JP2002122610A - Ｄｎａ分析用マイクロアレイの製造方法 - Google Patents

Ｄｎａ分析用マイクロアレイの製造方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡマイクロアレイを用いるＤＮＡ断片試
料の検出において検出精度が高く、かつ検出誤差が少な
いＤＮＡマイクロアレイの製法を提供する。 【解決手段】 表面に反応性基を有する固相担体の上
に、該反応性基と反応して共有結合を形成することので
きる反応性基を備えた、核酸断片などのプローブ分子を
含み、かつ増粘剤の添加により所定の粘度にまで増粘さ
れた水性液を点着する工程；該水性液の点着が行なわれ
た固相担体をインキュベートして、該基板表面にて共有
結合反応を生起させる工程；そして、該基板表面を水性
媒体で水洗して、増粘剤を固相担体表面から除去する工
程を含むＤＮＡ分析用マイクロアレイの製法。なお、こ
の増粘剤を用いるＤＮＡ分析用マイクロアレイの製法
は、プローブ分子が固相担体表面に静電結合で固定され
る場合でも有効である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型などの同時解析に非常に有用なＤＮＡ分析用マ
イクロアレイの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多種多様な生物の遺伝子構造を明らかに
するのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解
明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効
率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。Ｄ
ＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいう）は、スラ
イドガラス等の固相担体（基板）に多数のＤＮＡ分子を
所定の領域毎に整列固定させた高密度のアレイであり、
核酸の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多
型性などの同時解析に非常に有用である。このＤＮＡマ
イクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、ＤＮＡなど
の生体分子にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断
や予防法の開発などに極めて有用であるため、ＤＮＡマ
イクロアレイの作製技術および得られたデータの解析シ
ステムのより一層の開発が望まれている。
【０００３】ＤＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡ等の
核酸の検出に際しては、まず固相担体表面に高密度に整
列したＤＮＡ断片などのプローブに対して、ラジオアイ
ソトープ（ＲＩ）や蛍光で標識した核酸断片試料（ター
ゲット核酸資料）をハイブリダイズさせる。このとき、
ターゲット核酸中の、プローブと相補的な塩基配列をも
つ分子は、プローブと相補的に結合（ハイブリダイズ）
する。次いで、このハイブリダイズしている標識したタ
ーゲット分子のシグナルを測定し、ハイブリダイズされ
たプローブ分子を同定する。具体的には、ＲＩや蛍光イ
メージスキャナーでマイクロアレイ上の放射線強度また
は蛍光強度を測定し、そして得られた画像データを解析
処理する。従って、ＤＮＡマイクロアレイによれば、数
千乃至数万個の分子を同時にハイブリダイズさせて検出
することができ、微量の試料で短時間のうちに大量の遺
伝子情報を得ることができる。
【０００４】ＤＮＡマイクロアレイを作製するには、固
相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法
（「オン・チップ法」という）と、予め調製したＤＮＡ
断片を固相担体表面に固定する方法などがある。前者の
オン・チップ法は、光照射で選択的に除去される保護基
を使用し、半導体製造に用いられるフォトリソグラフィ
技術と固相合成技術を利用して、固相担体上の多数の微
小なマトリックスで、組合せ反応（コンビナトリアル・
シンセシス）により、多種類のオリゴヌクレオチドを同
時に合成する方法である（Fodor, S.P.A. et al, Scien
ce, 251, 767-773(1991)）。
【０００５】一方、後者の方法は、予め調製したＤＮＡ
断片試料などのプローブ分子を固相担体表面に点着させ
ることにより共有結合あるいはイオン結合を利用して結
合固定する方法であり、プローブ分子の種類や固相担体
の種類に応じて下記のように分類することができる。 （１）固定するプローブ分子がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳
型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮ
ＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）などのＤ
ＮＡ断片試料である場合には一般に、これらをＤＮＡマ
イクロアレイ作製装置に備えられたスポット装置を用い
て、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン
等）で表面処理した固相担体表面に点着し、ＤＮＡ断片
試料の荷電を利用して固相担体に静電結合させて固定す
る（Schena, M. et al, Science, 270, 467-470(199
5)）。
【０００６】（２）固定するプローブ分子が合成物（オ
リゴヌクレオチド）の場合には、予め反応活性基を導入
したオリゴヌクレオチドを合成し、これらを表面処理し
た固相担体表面にスポット装置を用いて点着し、共有結
合を介して固定させる（「蛋白質・核酸・酵素」、43、
2004-2011(1998); Lamture, J.B. et al., Nucl. Acids
Res., 22, 2121-2125(1994); 及び Guo, Z. et al., N
ucl. Acids Res., 22,5456-5465(1994)）。オリゴヌク
レオチドに導入する反応活性基としては、アミノ基、ア
ルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどが用いられる。固相
担体の表面処理には、アミノ基、アルデヒド基、エポキ
シ基等を有する各種のシランカップリング剤が用いられ
る。この共有結合による場合には、（１）の静電結合に
よる場合に比べて、プローブを固相担体表面に安定に固
定することができる。
【０００７】（３）固定するプローブ分子がＰＮＡであ
る場合には、上記の（２）のオリゴヌクレオチドの場合
と同様に、反応活性基を予め導入して、固相担体表面に
共有結合により固定する。
【０００８】なお、本出願人による特願平１１−３４６
１５７号明細書は、固相担体をアミノ基を有するシラン
カップリング剤等で表面処理した後、ジスルホン化合物
を接触させることにより、ビニルスルホン基が導入され
た固相担体表面を形成し、これにＤＮＡ断片を共有結合
により固定する方法が記載されている。
【０００９】固相担体表面にプローブ分子を点着固定し
て多数のスポットを形成するには、ピン先端を担体表面
に機械的に接触させるピン方式や、インクジェットプリ
ンタの原理を利用したインクジェット方式などによる各
種のスポット装置が用いられている。検出対象の核酸断
片試料の検出精度を少しでも高めてＤＮＡマイクロアレ
イによる解析精度を向上させるためには、いずれの装置
を用いた場合であっても、固相担体上に点着形成された
スポットでは、プローブ分子が担体表面にしっかりと固
定されるとともに、その形状や大きさができるだけ揃っ
ていて、再現性が良いことが望まれている。
【００１０】なお、米国特許第５８３７１９６号明細書
には、ニトロセルロースなどの結合剤ポリマー（matrix
polymer）の溶液を含む生体分子の溶液を、固相担体表
面に接触させて核酸などの生体分子を固定する方法が開
示されており、結合剤ポリマーは固定後も担体表面に存
在して、生体分子を固定するための接着剤として機能し
ていると理解される。
【００１１】また、本出願人による特願２０００−２２
１８０号明細書には、ＤＮＡ断片と親水性ポリマーを含
有する水性液を固相担体表面に点着して、ＤＮＡ断片を
担体表面に結合させることを特徴とするＤＮＡ断片の固
定方法が記載されている。この場合にも、固定後に親水
性ポリマーの除去は行われず、親水性ポリマーは担体表
面に存在して、ＤＮＡ断片と担体との静電結合に係る役
割および一般的な接着的役割を果たしている。
【００１２】本発明者の研究によると、ＤＮＡ断片など
のプローブ分子の際に親水性ポリマーを用いることによ
り、プローブ分子の固相担体表面への固定が安定化する
が、固相担体表面に残留する親水性ポリマーには、ハイ
ブリダイゼーションの実施に際して、プローブと相補性
を持たないＤＮＡ断片試料が付着しやすく、このためＤ
ＮＡ断片試料の検出に誤差をもたらしやすいことが判明
した。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡマイ
クロアレイを用いるＤＮＡ断片試料の分析に際して、検
出精度が高く、かつ検出誤差の発現が少ないＤＮＡマイ
クロアレイの製造方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＤＮＡ断片
などのプローブ分子として、固相担体表面に予め形成し
た反応性基と共有反応して結合する反応性基を備えたプ
ローブ分子を選び、そのプローブ分子の水性液に、洗浄
による除去が容易な水溶性の増粘剤を添加して水性液を
増粘させると、水性液を固相担体表面に点着した時に、
スポットが安定化し、その形状や大きさが揃って再現性
が良いスポットが形成されることを見い出した。そし
て、さらにプローブ分子の固定後に固相担体表面より洗
浄などの方法で増粘剤を除去することによって、ハイブ
リダイゼーションを介することのない核酸断片試料の固
相担体表面への付着を防ぎ、その結果として、測定した
蛍光強度にバックグランドノイズが生じるのを防ぐこと
ができることを見い出し、本発明に到達した。
【００１５】また、上記のプローブ分子の水性液への増
粘剤の添加効果は、プローブ分子の固相担体表面への固
定が、静電結合による場合でも、有効に発現されること
も判明した。
【００１６】従って、本発明は、表面に反応性基を有す
る固相担体の上に、該反応性基と反応して共有結合を形
成することのできる反応性基を備えた、核酸断片、オリ
ゴヌクレオチドもしくはＰＮＡから選ばれるプローブ分
子を含み、かつ増粘剤の添加により所定の粘度にまで増
粘された水性液を点着する工程；該水性液の点着が行な
われた固相担体をインキュベートして、該基板表面にて
共有結合反応を生起させる工程；そして、該基板表面を
水性媒体で水洗して、増粘剤を固相担体表面から除去す
る工程を含むＤＮＡ分析用マイクロアレイにある。
【００１７】本発明はまた、表面に荷電性基を有する固
相担体の上に、該荷電性基に静電結合することのできる
荷電性基を備えた、核酸断片、オリゴヌクレオチドもし
くはＰＮＡから選ばれるプローブ分子を含み、かつ増粘
剤の添加により所定の粘度にまで増粘された水性液を点
着する工程；該水性液の点着が行なわれた固相担体をイ
ンキュベートして、該プローブ分子を該基板表面に静電
結合させる工程；そして、該基板表面を水性媒体で水洗
して、増粘剤を固相担体表面から除去する工程を含むＤ
ＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法にもある。
【００１８】本発明のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製
造方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）固相担体に点着される水性液の粘度が、２ｍＰａ
・Ｓ〜５０ｍＰａ・Ｓの範囲にある。 （２）増粘剤が水溶性ポリマーである。
【００１９】（３）固相担体表面の反応性基がスルホニ
ルビニル基であり、プローブ分子に備えられた反応性基
がアミノ基である。 （４）固相担体表面の反応性基がスルホニルビニル基で
あって、基板表面に予め付設されていたアミノ基にジビ
ニルスルホン誘導体を反応させることにより形成された
スルホニルビニル基である。
【００２０】（５）固相担体表面の荷電性基がアミノ基
であり、プローブ分子に備えられた荷電性基がリン酸基
である。 （６）固相担体表面の荷電性基がアミノ基であって、基
板表面のアミノシランカップリング剤もしくはポリ陽イ
オンによる処理により導入されたアミノ基である。
【００２１】（７）固相担体表面を水洗する水性媒体が
界面活性剤を含んでいる。 （８）固相担体表面の二以上の所定領域に、それぞれが
所定の粘度となるように増粘された水性液を点着する。 （９）二以上の所定領域に点着される水性液の粘度が互
いに等しい。ここで粘度が互いに等しいとは、点着され
た各水性液のスポットの形状が外観的に互いに相違がな
い状態をもたらす程度に粘度に相違がないことを意味す
る。
【００２２】（１０）マイクロアレイのスポットの間の
変動係数が６．５％以下である。スポットの変動係数
（ＣＶ）とは、蛍光強度に基づく変動係数であり、蛍光
標識試薬Ｃｙ５で標識したＤＮＡ断片を、スポット装置
（Cartesian TECHNOLOGIES社製）を用いて、固相担体表
面に二つ以上のスポットとして点着固定することにより
作製したＤＮＡマイクロアレイについて、担体表面の蛍
光強度を蛍光スキャニング装置で測定したときに得られ
る、各スポットの蛍光強度の平均値に対する標準偏差
（ＳＤ）の割合（％）を意味する。
【００２３】本発明のＤＮＡ分析用マイクロアレイは、
その表面の多数の所定の領域のそれぞれに、蛍光物質で
標識した核酸断片試料を溶解あるいは分散してなる水性
液を点着した後、これをインキュベートし、そしてマイ
クロアレイの各点着領域における蛍光強度を測定して、
マイクロアレイ上のプローブと核酸断片試料とで形成さ
れたハイブリッドを検出することを特徴とする、マイク
ロアレイ上のプローブに対して相補性を有する核酸断片
の検出方法に利用することができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下に、ＤＮＡ分析用マイクロア
レイの作製工程と核酸断片試料の検出工程とからなるＤ
ＮＡ分析用マイクロアレイ技術の全体像を、図面を参照
しながら説明する。
【００２５】本発明に従うＤＮＡマイクロアレイの代表
的な作製工程および核酸断片試料の検出工程を、図１
に、プローブ分子を固相担体上に共有結合で固定する方
法を例にとって、それぞれの作業の流れに従って模式的
に示す。なお、この模式図は、「タンパク質・核酸・酵
素」（Vol.43, No.13, 2007(1998)）から転写したもの
である。
【００２６】まず、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ（ＥＳＴ
は、３’末端から２００〜３００ｂｐ（ｂｐ：塩基対）
程度のｃＤＮＡ断片を意味する）などの配列が登録され
ているデータベース（１１）、あるいはクローンコレク
ション（１２）から、ＰＣＲ法による増幅あるいは化学
合成により、ＤＮＡコレクション（ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、
オリゴＤＮＡ等）（２１）を調製する。そして、ＤＮＡ
コレクション（２１）を水性液に、増粘剤ともに分散、
溶解させ、その増粘させたＤＮＡ水性液を、固相担体
（３１ａ）の表面に、スポット装置により点着し、次い
で増粘剤を水洗除去して、ＤＮＡ断片（３１ｂ）が固定
されたＤＮＡ分析用マイクロアレイ（３１）を得る。
【００２７】一方、細胞や組織などの検体（４１）から
ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ（５１）を抽出し、逆転写反
応によりｃＤＮＡ又はターゲットＤＮＡ（５２）を得
る。これを蛍光標識物質（５３ａ）により標識して、標
識したターゲット核酸（５３）とする。ターゲット核酸
（５３）は、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれであってもよ
い。次いで、ＤＮＡ分析用マイクロアレイ（３１）上の
ＤＮＡ断片（３１ｂ）とターゲット核酸（５３）とのハ
イブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション
によって二本鎖が形成されたＤＮＡ分析用マイクロアレ
イ（６１）について、蛍光スキャニング装置を使ってそ
の蛍光強度を測定し、画像データ（７１）を得る。得ら
れたデータから、ターゲット核酸の塩基配列を決定した
り、遺伝子発現プロファイルを作成することができる。
更に、データ解析ソフトや外部データベースを利用する
ことにより、遺伝子の変異や多型などの複雑な解析を行
うことも可能である。
【００２８】図２に、ハイブリダイゼーション後のＤＮ
Ａ分析用マイクロアレイを拡大して示す。
【００２９】次に、本発明のＤＮＡ断片などのプローブ
分子の固相担体への固定方法について、先ず、共有結合
による固定を例にとって、詳細に説明する。固相担体
は、疎水性、あるいは親水性に乏しい担体であることが
好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低い
ものであってもよい。固相担体の材質としては、ガラ
ス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニュー
セラミックス；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セル
ロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリス
チレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー；シリ
コーン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、
多孔質シリコーン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルターなどの多孔質物質、
そして金電極などの金属材料表面を挙げることができ
る。多孔質物質の細孔の大きさは、一般に２〜１０００
ｎｍの範囲にあり、好ましくは２〜５００ｎｍの範囲に
ある。表面処理の容易さや蛍光スキャニング装置による
測定の容易さから、固相担体の材質は、ガラスもしくは
シリコーンであることが特に好ましい。固相担体の厚さ
は、一般に１００〜２０００μｍの範囲にある。
【００３０】固相担体は、その表面がポリ陽イオン（例
えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイミン、ポリア
ルキルアミン）で被覆処理されて、反応性基が導入され
ていることが好ましく、特に好ましいのはポリ−Ｌ−リ
シンによる被覆処理である。あるいは、アミノ基、アル
デヒド基、エポキシ基、メルカプト基等を有するシラン
カップリング剤によって接触処理されていてもよい。好
ましくは、アミノ基またはメルカプト基を有するシラン
カップリング剤である。ポリ陽イオンによる場合には、
アミノ基またはメルカプト基が静電結合によって担体表
面に導入されるのに対して、シランカップリング剤によ
る場合には共有結合によって導入されるため、アミノ基
またはメルカプト基は担体表面に安定に存在する。
【００３１】ポリ陽イオンを用いる処理に、シランカッ
プリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。疎
水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片など
のプローブ分子との静電的相互作用を促進することがで
きる。ポリ陽イオン処理がされた固相担体表面上に、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって、ポリ陽イオン処理がされた固相担体の凹凸を
軽減することができる。固相担体の種類によっては、そ
の担体中に親水性高分子等を含有させることも可能であ
り、このような処理を施した固相担体も好ましく用いる
ことができる。
【００３２】ＤＮＡ断片を共有結合により固定する場
合、上記の活性基が導入された固相担体表面に、更に下
記に示すようなジスルホン化合物を接触させることによ
り、ビニルスルホン基が導入された固相担体であること
が特に好ましい。このような固相担体およびＤＮＡ断片
の固定方法については、前記の特願平１１−２２１８０
号明細書を参照することができる。
【００３３】
【化１】Ｘ1−ＳＯ2−Ｌ−ＳＯ2−Ｘ2 （ただし、Ｘ1とＸ2は、ビニル基を表わし、Ｌは二価の
連結基を表わす）
【００３４】プローブ分子は、目的によって、核酸断
片、オリゴヌクレオチドもしくはＰＮＡの三通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、一般
に、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のＤＮＡ断片
（ポリヌクレオチド）を使用する。これらのポリヌクレ
オチドは、配列や機能が未知であってもよいが、一般的
にはデータベースに登録された配列を基にして、ｃＤＮ
Ａやゲノムのライブラリー、あるいは全ゲノムをテンプ
レートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という）。ＰＣＲ法によって増幅し
ていないものも使用することができる。
【００３５】一方、遺伝子の変異や多型を調べるために
は一般に、標準となる既知の配列を基にして変異や多型
に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成して使用す
ることもできる。さらに、塩基配列決定の場合には、４
n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチド（オリ
ゴＤＮＡ）を合成して使用する。使用するＤＮＡ断片の
塩基配列は既知であることが好ましい。ＤＮＡ断片は、
オリゴＤＮＡであれば２〜５０merであることが好まし
く、特に好ましくは１０〜２５merである。
【００３６】また、プローブ分子として、ＤＮＡのホス
ホジエステル結合をペプチド結合に変換した人工核酸、
すなわちペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いることもでき
る。
【００３７】ＤＮＡ断片などのプルーブ材料の一方の末
端には、一般に、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、
カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカ
ルボキシイミド基等の官能基を導入する。好ましくはア
ミノ基を導入する。共有結合によりＤＮＡ断片を固定す
る場合に、ＤＮＡ断片の官能基とリン酸エステル基との
間にクロスリンカーを存在させることが好ましく、クロ
スリンカーはアルキレン基またはＮ−アルキルアミノ−
アルキレン基であることが好ましく、より好ましくはヘ
キシレン基またはＮ−メチルアミノ−ヘキシレン基であ
り、特に好ましくはヘキシレン基である。
【００３８】前述のように、本発明におけるプローブ分
子の固相担体表面への固定は、共有結合のみならず、静
電結合によるものであってもよい。プローブ分子の固相
担体表面への静電結合による固定は、以前から知られて
いる。例えば、ガラス表面のアミノシランカップリング
剤による処理、あるいはポリ陽イオン（例、ポリリシ
ン、ポリエチレンイミン）による被覆処理により、固相
担体表面にカチオン性基（アミノ基）を導入し、これ
に、リン酸基などのアニオン性基を備えたＤＮＡ断片、
あるいは任意のアニオン性基が導入された合成オリゴヌ
クレオチドやＰＮＡを接触させる方法が利用される。
【００３９】本発明の特徴的な要件である水溶性増粘剤
としては、例えば合成もしくは天然の水溶性高分子物
質；グリセロールなどの多価アルコール；トレハロー
ス、アルギン酸ナトリウム、でんぷんなどの糖類を挙げ
ることができる。
【００４０】水溶性高分子物質としては、カチオン性、
アニオン性もしくは両性の親水性ポリマーであることが
好ましい。ノニオン性ポリマーも用いることができる。
特に好ましいのはカチオン性ポリマーである。ポリマー
の分子量は一般に、１０3〜１０6の範囲にあることが好
ましい。分子量がこの範囲を超えると、粘性が大きくな
りすぎるため、ＤＮＡ断片などのプローブ分子の分散性
や固相担体への結合に悪影響を及ぼす。
【００４１】カチオン性ポリマーは、四級アミン系ポリ
マーであることが好ましい。具体的には、ポリ（１，４
−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタン−１，４
−ジイルメチレン−１，４−フェニレンメチレンクロリ
ド）、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロ
リド、ポリアクリル酸メチレントリメチルアンモニウム
クロリドエステル、ポリアクリル酸エチレントリメチル
アンモニウムクロリドエステル等を挙げることができ
る。ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルイミダゾ
ール、ポリビニルピラゾール等の三級アミン系ポリマー
を用いることも好ましい。特に好ましくは、ポリ（１，
４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタン−１，
４−ジイルメチレン−１，４−フェニレンメチレンクロ
リド）である。
【００４２】アニオン性ポリマーは、ＣＯＯ-、Ｓ
Ｏ3 -、ＯＳＯ3 -、ＰＯ3 -、ＰＯ2 -等のアニオン含有ポリ
マーであることが好ましい。具体的には、カルボキシメ
チルセルロース、セルロースの硫酸エステル、ポリアク
リル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルベンゼンスルホ
ン酸、またはこれらの塩を挙げることができる。特に好
ましくは、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、およびカルボキシメチルセ
ルロースである。
【００４３】ノニオン性ポリマーとしては、ポリアクリ
ルアミド、ポリエチレングリコールポリビニルアルコー
ル、ポリビニルアルコールのアセタール体、セルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピル
セルロース等のセルロース誘導体を挙げることができ
る。特に好ましくは、ポリアクリルアミドおよびポリエ
チレングリコールである。
【００４４】両性ポリマーとしては、アルブミン、ゼラ
チン、ゼラチン誘導体、アルブミンそしてカゼイン等の
タンパク質を挙げることができる。特に好ましいのはア
ルブミンである。
【００４５】上記のプローブ分子および水溶性増粘剤
を、蒸留水、ＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）など
の水性媒体に溶解もしくは分散して、ＤＮＡ断片の水性
液を調製する。水性液の粘度は、使用するスポット装置
によっても異なるが、一般には１〜１００ｍＰａ・ｓの
範囲にある。例えば、クイルピンタイプのスポット装置
であれば、水性液の粘度は２〜５０ｍＰａ・ｓの範囲に
あることが好ましく、特に好ましくは２〜２０ｍＰａ・
ｓの範囲にある。水溶性増粘剤が水溶性高分子物質であ
る場合には、一般に０．１〜５重量％の範囲で添加さ
れ、好ましくは０．３〜３重量％の範囲にある。増粘剤
が多価アルコールや糖類である場合には、一般に５〜５
０重量％の範囲で添加され、好ましくは１０〜４０重量
％の範囲にある。
【００４６】このプローブ分子の水性液を、９６穴もし
くは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した
水性液をスポット装置等を用いて固相担体上に滴下して
点着を行う。スポット装置としては通常は、ピンにプロ
ーブ分子水性液を保持させ、そのピンを固相担体表面に
接触させ、そして水性液を担体表面に移行させてスポッ
トを形成するピン方式による装置が用いられる。ピンの
先端の形状には、ソリッドピンタイプ（特に、溝が切ら
れていないもの）、クイルピンタイプ（万年筆のように
溝が切られているもの）など様々なタイプがあり、いず
れであっても使用することができる。好ましくは、クイ
ルピンタイプである。また、ピン方式以外にも、インク
ジェットプリンタの原理を利用したインクジェット方式
や、毛細管によるキャピラリ方式などを利用したスポッ
ト装置も用いることができる。
【００４７】点着するプローブ分子は、固相担体表面に
対して１０2〜１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好
ましい。プローブ分子の量は、１〜１０-15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、プローブ分子は、固相担体表面にス
ポットとして固定される。本発明においては、プローブ
分子の水溶液に水溶性増粘剤が添加されているので、各
スポットの形状はほぼ円形であって、ほぼ同じ大きさで
ある。形状や大きさに変動がないことは、遺伝子発現の
定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
スポット当たりの水性液の点着量は、一般に１００ｐＬ
〜１μＬの範囲にあり、好ましくは１〜１００ｎＬの範
囲にある。スポットの大きさは、一般には直径が５０〜
３００μｍの範囲にある。そして、スポット間の距離
は、一般に０〜１．５ｍｍの範囲にあり、好ましくは１
００〜３００μｍの範囲にある。
【００４８】プローブ分子水溶液の点着後、固相担体上
の点着水溶液の急速な乾燥を防ぐために、固相担体を７
０％以上の湿度及び２５℃〜５０℃の温度範囲の環境下
に置いてもよい。また、プローブ分子と固相担体との結
合（固定）をより安定にするために、加熱、紫外線、水
素化ホウ素ナトリウムまたはシッフ試薬による後処理を
施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合
わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わ
せて行うことが好ましい。あるいは、インキュベーショ
ンを行ってもよい。これらの後処理により、プローブ分
子と固相担体との間に安定な共有結合あるいは静電結合
が形成される。
【００４９】次いで、プローブ分子が結合固定された固
相担体の表面を洗浄して、水溶性増粘剤を実質的に除去
する。固相担体表面の洗浄は、例えばドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）水溶液や標準食塩−クエン酸緩衝液を
用いて行なうことができる。その際に洗浄液を加温して
もよい。これにより、水溶性増粘剤が実質的に取り除か
れると同時に、結合しなかったプローブ分子も除去され
る。
【００５０】上記のプローブ分子の固定方法により作製
された本発明のＤＮＡ分析用マイクロアレイは、多数の
プローブ分子が共有結合もしくは静電結合により固定さ
れた領域からなるスポットを多数個（通常は、数百から
数万個）有する。スポット間のばらつきの指標となる変
動係数はＣＶが６．５％以下のものであることが好まし
い。
【００５１】上記のプローブ分子の固定方法に従って作
製されたＤＮＡ分析用マイクロアレイの寿命は通常、ｃ
ＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ分析用マイクロアレイ
では数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮ
Ａ分析用マイクロアレイでは更に長期間である。これら
のＤＮＡ分析用マイクロアレイは、遺伝子発現のモニタ
リング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用
される。
【００５２】次に、本発明のＤＮＡ分析用マイクロアレ
イを用いたＤＮＡ断片試料の検出方法について説明す
る。まず、標識したＤＮＡ断片試料を用意する。ＤＮＡ
断片試料（ターゲットＤＮＡ）としては通常、その配列
や機能が未知であるＤＮＡ断片あるいはＲＮＡ断片が用
いられる。
【００５３】標識したＤＮＡ断片試料は、遺伝子発現を
調べる目的では一般に、真核生物であればその細胞や組
織サンプルからｍＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によ
り、標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する）
を取り込ませながら、ｃＤＮＡとすることにより得られ
る。細菌などの原核生物であれば、ｍＲＮＡの選択的な
抽出が困難であるので全ＲＮＡを抽出する。ゲノムを試
料とする場合には、赤血球を除く任意の組織サンプルか
ら単離することができる。赤血球を除く任意の組織は、
例えば抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等である。
１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、
液量や標識方法によっても異なるが、通常は数μｇ以下
である。なお、ｍＲＮＡをアンチセンスＲＮＡとして用
いる方法もある。標識ｄＮＴＰとしては、化学的な安定
性の点から、標識ｄＣＴＰを用いることが好ましい。ま
た、ＤＮＡ分析用マイクロアレイ上のＤＮＡ断片がオリ
ゴＤＮＡである場合には、ＤＮＡ断片試料を低分子化し
ておくことが望ましい。
【００５４】標識したＤＮＡ断片試料は、遺伝子の変異
や多型を調べる目的では、一般に標識プライマーもしく
は標識ｄＮＴＰを含む反応系でターゲット領域のＰＣＲ
を行うことにより得られる。
【００５５】標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍
光法、ビオチン法、化学発光法等）が知られているが、
蛍光法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、核
酸の塩基部分と結合できるものであればいずれであって
も用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ
ＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン
６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフル
オレン（ＡＡＦ）、およびＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘
導体）等を使用することが好ましい。
【００５６】次いで、上記の標識したＤＮＡ断片試料を
ＳＳＣなどの水性媒体に溶解あるいは分散して、試料の
水性液を調製する。この水性液を本発明のＤＮＡ分析用
マイクロアレイ上に点着した後、インキュベートして、
ハイブリダイゼーションを行う。点着は、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに試料の水性液を分注
し、スポット装置を用いて滴下することにより実施す
る。水性液の点着量は、スポット当たり１〜１００ｎＬ
の範囲にあることが好ましい。インキュベーションは、
室温〜７０℃の範囲の温度で、６〜２０時間の範囲の時
間で実施することが好ましい。
【００５７】ＤＮＡ分析用マイクロアレイを使用する場
合、使用するＤＮＡ断片試料の量が非常に少なくて済む
半面、ハイブリダイゼーションに際してはＤＮＡ分析用
マイクロアレイ上のプローブの鎖長や試料の種類に応じ
て、その最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の
解析には、低発現の遺伝子をも十分に検出できるよう
に、ハイブリダイゼーションを長時間かけて行うことが
好ましい。一方、一塩基変異の検出には、ハイブリダイ
ゼーションを短時間で行うことが好ましい。これによ
り、ＤＮＡ分析用マイクロアレイ上のＤＮＡ断片と、標
識したＤＮＡ断片試料中の、該プローブと相補的な塩基
配列をもつ分子とがハイブリダイズして、ハイブリッド
ＤＮＡ（２本鎖）を形成する。
【００５８】ハイブリダイゼーション終了後、界面活性
剤の溶液と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未
反応のＤＮＡ断片試料を除去することが好ましい。界面
活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝
液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、ある
いはグッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸
緩衝液を用いることが好ましい。
【００５９】次に、ＤＮＡ分析用マイクロアレイ上のハ
イブリッドＤＮＡからの蛍光シグナルを検出器により検
出する。検出器としては、例えば蛍光レーザー顕微鏡、
冷却ＣＣＤカメラおよびコンピュータを連結した蛍光ス
キャニング装置が用いられ、ＤＮＡ分析用マイクロアレ
イ上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣ
Ｄカメラの代わりに共焦点型または非焦点型のレーザー
を用いてもよい。これにより、ＤＮＡ分析用マイクロア
レイに対応した画像データが得られる。得られたデータ
から、ＤＮＡ分析用マイクロアレイ上のＤＮＡ断片など
のプローブに対して相補性を有する試料ＤＮＡ断片を同
定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファ
イルを作成したり、核酸断片試料の塩基配列を決定する
ことができる。さらに、データ解析ソフトや外部データ
ベースを利用することにより、遺伝子の変異や多型など
のより複雑な解析を行うことも可能である。あるいは、
試料として互いに異なる蛍光物質によって標識したＤＮ
Ａ断片試料を複数種類用意し、これらを同時に用いるこ
とにより、一個のＤＮＡ分析用マイクロアレイ上で発現
量の比較や定量を行うことも可能である。
【００６０】
【実施例】［実施例１〜３］共有結合によるＤＮＡ断片
（プローブ分子）の固定、スポット再現性およびＤＮＡ
断片固定量の評価 （１）共有結合タイプの固相担体（Ｂ）の作製 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
(株)製）の水溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５
ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、水で洗浄後、１１
０℃で１０分間乾燥して、アミノシラン化合物で被覆さ
れたイオン結合タイプの固相担体（Ａ）を作製した。次
いで、このアミノシラン化合物被覆固相担体（Ａ）を、
３重量％１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミ
ド）エタンのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶液に２時間
浸した後、取り出し、水で洗浄し、１時間減圧下で乾燥
し、ビニルスルホニル基が導入された共有結合タイプの
固相担体（Ｂ）を得た。
【００６１】（２）ＤＮＡ断片の固定 ＤＮＡ断片として、３’末端および５’末端がそれぞれ
アミノ基、蛍光標識試薬（FluoroLink Ｃｙ５−ｄＣＴ
Ｐ、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で修
飾された４０merのオリゴＤＮＡ (５’−ＣＴＡＧＴＣ
ＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＡ
ＣＡＴＧＧＡＧＧＡ−３’)((Ｃｙ５)オリゴＤＮＡ
(＋))を用意した。別に、下記表１に示すように水溶性
増粘剤を溶解した各種の水溶液を調製し、これらの水溶
液にＤＮＡ断片を１×１０-6Ｍの濃度で分散して、ＤＮ
Ａ断片の水性液を調製した。これらのＤＮＡ断片の水性
液を、ＤＮＡマイクロアレイ作製装置（クイルピンタイ
プ、Cartesian TECHNOLOGIES社製ＤＮＡスポット装置）
を用い、上記の共有結合タイプの固相担体（Ｂ）上に、
繰り返し５０回点着してスポットを形成した。点着後、
固相担体を温度２５℃、湿度７０％のモイスチャーチャ
ンバー内において１８時間放置してＤＮＡ断片を固相担
体表面に結合固定した後、チャンバーから取り出し、室
温で乾燥した。
【００６２】（３）固相担体の洗浄 これらの固相担体を、室温の０．１重量％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム）水溶液と２×ＳＳＣ（標準食塩−
クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、５０℃の０．２
×ＳＳＣで１回、室温の蒸留水で１回順次洗浄して、水
溶性増粘剤を除去した。洗浄後、固相担体を室温で乾燥
して、ＤＮＡ断片が固定された固相担体を得た。
【００６３】（４）スポット再現性およびＤＮＡ断片固
定量の評価 洗浄前後のＤＮＡ断片が固定された各固相担体につい
て、スポット部分の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で
測定した。各スポットの蛍光強度（相対値）の平均値
（Ｎ＝５０）に対する標準偏差（ＳＤ）の割合（％）、
すなわちスポットの蛍光強度の変動係数ＣＶ（％）を求
め、これによりスポット再現性の評価を行った。また、
洗浄前後での各スポットの蛍光強度（相対値）の平均値
をそれぞれ算出し、その変化率を求めてＤＮＡ残存量
（％）とし、これによりＤＮＡ断片の固定量を評価し
た。
【００６４】［比較例１、２］実施例１において、水溶
性増粘剤を溶解した水溶液の代わりに、２×ＳＳＣおよ
び蒸留水それぞれを用いてＤＮＡ断片の分散した水性液
を調製したこと以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断
片（プローブ）が固定された固相担体を作製した。次い
で、実施例１と同様にして、スポット再現性およびＤＮ
Ａ断片固定量の評価を行った。得られた結果をまとめて
表１に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】表１に示した結果から明らかなように、本
発明の方法に従って水溶性高分子物質や糖類を含有する
ＤＮＡ断片の水性液を用いて作製したＤＮＡ断片固定固
相担体（実施例１〜３）は、従来の方法に従って作製し
たＤＮＡ断片固定固相担体（比較例１、２）に比べて、
洗浄工程前においてスポットの蛍光強度のＣＶが１／２
〜１／３に著しく減少した。これにより、本発明の方法
では、点着が安定に行われ、スポット形状が円形に揃っ
ていて良好であり、スポットの再現性が高いことが分
る。そして、洗浄工程後におけるスポットのＣＶも、殆
ど変化（悪化）せず、再現性の高いスポットを形成保持
することができる。一方、従来の方法では、目視でもス
ポットの形状が丸くなく、不定形のスポットが存在する
ことが確認され、それがスポットのＣＶを大きくしてい
る一因となっている。
【００６７】また、本発明の方法で製造したＤＮＡ断片
固定固相担体のＤＮＡ固定量はいずれも、洗浄工程後
も、従来の方法に係る固相担体と同程度に多いことが明
らかである。このことから、増粘剤である水溶性高分子
物質や糖類はいずれも、ＤＮＡ断片の固相担体への固定
には実質的に関与していないことが分る。
【００６８】［実施例４〜６］イオン結合によるＤＮＡ
断片の固定、スポット再現性およびＤＮＡ断片固定量の
評価 実施例１において、共有結合タイプの固相担体（Ｂ）の
代わりにイオン結合タイプの固相担体（Ａ）を用いたこ
と、ＤＮＡ断片としてオリゴＤＮＡ(＋)の代わりに、同
じ塩基配列で５’末端のみがＣｙ５で修飾された４０me
rの(Ｃｙ５)オリゴＤＮＡ(−)を用意したこと、および
点着後、固相担体を温度２５℃、湿度７０％のモイスチ
ャーチャンバー内で１８時間放置する代わりに、温度８
０℃で１時間加熱処理した後、担体表面に１２０ｍＶで
紫外線（ＵＶ）照射を行ったこと以外は実施例１と同様
にして、ＤＮＡ断片が静電結合により固定された固相担
体を作製し、次いでスポット再現性およびＤＮＡ断片固
定量の評価を行った。
【００６９】［比較例３、４］実施例４において、水溶
性増粘剤を溶解した水溶液の代わりに、２×ＳＳＣおよ
び蒸留水それぞれを用いてＤＮＡ断片の分散した水性液
を調製したこと以外は実施例４と同様にして、ＤＮＡ断
片が固定された固相担体を作製し、次いでスポット再現
性およびＤＮＡ断片固定量の評価を行った。得られた結
果をまとめて表２に示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】表２に示した結果から明らかなように、Ｄ
ＮＡ断片を固相担体表面にイオン結合（静電結合）を介
して固定する際に、水溶性高分子物質や糖類などの増粘
剤を含有するＤＮＡ断片の水性液を用いて作製したＤＮ
Ａ断片固定固相担体（実施例４〜６）は、従来の方法に
従って作製したＤＮＡ断片固定固相担体（比較例３、
４）に比較すると、洗浄工程前においてスポットの蛍光
強度のＣＶが１／２〜１／３に著しく減少している。こ
れにより、本発明の方法では、点着が安定に行われ、ス
ポット形状が円形に揃っていて良好であり、スポットの
再現性が高いことが分る。なお、イオン結合は固相担体
表面への結合力が弱いため、その結合を補助していた増
粘剤を水洗除去すると、同時にＤＮＡ断片の脱落も発生
する。しかしながら、その増粘剤の水洗除去後であって
も、残存するＤＮＡ断片は、増粘剤を用いなかった場合
（比較例３、４）よりも多く、特に洗浄工程後のスポッ
トの蛍光強度のＣＶが共有結合と同じレベルまで低くな
っていることから、点着が安定に行われ、スポット形状
が円形に揃っていて、スポットの再現性が高いことが分
る。
【００７２】［実施例７〜９］ＤＮＡ分析用マイクロア
レイの作製および核酸断片試料の検出（１）共有結合に
よるＤＮＡ断片の固定 ＤＮＡ断片として、５’末端がアミノ基で修飾された４
０merのオリゴＤＮＡ(５’−ＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣ
ＴＡＧ−３’)(オリゴＤＮＡ(＋))、および５’末端が
アミノ基で修飾された５００ｂｐのｃＤＮＡ (ｃＤＮＡ
(＋))を用意した。別に、下記表３に示すように水溶性
増粘剤を溶解した各種の水溶液を調製し、これらの水溶
液にＤＮＡ断片を１×１０-6Ｍの濃度で分散して、ＤＮ
Ａ断片の水性液を調製した。これらのＤＮＡ断片の水性
液を、ＤＮＡ分析用マイクロアレイ作製装置を用いて、
実施例１で作製した共有結合タイプの固相担体（Ｂ）上
に、繰り返し５０回点着して、スポットを形成した。ま
た、ネガティブコントロールとして、ＤＮＡ断片が分散
していない水溶性増粘剤のみの水溶液を同様にして固相
担体の表面に点着した。点着後、固相担体を温度２５
℃、湿度７０％のモイスチャーチャンバー内において１
８時間放置した。さらに、固相担体を０．５Ｍグリシン
水溶液（ｐＨ８．５）中に１時間浸して、ＤＮＡ断片を
固相担体表面に結合固定した。
【００７３】（２）固相担体の洗浄 これらの固相担体を沸騰水に３分間浸漬して、水溶性増
粘剤を除去した。その後直ちに、固相担体を氷冷したエ
タノールに浸漬し、室温で乾燥して、ＤＮＡ断片が固定
された固相担体（ＤＮＡ分析用マイクロアレイ、Ｂ’）
を得た。
【００７４】（３）ハイブリダイゼーション 核酸断片試料として、上記のオリゴＤＮＡ (オリゴＤＮ
Ａ(＋))に対して相補的な塩基配列を部分的に有し、か
つｃＤＮＡ (ｃＤＮＡ(＋))と相補的であって５’末端
がＣｙ５で修飾された５００ｂｐのＤＮＡ断片を用意し
た。このＤＮＡ断片試料をハイブリダイゼーション用溶
液（４×ＳＳＣと１０重量％のＳＤＳ水溶液との混合溶
液）２０μＬに分散した分散液を、９０℃で３分間加
熱、冷却した後、前記スポット装置を用いて上記のＤＮ
Ａマイクロアレイ（Ｂ’）に点着した。表面を顕微鏡用
カバーガラスで保護した後、モイスチャーチャンバー内
にて６０℃で、２０時間インキュベートした。次いで、
ＤＮＡ分析用マイクロアレイを、室温の０．１重量％Ｓ
ＤＳ水溶液と２×ＳＳＣとの混合溶液で２回、５０℃の
０．２×ＳＳＣで１回、および室温の蒸留水で１回順次
洗浄した。次に、ＤＮＡマイクロアレイを６００ｒｐｍ
で２０秒間遠心して水分を除いた後、室温で乾燥した。
【００７５】（４）核酸断片試料の検出およびスポット
再現性の評価 得られた各ＤＮＡ分析用マイクロアレイについて、スポ
ット部分の蛍光強度を前記蛍光スキャニング装置で測定
し、標識したＤＮＡ断片試料を検出した。各スポットの
蛍光強度（相対値）の平均値を求めた。また、スポット
の蛍光強度（相対値）の変動係数ＣＶ（％）（Ｎ＝５
０）を求め、これによりスポット再現性の評価を行っ
た。
【００７６】［比較例５、６］実施例７において、水溶
性増粘剤を溶解した水溶液の代わりに、２×ＳＳＣおよ
び蒸留水それぞれを用いてＤＮＡ断片の分散した水性液
を調製したこと以外は実施例７と同様にして、ＤＮＡ断
片が固定された固相担体（ＤＮＡマイクロアレイ）を作
製し、次いで、核酸断片試料の検出およびスポット再現
性の評価を行った。得られた結果をまとめて表３に示
す。
【００７７】
【表３】
【００７８】表３に示した結果から明らかなように、本
発明の方法に従って水溶性高分子物質や糖類を含有する
ＤＮＡ断片の水性液を用いて作製したＤＮＡマイクロア
レイ（実施例７〜９）は、従来の方法に従って作製した
ＤＮＡマイクロアレイ（比較例５、６）に比べて、オリ
ゴＤＮＡを固定した場合、ｃＤＮＡを固定した場合のい
ずれにおいても、蛍光強度が高く、かつスポットのＣＶ
が１／３〜１／２に著しく減少した。これにより、本発
明の方法では、点着が安定に行われ、スポット形状が円
形に揃っていて良好であり、スポットの再現性が高いこ
とが分る。その結果として、本発明の方法で製造したＤ
ＮＡ分析用マイクロアレイによれば、ＤＮＡ断片試料を
より高い精度で検出できることが明らかである。
【００７９】また、蛍光強度は水溶性増粘剤の種類によ
って大きな差はなく、ネガティブコントロールの蛍光強
度も０であった。このことから、増粘剤の水溶性高分子
物質や糖類は、いずれも洗浄により除去されて、ＤＮＡ
断片の固相担体への固定には実質的に関与していないと
ともに、ハリブリダイゼーションを阻害してその効率を
低下させることがないこと、および試料の検出に悪影響
を及ぼさないことが分る。
【００８０】［比較例７〜９］実施例７において（２）
の固相担体の洗浄、すなわち固相担体を沸騰水に３分間
浸漬する処理を行わなかったこと以外は実施例７と同様
にして、ＤＮＡ断片が固定された固相担体（ＤＮＡ分析
用マイクロアレイ）を作製し、次いで、ＤＮＡ断片試料
の検出およびスポット再現性の評価を行った。得られた
結果を、実施例７〜９の結果とともにまとめて表４に示
す。
【００８１】
【表４】
【００８２】表４に示した結果から明らかなように、本
発明の方法に従って固相担体を洗浄して水溶性増粘剤を
除去した場合（実施例７〜９）にはいずれも、固相担体
を洗浄しないで増粘剤の除去を行わなかった場合（比較
例７〜９）に比べて、蛍光強度が高く、スポットの再現
性も良好である。特に、増粘剤が水溶性高分子物質であ
るとき、蛍光強度が顕著に高く、スポットの再現性も極
めて良く、より高い精度で試料を検出することができ
る。
【００８３】一方、洗浄しなかった場合には、ネガティ
ブコントロールのスポットでも蛍光が検出され（比較例
７、８）、高い精度での検出を妨げている。なお、ネガ
ティブコントロールの蛍光強度が０とならなかったの
は、水溶性高分子物質自体による蛍光と、標識したＤＮ
Ａ試料が水溶性高分子物質に非特異的に吸着したためと
考えられる。
【００８４】
【発明の効果】本発明のＤＮＡ分析用のマイクロアレイ
の製造法で利用するプローブ分子の固定方法によれば、
プローブ分子の水性液に除去可能な水溶性増粘剤を添加
することにより、固相担体表面にこの水性液を点着した
際にスポットを安定化させ、その形状や大きさを揃えて
スポット再現性を顕著に改善することができる。増粘剤
はプローブ分子の固定後には実質的に除去されるので、
ハイブリダイゼーションの際にプローブとＤＮＡ断片試
料との接触を妨げることがなく、ハイブリダイゼーショ
ンの効率が低下しない。同時に、バックグランドの蛍光
強度を大幅に元首させることができる。従って、本発明
の方法で製造されたＤＮＡ分析用マイクロアレイを用い
ることにより、総合的に、ＤＮＡ断片試料の検出精度を
顕著に高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイ技術の全体像の模式図で
ある。
【図２】ハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロア
レイの拡大模式図である。
【符号の説明】
１１ データベース １２ クローンコレクション ２１ ＤＮＡコレクション ３１ ＤＮＡマイクロアレイ ３１ａ 固相担体 ３１ｂ ＤＮＡ断片 ４１ 検体 ５１ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ ５２ ｃＤＮＡ又はターゲットＤＮＡ ５３ 標識したターゲット核酸 ５３ａ 標識物質 ６１ ハイブリッドＤＮＡが形成されたＤＮＡマイクロ
アレイ ７１ 画像データ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 (72)発明者 久原 哲 福岡県福岡市南区桧原７−31−17 (72)発明者 田代 康介 福岡県福岡市東区名島４丁目40−27 (72)発明者 牟田 滋 福岡県福岡市東区原田２丁目16−４ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 CA20 HA12 HA20 4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 FA15

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 表面に反応性基を有する固相担体の上
    に、該反応性基と反応して共有結合を形成することので
    きる反応性基を備えた、核酸断片、オリゴヌクレオチド
    もしくはＰＮＡから選ばれるプローブ分子を含み、かつ
    増粘剤の添加により所定の粘度にまで増粘された水性液
    を点着する工程；該水性液の点着が行なわれた固相担体
    をインキュベートして、該基板表面にて共有結合反応を
    生起させる工程；そして、 該基板表面を水性媒体で水洗して、増粘剤を固相担体表
    面から除去する工程を含む、ＤＮＡ分析用マイクロアレ
    イの製造方法。
  2. 【請求項２】 固相担体に点着される水性液の粘度が２
    〜５０ｍＰａ・Ｓの範囲にある請求項１に記載のＤＮＡ
    分析用マイクロアレイの製造方法。
  3. 【請求項３】 増粘剤が水溶性ポリマーである請求項１
    もしくは２に記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造
    方法。
  4. 【請求項４】 固相担体表面の反応性基がスルホニルビ
    ニル基であり、プローブ分子に備えられた反応性基がア
    ミノ基である請求項１乃至３のうちのいずれかの項に記
    載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  5. 【請求項５】 固相担体表面のスルホニルビニル基が、
    基板表面に予め付設されていたアミノ基にジビニルスル
    ホン誘導体を反応させることにより形成されたスルホニ
    ルビニル基である請求項４に記載のＤＮＡ分析用マイク
    ロアレイの製造方法。
  6. 【請求項６】 固相担体表面を水洗する水性媒体が界面
    活性剤を含んでいる請求項１乃至５のうちのいずれかの
    項に記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  7. 【請求項７】 固相担体表面の二以上の所定領域に、そ
    れぞれが所定の粘度となるように増粘された水性液を点
    着することを特徴とする請求項１乃至６のうちのいずれ
    かの項に記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方
    法。
  8. 【請求項８】 二以上の所定領域に点着される水性液の
    粘度が互いに等しいことを特徴とする請求項７に記載の
    ＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  9. 【請求項９】 請求項１乃至８のうちのいずれかの項に
    記載の方法で製造されたＤＮＡ分析用マイクロアレイ。
  10. 【請求項１０】 表面に荷電性基を有する固相担体の上
    に、該荷電性基に静電結合することのできる荷電性基を
    備えた、核酸断片、オリゴヌクレオチドもしくはＰＮＡ
    から選ばれるプローブ分子を含み、かつ増粘剤の添加に
    より所定の粘度にまで増粘された水性液を点着する工
    程；該水性液の点着が行なわれた固相担体をインキュベ
    ートして、該プローブ分子を該基板表面に静電結合させ
    る工程；そして、 該基板表面を水性媒体で水洗して、増粘剤を固相担体表
    面から除去する工程を含むＤＮＡ分析用マイクロアレイ
    の製造方法。
  11. 【請求項１１】 固相担体に点着される水性液の粘度が
    ２〜５０ｍＰａ・Ｓの範囲にある請求項１０に記載のＤ
    ＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  12. 【請求項１２】 増粘剤が水溶性ポリマーである請求項
    １０もしくは１１に記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイ
    の製造方法。
  13. 【請求項１３】 固相担体表面の荷電性基がアミノ基で
    あり、プローブ分子に備えられた荷電性基がリン酸基で
    ある請求項１０乃至１２のうちのいずれかの項に記載の
    ＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  14. 【請求項１４】 固相担体表面のアミノ基が、基板表面
    のアミノシランカップリング剤もしくはポリ陽イオンに
    よる処理により導入されたアミノ基である請求項１３に
    記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  15. 【請求項１５】 固相担体表面を水洗する水性媒体が界
    面活性剤を含んでいる請求項１０乃至１４のうちのいず
    れかの項に記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方
    法。
  16. 【請求項１６】 固相担体表面の二以上の所定領域に、
    それぞれが所定の粘度となるように増粘された水性液を
    点着することを特徴とする請求項１０乃至１５のうちの
    いずれかの項に記載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製
    造方法。
  17. 【請求項１７】 二以上の所定領域に点着される水性液
    の粘度が互いに等しいことを特徴とする請求項１６に記
    載のＤＮＡ分析用マイクロアレイの製造方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１０乃至１７のうちのいずれか
    の項に記載の方法で製造されたＤＮＡ分析用マイクロア
    レイ。
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