KR20040044151A - 유효성이 검증된 마이크로어레이 설계 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 실험적으로 검증된 마이크로어레이, 특히 실험적으로 검증된 DNA 마이크로어레이를 제조하기 위한 시스템, 이의 제조 방법 및 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 마이크로어레이에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명의 시스템 및 방법은 검증된 마이크로어레이에 대한 배치의 제공과 최종 생산물 자체의 제조를 분리시키는 것을 특징으로 한다.

Description

유효성이 검증된 마이크로어레이 설계{Validated design for microarrays}
본 발명은 실험적으로 검증된 마이크로어레이, 특히 실험적으로 검증된 DNA 마이크로어레이를 제조하기 위한 시스템, 이의 제조 방법 및 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명의 시스템 및 방법은 특히 검증된 마이크로어레이에 대한 배치(layout)의 준비와 최종 생산물 자체의 제조를 분리시키는 것을 특징으로 한다.
생명공학 분야에서, "마이크로어레이"라는 용어는 가능한 최소의 공간에 수많은 생체분자를 순차적으로 배열한 것을 의미한다. 마이크로어레이는 일반적으로 존재(identity) 및/또는 양이 알려지지 않은 샘플 분자와 연구하고자 하는 상기 샘플 분자와 잠재적으로 상호작용하는 알려진 수많은 분자와의 상호작용에 대하여 연구하고자 하는 목적으로 사용된다. Phimister (1999) Nature Genet. 21, Suppl. : 1-60의 명명법에 따라, 연구하려는 분자는 "목적 분자(target molecule)"로 표기하고, 순차적으로 배열된 알려진 분자들은 "프로브 분자(probe molecule)"로 표기한다. 프로브 분자는 일반적으로 유리 지지체(glass support) 상에 배열되지만, 플라스틱, 나일론 또는 금과 같은 귀금속들로 제조된 지지체가 또한 이용된다.
마이크로어레이에서, 프로브 분자를 함유하는 스팟(spot)은 전형적으로 직경이 200㎛ 미만이며, 일반적으로 프로브 분자를 함유하는 수천의 스팟이 이러한 어레이에 배열된다.
마이크로어레이는 수많은 프로브 분자/목적 분자 결합 쌍(pairs)에 사용되며, 또 특정한 프로브 분자/목적 분자 조합 범위 내에서 매우 다양한 응용 분야에 이용된다. 그러므로, 예를 들어서 목적 단백질과의 상호작용을 연구하기 위하여 다양한 펩타이드들이 프로브 분자로서 배열된 마이크로어레이가 있다. 또한, 다양한 잠재적인 리간드에 결합하는 것을 연구하기 위해서 단백질 프로브가 고정화될 수 있다. 그러나 반대로, 수많은 잠재적인 유기화학, 저분자량 리간드를 어레이로 배열하고 특정의 목적 단백질, 예를 들면 억제되어야할 효소가 상기 잠재적인 리간드에 결합하는지를 테스트하는 것이 또한 가능하다. 마찬가지로, 다른 마이크로어레이 시스템들은 당(sugar) 분자를 함유하는 위와 같은 시스템을 사용한다.
그러나 가장 일반적인 어레이 시스템은 핵산 분자들 또는 이들의 유사체들, 예를 들면 펩타이드 핵산 분자들 간의 상호작용의 연구에 관한 것이다. 이러한 유형에서는 일반적으로 비교적 짧은, 예를 들면, 100 미만의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 어레이로 배열되는데, 미지의 목적 핵산 또는 목적 핵산의 미지의 양은 이미 알려진 염기 쌍(base pair) 법칙에 따른 혼성화(hybridization)에 대하여 테스트될 것이다.
가능한 응용 범위 특히, DNA-마이크로어레이 기술은 유전자의 검출, 질병의 진단을 통한 유전자형 분석(genotyping)(예를 들면, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 대한 연구), 약제 검출(pharmacogenomics), 독성학(toxicogenomics) 분야의 연구까지 확장된다(또한, WO 01/31333에 이와 관련된 내용 참조).
특정 과제에 적합한 마이크로어레이를 생산하는 것은 기본적으로 마이크로어레이 시스템을 설계(design)하는 것에 더하여, 프로브의 선별, 지지체(기판 또는 구어로 "칩") 상에 초기 어레이의 제조, 목적 단백질의 준비, 테스트를 수행하고, 데이터의 기록 및 처리를 포함하며, 특히, 이러한 단계들 모두를 수행한 이후에, 마이크로어레이 시스템의 검증 즉, 예를 들면, 잠재적인 활성 물질의 작용(functioning)을 실질적으로 확인하기 위해, 프로브 분자의 초기에 제조된 배열이 샘플 물질에 함유된 목적 분자와 적합한 특이성으로 결합하는지 여부에 대한 후속 체크를 필요로 한다.
제공될 각각의 마이크로어레이 시스템은 이러한 검증을 요구하는데, 이는 어떠한 주어진 마이크로어레이의 제조 과정에 첫째, 합성 동안 및/또는 프로브 분자들을 적용하는 과정 중에 오류가 빈번하게 발생하고 둘째, 특히 DNA 마이크로어레이의 경우 컴퓨터에 의해서 조절되는 인-실리코(in silico) 방법은 최적의 올리고뉴클레오타이드를 선택할 수 없고, 또한, 최적의 시그날(signal)을 제공하기 위해특히, 각 스팟 내 프로브 분자의 유전자에서의 위치, 길이 및 양이 주어진 응용 분야에 따라 개조되어야(adapted)하기 때문이다.
마이크로어레이를 제조하기 위한 몇몇 시스템 및 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 다음의 두 가지 서로 다른 방식이 있다: 첫 번째 방법에서 프로브 분자는 특정의 기판(substrate) 상에서 (예를 들면, 적합한 포토리소그래픽(photolithographic) 마스크 노출 방법으로) 인-시츄(in-situ) 합성된다. 두 번째 방법에서 프로브 분자가 먼저 적절한 합성 방법 (예를 들면, 통상적인 고상 합성)에 의하여 먼저 엑스-시츄(ex-situ) 합성되고, 그런 다음 (예를 들면, "스파팅" 또는 "프린팅"에 의해서) 특정 기판에 적용된다.
엑스-시츄 합성 및 후속 스파팅으로 검증된 즉, 가능한 오류가 없는(error-free) 마이크로어레이를 제조하기에는 매우 긴 시간, 보통 수 주, 대체로 약 5주 보다 더 오래, 예를 들면 5개월까지 소요될 수도 있는데, 이는 마이크로어레이의 최초 설계가 검증 과정에 몇몇 평가 사이클(evaluation cycle)에서 주어지는 문제에 따라 개조되어야만 하기 때문이다. 따라서,각 평가 사이클에서 어레이의 배열이 개조되는 경우에는 많은 서로 다른 프로브 분자 종(특징)의 제조 및 이들의 스파팅은 초기 어레이부터 검증된 어레이까지 소요되는 시간적 측면에서 볼 때 유용하지 않다. 현재 약 600게놈의 서열 분석이 마무리 단계에 있으며 유전 정보의 양이 극적으로 계속하여 증가할 것이라는 사실을 고려하면, 마이크로어레이를 이용하여 유전자의 기능을 연구하는데 있어서 실질적으로 더욱 신속한 방법이 상당히 중요시되고 있다. 더욱이, 지식이 축적되면서 응용 분야는 더욱 특이적으로 되고 마이크로어레이 개발을 위한 시간적 압박은 증가하고 있다. 너무 오랜 시간이 소요되는 것은 특히, 활성 물질들의 연구에는 유용하지 않은데, 활성 물질을 위한 신속한 개조가 요구되기 때문이다. 특히, 진단에서는 가능한 활성 물질 또는 활성 물질들의 조합에 대한 신속하고 환자-특이적인 평가가 종종 기대된다. 반대로, 인-시츄 방법 및 마이크로어레이의 제조에 적합한 장치들을 포함하는 적합한 시스템은 일반적으로 서로 다른 특징(feature)을 적용할 수 있다는 점에서 우수하다. 그러나, 인-시츄 방법은 상당히 더 복잡한 장치를 요구하고, 앞서 기재된 방식 (엑스-시츄 합성/스파팅)보다 더 많은 비용이 소요된다는 점에서 특히, 검증된 마이크로어레이의 대량 생산을 위한 경우에는 유용하지 않다.
본 발명의 목적은 가능한 신속하고, 비용 효율적이며 산업적인 생산 규모로 검증된 마이크로어레이의 생산을 가능하게 하는 것이다.
도 1은 검증된 마이크로어레이, 일례로 DNA 마이크로어레이를 제조하기 위한 종래의 통상적인 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 DNA 마이크로어레이를 제조하는 과정을 나타낸다.
이러한 목적은 특히 청구범위에서 특징지어진 본 발명에 따른 양태에 의해서 달성된다.
보다 상세하게는, 본 발명은 검증된 마이크로어레이의 분리된(decoupled) 제조를 위한, 적어도 하기 장치들로 이루어진 시스템을 제공한다.
- 마이크로어레이를 통해서 분석될 목적 분자에 대한 정보의 입력을 위해서 설계된 하나 또는 그 이상의 장치,
- 분석될 목적 분자에 대한 정보를 기반으로 하여 상기 목적 분자에 잠재적으로 상호작용하는 프로브 분자(테스트 프로브 분자)를 결정하도록 설계된 하나의 장치,
- 하기 장치들을 포함하는 하나의 배치-제공 장치(layout-providing apparatus),
- 테스트 프로브 분자의 고밀도 인-시츄 합성용 장치,
- 테스트 프로브 분자와 목적 분자를 접촉시키기 위해 설계된 마이크로어레이 테스트 장치, 및
- 목적 분자와 테스트 프로브 분자의 접촉 동안에 수정된 시그날을 기록하기 위해서 설계된 마이크로어레이 판독(read-out) 장치,
- 프로브 분자의 엑스-시츄 합성용으로 설계된 하나의 프로브 분자 합성용 장치, 및
- 기판에 프로브 분자를 적용(apply)하기 위해서 설계된 하나의 마이크로어레이-제공 장치(microarray-providing apparatus).
본 발명의 시스템은 바람직하게는 컴퓨터를 기반으로 한 기술을 포함한다. 이러한 바람직한 양태에서 예를 들면, 마이크로어레이를 통해 분석될 목적 분자에 대한 정보의 입력용 장치들은 각각 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 데이터 파일로 상기 정보를 저장할 하나의 (또는 하나 이상의) 컴퓨터를 포함한다. 마찬가지로, 테스트 프로브 분자를 결정하는 장치는 바람직하게는 목적 분자에 대한 정보를 기반으로 하여 테스트 프로브 분자를 프로그램 제어로 선택하는 컴퓨터를 포함한다. 더 나아가, 상기 배치-제공 장치 역시, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 데이터 파일의 형태로 배치를 저장하는 하나의 컴퓨터 (또는 적합한 경우에, 예외적으로 몇 대의 컴퓨터)를 포함한다. 그러므로, 예를 들면, 배치-제공 장치는 프로브 분자의 합성 장치에 의해 제조될 프로브 분자에 대한 정보를 포함하는 하나의 데이터 파일을 (적합한 포맷으로) 생성할 수 있으며, 동시에 다른 (또는 몇 개의 다른) 데이터 파일이 생성되는데, 이는 (마이크로어레이-제공 장치를 위한) 마이크로어레이 상에 적용하는 방식, 밀도, 개수, 방향, 배열 등에 대한 정보를 포함한다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 컴퓨터 및 적합한 조절 프로그램은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 배치-제공 장치는 제조될 검증된 마이크로어레이의 배열을 결정하는데 사용된다. 본 발명에서 마이크로어레이의 용어 "배치(layout)"는 설계(design) 즉, 유형, 특성 (특히, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 서열 등), 양, 밀도, 결합 (예를 들면, 어떠한 링커가 마이크로어레이에 사용된 지지체 상에 프로브 분자를 부착시키기 위해서 이용된다), 방향 (예를 들면, 핵산의 경우에 5’에서 3’ 또는 그 역, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 등의 경우에 N-말단에서 C-말단 또는 그 역) 및 마이크로어레이 상에서 프로브 분자의 배열 등과 같은 마이크로어레이를 특징짓는 변수들에 관한 것이다.
배치-제공 장치는 테스트 프로브 분자의 고밀도 인-시츄 합성용 장치를 포함한다. 이러한 장치는 많은 수의, 예를 들면 1,000 이상, 바람직하게는 적어도 4,000의 다른 (테스트) 프로브 분자 종을 마이크로어레이를 위한 통상적인 영역,예를 들면 약 1200mm2부터 약 3000mm2까지, 바람직하게는 마이크로어레이 배열, 예를 들면, 약 20 x 60mm부터 약 38 x 75mm까지, 바람직하게는 약 25 x 75mm 넓이 영역의 마이크로어레이 기판 상에 직접 합성하는 것을 특징으로 한다.
이와 관련해서, "(테스트) 프로브 분자 종"은 각 경우에 있어서 특정한 구조의 프로브 분자, 예를 들면 특정한 뉴클레오타이드 서열의 핵산, 특히 DNA 또는 특정 아미노산 서열을 가지는 (폴리- 또는 올리고-) 펩타이드를 의미한다. 일반적으로 (테스트) 프로브 분자 종은 또한 "특징(feature)"으로서 지칭하기도 한다.
적합한 인-시츄 합성 장치는 당업자에게 잘 알려져 있고 일반적으로 포토리소그래픽적으로(photolithographically) 생산되는 노출 장치 또는 습식 화합물(wet-chemical)의 프린팅에 의해서 또는 전기화학적으로 작동하는 장치이다.
보다 상세하게, 검증된 DNA 마이크로어레이는 습식 화합물의 프린팅을 통한 인-시츄 합성용 장치에 의해 제조될 수 있는데, 본 발명에 따라 사용할 수 있고, 예를 들면 Clondiag Chip Technologies GmbH(Jena, Germany)로부터 입수할 수 있다. 본 발명에는 포토리소그래픽 장치, 예를 들면 인-시츄 DNA 합성을 위한 포토리소그래피 장치가 바람직하고 예를 들면, NimbleGen, System, Inc.(Madison, WI, USA), Affymetrix Inc.(Santa Clara, CA, USA), Xeotron Corp(Houston, TX, USA), Combinature Biopharm AG(Berlin, Germany) 및 Febit AG(Mannheim, Germany)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 아주 많거나 상당한 고밀도의 (테스트) 프로브 분자를 저비용 및 단시간에 인-시츄 합성할 수 있는 가능성 때문에, (테스트) 프로브분자의 MAS(maskless array system) 합성용 장치가 특히 바람직하다. 이러한 장치를 사용하여 하나의 어레이에서 통상적으로 400,000개 이상의 DNA 특징, 또 예를 들면 특정한 배열에서 750,000 (DNA) 특징들을 합성하는 것이 가능하다. MAS 기술은 예를 들면, 이의 개시 내용이 본 발명에 그대로 포함된 WO 99/42813에 기재되어 있다. MAS 합성에 적절한 추가 장치 및 이러한 기술의 특정한 형태는 WO 01/34847 및 WO 02/04597에 예시되어 있으며, 이러한 점에서 이들의 개시 내용도 마찬가지로 본 발명에 참고문헌으로 포함된다. 인-시츄 합성을 위한 더 바람직한 장치는 전기화학적으로 또는 인-시츄 스파팅을 사용함으로써 작동되는 장치이다.
마이크로어레이 테스트 장치 및 마이크로어레이 판독 장치와 같이 배치-제공 장치에 포함된 다른 장치들도 마찬가지로 당해 기술수준이고 상업적으로 입수 가능한 것이다. 완전히 통합된 장치를 제공하는 관련된 제조업자의 예는 Agilent (USA), Genomic Solutions (USA), Affymetrix (USA), Axon Instruments Inc. (USA) 및 Packard Bioscience (USA)이다.
프로브 분자의 엑스-시츄 합성 장치는 본 발명에 따른 시스템의 한 부분으로서, 최종 생산물로 제공될 마이크로어레이를 위한 프로브 분자를 합성하는데 사용되며, 바람직하게는 당업계에 알려진 고상 합성용 장치이다. 프로브 분자 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드의 엑스-시츄 고상 합성용 장치는 특히, 메리필드-합성 형(Merrifield-synthesis type)(H.G. Gassen et al. (1982), Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments, Verlag Chemie, Weinheim; Gait (1987) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford) 또는 다른형 (Beyer and Walter (1984) Lehrbuch der organischen Chemie, pages 816 ff., 20th Edition, S. Hirzel Verlag, Stuttgart)이 통상적으로 알려져 있으며 예를 들면, Dharmacon Research Inc. (USA) 및 Synthegen (USA)에 의해 공급되고 있다. 프로브 분자 특히, 올리고뉴클레오타이드의 고상 합성은 통상 무료(as service)로 제공되는데, 그 중에서도 특히, 예를 들면, Proligo (USA), Sigma (Germany), MWG Biotech AG(Germany) 등이 무료로 제공한다. 이러한 고상 합성용 장치는 유익하게도, 대량의 주어진 프로브 분자 또는 주어진 프로브 분자의 종(특징) 예를 들면, 주어진 서열의 올리고뉴클레오타이드를 저비용, 비교적 단시간에 양호한 수율로 제공하는 것을 가능하게 한다.
본 발명 시스템의 마이크로어레이-제공 장치는 이러한 방식으로 마이크로어레이를 완성하기 위해 엑스-시츄 합성된 프로브 분자를 적합한 기판에 적용(apply)하는데 이용된다. 엑스-시츄 합성된 프로브 분자를 적용하기 위해 본 발명에서 이용될 수 있는 장치도 마찬가지로 당해 기술수준이며 예를 들면, Biorobotics (USA), Genemachines (USA), Perkin Elmer Life Sciences (USA), MWG Biotech AG (Germany) 또는 GeneScan Europe AG (Germany)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명에서 엑스-시츄 합성된 프로브 분자를 적용하기 위한 바람직한 장치는 적합한 스파팅 또는 프린팅 장치이다.
본 발명에 따른 시스템의 상기 기재된 구성 요소(component)들은 바람직하게는 컴퓨터에 의해서 제어되어 반 자동 또는 완전 자동으로 작동된다. 구성요소들 특히, 적합한 배치-제공 장치, 프로브 분자 합성용 장치 및 마이크로어레이-제공장치는 미세유체성분(microfluidic) 및 미세기계부품(micromechanical components)을 구비하고 있는데, 이들은 전형적으로 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 입수 가능하다.
따라서 본 발명에 따른 시스템에 사용되는 장치들의 바람직한 배열은 데이터 입력 및 데이터 처리를 실질적으로 단순화시키는 컴퓨터가 추가로 구비된 것이다. 이러한 시스템에서 (예를 들면, 입력 장치와 배치-제공 장치 간, 배치-제공 장치 및 프로브 분자 합성용 장치간, 또한 마이크로어레이-제공 장치 간의) 데이터의 교환을 위한 구성요소들이 데이터 전송 장치를 통해서 네트워크로 연결되는 것이 바람직하다. 네트워크는 예를 들면, 국소(local) 네트워크일 수 있는데, 여기서는 예를 들면, 단지 몇 대의 컴퓨터가 다른 것과 정보교환하는 것일 수 있다. 네크워크가 인터넷인 경우가 유리하다. "월드 와이드 웹(World Wide Web)"의 기본적인 배열 및 정보교환(communication) 알고리즘에 관하여 예를 들면, WO 01/30333의 이러한 주제에 대한 내용이 참고 문헌으로 포함된다. 네트워크는 또한 데이터 전송 장치들을 통해서 정보교환하는 컴퓨터들의 어떠한 다른 지방, 국내 또는 국제적인 연결(connection)이 될 수 있다.
네트워크에서 예를 들면, 인터넷을 통한 본 발명의 장치들을 조합하는 관점으로부터, 본 발명의 더 바람직한 배열은 장치들이 연구 연합(association) 또는 연구 콘소시엄에서의 연결 (예를 들면, 정보교환, 상호 데이터 교환 등)을 위한 플랫폼(platform)을 제공하는 시스템이다. 또한, 합작 프로젝트로 특히, 서로 다른 위치에서 작업하는 그러한 연구 콘소시엄에서는 실험적으로 검증된 마이크로어레이를 이용한 후에, 향상된 지식으로 인하여, 마이크로어레이의 조합 (즉, 배치)에 대한 새로운 수요가 있는 경우에 재설계를 요청하는 것이 가능하다. 이러한 방식에서는 국소적이지 않은 설계와 검증된 마이크로어레이의 국소적 생산으로, 지식의 축적 효율을 급격하게 증가시키는 것이 가능하다. 그러한 플랫폼 시스템의 효과적인 이용에 대한 양태의 예는 웹 기반으로 한 (특히, 인터넷을 기반으로 한) 실험실 정보 관리 시스템(LIMS)으로, 여기서는 관련된 모든 사람들 (예를 들면, 연구 연합 또는 연구 콘소시엄의 구성원들)이 마이크로어레이 배치, 재-설계 배치 및 마이크로어레이의 관리를 공유한다. 그러한 LIMS의 일례가 Clondiag에 의한 "Partisan"이다.
추가로, 본 발명은 검증된 마이크로어레이 배치의 분리된(decoupled) 제조 방법 특히, 상기 기재된 시스템을 이용하는 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 바람직하게는 상기 입력 장치를 이용하여, 마이크로어레이에 의해서 분석될 목적 분자에 대한 정보를 제공하는 단계;
(b) 예를 들면, 본 발명의 테스트 프로브 분자 결정 장치를 이용하여, 상기 정보를 기반으로 하여 테스트 프로브 분자 (즉, 목적분자와 잠재적으로 상호작용하는 프로브 분자들)를 결정하는 단계;
(c) 하기 단계들을 포함하는, 특히 상기 기재된 배치 장치를 이용해서, 마이크로어레이의 검증된 배치를 제공하는 단계,
- 바람직하게는 상기 인-시츄 합성용 장치를 이용하여, 상기 결정된 테스트 프로브 분자의 고밀도 인-시츄 합성 방법으로, 적어도 하나의 테스트 마이크로어레이를 제조하는 단계,
- 바람직하게는 상기 마이크로어레이 테스트 장치에 의해, 목적 분자를 이용하여 테스트 마이크로어레이를 테스트하는 단계, 및
- 특히 상기 마이크로어레이 판독 장치에 의해, 목적 분자를 이용하여 테스트 마이크로어레이를 테스트할 때 수정된 적어도 하나의 시그날을 기록하는 단계,
(d) 특히, 상기 프로브 분자 합성 장치를 이용하여, 검증된 배치 (검증된 프로브 분자)에 상응하는 프로브 분자를 엑스-시츄 합성하는 단계, 및
(e) 바람직하게는, 본 발명에 따른 마이크로어레이-제공 장치를 이용하여, 검증된 배치에 따라 검증된 프로브 분자를 기판에 적용하는 단계.
본 발명의 시스템 및 방법은, 검증된 마이크로어레이 배치를 제공하기 위해서 필요한 하나 또는 그 이상의 테스트 마이크로어레이를 제조하는 과정은 적절한 장치에 의해서 인-시츄 방법을 통해서 수행되는 한편, 실질적인 (검증된) (검증된 배치에 부합하는) 마이크로어레이는 프로브 분자의 엑스-시츄 합성, 바람직하게는 고상 합성에 의해서 제조되고, 그런 다음 다시 적합한 시스템 구성요소들의 도움으로 적합한 기판에 적용된다는 발견에 기반을 둔다. 따라서 본 발명의 시스템 및 방법에서 검증 과정은 최종 생산물, 검증된 마이크로어레이의 제조와는 분리(decoupling)되어 있다. 본 발명의 조합은 각각 방법의 원리가 다음의 특정한특이적 장점들을 나타내는데 적용되도록 최선의 방법으로 상기 두 방법의 원리를 함께 연결하는 것이다 : 고밀도 인-시츄 합성은 특히 유동적(flexible)이어서 목적 분자와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 프로브 분자의 광범위한 풀(pool)로부터 시작하는 테스트 마이크로어레이 제조에 적합하다. 마이크로어레이의 검증된 배치가 이용할 수 있게 된다면, 후자는 각 경우에, 검증된 배치에 따라 프로브 분자의 신속하고 비용-효율적인 엑스-시츄 합성 및 후속적인 기판에의 적용에 의해서 제조된다. 검증 과정이 이미 프로브 분자의 수를 비교적 낮은 수준까지 제한하므로, 상대적으로 적은 수의 서로 다른 프로브 분자 종이 최종 생산물을 위한 엑스-시츄 합성에서 제조될 필요가 있고, 이러한 결과로, 본 발명에 따른 방법의 도움으로, 검증된 마이크로어레이를 제조하는데 소요되는 비용은 기존에 통상적인 과정과 비교했을 때 현저하게 감소될 수 있다. 최종 생산물을 위한 프로브 분자의 엑스-시츄 합성은 산업적인 규모로 마이크로어레이를 합성하는데 특히 적합하고, 따라서 본 발명에 따른 발명의 장점은 대량의 검증된 마이크로어레이를 필요로 하는 경우에 특히 유리하다는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 제조 방법에서 기술된 과정들은 시너지 효과적으로 작용하여 검증된 마이크로어레이를 신속하고, 비용-효율적이며 낮은 오차율로 제공하는 것을 가능하게 만든다.
본 발명에 있어서, 단계 (a)는 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 마이크로어레이 사용자가 함께 실시하고, 단계 (b) 및 (c)는 그들로부터 공간적으로 분리된 예를 들면, 배치 제공자들과 함께 실시하며, 단계 (d)는 예를 들면, 프로브 분자 제조업자와 함께 실시하고, 단계 (e)는 예를 들면, 마이크로어레이 제조업자와 함께 실시하는 방식으로 본 발명을 실시하는 것이 바람직하다. 물론 단계 (b) 및 (c)가 각 경우에 서로 공간적인 분리 상태에서 실시되는 것이 가능하다. 그러므로, 예를 들면 마이크로어레이 사용자는 또한 테스트 프로브 분자를 결정할 수 있고, 이러한 방식으로 배치 제공자를 위한 테스트 프로브 분자를 미리 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 단계들의 상기 예시된 공간적 분리에서는 특히, 전자 데이터를 전송함으로써 필수적인 정보의 흐름을 이행하는 것이 바람직하다. 따라서 단계 (a)에서 정보는 바람직하게는 데이터 파일의 형태로 전자 데이터 전송 장치의 도움으로 제공된다. 마찬가지로, 검증된 배치는 단계 (c)에서 바람직하게는 데이터 파일의 형태로 전자 데이터 전송 장치의 도움으로 제공된다. 그러므로, 예를 들면, 사용자가 목적 분자에 대한 정보를 전자 형태로 본 발명의 입력 장치로 입력하면 이 정보는 예를 들면 배치 제공자에 의해 배열된(arranged) 테스트 프로브 분자 결정용 장치로 전달된다. 마이크로어레이의 검증된 배치를 생산한 이후에, 후자는 차례로 프로브 분자에 대한 정보, 가능하다면 검증된 마이크로어레이를 특징짓는 상기 기재된 추가 데이터를 포함한 적절한 완전한 배치를 데이터 파일로서 (바람직하게는 프로브 분자 제조업자에 의해 배열된) 프로브 분자 합성용 장치로 전송한다. 더 나아가, (예를 들면, 적합한 마이크로어레이 제조업자에 의해 배열된) 마이크로어레이-제공 장치의 검증된 배치 데이터는 바람직하게는 하나 이상의 데이터 파일로 제공된다.
이를 위해 발명의 시스템에 포함된 구성요소들은 이미 앞에서 예시한 바데로, 유익하게는 컴퓨터 네트워크를 통해서, 특히 인터넷을 통해서 서로 연결된다. 제공 장치(단계 (a)), 결정 장치(단계 (b)), 배치-제공 장치(단계 (c)), 프로브 분자 합성용 장치(단계 (d)) 및 마이크로어레이-제공 장치(단계 (e)) 간의 가능한 정보교환(communication) 방법을, 특히 인터넷을 통해서, 바람직하게는 적합한 시스템 소프트웨어를 이용하는 가능한 방식들은 당해 기술수준이고, 예를 들면 특허 공보의 개시 내용이 본 발명에 그대로 포함되는 WO 01/31333에 예시되어 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (a)에서, 시스템에 제공될 배치를 가진 마이크로어레이에 의해 분석될 목적 분자에 대한 정보 즉, 특징적인 성질이 먼저 제공된다. 이러한 정보는 예를 들면, 목적 분자의 유형 및 성질, 예를 들면 분석될 목적 분자가 핵산, (올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함하는)펩타이드, 펩타이드 핵산 분자, 저분자량 유기 물질, 당 분자 (예를 들면, 올리고당류 및 다당류) 등 (존재한다고 언급된 분자 종의 혼합물도 또한 가능함)인지에 대한 것들을 포함한다. 더 나아가, 이러한 정보는 목적 분자 및/또는 가능하다면, 마이크로어레이에 사용될 지지체 또는 기판 물질의 표면 구조, 부피 등에 대한 (예를 들면, 입체적 특성에 관한 정보를 포함하는) 정보, 사용될 수 있는 프로브 분자와의 및/또는 예정된 지지체 물질과의 잠재적 비특이적 상호작용을 포함한 목적 분자의 접착 또는 결합 특성에 대한 정보 특히, 이러한 결합 변수가 포함하는, 결합 상수, 상호적인 변수 등과 같은 결합 특성 및 존재할 수 있는 구조적인 가요성(flexibility)을 고려한 동력학에 대한 정보들을 포함한다. 추가 정보는 마이크로어레이로 수행할 실험 동안에 존재하는 반응 조건 즉, 온도, 완충액조건(pH, 염 함량, 계면 활성제,보조제 등)에 관한 것이다. 이러한 정보는 이로부터 이용가능하게 된 과제를 기반으로 하여 마이크로어레이에 적용할 잠재적으로 목적 분자와 상호작용하게 될 프로브 분자에까지 이어진다. 그러나 이러한 초기 결정된 프로브 분자는 검증 과정에서 마이크로어레이 배열을 개조시킴으로써 제조될 마이크로어레이에서 그들의 실질적인 적합성에 관해서 체크되어야 한다. 따라서, 이러한 초기에 결정된 프로브 분자들은 본 발명에서 "테스트 프로브 분자"로서 표기된다.
앞에서 이미 논의된 바데로, 목적 분자에 대한 정보, 특히, 제공될 배치가 기초로 하는 분석할 문제 및/또는 검증된 배치는 데이터 파일의 형태로 전자 데이터 전송 장치의 도움으로 제공된다. 예를 들면, 이러한 데이터 전송 장치는 이-메일에 의해서 서로 정보교환하는 두 대의 컴퓨터로 구성된다. 이러한 경우에, 이용자는 통상적으로 목적 분자에 관한 필수적인 정보를 중앙에서 떨어지게 배열된 컴퓨터로부터 중앙 컴퓨터까지, 바람직하게는 전자 데이터 전송에 의해서 예를 들면, 이-메일을 이용하여 전송한다. 물론, 상기 정보들은 또한 다른 어떠한 가능한 데이터 운반체 예를 들면, 플로피 디스크, CD-ROM 등 상에서 제공될 수 있다. 그런 다음, 특정한 데이터세트(dataset)를 예를 들면, (예를 들면, 앞서 수행된 연구로부터 유래되고, 이는 추가적인 최적화를 위한 "트레이닝 세트(training set)"로서 이용될 수 있는) 이미 생산된 마이크로어레이 또는 마이크로어레이 배치와 비교하여 이러한 방식으로 "선최적화된(preoptimized)"마이크로어레이 배치를 결정하는 것이 가능하다. 상기 데이터세트는 먼저 그들을 바람직하게는 동일한포맷(format)으로 전환하고 그런 다음, 그들을 이러한 포맷된 데이터로부터 생산된 주형 및/또는 뉴우런(neuronal) 네트워크의 도움으로 이미 이용 가능한 데이터세트와 비교함으로써 최적화하고, 적합할 시에는, 그에 따라 개조된다.
본 발명의 방법은 테스트 프로브 분자 또는 검증된 프로브 분자 또는 목적 분자의 유형에 대하여 제한적이지 않다. 그러므로, 이러한 분자들은 예를 들면, 핵산, (올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질, 특히 항체 또는 이들의 단편을 포함하는)펩타이드, 펩타이드 핵산 분자, 저 분자량 유기 물질, 당 분자(예를 들면, 올리고당 및 다당류) 및 언급된 분자 종들의 혼합물이 또한 존재할 수도 있다.
본 발명의 제조 방법은 목적 분자로서 핵산을 연구하는데 사용되는 마이크로어레이를 검증하는데 특히 매우 적합하다. 따라서 본 발명의 방법은 이러한 변형체를 기반으로 하는 실시예에 의하여 이하에서 기술된다. 그러나 당업자에게는 본 발명의 방법이 기초로 한 전반적인 개념(concept)은 어떠한 다른 가능한 마이크로어레이 과제들에 특히, 여타의 다른 구조적으로 상이한 프로브 및 목적 분자에 자유롭게 적용될 수 있다는 것은 자명할 것이다.
DNA 마이크로어레이의 경우에, 단계 (a)에서 제공될 목적 분자에 대한 정보는 일반적으로 마이크로어레이 테스트가 기초로 하는 게놈에 관한 과제이다. 예를 들면, 이것은 분석될 목적 분자, 즉 DNA가 유래되는 유기체에 대한 정보를 포함한다. 그러나 분석될 DNA 목적 분자에 대한 정보는 분석될 DNA 분자군(population)을 보다 정확하게 특성화하는 더욱 상세한 정보일 수도 있다. 특히, 이러한 정보는 일반적으로 목적 핵산의 서열이며, 바람직하게는 당업자에게 공지된 적절한 포맷인 데이터 파일로 제공된다. 서열을 위한 통상적으로 알려진 기본적인 데이터 포맷의 일예는 FASTA 포맷이다. 더 나아가, 상기 정보는 또한 특정한 세포 유형, 예를 들면, 세포가 일반적으로 암세포인지 아니면 어떠한 다른 질병 상태에 있는 세포인지 또는 예를 들면, 특정한 세포주가 연구될 것인지 등에 관한 것일 수도 있다. 다른 정보는 주로 유기체 예를 들면, 특정한 세포, 기관, 기관의 일부분 등에 미치는 영향, 이벤트 또는 치료에 관한 것이며, 이들이 수행될 마이크로어레이 테스트에 선행되고, 이들은 예를 들면, 유기체 또는 그들의 일부분을 특정한 물질, 예를 들면, 약제, 독성학적으로 관련된 물질 등에 노출시키는 것을 포함한다.
기본적인 과제에 대한 정보 즉, 분석될 목적 분자에 대한 정보가 예를 들면, 바람직하게는 데이터 전송 장치를 이용하여 배치 제공자에게 마련된 중앙 컴퓨터와 같은 중앙 위치로 제공된 후에, 목적 분자와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 테스트 프로브 분자가 본 발명의 방법 단계(b)에서 결정된다. 바람직한 양태에서, 이는 당업자에게 익숙한 컴퓨터 프로그램 예를 들면, Arraydesigner 2 (Primer Biosoft International) 및 많은 여타의 것들에 의해서 수행된다. 따라서 본 발명에 따른 제조 방법의 바람직한 예에서는 단계 (b)에서 (게놈과 관련된) 과제를 기초로 결정된 테스트 프로브 분자로 사용될 핵산 서열, 특히 올리고뉴클레오타이드 예를 들면, 약 4 내지 약 80, 보다 바람직하게는 약 8 내지 80 뉴클레오타이드가 제공된다.
특히 바람직한 양태에 따라, 단계 (b)에서 예를 들면, 특별한 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 결정된 테스트 프로브 분자는 배치가 제공된 마이크로어레이에 의해 분석될 목적 분자와 잠재적으로 상호작용하는 분자들의 전체 군을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드가 인-시츄 합성에서 특히 MAS 기술을 사용해서 프로브 분자로서 이용될 때, 이러한 전체 군은 예를 들면, 어떠한 유기체의 전체 게놈일 수도 있다. 유기체의 예에는 사람, 마우스, 래트, 염소, 돼지, 소, 기니아 피그,Danio rerio및C. elegans와 같은 동물, 유용한 식물,Arabidopsis등과 같은 식물, 프로토조아(protozoa), E.coli 같은 박테리아, 곰팡이 예를 들면,S. cerevisae와 같은 효모를 포함하며, 또한 본 발명에 따라 바이러스, 비로이드(viroid) 등을 포함할 수도 있다. 하지만, 프로브 분자 특히, 올리고뉴클레오타이드는 또한 더 큰 전체 군의 일부분을 나타낼 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드의 경우에, 적절한 (부분적인) 전체 군의 예는 유기체 예를 들면, 상기 기재된 유기체의 하나 또는 그 이상의 염색체의 유전 물질이 될 수 있다. 더 나아가, (부분적인) 전체 군은 각각의 cDNA 라이브러리일 수도 있다. 추가로, 테스트 프로브 분자는 스플라이스 변이체 (예를 들면, 특정 유전자 또는 하위그룹 유전자의 일차 전사체의 모든 스플라이스 변이체), 프로모터 영역, SNPs(특정한 유전자 또는 유전자 그룹 또는 유전자 하위그룹의 (지금까지) 공지된 모든 SNPs), 돌연변이(SNPs에서와 같이), 고반복 DNA 영역 등일 수 있다.
본 발명에 따른 검증된 배치 제공 방법은 바람직하게는 하기의 세부 단계들을 포함한다:
(1) 프로브 분자 (예상되는 시그날)와 목적 분자의 상호작용 시에 마이크로어레이로부터 예상되는 적어도 하나의 시그날을 특징화하는 단계;
(2) 바람직하게는 상기 기재된 인-시츄 합성용 장치를 이용하여, 결정된 테스트 프로브 분자를 고밀도로 인-시츄 합성함으로써, 테스트 마이크로어레이를 제조하는 단계;
(3) 특히, 본 발명에 따른 마이크로어레이 테스트 장치를 이용하여, 목적 분자에 의해 테스트 마이크로어레이를 테스트하고, 바람직하게는 상기 기재된 마이크로어레이 판독 장치를 이용하여, 적어도 하나의 테스트 시그날을 기록하는 단계;
(4) 적어도 하나의 테스트 시그날을 적어도 하나의 예상되는 시그날과 비교하는 단계;
(5) 테스트 시그날이 예상되는 시그날과 실질적으로 상응할 때까지, 단계 (2)에서 (4)까지 반복하고, 단계 (2)에서 마이크로어레이 상의 프로브 분자, 양, 결합, 개수, 밀도, 방향 및/또는 이들의 배열을 수정함으로써, 테스트 마이크로어레이를 개조시키는 단계; 및
(6) 적어도 하나의 테스트 시그날이 적어도 하나의 예상되는 시그날과 실질적으로 상응하는 마이크로어레이 배치를 제공하는 단계.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태의 세부 단계 (1)에서, 프로브 분자와 목적 분자의 상호작용 시에 마이크로어레이로부터 예상되는 하나 또는 그 이상의 예상되는 시그날을 미리 결정할 수 있다. 그러한 시그날은 어떠한 실험적으로 측정가능한 화학적 또는 물리적인 변수로서, 목적 분자가 프로브 분자와 접촉되는 (상기 기재된 마이크로어레이 테스트 장치를 사용하는) 테스트에서 적합한 마이크로어레이로부터 적절한 마이크로어레이 판독 장치(즉, 측정 장치)의 도움으로 판독될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 목적 분자 예를 들면, 핵산은 바람직하게는 하나 이상의 적절한 플루오로포어(fluorophores)(예를 들면, FITC, 텍사스 레드, Cy3, Cy5 등과 같은 시아닌)로 형광 표지된다. 따라서 이러한 경우에 예상되는 시그날은 형광 시그날일 것이며, 이는 마이크로어레이에 적절한 형광측정기, 커플된(coupled) CCD 카메라를 구비한 적합하게 설계된 공초점 형광성 현미경 또는 마이크로어레이 형광 검출을 위한 적절한 다른 측정 장치를 이용해서 측정된다. 마이크로어레이 기술 예를 들면, 지지체 물질에서 프로브 분자 및 목적 분자 간에 상호작용에 의해 및/또는 적절한 마커, 예를 들면, 레독스 마커 등을 통해서 유발되는 전자 시그날 (특히, 전류 변화)을 측정하는데 사용되는 다른 예상되는 시그날 및 테스트 시그날이 본 발명에 따른 방법에 이용될 수 있다.
더 나아가, 결정된 테스트 프로브 분자 (바람직하게는 올리고뉴클레오타이드)에 대한 마이크로어레이는 적합한 지지체 (바람직하게는 기능화된 유리, 예를 들면 시레인화(silanization)에 의해서) 상에 고밀도로 세부 단계 (2) (또는 본 발명에 따른 제조 방법의 상기 단계 (c))에 따라 인-시츄 합성된다. 이러한 테스트 프로브 분자의 인-시츄 합성은 당업자에게 알려진 여러 가지 방법으로 예를 들면, 인-시츄 합성용으로 본 발명의 장치에 관하여 앞에서 상기 나열된 공급업자들의 방법에 의해서 수행될 수 있을 것이다. 특히 MAS 기술의 도움으로 인-시츄 합성을 수행하는 것이 바람직하고, 이와 관련하여 WO 99/42813, WO 01/34847 및 WO 02/04597에서 예시된 양태가 참고문헌이 된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 테스트 프로브 분자의 고밀도 인-시츄 합성은 1,000 이상, 바람직하게는 적어도 4,000의 서로 다른 (테스트) 프로브 분자 종이 마이크로어레이를 위해서 선택된 기판 상의 어떠한 위치, 예를 들면, 약 1200mm2내지 약 3000mm2의 영역에 직접적으로 합성되는 것을 의미한다. 이와 관련해서, 바람직한 마이크로어레이 면적은 약 20 x 60mm 내지 약 38 x 75mm에 해당하며, 특히 약 25 x 75mm이다. MAS 방법은 예를 들면, 750,000 이상의 프로브 분자 종 (feature)의 프로브 분자의 인-시츄 합성을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태의 세부 단계 (3)에 따라, 이러한 방식으로 제조된 테스트 마이크로어레이의 테스트는 목적 분자를 이용해서 수행되고, 적어도 하나의 테스트 시그날이 기록된다. 예상되는 시그날에 관한 상기 내용들이 또한 기록될 테스트 시그날, 특히 형광 시그날에도 적용된다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 양태의 다음 세부 단계 (4)에서, 기록된 테스트 시그날 및/또는 기록된 테스트 시그날들은 미리 결정된 예상 시그날(및 각각 복수의 예상 시그날)과 비교된다. 이러한 비교는 예상되는 시그날 및 측정된 시그날이 판독되는 컴퓨터를 사용해서 공지의 프로그램의 도움으로 통상적으로 수행된다.
테스트 프로브 분자의 선택, 지지체 상에 프로브 분자의 인-시츄 합성 및 불확실성을 가지고 이행되는 이 방법의 다른 과정들로 인하여, 세부 단계 (3)에서 초기에 획득하는 테스트 시그날은 예상되는 시그날과 일치하지 않을 수 있다. 프로브 분자로서, 특히, 핵산 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드의 경우에 인-시츄 합성은 100% 수율로 달성할 수 없고, 따라서 특정 스팟에 있는 몇몇 올리고뉴클레오타이드는 예상된 또는 결정된 길이를 가지지 않거나 올바른 뉴클레오타이드 대신에 다른 뉴클레오타이드가 인-시츄 합성동안에 삽입될 수 있으므로 다른 서열을 가질 수도 있다는 사실에 주목해야 한다. 더 나아가, 스팟 당 적용된 프로브 분자의 양은 종종 특정한 적용 분야에 최적으로 개조되지 않을 수도 있다.
세부 단계 (3)에 따른 테스트를 수행하기 위한 방법의 한 예는 적용된 프로브 분자 특히, DNA를 표지하고, 그들에게 특히, 하나 또는 그 이상의 형광 표지를 제공하여 어레이의 형광 그래프 기록을 만들 수 있도록 하는 것이다. 이러한 목적을 위해서 각 적용된 프로브 분자 예를 들면, 각 올리고뉴클레오타이드를 표지할 필요는 없으며, 본 발명에서, 예를 들면 매 100번째, 500번째 또는 1000번째 프로브 분자를 표지하는 것으로 충분하다. 올리고뉴클레오타이드의 경우에 예를 들면, 비 표지 및 플루오레세인(fluorescein) 표지 뉴클레오타이드 1000:1 혼합물을 세부 단계 (2)에 따른 올리고뉴클레오타이드 합성 개시 단계에서 사용함으로써, 매 1000번째 올리고뉴클레오타이드만을 표지할 수 있다. 단지 수개의 프로브 분자를 표지하는 것은 어떠한 상당한 비용을 초래하지 않는다는 장점을 가지고 있다. 더 나아가, 있을 수 있는 형광 켄칭(quenching) 효과 (예를 들면, 형광 공명 에너지의 전이(FRET))가 없거나 적어도 감소될 수 있다. 이상적으로는, 마이크로어레이에 적용되는 올리고뉴클레오타이드의 형광 표지는 측정되는 형광이 적용된 프로브 분자가 표지된 목적 분자와 혼성화되었을 때 발생되는 형광의 양에 근접하게 상응하도록 맞추는 것이다.
추가의 바람직한 양태에 따라, 세부 단계 (3)에서 테스트는 하기 예시된 바데로 테스트 프로브 분자로 올리고뉴클레오타이드인 경우 본 발명에 따라 수행된다. 이러한 테스트는 어레이로 적용되도록 결정된 테스트 프로브 분자가 실질적으로 목적 분자와 혼성화할 수 있는지에 대하여 체크하는데 실질적으로 사용된다.
이러한 목적을 위해서, 어레이로 적용된 올리고뉴클레오타이드는 첫 번째 단계에서 약 1,000개 (예, 마이크로티터 플레이트 당 3 x 384 웰)의 세트로 분리한다. 두 번째 단계에서, 10 내지 15 뉴클레오타이드를 포함하는 서열을 조립된(assembled) 올리고뉴클레오타이드의 3’말단에 연결한다. 이러한 연장(extension)부분은 (마찬가지로 10 내지 15 뉴클레오타이드를 포함하는) 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 혼성화하는데 이용된다. 그런 다음, 상보적인 염기 서열 (두 번째 가닥)은 Taq 폴리머라제를 이용해서 연장된다. 이어서, 주형 가닥 및 두 번째 가닥을 분리하기 위한 변성 단계가 뒤따른다. 혼성화, 연장 및 변성의 단계를 PCR에서와 같이 반복되어 주형 가닥을 초과하는 표지된 두 번째 가닥을 생성되도록 한다. 마지막으로, 이러한 방식으로 생성된 두 번째 가닥은 (최종적으로) 플루오로포어(fluorophor)로 표지하고 마이크로어레이와 혼성화한다.
이러한 방법으로 형광 시그날을 측정했을 때, 올리고뉴클레오타이드가 단지 비효율적으로 혼성화하는 것인지의 여부를 확인하는 것이 가능하다. 그런 다음 이는 수정될 수 있고, 가능하다면, 다시 테스트될 수 있다. 이러한 방법의 또 다른 실시예에서, 두 번째 가닥의 분리 및 주형의 재사용 모두를 용이하게 하도록 일차가닥이 비오틴(biotin)을 통해서 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된 마이크로티터 플레이트에 결합될 수 있다. 마찬가지로 두 번째 가닥을 합성한 후에 표지할 필요가 없어진 이미 5’말단에 플루오로포어를 구비한 10 내지 15 뉴클레오타이드를 포함하는 상보적인 서열을 합성하는 것이 가능하다. 추가로, 마이크로어레이가 사용될 때마다, 이러한 조절 물질(control material)에 4번째 플루오로포어를 사용하고, 이것을 예를 들면 Cy3- 및 Cy5-로 표지된 실제 목적 분자와 함께 혼성화하는 것이 가능하다. 이는 마이크로어레이의 프로브 분자와 혼성화가 각 생산물 단위마다 동일하게 유지되도록 해준다.
본 발명에 있어서, 마이크로어레이는 테스트 시그날이 예상되는 시그날과 실질적으로 상응할 때까지, 세부 단계 (2) 내지 (4)를 반복함으로써, 테스트 시그날 및 예상되는 시그날 간의 비교에 따라 적절히 개조해간다. 이와 관련해서, 마이크로어레이 배치의 변수들은 세부 단계 (3)에서의 테스트의 결과 및 각 케이스 별로 선행된 라운드의 세부 단계 (4)에 따른 비교의 결과에 따라 세부 단계 (2)에서 각 케이스 별로 수정되는 바, 테스트 프로브 분자, 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드와 같은 핵산의 경우에, 서열, 길이, 표지, 이들의 형태 (예를 들면, 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드 대신에 뉴클레오타이드 유사체의 이용), 양, 개수, 밀도, 기판 상에 결합, 방향 및/또는 마이크로 상에서 이들의 배열이 수정된다. 수정될 수 있는 추가의 변수는 반응 조건, 프로브 및 목적 분자로서 핵산인 경우에 특히 온도, pH, 이온 강도와 같은 혼성화 조건, 이와 관련해서 특히 용액 및 완충액 조성, 예를 들면, 염 함량, 계면활성제 함량 등과 또한 관련된 것일 수 있다. (수정된 변수에 맞게 적절하게) 테스트 마이크로어레이를 제조하는 단계(세부 단계(2)), 목적 분자를 사용해서 마이크로어레이를 테스트하는 단계(세부 단계(3)), 테스트 시그날 및 예상되는 시그날을 비교하는 단계(세부 단계(4))는 테스트 시그날이 필연적으로 예상되는 시그날과 상응할 때까지 마이크로어레이의 적합한 개조와 함께 반복된다.
(테스트) 마이크로어레이를 검증할 때, 매 라운드 또는 몇 라운드 개조 후에 테스트 마이크로어레이의 테스트 및 판독 동안에 수득된 데이터를, 목적 분자에 대한 정보를 바람직하게는 본 발명의 입력 장치를 사용하여 시스템에 입력한 사람에게 추가로 전달하는 것이 바람직하다. 이러한 데이터를 기반으로 하여, 그 후 사용자가 차례로 검증 과정에 관여하는 것을 가능하게 하며 특정 목적 분자 및/또는 특정한 시간에 그 테스트에 존재한 프로브 분자에 대한 및/또는 상호작용 동안에 유지될 반응 조건에 대한 추가 발견(자체의 실험 데이터, 문헌 데이터 등)을 앞으로의 검증에 이용하는 것을 가능하게 하고, 이러한 발견들은 과정 중간에 수득할 수 있다. 이러한 경우에, 상기 기재된 장치, 네트워크 등을 통해서 전자 데이터를 전송하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 따른 방법의 이러한 바람직한 수정 형태를 사용함으로써 루프(loop)와 같은 방식이 제공되는데, 이는 특정한 단계에서 존재한 프로브 분자, 테스트에서 선택된 목적 분자 및 조건에 대한 정보 베이스(base)를 확장시킴으로써 특히 효율적인 방식으로 최적화된 배치 및 오차 없이 작동하는 맞춤형 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시예에 따른 마지막 세부 단계 (6)은 이러한 방식으로 테스트 시그날이 예상되는 시그날과 상응하는 검증된 마이크로어레이의 배치를 제공한다. 다시 이 배치를 데이터 파일의 형태로 전자 데이터 전송 장치의 도움으로 여기서 유사하게 적용할 수 있는 본 발명 방법의 단계 (a)에 관한 이전의 설명(remark)과 함께 마이크로어레이 사용자, 바람직하게는 프로브 분자 제조업자에게 배열된 프로브 분자 합성용 장치 및/또는 바람직하게는 마이크로어레이 제조업자에게 배열된 마이크로어레이-제공 장치에 제공하는 것이 가능하다.그러므로, 예를 들어서, 결정된 마이크로어레이 배치에 대한 정보는 하나 이상의 데이터 파일에 저장되고, 바람직하게는 이메일에 의해서 중앙 컴퓨터를 통해서 프로브 분자 제조업자 (특히, 올리고뉴클레오타이드 제조업자) 및 마이크로어레이 또는 바이오칩 제조업자에게 배치된 컴퓨터로 전송된다.
프로브 분자는 전술한 단계에서 제공된 배치에 따라 바람직하게는 종래기술에서 기재된 고상 합성법에 의해서 특히, (본 발명의 시스템과 관련하여 앞에서 언급된 대로) 메리필드 합성 방식 (H.G. Gassen et al. (1982), supra; Gait (1987), supra) 또는 다른 방식 (Beyer and Walter (1984), supra)으로 엑스-시츄 합성된다. 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 바람직한 방법은 포스포라미디트(phosphoramidite) 방법에 기반을 두고 통상적으로 (바람직하게는 아미노알킬로 수정된, 특히 아미노프로필로 수정된) 다공성 유리 지지체(CPG, controlled pore glass)를 사용한다. 이러한 방법의 장점은 대량의 주어진 (검증된) 프로브 분자 또는 주어진 (검증된) 프로브 분자 종(특징) 예를 들면, 주어진 서열의 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 8 내지 약 80 뉴클레오타이드 길이등을 저비용으로 비교적 단기간에 양호한 수율로 제공하는 것을 가능하게 한다는 것이다.
본 발명에 따른 최종 생산물 (검증된 마이크로어레이)은 다시 본 발명 방법의 단계 (c)에서 결정된 배치에 따라 엑스-시츄 합성된 프로브 분자를 적합한 기판에 적용함으로써 제공된다. 엑스-시츄 합성된 프로브 분자를 적용하는 본 발명에 따라 이용될 수 있는 방법은 당해 기술수준이며 예를 들면, (예를 들면 "프린팅 방법" 또는 "잉크젯 방법"으로 또한 불리우는) 적절한 스파팅 방법을 포함한다.
그러므로, 상기 예시된 단계들은 초기 과제, 특히, DNA 마이크로어레이를 사용할 때, 게놈과 관련된 과제들에 따라 가능한 올바르게 개조된 검증된 마이크로어레이를 제공하며, 따라서 이들은 특히 낮은 오차를 갖는 것으로 분류될 수 있다.
본 발명에 따른 추가 바람직한 양태에 따라, 다중(multiple) 마이크로어레이는 한 기판 상에 제공되며, 이는 "어레이들의 어레이(array of arrays)" 또는 "다중화된 어레이(multiplexed array)" 배열이라고 불린다. 물론, 각각 동일한 또는 서로 다른 설계를 가진 마이크로어레이가 다중화된 어레이 배열로 존재할 수 있다.
이러한 양태에서, 기판은 바람직하게는 상응하는 소수성 폴리머 또는 폴리머 조성물(예를 들면, 실리콘, 테프론(Teflon®) 또는 다른 불소화된 폴리머 또는 폴리머 조성물, 예를 들면, Cytonix로부터 나온 PerFluorCoatTM와 같은 생산물)과 같은 적절한 소수성제(hydrophobic agent)의 도움으로 소수성 패턴(소위 "양식(patterning)")으로 제공된다. 상응하는 방법이 본 발명에 따른 종래기술로알려져 있으며, 이 기술분야에서는 상응하는 폴리머 조성물을 사용하는 스크린 프린팅 방법이 바람직하다. 이를 통해서, 예를 들면, 소수성 코팅에 의해서 둘러싸이고 이로 인해서 서로 분리된 2, 8 (2 x 4), 12 (2 x 6), 16 (2 x 8), 48 (4 x 12) 또는 192(8 x 24) 반응 구역 또는 영역(웰), 각각 예를 들면, 글라스 슬라이드, 바람직하게는 (전형적인 현미경 슬라이드의 넓이에 상응하는) 25 x 75 mm의 넓이를 가지는 기판 상에 생성될 수 있다. 이러한 반응 구역은 기판을 코팅하는 대신에 반응 구역을 기판에 스탬프(stamp)하는 것이 가능하다는 것은 자명할 것이다. 설계, 특히 기판 상에서 반응 구역의 개수, 모양(원형, 타원형, 다각형) 및 배열 및 기판의 넓이는 절대적으로 임의로 선택될 수 있으며, 개별적으로 소비자의 요구에 따라 개조될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 전형적인 마이크로티터 (예를 들면, 85.48 x 127.76mm) 플레이트의 넓이를 가지는 기판이 바람직한 예로서 언급될 수 있다. 이러한 다중화된 어레이 배열은 특히 간단한 방식으로 액체 핸들링 및 고출력 과정을 위한 전형적인 자동화 시스템에 유용하게 통합될 수 있다.
다중화된 어레이의 이점은 특히 재현성의 증가 (모든 마이크로어레이가 동일한 기판에 적용되고 동일한 조건하에서 목적 분자와 접촉 (예를 들면,혼성화)된다; 추출, 역전사, 증폭 및 목적 분자의 표지는 각각의 마이크로어레이에 대하여 또한 동시에 수행할 수 있다; 단일 목적 분자를 단일 기판 상에 여러 차례 특성화하는 것이 가능하다(통계학적 개선)), 비용의 절감 (다중화된 어레이의 비용 증가는 일반적으로 1/어레이 수에 비례하여, 예를 들면, 다중화된 어레이의 가격은 단일 마이크로어레이 비용의 5배 미만이다. 그러나 다중화된 어레이는 예를 들면, 8 내지200테스트의 특성화를 위해서 이용될 수 있다) 및 처리량의 증가 (다중화된 어레이들이 테스트 용액과 동시에 접촉 (예를 들면, 혼성화)하므로 감소된 샘플 처리; 자동화의 가능성 특히 기판이 마이크로티터 플레이트의 형태로 사용될 때)이다.
더 나아가, 본 발명에 따른 마이크로어레이 또는 어레이들의 어레이는 용매 (주로, 증류수 또는 완충액; 적은 양의 샘플을 이용하는 마이크로어레이의 테스트 시에 특히 중요한)의 증발 및 근접한 마이크로어레이(다중화된 어레이의 경우)들의 교차 오염을 최소화하기 위해서 접착성 초구조물(superstructure)들을 (예를 들면, Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR, USA로부터 상업적으로 입수 가능) 구비할 수 있다.
본 발명에 따른 다중화된 어레이는 본 발명의 검증된 마이크로어레이를 위한 (본 발명에 따른 방법의 단계 (c)에 따라) 검증된 배치의 제공 및 (본 발명에 따른 방법의 단계 (e)에 따라) 검증된 프로브 분자의 (상응하는 양식, 바람직하게는 소수성으로 제공되어지는) 기판 상으로의 적용 모두에 사용될 수 있다. 다중화된 어레이 배열의 형태로 본 발명에 따른 검증되어진 마이크로어레이를 제공하는 것이 바람직한데, 검증된 프로브 분자를 적용하기 위해서 상응한 방법 (예를 들면, 스파팅, 잉크젯 프린팅 등)들이 이러한 경우에 가장 적합하기 때문이다. 따라서 본 발명의 이러한 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 상기 기재된 단계 (단계 (c) 및/또는 단계 (e), 바람직하게는 단계 (e))는 하나 이상의 테스트 마이크로어레이 (본 발명에 따른 방법의 단계(c)를 참조)를 생산하고 검증된 프로브 분자를 다중 마이크로어레이 형태 (본 발명에 따른 방법의 단계 (e)를 참조)로 적용하는 단계를 포함한다. 아직 검증되지 않은 테스트 마이크로어레이들(단계 (c)) 또는 검증된 배치를 가지는 마이크로어레이(단계 (e)) 각각은 동일하거나 상이할 수 있다. 기판의 분획(partitioning)은 종래기술에 공지된 양식(patterning) 장치에 의해서, 바람직하게는 잉크젯 프린팅(예를 들면, Systematic Automation, Inc., Farmington, CT, USA로부터 입수 가능)용으로 개조된 스크린 프린팅 장치에 의해서 수행될 수 있다. 이미 앞에서 요약한 바와 같이 본 발명에 따른 방법의 단계 (c)의 배경(context)에서 소비자에 의해서 확립된 정보를 통합하거나 본 발명에 따른 마이크로어레이의 설계에 이미-존재하는(pre-existing) 정보를 다중화된 어레이 배열에 통합시키는 것이 또한 바람직하다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해서 제조된 검증된 마이크로어레이 (즉, 검증된 배치를 가지는 마이크로어레이)에 관한 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 이는 다중화된 어레이 배열 내에 존재할 수도 있다.
<실시예 1>
도 1의 DNA 마이크로어레이의 통상적인 제조 과정에 대하여 설명한다.
통상적인 방법에서 첫 번째 부분은 DNA 마이크로어레이의 예비(preliminary) 제조 및 설계에 관한 것이다. 이러한 목적을 위하여, 먼저 코돈을 선택하였다. 이후, 요구되는 올리고뉴클레오타이드의 수를 최소화하기 위해 공지된 알고리즘을 이용하는 인-실리코(in-silico) 올리고뉴클레오타이드 설계를 수행하였다. 추가 변수들은 칩 당 스팟의 수를 최적화하는 것과 관련되었다. 이러한 최적화는 추후올리고뉴클레오타이드 합성 동안에 발생할 수 있는 비용을 절감하는데 반드시 필요하였다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 사용자에 의해 정제 단계를 종종 포함하는 고상 합성 방법으로 외부적으로 합성되었다. 이와 관련하여, 합성은 약 10% 오차율을 가질 것으로 추정되며, 적절한 품질(quality) 체크 또는 적절한 품질 제어(control)가 필요하게 하였다. 이는 추가로 고비용을 발생시키고, 이러한 올리고뉴클레오타이드 합성에만 1주 내지 2주가 소요되었다 (예를 들면, 1,000 내지 2,000 올리고뉴클레오타이드의 경우). 이러한 방식으로 외부적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드는 적합한 지지체에, 특히 유리(glass)에 적용(스파팅)되어야 하였다. 스파팅은 특히, 스파팅 용액을 제조하는 단계, 마이크로어레이에 따라 96, 384등 웰을 가진 마이크로티터(microtiter) 플레이트로 포매팅(formatting)하는 단계 및 상기 용액을 실제로 스파팅하는 단계를 포함하였다. 여기서 또한, 상응하는 품질 체크 문제가 야기되는데, 각 단계들은 제조될 다수의 용액 등으로 인하여, 비교적 오차가 발생하기 쉽기(error-prone) 때문이다. 또한, 이러한 스파팅 단계에 통상적인 마이크로어레이의 경우에 약 1주일이 소요되었다. 그런 다음, 이러한 방식으로 제조된 마이크로어레이는 혼성화, 분석 및 평가의 단계에 의해서 검증되어야 했다. 이미 오차를 포함하고 있는 상기 알고리즘에 의한 올리고뉴클레오타이드의 선택으로 인하여, 전체적인 방법은 마이크로어레이의 설계가 요구하는 사항들을 만족할 때까지 인-실리코 올리고뉴클레오타이드 선별부터 반복되어야 하며, 이 과정은 몇 주 또는 몇 개월이 소요되었다.
<실시예 2>
도 2의 본 발명에 따른 DNA 마이크로어레이의 제조방법에 대하여 설명한다.
먼저, (사용자에 의해서 제공된 목적 핵산 분자에 대한 정보를 기반으로 하여) 코돈을 선별하고 선택한 프로브 올리고뉴클레오타이드를 유리 지지체(유리 슬라이드) 상에서 인-시츄 MAS 합성을 수행하였다. 이러한 합성 방법은 매우 빠르며 (약 3시간/슬라이드), 또한 광범위 마이크로어레이(수십만 올리고류/슬라이드)의 경우에도 수행될 수 있었다. 이는 결정되어 적용된 프로브 올리고뉴클레오타이드가 유기체의 완전한 유전적 정보를 대표할 수 있다는 것을 또한 의미하였다. 이어서, 처음 제공된 마이크로어레이는 혼성화, 분석 및 평가의 세부 단계에서 검증될 수 있으며, 적절한 경우 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열을 개조하여 수정된 합성 과정을 다시 수행하였다. 프로브 올리고뉴클레오타이드는 사용자 특히, 원하는 마이크로어레이(칩)의 제조업자가 제공한 바람직하게는 인터넷을 통해서 제공된 정보에 따라 요구되는 마이크로어레이 배치(칩 설계)의 특이성 및 설계를 고려하여 선택되었다. 그 후, 검증된 배치에 따라 확인된 올리고뉴클레오타이드를 통상적인 고상 합성 방법을 사용하여 합성하고, 마이크로어레이 제조업체에서 검증된 프로브 분자들을 검증된 배치에 따라 스파팅 또는 프린팅 방법을 사용해서 적용하였다. 이러한 과정의 실질적인 장점은 배치(layout)를 생산하기 위하여 종래 과정에서 소요되는 (이용 가능한 정보의 정도에 따라) 약 5 내지 10주 시간을 (연구될 목적 분자에 대한 정보를 제공하는 것에서부터 검증된 마이크로어레이 배치까지) 1일 내지 1주일까지 많은 시간을 절약할 수 있고, 또한 본 발명의 방법은 검증된 마이크로어레이를 제조하는데 대량 생산에 특히 적합한 통상적인 방법을 사용함으로써 상당히 비용을 절감할 수 있었다.
본 발명에 따른 시스템 및 방법의 가능한 적용범위는 활성 물질의 선별을 위해서 특정한 마이크로어레이, 특히 DNA 마이크로어레이의 제조를 위해서 제공된다. 더 나아가, 본 발명의 방법에 의해서 특히, 본 발명의 시스템을 사용함으로써 제공되는 마이크로어레이는 활성 물질의 환자-특이적인 선별에 사용될 수 있다. 경험상 이러한 경우에 환자들이 그들의 임상적인 상태에 최적화된 약물들을 수용하는 속도가 중요하다는 것을 알 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따라서 제공되는 배치를 기반으로 하여 제공되는 마이크로어레이는 마찬가지로 짧은 반응 시간을 요구하는 독성 반응을 위한 기초로서 사용할 수도 있다. 더 나아가, 본 발명에 따라 제공되는 마이크로어레이는 생명공학적으로 생산되는 물질들에 대한 생산 공장(plant)을 평가하고 최적화하는데 이용되어질 수 있다. 그러한 공장은 보통 온라인 공정 제어를 통해서 목적한 생산물을 생산하기 위해 이용된 박테리아의 생물학적 활성을 최적화되도록 조절된다.

Claims (26)

  1. 검증된 마이크로어레이의 분리된 제조를 위한, 적어도 하기 장치들로 이루어진 시스템
    - 마이크로어레이를 통해서 분석될 목적 분자에 대한 정보를 입력하기 위해서 설계된 하나 또는 그 이상의 장치,
    - 분석될 목적 분자에 대한 정보를 기반으로 하여 상기 목적 분자와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 프로브 분자(테스트 프로브 분자)를 결정하도록 설계된 하나의 장치,
    - 하기 장치들을 포함하는, 하나의 배치-제공 장치,
    - 테스트 프로브 분자의 고밀도 인-시츄 합성용 장치,
    - 테스트 프로브 분자와 목적 분자를 접촉하기 위해 설계된 마이크로어레이 테스트 장치, 및
    - 목적 분자 및 테스트 프로브 분자의 접촉 동안에 수정된 시그날을 기록하기 위해서 설계된 마이크로어레이 판독 장치,
    - 프로브 분자의 엑스-시츄 합성용으로 설계된 하나의 프로브 분자 합성용 장치, 및
    - 기판에 프로브 분자들을 적용하기 위해서 설계된 하나의 마이크로어레이-제공 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 마이크로어레이를 통해서 분석될 목적 분자에 대한 정보의 입력용 장치가 정보를 하나 이상의 데이터 파일로 저장하는 컴퓨터를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 테스트 프로브 분자 결정 장치가 목적 분자에 대한 정보를 기반으로 하여 컴퓨터 프로그램 제어로 테스트 프로브 분자를 선별하는 컴퓨터를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 배치-제공 장치가 배치를 데이터 파일의 형태로 저장하는 컴퓨터를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브 분자 합성용 장치가 고상 합성용 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이-제공 장치가 스파팅 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이-제공 장치 및/또는 배치-제공 장치가 기판을 다양한 반응 영역으로 분획하기 위해서 개조된 양식 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치들은 데이터 전송 장치를 통해서 네크워크로 연결된 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 네트워크가 인터넷인 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 장치들이 연구 콘소시엄 내에 상호작용을 위한 플랫폼으로 연결되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제 1항 내지 제 10항에 따른 시스템을 사용해서 다음의 단계들을 포함한 검증된 마이크로어레이의 분리된 제조 방법:
    (a) 마이크로어레이를 통해서 분석될 목적 분자에 대한 정보를 입력 장치를 이용하여 제공하는 단계;
    (b) 상기 정보를 기반으로 하여 테스트 프로브 분자 결정 장치를 이용하여, 테스트 프로브 분자를 결정하는 단계;
    (c) 하기 단계를 포함하는, 배치 장치를 이용하여 마이크로어레이의 검증된 배치를 제공하는 단계;
    - 인-시츄 합성 장치를 이용하여, 상기 결정된 테스트 프로브 분자의 고밀도 인-시츄 합성 방법으로 적어도 하나의 테스트마이크로어레이를 제조하는 단계,
    - 마이크로어레이 테스트 장치에 의해 목적 분자를 사용하여 테스트 마이크로어레이를 테스트하는 단계, 및
    - 마이크로어레이 판독 장치에 의해 목적 분자를 사용하여 테스트 마이크로어레이를 테스트할 때 수정된 적어도 하나의 시그날을 기록하는 단계,
    (d) 프로브 분자 합성용 장치를 이용하여, 검증된 배치에 상응하는 프로브 분자를 엑스-시츄 합성하는 단계, 및
    (e) 마이크로어레이-제공 장치를 이용하여, 검증된 배치에 따라 검증된 프로브 분자를 기판에 적용하는 단계.
  12. 제 11항에 있어서, 단계 (a)의 정보 및/또는 단계 (c)의 검증된 배치가 전자 데이터 전송 장치의 도움으로 데이터 파일의 형태로 (각각의 경우) 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항 및 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 테스트 프로브 분자가 컴퓨터 프로그램의 도움으로 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 검증된 배치를 제공하는 단계가 하기 세부 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (1) 프로브 분자(예상되는 시그날)와 목적 분자의 상호작용 시에 마이크로어레이로부터 예상되는 적어도 하나의 시그날을 특징화하는 단계,
    (2) 결정된 테스트 프로브 분자를 고밀도 인-시츄 합성함으로써 테스트 마이크로어레이를 제조하는 단계,
    (3) 목적 분자를 사용하여 테스트 마이크로어레이를 테스트하고, 적어도 하나의 테스트 시그날을 기록하는 단계,
    (4) 적어도 하나의 예상되는 시그날과 적어도 하나의 테스트 시그날을 비교하는 단계,
    (5) 테스트 시그날이 예상되는 시그날과 실질적으로 상응할 때까지, 단계 (2) 내지 (4)를 반복하고 단계(2)에서 마이크로어레이 상의 테스트 프로브 분자, 양, 결합, 개수, 밀도, 방향 및/또는 이들의 배열을 수정함으로써 테스트 마이크로어레이를 개조시키는 단계, 및
    (6) 적어도 하나의 테스트 시그날이 적어도 하나의 예상되는 시그날과 실질적으로 상응하는 마이크로어레이 배치를 제공하는 단계.
  15. 제 14항에 있어서, 예상되는 시그날 및 테스트 시그날이 형광 시그날인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 결정된 테스트 프로브 분자는 목적 분자와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 분자들의 전체 군을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 분자 또는 검증된 프로브 분자 및/또는 목적 분자가 핵산, 펩타이드, 펩타이드 핵산, 폴리펩타이드, 올리고당류, 다당류 및/또는 저 분자량 유기 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 테스트 분자 또는 검증된 프로브 분자가 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 약 8 내지 약 80 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 단계 (b)에서 올리고뉴클레오타이드가 유기체의 전체 게놈, 유기체의 하나 또는 그 이상의 염색체의 유전물질, cDNA 라이브러리, 스플라이스 변이체, 프로모터 영역, SNPs, 돌연변이 또는 고반복 DNA 영역을 대표하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 11항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 분자가 하나 또는 다수의 형광 표지를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 11항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 및 각각 세부 단계 (2)에서 인-시츄 합성은 전기화학적인 방법 및 프로브 분자 빌딩 블록의 인-시츄 합성에 의해서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 11항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25mm x 75mm 당 약 1,000개 이상의 테스트 프로브 분자 종이 단계 (c) 및 각각 세부 단계 (2)에서 각각 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 약 25mm x 75mm 당 적어도 약 4,000개의 테스트 프로브 분자 종이 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 11항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 테스트 마이크로어레이가 단계 (c)의 기판 상에 생산되고/거나 검증된 프로브 분자가 단계 (e)의 다중 마이크로어레이에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조될 수 있는 검증된 마이크로어레이.
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