 시 그 결합력이 높아지는 직접적 원인이 된다. 그 결과, 혼성화 반응속도가 빠를 뿐만 아니라 특이도도 매우 높아 S/N 비율(signal to noise ratio)이 향상되는 장점이 있다. 또한 핵산분해효소와 같은 생 분해효소 등이 인지하지 못하여 DNA나 RNA보다 안정성이 매우 높다(문헌 [Peptide nucleic acid, PNA, sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, P.E. Nielsen et al., 1991, Science, 254, 1497-1500]). 이와 같이 DNA나 RNA와 같은 역할을 하면서 혼성화 결합력과 안정성이 우수한 PNA는 현재 DNA의 단점을 보완할 수 있는 대체물질로서 높은 잠재력을 인정받아, DNA 올리고머를 대신하여 PNA 올리고머를 이용하여 분석 또는 진단하는 방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(한국공개특허 제2006-0091708호 및 제2005-0122544호, 및 문헌 [Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors, Brandt O et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22, 617-622] 및 [Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support, Frdric R Raymond et al., 2005, BMC technology, 5, 1-5]).
본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 상기한 장점을 갖는 PNA를 이용하여 라미부딘 내성을 나타내는 HBV의 단일 또는 혼합 변종을 검출할 수 있는 PNA 프로브를 제작하고, 이들 PNA 프로브를 이용하여 PNA 칩을 제작하였으며, 이들을 이용하여 라미부딘 내성 HBV의 점 돌연변이를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 라미부딘 내성 HBV를 높은 특이도 및 민감도로 정확하게 검출할 수 있는 생물학적 효소에 안정한 PNA 프로브를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 라미부딘 내성 HBV의 검출키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출키트를 이용한 라미부딘 내성 HBV의 검출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은 서열번호 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 14, 15 및 16 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 B 영역 내 코돈 180 부위 또는 C 영역 내 코돈 204 또는 207 부위의 야생형 또는 변종 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은 서열번호 4, 7, 8, 13 및 17 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 HBV DNA 중합효소 유전자와 혼성화하지 않는 음성 대조 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은 지지체 상에 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 B 영역 내 코돈 180 부위 또는 C 영역 내 코돈 204 또는 207 부위의 야생형 또는 변종 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브, 및 임의로 상기 PNA 프로브의 염기서열로부터 변형된 염기서열을 가져 상기 HBV DNA 중합효소 유전자와 혼성화하지 않는 음성 대조 프로브가 고정화되어 있는, 라미부딘 내성 HBV의 검출키트에 관한 것이다.
본 발명의 제4면은
⒜ 상기 검출키트에 표적 DNA를 함유하는 반응 시료를 가하고;
⒝ PNA 프로브와 표적 DNA를 혼성화 반응시키고;
⒞ PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는:
단계를 포함하는, 라미부딘 내성 HBV의 검출방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "돌연변이", "변이", "변종"은 동일한 의미를 갖는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. 또한, HBV "DNA 중합효소"와 "역전사효소"는 동일한 의미를 갖는 것으로 상호교환가능하게 사용된다.
본 발명의 라미부딘 내성 HBV 검출용 PNA 프로브, 및 라미부딘 내성 HBV 검출키트 및 방법은 다음과 같은 단계로 완성되었다.
1. 클론 확보 및 서열분석
라미부딘 치료를 받고 있는 HBV에 감염된 만성 B형 간염 환자의 DNA 샘플을 하기 표 2에 나타낸 프라이머로 PCR 증폭하고, 증폭된 PCR 산물을 플라스미드 백터에 클로닝(cloning)하였다. 여기서 얻은 클론들을 대장균 JM109에 형질전환하여 DNA를 대량 확보하고, 확보한 클론 DNA를 서열분석하여 HBV의 라미부딘 내성과 관련된 유전자의 야생형과 돌연변이 유전자형을 확인하였다. 염기서열분석으로 유전자형이 확인된 클론은 본 발명의 PNA 칩 반응조건 확립 시 표준 및 대조군 검체로 사용하였다. 라미부딘 내성 관련 HBV 야생형 및 돌연변이 유전자형이 확인된 임상 검체는 본 발명의 PNA 칩 정확도 분석에 사용하였다.
2. PNA 프로브의 설계 및 제작
라미부딘 내성 HBV를 검출하기 위한 표적 프로브로서, 라미부딘 내성을 유도하는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열, 즉 HBV DNA 중합효소 유전자의 C 영역 내의 YMDD 모티프에서 코돈 204 부위의 메티오닌(M)이 발린(V)으로 치환된 rtM204V, 상기 메티오닌(M)이 이소류신(I)으로 치환된 rtM204I, 코돈 207 부위의 발린(V)이 이소류신(I)으로 치환된 rtV207I와 B 영역 내의 코돈 180 부위의 류신(L)이 메티오닌(M)으로 치환된 rtL180M 부위의 점 돌연변이 염기서열을 포함하 는 PNA 프로브를 고안하였다. 각 부위의 점 돌연변이를 검출할 수 있는 프로브를 13 내지 17머의 길이로 설계하였다. 단, 코돈 180의 돌연변이 검출 부위 내의 염기서열이 60% 이상의 피리미딘 염기를 함유하고 있어 상보적으로 결합하는 프로브의 염기서열이 부득이하게 60% 이상의 퓨린 염기를 함유하게 되어 본 출원인에 의해 출원된 한국특허출원 제2006-0129517호에 개시된 바와 같이 유니버설 염기를 적용하였다(서열번호 1). 즉, 문헌 [Hemavathi et al., 1999, Organic Letters Vol. 1, No. 10, 1639-1641]에 기재된 바와 같이, 하기 화학식 1의 유니버설 염기를 포함하는 PNA 단량체를 합성하여 사용하였다.
상기 식에서,
UB(Universal Base)는 DNA 이중 나선구조를 유지하면서 염기 스태킹을 최대화하는 인위적 염기로서, 예를 들면, 식 (a)의 퓨린, 식 (b)의 3-니트로피롤, 식 (c)의 5-니트로인돌, 식 (d)의 벤즈이미다졸 화합물, 식 (e)의 벤젠, 플루오로벤젠, 예를 들어 4-플루오로벤젠, 펜타플루오로벤젠, 식 (f)의 잔틴, 식 (g)의 피리도피리미딘 화합물, 식 (h)의 당쇄의 X, Y 위치에 N 또는 CH를 포함하는 화합물, 예를 들어 하이포잔틴, 식 (i) 내지 (k)의 시토신 화합물, 식 (l)의 아데닌 화합 물, 식 (m)의 3-아미노카르보닐피롤, 식 (n)의 니트로디아졸, 식 (o)의 환 내에 S 또는 Se를 함유하는 화합물, 식 (p)의 디아졸 화합물, 식 (q)의 트리아졸 화합물 또는 식 (r)의 β-헵타플루오로나프탈렌(미국특허 제5,438,131호 및 문헌 [Kathryn et al ., 2002, Chem. Commun. 2206-2207] 참조)이다:
상기 식에서,
R1은 H, NO2 또는 NH2이며,
R2는 H 또는 F이고,
R3는 H 또는 NH2이며,
X 및 Y는 서로 독립적으로 CH 또는 N이고,
Z는 S 또는 Se이다.
UB는 바람직하게는 식 (b)의 3-니트로피롤 또는 식 (c)의 5-니트로인돌, 특히 3-니트로인돌이다.
또한 본 발명에서는 한 가지 이상의 다른 유형이 혼합된 돌연변이의 검출 및 비특이적 교차 혼성화 반응으로 인한 위양성을 구별할 수 있는 음성 대조 프로브를 설계하였다. 음성 대조 프로브는 각 코돈에 대한 야생형과 돌연변이를 검출하기 위한 염기서열을 함유하는 표적 프로브 외에 표적 프로브의 염기서열을 기초로 하여 하나 이상의 염기서열을 치환(substitution), 삽입(insertion), 결실(deletion) 등의 방법에 의해 인위적으로 변형시켜 혼성화되지 않도록 고안한 프로브이다. 표 1에 본 발명에 따른 PNA 프로브의 서열번호, 염기서열 및 HBV 중합효소 유전자 내 B 및 C 영역의 코돈 및 아미노산 변이를 나타내었다.
N: 유니버설 염기-PNA
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프로브는 라미부딘 내성을 일으키는 주된 돌연변이 부위인 HBV 역전사효소 내의 B 및 C 영역에서 발생하는 점 돌연변이 유형에 따라 각각 서열번호 1 내지 17에 기재된 염기서열로 이루어진다.
서열번호 1과 3은 코돈 180 류신의 야생형의 표현형을 갖는 유전자형 CTG와 TTG에 상보적으로 결합하는 염기서열이고, 서열번호 2는 코돈 180의 류신이 메티오닌으로 변화된 돌연변이형을 갖는 유전자형 ATG에 상보적으로 결합하는 염기서열이며, 서열번호 4는 코돈 180에 대한 음성 대조 프로브로서 야생형과 돌연변이에 속하지 않는 G로 치환된 GTG의 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열이다.
서열번호 5는 코돈 204 메티오닌의 야생형의 표현형을 갖는 유전자형 ATG에 상보적으로 결합하는 염기서열이고, 서열번호 6은 코돈 204의 메티오닌이 발린으로 변화된 돌연변이형을 갖는 유전자형 GTG에 상보적으로 결합하는 염기서열이며, 서열번호 7은 코돈 204에 대한 음성 대조 프로브로서 야생형과 돌연변이에 속하지 않는 T로 치환된 TTG의 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열이다. 이때 T 대신에 C를 치환하여 사용하여도 무관하다(서열번호 8).
서열번호 9는 코돈 204 메티오닌의 야생형의 표현형을 갖는 유전자형 ATG에 상보적으로 결합하는 염기서열이고, 서열번호 10, 11 및 12는 코돈 204의 메티오닌이 이소류신으로 변화된 돌연변이형을 갖는 유전자형 ATA, ATC 및 ATT에 각각 상보적으로 결합하는 염기서열이며, 서열번호 13은 코돈 204에 대한 음성 대조 프로브로서 야생형 및 돌연변이형과 혼성화하지 않도록 치환과 삽입이 일어난 염기서열이다.
서열번호 14는 코돈 207 발린의 야생형의 표현형을 갖는 유전자형 GTG에 상보적으로 결합하는 염기서열이고, 서열번호 15 및 16은 코돈 207의 발린이 이소류신으로 변화된 돌연변이형을 갖는 유전자형 ATT 및 ATA에 각각 상보적으로 결합하는 염기서열이며, 서열번호 17은 코돈 207에 대한 음성 대조 프로브로서 야생형 및 돌연변이형과 혼성화하지 않도록 C와 T로 치환된 CTT의 염기서열에 상보적으로 결합하는 염기서열이다.
본 발명의 PNA 프로브는, 지지체 상에 효율적으로 고정화하기 위해, N-말단에 아민 또는 티올과 같은 고정화에 필요한 작용기를 가질 수 있으나, 작용기의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 본 발명의 PNA 프로브가 N-말단에 아민기를 갖는 경우, 본 출원인에 의해 출원된 한국특허출원 제2006-0128938호에 개시된 바와 같은 하기 화학식 2의 다중아민기(multi-amine linker)를 갖는 것이 바람직하나, 본 발명의 범위가 이에 의해 제한되는 것은 아니다:
상기 식에서,
L1, L2 및 L3는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 선형 사슬이고, 상기 탄소수 1 내지 10의 선형 사슬은 1 내지 3개의 산소를 더 포함할 수 있으며;
X는 CH 또는 N이고;
m은 2 내지 10의 정수이며;
n은 0 또는 1이다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethoxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(문헌 [J Org Chem 59, 5767-5773, J Peptide Sci 3, 175-183, Tetrahedron Lett 22, 6179-6194]). 화학식 2의 다중아민기를 갖는 PNA는 상기 합성된 PNA 또는 PNA와 결합된 스페이서(spacer)의 N-말단에 1개의 카복실기와 2개 이상의 분지된 아민기를 갖는 덴드론 단량체를 2회 이상 순차적으로 결합 시켜 합성되는 바, 구체적으로는 (ⅰ) PNA 올리고머의 아민기에 결합되어 있는 보호기의 탈보호(deprotection), (ⅱ) 다중아민기를 갖는 덴드론 단량체와 PNA의 커플링(coupling) 및 (ⅲ) 캡핑(capping)의 3단계를 거쳐 합성될 수 있다(한국특허출원 제2006-0128938호 참조).
3. PNA 칩의 제작
상기 2.에서 설계된 프로브는 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스, 특히 유리 슬라이드 등의 지지체 위에 고정화된다. 지지체의 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어 유리 슬라이드와 같이 손으로 잡을 수 있는 박판(薄板) 형태뿐만 아니라, 튜브 형태 또는 액체에 혼합하여 이송할 수 있는 0.1 ㎜ 이하 크기의 비드 형태일 수 있다. 지지체의 표면은 알데히드기, 카복실기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기, N-하이드록시석신이미딜기, 활성화 에스터기 등의 작용기, 특히 에폭시기로 기능화될 수 있다. 프로브를 고정화한 후에는 잔여 아민과 에폭시기 등의 작용기를 블록킹하여 배경신호를 감소시키는 처리를 거쳐 안정화할 수 있다(실시예 5 참조).
4. PNA 칩에서 반응 및 분석조건 수립
본 발명에 따른 라미부딘 내성 HBV 돌연변이의 검출방법은
⒜ 상기 PNA 칩에 표적 DNA를 함유하는 반응 시료를 가하고;
⒝ PNA 프로브와 표적 DNA를 혼성화 반응시키고;
⒞ PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는:
단계를 포함한다.
단계 ⒜에서, 표적 DNA는 표 2에 나타낸 바와 같은 서열번호 18 및 19의 프라이머를 이용하여 HBV에 감염된 환자로부터 분리된 DNA를 1차 PCR에 의해 증폭한 후 서열번호 20 및 21의 바이오틴(biotin)이 말단에 표지된 프라이머를 이용하여 2차 PCR에 의해 증폭하여 사용하는 것이 바람직하다.
단계 ⒝에서, PNA 프로브와 표적 핵산의 혼성화 반응이 잘 일어날 수 있도록 적당한 성분을 포함하는 혼성화 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 프라이머 말단에 표지되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색하는 스트렙타비딘-시아닌 5(Streptavidin-cyanine 5)를 첨가하여 혼성화하는 것이 바람직하다. 혼성화 반응 후에는, 반응되지 않은 잔여 표적 핵산과 비특이적 반응물을 효과적으로 제거할 수 있는 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
단계 ⒞에서, 검출수단으로는 DNA/DNA 혼성화 반응 유무에 의한 신호를 검출하는 광학적, 전기화학적, 기타 방법을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, cy5, 바이오틴 결합 화합물, cy3 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 스트렙타비딘-시아닌 5를 이용하여 표적 핵산의 말단에 부착되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색되는 형광을 스캐닝하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 라미부딘 내성 HBV 검출을 위한 PNA 올리고머 합성
HBV 라미부딘 내성 유전자를 검출하기 위하여 사용한 16개의 PNA 프로브는 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 라미부딘 내성을 일으키는 변이와 관련된 야생형과 하나의 염기차이로 나타나는 점 돌연변이 검출을 위한 염기서열로 제작하였다. 각 프로브를 유리 슬라이드 상에 고정화하기 위하여 N-말단에 다중아민기를 부착하여 합성하였다.
1) PNA 올리고머의 제조
한국등록특허 제464261호의 방법에 따라, PNA 올리고머를 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다. N-말단에 스페이서로 8-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-3,6-디옥사-옥탄산을 2회 반복 사용하였다. PNA가 레진에 부착된 상태로 다음 반응에 이용하였다.
2) 다중아민기를 갖는 PNA 프로브의 제조
1)에서 제조된 레진에 부착된 PNA를 1 M 피페리딘의 DMF(dimethylformamide) 용액으로 20 분간 처리하여 N-말단의 Fmoc 보호기를 제거한 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 ⒜). 1 당량의 비스 Fmoc 단량체에 1 당량의 HOBt(1-hydroxybenzotriazole), 2 당량의 DIC(diisopropylcarbodiimide) 및 DMF를 가하고 1 시간 동안 흔들어준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 ⒝). 5% 무수 초산(acetic anhydride)과 6% 루티딘(lutidin)이 함유된 DMF를 첨가하고 상온에서 5 분간 흔들어준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 ⒞). 상기 ⒜~⒞ 과정을 2~3회 반복하여 실시하고 최종적으로 ⒜ 과정을 반복하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 아민기가 4개인 경우 2회 반복하고 8개인 경우 3회 반복하였다. PNA가 부착된 레진을 m-크레솔/TFA(trifluoroacetic acid)(1/4 v/v) 용액으로 2 시간 처리하여 PNA를 레진으로부터 떼어내고, 에테르(ether)로 처리하여 석출시킨 후 HPLC로 정제하여 서열번호 1 내지 7 및 9 내지 17(서열번호 1: N = 3-니트로인돌-PNA)의 다중아민기가 포함된 프로브를 제작하였다.
실시예 2: 라미부딘 내성 HBV 표적 DNA의 제조를 위한 프라이머 합성
HBV PCR 프라이머는 문헌 [Oligonucleotide chip for Detection of Lamivudine-resistant Hepatitis B virus, Jang et al., J Clin Microbiol 2004, 4181-4188]의 방법에 따라 HBV DNA 중합효소 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 부위를 사용하였다. 상기 프라이머는 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 염기서열을 갖는다. 서열번호 18과 19는 1차 PCR 반응을 위한 외부 프라이머(outer primer)로, 서열번호 20과 21은 바이오틴이 표지된 프라이머로서 내부 프라이머(inner primer)로 이용하였다.
프라이머 염기서열(5’→3’) | PCR 산물 크기(bp) | ||
BF105 | 센스 (서열번호 18) | 5'-TCCTGCTGCTATGCCTCATC-3' | 500 bp |
BF112 | 안티센스 (서열번호 19) | 5'-TTCCGTCGACATATCCCATGAAGTTAAGGGA-3' | |
HB-F3 | 센스 (서열번호 20) | 5'-바이오틴-CTTGTATTCCCATCATCCCATCATC-3' | 200 bp |
HB-R2 | 안티센스 (서열번호 21) | 5'-바이오틴-GAAAAGAAAATTGGTAACAGCGGTA-3' |
상기 내부 프라이머는 혼성화 반응 후에 형광반응을 확인하기 위하여 5' 말단에 바이오틴이 부착되어 혼성화 반응 후에 스트렙타비딘-시아닌 5와 결합하도록 제작하였다. 상기 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 3: 재조합 HBV 클론 대량 확보
㈜진인(한국)으로부터 제공받은 HBV 클론 DNA을 대장균 JM109(스트라타진(Stratagene), USA)를 통하여 형질전환하여 대량 확보하고, 염기서열분석으로 라미부딘 내성에 관련된 HBV의 야생형과 돌연변이 유전자형을 확인하였다.
실시예 4: 표적 핵산의 제조
㈜진인(한국)에서 제공받은 임상샘플에서 추출한 DNA 및 실시예 3의 방법으로 확보한 HBV의 라미부딘 내성에 관련된 야생형과 각각의 돌연변이 유전자형 DNA를 이용하였다. PCR을 1차 및 2차에 걸쳐 실시하여 DNA를 증폭하였다. 1차 PCR은 표 1에 나타낸 BF105와 BF112 프라이머를 이용하여 하기 조건으로 수행하였다:
주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 3 ㎕, 센스 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmol/㎕) 1 ㎕, dNTP(10 mM) 1 ㎕, 10× Taq 완충액(MgCl2 포함) 5 ㎕, BD(Band Doctor™)(솔젠트(한국)) 10 ㎕, Taq(5 유닛/㎕, 솔젠트(한국)) 0.2 ㎕, 증류수 28.8 ㎕의 조성으로 94 ℃에서 4 분간 처리한 후, 94 ℃에서 1 분, 58 ℃ 1 분 및 72 ℃ 1 분을 30회 반복함.
2차 PCR은 표 1에 나타낸 바이오틴으로 표지된 HB-F3와 HB-R2 프라이머를 이용하고 주형 DNA로 1차 PCR한 산물을 이용하여 하기 조건으로 수행하였다:
1차 PCR 용액 1 ㎕, 센스 프라이머(10 pmol/㎕) 1.25 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmol/㎕) 0.75 ㎕, dNTP(10 mM) 1 ㎕, 10× Taq 완충액(MgCl2 포함) 5 ㎕, BD (솔젠트(한국)) 10 ㎕, Taq(5 유닛/㎕, 솔젠트(한국)) 0.2 ㎕, 증류수 30.8 ㎕의 조성으로 94 ℃에서 4 분간 처리한 후, 94 ℃에서 1 분, 58 ℃ 1 분 및 72 ℃ 1 분을 30회 반복함.
반응이 끝난 2차 PCR 산물(200 bp, 5 ㎕)에 젤 로딩 완충액(썬바이오, 한국) 1 ㎕를 가하고 1.5% 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 후 1 ㎍/㎖ 에티디움브로마이드(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV-transilluminator)에서 산물을 확인하였다. 전기영동한 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 5: PNA 칩의 제작
상기 표 1에 나타낸 서열번호 1 내지 7 및 9 내지 17(서열번호 1: N = 3-니트로인돌-PNA)의 정제된 PNA 올리고머를 스팟팅 완충액에 50 mM로 희석하여 에폭시기로 기능화된 유리판에 핀 방식으로 스팟팅하고, 일정하게 습도가 유지되는 상온에서 4 시간 동안 정치하였다. 이후 DMF에 가하고 15 분간 초음파 세척하였다. 0.1 M 석시닉언하드라이드를 첨가한 DMF에 가하고 40 ℃에서 2 시간 동안 반응하지 않은 아민기를 제거하였다. 반응 후 반응액을 제거하고 DMF, 3차 증류수 순으로 15 분간 초음파 세척하였다. 이후 0.1 M 에탄올아민이 함유된 100 mM 트리스 완충액(Tris-HCl)을 가하고 고체 표면의 잔여 에폭시기를 불활성화하였다. 이 유리 기판을 3차 증류수로 15 분간 초음파 세척하는 과정을 2회 반복한 후, 끓는 물에서 5 분간 처리하고 3차 증류수를 이용하여 5 분간 세척하고 건조하였다. 이후 100 ㎕의 혼성화 용액이 함유될 수 있도록 제작된 실리콘 반응기를 유리판 위에 밀착시켰다. 도 4에 PNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 모식적으로 나타내었다.
비교예 1: DNA 칩의 제작
문헌 [Oligonucleotide chip for Detection of Lamivudine-resistant Hepatitis B virus, Jang, et al., J Clin Microbiol 2004, 4181-4188]의 방법에 따라, N-말단에 아민기를 갖는 라미부딘 내성 HBV 검출용 DNA 프로브를 알데히드기가 결합된 슬라이드 CSS-100(셀(Cell)사, USA)에 3× SSC 스팟팅 완충액과 혼합하여 고정화하였다. 이후 아민기와 결합하지 않은 알데히드기를 소듐보로하이드레이트(NaBH4) 용액으로 환원시키고 건조하였다. 이후 100 ㎕의 혼성화 용액이 함유될 수 있도록 제작된 실리콘 반응기를 유리판 위에 밀착시켜 DNA 칩을 제조하였다.
실험예 1: PNA 칩 및 DNA 칩에서의 표적 핵산과의 혼성화 반응
바이오틴이 부착된 PCR 산물을 혼성화 완충액 100 ㎕에 5 ㎕ 첨가하여 사용하고, 이때 형광반응을 일으키기 위하여 스트렙타비딘-cy5를 첨가하였다. 실시예 5 및 비교예 1에서 각각 제작된 유리 슬라이드의 실리콘 반응기 구멍을 통하여 100 ㎕의 혼성화 혼합액을 주입하고, 40 ℃에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후에 세척 완충액으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다. 형광 스캐너를 이용하여 유리 슬라이드의 이미지를 분석하였다(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국).
도 5a 내지 5l에 PNA 칩(실시예 5)으로 라미부딘 내성 HBV 변종을 검출한 결과를 나타내었다. 도 5a와 5b는 HBV의 야생형 rtL180, rtM204 및 rtV207의 유전자형을 검출한 사진이고, 도 5c는 rtL180의 류신이 메티오닌으로 변화된 rtL180M, 및 야생형 rtM204와 rtV207의 유전자형을 검출한 사진이며, 도 5d는 rtL180M과 rtM204가 이소류신으로 변화된 rtM204i1의 유전자형을, 도 5e는 rtM204i2의 유전자형을, 도 5f는 rtM204i3의 유전자형을 검출한 사진이고, 도 5g는 rtM204가 발린으로 변화된 rtM204V의 유전자형을 검출한 사진이며, 도 5h는 rtV207이 이소류신으로 변화된 rtV207i1의 유전자형을 검출한 사진이고, 도 5i는 야생형 rtL180과 돌연변이형 rtL180M을 동시에 갖는 임상샘플의 유전자형을 검출한 사진이며, 도 5j는 야생형 rtM204와 돌연변이형 rtM204i3를 동시에 갖는 임상샘플의 유전자형을 검출한 사진이고, 도 5k는 야생형 rtL180과 돌연변이형 rtM204i2 및 rtM204i3를 동시에 갖는 임상샘플의 유전자형을 검출한 사진이며, 도 5l은 돌연변이형 rtM204V와 야생형 rtV207과 돌연변이형 rtV207i1을 동시에 갖는 임상샘플의 유전자형을 검출한 사진이다. 상기 도면으로부터, 단일 염기서열 변이에 의한 돌연변이 검출임에도 비특이적 교차반응 없이 유전자형에 특이적으로 표적 핵산과 프로브가 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 상기 표 1에 나타낸 돌연변이형의 염기서열과 일치하는 것으로서, PNA 칩의 높은 특이도를 확인할 수 있었다.
또한, 도 6에 각각 DNA 칩(비교예 1)과 PNA 칩(실시예 5)에서 HBV 약제 내성을 일으키는 주된 부위인 rtM204I2, rtM204I3 및 rtM204V의 돌연변이형에 대한 정량분석된 검출신호를 나타내었고, 도 7에 DNA 칩(비교예 1)과 PNA 칩(실시예 5)의 특이신호와 S/N 비율을 비교하여 나타내었다. 상기 도면으로부터, 본 발명에 따른 PNA 칩은 기존의 DNA 칩과 비교하여 우수한 특이신호와 분리능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따르면, 라미부딘 내성을 일으키는 HBV의 변종을 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 검출 및 분석할 수 있으므로, 만성 B형 간염 치료제인 라미부딘에 대한 내성을 갖는 HBV 변종의 존재 유무를 신속하고 정확하게 확인할 수 있어, 만성 B형 간염에 대한 효과적인 치료뿐 아니라, 간암의 예방 및 진단에 중요한 정보를 제공하는데 기여할 수 있다. 또한 프로브로 이용된 PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하여 보관이나 사용 시 환경변화나 기타 요 소들에 의해 영향을 받지 않으므로 DNA 프로브를 이용한 상업적인 HBV 감염 진단 및 항생제 내성 검사, 예들 들어 라인 프로브 어세이, DNA 어레이 등에 사용하기에 용이할 것으로 기대된다.
<110> Panagene Inc.
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Hepatitis B Viruses
<160> 21
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 180w
<400> 1
agccaggnga aac 13
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 180wt
<400> 2
tgagccatga taac 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 180m
<400> 3
tgagccaaga taac 14
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 180n
<400> 4
cagagccacg agatacg 17
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204vw
<400> 5
tcatccatat aactg 15
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204v
<400> 6
catccacata act 13
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204vn
<400> 7
tcatccaaat aactg 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204vn
<400> 8
tcatccagat aactg 15
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204iw
<400> 9
atcatccata taac 14
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204il
<400> 10
catcatctat ataactg 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 11
catcatcgat ataactg 17
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204i3
<400> 12
catcatcaat attaac 16
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 204in
<400> 13
catcatctca tataa 15
<210> 14
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 207w
<400> 14
aataccacat cat 13
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 207i1
<400> 15
caatacaata tcatc 15
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 207i2
<400> 16
caatactata tcatc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PNA probe 207n
<400> 17
caatacgaaa tcatc 15
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer BF105
<400> 18
tcctgctgct atgcctcatc 20
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer BF112
<400> 19
ttccgtcgac atatcccatg aagttaaggg a 31
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer HB-F3
<400> 20
cttgtattcc catcatccca tcatc 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer HB-R2
<400> 21
gaaaagaaaa ttggtaacag cggta 25
Claims (9)
- 서열번호 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 14, 15 및 16 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 라미부딘 내성(lamivudine resistance)을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 B 영역 내 코돈 180 부위 또는 C 영역 내 코돈 204 또는 207 부위의 야생형 또는 변종 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브.
- 서열번호 4, 7, 8, 13 및 17 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 B 영역 내 코돈 180 부위 및 C 영역 내 코돈 204 및 207 부위의 야생형 및 변종 유전자와 혼성화하지 않는 음성 대조(negative control) PNA 프로브.
- 지지체 상에 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 B 영역 내 코돈 180 부위 또는 C 영역 내 코돈 204 또는 207 부위의 야생형 또는 변종 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브가 고정화되어 있는, 라미부딘 내성 HBV의 검출키트.
- 제3항에 있어서, PNA 프로브가 서열번호 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 14, 15 및 16 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것인 검출키트.
- 제3항에 있어서, 상기 PNA 프로브의 염기서열로부터 변형된 염기서열을 가져 라미부딘 내성을 유도하는 HBV DNA 중합효소 유전자의 B 영역 내 코돈 180 부위 및 C 영역 내 코돈 204 및 207 부위의 야생형 및 변종 유전자와 혼성화하지 않는 음성 대조 프로브가 추가로 고정화되어 있는 검출키트.
- 제5항에 있어서, 음성 대조 프로브가 서열번호 4, 7, 8, 13 및 17 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 것인 검출키트.
- 제3항에 있어서, 지지체가 유리 슬라이드, 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나일론, 폴리디메틸실록산(PDMS), 셀룰로스 및 니트로셀룰로스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 검출키트.
- 제3항에 있어서, 지지체가 박판, 튜브 또는 비드 형태의 것인 검출키트.
- ⒜ 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 검출키트에 표적 DNA를 함유하는 반응 시료를 가하고;⒝ PNA 프로브와 표적 DNA를 혼성화 반응시키고;⒞ PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는:단계를 포함하는, 라미부딘 내성 HBV의 검출방법.
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