CN1501085A - 用于微阵列的经验证的设计 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备经实验验证的微阵列、特别是经实验验证的DNA微阵列的系统；其相应的制备方法；以及通过本发明的方法所获得的微阵列。本发明的系统以及方法的特征特别在于为该经验证的微阵列提供布局与制备最终产物本身之间是分离的。

Description

用于微阵列的经验证的设计
技术领域
本发明涉及用于制备经实验验证的微阵列、特别是经实验验证的DNA微阵列的系统；其相应的制备方法；以及通过本发明方法所获得之微阵列。本发明之系统以及方法的特征特别在于为该经验证的微阵列提供布局(layout)与制备最终产物本身之间是分离的。
背景技术
在生物技术中，术语“微阵列”是指在尽可能小的空间中，将大量的生物分子样品进行有秩序的排列。微阵列通常用于研究未知性质及/或数量的样品分子与非常大量的已知分子的相互作用，而这些已知分子可能与待研究的样品分子相互作用。根据Phimister(1999)Nature Genet.21增刊：1-60的命名，待研究的分子在以下是以“靶分子”表示，而将有序排列的已知分子称为“探针分子”。探针分子一般是排列在玻璃支持物上，但也可使用由塑料、尼龙或贵金属(例如金)所制成的支持物。
在微阵列中，包含探针分子的点通常直径是小于200微米，并且通常有数千个包含探针分子的点排列在这样的阵列中。
微阵列可用于大量的探针分子/靶分子对，且在特定的探针分子/靶分子的组合内，其具有非常广泛的应用。因此，例如有将各种肽排列为探针分子的微阵列，以用于研究与靶蛋白质之相互作用。此外，也可将蛋白质探针固定，以研究其与各种可能的配体的结合。反过来，也可将大量可能的有机化学、低分子量之配体排列在阵列中，并且测试特定的靶蛋白质(例如要被抑制的酶)结合至可能的配体。其它的微阵列系统也类似地使用包含糖分子的相应系统。
然而，最常见的阵列系统涉及研究核酸或其类似物(例如肽核酸(peptide nucleic acid))之间的相互作用。在这种类型中，一般而言，包括例如小于100个核苷酸的相对短的寡核苷酸被排列在阵列中，而未知的靶核酸或未知量的靶核酸是根据已知的碱基对规则而就有关的杂交作用进行测试。
可能的应用范围，特别是DNA微阵列技术的应用范围，是从基因之检测、经由诊断疾病之基因型分型(例如有关单一核苷酸多态性(SNP)之研究)、药物检测(药物基因组学)延伸至毒理学领域之研究(毒理基因组学)(也请参照WO 01/31333中有关于此的评论)。
制造适合于特定问题的微阵列，除了原则上的微阵列系统设计之外，还需要包括探针的选择、在支持物(基质或通称的“芯片”)上制备初始阵列、提供靶分子、进行测试、资料的记录及处理(特别是在所有这些步骤已进行之后)、微阵列系统的验证(也就是后续查验最初制备的探针分子之排列是否可在样品材料中以适当的特异性结合靶分子，以便例如可实际上鉴定可能的活性物质的功能)。
每个所提供的微阵列系统都需要这种验证，因为在任何特定的微阵列之制备期间，首先在合成及/或同时施加探针分子的期间，通常会发生错误，其次特别在DNA微阵列的例子中，计算机控制的计算机学(insilico)方法无法选择最佳的寡核苷酸，特别是也无法选择最佳的基因位置，位于每个点中的探针分子之长度及数量都必须适应特定的应用，才能得到最佳的信号。
一些制备微阵列的系统以及方法在现有技术中是已知的。一般而言，可采用两种不同的方法。在第一种方法中，探针分子是在特定基质上原位(in situ)合成(例如借助于适当的光刻掩模曝光方法(photolithographic mask exposure process))。在第二种方法中，先将探针分子通过适当的合成方法(例如常用的固相合成)而离位(exsitu)制备，然后再施加到特定的基质(例如通过“点上”或“印刷”)。
借助于离位合成以及后续点上来制备经验证的(也就是尽可能无错误的)微阵列要花费非常长的时间，正常要数周，通常是在远长于5周的范围，例如多达5个月，这是因为最初设计的微阵列必须在验证期间的许多评估周期中适应特定的问题。在每个评估周期中，制备许多不同探针分子的种类(“特征(feature)”)并点在每个适应的阵列排列上，因此从最初的阵列到经验证的阵列需要花费大量的时间。有鉴于目前大约600个基因组的测序是在其最后阶段，以及基因信息的量将持续大幅增加，因此，借助于微阵列研究基因功能的实质上更快速的方法变得愈来愈必要。此外，应用也随着知识渐增而变得更具特异性，且微阵列开发的时间压力也增加了。太长的期间是特别不利的，特别是对于需要快速适应的活性物质之研究而言。特别是在诊断中，常常期望对可能的活性物质或活性物质的组合做出快速的、患者特异性的评估。反过来，当涉及应用许多不同的特征时，用于制备微阵列之原位方法及包含适合组件的适当系统，通常是较好的。然而，原位方法的不利在于它们需要非常复杂的仪器，并且是比上述的方法(离位合成/点上)更昂贵，特别是在大量制造经验证的微阵列的情况下。
发明内容
本发明提供了用于以分离的方式制备经验证的微阵列的系统，其至少具有：
·一或多个装置，其被设计为用于输入拟通过微阵列进行分析的靶分子的信息；
·一装置，其被设计为用于根据待分析的靶分子的信息来测定可能与靶分子相互作用的探针分子(测试的探针分子)；
·一提供布局的装置，其包括：
·一以高密度原位合成测试的探针分子之组件；
·一微阵列测试组件，其被设计为用于使靶分子与测试的探针分子接触；以及
·一微阵列读出组件，其被设计为用于记录在靶分子与测试的探针分子接触期间发生改变的信号；
·一用于合成探针分子的装置，其被设计为用于探针分子的离位合成；以及
·一提供微阵列的装置，其被设计为用于将探针分子施加到基质。
本发明进一步涉及一种以分离方式制备经验证的微阵列布局的方法，特别是利用上述定义之系统，其包括下列步骤：
(a)提供拟通过微阵列进行分析的靶分子的信息，优选地是通过上述输入装置而提供；
(b)在该信息的基础上测定测试的探针分子(也就是可能与靶分子相互作用的探针分子)，例如通过本发明的装置而测定测试的探针分子；
(c)提供用于微阵列的经验证的布局，特别是通过上述定义的布局装置，其包括：
·通过以高密度原位合成经测定的测试探针分子，而制备至少一测试的微阵列，优选地是通过上述用于原位合成之组件；
·利用靶分子而测试该测试的微阵列，优选地是通过上述的微阵列测试组件；以及
·当利用靶分子测试该测试的微阵列时，记录至少一发生改变的信号，特别是通过上述的微阵列读出组件；
(d)离位合成相应于经验证的布局的探针分子(经验证的探针分子)，特别是通过上述用于合成探针分子的装置；以及
(e)将依据经验证的布局的经验证的探针分子施加到基质，优选地是通过本发明提供微阵列的装置。
附图说明
图1显示先前熟知用于制备DNA微阵列的例子之经验证的微阵列之方法。熟知方法的第一部分涉及DNA微阵列的初步制备及设计。为此目的，首先选择密码子。然后利用已知的算法以计算机进行寡核苷酸的设计，用以将所需的寡核苷酸数目减少到最小的所需数目。其它的参数涉及将每个芯片的点数目优化。这些优化作用基本上可用于降低在后续寡核苷酸合成期间所产生的成本。寡核苷酸通常是由使用者通过固相合成法而外部地合成，其通常包括纯化步骤。与此相关连的，合成假设具有约10％的错误率，使得适当的品质检查或适当的品质管制是必要的。这会产生另外高的成本，以及单独这个寡核苷酸合成就要持续1至2周(例如对于1,000至2,000个寡核苷酸而言)。以此方式外部合成的寡核苷酸必须施加(点)到适合的支持物，特别是玻璃。点上特别包括以下步骤：制备点上的溶液、根据微阵列而格式化成具有96、384等槽孔的微滴定盘、以及实际上将溶液点上。此处也是一样，产生相应的品质管制问题，因为个别步骤是相当容易错误的，这是由于要制备多种的溶液等所致。此外，对于普通的微阵列，这个点的步骤也需要约1周。以此方式制备的微阵列接着必须通过杂交、分析及评估之步骤而验证。由于通过算法选择已包含错误的寡核苷酸，因此要重复从先以计算机选择寡核苷酸到微阵列的设计(布局)以符合要求的整个方法，而这要花数周到数月的时间。
图2相对地显示本发明方法之步骤，其中首先选择密码子(在有关使用者提供的靶核酸信息之基础上选择)，所选择的探针寡核苷酸之后续原位MAS合成是在玻璃支持物(玻璃载片)上进行。这个合成方法是非常快速的(约3小时/载片)，并且也可在非常庞大的微阵列的例子中进行(数个100,000个寡核苷酸/载片)。这表示可能经测定的及施加的探针寡核苷酸也可代表生物体的完整遗传信息。之后，将一开始提供的微阵列在杂交、分析及评估的次级步骤中验证，视情况再次进行具有例如适应寡核苷酸长度及序列之修饰的合成。探针寡核苷酸是根据由使用者提供的信息，特别是由所要微阵列(芯片)的制造者提供的信息，优选地是经由国际互联网提供，以关于所需的微阵列布局(芯片设计)之特异性及设计而选择。接着利用熟知的固相合成法，根据经验证的布局而合成经鉴定的寡核苷酸，并且根据经验证的布局，利用点上或印刷方法，在微阵列制造者处施加经验证的探针分子。这个方法的实质优点一方面是节省大量的时间，从传统用于制造布局的方法所需之约5至10周的时间(取决于可获得的信息之程度)减少到1天至1周(从提供有关待研究之靶分子的信息，到经验证的微阵列布局)，除此之外，本发明之方法更可通过使用熟知特别适合于大量制造的方法以制备经验证的微阵列，而节省大量的成本。
具体实施方式
本发明提供了用于以分离的方式制备经验证的微阵列的系统，其至少具有：
·一或多个装置，其被设计为用于输入拟通过微阵列进行分析的靶分子的信息；
·一装置，其被设计为用于根据待分析的靶分子的信息来测定可能与靶分子相互作用的探针分子(测试的探针分子)；
·一提供布局的装置，其包括：
·一以高密度原位合成测试的探针分子之组件；
·一微阵列测试组件，其被设计为用于使靶分子与测试的探针分子接触；以及
·一微阵列读出组件，其被设计为用于记录在靶分子与测试的探针分子接触期间发生改变的信号；
·一用于合成探针分子的装置，其被设计为用于探针分子的离位合成；以及
·一提供微阵列的装置，其被设计为用于将探针分子施加到基质。
本发明之系统优选地并入以计算机为基础之技术。根据这个优选的实施方式，例如每个用于输入拟通过微阵列进行分析的靶分子信息的装置，优选地都包括一个(或多个)计算机，其将信息储存在一个或多个资料夹中。类似地，用于测定测试的探针分子的装置，也优选地包括一计算机，根据靶分子的信息，其以程序控制的方式选择测试的探针分子。此外，上述提供布局的装置也优选地包括一计算机(或视情况数个计算机)，其将布局以一个或多个资料夹的形式而储存。因此，例如提供布局的装置可产生一个(或多个)资料夹(以适当的形式)，其包含有关要通过上述用于探针分子合成的装置而制备的探针分子的信息，同时产生另一个(或数个其它的)数据夹，其包含在微阵列上有关施加方式、密度、数目、方向性、排列等的信息(用于提供微阵列的装置)。可根据本发明及适当控制程序而使用的计算机，是本领域人员已知的。
本发明提供布局的装置可用于确定要制备的经验证的微阵列之排列。根据本发明，术语微阵列的“布局”涉及微阵列上的探针分子的设计，也就是微阵列的特征性参数，例如微阵列上的探针分子的类型、性质(特别是寡核苷酸、肽等的序列)、数量、密度、结合(例如何种连接子用于将探针分子结合于微阵列所使用的支持物上)、方向性(例如核酸的5’到3’或相反，在肽、多肽或蛋白质等的例子中之氨基端到羧基端或相反)以及排列。
提供布局的装置包括用于以高密度原位合成之测试的探针分子的组件。这些组件的特征在于直接在选用于微阵列的基质上(也就是原位)，在通常对于例如约1,200平方毫米至约3,000平方毫米的微阵列区域上，优选地具有例如约20毫米×60毫米至约38毫米×75毫米的尺寸之微阵列排列，优选地约25毫米×75毫米的区域上，合成大量不同(测试的)探针分子种类，例如大于1,000个，优选地至少4,000个不同的(测试的)探针分子种类。
与此相关的，每个例子中的“(测试的)探针分子种类”是指特定结构的探针分子，例如特定核苷酸序列的核酸或特别是DNA，或具有特定氨基酸序列的(多或寡)肽。(测试的)探针分子种类一般也称为“特征”。
适合的原位合成组件是本领域人员已知的，并且通常是光刻法制造的曝光组件，或可通过湿式化学印刷或电化学操作的组件。
特别地，经验证的DNA微阵列是通过原位合成的组件，经由湿式化学印刷而制备，其可根据本发明而使用，并且可得自例如Clondiag芯片技术公司(耶拿，德国)。根据本发明，例如用于DNA原位合成的光刻组件是优选的，并且可购自例如NimbleGen系统公司(麦迪逊，威斯康辛，美国)、Affymetrix公司(圣克拉，加州，美国)、Xeotron公司(休市顿，德州，美国)、Combinature生物医药公司(柏林、德国)以及Febit公司(曼海姆，德国)。由于以低成本及短时间原位合成特别大量或特别高密度(测试的)探针分子是可能的，因此特别优选者为用于MAS(无掩模阵列系统(maskless array system))合成(测试的)探针分子之组件。利用这个组件，可在一个阵列中例行性地合成超过400,000个(DNA)特征，在特定的排列中，例如可合成750,000个(DNA)特征。MAS技术是说明于例如WO 99/42813，其完整的揭露内容在此以引用方式纳入本发明中。其它适合于MAS合成的组件以及这个技术的特定形式是说明于WO 01/34847及WO 02/04597，其揭露内容在此也以引用方式纳入本发明中。其它用于原位合成的优选的组件是可通过电化学以及利用原位点上而操作的组件。
包含在提供布局的装置中的其它组件，例如微阵列测试组件及微阵列读出组件，也同样是在本领域中所熟知的，并且在市面上可以购得。也提供完整的整合组件之相关制造厂商的实例是Agilent(美国)、Genomic Solutions(美国)、Affymetrix(美国)、Axon仪器公司(美国)以及Packard生物科学(美国)。
用于离位合成探针分子的装置，其为本发明系统的一部分，可供合成用于要被提供为最终产物的微阵列之探针分子，并且优选地是在本领域中已知用于固相合成的组件。用于离位固相合成探针分子(例如寡核苷酸)的组件，特别是用于梅里菲尔德(Merrifield)合成类型的固相合成(H.G.Gassen等人(1982)，基因片段的化学及酶合成，化学出版社，Weinheim；Gait(1987)，寡核苷酸合成：实用方法，IRL出版社，牛津)或不同类型的固相合成(Beyer及Walter(1984)，有机化学理论，第816页，20版，S.Hirzel出版社，斯图加特)是熟知的，并且可由例如Dharmacon研究公司(美国)及Synthegen(美国)而提供。探针分子的固相合成，特别是在寡核苷酸的例子中，通常是以服务的形式而提供，例如尤其是通过Proligo(美国)、Sigma(德国)、MWG生物科技公司(德国)所提供之服务。用于固相合成的这些组件，有利地使其可在相当短的期间内，以低成本及优良的产率，提供大量特定的探针分子或特定的探针分子种类(特征)，例如特测序列的寡核苷酸等。
本发明系统之提供微阵列的装置，是用于将离位合成的探针分子施加到适合的基质上，以便以此方式完成微阵列。本发明可使用之用于施加离位合成的探针分子之组件，同样是在本领域中人员所熟知的，并可购自例如Biorobotics(美国)、Genemachines(美国)、Perkin Elmer生命科学(美国)、MWG生物科技公司(德国)或GeneScan欧洲公司(德国)。本发明优选的用于施加离位合成的探针分子之组件是适合的点上或印刷组件。
本发明系统之上述零件优选地是计算机控制的，并且因此是半自动或全自动操作的。零件(特别是适合的提供布局的装置、用于探针分子合成的装置以及提供微阵列的装置)通常配备有在本领域中熟知并可一般购得的微流体及微机械零件。
因此，用于本发明系统的装置的发明上优选的排列，是进一步配备可实质简化资料输入及数据处理的计算机。在系统中，用于必须交换资料的零件(例如在输入装置及提供布局的装置间、在提供布局的装置及用于探针分子合成的装置及提供微阵列的装置间)，优选地是经由资料传送组件而连结成一网络。例如网络可以是局域网络，其中例如仅有部分计算机与彼此通连。有利地，网络是国际互联网。关于“全球信息网”之主要排列及信息运算法(communication algorithm)，可参考例如WO 01/31333对此事件的评论。网络也可以是任何其它经由资料传送装置而通连的计算机之区域性、国内性或国际性的连结。
从经由例如国际互联网而将本发明装置结合成网络的观点而言，本发明其它优选的排列是装置可在研究联盟或研究伙伴中提供用于互动(通连、互相资料交换等等)之平台的系统。在联合计划工作的这些研究伙伴中，特别也是在不同位置的研究伙伴，于利用经实验验证的微阵列之后，由于渐增的知识，因此可能对于微阵列的组成(也就是布局)有需要重新设计之新的需求。在经验证的微阵列之非定域设计(布局决定)及局部生产的协助下，可以此方式大幅提升此知识所增加的效率。一个有效率利用这样的平台系统之实施方式的例子，是以网络为基础(特别是国际互联网为基础)的实验室信息管理系统(LIMS)，其中每个参与者(例如研究联盟或研究伙伴之成员)都可分享微阵列布局、重新设计的布局及微阵列之管理。这样的LIMS的一个例子是Clondiag做的“Partisan”。
本发明进一步涉及一种以分离方式制备经验证的微阵列布局的方法，特别是利用上述定义之系统，其包括下列步骤：
(a)提供拟通过微阵列进行分析的靶分子的信息，优选地是通过上述输入装置而提供；
(b)在该信息的基础上测定测试的探针分子(也就是可能与靶分子相互作用的探针分子)，例如通过本发明的装置而测定测试的探针分子；
(c)提供用于微阵列的经验证的布局，特别是通过上述定义的布局装置，其包括：
·通过以高密度原位合成经测定的测试探针分子，而制备至少一测试的微阵列，优选地是通过上述用于原位合成之组件；
·利用靶分子而测试该测试的微阵列，优选地是通过上述的微阵列测试组件；以及
·当利用靶分子测试该测试的微阵列时，记录至少一发生改变的信号，特别是通过上述的微阵列读出组件；
(d)离位合成相应于经验证的布局的探针分子(经验证的探针分子)，特别是通过上述用于合成探针分子的装置；以及
(e)将依据经验证的布局的经验证的探针分子施加到基质，优选地是通过本发明提供微阵列的装置。
本发明之系统以及方法是根据以下的发现：即制备一或多个测试的微阵列之方法(该方法是必要的以提供经验证的微阵列布局)，是经由原位方法，通过适合的组件而进行，而实际的(经验证的)微阵列则是由探针分子(对应于经验证的布局)之离位合成，优选地是固相合成而制备，然后再次通过适当的系统零件之协助而施加(点)到适合的基质。因此，在本发明的系统及方法中，验证过程与最终产物(经验证的微阵列)的制备是分离的。本发明的组合将上述两种方法原理以最佳可能的方式连结在一起，使得每个方法原理都可被使用，其特别具体的优点显示：高密度的原位合成具有很大的可变性，因此适合于制备测试的微阵列，后者起始于大量的可能与靶分子相互作用之(测试的)探针分子。如果可获得微阵列的经验证的布局，则后者可通过快速及有成本效益的离位合成探针分子，并后续施加到基质而制备，在每个例子中都是根据经验证的布局。由于验证方法已将探针分子的数目限制到相当低的水平，因此在离位合成中仅需制备相对少数不同的探针分子种类以用于最终产物，结果相对于先前熟知的方法，制备经验证的微阵列之成本可在本发明方法之协助下明显地减少。离位合成探针分子以用于最终产物，是特别适合于工业规模的微阵列制造，因此在需要大量经验证的微阵列时，本发明方法之优点是特别明显的。因此在本发明的制备方法中，上述方法协同地作用，使其可快速地、有成本效益地并具有低错误率地提供经验证的微阵列。
根据本发明，优选地以下列方式进行该方法：例如步骤(a)是与一或多个微阵列使用者一起进行，步骤(b)及(c)是例如与布局提供者而空间上分离地进行，步骤(d)是例如与探针分子制造者一起进行，以及步骤(e)是例如与微阵列制造者一起进行。当然，在每个例子中，也可空间上彼此分离地进行步骤(b)及(c)。因此，例如微阵列使用者也可测定测试的探针分子，并且以此方式预先测定用于布局提供者之测试的探针分子。
特别对于上述空间分离的方法步骤，根据本发明优选地通过传送电子资料而执行必要的信息流动。因此，在步骤(a)中的信息优选地是通过电子资料传送装置的协助，以资料夹的形式而提供。类似地，在步骤(c)中经验证的布局优选地是通过电子资料传送装置的协助，以资料夹的形式而提供。因此，例如使用者将有关靶分子的信息以电子形式输入到本发明的输入装置，然后将该信息传送到用于测定测试的探针分子的装置，其在例如布局提供者处排列。后者在产生微阵列之经验证的布局之后，接着将有关(经验证的)探针分子的信息，视情况将包括上述特征为经验证的微阵列的其它资料之完整布局，以资料夹的形式传送到用于探针分子合成的装置(优选地在探针分子制造者处排列)。此外，提供微阵列的装置之经验证的布局数据(其在例如适当的微阵列制造者处排列)，优选地是以一个或多个资料夹的形式而提供。
为了这个目的，包含在本发明系统中的零件彼此是经由计算机网络而有利地连结，特别是经由国际互联网，已如上述。在提供装置(步骤(a))、测定装置(步骤(b))、提供布局的装置(步骤(c))、用于探针分子合成的装置(步骤(d))以及提供微阵列的装置(步骤(e))之间可能的通连方式，特别是经由国际互联网，优选地系利用适合的系统软件，是在本领域中所熟知的，并且说明于例如WO01/31333，其完整的揭露内容在此以引用方式纳入本发明中。
在本发明方法的步骤(a)中，系统一开始通过微阵列(其布局是要被提供)，而提供待分析的靶分子的信息，也就是它们有特征的性质。这个信息包括例如靶分子的种类及性质，例如要分析的靶分子是否是核酸、肽(包括寡肽、多肽及蛋白质)、肽核酸、低分子量的有机物质、糖类(例如寡糖及多糖)等等(也可用于上述出现的分子种类之混合物)。此外，这个信息也包括有关靶分子及/或视情况用于微阵列的支持物或基质物质之表面结构、体积的信息(例如包括有关空间性质的信息)、有关靶分子的粘着或结合性质，包括与可能使用的探针分子及/或与计划的支持物质发生可能非特异性相互作用的性质，这些结合参数特别包括有关结合性质的动力学之信息，例如结合常数、合作参数等，并且也考虑到可能存在的结构弹性。其它的信息涉及微阵列所要进行的实验期间所存在的反应条件，例如温度、缓冲条件(pH、盐含量、清洁剂、辅助物质等)。在藉此可产生的问题之基础上，这个信息会通到要施加到可与靶分子相互作用的微阵列之探针分子。然而，这些最初测定的探针分子必须检查它们对于在验证方法中通过适应微阵列排列而制备的微阵列之实际上的适合性。因此，这些一开始测定的探针分子是根据本发明而标记成“测试的探针分子”。
如以上之讨论，有关靶分子的信息，特别待提供的布局所根据之解析问题，及/或经验证的布局，是在电子资料传送装置的协助下，以资料夹的形式而提供。例如这样的资料传送装置是由两个计算机所组成，其彼此通过例如电子邮件而通连。在这个例子中，使用者通常将有关靶分子的所需资料，从非中心排列的计算机传送至中心计算机，优选地是通过电子资料传送，例如通过电子邮件。当然，信息也可在任何其它可能的载体上而提供，例如软式磁盘、光盘只读存储器等等。然后可将特定的数据组与例如已制造的微阵列或微阵列布局之数据组(例如从先前进行的研究中之微阵列或微阵列布局，其可使用作为“训练组”以用于进一步的优化)加以比较，以便以此方式测定“预先优化的”微阵列布局。资料组是通过先将它们优选地转换成相同的格式，然后经由根据这些格式化资料所制作的模板及/或在神经元网络(neuronal network)的协助下，将它们与先前获得的资料组进行比较而优化，以及视情况因此而使之适应。
本发明之方法并不限于测试的探针分子或经验证的探针分子或靶分子之类型。因此，这些分子可例如是核酸、肽(包括寡肽、多肽及蛋白质，特别是抗体或其片段)、肽核酸、低分子量的有机物质、糖类(例如寡糖及多糖)等等，以及也可出现的上述分子种类之混合物。
本发明之制备方法是非常适合对用于研究作为靶分子的核酸的微阵列进行验证。因此，本发明之方法是通过下述以这个变化为基础的实施例而说明。然而，对于熟悉本领域人员明显的是，本发明方法所根据之整体概念，也可自由地转成任何其它可能的微阵列问题，特别是其它结构上不同的探针及靶分子。
在步骤(a)中要提供的DNA微阵列的例子中，有关靶分子的信息，因此通常是微阵列测试所根据的基因组问题。这包括例如待分析的靶分子(即DNA)来源的生物体之信息。然而，待分析的DNA靶分子的信息也可以是更详细的信息，其特征在于要分析的DNA分子之族群更为准确。特别地，这个信息通常是靶核酸的序列，其优选地是以资料夹的形式而提供，适合的格式是在本领域中人员所熟知的。一般熟知的序列之标准资料格式的例子是FASTA格式。此外，信息也可关于特定的细胞类型，例如细胞一般而言是否为癌细胞，或是任何其它疾病状态中的细胞，或例如是否特定的细胞株要被研究等等。其它的信息通常是有关对于生物体(例如特定细胞、器官、器官部分等)的影响、事件或治疗，然后是要进行的微阵列测试，其包括，例如将生物体或其部分暴露至特定物质，例如药物、毒理学相关的物质等等。
在有关基本问题的信息(也就是待分析的靶分子的信息)已优选地通过资料传送装置而提供到例如中心位置(例如安排在布局提供者处的中心计算机)之后，可能与靶分子相互作用之测试的探针分子是在本发明方法的步骤(b)中被测定。根据优选的实施方式，这是通过本领域人员所熟知的计算机程序而进行，例如Arraydesigner 2(Primer国际生物软件)以及许多的其它程序。因此，在本发明制备方法之优选的实例中，系提供要使用作为测试的探针分子之核酸序列，特别是寡核苷酸，例如约4至约80个、优选地是约8至约80个核苷酸之长度，这些序列已在步骤(b)中的(基因组)问题之基础上被测定。
根据特别优选的实施方式，在步骤(b)中借助于例如特定计算机软件而测定的测试的探针分子，代表完整族群的分子，其可能与要借助于被提供布局的微阵列而研究的靶分子发生相互作用。当使用寡核苷酸作为原位合成中的探针分子时，特别是利用MAS技术时，这个完整族群可以是例如生物体的全部基因组。生物体的例子是人类、动物(例如老鼠、大鼠、山羊、猪、牛、天竺鼠、斑马鱼(Danio rerio)及线虫(C.elegans))、植物(例如实用植物、阿拉伯芥(Arabidopsis)等)、原生动物、细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、真菌(例如酵母菌，例如啤酒酵母(S.cerevisae))，但根据本发明也可包括病毒、类病毒等等。然而，探针分子(特别是寡核苷酸)也可代表较大完整族群的一部分。在寡核苷酸的例子中，适合此处的(部分)完整族群是生物体(例如上述的生物体)的一个或多个染色体之遗传物质。此外，(部分)完整族群也可以是个体的互补DNA(cDNA)数据库。此外，测试的探针分子也可以是剪接变体(例如初级转录物或特定基因族群或亚群的初级转录物之所有剪接变体)、启动子区域、SNPs(例如特定基因或基因族群或亚群的所有(目前)已知的SNPs)、突变体(如SNPs之说明)、高度重复性的DNA区域等等。
根据本发明，提供经验证的布局优选地包括下列次级步骤：
(1)在靶分子与探针分子相互作用的例子中(预期信号)，从微阵列中指定至少一种预期的信号；
(2)通过以高密度原位合成经测定的测试探针分子，而制备测试的微阵列，优选地是通过上述定义用于原位合成的组件来制备；
(3)利用靶分子而测试该测试的微阵列，特别是通过本发明之微阵列测试组件，以及记录至少一测试的信号，优选地是利用上述定义的微阵列读出组件；
(4)将至少一测试的信号与至少一预期的信号比较；
(5)通过重复步骤(2)至(4)而适应测试的微阵列，直到测试的信号基本上与预期的信号一致为止，修饰步骤(2)中在微阵列上的探针分子、数量、结合、数目、密度、方向性及/或其排列；以及
(6)提供微阵列布局，其中至少一测试的信号基本上与至少一预期的信号一致。
在本发明方法的优选的实施方式之次级步骤(1)中，在靶分子与探针分子相互作用的例子中，一或多个预期的信号被预先测定哪一个将从微阵列中被预期得到。这样的信号可以是任何实验上可测量的、化学的或物理的参数，其可在靶分子与探针分子接触的测试中(利用上述定义的微阵列测试组件)，通过适合的微阵列读出组件(例如测量组件)之协助下，由适合的微阵列读出。在本发明的方法中，靶分子(例如核酸)优选地是以一或多个适合的荧光基团(例如异硫氰基荧光素(FITC)、德州红、花菁(例如Cy3、Cy5等))而荧光标记。因此在这个例子中，被预期的信号是一荧光信号，其利用适合于微阵列的荧光计、具有连接电荷耦合组件(CCD)照相机的适当设计的共焦荧光显微镜、或其它适合于微阵列荧光检测的测量组件而测定。其它用于微阵列技术之预期的信号及测试的信号，例如该微阵列技术是例如在支持材料中及/或经由适合的标记(例如氧化还原反应标记)，而测量由探针分子与靶分子间之相互作用所引起的电子信号(特别是电流的改变)，当然也同样可用于本发明之方法。
此外，经测定的测试探针分子(优选地是寡核苷酸)之微阵列，是根据次级步骤(2)(或本发明上述制备方法的步骤(c))，在适合的支持物上(优选地是例如通过硅烷化作用而官能化的玻璃)，以高密度原位合成。这个测试的探针分子之原位合成可以本领域中人员所熟知的不同方式而进行，例如通过以上所列举的提供者之方法，结合本发明用于原位合成的组件。特别优选地在MAS技术的协助下进行原位合成，并且与此相关的，请再次参考WO 99/42813、WO 01/31847及WO02/04597所说明之实施方式。
根据本发明之优选的实施方式，测试的探针分子以高密度之原位合成，是指超过1,000个，优选地是至少4,000个不同的(测试的)探针分子种类，直接在用于微阵列所选择的基质上，在例如约1,200平方毫米至约3,000平方毫米的面积上合成。与此相关的，优选的微阵列尺寸范围从约20毫米×60毫米至约38毫米×75毫米，并且特别是约25毫米×75毫米。MAS方法可提供例如超过750,000个探针分子种类(特征)的探针分子之原位合成。
根据本发明方法的优选的实施方式之次级步骤(3)，以此方式制备的测试微阵列之测试，是利用靶分子而进行，并且记录至少一测试信号。上述有关预期信号的评论，也可应用在要记录的测试信号，特别是荧光信号。
在本发明方法的优选的实施方式之次级步骤(4)，记录的测试信号及/或记录的多数测试信号，是与预先测定的预期信号(以及分别与多数的预期信号)相比较。这个比较通常是利用计算机而进行，其中预期及测量的信号是在已知程序的协助下而读入。
由于测试的探针分子之选择、探针分子在支持物上的原位合成以及其它带有不确定性的方法步骤，因此在次级步骤(3)中一开始所得到的信号与预期的信号并不一致。请注意，特别是在核酸(例如寡核苷酸)作为探针分子的例子中，原位合成并无法达到100％的产率，因此在特定点中的部分寡核苷酸并不具有预期的或测定的长度或是具有其它序列，这是因为其它的核苷酸已在原位合成期间并入而取代正确的核苷酸所致。此外，每个点所施加的探针分子的量，通常并非最佳地适应于特定的应用，如果真有的话。
一种进行次级步骤(3)的测试方法之实例是对施加的探针分子(特别是DNA)进行标记，并且特别地提供它们一或多个荧光标记，以便之后提供阵列的荧光图记录。为此目的，不需要标记每个施加的探针分子(例如每个寡核苷酸)，但根据本发明，例如仅标记每100个、500个或1,000个中的一个探针分子是足够的。在寡核苷酸的例子中，例如在寡核苷酸根据次级步骤(2)开始合成时，可利用1,000∶1之未标记及例如荧光素标记的核苷酸之混合物，而仅标记每1,000个中的一个寡核苷酸。仅标记一些探针分子具有的优点在于标记并不会引起任何大量的成本。此外，可因此避免可能的荧光中止效果(例如荧光共振能量转移(FRET))或可能变少。理想上，施加到微阵列中的核苷酸之荧光标记，是以测量的荧光约相当于当施加的探针分子与标记的靶分子杂交时所产生的荧光水平而调整。
根据另一优选的实施方式，次级步骤(3)的测试是根据本发明以寡核苷酸作为探针分子而进行，如以下之说明。这个测试基本上可供检查已施加到阵列中经测定的测试探针分子是否的确可与靶分子杂交。
为此目的，将施加到阵列中的寡核苷酸在第一步骤中区分为约1,000组(例如3×384个槽孔/微滴定盘)。在第二步骤中，将包括10至15个核苷酸的序列粘接到组合的寡核苷酸之3’端。这个延伸是用于杂交互补的核苷酸序列(同样包括10至15个核苷酸)。然后将互补的碱基序列(第二链)利用Taq聚合酶而延伸。之后进行变性步骤，以将模板链及第二链分离。将杂交、延伸及变性的步骤如PCR般的重复，以产生超过模板链之标记的第二链。最后，将以此方式产生的第二链以荧光基团(终端地)标记，并且以微阵列杂交。
当测量荧光信号时，这个方法可鉴定何种寡核苷酸仅是没有效率地杂交或根本没有杂交。这些接着可视情况修饰，并且再次测试。在这个方法的另一实施方式中，第一链可经由生物素而结合至抗生物素蛋白链菌素覆盖的微滴定盘，以促进第二链的纯化以及模板的重复利用。同样也可合成包括10至15个核苷酸的互补序列，已在其5’端提供荧光基团，藉此排除合成第二链之后的标记。此外，当使用微阵列时，也可使用第四荧光基团于这个控制物质，并可将其一起与实际上例如Cy3-及Cy5-标记的靶分子杂交。这可确保与微阵列的探针分子之杂交对每个产物单元仍可保持相同。
根据本发明，微阵列是通过重复次级步骤(2)至(4)，而对应地适应到测试的信号与预期的信号间之比较，直到测试的信号或多数测试的信号基本上与预期的信号一致为止。与此相关的，微阵列布局的参数是在每个例子的次级步骤(2)中，根据次级步骤(3)中的测试结果以及每个例子前一轮次级步骤(4)的比较结果而修饰，也就是测试的探针分子，例如在核酸的例子中(例如寡核苷酸)，其序列、长度、标记、类型(例如使用核苷酸类似物取代天然存在的核苷酸)、数量、数目、密度、在基质上的结合、方向性及/或在微阵列上的排列是被修饰的。其它可被修饰的参数也可能与在核酸作为探针及靶分子的例子中之反应条件有关，特别是杂交条件，例如温度、pH、离子强度、特别是溶液及缓冲液的组成份间之关连性(例如盐含量、清洁剂含量等)。制备测试的微阵列(视情况连同修饰的参数)  (次级步骤(2))、利用靶分子测试微阵列(次级步骤(3))以及比较测试的信号与预期的信号(次级步骤(4))等步骤，是连同适合的微阵列之适应性而重复，直到测试的信号基本上与预期的信号一致为止。
当验证(测试的)微阵列时，优选地将测试的微阵列之测试及读出期间所获得的资料，传送到已将有关靶分子的信息输入至系统的使用者，优选地使用本发明之输入装置，在每一轮传送或是在数轮适应之后传送。在这些资料的基础上，使用者接着可依次干预验证的方法，并可用于其它验证的方法，以及在特定时间、有关特定靶分子及/或有关测试中的探针分子，及/或有关在相互作用期间要维持的反应条件之其它发现(特有的实验资料、文献资料等)，这些发现可能已同时获得。在这个例子中，优选地再次利用经由上述的装置、网络等的电子资料传送。利用本发明方法的这个优选的变异，提供一种环状的方法，其以特别有效率的方式，通过扩大有关特定阶段存在的探针分子、靶分子以及在测试中要选择的条件之信息库，而提供最佳的布局，并且因此是无错误的特制微阵列。
本发明方法的优选的实施方式之最后次级步骤(6)，提供以此方式所验证的微阵列的布局，其中测试的信号或多数测试的信号基本上是与预期的信号一致。其也可以资料夹的形式，在电子资料传送装置的协助下，根据关于本发明方法的步骤(a)在此可类似应用的先前评论，将这个布局提供给微阵列使用者、提供给用于探针分子合成的装置(优选地是安排在探针分子制造者处)、及/或提供给提供微阵列的装置(优选地是安排在微阵列制造者处)。因此，例如有关经测定的微阵列布局之信息，是储存在一个或多个资料夹中，并且优选地是通过电子邮件，经由中心计算机，而传送至在探针分子制造者(特别是寡核苷酸制造者)处及在微阵列或生物芯片制造者处之非中心排列的计算机。
探针分子是根据前步骤所提供的布局而离位合成，优选地是通过现有技术中所说明的固相合成方法，特别(如上所述结合本发明之系统)是以梅里菲尔德(Merrifield)合成的方式(H.G.Gassen等人(1982)，上述文献；Gait(1987)，上述文献)或不同的方式(Beyer及Walter(1984)，上述文献)而合成。用于寡核苷酸合成的优选的方法是根据氨基磷酸盐方法，并且通常使用(优选地是氨烷基修饰的，特别是丙氨基修饰的)多孔性玻璃支持物(CPG，控制孔的玻璃)。这些方法的优点在于可在相当短的时间内，以低成本及优良的产率提供大量指定(经验证的)的探针分子或指定(经验证的)的探针分子种类(特征)，例如指测序列的寡核苷酸，优选地是从约8至约80个核苷酸的长度等。
根据本发明的最终产物(经验证的微阵列)是根据本发明方法的步骤(c)所决定的布局，通过将离位合成的探针分子施加到适合的基质而再次提供。可用于本发明之施加离位合成的探针分子之方法是在本领域中所熟知的，并且包括例如适合的点上之方法(例如也称为“印刷方法”或“喷墨方法”)。
因此，当使用DNA微阵列时，上述步骤提供一种已适应于并可适应于最初的问题(特别是基因组的问题)之经验证的微阵列，该经验证的微阵列因此可归类为特别低的错误。
根据本发明的另一优选的实施方式，系将多数的微阵列提供于称为“多数阵列的阵列”或“多任务阵列”排列的基质上。当然，个别具有相同或不同设计的微阵列可存在于多任务阵列的排列中。
在这个实施方式中，基质优选地是在适合的疏水性作用剂之协助下，提供疏水性的样式(所谓的“图形(patterning)”)，该作用剂例如相应的疏水性聚合物或聚合组合物(例如硅酮、Teflon或其它全氟化的聚合物或聚合组合物，例如Cytonix的产物，例如PerFluoroCoatTM)。相应的方法是在本领域中已知的，其中根据本发明，利用相应的聚合组合物之网版印刷方法是优选的。经由这个方法，例如2、8(2×4)、12(2×6)、16(2×8)、48(4×12)或192(8×24)个反应隔间或区域(槽孔)，其个别都被疏水性的涂层所环绕并藉此将彼此隔开，可在优选地具有25毫米×75毫米尺寸(相当于通常显微镜载片的尺寸)的基质上(例如玻璃载片)产生。不言而喻的是，可将这些反应隔间盖印在适合的基质内，以取代将其覆盖上去。应了解的是，设计，特别是在基质上的反应隔间之数目、形状(圆形、椭圆形、角形)及排列，以及基质的尺寸，可绝对自由地选择，并可个别地适应客户的需求。具有通常微滴定盘尺寸的基质(例如85,48毫米×127,76毫米)，可提为优选的实例。这些多任务的阵列排列可有利地整合成典型的自动化系统，用于以特别简单的方式之液体操作及高产量方法。
多任务的阵列之优点特别是在于增加可再现性(在相同条件下，所有微阵列都施加到相同基质上并与靶分子接触(例如杂交)；靶分子的萃取、逆转录、增殖及标记，也可同时对每个微阵列进行；可在单一基质上定性单一靶分子数次(统计学的改善))、减少成本(多任务的阵列之成本增加通常是与阵列数目的倒数成比例，例如多任务的阵列之成本是比单一微阵列的成本5倍来得少，然而多任务的阵列可用于例如8至200次测试的定性)、以及增加产量(减少样品操作，因为多任务的阵列是与测试的溶液同时接触(例如杂交)；自动化的可能性，特别是当使用微滴定盘形式的基质时)。
此外，本发明之微阵列或多数阵列的阵列，可有利地提供粘性上层结构(例如可购自Grace生物实验室公司，班德，奥勒岗州，美国)，以将溶剂的蒸发(大部分是水或缓冲液；特别重要的是在利用低样品体积的微阵列测试中)以及相邻微阵列的交叉污染(在多任务的阵列的例子中)减到最小。
本发明之多任务的阵列可用于提供经验证的布局，以用于本发明之经验证的微阵列(根据本发明方法的步骤(c))，并可将经验证的探针分子(根据本发明方法的步骤(e))施加到基质上(提供优选地是疏水性的对应图形)。以多任务的阵列排列之形式提供本发明之经验证的微阵列是优选的，因为施加经验证的探针分子之对应方法(例如点上、喷墨、印刷等)是最适合于这个例子。因此，根据本发明之优选的实施方式，本发明方法之上述步骤(步骤(c)及/或步骤(e)，优选地是步骤(e))包括制造超过一个测试的微阵列(参见本发明方法之步骤(c))及以多种微阵列的形式施加经验证的探针分子(参见本发明方法之步骤(e))等步骤。尚未验证的测试微阵列(步骤(c))或具有经验证的布局的微阵列(步骤(e))，各自可能是相同或不同的。基质的分割可通过在现有技术中已知的图形化组件而进行，优选地是通过适应于喷墨印刷的网版印刷组件而进行(例如可得自系统自动化公司，法明顿，康乃狄克，美国)。如以上之概述，也优选地是将本发明方法的步骤(c)内容中由客户所建立的信息，或根据本发明之微阵列设计中先前存在的信息，整合到多任务的阵列排列中。
本发明更有关于可得自本发明方法之经验证的微阵列(也就是具有经验证的布局的微阵列)。如上所述，这些可存在于多任务的阵列排列内。
本发明系统及方法的可能的应用，是特别提供用于制备特定的微阵列，特别是DNA微阵列，以筛选活性物质。此外，本发明方法所提供的微阵列，特别是利用本发明系统所提供的微阵列，可用于患者特异性的筛选活性物质。经验显示，在这个例子中，患者接受最适合他临床状况的药剂的速率是重要的。此外，在本发明制备的布局之基础上所提供的微阵列，可作为同样需要短的反应时间的毒性测试之基础。此外，根据本发明提供的微阵列也可用于评估及优化用于生物技术产生的产品之制造工厂。这样的工厂通常是经由线上控制的方法而控制，同时优化用于制造所要产品的细菌之生物活性。

Claims (26)

1.一种用于以分离方式制备经验证的微阵列的系统，其至少具有：
·一或多个装置，其被设计为用于输入拟通过微阵列进行分析的靶分子的信息；
·一装置，其被设计为用于根据待分析的靶分子的信息来测定可能与靶分子相互作用的探针分子(测试的探针分子)；
·一提供布局的装置，其包括：
·一以高密度原位合成测试的探针分子的组件；
·一微阵列测试组件，其被设计为用于使靶分子与测试的探针分子接触；以及
·一微阵列读出组件，其被设计为用于记录在靶分子与测试的探针分子接触期间发生改变的信号；
·一用于合成探针分子的装置，其被设计为用于探针分子的离位合成；以及
·一提供微阵列的装置，其被设计为用于将探针分子施加到基质。
2.权利要求1的系统，其中用于输入拟通过微阵列进行分析的靶分子信息的装置包括将该信息储存在一个或多个资料夹的计算机。
3.权利要求1或2的系统，其中用于测定测试的探针分子的装置包括根据靶分子的信息以程序控制的方式选择该测试的探针分子的计算机。
4.权利要求1或2的系统，其中提供布局的装置包括将所述布局以资料夹的形式而储存的计算机。
5.权利要求1或2的系统，其中用于探针分子合成的装置包括用于固相合成的组件。
6.权利要求1或2的系统，其中提供微阵列的装置包括点样的组件。
7.权利要求1或2的系统，其中提供微阵列的装置及/或提供布局的装置包括适合于将基质分割成多个反应区域的图形化组件。
8.权利要求1或2的系统，其中的装置通过资料传送组件而连结成一网络。
9.权利要求8的系统，其中的网络是国际互联网。
10.权利要求8的系统，其中的装置是结合于一平台内，以用于研究伙伴内的互动。
11.一种利用如前述权利要求中任一项的系统以分离的方式制备经验证的微阵列的方法，其包括下列步骤：
(a)通过微阵列的输入装置提供待分析的靶分子的信息；
(b)根据该信息，通过测定测试的探针分子的装置而测定测试的探针分子；
(c)通过布局装置提供用于微阵列的经验证的布局，其包括：
·通过原位合成组件，以高密度原位合成经测定的测试探针分子而制备至少一种测试的微阵列；
·利用靶分子，通过微阵列测试组件而测试该测试的微阵列；以及
·当利用靶分子测试该测试的微阵列时，通过微阵列读出组件记录至少一个修饰的信号；
(d)通过用于合成探针分子的装置离位合成相应于经验证的布局的探针分子(经验证的探针分子)；以及
(e)通过提供微阵列的装置将依据经验证的布局的经验证的探针分子施加到基质。
12.权利要求11的方法，其中在步骤(a)中的信息及/或在步骤(c)中经验证的布局是借助于电子资料传送装置，以资料夹的形式而(在每个情况中)提供。
13.权利要求11或12的方法，其中借助于计算机程序测定步骤(b)中的测试的探针分子。
14.权利要求11或12的方法，其中步骤(c)中提供经验证的布局包括下列次级步骤：
(1)在靶分子与探针分子相互作用的情况中(预期信号)，从微阵列中指定至少一个预期的信号；
(2)通过高密度原位合成经测定的测试探针分子而制备测试的微阵列；
(3)利用靶分子而测试该测试的微阵列，以及记录至少一个测试的信号；
(4)将该至少一个测试的信号与该至少一个预期的信号做比较；
(5)通过重复步骤(2)至(4)而调整测试的微阵列，直到测试的信号基本上与预期的信号一致为止，修饰步骤(2)中在微阵列上的测试探针分子、数量、结合、数目、密度、方向性及/或其排列；以及
(6)提供微阵列布局，其中该至少一个测试的信号基本上与该至少一个预期的信号一致。
15.权利要求14的方法，其中预期的信号及测试的信号是荧光信号。
16.权利要求11或12的方法，其中在步骤(b)中经测定的测试探针分子代表可能与该靶分子相互作用的完整族群的分子。
17.权利要求11或12的方法，其中的测试的分子或经验证的探针分子及/或靶分子是核酸、肽、肽核酸、多肽、寡糖、多糖及/或低分子量的有机物质。
18.权利要求17的方法，其中的测试的分子或经验证的探针分子是寡核苷酸。
19.权利要求18的方法，其中的寡核苷酸的长度是约8至约80个核苷酸。
20.权利要求18的方法，其中在步骤(b)中的寡核苷酸代表生物体的全部基因组、生物体的一个或多个染色体的遗传物质、cDNA文库、剪接变体、启动子区域、SNPs、突变体或高度重复性的DNA区域。
21.权利要求11或12的方法，其中的靶分子包含单一或多种的荧光标记。
22.权利要求11或12的方法，其中在步骤(c)及次级步骤(2)中的原位合成分别是通过电化学方法及原位点样探针分子基础材料而进行。
23.权利要求11或12的方法，其中分别在步骤(c)及次级步骤(2)中合成超过约1,000个测试的探针分子种类/约25毫米×75毫米。
24.权利要求23的方法，其中合成至少约4,000个测试的探针分子种类/约25毫米×75毫米。
25.权利要求11或12的方法，其中在步骤(c)中将多种测试的微阵列在一种基质上制造，及/或在步骤(e)中将经验证的探针分子施加到多种微阵列中。
26.一种经验证的微阵列，其得自权利要求11至25项中任一项的方法。
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