JP4272800B2 - 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、二種類以上の互いに異なる試料に発現している遺伝子のその発現量を検出するために有用なデファレンシャル・ハイブリダイゼーション(differential hybridization)技術に関する。
【0002】
【従来の技術】
細胞や組織における遺伝子発現態様の解析は、種々の状態の細胞や組織からmRNAを調製し、調製したmRNAをメンブレン上に固定し、mRNAの特異的プローブを用いてハイブリダイゼーションを行うノーザンブロット解析法もしくはドットブロット解析法、または各遺伝子に特異的なプライマ(PCR法において、DNA合成酵素がDNAの複製開始に必要とする20塩基程度の短いDNA断片)を用いるRT−PCR法(逆転写反応とPCR法を組み合わせた方法)によって行われてきた。一方、生命現象に関わる遺伝子研究の進展により解析に供する遺伝子数が急速に増加し、さらにゲノムプロジェクトの進行に伴って各生物が保持する全遺伝子が明らかになるにつれて、多数の遺伝子の挙動を一度に解析する必要性が高まっている。
【0003】
DNAマイクロアレイ法は、ゲノム構造が解析された後に必須となるゲノム機能の大量で迅速な解析を可能にする手段として注目されている。この方法では、スライドガラス等の担体上に高密度に整列化しているDNA断片に対して、標識した核酸断片をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの解析は、その標識方法によって異なるが、蛍光法、ラジオアイソトープ法、電気化学的な方法等によるのが一般的である。電気化学的な方法として、特開平9−288080号公報に、DNAマイクロアレイ(DNA断片が担体上に高密度に整列化してなるもの)および電気化学活性縫い込み型インターカレータを用いて、試料DNA断片を検出する方法が開示されている。
【0004】
米国特許第5800992号には、二蛍光標識法を用いる遺伝子発現解析の技術が開示されている。この原理は、互いに異なる二つの試料中の特定遺伝子(mRNAもしくはmRNAを転写したcDNA)を互いに異なる蛍光物質で標識し、その標識遺伝子を用いてDNAマイクロアレイ上で競合的にハイブリダイゼーションを行い、両者の蛍光を測定し比較することによって、互いに異なる二つの試料中の遺伝子の発現の差を検出するものである。この技術は、同一スポット上で競合するハイブリダイズに係るシグナルを検出するので、相対的比較ができる点で極めて有効である。二蛍光標識法を用いる遺伝子発現解析の技術は、その他多数の文献(P.Brown et al., Nature Genetics Supplement, 21, 1999, 33-37、細胞工学 Vol.18, No.4, 1999, 541-549、および実験医学 Vol.17, No.11, 1999, 1362-1366)にも報告があるが、これらは、何れも蛍光法を用いるものである。しかし、蛍光法では、励起光による褪色が起こりやすいという問題点を有する。この問題点を克服するべく、現在では、蛍光法でこれまで一般的に使用されてきたフルオロセインに代えて、褪色が起こりにくいCy色素が使用されている。しかし、Cy色素は極めて高価であるという問題点を有し、今後、価格を含めた機器の改善と方法の改良が必要である。
【0005】
二蛍光標識法ではないが、DNAマイクロアレイ法の応用例として、DNAのように負電荷を持たず、かつDNA(もしくはRNA)を模倣した分子であるPNA(peptide nucleic acid)を用いる方法が知られている。
【0006】
PNAは、いわゆるアンチセンス分子の一つとして知られているものである。アンチセンス分子は、遺伝子が発現する際に、一本鎖になるDNAの塩基配列の転写領域もしくはRNAの塩基配列の翻訳領域に高選択的に結合して、その領域の機能を制限するように働く分子であり、遺伝子治療の分野ではアンチセンス医薬品として知られている。PNAは、核酸と同様にその分子中に核酸塩基を有し、相補的な塩基配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズして二本鎖を形成する(P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991))。PNAは、機能的には核酸とほとんど変わりないが、その構造は全く異なり、N−(2−アミノエチル)グリシンを単位とするポリアミドを基本骨格としており、その分子中に糖およびリン酸を含まない。核酸塩基は、ポリアミド骨格に、通常、メチレンカルボニル基を介して結合している。下記に、PNAの代表的な構造をDNAの構造と共に示す。
【0007】
【化1】
【0008】
PNAは、電気的には中性であり、塩の存在しない条件下でも荷電することがない。PNAの有する機能は核酸のそれとほとんど同じと言っても、PNAと核酸とで形成される二本鎖は、DNAと核酸とで形成される二本鎖よりも安定であり、核酸の塩基配列をより厳密に認識できるという特徴を持つ(杉本直巳、日本化学会第74回春季大会要旨集、1287頁)。そのため、PNAは、アンチセンス医薬以外にも各種診断薬への応用が期待されている分子である(特表平6−509063号の明細書)。
【0009】
特開平11−332595号公報には、固相担体表面にPNA断片をその一端部にて固定してなるPNAマイクロアレイ、およびPNAマイクロアレイを用いるDNA断片の検出方法が開示されている。このPNAマイクロアレイは、アビジン−ビオチン法によって、表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の測定チップにPNA断片を固定させたものである。PNAマイクロアレイを用いたDNA断片の検出は、表面プラズモン共鳴シグナルを測定することによって行なわれている。また、PNAマイクロアレイ、およびラジオアイソトープで標識した試料DNA断片を用いて、相補性を有する試料DNA断片を検出する方法も知られている(P.E.Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500(1991))。上記のアビジン−ビオチン法および上記のラジオアイソトープ法では、何れも、PNA断片と試料DNA断片との間に生じる電気的反発が少なくなるため、検出感度を向上させることができる。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、互いに異なる二種類以上の試料中にそれぞれ存在する試料核酸断片の量を、DNA分析素子を用いて電気化学的に検出する方法を提供することを、その課題とする。本発明は、また、DNA分析素子の代わりに、PNA分析素子を用いて該試料核酸断片の存在量を電気化学的に検出する方法を提供することをも、その課題とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】
〈DNA分析素子を用いる方法〉
本発明は、(1)導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するDNA断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に0乃至800mVの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が50mV以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程;(2)導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のDNA断片が導電性基板の表面に固定されてなるDNA分析素子に接触させる工程;(3)該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程;そして、(4)各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法にある。
【0012】
本発明の、DNA分析素子を用いる検出方法の好ましい特徴は以下の通りである。
(イ)導電性基板の表面がポリ陽イオンまたは反応性基を有するシランカップリング剤で被覆されており、既知の塩基配列を有するDNA断片が末端に反応性基を有し、ポリ陽イオンの陽イオンまたはシランカップリング剤の反応性基とDNA断片の末端の反応性基とが共有結合を形成することにより、既知の塩基配列を有するDNA断片を導電性基板の表面に固定する。
(ロ)電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【0013】
〈PNA分析素子を用いる方法〉
本発明は、また、(1)導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するPNA断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に0乃至800mVの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が50mV以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程;(2)導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のPNA断片が導電性基板の表面に固定されてなるPNA分析素子に接触させる工程;(3)該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程;そして、(4)各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法にもある。
【0014】
本発明の、PNA分析素子を用いる検出方法の好ましい特徴では、電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行う。
【0015】
【発明の実施の形態】
図1に、本発明の代表的な検出方法を模式的に示す。互いに異なる試料a(1a)および試料b(1b)に存在している試料核酸断片(2)を、それぞれ、酸化還元電位が互いに異なる導電性物質(3a)、導電性物質(3b)で標識する。そして、導電性物質(3a)が結合した試料核酸断片(4a)を含む標識試料溶液と導電性物質(3b)が結合した試料核酸断片(4b)を含む標識試料溶液とを混合し、その混合試料溶液をDNA分析素子(5)上の一つの領域(6)に接触させることにより、DNA分析素子上に固定されているDNA断片(7)と標識試料核酸断片(4a)とのハイブリッドDNA、および該DNA断片と標識試料核酸断片(4b)とのハイブリッドDNAを形成させる。
ここで、「DNA分析素子」は、導電性基板の表面に多数のDNA断片がその一端部にて固定されてなる素子を表す。DNAマイクロアレイが、一般的に、複数のDNA断片が固定された領域が複数個整列したものを意味するのと異なり、本明細書におけるDNA分析素子では、図1に示すように該領域の数が複数であっても、あるいは一つであってもよい。
次いで、領域(8)における、導電性物質(3a)と導電性基板との間を流れる電流量、および導電性物質(4a)と導電性基板との間を流れる電流量を、それぞれ、導電性物質(3a)が有する酸化還元電位、導電性物質(4a)が有する酸化還元電位にて測定することにより、領域(8)における標識試料核酸断片(4a)の存在量と標識試料核酸断片(4b)の存在量との比を検出することができる。領域(8)における存在量比は、試料a中の標識前の試料核酸断片の存在量と試料b中の標識前の試料核酸断片の存在量との比を示す。尚、導電性物質(3a)が有する酸化還元電位とは、導電性物質(3a)で標識された試料核酸断片(4a)が示す、極大電流値を与える酸化還元電位の値をいう。
【0016】
本発明の検出方法では、DNA分析素子に固定されているDNA断片と完全な相補性を有する試料核酸断片であって、同一の塩基配列を有する試料核酸断片を対象とする。試料aおよび試料bには、何れも、複数の種類の試料核酸断片が存在していてもよいが、複数の種類の試料核酸断片の内で、特定のDNA断片と完全相補する試料核酸断片は一種類しか存在しないものとし、その試料核酸断片の塩基配列は完全に同一であることとする。互いに異なる試料は、三種類以上の試料であってもよいが、各試料に存在している試料核酸断片の性質は、上記と同様である。
【0017】
以下、DNA分析素子を用いる検出方法を中心に説明するが、特に断らない限りPNA分析素子を用いる場合についても同様とする。本明細書において用いる用語を次のように定義する。
「PNA断片」には、合成によって得られたPNAを切断等の操作により断片化したものを含まない。
「ハイブリッドDNA」とは、DNA分析素子上に固定されたDNA断片と標識試料核酸断片とで形成される二本鎖断片を、「ハイブリッドPNA」とは、PNA分析素子上に固定されたPNA断片と標識試料核酸断片とで形成される二本鎖断片をいう。
「導電性基」とは、一つ以上の結合手を有する導電性物質をいう。試料核酸断片に結合している状態の導電性物質を導電性基とする。
「存在」とは、試料中に試料核酸断片が含まれている状態をいい、遺伝子の発現を含む。
【0018】
[導電性基板]
導電性基板としては、疎水性(あるいは低親水性)の導電性基板、または疎水性(あるいは低親水性)の電気絶縁性の担体上に複数の疎水性(あるいは低親水性)の導電性基板が設けられてなる基板であることが好ましい。導電性の疎水性基板および電気絶縁性の疎水性担体は、何れも、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。
電気絶縁性の担体の材質としては、何れも、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールAのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルタ等の多孔質物質などを挙げることができるが、各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。電気絶縁性の担体の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、100乃至10000μmの範囲にあることが好ましい。
疎水性の導電性基板としては、電極、光ファイバ、フォトダイオード、サーミスタ、ピエゾ素子、表面弾性波素子なども好ましく用いることができるが、電極を用いることが特に好ましい。電極の材料としては、グラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、金、パラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Si、Ge、ZnO、CdS等の半導体電極、チタンなどの電子伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカーボンを用いることがが特に好ましい。これらの電子伝導体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子膜によって被覆されていてもよい。
【0019】
導電性基板としては、疎水性の電気絶縁性の担体上に、複数の疎水性の導電性基板が設けられてなる基板を用いることが特に好ましい。このとき、導電性基板は、互いに接しないように、かつ規則的に電気絶縁性の担体上に配置されていることが好ましい。電気絶縁性の担体上に導電性基板を設ける前に、電気絶縁性の担体上に、電荷を有する親水性の高分子物質からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって該担体の凹凸を軽減することができる。また、担体の種類によっては、その担体中に電荷を有する親水性の高分子物質を含ませることも可能であり、このような処理を施した担体も好ましく用いることができる。
【0020】
電気絶縁性の担体上に複数の電極が配置されたものとしては、文献(Sosnowski,R.G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 1119-1123(1997))に記載の、核酸断片が未固定のシリコンチップも好ましく用いることができる。また、プリント配線導電性基板のように、電極が導電性基板上に印刷されてなるものであってもよい。
【0021】
[DNA断片]
DNA断片としては、導電性基板表面に二本鎖のDNA断片を固定した後、一方の鎖のみを固定させる処理を施したもの、あるいは固定前に二本鎖のDNA断片を一本鎖のDNA断片としたものであることが好ましい。また、DNA断片としては、合成オリゴヌクレオチドあるいは導電性基板表面で直接合成して得られたオリゴヌクレオチドであることも好ましい。
【0022】
二本鎖のDNA断片を固定させるためには、一般的に、導電性基板表面に該DNA断片の固定のための反応性基(反応性基D1とする。)を導入することが好ましい。反応性基D1は、導電性基板表面をポリ陽イオン(例えば、ポリ−L−リシン、ポリエチレンイミンもしくはポリアルキルアミンであることが好ましく、ポリ−L−リシンであることが特に好ましい)で被覆処理することによって導入されたものであっても、または反応性基D1を有するシランカップリング剤を導電性基板表面に接触させることによって導入されたものであることが好ましい。反応性基D1としては、アミノ基、メルカプト基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基もしくは水酸基であることが特に好ましい。アミノ基を有するシランカップリング剤としては、具体的には、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、N−β(アミノエチル)γ−アミノプロピルトリメトキシシランおよびN−β(アミノエチル)γ−アミノプロピルメチルジメトキシシランを挙げることができ、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【0023】
二本鎖のDNA断片は、mRNAに対してRT(reverse transcription)法によって得たcDNA断片をベクターに組み込んだもの(cDNAのライブラリ)をテンプレートとしてPCR法によって増幅して調製することが好ましい。
一本鎖のcDNA断片をPCR法により増幅して得られる二本鎖のcDNA断片は、一方の鎖がその末端部に反応性基(反応性基D2とする。)を持ち、かつ他方の鎖が反応性基を持たないものであり、これは、二種類のプライマ(反応性基D2を5’末端に有するプライマと反応性基を有しないプライマ)を用いて調製することができる。このような反応性基D2としては、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。
【0024】
固定は、PCR法によって得られた二本鎖のcDNA断片の一方の鎖の末端部(好ましくは、5’末端)に有する反応性基D2と導電性基板表面に導入された反応性基D1との共有結合によって行うことが好ましい。反応性基D1と反応性基D2との共有結合は、スペーサを介して行ってもよい。cDNA断片の塩基数は、3乃至100000の範囲にあることが好ましく、3乃至10000の範囲にあることがより好ましく、50乃至1000の範囲にあることが特に好ましい。導電性基板表面に固定した二本鎖のcDNA断片を解離させる変性処理の方法としては、公知の方法を用いることができる。変性処理によって、反応性基D2を有する鎖が固定される。
また、特願平9−288080号公報に記載の、導電性基板として、金で蒸着処理されているものやグラシーカーボンが塗布されているものを用いる固定方法も好ましい。
【0025】
DNA断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましく、その塩基種も既知であることが好ましい。DNA分析素子が複数の領域を有するものである場合には、導電性基板表面に区画された複数の領域のそれぞれに、互いに異なる塩基配列を有するDNA断片を固定させることもできるが、その場合、DNA断片としては、複数の種類のものを用いることができる。
【0026】
DNA断片の固定は、DNA断片が溶解あるいは分散されてなる水性液を導電性基板上に点着して行うことが好ましい。DNA断片を含む水性液中には、その水性液の粘性を高める添加剤を含有させてもよい。このような添加剤としては、ショ糖、ポリエチレングリコール、グリセロール等を挙げることができる。点着後、所定の温度でそのまま数時間放置するとDNA断片が固定される。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、汎用されているDNAチップ作製装置に装備されたスポッタを用いて行うこともできる。点着後は、インキュベーションを行ってもよい。インキュベート後、未固定のDNA断片を洗浄して除去することが好ましい。上記のようにして作製したDNA分析素子の寿命は、通常、数日間乃至数週間の範囲にある。
【0027】
[PNA断片]
本発明で好ましく用いられるPNA断片は、下記一般式(I)で表される化合物である。
【0028】
【化2】
【0029】
式中、B11は、リガンドであって、天然の核酸塩基(A、T、C、G、IもしくはU)あるいは塩基類似体を表す。B11は、天然に見出される位置、即ち、アデニン、グアニンもしくはイノシンを含むプリンについては、9位において、チミン、ウラシルもしくはシトシンを含むピリミジンについては、1位において結合している。塩基類似体とは、天然に存在しない核酸塩基に類似の有機塩基をいい、プリン環やピリミジン環の一部がCからNへ、もしくはNからCへ置換された化合物、またはプリン環やピリミジン環の一部に新たな修飾を施された化合物(スルフヒドリル基やハロゲン原子が導入された化合物)をいう。また、B11は、核酸塩基を含まない芳香族部分、炭素原子数が1乃至4のアルカノイル基、水酸基あるいは水素原子であってもよい。塩基類似体としては、7−デアザアデニン、6−アザウラシルおよび5−アザシトシンを挙げることができる。
典型的な核酸塩基リガンドおよび例示的合成リガンドについては、WO92/20702に図示されており、5−プロピルチミンおよび3−デアザウラシルは、DNA断片への結合親和性を増加させることが知られている(特開平11−236396号公報)。他の有用な天然にない核酸塩基としては、6−チオグアニンやピラゾロ[4,3d]−ピリミジンが有用である(国際出願PCT/US92/04795)。
さらに、B11は、DNAインターカレータ、レポーターリガンド(例えば、フルオロフォア)、ハプテンやビオチンのタンパク質標識、スピン標識、あるいは放射性標識であってもよい。
B11は、核酸塩基(A、T、C、GもしくはU)であることが特に好ましい。
【0030】
R11は、水素原子、もしくは天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基としては、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が6乃至20のアリール基、炭素原子数が1乃至6のアルキル基を含む炭素原子数が7乃至26のアラルキル基、炭素原子数が6乃至20のヘテロアリール基、水酸基、炭素原子数が1乃至6のアルコキシ基、炭素原子数が1乃至6のアルキルチオ基、−NR13R14基、−SH基、および炭素原子数が1乃至6のアルキル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。炭素原子数が1乃至6のアルキル基は、さらに、水酸基、炭素原子数が1乃至6のアルコキシ基もしくは炭素原子数が1乃至6のアルキルチオ基で置換されていてもよい。R13およびR14は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が1乃至3のアルキル基、炭素原子数が1乃至3のアルコキシ基、炭素原子数が1乃至3のアルキルチオ基および水酸基からなる群より選ばれる原子もしくは水酸基を表す。天然のα−アミノ酸の側鎖を表す基は、R11が結合している炭素原子の水素原子と一緒になって脂環あるいは複素環を形成していてもよい。
【0031】
L11は、連結基を表し、−CO−基もしくは−CO−NR12−基であることが好ましく、−CO−基であることが特に好ましい。R12は、水素原子、炭素原子数が1乃至4のアルキレン基、水酸基、炭素原子数が1乃至4のアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素原子数が1乃至4のアルキレン基、炭素原子数が1乃至4のアルコキシ基およびアミノ基は、何れも炭素原子数が1乃至4のアルキル基、炭素原子数が1乃至4のアルコキシ基もしくは水酸基で置換されていてもよい。
【0032】
dは、1乃至60の整数を表す。dは、1乃至40の整数であることが好ましい。a、bおよびcは、それぞれ独立に0乃至5の整数を表す。a、bおよびcは、何れも1であることが好ましい。
【0033】
本発明で用いるPNA断片は、下記一般式(II)で表される化合物であることが特に好ましい。式中、B11およびdは、それぞれ、上記一般式(I)のB11、dを表す。
【0034】
【化3】
【0035】
PNAは、ペプチドと同様に液相法や固相法によって合成することができ、合成されたものは市販もされている。PNAの合成法については、特表平6−509063号の明細書、米国特許2758988号の明細書、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1987(1992)、P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 9677-9678(1992)などに詳細が記載されている。
【0036】
[ハイブリダイゼーション]
ハイブリダイゼーションは、DNA分析素子に、互いに異なる二種類以上の、標識試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる標識試料溶液を接触させることによって実施する。互いに異なる二種類以上の標識試料溶液は、混合したものを接触させる。混合の割合は、特にその割合を問わないが、通常等量である。
ハイブリダイゼーションは、室温乃至70℃の温度範囲で、そして0.5乃至20時間の範囲で実施することが好ましいが、導電性基板に固定するDNA断片の鎖長、試料核酸断片の種類などに応じて、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定することが望ましい。例えば、遺伝子発現の解析を目的とする場合には、低発現の遺伝子も充分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後は、洗浄を行い、未反応の標識試料核酸断片を除去することが好ましい。
【0037】
[標識試料核酸断片]
試料核酸断片としては、生物試料に存在しているmRNAもしくはmRNAを逆転写反応させることによって得られるcDNA断片を用いることが好ましい。標識試料核酸断片は、試料核酸断片の一方の末端部(もしくは末端部付近)に導電性物質を結合させることによって調製することができる。その調製方法については、文献(S.Takenaka et al., Analytical Biochemistry, 218, 436-443(1994))に詳細が記載されている。標識試料核酸断片は、試料核酸断片に、導電性基を結合させたdNTPを逆転写反応により取り込ませることによって調製することもできる。さらに、試料核酸断片に、アミノアリル基を結合させたdNTPを逆転写反応により取り込ませて、複数のアミノ基を有するcDNA断片に導き、次いで、導電性物質の活性体をこれらのアミノ基と反応させる方法によって、標識試料核酸断片を調製する方法も知られている。この方法は、導電性物質を結合させたdNTPの取り込み率が低いことに比べ、多数の導電性物質を取り込むことができる点で優れた方法である。上記前者の、導電性基を結合させたdNTPを取り込ませる方法、およびアミノアリル基を結合させたdNTPを取り込ませる方法では、何れも、互いに異なる試料核酸断片への取り込み率は同一であることが好ましい。
【0038】
[導電性物質]
互いに異なる二種類以上の試料中に含まれる試料核酸断片は、それぞれ、互いに異なる導電性物質で標識する。互いに異なる導電性物質とは、試料核酸断片に結合していない状態で導電性物質そのものが与える極大電流値を比較したとき、極大電流値を与える酸化還元電位が互いに異なるような物質をいう。但し、互いに異なる導電性物質であって、その当量(モル)の導電性物質が与える極大電流値は同一の値を示すことが好ましい。極大電流値である必要はないが、極大電流値を与える酸化還元電位を比較することが望ましい。互いに異なる酸化還元電位は、酸化還元電位が何れも0乃至800mVの範囲にあることが好ましく、互いの酸化還元電位の差が50mV以上であることが好ましい。
【0039】
導電性物質の具体例を以下に示す。導電性物質としては、有機金属化合物と金属原子を含まないが導電性を有する物質とを挙げることができる。結合手については省略する。
【0040】
有機金属化合物としては、配位子から中心金属原子の電子供与に加えて、中心金属原子の軌道から配位子の原子の空軌道へ電子がπ結合を通じて供与されるタイプのπ錯体を用いることが好ましい。また、有機金属化合物としては、繰り返し単位どうしが配位結合によって結合している配位高分子も好ましく用いることができる。π錯体は、金属原子に対する配位が、単座配位、二座配位、多座配位もしくは架橋配位の何れの配位によるものであってもよい。π錯体の具体例としては、下記式に示すメタロセン錯体をあげることができる。Mは、金属原子を表す。
【0041】
【化4】
【0042】
上記式で表されるメタロセン錯体の金属原子は、Fe、Ni、Co、Mo、Zn、Cr、Tl、Ta、Ti、Cu、Mn、W、V、RuもしくはOsであることが好ましく、Fe、Co、Ni、Ru、Os、VもしくはCrであることがさらに好ましく、Feであることが特に好ましい。
【0043】
π錯体としては、下記式で表されるシクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、フェナントロリン錯体、ビピリジン錯体もしくはトリフェニルホスフィン錯体も好ましく用いることができる。
【0044】
【化5】
【0045】
【化6】
【0046】
ビピリジン錯体としては、[Pd(bpy)2]2+、[CoCl2(bpy)2]+、[Fe(bpy)3]n、もしくは[Cr(bpy)3]nであることが好ましい。但し、bpyは2,2’−ビピリジンを表し、nは、−1乃至3の整数を表わす。トリフェニルホスフィン錯体としては、CoCH3(PPh3)3、CoH(N2)(PPh3)3、RuH2(PPh3)4もしくはRhH(PPh3)4であることが好ましい。Phは、フェニル基を示す。
【0047】
導電性物質としては、クロロクルオロヘム、クロロフィリド、クロロフィル、ヘム、ビタミンB12等のポルフィリン系錯体も好ましく用いることができる。
【0048】
金属原子を含まない導電性物質としては、下記式で表されるビオロゲン、2,2’−ビピリジン、1,10−フェナントロリン、カテコールアミン等を挙げることができる。但し、RA、RBは、互いに独立に、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が1乃至6のアルコキシ基、炭素原子数が6乃至12のアリール基、並びにN、OおよびSからなる群より選ばれるヘテロ原子を1乃至4個含む炭素原子数が2乃至12の複素環基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。上記のアルキル基、アルコキシ基、アリール基および複素環基は、何れも炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が1乃至6のアルコキシ基および炭素原子数が6乃至10のアリール基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。RA、RBは、何れも、炭素原子数が1乃至6のアルキル基もしくは炭素原子数が6乃至12のアリール基であることがさらに好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。
【0049】
【化7】
【0050】
【化8】
【0051】
導電性物質は、置換基を有していてもよい。特定の構造を持つ導電性物質を主骨格とした場合、酸化還元電位の相違は、その導電性物質が有する置換基の性質に依存することが多い。従って、互いに異なる導電性物質としては、上記の導電性物質を主骨格として、その主骨格に互いに異なる性質の置換基が結合してなるものを用いることが、調製の簡便さの点からも好ましい。上記置換基は、試料核酸断片と結合する際に、結合手となる二価の基を含むものであることが特に好ましい。置換基の数が複数の場合には、その内の一つが結合手となる二価の基を含むものであることが好ましい。
【0052】
結合手となる二価の基を含む置換基を有する導電性物質の好ましい具体例を下記式(III)に示す。結合手となる二価の基とは、−X−、−Y−もしくは−X−Y−をいう。−X−および−Y−の内何れか一方は単結合であってもよい。。−X−の左側に核酸断片が結合する。
【0053】
【化9】
【0054】
上記式中、Xは、試料核酸断片との縮合反応によって形成される基を表す。Yは、単結合、置換基を有していてもよい炭素原子数が1乃至6のアルキレン基、あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が1乃至6のアルケニレン基を表す。炭素原子数が1乃至6のアルキレン基としては、メチレン基もしくはエチレン基であることが好ましい。
置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、炭素原子数が1乃至6のアルキル基、炭素原子数が1乃至6のアルキルアミノ基、炭素原子数が1乃至6のハロゲン化アルキル基、炭素原子数が5乃至7のシクロアルキルアミノ基、炭素原子数が2乃至12のジアルキルアミノ基、炭素原子数が6乃至12のアリール基、炭素原子数が1乃至6のアルキル基を有する炭素原子数が7乃至18のアラルキル基、1乃至6のアルキル基を有する炭素原子数が7乃至18のアラルキルアミノ基、炭素原子数が2乃至7のアルカノイル基、炭素原子数が2乃至7のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が3乃至10のN−アルカノイル−N−アルキルアミノ基、アミノカルボニル基、炭素原子数が2乃至7のアルコキシカルボニル基、S、NおよびOからなる群より選ばれるヘテロ原子を1乃至4個含む炭素原子数2乃至10の複素環基、並びに置換基として炭素原子数1乃至6のアルキル基、炭素原子数1乃至6のアルコキシ基、もしくはハロゲン原子を1乃至5個有していてもよい環構成炭素原子数の数が6乃至12のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が1乃至6のアルキレン基については、1乃至12個であることが好ましく、1乃至3個であることが特に好ましい。炭素原子数が1乃至6のアルケニレン基については、その数は1乃至10個であることが好ましく、1乃至3個であることが特に好ましい。
【0055】
フェロセン分子は、−X−Y−基の結合位置を除く他の位置がさらに置換されていてもよい。置換基としては、カルボン酸基、炭素原子数が2乃至6のジアルキルアミノ基を有する炭素原子数が8乃至12のジアルキルアミノアルキレン基、および−CONH−炭素原子数が1乃至6のアルキレン基−炭素原子数が2乃至6のジアルキルアミノ基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。置換基の数は、フェロセン一分子について1乃至9個であることが好ましく、1個であることが特に好ましい。フェロセン一分子が有する置換基の種類は複数であってもよい。
【0056】
二つの、互いに異なる上記式(III)で表される導電性物質の特に好ましい組み合わせとしては、Yが単結合を表す導電性基とYがメチレン基を表す導電性基との組み合わせを挙げることができる。Yを変化させずに、導電性基の何れか一方のフェロセン分子に電子吸引性基あるいは電子供与性基を置換させてもよい。
【0057】
[標識量の検出]
電流量の測定は、導電性基板と導電性物質との間を流れる電流量が測定できる方法であれば如何なる方法であってもよい。サイクリックボルタモグラフィ(CV)、デファレンシャルパルスボルタモグラフィ(DPV)、リニアスィープボルタモグラフィ、ポテンショスタット等を用いることが好ましい。カウンタ電極とハイブリッドDNAが固定された導電性電極を電解質溶液に浸漬し、一対の電解系を形成させ、デファレンシャルパルスボルタモグラフィを測定することが特に好ましい。
【0058】
本発明の検出方法では、上述の通り、互いに異なる二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量(数)比を求めることができる。互いに異なる二種類の試料の例としては、正常細胞と異常細胞との組み合わせ、あるいは特定の菌体の野生株と変異株との組み合わせを挙げることができる。具体的には、DNA分析素子上のDNA断片が、例えば、フィブロネクチン産生に関与する遺伝子に相補性を有する塩基配列を持つものであれば、正常細胞に発現しているフィブロネクチン産生に関与する遺伝子と胃がん由来の株細胞NUGC3に発現している該遺伝子とについて、それらの量比を求めることができる。また、分析素子上のDNA断片の種類を変えることによって、例えば、正常細胞と慢性骨髄性白血病由来の株細胞K562とにそれぞれ発現しているフィブロネクチン産生に関与する遺伝子の量比を求めることもできる。さらに、DNA分析素子上の複数の領域のそれぞれに互いに異なる種類のDNA断片を固定しておけば、互いに異なる試料中にそれぞれ発現している複数の種類の遺伝子について、同時に、各遺伝子の発現量比の解析を行うこともできる。
【0059】
【実施例】
[実施例1]
(1)DNA分析素子の作製
面積が2.25mm2の金電極に、C末端にメルカプトヘキシル基を導入した100ピコモル/1μLのチミンの20量体を含む水溶液2μLを滴下し、室温で1時間放置することによってDNA分析素子を作製した。
(2)標識試料DNA断片の調製
文献(Takenaka et al., Analytical Biochemistry, 218, 436-443(1994))に記載された方法に従って、下記式で順に表される、酸化還元電位が互いに異なる二種類のフェロセン標識オリゴヌクレオチド、F1−A20およびF2−A20を調製した。Aはアデニンを示す。
【0060】
【化10】
【0061】
【化11】
【0062】
(3)試料DNA断片の検出
(イ)F1−A20の検出
前記(1)で得たDNA分析素子の表面に、80ピコモルのフェロセン標識オリゴヌクレオチドF1−A20を含む10mMトリス緩衝液(pH7.5)溶液の2μLを滴下し、25℃にて30分間インキュベートした。次いで、分析素子表面を純水にて洗浄し、未反応のF1−A20を除去した。38℃にて、0.1M塩化カリウム−0.1M酢酸緩衝液(pH5.6)溶液に、純水で洗浄後の分析素子を浸漬し、印加電圧が100乃至700mVの範囲にて、デファレンシャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、460mVにおいてF1−A20に由来する応答電流が認められ、その電流値は6.0μAであった(図2の1)。
(ロ)F2−A20の検出
F1−A20の代わりにF2−A20を用いる以外は上記(イ)と同様にしてデファレンシャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、260mVの印加電圧においてF2−A20に由来する応答電流が認められ、その電流値は6.0μAであった(図2の2)。
【0063】
[参考例]
チミンの20量体の代わりにアデニンの20量体を用いる以外は実施例1の(1)と同様にしてDNA分析素子を作製し、そのDNA分析素子を使用する以外は、実施例1の(3)と同様にして、F1−A20およびF2−A20についてそれぞれデファレンシャル・パルス・ボルタンメトリを行ったところ、何れの場合にも応答電流は認められなかった。
【0064】
[実施例2]DNA分析素子上のDNA断片に相補的な試料DNA断片の試料中の存在量比の確認
試料DNA断片として、40ピコモルのF1−A20と40ピコモルのF2−A20とからなる混合物を含むトリス緩衝液を用いる以外は、実施例1と同様にして、印加電圧460mVおよび260mVにおける応答電流をそれぞれ測定した(図3)。また、F1−A20のモル数が0、20、60および80ピコモルの場合についても、それぞれ、混合物の総モル数が80ピコモルとなるように調製した混合物を用いて、印加電圧460mVおよび260mVにおける応答電流を測定した(図3)。図3の−黒塗り四角−は、印加電圧460mVにおける応答電流を、−黒塗り丸−は、印加電圧260mVにおける応答電流をそれぞれ表す。
【0065】
図3より、260mVにおけるピーク電流値と460mVにおけるピーク電流値との比は、試料に含まれるF2−A20の濃度とF1−A20の濃度との比に対応することが分かる。
【0066】
[実施例3]PNA分析素子上のPNA断片に相補的な試料DNA断片の試料中の存在量比の確認
(1)PNA分析素子の作製
下記式で表されるペプチド核酸:PNA−H2N−Lys−T10−H(以下「PNA−T10」という。)を、文献(P.E.Nielsen et al., Journal of American Chemical Society, 114, 1895-1897(1992)および同114, 9677-9678(1992))に記載の方法に従って合成した。Tは、チミンを表し、式の左端がPNAのC末端、右端がPNAのN末端をそれぞれ表す。
【0067】
【化12】
【0068】
表面にメルカプト基を有する面積が2.25mm2の金電極に、1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタンのリン酸緩衝液を滴下して得られる、一方の端部のビニルスルホニル基が遊離な金電極に、100ピコモル/1μLのチミンの10量体であるPNA−T10の水溶液(2μL)を滴下し、室温で1時間放置してPNA修飾電極を作製した。
(2)試料DNA断片の検出
DNA分析素子を用いる代わりに上記(1)で作製したPNA分析素子を用いる以外は実施例2と同様の操作を行って、F1−A20とF2−A20とからなる混合物の応答電流を測定した。図4の−黒塗り四角−は、印加電圧460mVにおける応答電流を、−黒塗り丸−は、印加電圧260mVにおける応答電流をそれぞれ表す。
【0069】
図4より、PNA分析素子を用いても、DNA分析素子を用いた場合と同様な結果が認められた。また、DNA分析素子と比べると、さらに感度よく検出できることが分かる。
【0070】
【発明の効果】
本発明の検出方法は、互いに異なる二種類以上の試料中における試料核酸断片の存在量の差を検出する二蛍光標識法に対して、標識を導電性物質に変えた初めての電気化学的な方法である。本発明の検出方法は、従来の二蛍光標識法と比較して、迅速・簡便であり、感度が高く、コストが低い。また、試料核酸断片として、試料中に発現しているmRNAあるいはそのmRNAから作製されたcDNAを用いれば、互いに異なる試料中の、特定のタンパク質の産生に関与する遺伝子の発現の差を求めることもできる。DNA分析素子をPNA分析素子に代えても、上記と同様な検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の遺伝子の発現解析の代表的な方法を示す模式図である。
【図2】実施例1における、印加電圧と応答電流との関係を示すグラフである。
【図3】実施例2にける、混合試料中のF1−A20の割合と応答電流との関係を示すグラフである。
【図4】実施例3にける、混合試料中のF1−A20の割合と応答電流との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
1a 試料a
1b 試料b
2 試料aから得られた試料核酸断片あるいは試料bから得られた試料核酸断片
3a 導電性物質a
3b 導電性物質b
4a 導電性物質aが結合した試料核酸断片
4b 導電性物質bが結合した試料核酸断片
5 DNA分析素子
6 DNA分析素子上の一領域
7 DNA分析素子上の一領域に固定されている、試料核酸断片に相補性を有するDNA断片
8 DNA分析素子上の一領域におけるハイブリッドDNA
Claims (4)
- (1)導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するDNA断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に0乃至800mVの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が50mV以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程;(2)導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のDNA断片が導電性基板の表面に固定されてなるDNA分析素子に接触させる工程;(3)該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程;そして、(4)各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法。
- (1)導電性基板の表面に固定された既知の塩基配列を有するPNA断片に相補性を有し、かつ互いに異なる二種類以上の試料中の試料核酸断片を、それぞれ、共に0乃至800mVの範囲に酸化還元電位を有する物質であって、その酸化還元電位の差が50mV以上である導電性物質で標識することにより、導電性基を結合させた試料核酸断片を調製する工程;(2)導電性基を結合させた試料核酸断片を含む標識試料溶液を混合し、この混合試料溶液を、上記のPNA断片が導電性基板の表面に固定されてなるPNA分析素子に接触させる工程;(3)該分析素子に、二以上の、導電性物質が示す電位を順次に印加し、それぞれの電位における、該分析素子と導電性基との間を流れる電流を測定する工程;そして、(4)各電位における電流量を互いに比較することによって、二種類以上の試料にそれぞれ含まれる試料核酸断片の存在量を検出する方法。
- 導電性基板の表面がポリ陽イオンまたは反応性基を有するシランカップリング剤で被覆されており、既知の塩基配列を有するDNA断片が末端に反応性基を有し、ポリ陽イオンの陽イオンまたはシランカップリング剤の反応性基とDNA断片の末端の反応性基とが共有結合を形成することにより、既知の塩基配列を有するDNA断片を導電性基板の表面に固定することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 電流の測定をデファレンシャルパルスボルタモグラフィによって行うことを特徴とする請求項1もしくは2に記載の方法。
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